JP3032891B2 - 遊離ヘモグロビン測定用試薬キット及びそれを用いる遊離ヘモグロビンの測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は臨床検査領域等で用いられる遊離ヘモグロビ
ン測定用試薬キット及びそれを用いる遊離ヘモグロビン
の測定法に関するものである。更に詳細には固相化ヒト
ハプトグロビンと酵素標識抗ヒトヘモグロビン抗体とか
らなる遊離ヘモグロビン測定用試薬キット及びそれを用
いる酵素免疫測定法並びにヒトハプトグロビン感作粒子
と抗ヒトヘモグロビン抗体とからなる遊離ヘモグロビン
測定用試薬キット及びそれを用いるヒトハプトグロビン
感作粒子凝集法に関するものである。

［従来の技術］ 大量輸血、体外循環、血液透析、臓器灌流などでは、
しばしば高度溶血を起こすために溶血性腎障害をはじめ
種々の合併症が懸念される。その病因となるヘモグロビ
ンはハプトグロビンと結合していない遊離ヘモグロビン
といわれており、臨床的には血漿及び血清中のヘモグロ
ビンはハプトグロビン結合型ヘモグロビンの遊離ヘモグ
ロビンに分けて定量することが必要となっている。

このように、血漿、血清等に含まれる遊離ヘモグロビ
ンの測定は臨床上重要な意義を有し、その測定方法とし
ては、セルロースアセテート膜電気泳動法による方法
や、簡易分別定量法による方法、遊離ヘモグロビン吸着
定量法（カラム法）が従来から知られている。

上記のセルロースアセテート膜電気泳動法による遊離
ヘモグロビンの測定は、まずシアンメトヘモグロビン法
で検体（血漿及び血清）中の総ヘモグロビン量を定量す
る。次に同一検体につき、セルロースアセテート膜電気
泳動法で遊離ヘモグロビン、ハプトグロビン−ヘモグロ
ビン複合体、メトヘモアルブミン（アルブミン結合型ヘ
モグロビン）画分に分離し、ペルオキシダーゼ反応によ
りヘモグロビンを染色した後、各画分における染色度を
デンシトメーターでスキャンニングし、総ヘモグロビン
（遊離ヘモグロビン＋ハプトグロビン−ヘモグロビン複
合体＋メトヘモアルブミン）量に対する遊離ヘモグロビ
ン量の比率を求める。求めた比率を予めシアンメトヘモ
グロビン法で定量した総ヘモグロビン量に乗じて検体中
の遊離ヘモグロビン量が算出される。

簡易分別定量法による遊離ヘモグロビンの測定は、シ
アンメトヘモグロビン法による総ヘモグロビンの定量と
一元免疫拡散法（Mancini法）による総ハプトグロビン
の定量を行ない、ハプトグロビン−ヘモグロビンとの結
合比を用いて、遊離ヘモグロビン量を算出するものであ
る。なお、一元免疫拡散法で総ハプトグロビンを定量す
るに当たっては、予め、澱粉ゲル電気泳動法又は免疫電
気泳動法もしくはアクリルアミドゲル電気泳動法でハプ
トグロビンの血清型を識別しておき、血清型別に作成し
た標準曲線を用いるか、又はプール血清を用いて作成し
た標準曲線を用いる場合は標準曲線から求めた測定値に
ハプトグロビンの血清型別の係数を乗じて定量値としな
ければならない。

また、遊離ヘモグロビン吸着定量法による遊離ヘモグ
ロビンの測定は、ハプトグロビン固定化セファロースを
均一に充填した円筒状カラムに一定量の検体（血漿又は
血清）を注入し、約３倍〜10倍量の生理食塩水で洗浄し
た後、ハプトグロビン固定化セファロースに吸着した遊
離ヘモグロビンによる着色部分の長さを計測することに
より遊離ヘモグロビン量を求めるものである。

［発明が解決しようとする課題］ 上記の従来技術において、セルロースアセテート膜電
気泳動法による方法は、総ヘモグロビン量に分画比を乗
じて、間接的に遊離ヘモグロビン量を求める方法である
ため、測定操作が繁雑で長時間を要すると共に総ヘモグ
ロビンの定量限界及びセルロースアセテート膜電気泳動
法の検出限界以下の遊離ヘモグロビンについては測定で
きないという問題がある。

また、簡易分別定量法による測定方法では、総ヘモグ
ロビン量と総ハプトグロビン量から間接的に遊離ヘモグ
ロビン量を求める方法であるため、総ヘモグロビンの定
量限界以下の遊離ヘモグロビンについては測定できな
い。更に総ハプトグロビンの定量限界以下のハプトグロ
ビン量と結合したヘモグロビンは結果的に遊離ヘモグロ
ビンとして算出されるという問題がある。

一方、遊離ヘモグロビン吸着定量法による測定方法で
は、ハプトグロビン固定化セファロースを充填したカラ
ムに一定量の検体（血清又は血漿）を注入し、ハプトグ
ロビン固定化セファロースに吸着した遊離ヘモグロビン
によって着色したカラムの着色層の長さを計測すること
によって検体中の遊離ヘモグロビン量を求める方法であ
るため、カラム内のハプトグロビン固定化セファロース
の均一性、検体の注入方法、洗浄方法等によって着色層
の長さが異なる上に、着色層の終末点が不明確であり、
定量性、再現性に欠けるという問題点がある。

本発明は、上記の従来技術の欠点を解消すべくなされ
たもので、検体（例えば、血清、血漿、尿、糞便等）中
の遊離ヘモグロビンを特異的に、高感度で直接的に定量
できる遊離ヘモグロビン測定用試薬キット及びそれを用
いる測定法を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段及び作用］ 本発明の遊離ヘモグロビン測定用試薬キットは、マ
イクロプレート、プラスチックチューブ又はプラスチッ
クボールからなる固相にヒトハプトグロビンを結合させ
た固相化ヒトハプトグロビンと、抗ヒトヘモグロビン抗
体に酵素を結合させた酵素標識抗体とからなることを特
徴とする遊離ヘモグロビン測定用試薬キットである。ま
た、ヒトハプトグロビンを粒子担体に結合させたヒト
ハプトグロビン感作粒子と抗ヒトヘモグロビン抗体とか
らなることを特徴とする遊離ヘモグロビン測定用試薬キ
ットを提供する。

また、本発明の遊離ヘモグロビンの測定法は、（ｉ）
マイクロプレート、プラスチックチューブ又はプラスチ
ックボールからなる固相にヒトハプトグロビンを結合さ
せた固相化ヒトハプトグロビンに、遊離ヘモグロビン含
有検体を接触させて検体中の遊離ヘモグロビンを固相上
のヒトハプトグロビンと結合させた後、更に抗ヒトヘモ
グロビン抗体に酵素を結合させた酵素標識抗体を作用さ
せ、遊離ヘモグロビンを介して固相上に該酵素標識抗体
を固定化し、次いでその酵素活性を測定することを特徴
とする遊離ヘモグロビンの測定法である。また、（ii）
ヒトハプトグロビンを粒子担体に結合させたヒトハプト
グロビン感作粒子に、遊離ヘモグロビン含有検体を接触
させて検体中の遊離ヘモグロビンを粒子上のヒトハプト
グロビンと結合させた後、更に抗ヒトヘモグロビン抗体
を作用させ、粒子上の遊離ヘモグロビンと抗ヒトヘモグ
ロビン抗体との結合により生じる粒子間の凝集度合によ
って、検体中の遊離ヘモグロビンを測定することを特徴
とする遊離ヘモグロビンの測定法を提供する。

本発明は上記の構成よりなり、その内、上記（ｉ）に
示した遊離ヘモグロビン測定法の場合、前記に示され
る固相化ヒトハプトグロビンと抗ヒトヘモグロビンに酵
素を結合させた酵素標識抗体を用い、該固相上に検体中
の遊離ヘモグロビンを介して該酵素標識抗体を結合させ
（所謂サンドイッチ法）、次いでその酵素標識抗体の酵
素活性を測定するもので、酵素活性は結合した酵素標識
抗体量によって定まり、その酵素標識抗体量は固相化ヒ
トハプトグロビンに結合した遊離ヘモグロビン量によっ
て定まる。また、固相化ヒトハプトグロビンに結合する
遊離ヘモグロビン量は検体中の遊離ヘモグロビン量によ
って定まる。従って、酵素活性は検体中の遊離ヘモグロ
ビン量に相関するので、酵素活性を測定することにより
検体中の遊離ヘモグロビン量を求めることができる。

また、上記（ii）に示した遊離ヘモグロビン測定法の
場合、前記に示された粒子担体にヒトハプトグロビン
を結合させたヒトハプトグロビン感作粒子と抗ヒトヘモ
グロビン抗体を用い、該感作粒子上に検体中の遊離ヘモ
グロビンを結合させた後、抗ヒトヘモグロビン抗体を作
用させて、感作粒子の凝集度合によって検体中の遊離ヘ
モグロビン量を測定するもので、その感作粒子の凝集度
合は感作粒子上に結合した遊離ヘモグロビン量によって
定まり、感作粒子上に結合する遊離ヘモグロビン量は検
体中の遊離ヘモグロビン量によって定まる。従って、感
作粒子の凝集度合は検体中の遊離ヘモグロビン量に相関
するので、感作粒子の凝集度合を測定することにより、
検体中の遊離ヘモグロビン量を求めることができる。

本発明の第１の遊離ヘモグロビン測定用試薬キット
は、マイクロプレート、プラスチックチューブ又はプラ
スチックボールからなる固相にヒトハプトグロビンを結
合させた固相化ヒトハプトグロビンと抗ヒトヘモグロビ
ンに酵素を結合させた酵素標識抗体とからなる試薬キッ
トである。

ここで使用する固相化ヒトハプトグロビンとしては、
ヒト血漿から既知の手段（臨床ハプトグロビン、大城孟
著：永井書店発行、第223頁参照）で調製したヒトハプ
トグロビンを用いて、吸着法、ブロムシアン法などの既
知の手段（酵素免疫測定法、第３版：医学書院発行、第
395頁参照）で調製できる。ヒトハプトグロビンを固定
化する固相材料としては、酵素免疫測定法等で従来から
使用されている固相材料のいずれも用いることができ、
例えば、アガロース、セファロース等の多糖類、ガラ
ス、セラミックス、プラスチック等が例示される。これ
の材料の形状は、測定操作の便宜性等からマイクロプレ
ート、プラスチックチューブ又はプラスチックボールと
される。担体上に固定化されるヒトハプトグロビン量は
特に限定されず、所望する感度等により適宜調整され、
この調整は担体に導入するブロムシアン基、ヒトハプト
グロビン濃度等を調整することにより行うことができ、
固定化に使用されるヒトハプトグロビン溶液のヒトハプ
トグロビン濃度は５μg/ml〜5mg/ml程度が好ましい。

一方、酵素標識抗ヒトヘモグロビン抗体はヒトヘモグ
ロビンに対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクロ
ーナル抗体）を用いて、グルタルアルデヒド法、マレイ
ミド法、過ヨウ素酸酸化法などの既知の手段（酵素免疫
測定法、第３版：医学書院発行、第109頁参照）で酵素
と結合させることにより調製できる。酵素標識抗ヒトヘ
モグロビン抗体の調製に用いる抗ヒトヘモグロビン抗体
としては、ヒトヘモグロビンに対する抗体（ポリクロー
ナル抗体及びモノクローナル抗体）であればいずれの抗
体も使用することができ、これらはヒトヘモグロビンで
免疫した動物の血清より慣用の方法で得ることができ
る。より好ましくは精製ヒトヘモグロビン抗体が用いら
れ、例えば、ジョージら（George H,et al.Am.J.Clin.P
athol.Vol.69,342〜346,1978）の方法によって調製で
き、またヒトヘモグロビン抗体（ポリクローナル抗体及
びモノクローナル抗体）から、精製ヒトヘモグロビンを
結合させたアフィニティクロマトグラフィーにより調製
することも可能である。また、ここで使用される酵素と
しては、酵素免疫測定法で従来から使用されている酵素
のいずれも使用することができ、例えば、ペルオキシダ
ーゼ、アルカルフォスファターゼ、グルコシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等が
例示される。

本願発明の第２の遊離ヘモグロビン測定用試薬キット
は、粒子担体にヒトハプトグロビンを結合させたヒトハ
プトグロビン感作粒子と抗ヒトヘモグロビン抗体からな
なる試薬キットである。

ここで使用するヒトハプトグロビン感作粒子として
は、ヒト血漿から既知の手段（臨床ハプトグロビン、大
城孟著：永井書店発行、第223頁参照）で調製したヒト
ハプトグロビンから、抗ヒトヘモグロビン抗体を結合さ
せたアフィニティクロマトグラフィーによって、ヘモグ
ロビン−ハプトグロビン複合体（吸着画分）を除いたヒ
トハプトグロビン（未吸着画分）を用いて、粒子担体に
吸着させる方法、疎水結合法、カップリング剤（例え
ば、タンニン酸、グルタルアルデヒド、ビスジアゾベン
ゼン、トリレンジイソシアナート、カルボジイミドな
ど）を用いる方法等の既知の手段で調製できる。ヒトハ
プトグロビンを固定化する粒子担体としては、ホルマリ
ン処理、グルタルアルデヒド処理などがされた赤血球や
ポリスチレンラテックスなどの人工粒子を用いた凝集反
応試験（粒子イムノアッセイ法）等で従来から使用され
ている担体のいずれも用いることができ、上記の赤血
球、ラテックス以外にもゼラチン粒子、ベントナイト粒
子、プラスチック粒子、カオリン粒子、セラミックス粒
子、アガロース、セファロース等の多糖類粒子などが例
示され、測定操作の便宜性等から、その形状は球状がよ
り好ましい。また、該粒子担体の粒径としては0.1〜2.0
μｍ程度のものが使用される。粒子担体上のヒトハプト
グロビン量は特に限定されず、所望する感度等により適
宜調整され、この調整は粒子担体に接触させるヒトハプ
トグロビン溶液のヒトハプトグロビン濃度を調整する方
法等により行うことができ、粒子担体に吸着させる際に
使用されるヒトハプトグロビン溶液のヒトハプトグロビ
ン濃度としては、0.005〜0.05％程度が好ましい。

一方、抗ヒトヘモグロビン抗体としては、ヒトヘモグ
ロビンに対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクロ
ーナル抗体）であればいずれの抗体も使用することがで
き、これらはヒトヘモグロビンで免疫した動物血清より
慣用の方法で得ることができる。より好ましくは精製ヒ
トヘモグロビン抗体が用いられ、精製ヒトヘモグロビン
抗体は抗ヒトヘモグロビン抗体（ポリクローナル抗体及
びモノクローナル抗体）から、精製ヒトヘモグロビンを
結合させたアフィニティクロマトグラフィーにより調製
することができる。

本発明の試薬キットの内、前記に示した試薬キット
は、マイクロプレート、プラスチックチューブ又はプラ
スチックボールからなる固相にヒトハプトグロビンを結
合させた固相化ヒトハプトグロビンと、抗ヒトヘモグロ
ビン抗体に酵素を結合させた酵素標識抗体とで少なくと
も構成され、該固相化ヒトハプトグロビンは保存性及び
安定性を向上させるため、通常、凍結乾燥手段等を用い
て乾燥状態とされ、また該酵素標識抗体は凍結乾燥製剤
等の粉末状でも、リン酸緩衝液等の適宜な緩衝液に溶解
した液状としてもよい。さらに追加的に、酵素活性を測
定するための酵素基質試薬、検量線作成に使用する遊離
ヘモグロビン標準品及び確認試験用試薬として使用され
るハプトグロビンを一定量含有するハプトグロビン試薬
を含んでいてもよい。上記の酵素基質試薬は、酵素標識
抗体に使用されている酵素の基質そのもの又はそれを適
宜な緩衝液に適当な濃度に溶解したものが使用される。
また遊離ヘモグロビン標準品は、例えば、後記実施例５
に記載の手段等で調製でき、ハプトグロビン試薬は後記
実施例８に記載の手段等で調製することができる。

また、前記に示した試薬キットはヒトハプトグロビ
ンを前記粒子担体に結合させたヒトハプトグロビン感作
粒子と抗ヒトヘモグロビン抗体とで少なくとも構成さ
れ、上記感作粒子は、通常、凍結乾燥製剤とするか又は
適当は緩衝液を用いて浮游液とされ、また抗ヒトヘモグ
ロビン抗体は凍結乾燥製剤等の粉末状でも、リン酸緩衝
液等の適宜な緩衝液に溶解した液状としてもよい。さら
に追加的に、凝集度合の比較対照として使用される遊離
ヘモグロビンを一定量含有する遊離ヘモグロビン陽性コ
ントロール、遊離ヘモグロビンを実質的に含有しない遊
離ヘモグロビン陰性コントロール及び確認試験用試薬と
して使用されるハプトグロビンを一定量含有するハプト
グロビン試薬を含んでいてもよい。これらの遊離ヘモグ
ロビン陽性コントロール、遊離ヘモグロビン陰性コント
ロール及びハプトグロビン試薬は、後記実施例６、７及
び８に記載の手段等で調製できる。

次に、本発明の試薬キットを用いる遊離ヘモグロビン
の測定法をより詳細に説明すると、前記示した遊離ヘ
モグロビン測定用試薬キットの場合、まず、必要に応じ
て適当な緩衝液で濃度調整された遊離ヘモグロビン含有
検体（血清、血漿、尿、糞便抽出液等）を固相化ヒトハ
プトグロビンと反応させた後、上清を除去することによ
って、固相化ヒトハプトグロビンと特異的に結合した遊
離ヘモグロビンが固相上に残る。次に、酵素標識抗体を
添加することによって、酵素標識抗体は固相上に残った
遊離ヘモグロビンに結合する。結合しなかった過剰の酵
素標識抗体を除いた後、酵素活性を測定する。一方、遊
離ヘモグロビン標準品を３〜５段階濃度に希釈した試料
液につき上記と同様な操作を行うことによって、遊離ヘ
モグロビン濃度と酵素活性との関係式（検量線）を作成
し、上記で得られた酵素活性と検量線とを対比すること
により、検体中の遊離ヘモグロビン量を求めることがで
きる。

上記方法において、酵素活性の測定方法としては、酵
素の種類により種々の方法が用いられるが、酵素標識抗
体の酵素の基質を添加し、該基質の変化量を測定する方
法（例えば、比色法、螢光法、化学発光法、生物発光法
等）が操作性及び定量性に優れるので好ましい。特に基
質の変化量を吸光度の測定を行う方法が簡便であり、こ
のような酵素とその基質の例としては、例えば、ペルオ
キシダーゼと過酸化水素及びｏ−フェニレンジアミンと
の組み合わせ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼとｏ−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドとの組み合わせ、アル
カリフォスファターゼとｐ−ニトロフォスフェートとの
組み合わせ等が例示される。

一方、前記に示した遊離ヘモグロビン測定用試薬キ
ットを用いる遊離ヘモグロビンの測定法をより詳細に説
明すると、例えば、適当な緩衝液で適宜希釈した検体
（血清、血漿、尿、糞便抽出液等）をヒトハプトグロビ
ン感作粒子と反応させることによって、検体中の遊離ヘ
モグロビンを粒子上のヒトハプトグロビンに結合させ
る。更に抗ヒトヘモグロビン抗体を加えることによっ
て、抗ヒトヘモグロビン抗体は粒子上に結合した遊離ヘ
モグロビンと特異的に結合するが、抗ヒトヘモグロビン
抗体は２つの抗原結合部位を有しているため、遊離ヘモ
グロビンが結合した粒子間で凝集が生じる。検体を適当
な緩衝液で倍々希釈した試料液を用いて、凝集を生じる
最高希釈倍数を求め、一方、既知濃度の遊離ヘモグロビ
ンを含有する標準液を倍々希釈した試料液（陽性コント
ロール）を用いて、凝集を生じる最高希釈倍数を求め、
両者を比較することによって、検体中の遊離ヘモグロビ
ン量を半定量的に測定することができる。この凝集度合
の測定は、マイクロプレートを用いた赤血球凝集反応試
験及びスライドガラス（観察板）を用いたラテックス凝
集反応試験などで一般的に用いられている操作法と同様
にして行うことができる。

また、本発明の遊離ヘモグロビンの測定法は上記方法
に限られず、例えば、生じた凝集塊以外の凝集しなかっ
たヒトハプトグロビン感作粒子の数を光学的に計数する
方法（粒子カウンティングイムノアッセイ法）、近赤外
線（0.8〜2.4μｍ）を用いて凝集塊の濁度を測定する方
法（近赤外線比濁法）等の方法を使用することにより、
遊離ヘモグロビンを定量的に測定することもできる。

［発明の効果］ 本発明の遊離ヘモグロビン測定用試薬キット及びそれ
を用いる遊離ヘモグロビンの測定法によれば、酵素免疫
測定法及びヒトハプトグロビン感作粒子凝集法を用いる
もので、検体（例えば、血清、血漿、尿、糞便等）に含
まれる遊離ヘモグロビンを特異的に、高感度かつ直接的
に定量的（又は半定量的）に測定することができ、測定
操作も簡便であると共に短時間で測定が終了するという
効果を奏する。

［実施例］ 以下、本発明を実施例及び実験例に基づいてより詳細
に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるもので
はない。

実施例１ 固相化ヒトハプトグロビンの調製 ヘモグロビンを含まない正常人プール血漿より調製し
た精製ヒトハプトグロビン（（株）ミドリ十字製）を0.
05M炭酸ナトリウム塩緩衝液（pH9.6）にハプトグロビン
が1mg/mlになるように溶解し、その0.2mlずつをEIA用マ
イクロプレートのウェルに加え、４℃で15時間静置し
た。ウェルの内容液を吸引除去後、0.02％Tween−20を
含有するリン酸塩緩衝化生理食塩液（PBS）0.3mlを加え
再び吸引除去した。Tween−20含有PBS添加及び吸引除去
を計３回繰り返した後、0.5％ウシ血清アルブミンを含
有するPBS（0.3ml）を添加し、室温で３時間放置後吸引
除去した。以上の処理により、ハプトグロビン固定化マ
イクロプレートを調製した。

実施例２ 酵素標識抗体の調製 ジョージら（George H.et al.Am.J.Clin.Pathol.Vol.
69,342〜346,1978）の方法によって調製した精製抗ヒト
ヘモグロビン・ヤギIgGを常法に従ってペプシン消化
し、Ｆ（ab′）_２を得た後、更に２−メルカプトエチル
アミンで還元してFab′を調製した。次に、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（以下、HRPOと称する）2mgを0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解した溶液に、0.3
mgの４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１
−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを
N,N−ジメチルホルムアミド30μに溶解した溶液（架
橋試薬）を加え、30℃で60分間反応させた。次いで沈澱
物を遠心除去後、Sephadex G−50カラムでゲル濾過し
（溶出液:0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0）、403n
mの吸収を示す画分を分取して濃縮し、マレイミド化HRP
Oを調製した。

上記で得たマレイミド化HRPO1.8mg及びFab′2mgを混
合し、2.5mM EDTAを含有する0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液（pH6.0）を加え、全量を1mlとし30℃で60分間反応さ
せた。その後、50nM N−１エチルマレイミドを10μ加
えて反応を停止させた後、Ultrogel AcA 44（LKB）カラ
ムで複合体画分を分取し、１当りのFab′量が0.025〜
0.05mgになるように、0.25％ウシ血清アルブミンを含有
するPBSで希釈し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトヘモグ
ロビン抗体液とした。

実施例３ ハプトグロビン感作粒子の調製 実施例１に記載の精製ヒトハプトグロビン（（株）ミ
ドリ十字製）から、抗ヒトヘモグロビン抗体を結合させ
たアフィニティクロマトグラフィーによって、ヘモグロ
ビン−ハプトグロビン複合体（吸着画分）を除いた高度
精製ヒトハプトグロビン（未吸着画分）をPBS（pH7.2）
でハプトグロビン濃度が0.01％になるように溶解したハ
プトグロビン溶液と、粒径1.8〜2.0μｍの人工粒子（日
本合成ゴム（株）製、IMMUTEX商品名）を２（V/V）％と
なるように同PBSで懸濁した懸濁液とを等量混合し、37
℃で１時間静置した。その上清を吸引除去後、粒子容量
の100〜200倍量の同PBSを加え、軽く振盪し懸濁させた
後遠心分離し、その上清を吸引除去する遠心洗浄操作を
計５回繰り返し行った。次いで、0.25％ウシ血清アルブ
ミンを含有するPBSを粒子容量の約100倍量加え軽く振盪
して懸濁させた後、４℃で15時間静置した。その上清を
吸引除去後、上記の方法で遠心洗浄を計５回繰り返し行
った後、粒子量が容量比で0.2％になるようにPBSを加
え、ハプトグロビン感作粒子懸濁液とした。以上の処理
により、ハプトグロビン感作粒子懸濁液を調製した。

実施例４ 抗ヒトヘモグロビン抗体の調製 ジョージら（George H.et al.Am.J.Clin.Pathol.Vol.
69,342〜346,1978）の方法によって調製した精製抗ヒト
ヘモグロビン・ヤギIgGを上記PBSで280nmにおける吸光
度が0.28になるように溶解した。以上の処理により抗ヒ
トヘモグロビン抗体液を調製した。

実施例５ 遊離ヘモグロビン標準液の調製 ウィリアムズ（Williams,Anal.Biochem.Vol.54,137〜
145,1973）の方法によって調製したヒトヘモグロビンか
ら、抗ヒトハプトグロビン抗体を結合させたアフィニテ
ィクロマトグラフィーにより未吸着画分を分取し、吸着
画分（ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体）を除去し
た。分取した未吸着画分につき、シアンメトヘモグロビ
ン法でヘモグロビン量を測定し、遊離ヘモグロビン標準
液とした。

実施例６ 遊離ヘモグロビン陽性コントロールの調製 実施例５で得た遊離ヘモグロビン標準液をPBSで最終
的に遊離ヘモグロビン量が20μg/mlになるように希釈し
た希釈液を遊離ヘモグロビン陽性コントロール液とし
た。

実施例７ 遊離ヘモグロビン陰性コントロールの調製 ヘモグロビンを含まない正常人プール血漿から、抗ヒ
トヘモグロビン抗体を結合させたアフィニティクロマト
グラフィーにより、未吸着画分を分取し、吸着画分（遊
離ヘモグロビン及びヘモグロビン−ハプトグロビン複合
体）を除去した。分取した未吸着画分を遊離ヘモグロビ
ン陰性コントロール液とした。

実施例８ ハプトグロビン試薬の調製 ヘモグロビンを含有しない正常人プール血漿より調製
した精製ハプトグロビン（株）ミドリ十字製）をPBSで
ハプトグロビン濃度が0.1（W/V）％となるように希釈
し、得られた希釈液をハプトグロビン試薬とした。

［実験例］ 実施例で得たヒトハプトグロビン固定化マイクロプレ
ート、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトヘモグロビン抗体、
遊離ヘモグロビン標準液、ヒトハプトグロビン感作粒
子、抗ヒトヘモグロビン抗体液、遊離ヘモグロビン陽性
コントロール液、遊離ヘモグロビン陰性コントロール液
及びハプトグロビン試薬を用いた遊離ヘモグロビンの測
定を以下のとおり行った。

実験例１ 遊離ヘモグロビン標準品による検量線の作成 実施例５で得た遊離ヘモグロビン標準液を1ml中の遊
離ヘモグロビン量が1,000ngになるように0.5％ウシ血清
アルブミンを含有するPBSで濃度調整を行った後、同PBS
で段階的に倍々希釈して得た１倍〜1,024倍希釈液を測
定試料液とした。

次に、実施例１で得たヒトハプトグロビン固定マイク
ロプレートのウェルに、上記PBS及び１倍〜1,024倍希釈
液を0.1mlずつ添加し、37℃で１時間静置した。ウェル
の内容液を吸引除去後、Tween−20含有PBS（0.3ml）の
添加及び吸引除去を計３回繰り返し洗浄した。その後、
実施例２で得たペルオキシダーゼ標識抗ヒトヘモグロビ
ン抗体液を0.1mlずつ各ウェルに添加し、37℃で１時間
静置した。再びウェルの内容液を吸引除去し、Tween−2
0含有PBS（0.3ml）の添加及び吸引除去を３回繰り返し
洗浄した。次いで0.1Mリン酸−クエン酸緩衝液（pH5.
0）に過酸化水素（0.015％w/v）、ｏ−フェニレンジア
ミン（1.5mg/ml）を溶かした基質溶液0.1mlをウェルに
加え、室温で30分間反応させ、その後2.5M硫酸（0.05m
l）を添加して反応を停止した。測定試料液に代えてPBS
を添加したウェルを対照として、測定試料を添加したウ
ェルの吸光度（492nm）をマイクロプレート用分光々度
計を用いて測定した。結果を第１図に示した。

実験例２ 酵素免疫測定法の特異性試験 遊離ヘモグロビンを１〜20mg/dl程度含有する血漿
を、２本の試験管に各々0.5mlずつ分取し、その一方に
実施例８で得たハプトグロビン試薬を0.5ml加えて37℃
で１時間放置したもの（阻止後試料と称する）と、他方
にハプトグロビン試薬に代えてPBSを0.5ml加えて同様に
37℃で１時間放置したもの（阻止前試料と称する）とを
調製した。各々を0.5％ウシ血清アルブミンを含有するP
BSで1,000倍に希釈した後、実験例１に示した方法に準
じて処理し492nmおける吸光度を測定した。阻止前試料
の吸光度から阻止後試料の吸光度を差し引いた値を阻止
前試料の吸光度で除することによって、ハプトグロビン
試薬による阻止率（％）を求めた。

３名の血漿（検体番号Ｉ〜III）を用いて行った試験
結果を第１表に示した。第１表に示されるように、ハプ
トグロビン試薬の添加により著しく阻止されており、本
発明の酵素免疫測定法が遊離ヘモグロビンに対して特異
性の高い試験法であることが確認された。

実験例３ ハプトグロビン感作粒子凝集法による希釈試験 実施例５で得た遊離ヘモグロビン標準液をPBSで遊離
ヘモグロビン濃度が100μg/mlになるように濃度調整を
行った後、同PBSで段階的に倍々希釈を行い、１倍（100
μg/ml）から512倍（0.20μg/ml）までの10種類の希釈
液を測定試料とした。

マイクロプレート［縦８ウェル（Ａ〜Ｈ列）、横12ウ
ェル（１〜12）］（第２図参照）のＨ列（１〜12）のウ
ェルに、実施例６で得た遊離ヘモグロビン陽性コントロ
ール液、実施例７で得た遊離ヘモグロビン陰性コントロ
ール液及び上記10種類の測定試料50μずつ添加し、そ
の他のウェル（Ｇ〜Ａ列の１〜12のウェル）にはPBSを2
5μずつ添加した後、常法に準じてオートダイリュー
ター（25μ用）を用いて、Ｈ列からＡ列へと倍々希釈
を行った。

次に、実施例３で得たハプトグロビン感作粒子懸濁液
を25μずつ全ウェルに添加し、軽く振盪した後、37℃
で30分間放置した。更に実施例４で得た抗ヒトヘモグロ
ビン抗体液を25μずつ添加し軽く振盪した後、室温で
約２時間静置した後、各ウェルにおけるハプトグロビン
感作粒子の凝集度合を観察した。

その結果の概略図を第２図に示した。同図中、−は非
凝集、±は凝集と非凝集の中間程度の凝集、＋は凝集を
示す。第２図から明らかなように、陽性コントロール
（20μg/ml）及び各試料液（100.0〜0.2μg/mlの10種
類）ともに0.39〜0.2μg/mlの濃度に希釈されたときに
凝集から非凝集に変化し、本発明の方法が信頼性の高い
方法であることを示した。

実験例４ ハプトグロビン感作粒子凝集法の特異性試験 実験例２で各々調製した阻止後試料と阻止前試料を測
定試料とした。各々の阻止後試料と阻止前試料をPBSで1
6倍に希釈した希釈液を、マイクロプレート（第３図参
照）のＨ列の１と２、３と４、５と６のウェルにそれぞ
れ50μずつ添加し、その他のウェル（Ｇ〜Ａ列の１〜
６のウェル）にはPBSを25μずつ添加した後、常法に
準じてオートダイリューター（25μ用）を用いてＨ列
からＡ列へと倍々希釈を行った。

次に、実施例３で得たハプトグロビン感作粒子懸濁液
を25μずつ全ウェルに添加し、軽く振盪した後、37℃
で30分間放置した。更に実施例４で得た抗ヒトヘモグロ
ビン抗体液を25μずつ添加し軽く振盪した後、室温で
約２時間静置した後、各ウェルにおけるハプトグロビン
感作粒子の凝集度合を観察し、阻止前及び阻止後の凝集
価を比較した。

その結果の概略図を第３図に示した。同図中、−は非
凝集、±は凝集を示す。第３図に示されるように、ハプ
トグロビン試薬の添加により凝集が著しく阻止されてお
り、本発明のハプトグロビン感作粒子凝集法が遊離ヘモ
グロビンに対して特異的の高い試験法であることが確認
された。

実験例５ 従来法との比較試験 溶血患者血漿を生理食塩液で段階的に倍々希釈（１〜
32倍希釈）した希釈液と、実施例６及び７でそれぞれ得
られた遊離ヘモグロビン陽性コントロール液及び遊離ヘ
モグロビン陰性コントロール液を測定試料として、本発
明の固定化ヒトハプトグロビンと酵素標識抗ヒトヘモグ
ロビン抗体を用いた酵素免疫測定法及びヒトハプトグロ
ビン感作粒子凝集法並びに従来から用いられている簡易
分別定量法及びハプトグロビン固定化セファロースカラ
ムを用いた吸着定量法（カラム法）によって遊離ヘモグ
ロビンを測定した。

酵素免疫測定法による測定は実験例１に示した方法で
行い、その検量線から検体中の遊離ヘモグロビン量（mg
/dl）を求めた。ヒトハプトグロビン感作粒子凝集法に
よる測定は実験例３に示した方法で行い、凝集を示した
最高希釈倍数（凝集価）を求めると共に、遊離ヘモグロ
ビン陽性コントロール液を基準として、検体中の遊離ヘ
モグロビン量（換算値、mg/dl）を求めた。

簡易分別定量法による測定及び吸着定量法（カラム
法）による測定は各々大城の方法（臨床ハプトグロビ
ン、大城孟著：永井書店発行、第33頁参照）に準じて行
った。

その結果を第２表に示した。第２表に示されるよう
に、従来法である簡易分別定量法及び吸着（カラム）法
では低濃度の遊離ヘモグロビンを測定することはできな
いが、本発明によれば低濃度の遊離ヘモグロビンまで定
量（又は半定量）できることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の固定化ヒトハプトグロビンと酵素標
識ヒトヘモグロビン抗体を用いた酵素免疫測定法による
遊離ヘモグロビンの測定における検量線を示す図であ
り、 第２図は、本発明のヒトハプトグロビン感作粒子凝集法
による遊離ヘモグロビンの測定において、遊離ヘモグロ
ビン濃度に対するヒトハプトグロビン感作粒子の凝集度
合を示す概略図である。同図中、−は非凝集、±は凝集
と非凝集の中間程度の凝集、＋は凝集を示す。 第３図は、本発明のヒトハプトグロビン感作粒子凝集法
による遊離ヘモグロビンの測定において、検体中の遊離
ヘモグロビンに対してヒトハプトグロビン感作粒子が特
異的に凝集することを示す概略図である。同図中、−は
非凝集、±は凝集を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 豊田 隆之 大阪府大阪市都島区都島中通３丁目５番 44号 株式会社ミドリ十字都島工場内 (56)参考文献 特開 昭54−150886（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−79163（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−106154（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−228351（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−38362（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−70764（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】マイクロプレート、プラスチックチューブ
   又はプラスチックボールからなる固相にヒトハプトグロ
   ビンを結合させた固相化ヒトハプトグロビンと、抗ヒト
   ヘモグロビン抗体に酵素を結合させた酵素標識抗体とか
   らなる遊離ヘモグロビン測定用試薬キット。
2. 【請求項２】固相化ヒトハプトグロビンの固相が、マイ
   クロプレートである請求項１記載の遊離ヘモグロビン測
   定用試薬キット。
3. 【請求項３】酵素標識抗体の酵素がペルオキシダーゼ、
   β−Ｄ−ガラクトシダーゼ又はアルカリフォスファター
   ゼである請求項１又は２記載の遊離ヘモグロビン測定用
   試薬キット。
4. 【請求項４】追加的に、遊離ヘモグロビンを一定量含有
   する遊離ヘモグロビン標準品、一定量のヒトハプトグロ
   ビンを含有するハプトグロビン試薬及び酵素の基質試薬
   を含む請求項１乃至３のいずれかに記載の遊離ヘモグロ
   ビン測定用試薬キット。
5. 【請求項５】マイクロプレート、プラスチックチューブ
   又はプラスチックボールからなる固相にヒトハプトグロ
   ビンを結合させた固相化ヒトハプトグロビンに、遊離ヘ
   モグロビン含有検体を接触させて検体中の遊離ヘモグロ
   ビンを固相上のヒトハプトグロビンと結合させた後、更
   に抗ヒトヘモグロビン抗体に酵素を結合させた酵素標識
   抗体を作用させ、遊離ヘモグロビンを介して固相上に該
   酵素標識抗体を固定化し、次いでその酵素活性を測定す
   ることを特徴とする遊離ヘモグロビンの測定法。