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JP3026985B2 - 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法 - Google Patents

遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法

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JP3026985B2
JP3026985B2 JP1500933A JP50093388A JP3026985B2 JP 3026985 B2 JP3026985 B2 JP 3026985B2 JP 1500933 A JP1500933 A JP 1500933A JP 50093388 A JP50093388 A JP 50093388A JP 3026985 B2 JP3026985 B2 JP 3026985B2
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JP
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albumin
plant
recombinant dna
nucleic acid
protein
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クレッバース，エンノ
ボッテルマン，ヨハン
レーマンズ，ジャン
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Bayer CropScience NV
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Plant Genetic Systems NV
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、適当な植物遺伝子の修飾により、有用で生
物学的に活性な、ポリペプチドを生成する方法に関す
る。
容易に純化できる形でかつ有用な量で一定の生物学的
に活性なポリペプチドを生成することには今なおほとん
どの場合において多大な問題点がある。
代替的な手法として挙げられるのは、化学的合成又は
遺伝的に処理された微生物による製造である。第１の手
法は、きわめて費用のかかる手法であり、しかも往々に
して、適当なコンフォーメーション（立体配座）をもつ
ポリペプチドが得られない。後者の手法は、ポリペプチ
ドの不安定さ、細胞内沈降そして純粋な形での生成物の
鈍化といった問題点のため、むずかしいものである。そ
の上、ホルモンペプチドを含むいくつかのクラスのペプ
チドは、適正なジスルフィドブリッジ形成、アセチル
化、グリコシル化又はメチル化といった付加的な処理の
後に初めて充分の活性を有することになる。天然におい
ては、ジスルフィドブリッジは、前駆体の膜転移の間に
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（異性化酵素）に
よる同時翻訳触媒作用を受けるため、きわめて高効率で
形成される。次に、タンパク質分解印割により、前駆体
から活性形が誘導される。
化学的に合成された又は原核系内で過剰生産されたペ
プチドは一般に還元された形で得られ、従って、次に、
システイン残基の穏やかな酸素によりジスルフィドブリ
ッジを形成させなくてはならない。往々してペプチドの
充分に変性された「スクランブル」状態から出発するた
め、このときジスルフィドブリッジの形成は、不規則過
程であり、この間に分子間架橋（より高い分子量の会合
物を生成する）ならびに不適切なジスルフィド結合（不
活性ペプチドを生成する）が正しく折りたたまれたペプ
チドの他に生成される可能性がある。
一定のペプチドを製造するためのシステムとして植物
細胞を用いることも同様に、PCT/US86/01599などにおい
て提案されてきた。この特許の中では、既知の技法（EP
83112985.3）に従った前記ペプチドを構造的に表現へと
もって行くことを原理とする提案されている方法が、植
物の生理を乱すことなく高い発現レベルを得ることそし
て植物タンパク質から分離することによりかかるペプチ
ドを回収する上で高い収量を得ることを可能にするもの
である、ということは実証されていない。このことは特
に、植物全体があるがままの形で用いられ土中で育てら
れる場合に言えることである。
本発明の目的は、これらの問題点を克服し、経済的に
価値ある方法及び大量に生産できる遺伝子的に処理され
た生物体を提供することにある。この方法において、一
定のポリペプチドは、かかる生物体の生理を乱すことな
く大量に合成されうると同時に、同じ又はほぼ同じアミ
ノ酸配列をもつ野生型ペプチドに共通の高度の生理学的
活性を提供する形で生成され、また、かかる生物体から
容易に回収されうる。
さらに詳しく言うと、本発明の目的は、遺伝的に修飾
された植物DNAならびにかかる植物材料の細胞で複製可
能なこの遺伝的に修飾されたDNAを含む植物の生きた材
料を提供することにある。ここで遺伝的に修飾された植
物のDNAは、相応する植物の成長の少なくとも１段階に
おいてその発現を実施させる一定の与えられた植物プロ
モータによって表現が制御されているような前記一定の
ポリペプチドについてコード付けする配列を含んでい
る。この成長段階は、大量に作られしかも容易に回収可
能な植物の器官又は組織内で発現が起きるように選ばれ
る。
本発明のもう１つの目的は、種子の貯蔵タンパク質に
備わっている、植物中に大量に生産される能力及びかか
る植物の一定の成長段階とくに種子形成段階において発
現される能力を利用することにある。さらに詳しく言う
と、本発明は、水溶性貯蔵タンパク質が相応する植物の
種子から容易に回収されうるという点を利用することを
その目的としている。
植物内での外来性遺伝子の発現は充分に立証されてい
る（De Blaere他、1987年）。いくつかの事例におい
て、種子の貯蔵タンパク質遺伝子が他の植物内に移入さ
れた。またいくつかの事例において、移入された種子の
貯蔵タンパク質遺伝子がその新しい環境の中で、組織特
異的でかつ発育調製された形で表現されるということが
示された。（Beachy他、1985年;Okamuro他、1986年;Sen
gupta−Gopalan他、1985年;Higgins他、1986年）、この
ことはすなわち、移入された遺伝子が、種子の適当な部
分内でしかも正規の時点でのみ発現される、ということ
を意味している。同様に、少なくとも１つの事例におい
て、外来性種子貯蔵タンパク質が宿主植物のタンパク粒
の中に位置づけられていることも示された（Greenwood
＆ Chrispeels、1985年）。さらに、イントロン（介在
配列）を含む完全な遺伝子ではなくむしろcDNAがキメラ
遺伝子のためのベースとして用いられた場合に、安定し
た機能的な伝令DNAを得ることができるということも立
証された（Chee他、1986年）。
種子貯蔵タンパク質は、多くの植物の種子内で全種子
タンパク質の最高90％を占めている。これらは、発芽直
後の若い苗のための栄養源として用いられる。これらを
コード付けしている遺伝子は、厳しく制御されており、
きわめて組織特異的かつ段階特異的な形で発現される
（Walling他、1986年;Higgins他、1984年）。従ってこ
れらは、ほぼ排他的に発育する種子内でのみ発現され、
異なるクラスの種子貯蔵タンパク質は、その種子の異な
る発育段階で発現されうる。これらは一般にその細胞内
位置に関して制限を受けており、タンパク粒（プロテイ
ンボディ）又はタンパク質貯蔵液胞と呼ばれる、膜で結
合された細胞小器官（オルガネラ）内に貯蔵されてい
る。これらの細胞小器官は、プロテアーゼの無い環境を
提供し、又往々にしてプロテアーゼ抑制因子をも含んで
いる。これらのタンパク質は、開花の時点で減成され、
発育中の種子のための栄養源として役立つものと考えら
れている。これらのタンパク質のうちのいくつかのクラ
スについて単純な純化技法が記述されてきた。
種子貯蔵タンパク質は、例えばSvedbergが規定してい
るように（Stryer.L.,著「Biochemistry（生化学）」、
第２版内、W.H.Freeman,New York,p599）、一般に可溶
性とサイズ（さらに限定的に言うと沈降速度）に基づい
て分類される。１つの特定のクラスの種子貯蔵タンパク
質が研究された。すなわち、水溶性あるアルブミン類で
あり従って他のタンパク質から容易に分離される2S種子
貯蔵タンパク質である。これらはサイズが小さいことも
あって純化が単純になっている。いくつかの2S貯蔵タン
パク質が、タンパク質又はcDNAのいずれかのレベルで特
徴づけされてきた（Crouch他、1983年;Sharief ＆ Li、
1982年;Ampe他、1986年;Altenbach他、1987年;Ericson
他、1986年;Scofield ＆ Crouch、1987年;Josefsson
他、1987年；そして本出願明細書に記述されている研
究）。2Sアルブミンは、ジスルフィドブリッジにより連
結された、それぞれ６〜９及び３〜４キロダルトン（k
d）の２つのサブユニットから細胞内で形成される。
上述の参考図書内の研究は、2Sアルブミンが、数多く
の異なる種の2Sアルブミン間で共有の構成をもつ複合プ
リプロペプチドとして合成され、第２図にこれらの種の
うちの３つについて概略的に示されているとおりであ
る、ということを示していた。いくつかの完全な配列が
第２図に示されている。
2Sアルブミンのタンパク質配列に関する第２図につい
ては、以下のような観察が行なわれる。B.napus、B.exc
elsia及びA.thalianaについては、タンパク質及びDNAの
両配列が共に決定された。R.communisについては、タン
パク質配列のみが利用可能である。（B.napusはCrouch
他、1983年及びEricson他、1986年より;B.excelsiaは、
Ampe他、1986年、de Castro他、1987年及びAltenbach
他、1987年より;R.communisはSharief他、1982年よ
り）。囲みは、相同性を表わしており、高くなった点は
システインの位置を表わしている。
前駆体の初めのタンパク質配列と、シグナルペプチド
の標準的コンセンサス配列を比較すると、この前駆体
が、成熟タンパク質では存在しない１つではなく２つの
セグメントをアミノ末端基において有しており、そのう
ちの最初のものがシグナル配列であり（Perlman ＆ Hal
vorson、1983年）、第２のものはアミノ末端基処理済フ
ラグメントと呼称された（いわゆるATPE）。シグナル配
列は、小胞体の膜を横切っての未完成ポリペプチドの同
時翻訳輸送を確実に行なうのに役立ち（Blobel、1980
年）、これまでに研究されてきた全ての種子貯蔵タンパ
ク質を含む数多くのタイプのタンパク質内に見い出され
る（Herman他、1986年）。これは、タンパク質の適当な
区画化にとってきわめて重要である。タンパク質はさら
に、正しいジスルフィドブリッジが形成されるような形
で折りたたまれる。このプロセスはおそらく、酵素ジス
ルフィドイソメラーゼが局在化されている小胞体膜の管
腔部位に局在化される（Roden他、1982年;Bergman ＆ K
uehl、1979年）。小胞体膜を横切っての転座の後、ほと
んどの貯蔵タンパク質は前記小胞体を経由してゴルジ体
へと輸送され、次にそこから小さな膜で結合された小胞
（「密な小胞」）内をタンパク粒へと輸送される（Chri
speels、1983年;Craig ＆ Goodchild、1984年;Lord、19
85年）。シグナルペプチドが同時翻訳して除去されると
いうことはすなわちタンパク粒への種子貯蔵タンパク質
のそれ以上の輸送を検出するシグナルが、存在するタン
パク質配列の残りの部分にあるにちがいないということ
を暗に意味している。
2Sアルブミン類は、成熟ポリペプチド内には存在しな
いシグナル配列以外の配列を前駆体のアミノ末端に含ん
でいる。これは、全ての貯蔵タンパク質に一般的なこと
ではない。このアミノ末端基処理済フラグメントは、第
１図においてはProと、そして第２図ではATPFと標識づ
けされている。
さらに、第１図及び第1A図に示されているように、前
駆体内で小さなサブユニットと大きなサブユニットの間
に位置づけされているいくつかのアミノ酸は除去される
［第１図ではlink、第1A図ではIPFと標識づけされてお
り、IPFは内部処理フラグメント（internal processed
fragment）を意味する］。さらに、前駆体のカルボキシ
ル末端基からいくつかの残基が除去される［第１図はTa
il、第1A図ではCTPFと標識づけされており、CTPFはカル
ボキシル末端基処理フラグメント（carboxyl terminal
processed fragment）を意味する］。これら後者の処理
段階の細胞位置づけは不確かであるが、タンパク粒であ
る可能性が最も高い（Chrispeels、1983年;Lord、1985
年）。これらの処理段階の結果として、小さなサブユニ
ット（Sml.Sub）及び大きいサブユニットが残る。これ
らは、以下に述べるようにジスルフィドにより連結され
る。
種々の植物の2S−アルブミン類のタンパク質配列を比
較すると、強い構造的類似性がみられる。このことは、
さらに詳しくは、第２図及び第2A図で例示されている。
これらの図は以下のような異なる植物の代表的な2S−貯
蔵種子アルブミンタンパク質のそれぞれ小サブユニット
及び大サブユニットのアミノ酸配列を与えている： R.comm.;Ricinus communis A.thali;Arabidopsis thaliana B.napus;Brassica napus B.excel;Bertholletia excelsa（ブラジル産ナッツ） 第２図及び第2A図においては以下のことに留意しなく
てはならない。
− 前記サブユニットのアミノ酸配列は、複数のライン
上に広がっている。
− 例として示されている貯蔵タンパク質のアミノ酸配
列及び前記タンパク質のうちのいくつかの中の同様なア
ミノ酸のシステイン基は、垂直に整列させられている；
これらの配列のいくつかの中に現われるハイフン記号
は、アミノ酸欠損言い換えるとそれらととり囲む最も近
いアミノ酸の間の直接連結を表わしている。
− 異なるタンパク質においてはほぼ保存されているア
ミノ酸配列が、枠で囲まれている。
全ての配列は、Arabidopsis thalianaの2S−アルブミ
ンの実験により立証された真の構造を表わすというより
はむしろ（本論述を目的とした）仮想モデルを表わして
いる第３図に概略的に示されているようなジスルフィド
ブリッジ内に参与しうる８つのシステイン残基（小サブ
ユニット内に第１と第２のもの、残りは大サブユニット
内）を含んでいる、ということがわかる。かかる仮想モ
デルは、血清アルブミン（Brown、1976年）、アルファ
胎児タンパク（Jagodzinski他、1987年;Morinaga他、19
83年）及び、類似の一定のＣ−Ｃダブレット及びＣ−Ｘ
−ＣトリプレットがみられたビタミンＤ結合タンパク質
（Yang他、1985年）のような動物性アルブミンのジスル
フィドブリッジが媒介となったループ形成よりヒントを
得たものである。
さらに、システイン残基の間の距離は、大サブユニッ
ト内の第６と第７のシステイン残基の間の距離を除い
て、各サブユニット内でほぼ一定に保たれている。この
ことは、これらの配置が構造的に重要であるものの、こ
の第６と第７のシステインの間で大サブユニット内で或
る程度の変化が許されるということを示唆している。
本発明は、遺伝子導入植物の植物種子内のかかる修飾
貯蔵タンパク質の特性及び適切な処理の変化をひき起こ
さずに修飾されうるような貯蔵タンパク質の領域の決定
に基づいている。この領域（第３図に拡幅された斜線入
り部分で概略的に示されている）は、以下の例において
「超可変部」と呼ばれる。第３図はまた、前駆体の小サ
ブユニットと大サブユニットを分離する「IPF」セクシ
ョンならびに、タンパク質サブユニットのシステイン残
基のほぼ保持された部分内のアミノ酸の数（aa）を含め
て、前駆体配列の他の部分のそれぞれの位置も示してい
る。処理開裂部位は、▼という記号で示されている。
数多くの植物の種子は、上述の貯蔵タンパク質とほぼ
同じサイズのアルブミンを含んでいる。しかしながら文
言を簡略にするため、ここでは、第１図に示されている
全体的構造のペプチド前駆体をコード付けする遺伝子を
もち、ジスルフィドブリッジにより連結された２つのサ
ブユニットから成る最終的な形に処理される種子タンパ
ク質を指して、「2Sアルブミン」という語を用いる。こ
れは、以下に記述する方法がこのような2Sアルブミンの
みに適用できることを意味するとみなされてはならな
い。
問題の一定のポリペプチドを生成するための本発明に
従った方法は、 − 一世代又は複数世代にわたり、生成された植物細胞
から又はこの再生植物細胞から得られた植物の種子から
得た植物を栽培する段階、（なおここにおいて、かかる
植物内で複製可能なこの植物細胞の遺伝的遺産又は情報
には、種子特異的なプロモータの制御下に置かれた核酸
配列が含まれている。これは、かかる植物のシグナルペ
プチドを含む貯蔵タンパク質の前駆体の少なくとも一部
分をコード付けするmRNAに転写され、前記核酸は以下
「前駆体コード付け核酸」と呼ばれる） ・なおここで、かかる核酸には１つのヌクレオチド配列
（以下「関連配列」と呼ぶ）が含まれ、かかる関連配列
は、その中で自らをとり囲む未修飾部分と共に読みとり
段階においてオープンリーディングフレームを形成する
非相同核酸インサートにより修飾された可欠領域を含ん
でいる； ・かかるインサートは、前記問題のポリペプチドをコー
ド付けするヌクレオチドセグメントを含んでいる； ・前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサー
ト又は隣接する末端のいずれか又はその両方に属するヌ
クレオチドを有する単数又は複数のコドンにより、前記
関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結され
ている； ・前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列に
よりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質又は貯蔵タン
パク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲む選択
的に開裂可能な境界部位を構成する単数又は複数のアミ
ノ酸残基をコード付けする； − 栽培された植物の種子を回収し、その中に含まれて
いる雑種貯蔵タンパク質を抽出する段階； − 開裂部位レベルで前記雑種貯蔵タンパク質から問題
のペプチドを開裂させる段階；そして − 問題のペプチドを純化された形で回収する段階 を含んでいる。
上述の条件の下で、栽培された植物の各々全ての細胞
が修飾された核酸を含んでいることがわかるだろう。そ
れでも上述の組換え型つまり雑種の配列は、栽培された
植物の種子形成段階のみにおいて又はほとんどこの段階
において発現され、従って雑種タンパク質は大部分がこ
の種子内に生成されることになる。
上述の「非相同核酸インサート」は、少なくとも一部
分が当該種子又は植物の貯蔵タンパク質の前駆体をコー
ド付けする天然の核酸にとって外来性のものであるよう
なヌクレオチド配列を含むインサートから成る。最も一
般的には、問題のポリペプチドをコード付けするセグメ
ントはそれ自体、前記貯蔵タンパク質の前駆体をコード
付けする天然の核酸にとって外来性のものである。それ
でも、「非相同核酸インサート」という語は、上述の種
子又は植物細胞の遺伝的財産又は情報の中に通常存在す
る上述のようなセグメントを含むインサートをも含んで
いる。このとき前記インサートの「非相同」性は、その
両側でそれをとり囲み前記セグメントを前記前駆体をコ
ード付けする核酸の未修飾部分に連結する単数又は複数
のコドンに向けられているのである。上述の最後に示し
た状況の下で、本発明はこのように、植物の種子形成段
階またはその発育のその他の段階のいずれにおいても、
また種子のタンパク球内又は前記植物細胞の他のいずれ
の場所においてであれ、通常植物自体の中で作られる貴
重なタンパク質を生成し容易に分離し回収することを可
能にするような方法を提供している。
「問題のポリペプチド」は、通常、本発明に基づく方
法の最終段階において雑種貯蔵タンパク質から開裂され
たとき、生物学的特性のうち少なくともその問題の単一
のポリペプチド又はタンパク質によって処理されるべき
ものを保持又は回復するような単一のポリペプチド又は
タンパク質で構成される。問題のポリペプチドが保持す
べき特性の、制限的な意味をもたない一例として、酵素
活性又は治療効果、一定の抗体により認識されうる能
力、免疫学的特性例えば、生きた宿主内でかかる問題の
ペプチド又はこの「問題のポリペプチド」と同じ又は類
似したアミノ酸配列を含む抗原を含む病原性因子を中和
できる抗体を惹起（誘発）する能力などを挙げることが
できる。
ただし、「問題のポリペプチド」はまた、とくに何ら
かの望ましい生物学的活性をもつ個々のペプチド又はポ
リペプチドのユニットの反復をも含みうる。かかるユニ
ットは、生物学的なユニット又は反復を互いに分離する
ことができるようにしている開裂可能な部位の上又はそ
の中を通して互いに合わさっている。決定的なものでは
ないものの、このような開裂可能な部位は、「問題のポ
リペプチド」全体が雑種貯蔵タンパク質から開裂されう
るようにする上述のような「境界制限酵素」などの同じ
開裂手段と同一であるか又は、これに対して感応性をも
つという利点がある。実際、活性ユニットの互いからの
分離は、このとき上述の「開裂（切り出し）」オペレー
ションと同時に達成されうる。それでも異なるユニット
又は反復は、異なる開裂部位を通して結合される可能性
があり、こうしてこのユニットの互いの分離は、雑種貯
蔵タンパク質からの前記「問題のポリペプチド」の「開
裂」オペレーションの後に続いて行なわれうる。
当然のことながら問題のポリペプチド内の反復ユニッ
トの数は、本書中に規定されている条件の下で関連する
貯蔵タンパク質内に取り込まれうる問題のポリペプチド
の最大長さによって異なる。
本発明に基づく方法についての上述の定義づけにおい
て、前駆体をコード付けする前記核酸の関連配列のいわ
ゆる「可欠領域」は、未修飾の天然の貯蔵タンパク質の
ものに比べて結果として得られた上記雑種貯蔵タンパク
質の全体的構成が変わることなく、又、それ相応に修飾
された未完成雑種貯蔵タンパク質の上述のタンパク球内
への輸送に変化を与えることなく、上述のインサートを
その中に挿入するか又はかかるインサートで前記可欠領
域の少なくとも一部分を置換することによって修飾され
うるようなヌクレオチド配列をもつ領域から成る。
本発明においては、上述の前駆体コード付け核酸は当
然のことながら、本発明にて栽培されているものと同じ
植物種から出てきたものであってよい。しかしこれは
又、すでに登記されているBeachey他、1985年及びOkamu
ro他、1987年の教示に沿って、その他の植物種から出て
きたものであってもよい。
同様に、種子特異的プロモータは、同じ植物種からの
ものでも異なる植物種からのものでもよい。ただし、後
者の場合、宿主植物のポリメラーゼにそれを認識する能
力があることを条件とする。
貯蔵タンパク質内の可欠領域の位置づけについては、
どんな方法でも用いることができる。この領域がひとた
びタンパク質配列レベルで規定されると、前駆体コード
付け核酸の相応する領域を変えることができる。例え
ば、分子モデリングによる二次的及び三次的タンパク質
構造の設定に基づく方法を用いて、可欠領域を位置付け
ることができる。このようなモデルは、より高次の集合
におけるその構成又は相互作用にとってきわめて重要な
タンパク質の領域の識別を可能にする。このような技術
が無い場合、さまざまな植物種からの類似のタンパク質
のペプチド配列を比較することができる。前記ペプチド
配列が共通してもっている副配列（そしてこの一応の証
明のある事実は、有害な形でペプチドの構造、処理、細
胞内通過又はパッケージングに影響を及ぼすことなくこ
れらを修飾することはできないという仮定を裏づけるこ
とになる）、これらが、そのとき一定の非相同インサー
トによる修飾に適しているとみなされうる「可欠領域」
で構成されうるという仮定を裏づけるためには互いに異
なりすぎているような副配列とは、区別されうるもので
ある。
このようなアプローチは、異なる植物からのいくつか
の同じような貯蔵タンパク質の核酸配列又はタンパク質
配列が確認されている場合に可能である（2Sアルブミン
の場合のように）。このとき適切な方法には、アミノ酸
配列又は長さ或いはその両方における可変性を受けてい
るペプチド領域をコード付けする前記核酸領域を、逆に
前記いくつかの植物種の間でアミノ酸配列の大方の保存
を示している領域との比較において識別する作業が含ま
れている。研究中の貯蔵タンパク質がシステイン残基を
含み、さらにかかるシステインが、当該貯蔵タンパク質
の構造及びコンフォメーションの設定に重要な役割を果
たす可能性の中いジスルフィドブリッジに参加するとい
うことが考えられている又は実験データを通してすでに
わかっている場合、この方法は、このことを考慮に入れ
るように拡張されなくてはならない。この場合、システ
イン残基は貯蔵タンパク質の修飾により変えられた残基
のうちのいずれかであってはならず、類似タンパク質の
タンパク質配列の配列比較によってシステイン間の距離
（アミノ酸残基内の）が保持されていることがわかった
場合、この距離はその後のいかなる修飾によっても変え
られてはならない。このようにして選択されたタンパク
質配列内の前記可欠領域はこのとき、前駆体コード付け
核酸の相応する領域内に望ましいペプチド生成物をコー
ド付けする核酸セグメントを挿入することにより修飾す
ることができ、かかる修飾が達成された後、植物の発育
の種子形成段階において回収可能な種子内の修飾された
貯蔵タンパク質の発現を検定することができる。
１つの領域を修飾にもっていくことができるものであ
ると考えるか否か決定するため当業者が利用できるもう
１つの方法は、かかる修飾を行なうこと、そしてキメラ
タンパク質を経済的に有利な量だけ生成するには適切で
はないもののキメラタンパク質が安定していれば分析の
ため少量を生成するような複数の発現システムのうちの
いずれかでキメラ遺伝子を発現することから成る。この
ような実験においては、未修飾のタンパク質も対照とし
て発現させられなくてはならない。このようなシステム
としては（ただし制限的な意味無く）、Xenopus leaves
オオキスト（接合子嚢）（Bassener他、1983年）、植物
のクロロプラスト（葉緑体）内の一過性発現（Fromm
他、1985年）、酵母菌（Hollenberg他、1985年）、植物
のカルス（仮骨）及びAcetabularia（カサノリ属）シス
テムがある。後者のものは、ゼイン遺伝子の機能的分析
及びリジンをコード付けする配列によるその修飾のため
にBrown他（1986年）により用いられた。
修飾すべき植物細胞中に移入されるべき修飾された核
酸を生成するために、2S−タンパク質特に水溶性の2S−
タンパク質の前駆体をコード付けする前駆体コード付け
核酸を選択することは、既に記録されている理由によ
り、きわめて魅力のあることである。
第２図及び第2A図を見ればわかるように、タンパク質
の小さなサブユニット内では第１及び第２のシステイン
の間、タンパク質の大きいサブユニット内ではまず第５
と第６のシステイン間そして第７と第８のシステイン間
に介在している領域は、かなりの保存度つまり類似性を
示している。従って、これらの領域は、なんらかの形
で、植物の種子内で合成されたときのタンパク質の適切
なひだ形成及び／又は安定性にとってきわめて重要であ
る。
逆に、小サブユニットの終り、大サブユニットの最初
と終りにおけるようなその他の領域は、きわめて大きな
差異を示しているため、これらはタンパク質の最終的特
性に対し多大な影響を全く及ぼすものではないものと仮
定して保持することができる。重要であると思われない
領域は、大きなサブユニット内で、成熟タンパク質の第
６と第７のシステインの間にある領域の中央位置から成
る。図面（第２図）をみるとわかるように、B.napus
は、前にあるＱアミノ酸と後にくるＶアミノ酸の間にCK
QQM配列を有し、一方同じレベルで、A.thaliは同じ近隣
のseighbouring heighbouringアミノ酸の間で同様な配
列を全く有しておらず、B.excel及びR.coom.は、それぞ
れさらに短いCEQ及びCQペプチドを含んでいる。従っ
て、アミノ酸残基のレベルにおける類似性の欠如に加え
て、この領域を最長の2Sアルブミンでの置換及び最短の
2Sアルブミンにおけるアミノ酸付加又はその両方の延長
のために好適なものとしている長さの相違があるように
思われる。
同じ観察は、前記第６と第７のシステインの間の同じ
領域の最初の第３部分のほぼ終りのレベルにもあてはま
る：その他の例示された2S−タンパク質の相応する領域
に比べてその領域においてはるかに短いものであるR.co
mmunisの配列を参照のこと。
当業者の技能の範囲内にある実験によると、成熟タン
パク質の上述の第６及び第７のシステインに隣接するそ
の他のアミノ酸のうちのどれほどが、雑種タンパク質の
安定性及び適正な処理を妨げることなくさらに置換され
うるかがわかる。例えば、実験により、B.napusの上述
のGKQQM配列にその上流及び下流で隣接しているその他
のアミノ酸のうちのどれほどがさらに、正常なB.napus2
S−アルブミンの基本的特性を雑種タンパク質が失うこ
となしに、形成される可能性のある雑種タンパク質をさ
らに置換させること無く置換されうるか、がわかる。考
慮されている修飾は、好ましくは、関連するシステイン
例えば25−成熟タンパク質の第６及び第７のシステイン
に隣接する３つの好ましくは６つのアミノ酸に影響を与
えるべきではない。
当然のことながら、他の場所では甚だしい差異を示す
タンパク質の類似した部分を一列にすることが関わって
くるような任意の選択に基づく仮定に対しては用心しな
くてはならないということがわかる。それでも、かかる
比較はその他の遺伝学の分野においては、当業者に対し
て、異なるソースの類似したタンパク質において一方で
は局所的な構造的差異から他方では局所的類似性から、
（なお外来性の又は非相同性の配列により局所的に修飾
された同じタンパク質内に未修飾タンパク質の基本的特
性のいくつかを保持しなくてはならない場合に）かかる
タンパク質のどの部分が修飾できどの部分が修飾できな
いかを合理的に推測するための適切な指針を与えてくれ
るものである。
従って、確認の要はあるものの、１つのタンパク質又
はそのサブユニットのいずれの部分でも、異なるアミノ
酸配列を有するペプチドによる置換に適しているとみな
すことができる、ということが一応の証明ある事実と考
えられている。
本発明に基づく方法において用いられるべき適切な可
欠領域の選択は、同様に、問題のペプチドの長さによっ
ても左右される。従って基本的には本発明に基づく方法
は、長さがアミノ酸３〜100個の範囲にある生物学的に
活性のポリペプチドの生成を可能にする。この生物学的
に活性なポリペプチドは、植物性のものであってもよい
し、又は、細菌、菌類、藻類又は無せきつい動物又は哺
乳類のようなせきつい動物を源とする植物種非特異的な
ポリペプチドであってもよい。
関連貯蔵タンパク質例えば2S−タンパク質又はそのサ
ブユニットの適当な領域内に挿入されるべき配列（イン
サート）は、通常、この問題のポリペプチドをコード付
けするセグメントのみならず例えばプロテアーゼ又は化
学的処理により開裂可能な上述のアミノ酸接合部を形成
するアミノ酸又はペプチドをコード付けするコドン（或
いは又前駆体コード付け核酸の関連ヌクレオチド配列の
非修飾部分の隣接するヌクレオチドが適当にコドンを補
足することになった場合にはこのコドンの一部分）をも
含んでおり、このため問題のペプチドは後に、純化され
た2Sタンパク質から回収されうる。この接合部−配列
は、２本鎖オリゴマーとして、或いは又遺伝子の一部分
が使用可能である場合には、制限フラグメントとして作
ることができるが、後者の場合、開裂部位例えばプロテ
アーゼ開裂部位が一般に付加されなくてはならない。問
題のペプチドを縁どる配列の選択は、プロセスの最終段
階において、このペプチドを純化するために用いられる
べき技法に左右されるいくつかの要因に応じて異なる。
問題のペプチドは、問題のペプチドの配列が内部の類似
開裂部位を含んでいないことを条件として、いかなるタ
ンパク質分解印割部位でも側面に有することができる。
最後に、プロテアーゼ及び／又は化学的開裂試薬は、特
異的でかつ直ちに入手できなくてはならない。これら
は、アミノ末端及びカルボキシル末端の両方において挿
入された配列を適正に開裂しなくてはならない。例え
ば、プロテアーゼトリプシンは、アルギニン又はリジン
残基の後にプロリンがついていないと仮定して、これら
の前記の後で開裂する。従って、アルギニン又はリジン
残基のいずれも問題のペプチド内に存在しない場合（又
はこれらの残基の後にプロリンがついている場合）、こ
の配列は、これら２つのアミノ酸の１つをコード付けす
るコドンを側面に有することができる。このときペプチ
ドを、トリプシンを用いて雑種タンパク質から開裂させ
ることができ、その後に、余分なカルボキシル末端Arg
（アルギニン）又はLys（リジン）を除去するためエキ
ソプロテアーゼカルボキシペプチダーゼＢで処理がほど
こされる。同様にして、プロテアーゼendo−Lys−Ｃ（J
ekel他、1983年）は、リジン残基の後で開裂し、そのた
め、このプロテアーゼを用いて2Sアルブミンから開裂さ
れた形で２つのこのような残基の間にペプチドを１つ挿
入し、カルボキシペプチダーゼＢを用いて再び余分のリ
ジンを除去することができる。このような戦略は、2Sア
ルブミンが用いられる場合に特に有益である。というの
もそのリジン含有量が少ないために、わずかなフラグメ
ントしか生成されず、その結果純化が容易であるからで
ある。臭化シアンを、化学的開裂試薬の一例として用い
ることができる。この試薬による処理は、メチオニンの
カルボキシル側で開裂する。従って各々のケースについ
て、別々の戦略を展開しなくてはならないが、利用可能
なさまざまなプロテアーゼ開裂技法において同一の基本
原理に遵ずることが可能となっている。できるかぎり頻
繁に、戦略には経済的な市販のプロテアーゼ又は試薬が
用いられなくてはならず、又、純化作業段階数も制限さ
れていなくてはならない。さまざまな酸素による又は化
学的な開裂技術を再検討するためには、「酵素学諸法
（Methods in Enzymology）」の第19巻（1970年）及び
第47巻（1971年）を参照されたい。
最後に、Ｃ−末端アルファ・アミド構造をもついくつ
かのペプチドは、自然界に見い出される（アルファ−メ
ラノトロピン、カルシトニンその他;Hunt ＆ Dayhoff、
1976年参照）。この翻訳後修飾は、ペプチドの生物学的
活性にとってきわめて重要であるということがわかって
いる。かかるＣ末端でアミド化されたペプチドは、Ｃ−
末端グリシン残基のアミド基への形質転換により得るこ
とができる（Seiringer他、1985年）。従ってこのよう
なペプチドは、Ｃ末端グリシン残基を、純化後にアミド
基に形質転換されるペプチドに付加することによって2S
雑種タンパク質から生成され得る。
貯蔵タンパク質内に挿入されるべき領域の完全なタン
パク質配列が、問題のポリペプチド及び上述の開裂可能
な接合部を形成するペプチドのアミノ酸の両方を含めて
決定された時点で、かかるタンパク質配列をコード付け
するためのヌクレオチド配列が決定されなくてはならな
い。おそらくは絶対的に必要なことではないかもしれな
いが、コード付け核酸のコドン使用は、できるかぎり修
飾される遺伝子のものに類似しているべきである。当業
者は、かかるコドン使用を決定する適切なコンピュータ
解析手段を利用することができるだろう。
選択された前駆体コード付け核酸の一部分の代わりに
インサートを置換するため、又はこれを前記前駆体コー
ド付け核酸の適当な領域内に挿入するためには、適当な
いかなる遺伝子工学技法でも用いることができる。キメ
ラ遺伝子を作るためには、細菌内クローニングを伴う一
般的な試験管内組換え技術を用いることができる。以下
にさらに詳しく例示されるように、同じ目的のために部
位指向の突然変異誘発を用いることができる。現行の専
門的文献において開示されている技術に従って、植物細
胞の形質転換に適したプラスミドといったDNA組換え体
も生成することができる。これは又、最終的に、選択さ
れた前駆体コード付け核酸の関連部分によりコード付け
された雑種貯蔵タンパク質が表現されうるような形質転
換された植物細胞の生成にも適用できる。例として、こ
の目的のための適当な技術を開示している公開済みの欧
州特許出願明細書第116718号又は国際特許出願明細書WO
84/02913号（本書に参考文献として内含されている）を
参照することができる。
以上の詳述は、さらに詳しくは、一例として貯蔵2Sア
ルブミンの修飾を基礎として行なわれてきた。しかし、
それが分離されうる植物内でそれをコード付けするDNA
配列がすでに識別されている又は識別されうること、そ
してその中の可欠又は「超可変配列」がすでに検出され
ている又は検出されうることを条件として、本発明に基
づくプロセスは、他の沈降係数をもつその他のいかなる
タイプの2S−貯蔵タンパク質又はその他の貯蔵タンパク
質（例えば7S−11S及び−12S貯蔵タンパク質）或いは同
じものを用いた上で、実施することができるということ
もわかるだろう。
このようなその他の貯蔵タンパク質の例（例示を目的
とするものにすぎない）としては以下のようなものがあ
る［再検討のためにはHiggins（1984年）も参照のこ
と］： − エンドウ及びその他の豆類から分離できるレクチン
のような12Sタンパク質或いはすでに記録済みの2Sアル
ブミン又はエンドウ、ハッカダイコン又はひまわりから
分離できるその他の2Sアルブミンといった2Sタンパク質
などが考えられる、水溶性貯蔵タンパク質であるその他
のアルブミン； − Phaseolusから分離可能なフェゾリン、エンドウか
ら分離可能なヴィシリン、大豆から分離可能なコングリ
シニン、オート麦から分離可能なオート−ヴィシリンの
ような７−8Sグロブリンか、又はエンドウから分離可能
なレグミン、大豆から分離可能なグリシニン、ひまわり
から分離可能なヘリアンチンのような11−14Sグロブリ
ン、又は、インゲン豆、Arabidopsis及びおそらくは小
麦から分離可能なその他の11−14S−グロブリンが考え
られる、塩水中で可溶な貯蔵タンパク質であるグロブリ
ン； − とうもろこしから分離可能なゼイン、大麦から分離
可能なhordien、小麦から分離可能なグリアジン及びモ
ロコシ属から分離可能なカフィリンといったアルコール
可溶性貯蔵タンパク質であるプロラミン； − 低いpH条件下で可溶性をもち、小麦から分離可能な
貯蔵タンパク質であるグルテリン。
一例としてのみ挙げられたこれらの貯蔵タンパク質の
うちのいくつかは、システイン含有量が少ないものであ
る。それでも、同じグループの異なるタンパク質は、一
方では可変的な領域を示し、他方ではよりうまく保存さ
れた領域を示す。
言うまでもないことではあるが、これらの貯蔵タンパ
ク質は、相応する溶剤内でのそのそれぞれの特異的可溶
性に応じて、上述の雑種タンパク質の生成及び種子タン
パク質からそのそれぞれの純化のための適当なベクター
として用いることができる。
以上に一般的に開示されてきた手順は、問題のペプチ
ドをコード化するDNA配列を含む非相同性インサートに
よる上述のその他の貯蔵タンパク質のいずれかの可欠領
域の適切な修飾に、そして次に関連する植物の種子内に
おける問題のペプチドの配列を含む雑種タンパク質の生
成のために得られたキメラ遺伝子による関連する植物の
形質転換に適用され、これらは、かかる植物からの問題
のペプチドの回収に適用される。言うまでもないことで
あるが、当業者はあらゆる場合において、かかる問題の
ペプチドの最良の生産収量を達成するためには、既存の
技術のうちのいずれが、かかる修飾済植物の生産の各段
階レベルでのその必要性を最もうまく満たすことになる
かを選定することができることだろう。
これまでの記述は、さらに詳しく言って、一例とし
て、生物学的に活性なペプチドをコード付けするインサ
ートによる一定の貯蔵タンパク質の超可変領域の修飾を
基礎としてきた。しかし、当業者はインサートとしてか
かる生物学的に活性なペプチドの反復をコード付けする
配列を選ぶことができる。この場合、かかる生物学的に
活性なペプチドをコード付けする全ての配列は、純化の
間のその分離を可能にする選択的開裂部位をコード付け
する周縁配列により他から分離される。
例えば、相応する前駆体−コード付け核酸が配列決定
されたとき、一定の問題のポリペプチド又はその反復を
種子内で生成するための適切なベクターとして用いられ
うる貯蔵タンパク質の能力を利用するために、以下の方
法を用いることができる。このとき、かかる方法には、
以下の段階が含まれる： １）その一部を１つのインサートで置換することによっ
て或いはその中にこのインサートを挿入することによっ
て修飾されうるペプチド配列をコード付けする可欠領域
を含む（なおここでかかる修飾は、貯蔵タンパク質の構
成の保持と相容れるものである）前駆体コード付け核酸
の前記関連配列の１つを位置づけし、選択する段階 ２）前記関連配列の未修飾部分を適当なリーディングフ
レーム関係で前記前駆体核酸の選択された領域内に核酸
インサートを挿入する段階；なお、かかるインサートに
は、問題のポリペプチド又はその反復をコード付けする
一定のセグメント、そしてこのセグメントの下流及び上
流に、前記前駆体コード付け核酸内への挿入が達成され
た後問題のポリペプチド又はその個々の反復を互いに又
は貯蔵タンパク質又はそのサブユニットの関連部分内に
連結するアミノ酸接合部をコード付けするコドンの形成
に参加し（こうしてかかるアミノ酸接合部は問題のペプ
チドをとり囲む周縁部位を構成する）、それ自体特異的
ペプチダーゼなどによって選択的に開裂されるような、
適当なヌクレオチド、コドン又はヌクレオチドのトリプ
レットが含まれている。
３）完全な種子形成植物に再生されうる植物細胞の形質
転換に適したプラスミド内に得られた修飾された前駆体
コード付け核酸を挿入する段階。ここにおいて、かかる
挿入は、調節要素特に、それと結びつけられたオープン
リーディングフレームの前記植物の種子内での発現を提
供することのできる種子特異的プロモータの制御下に置
かれる）； ４）かかる修飾されたプラスミドで、かかる植物細胞の
培養物を形質転換する段階； ５）その超可変領域内に挿入された形で、問題のポリペ
プチド又はその反復をコード付けするセグメントの一定
の配列を有するキメラ貯蔵タンパク質の発現を検定する
段階、そしてこれが達成されると、 ６）得られた形質転換済み植物細胞から前記植物を再生
し、かかる植物を種子形成段階まで育てる段階； ７）種子を回収し、その中に含まれている貯蔵タンパク
質を抽出する段階； ８）例えば前述の特異的ペプチダーゼを用いて前記貯蔵
タンパク質を開裂させる段階、かなりの数のシステイン
残基を含む貯蔵2S−タンパク質の場合（今のところこの
貯蔵タンパク質が好ましい）、そしてさらに、異なる植
物内で同じ機能を果たししかもそれぞれ前記異なる植物
を源としている複数の類似したタンパク質の前駆体コー
ド付け核酸が利用可能であり、すでに配列決定された
（又は配列決定できる）場合、上述の一般的方法のステ
ップ１）は、以下のように実施することができる（ただ
し、以下に記されている一連のステップは、任意的なも
のであり、同じ結果を目的とする他のいかなる手順によ
ってでも置き換えることができる）、このとき前記「ス
テップ１）」は、次の作業を含む。
ａ）それぞれ複数の種子形成植物種において入手可能で
あり識別可能な前記植物貯蔵タンパク質のいくつかを選
択すること； ｂ）前記植物種の各々において前記植物貯蔵タンパク質
の前駆体をコード付けする前駆体コード付け核酸配列を
位置づけし、かかる前駆体コード付け核酸内において、
成熟貯蔵タンパク質をコード付けする配列又はかかる成
熟貯蔵タンパク質のサブユニットに対してコード付けす
る適当な副配列から成る関連ヌクレオチド配列を決定す
ること； ｃ）前記成熟タンパク質又はタンパク質サブユニット内
の連続したシステイン残基をコード付けするコドンの相
対的位置を決定すること、そして、前駆体コード付け核
酸の前記副配列内の前記コドンの上流、間及び下流に位
置づけされた相応する連続的核酸領域を識別し、さらに
かかる連続領域の中に、かかる複数の植物種内のアミノ
酸配列の大方の保存をまさに示しているようなその他の
領域と比較して、植物種同士でアミノ酸配列又はその長
さ又はその両方において可変性を受けているような部分
を識別すること（なお、かかるヌクレオチド領域の１つ
はこのとき、前記２）に開示されているように問題のペ
プチド又はその反復をコード付けするセグメントを含む
核酸インサートのその中への挿入のために選択され
る）。
この最後に記した本発明の実施態様は、１つの植物内
で雑種タンパク質の一部として問題の非相同ポリペプチ
ド又はその反復を作らせるにあたり、膜の転座の間に植
物タンパク質にジスルフィドイソメラーゼが通り、こう
して、その正常な前駆体状況におけるように雑種前駆体
内に正しいジスルフィドブリッジが形成される一方で問
題のポリペプチド又はその反復が、宿主微生物内に外来
性ペプチドを生成するための標準的遺伝子工学技術に関
して先に喚起したようなさまざまな欠点から守られる確
率が増加されることになる、ということを規定してい
る。
本発明はさらに、本発明に基づく方法において用いら
れる組換え型核酸自体特に以下のものに関する： − 前記方法の枠内で定義づけされてきた組換え型前駆
体コード付け核酸： − 他の植物のDNAからの前記前駆体コード付け核酸の
ものと同じDNAを源としているか否かには無関係の１つ
の種子特異性プロモータの制御下にある前記修飾された
前駆体コード付け核酸を含む組換え型核酸。
− ベクター、さらに詳しく言うと、例えば上述の植物
細胞の形質転換において用いるため前述の組換え型核酸
のいずれかにより修飾されたTi誘導のプラスミドといっ
た、植物プラスミド。
キメラ遺伝子にシグナル配列が無い場合（全ての貯蔵
タンパク質がそうであるように）適切なこのシグナル配
列を与えなくてはならない。
本発明は又、完全な植物に再生されうるような種子形
成植物細胞又はかかる種子形成植物の種子のいずれかで
形成されている、問題のポリペプチドの再生可能な供給
源にも関する。かかる供給源は、かかる植物又は種子
が、前記植物細胞の再生の結果として得られる植物の一
世代又は複数世代の結果として得られること、さらに前
記植物細胞又は種子の遺伝的情報を支持するDNAは、種
子特異的プロモータの制御の下に置かれた、前記植物の
貯蔵タンパク質の前駆体に相当するmRNA内に転写されう
る、シグナルペプチドをコード付けする配列を含めた１
つの核酸又はその一部部を含んでいること、そして 前記核酸配列には、成熟した貯蔵タンパク質をコー
ド付けする関連修飾配列又はこの成熟した貯蔵タンパク
質の単数又は複数のサブユニットに対してコード付けす
る複数の副配列のうちの１つが含まれていること； 前記関連配列の変更は、その可欠領域の１つの中で
起こり、関連配列の中で自らをとり囲んでいる未修飾部
分と読取り段階において１つのオープンリーディングフ
レームを形成する非相同核酸インサートで構成されるこ
と、 前記インサートには、前記問題のポリペプチドをコ
ード付けするヌクレオチドセグメントが含まれているこ
と； 前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサ
ート又は隣接する末端のいずれか又はその両方に属する
ヌクレオチドを有する単数又は複数のコドンにより、前
記関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結さ
れていること、 前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列
によりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質又は貯蔵タ
ンパク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲む選
択的に開裂可能な周縁部位を構成する単数又は複数のア
ミノ酸残基をコード付けすること を特徴としている。
本発明がこれに限定されているものとみなされてはな
らないが、問題のポリペプチド又はその反復をコード付
けする核酸インサートは、ほとんどの場合において、ウ
イルス又は細菌の遺伝子から又はウイルス又は細菌のRN
Aの誘導cDNAさらには非植物性真核生物遺伝子から誘導
されたオリゴヌクレオチド又は人工的合成ヌクレオチド
であり、これらは全て通常、その性質の如何に関わらず
生物学的プロセスを通して本発明に基づく植物細胞又は
種子の適切な場所に挿入される可能性が全く無いもので
ある。換言すると、これらのインサートは通常、とうに
遺伝的に全く関係が無く従って天然交雑プロセスを含む
標準的な生物学的方法によっていかなる遺伝的材料も交
換することができない異なる種類の植物の中に挿入され
うるという点で「植物種に非特異的」なものなのであ
る。
従って、本発明はさらに、前記形質転換された細胞又
は種子から得られた種子形成植物自体にも関するもので
ある。かかる植物は、それがその細胞内で種子プロモー
タと結びつけられている前記雑種前駆体コード付け核酸
を有していること、ただしほとんどかかる植物の種子の
中でかかるインサートが発現され相応する雑種タンパク
質が生成されていることをその特徴とする。
以下に、2S種子貯蔵タンパク質遺伝子の修飾、遺伝子
導入植物中でのその発現、2S貯蔵タンパク質の純化そし
て問題の生物学的に活性のペプチドの回収のために用い
ることのできる好ましい方法の概略を記す。ここに与え
られている方法の概略の後には、特定的な例が記されて
いる。当業者は、この方法をその他の2S種子貯蔵タンパ
ク質遺伝子の修飾のためにも適合させることができるも
のと思われる。
1.問題の配列による2S貯蔵タンパク質遺伝子の超可変領
域の置換又は補足 2SアルブミンのcDNA又はゲノムクローンのいずれでも
用いることができる。第２図の遺伝子の超可変領域の配
列の比較をみると、それらの長さが変わっていることが
わかる。従って問題の配列が短く、比較的短い超可変領
域を伴う2Sアルブミンが用いられる場合、問題の配列を
挿入することができる。そうでなければ超可変領域の一
部を除去して、その問題のセグメント又は配列、及び場
合によって周縁コドンを含むインサートによりこれを置
き換える。その結果得られる雑種貯蔵タンパク質は、修
飾された未修飾の天然タンパク質に比べ長いこともあれ
ば短いこともある。いずれの場合でも、次の２つの標準
的技法を適用することができる。すなわち、適当な制限
部位を利用するか又は突然変異誘発ベクターを用いる
（例えばStaussen他、1987年）かである。両方の場合に
おいて、メッセージのリーディングフレーム（読取り
枠）を維持するよう注意しなくてはならない。
2.変えられた2Sアルブミンコード付け領域を種子特異的
遺伝子プロモータの制御下に置く。
種子のみにおいて必ずその後の発現が行なわれるよう
にするため、種子特異的プロモータが用いられる。こう
して望まれる生成物の回収が容易になり、植物のその他
の部分に対する抑制の可能性を無くすることができる。
原則的に、修飾2Sアルブミンのプロモータを用いること
ができる。しかしこれは必ずそうでなくてはならないも
のではない。同じ目的に役立つものであればその他のい
かなるプロモータでも用いることができる。プロモータ
は、形質転換されるべき植物種におけるその効率レベル
に応じて選択することができる。以下の例においては、
大豆からのレクチンプロモータ及びArabidopsisからの2
Sアルブミンプロモータが用いられている。キメラ遺伝
子の構造によっては、そのプロモータが使用中である遺
伝子から又は修飾された遺伝子から、単一ペプチドコー
ド付け領域も同様に含み入れられなくてはならない。キ
メラ遺伝子の実際の構築は、標準的な分子生物学技法を
用いて行なわれる（例を参照のこと）。
3.キメラ遺伝子構造を、適当な宿主内に移入する。
キラメ又は修飾遺伝子構造が完成すると、これは、植
物形質転換ベクター内へと全て移入させられる。アグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tume
faciens）から誘導された無力化された（非催腫瘍性
の）Ti−プラスミドに基づく多種多様のものが、二元性
形及び同時組込み形の両方で利用可能である（De Blaer
e他、1987年）。一般に抗生物質耐性があり、形質転換
用の選択可能な標識を含むベクターを選ばなくてはなら
ない。同様に、植物形質転換の方法も数多くあり、個々
の植物に適合されている。その大部分は、原形質体形質
転換（Marton他、1979年）又は成体植物からの組織小片
の形質転換（Horsch他、1985年）に基づくものである。
以下の例においては、ベクターは、二元性の無防備のTi
−プラスミドベクターであり、標識は、カナマイシン耐
性のあるものでリーフディスク形質転換方法が用いられ
ている。
形質転換手順からのカルスは、選択可能な標識に基づ
いて選択され、適切なホルモン導入により成体植物に再
生される。これも又、使用されている植物の種に応じて
変化する。再生された植物は次に種子を収穫できるよう
な安定した系統を作り上げるのに用いられる。
4.生物学的に活性なポリペプチドの回収。
2S植物アルブミンの純化は、充分に実証されている
（Youle及びHuang、1981年;Ampe他、1986年）。これは
成熟した種子内の主要なタンパク質であり、水性緩衝液
中で高い可溶性を示す。2S貯蔵タンパク質の典型的な純
化には、以下のようなステップが関与してくる:1）ドラ
イアイス内での種子の均質化及びヘキサンでの抽出;2）
高塩分緩衝液での抽出及び精製水に対する透析（汚染グ
ロブリンを析出させる）;3）ゲルろ過クロマトグラフィ
による水溶性分画の付加的な純化（これによりより小さ
な2S貯蔵タンパク質がより大きな汚染物質から分離され
る）；そして４）イオン交換クロマトグラフィによる最
終的純化。使用される正確な方法は、ここで記される技
法にとって決定的な重要性をもつものではなく、ゲルろ
過、イオン交換及び逆相クロマトグラフィ及びアフィニ
ティ又はイムノアフィニティクロマトグラフィを含む、
広範な古典的技法を、キメラ2Sアルブミンを純化するた
めそしてそれがアルブミンから開裂された後生物学的に
活性なペプチドを純化するための両方に適用することが
できる。この開裂のために用いられる正確な技術は、側
面にある配列（上記参照）の設計の時点で決定される戦
略によって決められる。2Sアルブミンは、プロテアーゼ
に対し幾分か抵抗性を有するため、プロテアーゼ処理の
前に往々にして変性ステップを含み入れるべきである
（例を参照のこと）。
5.生物学的に活性なペプチドの検定。
回収された生成物についての検定は明らかに、生成物
自体によって異なる。植物の初期スクリーニングのため
には、問題のペプチドの存在を検出するのに免疫学的検
定を用いることができる。望まれる生成物に対する抗
体、往々にして、それがなお雑種2Sタンパク質の一部分
である間ででも機能する。そうでない場合には、これは
雑種から部分的又は完全に解放されなくてはならず、そ
の後でペプチド混合物を用いることができる。抗体を用
いたスクリーニングは、古典的なELISA技法（Engvall
＆ Pesce、1978年）によって行なわれるか又は、以前に
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されたタン
パク質のニトロセルロースブロットに基づいて行なわれ
る（ウエスタンブロット法、Towbin他、1979年）。純化
されたペプチドはさらに、アミノ酸の組成及び配列分析
により分析され、その同一性が確認される。
生物学的活性についての生物学的検定は当然のことな
がら、問題の最終的ペプチドの性質及び機能によって左
右される。
本発明はまた、適当なベクターとして植物の種子貯蔵
タンパク質を用いた、生物学的に活性でありうる標識づ
けされたタンパク質の生成にも適用できるということ
も、理解しなくてはならない。この場合、上述の項目
３）に記されている、得られた形質転換体の植物再生
は、標識づけされた炭素源（13C）及び／又は、窒素源
（15N）及び／又は水素源（2H）及び／又は硫黄源
（35S）及び／又はリン光体源（32P）が形質転換された
成長中の植物に対して与えられるべき条件の下で起こら
なくてはならない。（Kollman他、1979年;Jung ＆ Jett
ner、1972年、De Wit他、1978年）。
本発明の付加的な特徴は、とくに以下の添付の図面に
基づいた、制限的な意味の無い特定の例の開示を通して
明らかになるものと思われる： − 第１図、第1A図、第2A図、第２図及び第３図は、す
でに上述のような2S−貯蔵タンパク質の全体的特長を示
している。
− 第４図は、以下に指示されているように得られたpB
N2S1プラスミドから得たブラジルナッツの2S−アルブミ
ンの配列の一部分とその関連要素を表わしている。
− 第５図は、他の図面に示されている構成内で用いら
れている制限部位を表わしている。
− 第６図及び第７図は、１つの前駆体をコード付けす
る核酸を含む制限フラグメントを含むキメラプラスミド
の構成の連続的段階を図式的に示している（なお、かか
る核酸は本書において「前駆体−コード付け核酸」と呼
ばれ、この全体は、特に部位指向性をもつ突然変異誘発
を通して問題のポリペプチドをコード付けするDNAの挿
入による変更に適している）。
− 第８図は、上述の部位指向性の突然変異誘発の実施
に適したプラスミドの制限部位及び遺伝地図を示してい
る。
− 第９図は、一般に適当な場所での核酸の変更に適用
できるようなStanssens他（1987年）の部位指向性突然
変異誘発手順のさまざまな段階を図式的に示している。
− 第10図、第11図及び第12図は、以下の開示において
例としてロイ・エンケファリンが用いられているような
１つの問題のポリペプチドをコード付けするインサート
を、その前駆体核酸配列の可欠領域内に含み込むため、
この前駆体核酸を含む上述のキメラプラスミドを変更す
る諸段階を、図式的に示している。
− 第13図は、Arabidopsis thaliana2Sアルブミン遺伝
子を含む1kbフラグメントの配列を表わし、関連する要
素を示している。
− 第14図は、上述のArabidopsis2Sタンパク質の大き
なサブユニットのタンパク質配列を、関連するオリゴヌ
クレオチド配列と共に提供している。
− 第15図は、pGSC1703の制限地図を示している。
− 第16図は、pGSC1703Aの制限地図を示している。
− 第17A図は、C4カラム上での、標識として用いられ
た合成ペプチドYGGFLKのアリコートのクロマトグラムを
表わしている。勾配（破線）は０％の溶剤で０〜５分で
平坦であり、溶剤Ｂは70分で100％に達するべく増大す
る。溶剤A:水中0.1％TFA;溶剤B:70％CH3CN中0.1％のTF
A。
− 第17B図は、第17A図で行なわれたものと同じ条件下
での酸化された2S上のトリプレシン（tryptic）消化の
クロマトグラムを表わす、斜線のついたピーク部を収集
して、さらに純化を行なった。
− 第18B図は、C18カラム上での、標識として用いられ
た合成ペプチドYGGFLKのアリコートのクロマトグラムを
表わす。勾配（破線）は０％溶剤にて０分〜５分の間平
坦であり、溶剤Ｂは70分で100％に達するべく増大す
る。溶剤A:水中0.1％TFA;溶剤B:70％CH3CN中0.1％TFA。
− 第18図は、C4カラム上でHPLCから得られたピークを
含むYGGFLKの18カラム上での再クロマトグラフィを表わ
す（第17B図を参照）。実施条件は、第18A図の場合と同
じである。
− 第19図は、YGGFLK上のアミノ酸配列の決定の結果を
表わす、左角の囲みは、PTHアミノ酸の標準を示す（各
々20pモル）。サイクル１〜６についての信号は、基準
より８倍減衰されている。
− 第20A図は、マーカーとして用いられるYGGFLペプチ
ドを示すクロマトグラムである。このペプチドは合成ペ
プチドYGGFLKに対するカルボキシペプチダーゼＢ消化の
結果である。実施条件は、第17A図の場合と同じであ
る。
− 第20B図は、植物材料から分離されたYGGFLKペプチ
ドに対するカルボキシペプチダーゼＢ消化の後の、☆印
で表わされたIGGFLペプチドの分離を示している。
− 第21図は、超可変領域のほぼ全ての欠失及びそのAc
c I部位での置換、以下の開示に例として与えられてい
る開裂部位及びGHRFをコード付けする配列の、特に部位
指向性突然変異誘発を通してのAcc I部位内への挿入な
らびに、植物の形質転換に適した植物ベクター内の前記
キメラ遺伝子のクローニングを含む、キメラ2Sアルブミ
ンのArabidopsis thaliania遺伝子の構成の連続的段階
を、図式的に示している。
− 第22A図は、GHRFS及びGHRFL遺伝子の構成に用いら
れる８つのオリゴヌクレオチドを示している。オリゴヌ
クレオチドの限界は垂直線で表わされ、かかるオリゴヌ
クレオチドの上下の数字はその番号を示す。オリゴヌク
レオチド４及び８において、囲み内に入っている塩基は
除外され、結果としてGHRFSをコード付けする遺伝子が
得られる。このGHRFSとGHRFLのペプチド配列及び、CnBr
開裂部位を与えるメチオニン配列は、DNA配列の上に示
されている。
− 第22B図は、修飾されたAT2S1遺伝子のAcc I部位及
び、オープンリーディングフレームが維持されるように
するこのAcc I部位内への前記GHRFの挿入を示してい
る。
例１ 記述されている方法の第１の例としてヒトの脳及びそ
の他の神経繊維内においてアヘン剤活性をもつペンタペ
プチドであるロイ・エンケファリンの生成のための手順
が示される。（H.Ughes他、1975a）。ペプチド及び特異
的プロテアーゼの開裂部位をコード付けする合成オリゴ
マーが、Bertholletia excelsa（ブラジルナッツ）の2S
アルブミンをコード付けするcDNAクローン内で超可変領
域の一部と置換される。このキメラ遺伝子は、大豆のレ
クチン遺伝子のプロモータ及びシグナルペプチドコード
付け領域を含むフラグメントに融合させられる（Goldbe
rg他、1983年）。この構成全体を、アグロバクテリウム
を媒介にした形質転換システムを用いてタバコに移入
（転移）させる。この植物を再生させ、開花の後種子を
収集し、2Sアルブミンを純化させる。
オリゴヌクレオチド内に組み込まれた開裂部位をもつ
２つの特異的プロテアーゼを用いて、2Sアルブミンから
エンケファリンペプチドを開裂させ、次にHPLC技法を用
いてこれを回収する。
1.cDNAの合成及びスクリーニング Harris及びDureにより記述されている方法（1981年）
を用いてブラジルナッツのほぼ成熟し種子から全RNAを
分離する。次に、オリゴdTクロマトグラフィを用いてポ
リＡ＋RNAを分離する（Maniatis他、1982年）。いくつ
かの公開されている方法のいずれか（Maniatis他、1982
年;Okayama ＆ Berg、1982年;Land他、1981年;Gubler
＆ Hoffman、1983年）を用いて、cDNAの合成及びクロー
ニングを行なうことができる。この事例においては、ブ
ラジルナッツからの2Sアルブミンが配列決定され（Ampe
他、1986年）、アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチ
ドが構築された。これは、Maniatis他（1982年）の方法
を用いて作られたcDNAライブラリをスクリーニングする
のに用いられた。結果として得られたクローンはあまり
にも短すぎることがわかり、Gubler及びHoffman（1983
年）の方法を用いて第２のライブラリを作り、第１のよ
り短いcDNAクローンを用いてスクリーニングさせた。ブ
ラジルナットの2Sアルブミン配列を含むDNA組換え体を
分離した。後者をさらに、プラスミドpUC18内でクロー
ニングさせた［Yanisch−Perron,C.,Vieira,J.及びMass
ino,J.（1985年）、「Gene（遺伝子）」33、p103〜11
9］ 回収されたプラスミドをpBN2S1と呼称した。誘導され
たタンパク質配列、DNA配列、置換されるべき領域及び
関連する制限部位は、第４図に示されている。
導き出されたタンパク質配列（プラスミドpBN2S1から
得られたもの）は、DNA配列の上に示され、タンパク質
分解処理部位が示されている（第４図）。シグナル配列
の終りは、ａで表わされている。第６図、第７図、第10
図、第11図及び第12図中の構造にて用いられている制限
部位が表示されている。構造の後半部分内で用いられる
Pst I部位を表示する目的で、クローニングベクターの
ポリリンカーが示されている。挿入されるべきペプチド
のタンパク質及びDNA配列は、突然変異誘発に用いられ
るべきオリゴヌクレオチドの残りと共に、cDNA配列の下
に示されている。突然変異異誘発手順の間、図示されて
いるオリゴヌクレオチドは、cDNAの反対側のストランド
に対し交雑される（第10図参照）。
2.キメラ遺伝子の構成。
まず、大豆のレクチン遺伝子のシグナルペプチドとプ
ロモータをコード付けするDNAフラグメントに2Sアルブ
ミン遺伝子を融合させる。レクチン及びブラジルナッツ
の両方の中のシグナルペプチドの開裂点は、標準的コン
センサスシーケンスから誘導される（Perlman ＆ Halvo
rson、1983年）。以下にそして第４図内に、関連配列が
示されている： プラスミドpLe1、pSOYLEA1及びpBN2S1内のシグナルペ
プチド／成熟タンパク質配列の領域内のタンパク質配列
及び２本鎖DNA配列が第５図に示されている。図面に示
されている構造において用いられる制限部位の位置及び
認識部位が示されている。☆印は、シグナル配列の終り
のタンパク質開裂部位を表わす。
構成の出発点は、大豆のゲノムHind IIIフラグメント
を含むプラスミドpLe1（Okamuro他、1987年）である。
このフラグメントには、大豆レクチン遺伝子全て、その
プロモータ、種子特異的発現にとって重要でありうるプ
ロモータの上流の配列が含まれている。このフラグメン
トから、適当な大豆レクチンプロモータ／シグナル配列
のカセットが、第6a図に示されているように構成され
た。Dde I部位は、シグナル配列（SS）をコード付けす
る配列の終りにあり、その印割部位（C/TCAG）はプロセ
シング部位に相当する。このプロセシング部位において
有効な制限部位を得るために、SS配列のKpn I−Dde Iフ
ラグメント（以下「SS」と呼ぶ）をpLE1から分離し、そ
れ自体Kpn I及びBgl IIで線形化されたpLK57へクローニ
ングする（Botterman、1986年）。Dde I及びBgl IIの末
端には、KlenowDNAポリメラーゼＩを満たす。これはBgl
II部位（A/GATCT）を再構成し、その開裂部位はこのと
きシグナル配列処理部位に相当する（第６図、7a図参
照）。このようにして得られたプラスミドpSOYLEA1は、
従って、プラスミドpLK57から成り、ここにおいて当初p
LE1内に含まれていたSS配列のKpn I−Dde Iフラグメン
ト（SS）はpLK57の初期Kpn I−Bgl IIフラグメントで置
換されている。Hind III部位は、第４図に図式的に示さ
れているように、pSoyLea1内の（１）で表わされたPst
I−Kpn Iフラグメントの代りにpLK69からの前記Hind II
I部位を含むKpn I−Pst Iフラグメントを置換すること
により、このフラグメントの前に置かれている。この中
間構成はpSoyLea2と呼ばれる。第２段階においては、pS
oyLea2内にpLE1のHind III−Kpn Iフラグメント（２）
を挿入することによりレクチンプロモータを再構成す
る。このプロモータフラグメントの上流には別のBgl II
部位があるため、レクチンプロモータ／シグナル配列カ
セットは、このときBgl II−Bgl IIフラグメントとして
プラスミドpSoyLea3中に存在する。
このカセットはこのとき、プラスミドpBN2S1の205bp
ブラジルナッツcDNAフラグメントとレジスタ内で融合す
る。なおこれは、ブラジルナッツのプロ−2Sアルブミン
に対するコード付け配列（すなわちシグナル配列を除く
前駆体分子全て）を含んでいる。このことは、第５図に
示されているとおりに行なわれる。Bgl IでのcDNAクロ
ーンpBN2S1の消化（第４図）、Bgl I突出末端を切除す
るためのKlenowDNAポリメラーゼＩでの処理及びPst Iで
の消化の後に得られた205bpフラグメントは、Sma I及び
Pst Iでの消化により線形化されたpUC18へクローニング
される（Yannish−Perron他、1985年）。結果として得
られたプラスミドpUC18−BN1は、両末端共に充てんされ
再結紮されているEcoR I及びAva Iの両方で消化され
る。その結果、最初にEcoR I部位をもつ望ましいブラジ
ルナッツコード付け配列を含むp1UC18−BN2と呼ばれる
新しいプラスミドが再構成されることになる（第７
図）。
レジスタ内のブラジルナッツコード付け配列をレクチ
ンプロモータ／シグナル配列カセットに融合するため
に、pUC18−BN2はEcoR Iで消化され、末端は、dATPのみ
が存在する中でKlenow酵素を用いて部分的に充てんされ
る。残りの張出しヌクレオチドはS1ヌクレアーゼで除去
され、その後Pst I消化が行なわれる。こうして１つの
鈍端と１つのPst I消化末端をもつフラグメントが生み
出される。レクチンプロモータ／シグナル配列フラグメ
ントは、充てんされたBgl II末端をもつEcoR I−Bgl II
フラグメントとして、pSoyLea1（第７図）からとられ
る。これら２つのセグメントはPst I−EcoR I消化され
たpUC18で合わせて結紮される。この結果、シグナルペ
プチドコード付け配列とブラジルナッツ配列の接合部に
再構成されたBgl II部位をもつpUC18SLBN1が得られる
（第７図）。従ってpUC18SLBN1は、pSoyLea1のBgl II−
EcoR Iフラグメント（第６図に（３）として示されてい
る）そしてその転写方向上流にはpUC18BN2により供給さ
れブラジルナッツプロ−2Sアルブミンに対する205bpcDN
Aコード付け配列を含むEcoR I−PstEcoR Iフラグメント
が中に挿入されてしまっているpUC18プラスミドで構成
される。
しかしながら、読みとり枠は適切に維持されていな
い。これを補正するために、このプラスミドをBal IIで
線形化し、S1ヌクレアーゼで処理し、再結紮する。この
中間体をpUC18SLBN2と呼ぶ。この構成は最後に、pSoyLe
a3からのプロモータの５′部分を担うKpn Iフラグメン
トを挿入し、pUC18SLBN3を生み出し、pBN2S1からのブラ
ジルナッツcDNAの３′部分を含むPst Iフラグメントを
後者に挿入することにより、２段階の作業にて完成され
る。その結果得られた最終的構成pUCSLBN4は、BamH Iフ
ラグメント内に含まれているレクチンプロモータ／シグ
ナル配列−ブラジルナッツcDNA配列の融合物を含んでい
る。
3.エンケファリン及びプロテアーゼ開裂部位をコード付
けする配列での超可変領域の一部分の置換。
ロイ−エンケファリンペプチドはTyr−Gly−Gly−Phe
−Leuの配列を有する（Hughes他、1975b）。純化後の雑
種2Sアルブミンから無傷のポリペプチドを回復すること
ができるように、リジンをコード付けするコドンを、エ
ンケファリンコード付け配列のいずれかの側に置く。こ
うすることによって、下流の処理段階においてひきつづ
き、エンドペプチダーゼエンドリジン・Ｃ及びカルボキ
シペプチダーゼＢ、2Sアルブミンからエンケファリンポ
リペプチドを開裂することができる。最後に、突然変異
誘発の間に、オリゴヌクレオチドが間隙ある二本鎖分子
に交雑できるようにするため（以下参照）、保持すべき
ブラジルナッツ配列に対し相補的な追加配列を含み入れ
る。複数の植物貯蔵タンパク質遺伝子におけるコドン使
用を研究した後決定されたオリゴヌクレオチドの正確な
配列は以下のとおりである： ５′−GCAACAGGAGAAGTACGGTGGATTCTTGAAGCAGATGCG−
３′ ブラジルナッツ2Sアルブミンの超可変領域をコード付
けする配列の一部分の置換は、プライマとしてオリゴヌ
クレオチドを用い部位指向の突然変異誘発を使って行な
われる（第４図及び第10図）。Stanssens他（1987年）
のシステムが用いられる。
Stanssens他の方法は第９図に図示されており、以下
に再現する。これは、その制限及び遺伝子地図が第８図
に示されその主な特長も又以下に再現されているような
プラスミドpMac5−８を用いる。
pMac5−８の関連する遺伝子座は、第８図に示されて
いる。矢印は、その機能的方向性を示す。fdT:ファージ
fdの中央転写終結信号（ターミネータ）;F1−ORI:繊維
状ファージ（f1）の複数起点;ORI;Co/E1タイプの複数起
点;BLA/ApR:β−ラクタマーゼに対しコード付けする領
域;CAT−CmR:クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼに対しコード付けする領域。pMc5−８（bla−a
m遺伝子はSca I部位をもたない）及びpMc5−８（cat−a
m:突然変異は単一のPvu III部位を除去する）内に存在
するアンバー突然変異の位置が示されている。supE及び
supF宿主の両方におけるcatアンバー突然変異の抑制の
結果、少なくとも25μg/mlのCmに対する耐性が得られ
る。pMc5−８は、それぞれsupE及びsupF菌株でのアンバ
ー抑制の時点で±20μg/ml及び100μg/mlのApに対する
耐性を与える。野生型cat遺伝子内に存在するEcoR I、B
al I及びNco I部位（星印で示されている）は、突然変
異技術を用いて除去された。
以下に記されているように、ここで例示されている2S
−アルブミン領域の選択された超可変領域に対するロイ
−エンケファリンペプチドの置換に対しても適用される
ようなこのStanssens方法の原理も同様にまず、以下に
再現される： 基本的に、上述の置換のために用いられる突然変異誘
発の１ラウンドは、以下のように進行する。閉じた円で
Ap及びCm選択可能標識内のアンバー突然変異が示されて
いる第９図を参照する。 の記号は、突然変異誘発オリ
ゴヌクレオチドを表わす。突然変異自体は矢印の頭で示
されている。
このプロセスの個々の段階は、以下のとおりである： − 標的DNAフラグメントのpMa5−８へのクローニング
（Ｉ）。このベクターは、CmR遺伝子内のアンバー突然
変異を続行し、アンピシリンに対する耐性を規定する； − 偽ウイルス粒子からのこの組換え体の一本鎖DNAの
調製（II）； − 相補的pMc型プラスミドからの制限フラグメントの
調製（III）。pMc型ベクターは、Ap耐性標識内にアンバ
ー突然変異がとり込まれている一方で、野生型CmR遺伝
子を含んでいる； − 試験管内DNA/DNA交雑による間隙二本鎖DNA（以下gd
DNAと呼ぶ）の構成（IV）。gdDNA内において、標的配列
は一本鎖DNAとして露出される。交雑のその他のコンポ
ーネントからのgdDNAの予備的純化は必要でない； − gdDNAへの合成オリゴヌクレオチドのアニーリング
（Ｖ）； − 同時試験管内DNAポリメラーゼ/DNAリガーゼ反応に
よる残りの間隙の充てんならびにニックのシーリング
（VI）； − Cm耐性について選択する、mutS宿主、すなわち誤対
合修復において欠失している菌株の形質転換。この結
果、混合プラスミド後代が生成される（VII）； − アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の
再形質転換による鋳型ストランド（pMa型）から誘導さ
れる後代の除去（VIII）。Cm耐性に関する選択の結果、
間隙あるストランドすなわちその中に突然変異誘発オリ
ゴヌクレオチドが取り込まれているストランドから誘発
された後代が豊富になる； − 望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結
果として得られたクローンのスクリーニング。
第９図に描かれている突然変異誘発実験において、Cm
耐性は、合成標識のための間接的な選択として用いられ
る。明らかに、Ap選択可能な標識が開発利用されるよう
に、実験をセットアップすることもできる。後者の場
合、一本鎖鋳型（II）及びフラグメント（III）はそれ
ぞれpMc及びpMa−型である。単一の突然変異誘発プロセ
スは、望ましい突然変異の導入のみならずプラスミドの
pMa型からpMc型への又はその逆の変換という結果をもた
らす。従って、これら２つの形態の間の循環（アンピシ
リン又はクロラムフェニコールに対する抵抗性について
の交互選択も含む）を用いて、連続する突然変異誘発ラ
ウンド中に標的配列内で多くの突然変異を構成すること
ができる。
ここで、ブラジルナッツ2Sアルブミンの超可変領域を
コード付けする配列の一部分の置換に関する本例に戻る
と、Stanssens他のシステムは以下のように適用され
る： 問題の領域を含むキメラ遺伝子のPst I−EcoR Iフラ
グメント（第10図、第11図及び第４図参照）を、アンバ
ー突然変異を伴うクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子と無傷のベータラクタマーゼ遺伝子
を運ぶpMaベクター内に挿入し（第10図）、出発プラス
ミドがアンピシリン耐性のみを付与し、クロムフェニコ
ール耐性を付与しないようにする。一本鎖DNA（第４図
に示されているものと反対のストランドを表わす）を調
製し、EcoR I−Pst I線形化形状のpMc型プラスミドでア
ニーリングし、間隙ある二本鎖分子を生成する。オリゴ
ヌクレオチドをこの間隙二本鎖にアニーリングする。一
本鎖間隙を、KlenowDNAポリメラーゼＩで充てんし、結
紮し、混合物を適切な宿主に形質転換させる。望ましい
突然変異を有するコクローンは、アンピシリンに対し敏
感であるが、クロムフェニコールに対する耐性をもつ。
クロラムフェニコール耐性をもつ形質転換体を選び、DN
A配列づけにより分析する。最後に、pUC18SLBN4内のPst
1−Nco IフラグメントをpMC58BNからの突然変異誘発さ
れたものと置換することにより、雑種遺伝子フラグメン
トをレクチン／ブラジルナッツキメラに挿入し直す（第
11図）。結果として得られたプラスミドpUC18SLBN5は、
全てBamH Iフラグメントとして、雑種ブラジルナッツ−
エンケファリン遺伝子に融合されたレクチンプロモータ
及びシグナルシーケンスを含む。
4.タバコの形質転換 キメラ遺伝子を含むBamH Iフラグメントを、二元性ベ
クターpGSC1702のBamH I部位内に挿入する（第12図）。
このベクターは、大腸菌（E.coli）及びA.tumefaciens
の両方における安定性及び選択のための官能基ならびに
Ｔ−DNAフラグメントとして外来性DNAの植物ゲノムへの
転移のための官能基を含んでいる（Deblaere他、1987
年）。後者は、オクトピンＴ−領域の末端反復配列から
成る。フラグメントがクローニングされるBamH I部位
は、Ｔ−DNA遺伝子７のポリアデニル化シグナルの前に
ある。ノパリン合成（nos）プロモータ、ネオマイシン
フォスフォトランスウェラーゼタンパク質コード付け領
域（nos）及びOCS遺伝子の３′末端基から成るキメラ遺
伝子が存在するため、形質転換された植物はカナマイシ
ン耐性をもつことになる。標準的な手順（Deblaere他、
1987年）を用いて、プラスミドを、プラスミドpGV2260
をもつアグロバクテリウム菌株C58C1Rifに転移させる。
後者は植物のゲノムへＴ−DNA領域をうまく転移させる
のに必要とされるin trans及びvir遺伝子官能基を与え
る。次にこのアグロバクテリウムを用いて、標準の手順
により菌株SR1のタバコを形質転換する（Deblaere他、1
987年）。100μg/mlのカナマイシン上でカルスを選択
し、耐性あるカルスは、植物を再生するのに用いる。こ
れらの植物から調製されたDNAを、ブラジルナッツの2S
アルブミンクローン又はオリゴヌクレオチドとの交雑に
より雑種遺伝子の存在についてチェックする。陽性の植
物を生育させ、以下に記されているように処理する。
5.種子からの2Sアルブミンの純化 陽性の植物を生育させ種子を生じさせる。これには約
15週間が必要である。個々の植物の種子を収穫しドライ
アイス中で均質化（ホモジナイス）し、ヘキサンで抽出
する。残留物をLaemmli標本緩衝液に溶かし、沸とうさ
せ、SDSポリアクリルアミドゲル上に置く（Laemli、197
0年）。分離させたタンパク質をニトロセルロースシー
ト上にて電気ブロットし（Towbin他、1979年）、ロイ−
エンケファリン抗原の市販の多クローン性抗体で検定す
る（UCBcat、fi72/001、ib72/002）。
上述の免疫学的検定を用いて、強度に陽性の植物を選
択する。次にこれらをさらに大量に育て、種子を収穫す
る。ヘキサン粉末を調製し、高塩度緩衝液（0.5M NaC
l、0.05Mのリン酸ナトリウムpH7.2）で抽出する。次に
この抽出物を水に対し透析し、遠心分離で清澄にさせ
（30分間50,000×ｇ）、同じ高塩分緩衝液内で行なわれ
たSephadexG−75カラム上でのゲルろ過により上澄みを
さらに純化する。DEAE−セルロースカラム上の非イオ
ン、非タンパク質材料のイオン交換クロマトグラフィか
ら、さらにタンパク質を純化する。次に、2Sタンパク質
混合物を含む分画と組合せ、0.5％のNH4HCO3に対し透析
し、乾燥凍結させる。
6.ロイ−エンケファリンの回収 純化された内生の2S貯蔵タンパク質と雑種2Sタンパク
質の混合物を、Endo−Lys−Ｃで消化する。効果的にタ
ンパク質分解減成を行なうため、まず過ギ酸で2Sタンパ
ク質を酸化させる（Hirs、1956年）。この酸化段階は、
ジスルフィドブリッジを開き、タンパク質を変性させ
る。ロイ−エンケファリンは過ギ酸と反応しうるアミノ
酸残基を含んでいないので、この処理によってアヘン誘
導体が変わることはない。Endo−Lys−Ｃ消化は、37℃
で12時間、0.5％のNH4HCO3溶液中で実施され、凍結乾燥
で終結する。この消化によりロイ−エンケファリンは遊
離させられるが、なおＣ末端リジン残基に付着したまま
である。雑種タンパク質にはその他のリジン残基がきわ
めてわずかしか含まれていないため、endo−Lys−Ｃペ
プチドの数はきわめて少なく、このペプチドの付加的な
純化を単純なものにしている。エンケファリン−Lysペ
プチドは、C18カラムを用いて（例えばVYDACの商標で市
販されているもの）HPLC逆相クロマトグラフィで純化す
る。勾配は、初期溶剤としての0.1％のトリフルオロ酢
酸（Ａ）そしてダイリュータ溶剤としての0.1％のトリ
フルオロ酢酸中の70％のアセトニトリル（Ｂ）で構成さ
れている。一分あたり1.5％のＡ中Ｂ溶剤の勾配を、Amp
e他（1987年）により開示されている条件の下で用い
る。純化されたエンケファリン−Lysペプチドは、アミ
ノ酸分析及び／又は免疫学的方法により識別する。さら
に、カルボキシル末端リジン残基を除去するためAmbler
（1972年）が開示したようにカルボキシペプチダーゼＢ
でこれを処理する。最後に、Lewis他（1979年）が開示
している方法に従って逆相HPLCクロマトグラフィにより
オピオイドペプチドの分離及び純化を達成する。
例IIに示されているとおり、その他の方法も利用可能
である。
7.ロイ−エンケファリンの生物学的活性の検定 エンケファリンは、テンジクネズミの脳のナトリウム
の無いホモジエネート内で［3H］−ナロクソンの結合を
抑制する。前述のように（Simantov他、1976年）、ラッ
トの脳膜に対する特異的［3H］−ナロクソン結合を抑制
する能力として、オピオイド活性を検定することが可能
である（Pasternak他、1975年）。「エンケファリン」
のオピオイド活性の１ユニットは、200μの検定にお
いて50％の占有度を生むような量として定義づけされた
（Colquhaun他、1973年）。
例II: 当該技法の柔軟性を立証するものとして、異なる１つ
の2Sアルブミンを用いたロイ−エンケファリンの生成手
順が与えられる。この場合、構成の基礎としてBertholl
etia excelsaからのcDNAクローンを用いる代りに、Arab
isopsis thalianaから分離したゲノムクローンを用い
る。１つのゲノムクローンが用いられるため、その遺伝
子自身のプロモータが用いられ、構成は著しく簡略なも
のとなる。当該技術の一般性をさらに立証するため、タ
バコ、Arabidopsis及びその近縁植物であり同様に2Sア
ルブミンを有するBrassica napis（導入部参照）といっ
た異なる３つの植物において、変化した2Sアルブミン遺
伝子を発現させる。この例の細部の多くは前述の例と同
様であるため、ここではさらに簡単に説明する。
1.Arabidopsis thalianaの2Sアルブミン遺伝子のクロー
ニング 2Sアルブミンの純化が容易であるとすると（導入部、
例（１）参照）、Arabidopsisの2Sアルブミン遺伝子を
クローニングする最も直接的な方法は、タンパク質配列
に基づきオリゴヌクレオチドプローブを作り上げること
である。タンパク質配列は、標準的な技法すなわち基本
的にブラジルナッツの2Sアルブミンのものと同じ方法で
決定された（Ampe他、1986年）。第13図は、Arabidopsi
s thalianaの2Sアルブミン遺伝子を含む1kb Hind IIIフ
ラグメントの配列を示している。導き出されたタンパク
質配列はDNA配列の上に示され、タンパク質分解処理部
位が表示されている。シグナル配列の終りはａで示され
ており、ssuは小さなサブユニットを表わす。挿入され
るべきペプチドのタンパク質配列及びDN配列は、突然変
異誘発に用いるべきオリゴヌクレオチドの残りのものと
同じく、cDNA配列の下に示されている。突然変異手順の
間、示されているオリゴヌクレオチドは、示されている
DNA配列の反対側のストランドに交雑される。構成中にH
ind IIIフラグメントの方向性をチェックするために用
いられるNde I部位には下線が引かれている（bp−11
7）。番号づけシステムは、開始コドンのＡが塩基対１
としてとられるようなものである。
オリゴヌクレオチドプローブを用いる上での問題点
は、１つ以上のコドンが１つのアミノ酸をコード付けす
る可能性があるため、タンパク質配列からDNA配列をあ
いまいでなく決定することが不可能である、ということ
にある。従って、あいまいな位置では、塩基イノシンが
用いられた。イノシンの構造は、交雑の強度を増大させ
はしないものの減少させもしないというようなものであ
る（大塚他、1985年；高橋他、1985年）。これに基づ
き、第14図「Arabidopsis thalianaの2Sアルブミンの大
きいサブユニットのタンパク質配列」に示されているよ
うに、３つのオリゴヌクレオチドプローブが設計され
た。タンパク質配列の下には、遺伝子をクローニングす
るための交雑プローブとして用いられるオリゴヌクレオ
チドの配列がある。Ｉはイノシンを表わす。
標準的な方法（Maniatis他、1982年;Benton ＆ Davi
s、1977年）を用いて、ファージCharon35内で作られたA
rabiodopsisDNAのゲノムライブラリをスクリーニングす
るのに、この３つのオリゴヌクレオチドを用いた（Loen
en ＆ Blattner、1983年）。オリゴヌクレオチドをキナ
ーゼ化し（Miller ＆ Barnes、1986年）、５×SSPE（Ma
niatis他、1982年）、0.1％のSDS、0.02％のフィコー
ル、0.02％のポリビニルピロリドンそして50μg/mlの音
波処理されたニシンの精液DNAの中で45℃で交雑を行な
った。フィルターは、４〜８分45度で５×SSPE、0.1％S
DS中で洗浄した。これらの条件を用いて、これら３つの
オリゴヌクレオチドプローブ全てと交雑した１つのクロ
ーンを分離した。適当な領域を、標準的な技法（Maniat
is他、1982年）を用いてpUC18にサブクローニングし（Y
anisch−Perron他、1985年）、Maxam ＆ Gilbert（1980
年）の方法を用いて配列づけした。この遺伝子を含む領
域の配列は、第13図に示されている。
2.エンケファリン及びプロテアーゼ開裂部位をコード付
けする配列での可変領域の一部分の置換 上述の分離された遺を、ロイ−エンケファリン/2Sア
ルブミンキメラの構成のために直接使用した。第１の例
の場合と同様に、下流の処理段階においてエンケファリ
ンポリペプチドを回収することができるようにロイエン
ケファリン配列とその両側にリジンコード付けコドン
を、そして突然変異誘発の間オリゴヌクレオチドが間隙
ある二本鎖分子に交雑できるように側面にあるArabidop
sis配列に対し相補性のある追加配列を取込む１つのオ
リゴを設計した。その結果として得られたオリゴヌクレ
オチドの配列は、以下のようなものである： ５′−CAAGCTGCCAAGTACGGTGGATTCTTGAAGCAGCACCAAC−
３′ 配列中のその位置は第８図に示されている。
遺伝子及び必要な全ての調節信号を含むのに充分な側
面の（flanking）領域を含む領域は、クローニングベク
ターpJB65内に挿入された3.5kbのBgl IIフラグメント上
で含まれている（Botterman他、1987年）。このクロー
ンはpAT2S1Bgと呼ばれる。突然変異誘発されるべき領域
は、3.6kbのBgl IIフラグメント内で1kgのHind IIIフラ
グメント上で含まれており、この比較的小さいフラグメ
ントは、Stanssens他（1987年）のpMa5−８ベクターのH
ind III部位内に挿入される（第5c図）。非対称のNde I
を用いて方向性をチェックする（第８図）。突然変異誘
発は、例１のステップ３に記されている戦略そのものを
用いて行なわれる。その後、標準的な技法（Maniatis
他、1982年）を用いて、雑種遺伝子を、突然変異誘発さ
れたものを伴うより大きいフラグメント内に再度挿入す
る。再びNde I部位を用いて方向性をチェックする。
3.植物の形質転換 雑種遺伝子ならびに、遺伝子調節のための適当な信号
が確かに存在するようにするためのコード付け領域に対
する充分な側面配列（５′と３′の両方）を含んでいる
Bal IIフラグメントを、例１において用いられているの
と同じ二元性ベクターpGSC1702のBamH I部位内に挿入す
る（第12図）。このベクターについては、例１の第４節
に記されている。タバコの形質転換はまさにそこに記述
されているとおりに行なわれる。Arabidopsis thaliana
及びBrassica hapusの形質転換は、同じベクター内で全
く同じ構成が用いられうるようなものである。例１の第
４節に記されているようにアグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンスに対する授動の後、それぞれArabidopsis及
びBrassicaの形質転換のために、Llyod他（1986年）及
びklimaszewska他（1985年）の手順を用いる。各々の場
合において、タバコについてと同様、カルスを100μg/m
lのカナマイシン上で選択し、耐性あるカルスを植物の
再生に用いることがでいきる。このような植物から調製
されたDNAを、突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレ
オチドとの交雑により、雑種遺伝子の存在についてチェ
ックする（タバコ及びBrassicaの場合、雑種構成の比較
的大きい部分を用いることができるが、Arabidopsisの
場合、これらは内生の遺伝子と交雑する。
本発明の実施態様において、雑種遺伝子ならびに、遺
伝子調節のための適切な信号が必ず存在するようにする
のに充分なコード付け領域に対する側面配列（５′及び
３′の両方）を含むBal IIフラグメントは、二元性ベク
ターpGSC1703（第15図）又はpGSC1703A（第16図）のBgl
II部位内に挿入される。pGSC1703は、大腸菌及びアグ
ロバクテリウムの両方における選択のための官能基、な
らびに外来性DNAの植物ゲノム内への転移を可能にする
Ｔ−DNAフラグメントを含んでいる（Deblaere他、1987
年）。これにはさらに、ネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼタンパク質コード付け領域（NPT II）及び
ocs遺伝子の３′末端基を伴う両方向性プロモータTR（V
elten他、1984年）が含まれている。これには、pGSC170
2のようにアンビシリン耐性をコード付けする遺伝子は
含まれておらず、そのため、感染段階の後アグロバクテ
リアを殺すのにカルベニシリンならびにクラフォランを
用いることができる。ベクターpGSC1703Aは、ハイグロ
マイシントランスフェラーゼをコード付けする付加的な
遺伝子と共に、ベクターpGSC1703と同じ官能基を含んで
いる。このためカナマイシン及びハイグロマイシンの両
方について形質転換体を選択することが可能である。タ
バコの形質転換は、例１の第４節に記されているとおり
に行なわれ、こうして雑種遺伝子は、植物形質転換ベク
ターpGS1703内に挿入される。Arabidopsis thaliana及
びBrassica napusの形質転換は、その中に雑種AT2S1遺
伝子が挿入されたpGSC1703Aを用いて行なわれた。プラ
スミドpMP90をもつアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンスC58C1Rifへの授動の後（Koncz ＆ Schell、1986
年）、（なおこのプラスミドは、in trans及びvir遺伝
子官能基を与えるがアンピシリン耐性をコード付けする
遺伝子は有していない）、それぞれArabidopsis及びBra
ssicaを形質転換するためにLyoyd他（1986年）及びKlim
aszewska他（1985年）の手順が用いられる。同時培養が
起こった後アグロバクテリウムを殺すためにカルベニシ
リンを用いる。各々の場合において、タバコの場合と同
様に、カルスを100μg/mlのカナマイシン上で選択し、
耐性あるカルスを植物の再生のために用いることができ
る。このような植物から調製されたDNAを、突然変異誘
発において用いられたオリゴヌクレオチドとの交雑によ
り、雑種遺伝子の存在についてチェックする。（タバコ
の場合、雑種構成の比較的大きい部分を用いることがで
きるが、Brassica及びArabiodopsisの場合、これらは、
内生の遺伝子と交雑する） 4.種子からの2Sアルブミンの純化及び付加的な処理 各種属からの陽性の植物を育てて種子をつけさせる。
タバコの場合、これには約15週間が必要であるが、Arab
idopsis及びBrassicaについてはそれぞれ６週間及び３
カ月が必要である。異なる品種を使用すると、これらの
期間も異なりうる。種子からの2Sアルブミンの純化、ロ
イ−エンケファリン及び生物学的活性についての後者の
検定は、以下のように行なわれる。
Arabidopsis種子からのエンケファリンの分離に用いら
れる方法 Arabidopsis種子からエンケファリンを分離するのに
２つの方法を用いた。まず第１に、複数の個々の形質転
換体から分離された少量の種子を、キメラ2Sアルブミン
の存在についてスクリーニングした。これは、Jones他
（1985年）が記述しているように導入された遺伝子の表
現が個々の形質転換体の間で大幅に代わりうるという理
由から行なわれるものである。この予備的スクリーニン
グにより見られた個々の植物からの種子を用いて次に、
より多い量を分離し、収量をより正確に測定する。両方
の手順が以下に記されている。
Ａ）エンケファリン含有2Sタンパク質のための高速スク
リーニング手順 個々の植物の種子（約50mg）を収集し、Eppendorf管
の中でこの管に合う形の小さなプラスチック製グライン
ダを用いて磨砕した。この手順では、ドライアイスは全
く用いない。結果として得られたペーストを1mlのヘプ
タンで３回抽出し、残留物を乾燥させた。粉末を1MのNa
Cl 0.2ml中で懸濁させ、Eppendorf遠心分離機内で５分
間遠心分離した。この抽出を三回くり返し、上澄みを組
合せ、合計約0.5mlの量が得られた。この溶液を水で20
倍に希釈し、最終的に0.05MのNaCl濃度を得た。これを
一晩４℃で保存し、次にSorvall SS−34ローターで40分
間5000rpmの速さで回転させた。結果として得られた上
澄みを、使い捨てのC18カートリッジ上に通過させた（S
EP−PAC、Millipore,Milford,米国マサチューセッツ
州）。このカートリッジには、5ml/分の速さでカラムを
通し注射器で10mlの上澄みを注入して装荷した。次にこ
のカートリッジを、0.1％のTFA 2mlで洗い、７％、14
％、21％等々で最高70％までのアセトニトリルを含む0.
1％のTFA溶液の2ml部分で段階的に溶出することによっ
て脱着させた。28％から49％の範囲のアセトニトリル中
に溶出している分画を、異なる分画からとったアリコー
トについて行なったSDS−ポリアクリルアミドゲル分析
によって判断されるように、2Sアルブミンについて富化
する。2Sアルブミン含有分画を組合わせ、Speed Vac濃
縮器（Savant Instruments）内で乾燥させた。
組合わされた分画を水中１％TFA 0.95ml内で再構成
させ、HV−4Millexフィルター（Millipore）を通してろ
過し、長さ25cm直径0.46cmの逆相C4カラムを適用した
（Vydac214TP54、気孔径300オングストローム、粒径５
μｍ）。HPLC機器は、２台のポンプ（510型）、１台の
勾配制御装置（680型）そして１台のLC分光検知器（Lam
da−Max481型、全て米国マサチューセッツ州、Milford
のWaters社からのもの）で構成されていた。勾配は、以
下のように実行した：すなわち、溶液Ａは、H2O中0.1％
のTFAであり、溶液Ｂは70％のCH3CN中0.1％のTFAであっ
た。５分間、B0％A100％の溶液をカラム上に流し、その
後Ｂの濃度を70分にわたり線形的に100％にまで上昇さ
せていった。214nmの吸収度によりカラムの溶出物を検
出した。2Sアルブミンを含む分画を収集し、Speed Vac
濃縮器内で乾燥させた。
プロテアーゼでのより完全な消化を得るためには、過
ギ酸でジスルフィドブリッジを酸化させることによりタ
ンパク質を変性することが勧められる。このことは、9m
lの蟻酸と1mlの30％H2O2を室温で混合して作った溶液を
0.5ml加えて行なわれる。この溶液は、使用より２時間
前に作られた。０℃で30分反応を進ませ、Speed Vac濃
縮器内での乾燥で終らせた。微量の残留蟻酸は、水500
μを２度加え、標本を凍結乾燥させることによって除
去した。
残渣をpH8.5の0.1MのTris−HCl 0.75ml中に再度溶解
させ、その後４μｇのTPCK処理されたトリプシン（Wort
hington）を加えた。反応を３時間37℃で放置し、その
後TFA 10μを加えて終結させ、分析に先立ち−20℃
で保存した。結果として得られたペプチド混合物を、前
述の勾配混合物及びカラムを用いてHPLCで分離させる。
標準として、期待されるものと同じ配列（YGGFLK）のペ
プチドを、標準的な技術を用いてBiolynx4175ペプチド
合成装置（LKB）で合成した。このペプチドをカラム上
に流し、保持時間を測定した。次に同じカラム上で、ト
リプシン消化物から得られたペプチドの混合物を装荷
し、標準と同じ保持時間のペプチドを収集し、乾燥し、
C18−逆相カラム上に再度装荷した。標準ペプチドの溶
出時間はここでも、エンケファリン含有ペプチドの正し
い位置についての基準として役立った。アミノ酸配列づ
けによってこのペプチドの同一性を確認し、又これによ
って大方の定量を行なうこともできた。分析された６つ
の形質転換体のうち４つの植物が有効量のロイ−エンケ
ファリンを含んでいることがわかった。例として、これ
らの４つの植物のうちの１つについての詳しい分析及び
処理段階が以下に示されている。
Ｂ） Arabidopsis種子からのエンケファリンのさらに
大規模な分離及び処理 磨砕及び初期抽出 前記植物からの2.11gの種子をドライアイス内でモル
タルの中でグラインディングした。5mlのヘプタンで三
回抽出することによって結果として得られた粉末から脂
質を除去した。結果として得られた残渣を乾燥した。
タンパク質の抽出 粉末を約4mlの1.0M NaCl内に溶かした。結果として
得られたペーストをSS−34ローター内で17500rpmの速さ
で40分間回転させた。各回転の後に、上澄みを新しい試
験管内に移し、ペレットを再び4mlの1.0M NaCl中に懸
濁させた。この手順を三度くり返した。0.45μｍのフィ
ルター（HA,Millipore）に３回の上澄み（計12ml）を通
した。
ゲルろ過による2Sアルブミンの分離 前段階からの溶液12mlを6mlのバッチ２つに分けてSep
hadexG−50媒質（Pharmacia）上を通過させた。カラム
は、直径2.5cm、長さ100cmで0.5MのNaCl中毎時約27mlの
流量で作動した。約7mlの分画を収集した。この分画を
次の２つの方法でタンパク質について監視した。すなわ
ち、まず第一に、鉛筆で分画番号を表わしたWhatman 3M
Mペーパー片に各分画を10μ適用することにより、合
計タンパク質を検出した。暖気の中で斑点を乾燥させ、
10％のTCA溶液中にペーパーをすばやく浸して（30秒）
タンパク質を定着させた。次に紙片を、ポリアクリルア
ミドゲル染色に用いられるものと類似したCommassie Bl
ue溶液へと移す。１分後、ペーパーをとり出し水道水で
洗う。タンパク質を含む分画は、白の地に青の斑点を示
す。この技術の最小検出限界は、約0.05mg/mlである。
これらのタンパク質含有分画を、7ml分画２μを10μ
の標本緩衝液に加え次に17.5％のポリアクリルアミド
のミニゲル上にこの混合物６μを装荷することによっ
て、2Sアルブミンの存在について検定した。2Sアルブミ
ンを含むことがわかった分画をプールしておいた。プー
ルした分画の合計量は175mlであった。
分離された2Sアルブミンの脱塩 これは、長さ25cm、直径0.46cmのC4カラム上でHPLCに
よって行なった（Vydac214TP54、気孔径300オングスト
ローム、粒径５μｍ）。HPLC装置は、２台のポンプ（51
0型）、勾配制御装置（680型）及びLC分光検出器（Lamd
a−Max481型、全て米国マサチューセッツ州、Milfordの
Waters社のもの）で構成されていた。各々3.5mlずつ６
回にわけてこのシステムに175mlのうち21mlを装荷し
た。勾配は以下のように実行した：すなわち、溶液Ａは
H2O中の0.1％TFAであり、溶液Ｂは70％CH3CN中の0.1％T
FAであった。５分間０％のＢと100％のＡをカラム上に
流し、その後Ｂの濃度を70分にわたって線形に100％ま
で上昇させた。各回共その間に2Sアルブミンの分画を収
集し、６回全てが終了した時点でこれらの分画をプール
して３本の試験管に分けてとり、従ってこれらの試験管
の各々には2.11gの種子からの2Sアルブミンが7/175入っ
ていた。さらに別々のアリコートの各々を処理し、収量
の量的評価のために使用した。
トリプシン消化物 トリプシンでの消化に先立ち、３つのアリコートを上
述の要領で酸化させた。トリプシン消化は、基本的に上
述のように行なった。各アリコートに0.95mlの0.1M Tr
is−HCl、pH8.5を付加し、これに50μｇのトリプシン
（Worthington）を補足して、37℃で４時間反応させ
た。
YGGFLKペプチドの分離 カルボキシル末端残基を含むエンケファリンペプチド
を２つの連続したHPLC段階を用いて分離した。上記小規
模分離手順内に説明されているように、期待されている
ものと同じ配列のペプチドを合成し、上述の脱塩段階で
記されているのと同じカラム及び勾配条件を用いてHPLC
システム上に流した。合成ペプチドの保持時間を測定し
た（第17A図）。次に３つのトリプシン消化物を（別々
に）同じカラム上に装荷し、合成ペプチドを同じ保持時
間の材料を収集し（第17B図斜線の部分）、乾燥させ
た。次に、C18カラム（25×0.46cm、Vydac218TP104材
料、気孔径300オングストローム、粒径10μｍ）を用い
たことを除いて同じ装置及び勾配を用い同じ手順に従っ
た。ここでも、合成ペプチドと同じ保持時間の材料を収
集した（第18A図及び第18B図）。この結果、各々合計2S
アルブミンの7/175から誘導された３つの調製物が得ら
れた。
これらの３つのアリコートの１つにある材料の1/20を
用いて、分離されたペプチドの配列をチェックした。こ
れは、Applied Biosystems Inc.（U.S.A.）の470A気相
シークエネーター（sequenator）を用いた自動気相配列
決定によって確認された。段階的に遊離されたフェニル
チオヒダントイン（PTH）アミノ酸誘導体をオンラインP
THアミノ酸分析器（Applied Biosystems Inc.120A）で
分析した。シークエネーター（sequenator）及びPTH分
析器は、製造業者の指示に従って作動させた。サイクル
１から６までの遊離されたPTHアミノ酸のHPLCクロマト
グラムが、第19図に示されている。配列は、予想どおり
YGGFLKであった。この中間ペプチドの収量を計算するの
には、第１のサイクルのPTHアミノ酸の収量を用いた
（種子１グラムあたり251〜277nmol）。
エンケファリンからの余分なリジンの除去 前段階の結果得られた３つのアリコートをpH8.5の0.2
MのＮ−エチルモルフォリン100μ中に再度懸濁させ
（ベルギー、Janssen Chimica）、各々の３分の１を37
℃で0.2μｇのカルボキシペプチダーゼＢ（Boehringer
Manheim、配列決定グレード）で処理した。３つのアリ
コートをそれぞれ５分、12分及び17分間処理したが、３
つの消化物は全て同等に有効であることがわかった。消
化の後、上記脱塩の項で記されているものと同じ装置、
カラム及び勾配を用いてHPLCによってエンケファリンを
純化させた。
アミノ酸分析を行なうことにより、エンケファリンの
最終的収量を決定した。上述の３つのアリコートの合計
量の1/150にあたるアリコートを6NHCl、0.05％フェノー
ル400μの中で110℃で24時間加水分解した。加水分解
産物を乾燥させ、アミノ酸をフェニルチオカルバモイル
（PTC）残基に誘導体合成した（Bildingmeyer他、1984
年）。PICO−TAGアミノ酸分析システム（米国マサチュ
ーセッツ州Milford Millipore,Waters社）を用いて数量
化した。内標準としてアルファアミノブチル酸を用いて
３つの標本の各々についてエンケファリンペプチドの収
量を計算した。３つの測定値の平均に基づき、種子1gあ
たり206nmolのエンケファリンという最終収量を計算し
た。
最終的に得られたペプチドの同一性は三つの方法で確
認された。まず第一に、そのアミノ酸組成であり、これ
は、Gly、1.76;Tyr、1.00;Leu、1.15及びPhe、1.02の分
子比を示していた。第２に、その逆相HPLCカラム上での
保持時間は、基準エンケファリンペプチドのものと一致
しており（第20図）、最後に、そのアミノ酸配列が決定
された。これらの基準は、明確に、キメラ2Sアルブミン
から分離されたペプチドをロイ−エンケファリンである
ものとして識別している。
例III 上述の方法の第３の例として、２つの成長ホルモン放
出因子（GHRF）の類似体の生成のための手順が与えられ
る。位置27におけるメチオニンがロイシンにより置換さ
れ、カルボキシル末端基がさまざまな方法で変更されて
いるか又は４つのアミノ酸により短縮されてさえいるよ
うな当初分離された44のアミノ酸ペプチド（Guillemin
他、1982年）の合成及び天然の類似体は、活性であるこ
とが示された（Kempe他、1986年;Rivier他、1982年）。
この場合、以下GHRFL及びGHRFSと呼称される２つの類似
体が生成される。両方の場合共、位置27にメチオニンの
代りにロイシンの置換を取り込んでいる。GHRFLは、ペ
プチドの天然形態においてみられるようにカルボキシル
末端基がLeu−NH2であるような形で生成される（Guille
min他、1982年）。GHRFSはArg−Hse−NH2で終る。ここ
でHseはホモセリンを意味する。この類似体は、生物学
的に活性であることがKempe他（1986年）により示され
ている。両方の類似体は共に、2Sアルブミン内でメチオ
ニンコドンを側面に有しており、そのためCnBrでの処理
によって開裂されうる。このことはいずれの類似体も内
部メチオニンを含んでいないことから可能なのである。
HPLC技術を用いた２つのペプチドの分離の後、これらは
化学的に修飾されて、その結果Leu−NH2及びArg−Hse−
NH2カルボキシル末端が得られる。
２つのGHRF類似体及びCnBr開裂部位をコード付けする
１組の合成オリゴヌクレオチドは、Arabidopsis thalia
naの2Sアルブミンをコード付けするゲノミッククローン
内の超可変領域全体について置換される。６番目及び７
番目のシステイン残基に隣接するいくつかのアミノ酸の
みが残った。このキメラ遺伝子は、その天然のプロモー
タ及びシグナルペプチドの制御下にある。そのプロセス
及び構造は、第21図及び第22図に図式的に示されてい
る。構成全体を、アグロバクテリウムを媒介とする形質
転換システムを用いてタバコ、Arabidopsis thaliana及
びBrassica napusへと移入（転移）させる。植物を再生
させ、開花後に種子を収集して、2Sアルブミンを純化さ
せる。GHRFペプチドを、CnBrを用いて2Sアルブミンから
開裂させ、（なおこの印割部位はオリゴヌクレオチド内
に組込まれている）、次にHPLC技術を用いて回収する。
Arabidopsis thaliana2Sアルブミン遺伝子のクローニン
グ Arabidopsis thaliana遺伝子は、例IIに示されている
事項に従ってクローニングされた（Krebbers他、1988年
も参照のこと）。すでに公式の記録に載っているよう
に、この遺伝子を含むプラスミドはpAT2S1と呼ばれる。
AT2S1と呼ばれる、この遺伝子を含む領域の配列は、第1
3図に示されている。
2.AT2S1遺伝子の超可変領域の欠失及びAcc I部位による
置換 AT2S1の超可変領域の一部分は、以下のオリゴヌクレ
オチドと置換される： なおここで下線の配列は、Acc I部位を表わし、周囲
の配列は、保持されるべきArabidopsis2Sアルブミン遺
伝子の超可変領域のコード付け配列に対し相補的な配列
である。この結果、最終的に、オリゴヌクレオチドの下
に記されているアミノ酸配列が得られる。
AT2S1の超可変領域をコード付けする配列の一部分の
欠失及び置換は、プライマーとしてオリゴヌクレオチド
を用い、部位指向性突然変異誘発を使って行なわれる。
例Ｉに示されているように、Stanssens他（1987年）の
システムが用いられる。
このプロセスの個々の段階は、以下のとおりである。
− AT2S1遺伝子のコード付け領域を含むpAT2S1のHind
IIIフラグメントのpMa5−８へのクローニング（Ｉ）。
このベクターはCmR遺伝子内でアンバー突然変異を続行
し、アンピシリン耐性を規定する。この結果得られるプ
ラスミドは、pMacAT2S1と呼称される（第21図、ステッ
プ１を参照）； − 偽ウイルス粒子からのこの組換え体の一本鎖DNAの
調製（II）； − 相補性pMc型プラスミドからのHind III制限フラグ
メントの調製（III）。pMc型のベクターは、Ap耐性標識
内にアンバー突然変異が取り込まれている一方で、野生
型CmR遺伝子を含んでいる； − 試験管内DNA/DNA交雑による間隙二本鎖DNA（以下gd
DNAと呼ぶ）の構成（IV）。gdDNAにおいて、標的配列は
一本鎖DNAとして露出されている。交雑混合物のその他
の構成成分からのgdDNAの予備的な純化は不要である； − gdDNAへの30−mer合成オリゴヌクレオチドのアニー
リング（Ｖ）。
− 同時試験管内klenowDNAポリメラーゼI/DNAリガーゼ
反応による、残りの一本鎖間隙の充てんとニックのシー
リング（VI）； − Cm耐性について選択する、mutS宿主すなわち誤対合
修復における欠失菌株の形質転換；この結果、混合プラ
スミド後代が生成される（VII）。
− アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の
再形質転換による鋳型ストランド（pMa−型）から誘導
される後代の除去（VIII）。Cm耐性に関する選択の結
果、間隙あるストランドすなわちその中に突然変異誘発
オリゴヌクレオチドが取り込まれているストランドから
誘導された後代が豊富になる； − 望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結
果として得られたクローンのスクリーニング。結果とし
て得られるAT2S1の欠失した超可変領域を含むプラスミ
ドはpMa（AT2S1C40と呼ばれる（第21図ステップ２を参
照）。
3.超可変領域をコード付けする配列が欠失したAT2S1遺
伝子内へのGHRFをコード付けする配列の挿入 上述のように、超可変ループのほとんどをコード付け
する配列が除去されたとき、Acc I部位がその代りに挿
入された。問題の配列はこのAcc I部位内に挿入される
が、第２のAcc I部位も又、変更された遺伝子を含むHin
d IIIフラグメント内に存在する。従って、変更された
遺伝子を含むNde I−Hind IIIフラグメントは、同様にN
de I及びHind IIIで切断されたクローニングベクターpB
R（322）（Boliver、1977年）にサブクローニングされ
る。2Sアルブミン遺伝子内のNde I部位の位置は、第４
図に示されている。結果として得られるサブクローンは
pBRAT2S1と呼ばれる（第21図、ステップ３）。成長ホル
モンの２つのバージョンをコード付けする配列は、アニ
ーリングされたときGHRFの完全な配列を形成するような
一連の相補的合成オリゴヌクレオチドを構成することに
よりpBRAT2S1のAcc I部位内に挿入される。AT2S1のもの
とほぼ一致するようにコドン使用が選択され、診断目的
で用いられるべき制御部位（Sty I）が含み入れられ、G
HRFコード付け配列の末端にはBamH I及びPst I部位に対
し相補的な千鳥型末端基が、上述のステップの後2Sアル
ブミン遺伝子の読取り枠が維持されるようにするための
追加の塩基と合わせて含み入れられた。２つの構成にお
いて用いられた８つのオリゴヌクレオチドが第22図に示
されている。第22A図において、オリゴヌクレオチドの
限界は垂直線により示されており、配列の上下の数字は
その番号を表している。オリゴヌクレオチド（４及び
８）において、囲み内に入っている塩基は除外され、そ
の結果、この構成のGHRFSバージョンが得られる。第22A
図中☆印が付いている塩基は、GHRFLをさらに構成する
ために用いられるクローン（pEK7）内でＴに突然変異さ
せられたということがわかったが、これらの変化はアミ
ノ酸配列に影響を及ぼさなかったため、補正されなかっ
た。GHRFペプチドのペプチド配列及びCnBr部位を与える
ために含まれているメチオニンは、DNA配列の上に示さ
れている。各末端の張出し塩基は、フラグメントをBamH
I及びPst I部位に結紮するのに役立つ。これらはS1消
化により除去される。次に、第22B図に示されているよ
うに、鈍端フラグメントがpBRAT2S1のKlenow処理された
Acc I部位へと結紮される。Acc I部位の読取り枠文脈
は、図の上部に示されており、開裂部位は▼で表わされ
ている。処理の結果は下にあり、Acc I部位及びその充
てんの結果得られた塩基は、太字で示されている。
各々の構成において用いられている６つのオリゴヌク
レオチドは全て、キナーゼ化された。アニーリング反応
のためには、各々のオリゴヌクレオチド2pモルを合計12
μの体積になるよう組合わせた。混合物を10分間90℃
で保温し、10分間約65〜70℃の温度へと移行させ、それ
から35〜45分にわたって30〜35℃まで漸進的に冷却させ
た。この時間の終了時点で、リガーゼバッファ（Maniat
is他、1982年）及び1.5ユニットのT4−リガーゼを付加
し、体積を15μに調整し、混合物を16℃で一晩保温し
た。次に混合物を５分間65℃に保温し、その後、100mM
NaCl制限エンドヌクレアーゼバッファ2.5μ（Mania
tis他、1982年）、BamH I及びPat Iの各々を５〜10ユニ
ット付加し、体積を25μに調整した。この消化物は、
結紮段階中に形成したコンカテマーを開裂するためのも
のである。45分間の消化の後、反応物をフェノール／ク
ロロホルムで抽出し、沈降させ、BamH I及びPst Iで消
化された細菌アルカリフォスファターゼで処理されたpU
C18（Yanisch−Perron他、1985年）と結紮されたもの５
μを含む10μ中に再度懸濁させた。標準的な技術に
よる細菌細胞の形質転換の後（Maniatis他、1982年）、
32Pという標識のついたオリゴヌクレオチドNo.1末端を
用いてGruntein（1975年）の方法により組換え体コロニ
ーをスクリーニングした。GHRF遺伝子の各バージョンか
らのクローンを配列決定し、pEK7（GHRFLを含む）及びp
EK8（GHRFSを含む）と呼ばれる各バージョンについて１
つずつのクローンを、その後のステップで用いた（第21
図のステップ４参照）。
pEK7及びpEK8のBamH I−Pst IフラグメントをpBRAT2S
1のAcc I部位内に挿入した（第21図、ステップ５）。オ
ープンリーディングフレームを維持するために行なわれ
た処理の詳細は、第22図に示されている。pEK7及びpEK8
を各々BaH I及びPst Iの両方で切断し、S1ヌクレアーゼ
で処理し、GHRFコード付け配列を含むフラグメントを、
ゲル電気泳動の後分離させた。次にこれらのフラグメン
トを、Acc Iで切断されDNAポリメラーゼＩのKlenowフラ
グメントで処理されたpBRAT2S1と個別に結紮した。結果
として得られたクローンを、この目的のための合成配列
が含み入れられた部位であるSty I及びHind IIIとの消
化によりGHRFコード付け配列の適切な方向性についてチ
ェックした。正しい方向性でインサートを含んでいるこ
とがかったいくつかのクローンを配列決定した。これ
は、S1ヌクレアーゼ消化がつねに厳密に制御できないこ
とから、必要となることである。２つのGHRF構成の各々
について正しい配列をもつことの確認された１つのクロ
ーンを、その後のステップで用いた。これらは、それぞ
れGHRFL及びGHRFSについてpEK100及びpEK200と呼称され
た。
4.修飾された完全なAT2S1遺伝子のその天然プロモータ
による再構成 完全なキメラ遺伝子は、以下のように再構成される
（第21図参照）：クローンpAT2S1Bgは、遺伝子AT2S1の
コード付け領域を含む1.0kbのHind IIIフラグメントの
みならず、遺伝子の適切な発現にとって充分な配列をこ
のフラグメントの上流及び下流にて包含しているクロー
ニングベクターpJB65（Botterman他、1987年）内に挿入
された3.6kbのBgl IIフラグメントを含んでいる。この
プラスミドはHind IIIで切断され、5.2kbのフラグメン
ト（すなわちAT2S1のコード付け領域を含んでいないプ
ラスミドの一部分）が分離される。クローンpAT2S1はHi
nd III及びNde Iで切断され、結果として得られる320bp
Hind III−Nde Iフラグメントが分離される。このフラ
グメントは、追加のAcc I部位の複雑さ無く第21図のス
テップ５のオリゴヌクレオチドの挿入が進められうるよ
うに、pBRAT2S1の構成中に変更された2Sアルブミンから
除去されたもの（第21図のステップ３）を表わす。次に
これら２つの分離されたフラグメントを、３方向結紮に
て、修飾されたコード付け配列を含むそれぞれpEK100及
びpEK（200）からのNde I−Hind IIIフラグメントと結
紮させる。数多くの部位のうちのいずれかを用いて、Ba
l IIフラグメント内の再構成されたHind IIIフラグメン
トの適当な方向性についてチェックするため、個々の形
質転換体をスクリーニングすることができる。結果とし
て得られるプラスミドpEK502及びpEK6011は、全体的にB
al IIフラグメント上に含まれている、未修飾遺伝子と
同じ側面配列ひいては同じプロモータによりとり囲まれ
た、超可変領域内のみにおいて修飾された2Sアルブミン
遺伝子で構成されている。
5.植物の形質転換 キメラ遺伝子を含むBal IIフラグメントを、例２の第
３節で用いられ説明されている二元性ベクターpGSC1703
AのBgl II内に挿入する（第21図、ステップ６も参照の
こと）。結果として得られたプラスミドはpTAD12と呼ば
れる。標準的な手順を用いて（Deblaere他、1987年）、
pTAD12を、同様に例IIの第３節で用いられているプラス
ミドpMP90を有するアグロバクテリウム菌株C58C1Rifに
移入する。このアグロバクテリウムを次に植物の形質転
換のために用いる。SR1株のタバコを、標準的な手順を
用いて形質転換する（Deblaere他、1987年）。100μg/m
lのカナマイシン上でカルスを選択し、耐性あるカルス
を植物の再生に用いる。
Arabidopsis thaliana及びBrassica napusの形質転換
のための技法は、同じベクター内で全く同じ構成を用い
ることができるようなものである。上述のようなアグロ
バクテリウム・ツメファシエンスに対する授動の後、そ
れぞれArabidopsis及びBrassicaの形質転換のために、L
loyd他（1986年）及びklimaszewska他（1985年）の手順
を使用する。各々のケースについて、タバコの場合と同
様に、カルスを100μg/mlのカナマイシン上で選択し、
耐性あるカルスを植物の再生に用いることができる。
全三種の場合、再生の初期段階において、カナマイシ
ンを補足した媒質上で葉からカルスを導き出すことによ
り、形質転換について再生体をチェックする。（第６項
も参照のこと）。
6.形質転換された植物のスクリーニング及び分析 全三種の場合において、再生された植物を種子をつけ
るよう育てる。形質転換されたさまざまな植物は、異な
る表現レベルをもつと予想されうるため（「位置の効
果」Jones他、1985年）、当初複数の形質転換体を分析
しなくてはならない。これは原則として、RNA又はタン
パク質のいずれかのレベルで行なうことができる。この
場合、Beachy他（1985年）に記されているように種子RN
Aを調製し、標準的な技法を用いて（Thomas他、1980
年）、ノーザン・ブロット法を行なった。Brassica及び
Arabidopsisの両方の場合においては、キメラ遺伝子全
体は内因性遺伝子との交差交雑という結果をもたらすた
め、2Sアルブミン内の挿入に対し相補性のオリゴヌクレ
オチドプローブを用いた。すなわち構成を作るのに用い
たようなオリゴヌクレオチドの１つを用いることができ
る、各々の種について、１つ又は２つの個々の植物を選
択し、以下に開示するようなさらに詳しい分析に用い
た。
まず、キメラ遺伝子のコピー番号を、形質転換された
植物の葉の組織からDNAを調製し（Dellaporta他、1983
年）、上で用いられているオリゴヌクレオチドでプロー
ピングすることによって決定する。
7.GHRF類似体の分離 Ａ）キメラ2Sアルブミンの純化 例IIに説明されているように、高塩分抽出、ゲルろ過
及び逆相HPLCによって、2Sアルブミンを純化する。
天然GHRFに対する市販の抗体（UCB−Bioproducts,Dro
genbos、ベルギー）を用いた免疫学的技法により、キメ
ラ2Sアルブミンの正しい溶離回数（時間）を測定する。
Ｂ）キメラ2Sアルブミンの開裂及びGHRF類似体の分離 2Sアルブミンを含む脱塩、HPLC純化されたGHRFを次に
CNBr（Gross ＆ Witkop、1961年）で処理する。CnBr
は、なおCOOH末端基に付いている余分なホモセリン／ホ
モセリン−ラクトンでGHRF類似体を遊離させる。GHRF類
似体を、例IIに示されているように、古典的な逆相HPLC
技法を用いて純化させ、例IIに示されている方法を用い
て、そのアミノ酸配列を決定する。Kempe他（1986年）
が記しているようにアンモニア、ｎ−ブチルアミン及び
ｎ−ドデシルアミンを用いて、分離されたGHRFS類似体
をアミド化する。この結果が、説明されるArg−Hse−NH
2末端である。
カルボキシル末端になお余分なメチオニンを有する第
２の類似体GHRFLをまずカルボキシペプチダーゼＢで処
理し、カルボキシル末端ホモセリン残基を除去する（Am
bler、1972年）。その結果、Leu−Gly−COOH末端が得ら
れる。Kreil（1984年）に記されているように、カラタ
ーゼ及びアスコルビン酸塩の存在する中でＤ−アミノ酸
オキシダーゼで処理することにより、グリシン−COOH末
端は、アミド−CONH2及びグリオキシル酸末端に変換さ
れる。この一組の酵素段階の結果、最終的なアミド化さ
れたGHRFL類似体が得られる。
従って、前記諸例は、ロイ−エンケファリン又は成長
ホルモン放出因子をコード付けするインサートを中にと
り込むよう2Sアルブミン貯蔵タンパク質をいかに変更す
るか、そしてそれに続く相応する変更された前駆体核酸
を含む適切なプラスミドを用いたタバコ、Arabidopsis
及びBrassica細胞の形質転換、形質転換された植物細胞
の相応する植物への再生、種子形成段階に至るまでのそ
の栽培、種子の回収、そこからの雑種2Sアルブミンの分
離そして最終的に純粋な形でのかかる雑種タンパク質か
らのロイエンケファリン又はGHRFの回収についての完全
な例示を与えている。
従って本発明が、タンパク質又はポリペプチドの遺伝
的処理技術及びその天然の形態に近い形態でそれらを生
み出す条件の下で大量にこれらを生産する技術を提供す
るものであるということは直ちに明白である。
又当然のことながら、本発明は上述の例に限られてい
るわけではない。当業者は、各々のケースにおいて、問
題となっているいずれかの一定のポリペプチド又はペプ
チドの生産に用いるべき貯蔵タンパク質、その性質（例
えば、相応するDNAインサートを最もうまく収納するた
めそれが含んでいる適切な制限部位に応じて）を選択
し、問題のペプチドが究極的に開裂、回収及び純化され
うるもとである相応する雑種タンパク質を生成するため
の、形質転換されるべき種子形成植物の性質に基づく最
適な種子特異的プロモータの選択を適切に行なうことに
なる。
以下に、本書に記されているプロセスの段階のいくつ
かを達成するための既知の方法又は本発明の実施に先立
って立証された一般的知識に対し参照指示がなされた範
囲内で本開示全体を通して基準とされてきた参考文献
を、記す。
なお、以下のことをさらに確認しておく： − プラスミドpGV2260は、1983年12月にDSMに2799にて
寄託されたこと、 − プラスミドpSOYLEAは、1987年８月３日付で、DSMに
4205にて寄託されたこと、 − プラスミドpBN2S1は、1987年８月３日付でDSMに420
5にて寄託されたこと、 − プラスミドpMa5−８は、1988年５月３日付で4567に
て、又pMcは同日4566にてDSMに寄託されたこと、 − プラスミドpAT2S1は、1988年10月７日付で、DSMに4
879にて寄託されたこと、 − プラスミドpAT2S1Bgは、1988年10月７日付でDSMに4
878にて寄託されたこと、 − プラスミドpGSC1703Aは、1988年10月７日付でDSMに
4880にて寄託されたこと、 − プラスミドpEK7は、1988年10月７日付でDSMに4876
にて寄託されたこと、 − プラスミドpEK8は、1988年10月７日付でDSMに4877
にて寄託されたこと。
ただし、これらは全て、当業者がいかなる発明性の作
業を実施しなくても入手可能な遺伝材料から再生するこ
とのできるような構成である。
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合計種子タンパク質の百分率で表わした2Sアルブミン
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者 ボッテルマン，ヨハン ベルギー国、9721 シェバーゲン‐デ・ ピンテ、ヘット・ヴィンガールデッケ ５ (72)発明者 レーマンズ，ジャン ベルギー国、9831 デュアレ、ピー・ デ・デンテルゲムラーン ２ (56)参考文献 東独国特許240911（ＤＤ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．83 （1996）ｐ. 8240−8244 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12P 21/02 C07K 14/415 C12N 5/00 A01H 1/00 A01H 5/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (26)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】2Sアルブミンの前駆体をコードし、かつ該
    2Sアルブミンの大サブユニットの４番目と５番目のシス
    テイン残基の間の領域をコードする非必須領域におい
    て、目的のポリペプチドをコードする異種核酸挿入物
    を、該非必須領域に挿入することにより、あるいは該非
    必須領域の少なくとも一部と置換することにより、修飾
    されている核酸配列を含む組換えDNAであって、それに
    より、該組換えDNAが、該2Sアルブミンの大サブユニッ
    トの部分によって囲まれた該ポリペプチドを含むキメラ
    2Sアルブミンの前駆体をコードする、組換えDNA。
  2. 【請求項２】前記核酸挿入物の末端が、前記キメラ2Sア
    ルブミン内で最初に選択的に開裂可能な境界部位を規定
    する１以上のアミノ酸残基をコードする１以上のコドン
    に連結されている、請求項１に記載の組換えDNA。
  3. 【請求項３】前記核酸挿入物が、より小さいポリペプチ
    ドもしくはタンパク質のユニットの反復からなるポリペ
    プチドをコードし、該ユニットが、二番目に選択的に開
    裂可能な境界部位を規定する１以上のコドンにより分離
    されている、請求項２に記載の組換えDNA。
  4. 【請求項４】前記組換えDNAが植物のプロモーターの制
    御下にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換
    えDNA。
  5. 【請求項５】前記植物のプロモーターが種子特異的プロ
    モーターである、請求項４に記載の組換えDNA。
  6. 【請求項６】前記2Sアルブミンの前駆体がシグナルペプ
    チドをコードしている、請求項１〜５のいずれか１項に
    記載の組換えDNA。
  7. 【請求項７】前記2Sアルブミンの前記前駆体をコードす
    る前記核酸配列が、前記４番目のシステイン残基をコー
    ドするコドンから下流に４番目のコドンと、前記５番目
    のシステイン残基をコードするコドンから上流に６番目
    のコドンとの間で修飾されている、請求項１〜６のいず
    れか１項に記載の組換えDNA。
  8. 【請求項８】前記2Sアルブミンの前記前駆体をコードす
    る前記核酸配列が、前記４番目のシステイン残基をコー
    ドするコドンから下流に６番目のコドンと、前記５番目
    のシステイン残基をコードするコドンから上流に６番目
    のコドンとの間で修飾されている、請求項７に記載の組
    換えDNA。
  9. 【請求項９】前記核酸配列が、Arabidopsis thalianaの
    2Sアルブミンの前記体をコードし、該2Sアルブミンの大
    サブユニットのアミノ酸残基31と57とをコードするコド
    ンの間で修飾されている、請求項１〜６のいずれか１項
    に記載の組換えDNA。
  10. 【請求項１０】前記核酸が、Ricinus communis、Arabid
    opsis thaliana、Brassica napus、およびBertholletia
    excelsaの2Sアルブミンの群から選択される2Sアルブミ
    ンをコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の
    組換えDNA。
  11. 【請求項１１】前記核酸挿入物が、３〜100アミノ酸の
    長さの目的のポリペプチドをコードする、請求項１〜10
    のいずれか１項に記載の組換えDNA。
  12. 【請求項１２】前記核酸挿入物が、５〜46アミノ酸の長
    さの目的のポリペプチドをコードする、請求項11に記載
    の組換えDNA。
  13. 【請求項１３】前記核酸挿入物が、エンケファリンもし
    くはヒト成長ホルモン放出因子をコードする、請求項５
    に記載の組換えDNA。
  14. 【請求項１４】前記種子特異的プロモーターが、前記2S
    アルブミンの前記前駆体をコードする前記核酸配列に天
    然に属している、請求項５に記載の組換えDNA。
  15. 【請求項１５】前記種子特異的プロモーターが、前記2S
    アルブミンの前記前駆体をコードする前記核酸配列とは
    異種である、請求項５に記載の組換えDNA。
  16. 【請求項１６】請求項１〜13のいずれか１項に記載の組
    換えDNAによりコードされている、キメラ2Sアルブミ
    ン。
  17. 【請求項１７】請求項１〜13のいずれか１項に記載の組
    換えDNAを含む、植物の細胞。
  18. 【請求項１８】請求項１〜13のいずれか１項に記載の組
    換えDNAをそのゲノムに含む、Agrobacteriumにより形質
    転換され得る植物。
  19. 【請求項１９】前記植物がBrassica属に属している、請
    求項18に記載の植物。
  20. 【請求項２０】前記植物がBrassica napusである、請求
    項18に記載の植物。
  21. 【請求項２１】請求項１〜15のいずれか１項に記載の組
    換えDNAをそのゲノムに含む、Agrobacteriumにより形質
    転換され得る植物の種子。
  22. 【請求項２２】目的のポリペプチドを産生する方法であ
    って、そのゲノムDNAが請求項１〜15のいずれか１項に
    記載の組換えDNAを含む、Agrobacteriumにより形質転換
    され得る植物を栽培する工程を包含する方法。
  23. 【請求項２３】前記最初に選択的に開裂可能な境界部位
    を開裂し、前記目的のポリペプチドを分離する連続する
    工程を包含する、請求項22に記載の方法。
  24. 【請求項２４】前記ポリペプチドがより小さなポリペプ
    チドもしくはタンパク質ユニットの反復からなり、該ユ
    ニットが２番目に選択的に開裂可能な境界部位という手
    段により別のものから分離可能であり、さらに、２番目
    に選択的に開裂可能な境界部位を開裂する工程、および
    該目的のポリペプチドを分離する工程を包含する、請求
    項23に記載の方法。
  25. 【請求項２５】前記植物が種子形成植物であり、そして
    前記核酸配列が種子特異的プロモーターの制御下にあ
    り、さらに、該植物から種子を回収する工程を包含す
    る、請求項22〜24のいずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】キメラ2Sアルブミンを産生するAgrobact
    eriumにより形質転換され得る植物の作成方法であっ
    て、該植物のゲノムを請求項１〜15のいずれか１項に記
    載の組換えDNAにより形質転換する工程を包含する方
    法。
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