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JP3004049B2 - 病原性のないｐｈｏＰ型微生物を含有するワクチン - Google Patents

病原性のないｐｈｏＰ型微生物を含有するワクチン

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JP3004049B2
JP3004049B2 JP2505536A JP50553690A JP3004049B2 JP 3004049 B2 JP3004049 B2 JP 3004049B2 JP 2505536 A JP2505536 A JP 2505536A JP 50553690 A JP50553690 A JP 50553690A JP 3004049 B2 JP3004049 B2 JP 3004049B2
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phop
mutation
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ザ サード，ロイ カーティス
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Washington University in St Louis WUSTL
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ワクチンおよび組換えDNA発現生産物を調
製するための材料および方法に関し、特にワクチン、お
よび抗原を運搬するためのベクターとして有用な遺伝子
的に操作された微生物に関する。
参考文献 背景 従来から使用されてきた感染病に対するワクチンは、
一般に次の４つに分類される：（Ｉ）無処置の抗原、そ
の断片、あるいは天然抗原またはエピトープの合成アナ
ログを含む病原体からの特異的な成分、（II）抗イディ
オタイプ抗体、（III）全死病原体、または（IV）生ワ
クチンとしての病原体の無毒性（弱毒性）誘導体。弱毒
性ワクチンは、免疫に対するその効力に関して、天然の
感染と同様に作用するという利点を有している。弱毒性
ワクチンは、宿主中で増殖し、免疫原性である場合に
は、抗体の長期にわたる生産を刺激し、細胞性応答を誘
導し、侵入口において抗体の生産と抵抗を誘導する。
潜在的に病原性の菌株へ変異を導入することによっ
て、無毒性菌株を発育させることが可能であるが、その
結果、変異株の、宿主中に生存する能力が低下する。弱
毒性微生物の使用原理は、Salmonellaシステムを参照す
ると例示されているが、この原理は、広範囲に適用され
得る。
弱毒化が、Salmonellaの無毒性（病原性のない）菌株
の発達に関して価値があった理由は２つある。［例え
ば、無毒性菌株の発達に関しては、Baconら、（195
1）、CurtissおよびKelly（1987）、GermanierおよびFu
rer（1975）、およびHoisethおよびStocker（1981）を
参照のこと］。第１に、ヒトおよび動物において、異な
る種のSalmonella感染に対する防御的免疫応答を誘導す
ることを含めて、Salmonellaの生きた弱毒性菌株の方
が、死菌またはサブユニットワクチンよりもより効果的
であるという証拠が多数存在することである。［Hoiset
hおよびStocker（1981）;Ashcroftら、（1987）、Colli
ns（1974）;Collinsら、（1966）;Mukkurら、（198
7）；およびRobertsonら、（1983）］。第２に、侵襲性
を有するSalmonella属に属するもの、例えば、S.typhim
uriumおよびS.typhiは、経口摂取後組織に付着、侵入
し、腸管付属リンパ組織（GALT;パイエル板）の細胞中
で増殖することにより組織深部に入る。［例えば、Cart
erおよびCollins（1974）を参照のこと］。S.typhimuri
umの無毒性株は、これらの抗原に対する分泌性、細胞性
および体液性免疫応答を刺激する手段として、この部位
に異種の抗原を運搬するのに使用されている。［Clemen
tsおよびEl−Morshidy（1984）;Curtissら、（1986）;C
urtiss、（1988a）;Curtiss、（1988b）;Formalら（198
1）；およびMaskellら（1987）］。
Salmonellaを無毒性にするために、様々な異なる方法
が使用されている。これらの方法には、aroA［Hoiseth
およびStocker（1981）］、asdまたはthy［Curtissら
（1986）］、またはプリン生合成において欠陥を有する
株のような栄養要求性変異株［McFarlandおよびStocker
（1987）;O'Callaghanら、（1988）］、galE［Germanie
rおよびFurer 1975;FukasawaおよびNikaido（1959）;St
evensonおよびManning（1985）］のような炭水化物の使
用または合成において変化された変異株、温度感受性変
異株［Morrisら、（1985）］およびcya crp［Curtissお
よびKelly（1987）］のような全体的な遺伝子発現にお
いて変化された変異株が含まれる。これらの変異株は試
験され、使用されて、宿主、細菌種および免疫法の経路
に応じて異なる程度の成果を挙げるという驚くべき結果
が得られている。［ClementsおよびEl−Morshidy（198
4）;Curtissら、（1988a）;Curtissら、（1988b）;O'Ca
llaghanら、（1988）］。
発明の開示 サルモネラ（Salmonella）の病原性の高い菌株由来の
phoP変異株は、野生型親株のLD50投与量よりも１桁以上
多い投与量でも無毒性であり、GALTに限定された感染の
みを示したが、これらの変異株は、免疫原性であり、野
生型株の感染を高いレベルで防御した。本発明の様々な
実施態様は、SalmonellaにおけるphoP変異株または他の
タイプの微生物におけるphoP型変異に相等する変異株の
無毒性および免疫原性の特徴を利用している。
従って、本発明の１つの実施態様は、Salmonellaによ
って引き起こされる個体の病状を処置するためのワクチ
ンであり、このワクチンは、免疫原性を有するphoP変異
株である、病原性のないSalmonella、および薬学上受容
可能な賦形剤を含有する。
本発明の他の実施態様は、上記のワクチンであり、こ
こで、病原性のないSalmonellaは、それが由来するとこ
ろの野生型Salmonellaの病原性を低下させる少なくとも
１つの他の変異を有する。
本発明のさらに他の実施態様は、病原性微生物によっ
て引き起こされる個体の病状を処置するためのワクチン
であり、ここで、ワクチンは、免疫原性を有する病原性
のないphoP変異株であるキャリアSalmonella細胞を含
み、キャリア細胞は、該病原性微生物の免疫原性抗原を
コードする組換え発現ベクターで形質転換される。ま
た、この実施態様で意図されるのは、キャリアSalmonel
la細胞が、この細胞に対して致死性の変異を含み、その
致死性変異を補って平衡を保つ致死性宿主−ベクターシ
ステムを成立させるベクター中の組換え遺伝子によって
平衡を保たれる、ワクチンである。
本発明の他の実施態様は、phoPにおける変異株であ
り、細胞に対して致死性の変異を含み、致死性の変異を
補って平衡を保つ致死性宿主−ベクターシステムを構成
するベクター中の組換え遺伝子によって該変異が平衡を
保たれる、Salmonellaの単離された菌株である。
本発明のさらに他の実施態様は、phoPにおける変異株
であり、delta−cya delta−crpでもある、Salmonella
の単離された菌株である。
本発明のさらに他の実施態様は、ATCC No.53864、ATC
C No.53865、ATCC No.53866、その誘導体およびその変
異株からなる群から選択される、Salmonellaの単離され
た菌株である。
本発明の他の実施態様は、個体を免疫化する方法を含
む。これらの方法は、Salmonellaによって引き起こされ
る疾病に対して個体を免疫する方法を包含し、該方法
は、該個体に、Salmonellaによって引き起こされる病状
を有する個体を処置するためのワクチンを免疫学的に有
効な量で投与することを包含し、このワクチンはphoP変
異体であり免疫原性を有する病原性のないSalmonellaを
含有する。これらの方法はまた、上記のワクチンを免疫
学上有効な投与量で個体に投与することによりSalmonel
laによって引き起こされる病気に対して個体を免疫する
ことを含み、ここで、病原性のないSalmonellaは、それ
が由来するところの野生型のSalmonellaの病原性を低下
させる少なくとも１つの他の変異を有する。本発明に
は、Salmonellaによって引き起こされる病気に対して個
体を免疫化する方法もまた含まれ、この方法は、病原性
微生物によって引き起こされる個体の病状を処置するた
めのワクチンを該個体に投与して免疫することを含み、
ここで該ワクチンは、病原性のない免疫原性phoP変異株
であるキャリアSalmonella細胞を含み、このキャリア細
胞は、該病原性微生物由来の免疫原性抗原をコードする
組換え発現ベクターで形質転換されている。また、この
実施態様で意図されるのは、キャリアSalmonella細胞
が、この細胞に対して致死性の変異を含み、致死性の変
異を補って平衡を保つ致死性宿主−ベクターシステムを
構成するベクター中の組換え遺伝子によって平衡が保た
れる、ワクチンである。免疫は、免疫学上有効な投与量
で行われる。
図面の簡単な説明 第１は、Chi3687phoP株およびChi3181野生型株を接種
した後のマウスのパイエル板から得られたCFUを示す。
図２は、Chi3687phoP株およびChi3181野生型株を接種
した後のマウスの脾臓から得られたCFUを示す。
発明を実施するための形態 A.定義 「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」および
微生物を示すその他の用語は、互換的に使用され、組み
替えベクターまたは他の移入されたDNAの受容体として
使用され得、または使用されている細胞のことをさして
おり、トランスフェクトされたオリジナル細胞の子孫を
含む。単一親細胞の子孫は、偶発的または意図的な変異
のために、ゲノムまたは全ての補完的DNAにおいて、オ
リジナルの親細胞と全く同一である必要はない。例え
ば、phoPにおける変異から生じる病原性の消失を含む親
細胞の特性に関連する特性によって特徴つけられる、親
細胞に十分に類似した親細胞の子孫が含まれる。
「制御配列」は、それが連結するコード配列を発現さ
せるのに必要なDNA配列をさしていう。一般に、このよ
うな制御配列には、プロモーターおよびリボソーム結合
部位が含まれる。用語「制御配列」は、少なくとも、そ
の存在が発現に必要なすべての成分を含むものとし、そ
の存在が有利である他の成分、例えばオペレーターをも
含み得る。
「作動可能に結合された」は、上記の成分を、目的と
する方法で機能させ得る関係にある、並列する位置をさ
していう。コード配列に「作動可能に結合された」制御
配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下
で成し遂げられるように、連結される。
「レプリコン」は、すべての遺伝子要素であり、例え
ば、細胞内でポリヌクレオチド複製の自立的単位として
機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製すること
が可能な、プラスミド、染色体およびウィルスのことで
ある。
「ベクター」は、他のポリヌクレオチドセグメントが
付加されて、付加セグメントの複製および／または発現
を引き起こすレプリコンのことである。
「コード配列」は、適切な制御配列の制御下に置かれ
ると、mRNAに転写および／またはポリペプチドに翻訳さ
れるポリヌクレオチド配列のことである。コード配列の
境界は、５′末端の翻訳開始コドンおよび３′末端の翻
訳停止コドンによって決定される。コード配列は、cDNA
を含むがそれだけに限定されず、組換えポリヌクレオチ
ド配列を含み得る。
本願で使用される用語「発現ベクター」は、目的とす
るコード配列が作動可能に制御配列に結合されているベ
クターをさしていう。
「グラム陰性細菌」は、球菌、非腸内桿菌および腸内
桿菌を含む。グラム陰性細菌の属は、例えば、Neisseri
a,Spirillum,Pasteurella,Brucella,Yersinia,Francise
lla,Haemophilus,Bordetella,Escherichia,Salmonella,
Shigella,Klebsiella,Proteus,Vibrio,Pseudomonas,Bac
teroides,Acetobacter,Aerobacter,Agrobacterium,Azot
obacter,Spirilla,Serratia,Vibrio,Rhizobium,Chlamyd
ia,Rickettsia,Treponema,Camphelobacter,およびFusob
acteriumである。
「グラム陽性細菌」は、球菌、非胞子形成桿菌および
胞子形成桿菌を含む。グラム陽性細菌の属は、例えば、
Actinomyces,Bacillus,Clostridium,Corynebacterium,E
rysipelothrix,Lactobacillus,Listeria,Mycobacteriu
m,Myxococcus,Nocardia,Staphylococcus,Streptococcu
s,およびStreptomycesである。
「ミコバクテリア」は、特有の着色特性、すなわち、
酸性化有機溶剤による脱色に対する抵抗に基づいて、お
よび長鎖（およそ60個の炭素）ミコール酸の存在によっ
て定義される。
「通性細胞内病原菌」は、Salmonella,Yersinia,Past
eurella,Lagionella,Brucella,Mycobacteria,Listeria
およびNeisseriaを含む。
「処置」は、防御免疫応答をする個体にワクチンを投
与することをさしており、予防処置法および／または療
法を含む。
「天然の染色体遺伝子」は、野生型生物体の染色体中
に発生するものであり、例えば、E.coliまたはSalmonel
laにおけるアスパラギンセミアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ（asd）をコードする遺伝子、アラニンラセマーゼを
コードする遺伝子およびＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリ
ガーゼをコードする遺伝子である。天然の遺伝子の他の
例は、以下に記載されている。
本願で使用される、「組換え遺伝子」は、天然では、
大きなポリヌクレオチド分子と共に見いだされない、こ
の分子内のポリヌクレオチドの同定可能なセグメントと
して定義される。組換え遺伝子は、ゲノム、cDNA、半合
成または合成起源であり得る。
DNA構築物の「異種（非相同,heterologous）」領域
は、他のDNA分子内またはDNA分子に付加された同定可能
なDNAのセグメントであり、天然においては、該他の分
子と共には見いだされない。従って、異種領域が、細菌
遺伝子をコードする場合には、この遺伝子の側面には、
通常、細菌源のゲノム内の細菌遺伝子に隣接しないDNA
が接する。異種コード配列の他の例は、コード配列自身
が天然で発見されない。構築物（例えば、天然の遺伝子
とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝
子変異または天然に発生する変異は、本願で使用される
ような、DNAの異種領域を提供しない。
本願で使用される、「DAP」は、ジアミノピメリン酸
の両方の立体異性体およびその塩、すなわち、特に記載
されなければ、LL−およびmeso−形態である。
本願で使用される変異菌株の遺伝子記号は、Bachmann
（1987）およびSandersonおよびRoth（1987）によって
記載されるものである。トランスポゾン、得にTn10に使
用される記号は、Bukhariら（1977）に記載される慣例
に従う。
本発明のワクチンで処理された「個体」は、例えば、
家畜およびヒトを含む哺乳類、飼い鳥を含む様々な種類
の鳥類、特に農業上重要なもののような、すべての脊椎
動物を含むものとして本願では定義されている。さら
に、軟体動物およびある種の他の無脊椎動物は、原始免
疫システムを有しており、「個体」として含まれる。
本願で使用される、「形質転換」は、挿入の方法、例
えば、直接的な取り込み、電気搾孔、形質導入または接
合に関係なく、宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを挿
入することをさしていう。外因性ポリヌクレオチドは、
プラスミドとして維持され得、あるいは、ポリヌクレオ
チドの全体または部分が、宿主ゲノム内に統合され得
る。
本願で使用される、「phoP遺伝子またはその等価物」
は、他の遺伝子の発現を制御する生産物をコードし、病
原性の特質（例えば、コロニー形成の促進、侵襲性、感
染した個体に対する損傷および遺伝防御ネットワークに
おけるマクロファージまたは細胞内での生存）をコード
する遺伝子座、およびホスファターゼをコードする遺伝
子、例えばSalmonellaにおけるphoNを含む、遺伝子をさ
していう。
「phoP遺伝子またはその等価物」を含み得る生物体
は、腸内細菌の科のすべて（例えば、E.Coli,Salmonell
a,Proteus,Klebsiella,Serratia,Providencia,Citrobac
ter,Edwardsiella,HafniaおよびEnterobacter）、他の
細菌の属（例えば、Staphylococcus,Rhizobium,Mycobac
terium,Aerobacter,AlcaligenesおよびBacillus、およ
びいくつかのCandida種）を含む。phoP生産物は、酸性
ホスファターゼの調節因子である［Kierら、（197
9）］。
本願で使用される、「病原性微生物」は、病原に関連
した病状を引き起こす。
「病原性のない（病原性を消失した、avirulent）微
生物」は、感染個体内でのコロニー形成および複製能力
を有しているが、同一種の病原性（virulent）菌株に関
連する病状を引き起こさないものである。病原性がない
ということ（avirulent）は、その属また種の微生物
が、病原（pathogen）として全く機能し得ないことを意
味するのではなく、使用される特定の微生物が、処置さ
れる特定の動物に対して病原性がないことを意味する。
微生物は、通常、病原性である属または種に属し得る
が、病原性のない菌株に属さなければならない。病原性
消失（avirulent）菌株は、その病原性を消失していな
い（virulent）菌株に関連する病状のすべてを導入する
ことはできない。微生物の病原性消失菌株は、変異によ
って病原性菌株から得られ得る。
本願で使用される、用語「微生物」は、細菌、原虫類
および単細胞真菌類を含む。
「キャリア」微生物は、上記のように定義された病原
性消失微生物であって、目的のタンパク質をコードする
組換え遺伝子を含み発現する。本願で使用されるよう
に、「キャリア微生物」は、組換え宿主細胞の形態であ
る。
「抗原」は、宿主の免疫システムを刺激し、分泌、体
液性および／または細胞性の抗原特異性免疫応答を引き
起こす、１つまたはそれ以上のエピトープを含む分子を
さしていう。この用語はまた、「免疫原」と互換的に使
用される。
「ハプテン」は、それ自身では宿主免疫システムを刺
激して分泌性、体液性または細胞性免疫応答をさせな
い、１つまたはそれ以上のエピトープを含む分子をさし
ていう。
用語「エピトープ」は、抗原またはハプテン上の部位
をさしており、この部位において特異的な抗体がこの抗
原またはハプテンに結合する。エピトープは、エピトー
プに特有の配座内に３個のアミノ酸を含み、通常、エピ
トープは、少なくとも５個のこのようなアミノ酸、さら
に一般には、少なくとも８から10個のこのようなアミノ
酸から構成される。この用語はまた、「抗原決定基」ま
たは「抗原決定部位」と交代で使用される。
組成物またはワクチンに対する「免疫応答」は、目的
とする組成物またはワクチンに対する細胞および／また
は抗体媒介の免疫応答が宿主内で起こることである。通
常、このような応答は、組成物またはワクチンに含まれ
る１つまたはそれ以上の抗原に特異的な抗体を産生する
もの、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞お
よび／または細胞障害性Ｔ細胞からなる。
「ワクチン組成物」は、将来の損害が防御されるよう
に、生きた生物体の免疫システムを刺激するために使用
される薬剤を意味する。「免疫化」は、Ｔリンパ球が、
病原体を殺すか、および／または他の細胞（たとえば食
細胞）を活性化させ得る、高いレベルで持続する抗体お
よび／または細胞性免疫応答を引き起こす方法をさして
おり、この免疫化は、生物体が以前にさらされた病原体
または抗原に対して行われる。用語「免疫システム」
は、例えば、インターフェロンの生産のような、異物の
存在に対する単細胞生物体の応答を含み得るが、本出願
では、この用語は、解剖学上の形態を持つものおよび、
多細胞生物体がその細胞または細胞外液に侵入する抗原
物質に対する抗体を生産する機構に限定される。このよ
うにして生産された抗体は、イムノグロブリンA,D,E,G
またはＭのような免疫学上のどのクラスにも属し得る。
特に関心のあるのは、イムノグロブリンＡ（IgA）の生
産を刺激するワクチンである。なぜなら、このワクチン
は、温血動物の分泌システムによって生産される主要な
イムノグロブリンであるからである。抗原に対する免疫
応答に関しては、充分に研究され、広範囲に報告されて
いる。免疫学の調査は、Barrett、James T.,Textbook o
f Immunology:第４版、C.V.Mosby Co.,St.Louis,MO（19
83）に記載されている。
「脊椎動物」は、セグメントされた骨質または軟骨性
脊柱によって特徴つけられる、魚類、両性類、は虫類、
鳥類および哺乳類を含む、脊索動物門の第１部門である
脊椎動物亜門のすべてである。すべての脊椎動物は、機
能的な免疫システムを有し、抗体を生産することによっ
て抗原に応答する。
用語「タンパク質」は、本願では、天然に発生するポ
リペプチドをさすものとして使用される。用語「ポリペ
プチド」は、その最も広い意味で、すなわち、ペプチド
結合を介して結合されるアミノ酸（ジペプチドまたはそ
れ以上）のすべてのポリマーに使用される。従って、用
語「ポリペプチド」は、タンパク質、オリゴペプチド、
タンパク質断片、アナログ、変異タンパク質、融合タン
パク等を含む。
B.一般説明 本発明の実施にあたっては、特に指示が無い限り、通
常の細胞培養、分子生物学、微生物学、組み換えDNA、
および免疫学の技術を使用するが、これら当業者の技術
範囲内である。このような技術は文献に十分に説明され
ている。例えば次にあげる文献を参照のこと。Davis,R.
W.,Botstein,D.,およびRoth,J.R.ADVANCED BACTERIAL G
ENETICS:A MANUAL FOR GENETIC ENGINEERING.（Cold sp
ring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,198
0）,Maniatis,FritschおよびSambrook,MOLECULAR CLONI
NG:A LABORATORY MANUAL（1982）;DNA CLONING,Volumes
I and II（D.N.Glover編,1985）;OLIGONUCLEOTIDE SYN
THESIS（M.J.Gait編,1984）;NUCLEIC ACID HYBRIDIZATI
ON（B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、1984）;B.Perbal,
A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING（1984）;the
series,METHODS IN ENZYMOLOGY（Academic Press,In
c.）;VECTORS:A SURVEY OF MOLECULAR CLONING VECTORS
AND THEIR USES（R.L.RodriguezおよびD.T.Denhardt
編,1987,Butterworths）;and J.H.Miller,EXPERIMENTS
IN MOLECULAR GENETICS（1972,Cold Spring Harbor Lab
oratory），およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLO
GY,Volumes I−IV（D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編,19
86,Blackwell Scientific Publications）。
ここで述べられている全ての特許、特許出願、および
公報は、上記あるいは下記のものすべて参考のため、こ
こ引用されている。
本発明の中心的特性は、全面的にせよ部分的にせよ、
phoP遺伝子又はこれに相当するものの変異の結果として
病原性をなくしてはいるが、その免疫原性を保持してい
る微生物である。本発明の細胞は、生ワクチンの成分に
適している。ワクチンは、病原性のない菌株が誘導され
る微生物系で、その病原菌株が原因で起きる個体の病気
の予防処置に用いられ、例えばSalmonellaの場合には、
病原性のない菌株は免疫原性である。他型のワクチンの
場合、phoP型微生物は異種のポリペプチドをコードする
組み換え遺伝子変異を含むキャリア微生物であるため、
異種のポリペプチド抗原が、ワクチンで処理した個体の
コロニー形成部位に輸送される。
phoP遺伝子およびこれに相当する遺伝子は、“病原性
の全面的な制御”を示すタイプ、即ち細菌の病原性因子
をコードする遺伝子を含む多数の遺伝子を統合的に制御
するタイプである。これは、Vibrio choleraeのtoxR又
はBortadella pertussisのvirと類似の方法で、毒性の
遺伝子の発現を制御する。toxR遺伝子は、Millerおよび
Mekalanos（1984）およびTaylorら（1987）が検討して
おり、vir遺伝子は、Stibitsら（1988）が検討してい
る。このことは、phoPの生成物は、病原性微生物が、マ
クロファージの中で生存することを可能にする遺伝子の
発現を制御し、殺菌活性を有するマクロファージの陽イ
オン蛋白ディフェンシン（defensins）に対して不感性
になるというFieldら（1989）の考えと一致している。F
ieldら（1989）;Millerら（1989）。Salmonellaの場合
には、phoP遺伝子産物はまた、phoP遺伝子由来の非特異
的酸性ホスファターゼの発現も制御する。
phoP型変異株の特徴の一部は、S.typhimuriumの免疫
原性phoP変異株によって例示される。これらの病原性の
ない変異株は、免疫反応を起こすのに十分な期間、経口
感染した動物のパイエル板の感染を確立することができ
るが、脾臓に到達するには全く不十分である。phoP変異
株は、菌株の病原性の指標である組織培養細胞に付着お
よび侵襲するという、病原性の親株と同様の能力を示
す。これらの指標細胞の同定は、当業者に公知である。
例えば、S.typhimuriumを包含するSalmonellaの病原性
菌生は、Henle 407、Hela、Hep−２、CHO、MDCK細胞の
ような様々な培養細胞を侵襲する。さらに、Salmonella
変異株は親株の運動性、１型線毛を維持しており、親株
と類似したリポ多糖体（LPS）組成を有している。その
上、変異株の表現型は安定している。後者の特性を決定
する方法は、当業者に周知である。しかしながら、phoP
が変異した菌株が、phoP遺伝子以外の他の遺伝子がさら
に変異して変化した発現型を有し得ることも考えられ
る。phoP変異に加えて変異を有する菌株が考えられ、こ
れらも本発明の範囲内にある。
phoP変異株の、さらなる、そして有意な特性は、例え
ばSalmonellaにおける非特異的酸性ホスファターゼのよ
うな、ホスファターゼの構造遺伝子のphoPによる制御の
結果生じる。Salmonellaで例示したように、一般に、ph
oP型変異株には非特異的酸性ホスファターゼ活性が欠如
している。しかしながら、このホスファターゼ活性の欠
如は、たぶんphoP型遺伝子のホスファターゼの構造遺伝
子の発現に対する制御を除く第２の変異によって、克服
され得る。このように、病原性を欠く状態は維持してい
るが、表現型ではPho+で、しかもホスファターゼを産生
するphoPの変異株を得ることができる。したがって、ホ
スファターゼを産生できないこと自体は、phoP変異株に
病原性がないことの原因ではない。
phoP又はこれに相当する遺伝子が変異した菌株、特に
望ましい欠失変異株は、トランスポゾンを用いる技法で
できる。多くのポイントで細胞の染色体にトランスポゾ
ンが加えられる。トランスポゾン挿入および欠失の特徴
は、Kleckner（1977）に総説されている。例えばE.coli
およびS.thphimuirum、S.typhi、S.enteritis、S.dubli
n、S.gallinarium、S.pylorum、S.arizona、およびS.ch
oleraesuisのような様々なSalmonellaを包含する多様な
細菌種のphoP変異株を作製するのに、テトラサイクリン
耐性（およびフザリン酸感受性）を与えるトランスポゾ
ンTn10が使用され得る。phoP遺伝子に相当する遺伝子に
欠失変異が存在する他の生物の変異株の単離は、病原性
菌株に欠失を起こす、トランスポゾン（例えば、Tn5、T
n10、Tn916、Tn917または当該分野で知られているトラ
ンスポゾンを使用して）、そして、非特異的／酸性ホス
ファターゼの基質（例えば、４−ブロモ−３−クロロ−
２−インドリルホスフェートまたはα−ナフチルホスフ
ェート）を用いてPho-表現型をスクリーニングすること
により達成され得る。phoPまたはこれに相当する遺伝子
に制御されないホスファターゼが微生物に存在するとい
う場合には、これらのホスファターゼを失活させる変異
がトランスポゾン変異誘発開始菌株に含まれていなけれ
ばならない。
phoP変異株を作製する１つの方法を、下記の実施例に
記述する。その他の方法も可能である。ある方法におい
ては、S.typhimurium LT−２のphoP変異に、形質導入を
行う性質のあるファージp22HT intを、LT−2 X3000菌株
（米国特許出願NO.251,304参照）のTn10ライブラリー上
で増殖させて、phoP遺伝子に隣接するTn10を挿入する方
法を選択し、12単位/mlのテトラサイクリンと40μg/ml
の５−ブロモ−４−クロロ−２−インドリルホスフェー
ト（BCIP）を唯一のリン酸源として含むNeidhardt培地
で選択した。増殖する稀な被形質導入体には、たぶん野
生型Pho+遺伝子に密接に連鎖したTn10が存在する。デル
タ−phoP変異を標準法で他の菌株に移動させるのに、Tn
10挿入部分のDNAの欠失を都合よく使用することができ
るほどTn10がphoPに近い場合には、多数のTn10形質導入
体からのフザリン酸耐性誘導体の選別および、BCIPを含
有する培地での平板培養で、デルタ−phoP変異が証明さ
れる。（Kleckner 1977、および米国特許出願No.251,30
4、これは譲受人が所持しており、またここに引用とし
て加える）。
phoP変異を生み出す別法では、S.typhimurim phoP遺
伝子に密接に連鎖する栄養素要求性変異を使用する。pu
rB遺伝子はそのような性質を有する。上述のようにP22
HT intをTn10ライブラリー上で増殖させて得られた溶解
産物を用いてpurB S.typhimurim LT−２変異株にpurB+
形質導入し、Tcr phop- purB+被形質導入体を、アデニ
ンを含まずテトラサイクリンおよびBCIPを含むNeidhard
t培地で選択、同定する。phoP遺伝子の中に挿入されたT
n10が存在する（即ち、phoP::Tn10）変異が望ましい。
フザリン酸耐性を選別すれば、テトラサイクリン感受性
デルタ−phoP変異が作製される。
S.thphimurium LT−２で分離したデルタ−phoP変異
は、デルタ−phoP::Tn10に結合したTn10挿入体を使用し
て、他のSalmonella株に形質導入することができる。ど
ちらの場合にも、形質導入体はテトラサイクリン耐性で
選別される。phoP変異の導入により病原性をなくすべく
望んでいる毒性の高いSalmonella菌株がP22感受性なら
ば、結合したTn10を持つデルタ−phoP菌株またはphoP::
Tn10変異株の何れかで、P22 HT intを増殖させることが
でき、その溶解産物を使用して病原性のSalmonellaにテ
トラサイクリン耐性の形質を導入し得る。フザリン酸耐
性を選別することにより、デルタ−phoP変異に隣接し
た、またはphoPに挿入されたTn10変異を除去し得る。ph
oP::Tn10変異株の場合には、デルタ−phoP変異が創られ
る。phoP変異の導入により病原性をなすくべく望んでい
る病原性の高いSalmonella菌株がP22耐性であれば、ラ
フ型Salmonella株にのみ効率よく感染する。P1L4のよう
な他の形質導入ファージを使用することができる。この
場合には、形質導入又は２−デオキシガラクトース耐性
株を選別することにより、S.typhimurium LT−２デルタ
−phoP又はphoP::Tn10変異株にgalE変異を導入すること
ができる（米国特許出願No.251,304）。ガラクトースの
不存在下で、galE変異株を増殖すると、これはラフ型お
よびP1L4感受性となって、形質導入を行うための溶解産
物の増殖を許す。病原性Salmonella galE変異受容菌株
も、２−デオキシガラクトースを使用して選別される。
連結したTn10を有するgalEデルタ−phoP上あるいはgalE
phoP::Tn10株上で増殖したP1L4を使用する、これらのg
alE受容株への形質導入は、テトラサイクリンを含み、
さらにphoP-を同定するためにBCIPを含んでいる培地で
形質導入体を平板培養することにより達成され得る。フ
ザリン耐性株を選別すると、Tn10が排除され、phop::Tn
10変異株の場合にはデルタ−phoP変異が生じる。galE以
外の遺伝子の変異のためラフ型であるgalE+ S.typhimur
ium LT−２株上で増殖したP1L4を使用する、P1L4介在形
質導入により、次にgalE変異が除去できる。このような
変異株は当該分野に精通している人々には周知である
（Sanderson and Roth参照）。
組み換えDAN技法が様々な病原性細菌のphoP変異を起
こす場合にも使われることは明白である。これは、遺伝
子クローニングおよびDNAハイブリダイゼーション工
学、制限酵素部位のマッピング、クローン化されたphoP
配列を制限酵素で切断することによる欠失の作製、およ
び選別された細菌病原体にデルタ−phoP欠陥を導入する
対立形質置換組み換えによって、達成され得る。これを
達成する方法は、技術を学んだ人々には周知である（上
記参考文献参照）。
本発明の最初の実施態様では、ワクチンは病原微生物
を原因とする疾病の治療用である。本ワクチンは、欠失
変異が望ましいが、phoP又はこれに相当する遺伝子の変
異を含む、病原性のない免疫原性微生物および薬学上適
当な賦形剤を包含する。好適な実施態様では、Salmonel
laのこの病原性株、中でも農業上重要な動物（例えば、
ニワトリ、ウシ、ウマの類、ヒツジ、ブタ、またはcapr
a属を含む）、スポーツ様の動物およびペット様の動
物、およびヒトに病気を引き起こす菌株により引き起こ
される疾病の治療用である。これらのワクチンは、免疫
原性のSalmonellaの病原性のないphoP型変異株を含有
し、疾病の原因となる病原性菌株に対する防御を提供す
る。
もう１つの実施態様では、ワクチンはphoP又はこれに
相当する遺伝子が変異している微生物を含有し、ワクチ
ン、キャリア微生物、および／または所望のポリペプチ
ド産生源として細胞を使用する場合に望ましい特性を与
える、他の変異も１つ以上含んでいる。弱毒ワクチン株
は理想的には多くの特徴を持っているべきである。まず
第１に、完全に病原性がなく、高い免疫原性を有さねば
ならない。このことは、特に免疫化された母集団の遺伝
子が多様であり、食餌や衛生に個体差があるため、通常
は達成が難しいバランスを必要とする。第２に、少なく
とも病原性のないSalmonellaに関しては、病気又は正常
な宿主の生理や成長に障害を起こさずに、腸や腸関連リ
ンパ組織にコロニー形成する能力を保持しなければなら
ない。農業上重要な動物を免疫化する場合には、一時的
な成長の停止も発育阻害も経済的に不都合な結果となる
ため、前者の特性が特に重要である。第３に、復帰変異
又は遺伝子転移による特性の欠損を妨害する欠失変異が
望ましいが、２つ以上の病原性を低下させる変異がなけ
ればならない。この前者の特徴は、低病原性ワクチンの
安全性を高め、ヒトのワクチンの場合には特に考慮すべ
き用件であり、動物の免疫化に使用するワクチンの菌株
の場合、その中には食物連鎖を経てヒトに伝えられる可
能性もある。第４に、低病原性化する表現型は、食餌中
の何者にも、また動物宿主にも影響されてはならない。
免疫化する微生物がキャリア微生物として使用される場
合には、その系は免疫された個体にクローン化遺伝子の
安定した（しかも高水準が望ましい）発現をさせなけれ
ばならない。
このように、本発明の実施態様の１つの型では、ワク
チンは通常の細胞内寄生生物である微生物を含み、この
微生物は、好ましくは、少なくとも２つの変異のあるSa
lmonellaであり、その変異の１つはphoP遺伝子にあっ
て、他の１つは微生物の病原性を低めるように作用し、
phoP遺伝子に復帰変異が起きた場合には、微生物が野生
型の病原性に復帰しない可能性を有意に高める遺伝子に
ある。これらの変異は、例えば、変異又は欠失した場
合、病原性を失わせる遺伝子（たとえばプラスミド保存
株）、栄養素要求性にする遺伝子、炭水化物の利用又は
合成に変化をもたらす遺伝子、あるいは全体的な遺伝子
発現に欠陥がある遺伝子に存在し得る。後者の例として
は、CurtissおよびKelly（1987）が記述しているcya cr
p変異株がある。微生物が病原性を有せず、免疫原性を
維持している限り、微生物、特に上述した型の変異を２
つ以上含んでいるsalmonellaは、本実施態様の範囲内に
含まれる。phoP変異と合併して導入され得るSalmonella
の変異例を表１に示す。
本発明の別の実施態様では、ワクチンはphoPまたはこ
れに等価の遺伝子に変異のある微生物を含み、その微生
物は異種のポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を
含む“キャリア”であって、ワクチンで処置された個体
内のコロニー形成部位に、組み換え遺伝子の発現産物が
ワクチンとともに送り届けられる。キャリア微生物の組
み換え遺伝子は、真菌類、細菌、寄生生物、またはウイ
ルス性病原体の抗原、あるいはアレルゲンをコードする
と考えられる。局所免疫が重要な場合には、生ワクチン
は特に有用であり、最も優れた防御とも言える。キャリ
ア微生物が病原性をもたないという必要条件は、微生物
のphoP変異によって満たされる。しかしながら、微生
物、特に微生物が野生型の毒性に復帰変異する可能性を
減少させる補足的な変異が少なくとも１つあるSalmonel
laは、本実施態様の範囲内と考えられる。この型の変異
のタイプは上述してある。
キャリア微生物の場合には、異種の組み換え型ポリペ
プチドが発現しないと微生物が死んでしまう、“平衡化
された致死性”となるように、phoP-型微生物を遺伝子
操作することも望ましい。
このタイプの“平衡化された致死性”変異株は、細胞
の生存に不可欠な酵素をコードする天然の染色体遺伝子
の機能が欠如しているという特徴がある。上記酵素は好
ましくは、欠くことのできない細胞壁構造の成分を生合
成する工程を触媒する酵素であり、さらに好ましくは、
β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（asd）をコードする遺伝子である。この変異株は天然
の酵素の機能性代替物である酵素をコードする第１の組
み換え遺伝子を含んでおり、この第１の組み換え遺伝子
は欠損した染色体遺伝子を置換することができない。第
１の組み換え遺伝子は、所望の生成物をコードする第２
の組み換え遺伝子に構造的に結合している。第１の組み
換え遺伝子の発現による生成物が存在しない環境下に細
胞が存在する時、asdが欠如している場合には、第１の
組み換え遺伝子が欠損していると、溶解によって細胞が
死に至る。このタイプの“平衡化された致死性”変異株
を調製する方法は、1988年10月３日に出願された米国特
許出願No.251,304に開示されていて、本願の譲受人が所
有しており、ここに参考文献として組み入れられてい
る。phoP型遺伝子またはphoPの変異に起因する病原性の
ない“平衡化された致死性”変異株は、所望の生産物の
商品製造に有用であり、環境の中へ放出することも可能
である。
本発明の実施態様では、ここでキャリア細胞と称され
る病原性微生物の病原性をもたない誘導体も、GALT、例
えば回腸パイエル板に、選択された抗原を送り出すのに
使用することができる。Salmonellaなど、ある属の細菌
はパイエル板に帰ることが公知である（Carter,P.B.お
よびF.M.Collins,J.Exp.Med.139:1189（1974））。S.ty
phimurium−E.coliハイブリッドも、マウスのパイエル
板をコロニー化することが明らかにされている（Hohman
n,A.W.ら、Infect.and Immun.22:763（1978））。これ
らのキャリア細菌に病原性の微生物由来の遺伝子が含ま
れていて発現するのであれば、病原体から産生された抗
原性遺伝子産物に対する抗体が誘導される。組み換えDN
A技法の出現に伴って、今日では、病因となる病原体そ
のものによるのではなく、その抗原の遺伝子を発現でき
る別の細菌宿主株によって、特異的な抗原が産生される
総体的に独特なワクチンの開発が可能になってきた。抗
原が哺乳類宿主の抗原と交差反応し、それゆえ自己免疫
の誘導を増大するとき、影響を及ぼす交差反応性抗原決
定基が産生されないように、組み換えDNA技法を用いて
遺伝子を変化させることも可能である。このように、組
み換えDNA技法は、脊椎動物宿主抗原と交差反応し得る
かまたは自己免疫状態を誘発し得る物質を何も持ってい
ないワクチンの開発にも使用できる。
局所的な免疫が重要で、最も優れた防御と言える場合
には、細菌、真菌類、寄生生物またはウィルス性疾患病
原体に対する有効なワクチンの開発に、本発明が広く応
用できることは明らかである。そのいくつかの例は、Ye
rsinia pestisによる肺斑、Neisseria gonorrhoeaeによ
る淋疾、Treponema pallidumによる梅毒、およびChlamy
dia tracomatisによる性病および眼の感染のコントロー
ルのためのワクチンである。咽喉炎または心疾患を起こ
すような種の、Ａ群およびＢ群由来のStreptococci,Nei
sseria meningitidis,Mycoplasma Pneumoniae,Hemophil
us influenza,Bordetella pertussis,Mycobacterium tu
berculosis,Mycobacterium leprae,Bordetella avium,E
scherichia coil,Streptococcus equi,Streptococcus p
neumoniae,Brucella abortus,Pasteurella hemolytica,
Vibrio cholera,Shigella種、およびLegionella pneumo
philaは、遺伝子を得ることができる本発明の範囲内の
細菌のさらなる例である。インフルエンザウィルスに対
して産生されたもののような、ウィルスのワクチンも本
発明に含まれる。DNAウィルム或はRNAウィルスのどちら
であっても、その他のウィルスに対するワクチンを作る
ことができる。分類による例をあげると、Papovirus,Ad
enovirus,Herpesvirus,Poxvirus,Parvovirus,Reovirus,
Picornavirus,Myxovirus,Paramyxovirus,またはRetrovi
rusがある。病原性真菌、原生動物、および寄生虫によ
る感染症を防護するワクチンも、本発明によって考えら
れる。
さらに、ワクチンの免疫原性の構成成分が宿主のアレ
ルゲンである実施態様では、このようなワクチンは、ア
レルギー性のホストを特異的に脱感作するように設計し
た暴露療法に使用され得る。
その実施態様のひとつにおいては、本発明は脊椎動物
の免疫用ワクチンであるということができる。このワク
チンは、病原性微生物の、生きた、病原性をもたない誘
導体を含み、その誘導体は実質的に機能性アデニル化サ
イクレースおよびAMP受容体蛋白質を産生することがで
きない一方、上述の動物の病原体であるかまたはアレル
ゲンを産生する微生物由来の組み換え遺伝子を発現する
ことができる。
さらに別の実施態様では、本発明の病原性のない微生
物は、様々な宿主蛋白の合成用ベクターとして使用され
得る。本発明の病原性のない微生物は、宿主に導入され
た後、GALT、腸間膜リンパ節、および脾臓を包含する様
々な免疫担当構造間を動き回ることができるので、この
ような微生物は様々な免疫調節産物を標的として使用さ
れる。したがって、免疫調節蛋白質またはペプチドをコ
ードする１つ以上の遺伝子を組み換え技術により病原性
のない微生物に導入すると、該微生物が適当な免疫担当
組織内に定着したときに、該微生物は、組み換え産物を
発現して、宿主の免疫反応を抑制、増大或は変化させ
る。免疫調節分子の例は下記のものを含むが、これらに
限られるものではない。コロニー形成刺激抑制因子（マ
クロファージ、顆粒球、または混合物）、マクロファー
ジケモトキシン、マクロファージ阻止因子、白血球阻止
因子、リンホトキシン、幼若化因子、インターフェロ
ン、およびインターロイキン。
本発明の実施態様中の用語を、下記の考察で分析す
る。
ワクチンとは、将来の危害から保護するために、生き
ている生物の免疫系を刺激するのに使用する物質を意味
する。免疫化とは、高値の抗体を維持する誘導プロセ
ス、および／またはＴリンパ球が病原体を殺し、そして
／または生体内においてそのような作用を行う他の細胞
（例えば食細胞）を活性化し得る細胞性免疫反応を誘導
するプロセスをさしていい、それはその生物が以前に曝
された病原体または抗原に向けられている。“免疫系”
という熟語は、例えばインターフェロンの産生など、外
来の物質の存在に対する単細胞生物反応を含み得るが、
本願においては、生物の細胞または生物の細胞外液を侵
襲する抗原性物質に対して、多細胞生物が抗体を産生す
る解剖学的特徴およびメカニズムに限定して、本熟語を
適用する。このようにして産生される抗体は、イムノグ
ロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭのように、免疫学的ク
ラスのいずれかに属し得る。本発明のワクチンはイムノ
グロブリンＡ（IgA）の産生を刺激するものに限定され
ないが、とりわけ興味深いのは、IgAの産生を刺激する
ワクチンである。なぜなら、これは温血動物の分泌系に
よって産生される基本的な免疫グロブリンであるためで
ある。例えば、ここに記述されている性質を有するワク
チンは、IgA産生に加えて例えば細胞性免疫および体液
性免疫などの幅広い免疫反応を生み出すと考えられる。
抗原に対する免疫反応は、十分に研究され、広く報告さ
れている。Barrett,James T.,Textbook of Immunology,
第４版、C.V.Mosby Co.,ミズリー州、セントルイス（19
83）に、免疫に関する概説がある。
本発明の１つの実施態様では、GALTまたはBALTに帰る
病原性微生物の病原性をもたない誘導体が、病原体また
はアレルゲンに対する抗体反応の刺激に使用される遺伝
子産物のキャリアとして使用されている。「病原性のな
い（avirulent）」とは、その属または種の微生物が、
病原体として機能し得ないということを意味するのでは
なく、使用された特定の微生物が、処置される特定の動
物に関して病原性がないということである。この微生物
は、普通は病原性（pathogenic）の属または種に属する
こともあるが、病原性のない株に属さなければならな
い。病原性（Pathogenic）とは、疾病を引き起こした
り、正常な生理学的機能を傷害できることを意味する。
病原性のない（avirulent）菌株は、対応する病原性菌
株と通常は関連ある疾病の症状を完全に誘発することが
できない。ここで使用される微生物には、細菌、原生動
物、および単細胞真菌類が含まれる。
遺伝学的物質を第１の生物から、通常では第１の生物
と遺伝学的物質が交換されていない第２の生物に転移す
る手法は、組み換えDNAの手法が急速に普及した結果、
広く利用できるようになった。本願では、第２の生物の
生殖で同一の遺伝学的物質を有する子孫が生じる方法
で、ある生物から第２の生物に転移させた遺伝学的物質
を、組み換え遺伝子と言う。遺伝子という用語は、あら
ゆる遺伝形質の生物学的単位を表すために、ここでは最
も広い意味で使われている。組み換え遺伝子が、例えば
機能性ポリペプチドである高分子を産生したりあるいは
調節することができ、親株に存在する完全な遺伝子であ
る必要はない。抗原性産物を産生する際に、ガイドとし
て使用される鋳型として遺伝子が働けることだけが必要
である。この産物は、親にはそのもの自体の型が見られ
ないものであり得る。例えば、アミノ酸残基100個を含
むポリペプチド抗原をコードする機能的な遺伝子は、部
分的にキャリア微生物に転移され、アミノ酸残基が僅か
75個または10個というさえもあるものを含むポリペプチ
ドが、宿主細胞の細胞機構によって産生される。しか
し、この遺伝子産物が、親の生物に存在する類似した抗
原に対する抗体産生を引き起こす抗原であれば、この遺
伝子は本発明で定義された遺伝子という用語の範囲内で
あると考えられる。あるいは、特定の抗原またはそのフ
ラグメントのアミノ配列が知られていれば、DNAフラグ
メントまたはその類似体を、自動遺伝子合成装置などで
化学的に合成し、そのDNA配列を適当な発現ベクターに
導入することができる。スペクトルの他端には、幾つか
の遺伝子産物をコードするDNAの長い部分があり、その
うちの１個またはすべてが抗原となり得る。したがっ
て、ここで定義し、特許請求の範囲に記載された遺伝子
は、抗原を産生し得る遺伝形質のいずれもの単位であ
る。この遺伝子は、染色体、プラスミド、またはウィル
ス起源のいずれでもあり得る。
遺伝子が免疫反応を効果的に起こすためには、遺伝子
が発現されなければならない。遺伝子の発現とは、遺伝
子構造内の固有の情報（DNAの塩基配列）が、遺伝子が
存在する細胞の生物学的メカニズムによって、RNA分
子、ポリペプチドまたはその他の生物学的分子の形の物
理的産物に変換されることを意味する。このようにして
産生された生物学的分子を、遺伝子産物と呼ぶ。ここで
用いられる遺伝子産物という用語は、生物学的産物また
は、遺伝子のコントロール下で生じた生化学的反応の結
果として産生されたあらゆる産物をさして言う。遺伝子
産物は、例えば、RNA分子、ペプチド、あるいは酵素ま
たは遺伝子の最初の産物（つまり代謝性の産物）である
他の分子のコントロール下で産生された産物であり得
る。例えば、遺伝子はまず、RNA分子の合成をコントロ
ールする。このRNA分子は、遺伝子が存在するオリジナ
ル細胞にとっては外部の環境下で、リボソームの作用に
よってグリカン類の生成を調節する酵素に翻訳される。
RNA分子、酵素、グリカン類は全て、ここで使われる用
語における遺伝子産物である。これらのうちのいずれも
が、そして、糖蛋白および多糖類のような他の多くの遺
伝子産物が、動物の免疫系に導入されると、抗原として
作用する。糖蛋白およびリポ蛋白を包含する蛋白遺伝子
産物は、ワクチンにおいて抗原として使用するのに好ま
しい遺伝子産物である。
ワクチンが抗体を効果的に産生するためには、ワクチ
ンを投与された動物の抗原産生機構が活動する状態にな
るように、抗原性の物質が放出されなければならない。
したがって、遺伝子産物の微生物キャリアが動物に導入
されなければならない。先に述べたように、静脈内、筋
肉内、皮下注射または乳房内、腹腔内あるいは窒投与な
ど、他のワクチン投与方法も可能であるが、GALTまたは
BALT細胞の好ましい反応を刺激するためには、経口投
与、胃挿管、またはエアゾールの形のような方法によ
る、消化管または気管支に、微生物または遺伝子産物を
直接導入することが好ましい。
キャリア微生物として病原性のない微生物を使用する
場合には、キャリア微生物が動物内に存在すると直ち
に、抗原が動物の免疫系に利用されるようにならなけれ
ばならない。このことはキャリア微生物が死んで抗原分
子が放出される時に、完成されると考えられる。勿論、
溶解せずに原形質周囲の内容物を放出する“漏出性の”
病原性のない変異株を使用することも可能である。ある
いは、細胞が死ぬ前に、キャリア細胞によって外の環境
にも利用できるようになるような抗原の産生をコントロ
ールする遺伝子を選択してもよい。
asd変異による病原性のない菌株を使用することおよ
びAsd+クローニングベクターが時々欠損していることに
より、各世代において細菌の約１％が溶解し（実施例参
照）、細胞内容物を放出して、あらゆるコロニー形成お
よび毒性抗原を含む放出細胞内容物に対する免疫反応を
刺激する。
病原体を使用して他の病原体からGALTまたはBALTに抗
原を送り届けることは、その病原体が病原性をもたない
ように変えられるという事実が無ければ、パイエル板ま
たはBALTを侵襲する力を保持していても、不適当であ
る。
組み換え遺伝子が誘導される微生物は、ワクチンが投
与される動物の病原体、またはその動物のアレルゲンま
たは他の抗原を産生する微生物であり得る。アレルゲン
とは、アレルギー反応を引き起こす物質であり、この場
合は動物はアレルギー反応を引き起こす物質に対するワ
クチンを投与される。動物のフケおよび花粉などのよう
な、多種多様な物質がアレルゲンとなり得、特定の物質
に対しても、個々の動物のアレルギー反応を示す動物
に、アレルゲンに対する耐性を惹起することは可能であ
る。耐性を惹起する方法は周知であり、一般には投与量
を増加しながら、動物にアレルゲンを投与することを包
含する。耐性の惹起に関するさらなる検討は、先に引用
したBarrettの教科書にある。最後に、ベクターによっ
て免疫調節遺伝子が発現される場合には、宿主生物自身
が遺伝子物質源としての任務を果たすこともある。上に
開示したタイプの生ワクチンを動物に投与する方法は、
いずれの公知の標準法であってもよい。その方法として
は経口摂取、胃挿管、または気管−鼻噴霧がある。この
ような方法を用いれば、GALTまたはBALT細胞に生ワクチ
ンが容易に到達して抗体産生が惹起されるので、好まし
い投与方法である。静脈内注射のような、キャリア微生
物を動物の血流に到達させる他の投与方法も許容され得
る。後述するが、本発明の実施態様による静脈内、筋肉
内、または乳房内注射もまた許容される。
好ましい投与方法は経口摂取、エアゾール噴霧または
胃挿管法であるため、好ましいキャリア微生物は、ワク
チンを投与されるべき動物の腸または気管支のリンパ上
皮構造のいずれかに優先的に帰る種に属している微生物
である。このような菌株は、腸病原性菌株の遺伝子操作
によって産生された腸病原性菌株の病原性のない誘導体
であることが望ましい。パイエル板に帰り、したがって
IgA産生を直接刺激する菌株が最も好ましい。動物の場
合、この中にはパイエル板に帰るSalmonella、Salmonel
la−E.coliハイブリッドの特定の菌株が含まれる。
組み換えDNAの手法は、現在では十分に知られてお
り、広く普及しているので、ルーチン操作であると考え
られる。非常に一般的な広い用語では、この方法は、あ
る生物の遺伝物質、より一般的に言えば遺伝物質の一
部、を第２の生物に転移させ、転移された遺伝物質が、
移転先の生物の遺伝物質の恒久的な一部になる（組み換
える）方法である。この方法においては、通常はまず、
親株からDNAの小部分（プラスミドまたは親の染色体の
どちらか）を得る。プラスミド（染色体外因子とも呼ば
れる）は細胞の染色体とは物理的に分離された遺伝形質
単位である。DNAはどのような大きさであってもよく、D
NA分子の特定の塩基対部位で分離するように作用する制
限エンドヌクレアーゼの作用によって得られることが多
い。組み換え分子を形成するため、プラスミド、ファー
ジまたはコスミッドベクターに連結した後に、形質転換
（外の環境からの裸のDNAの取り込みであり、カルシウ
ムイオンのような、様々な化学物質の存在により人工的
に誘発される）ような様々な手段でその組み換え分子を
宿主細胞に転移させる。形質導入のような他の方法も適
しているが、この場合には、組み換えDNAはファージ内
にパッケージ化されている。適する形質導入ファージは
当該分野において公知であり、コスミドベクター用の形
質導入ファージを含むが、これに限られるものではな
い。組み換えDNAがキャリア細胞内に入ると、分離され
た一部として存在し続ける（一般に完全な伝達プラスミ
ド（complete transmitted plasmid）がこの場合にあて
はまる）か、または宿主細胞染色体に挿入されて、細胞
分裂中に染色体とともに再生産される。
病原性のない微生物の誘導体も本発明の範囲内である
と考えられる。誘導体とは、病原性のない株の、有性的
にまたは無性的に誘導された子孫であり、これは単数ま
たは複数の塩基置換、欠失、挿入または転移を含み、病
原性がなくかつ免疫原性であるという特徴を保持してい
る。
キャリア微生物として使用する場合には、病原性のな
い細菌または組み換え誘導体の必要とされる投与量は、
細菌または遺伝子産物の抗原性によって様々であり、既
存ワクチンにおいて代表的な免疫反応を起こすのに十分
な量だけが必要である。必要量はルーチンの実験で容易
に設定される。所望の防護水準を提供するためには、必
要に応じて複数回の投与を行う。
細菌菌株の増殖および収穫後には、この細胞は凍結乾
燥され得、特に食料品と混合する場合、あるいはカプセ
ル内に調製する場合には、そのようにされる。病原性の
ないphoP変異細菌株を含むワクチンは、処置される個体
に薬学的に受容され得る賦形剤を用いて調製されてもよ
い。例えば、ワクチンが固体で投与される場合には、接
種される個体に対して無毒で、しかも細菌と共存できる
物質で細胞を被覆し、および／またはそのような物質に
よりカプセル化してもよい。液体として投与する場合に
は、例えばスキムミルク、生理食塩水、および／または
生理的な濃度の、または生理的な濃度に近い他の無毒な
塩、ならびに当業者に公知の、その他の適当な液体キャ
リアを包含する、適当な液体キャリアに細胞を懸濁して
もよい。望ましい場合には、アジュバントを添加しても
よい。ワクチンを経気管支チューブ投与用に調製する場
合には、適当なバッファー中に調製してもよく、好まし
くは、エアゾールの形で提供される。
ワクチンが懸濁または溶解している薬学的賦形剤は、
溶媒あるいは固体でもよく、あるいは接種されるべき動
物に対して無毒で、しかもキャリア生物または抗原性遺
伝子産物と適合し得る物質中にカプセル化されていても
よい。適当な薬学的賦形剤としては、生理食塩水および
生理学的濃度または生理学的濃度に近い、その他の無毒
な塩のような液体キャリア、およびヒトには使用されな
いタルクまたは農場の動物の飼料にも使用されるショ糖
などの固体キャリアがある。必要に応じて抗原性を増強
するためにアジュバンドを添加してもよい。経気管支チ
ューブ投与用に使用する場合には、ワクチンは好ましく
はエアゾールの形で提供される。
病原体由来の遺伝子産物による免疫化は、病原体由来
の組み換え遺伝子によって特徴づけられた遺伝子産物を
発現するキャリアとして作用する、病原性微生物の病原
性のない誘導体による前免疫と組み合わせて使用されて
もよい。病原体由来の遺伝子産物に対する分泌免疫シス
テムが、GALTまたはBALTのリンパ細胞を刺激するために
該病原体由来の遺伝子産物を発現するキャリア微生物に
よる免疫化により一度プライムされると、そのような非
経口による免疫化は、分泌性免疫反応の発現を増強する
ブースターとして作用する。増強された反応は、２回目
のブースターとして、または既往反応として知られてお
り、その結果、長期にわたる宿主の免疫防護を生じる。
ブースター免疫化を多数回繰り返すと、有益な結果が得
られる。
上記の開示は本発明を一般的に述べたものである。以
下の特定の実施例を参照すれば、さらに完全な理解が得
られる。ここでは、この実施例は説明のためにのみ記載
されたものであって、他に指示のない限り、これに限定
することを意図するものではない。
実施例 S.typhimurium phop変異体の構築 高度に病原性を有するマウウ継代S.typhimurium Chi
3181株およびChi3339株を、S.typhimurium AD154株で
培養したP22 HTintの溶解産物により感染させ、テトラ
サイクリンおよび５−ブロモ４−クロロ−３インドリル
ホスフェート（BCIP）を含有するＬ寒天培地上で、形質
転換体を選択した。AD154はpurB中にトランスポゾンTn1
0の安定な挿入を有し、purBは高頻度（90％）にphoPの
共形質導入を行う。テトラサイクリン耐性のBCIP陰性形
質導入体（白色コロニー）を、P22HTintファージを含ま
なくなるまで線状に培地にぬりつけて単離を行った。こ
の工程により、Tn10トランスポゾンを組み込んだ形質導
入体でありphoP及びpur8についての変異体である形質導
入体が選択されchi3686（Chi3181由来）およびChi3688
（Chi3339由来）と命名された。つぎに、これらの形質
導入体を、S.typhimurium Chi3339株で増殖させたP22H
Tintにより感染させ、組換えによるTn10の欠失を選択す
るためのBCIPを含有するフザリン酸含有寒天培地に植え
た。フザリン酸耐性、BCIP陰性の形質導入体を、P22HTi
ntファージを含有しなくなるまで、再び同じ培地に線状
にぬりつけ培養を行った。選択された形質導入体を非特
異的酸性ホスファターゼ活性、P22感染性、およびアデ
ニンを欠く最小培地での増殖能力についてチェックし
た。Chi3687およびChi3689（表２）は、それぞれChi318
1およびChi3339由来の２つの形質導入体であり、最小培
地で増殖が可能であり、後述のプレート染色法による酸
性ホスファターゼ活性を示さなかった。
上記の記載において、使用された細菌株および得られ
たphoP変異体を表２に示す。Chi3181はHoiserおよびSta
rker（1981）に記載されているSR−11株と同一であり;C
hi3339は、Schneider（1956）に記載されているマウス
継代SLI344株である。これらは、短期及び長期の保存に
応じてそれぞれ、50％グリセロール中−20℃で、および
５％グリセロールを含有する１％バクトペプトン中−70
℃で保持した。Schmeiger（1972）に記載のバクテリオ
ファージP22HTintを形質導入の研究に用いた。バクテリ
オファージp22HTintを用いた形質導入体の条件は、Davi
s（1980）に記載の通りである。細菌はLennox（1955）
に記載のようにＬ培地あるいはＬ寒天培地で増殖させ
た。必要に応じて、BCIPを40マイクログラム/mlの濃度
で、そしてテトラサイクリンを12マイクログラム/mlの
濃度で加えた。テトラサイクリン感受性でフザリン酸耐
性変異体の選択は、Bochner（1983）に記載の方法およ
び培地を用いて行った。
非特異的酸性ホスファターゼ活性は、基本的にToh−
ｅらの方法（1973）を用い、Kierら（1979）により改変
された方法により決定された。簡単に述べれば、0.6M酢
酸ナトリウム、pH5.5、中に、次の濃度の基質の溶液を
新たに調製した：アルファ−ナフチルホスフェート5mg/
ml、テトラアゾ化−ｏ−ジアニシジン50mg/ml。各基質
溶液の100μｌを、0.5M酢酸ナトリウム、pH5.5、中の0.
6％寒天溶液2.8mlに加えた。基質を含有するソフト寒天
は、Ｌ寒天培地上に一夜増殖させた細菌コロニー上に重
層した。非特異的酸性ホスファターゼ活性を示すコロニ
ーは、基質を加えてから10分以内でオレンジ色に呈色し
た。
S.typhimuriumのphoP変異体の特徴 上記実施例において単離されたphoP変異株Chi3687お
よびChi3689を、S.typhimuriumの特性である病原性があ
ることを示す、あるいは示唆するいくつかの決定因子の
存在について調べた。それらは、Henle−407細胞に接着
し侵入する能力、病原性に必要とされるプラスミドの存
在、運動性、１型線毛の存在およびLPS組成、および表
現型の安定性である。
変異株Chi3687およびChi3689による組織培養細胞への
侵入を、親株であるChi3181およびChi3339の場合と比較
した。ATCCから入手したHenle−407細胞を24ウェルのプ
レートで増殖させた。増殖は10％（vol/vol）子ウシ血
清、5mMグルタミン、ペニシリン（100ユニット/ml）お
よびストレプトマイシン（100μg/ml）を補足したイー
グル最小培地（MEM）中で、適当な密度である５×105/
ウェルとなるまで行った。細胞の単層を、１ウェルあた
りハンクスの平衡塩類溶液（HBSS）中の106個の細菌
で、５％CO2雰囲気中37℃で２時間にわたり感染させ
た。次いで細胞の単層を５×HBSSで洗浄し、デオキシコ
ール酸ナトリウムを0.1％（wt/vol）の割合で含有する
リン酸緩衡化生理食塩水（PBS）で溶解させて接着した
細菌を検出し；あるいは、100μg/mlのゲンタマイシン
を含有するイーグルのMEM培地と共にさらに３時間イン
キュベートし、細胞外の細菌を除去し；次いで同様の方
法で細胞の溶解を行なった。その比較の結果を表３に示
す。表３から、変異株であるChi3687およびChi3689の両
者ともHenle−407細胞に接着し侵入する能力は、親の野
生型の株と同等であることが分かる。（つまり、ゲンタ
マイシン処理後３時間における組織培養物から回収した
接種物は、変異株および親株とも実質的に同一であっ
た。） 上記の研究において、細菌株をＬ培地で37℃で一晩放
置して増殖させ、あらかじめ温められたＬ培地で希釈
し、そして培養物のOD600値が0.7−0.9に到達するまで
振盪培養することによって増殖させた。最少培地をNeid
herdt（1974年）において記載された方法で調製した。
病原性プラスミド（virulence plasmid）の存在また
は不存在をBirnboim（1983年）の方法を用いて試験し
た。この分析の結果（データは示されていない）によ
り、両変異株およびその親株が100kbの病原性プラスミ
ドを含有することが示された。このプラスミドはマウス
におけるS.typhimuriumの病原性にとって必須であるこ
とが示された。例えば、GuligおよびCurtiss（1987年）
を参照されたい。
運動性をDifco（ミシガン州、デトロイト、Difco La
boratories）の運動性培地で試験した。Ｉ型線毛の存在
または不存在を、リン酸緩衡化生理食塩水中の３％（v/
v）濃度の新たに得たモルモットの赤血球を用いて、血
球凝集によって試験した。運動性および線毛の分析によ
ってphoP変異株は運動性を有し、そしてＩ型線毛を発現
した（データは示されていない）。
phoP変異株のLPS組成を親株のLPS組成と比較した。そ
れはHitchcockおよびBrown（1983年）の方法を本質的に
用いて行なった。この分析はLaemmli（1970年）の方法
によって調製されたポリアクリルアミドゲル上でドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）の存在下で行った。電気泳動
の後、このゲルをTsaiおよびFrasch（1982年）の方法に
よって染色した。染色されたゲルの分析によって変異
株、すなわちChi3687およびChi3689のLPS組成は、これ
らの親株、すなわちChi3181およびChi3339のLPS組成と
同様であることが示された（データは示されていな
い）。
変異株の表現型の安定性を、唯一のリン酸源としてBC
IPを補った最少培地に細胞を植えることによって試験し
た、この状態において、Pho+への頻度または復帰変異は
Chi3687では８×10-8、そしてChi3689では３×10-9であ
った。
マウスにおけるphoP変異株の病原性 phoP変異株、Chi3687およびChi3689の病原性を、これ
らの親株、Chi3181およびChi3339の病原性と比較した。
この比較は、BALB/cマウスに腹腔内投与および経口投与
の両方でその株を異なる用量で接種し、そして疾病の徴
候について接種された動物を試験することにより行なっ
た。
８から10週齢の雌のBALB/cマウス（ミズリー州、セン
トルイス、Sasco,Inc.）を用いた。経口投与による接種
は以下の方法により行なった。このマウスから４時間食
物および水を絶ち、50μｌの10％（wt/vol）重炭酸ナト
リウムを与え、次いで0.1％（wt/vol）のゼラチンを含
有する緩衝化生理食塩水中に懸濁させた適当な細菌懸濁
液（20μｌ）を与えた。接種後、30分で再び食物および
水を与えた。腹腔内投与による接種は100μｌの適当な
変異株または野生型細菌のBSG懸濁液を26ゲージの注射
針を用いてマウスに注入することにより行われた。これ
らの研究において、細菌数は、マッコンキー寒天を用い
ることにより算出した。
経口投与および腹腔内投与経路により投与された細菌
の感染性の研究の結果を表４および表５に、それぞれ示
す。Chi3687およびChi3689を経口投与で接種されたマウ
スは、野生型親株を経口投与した場合のLD50用量の104
倍の微生物数を経口投与で試したところ、生き残った
（表４）。行き残ったマウスは病気の徴候を示さず、試
験後少なくとも30日間健康であった。このマウスに腹腔
内投与経路によってphoP変異株を投与することによって
も、同様の結果が得られた（表５）。
マウスにおけるphoP変異株の組織分布 phoP変異株Chi3687または野生型親株Chi3181のいずれ
かで経口的に感染させたマウスにおける該細菌の組織分
布を試験した。
BALB/c雌マウスを、前出の病原性の研究で記載された
方法により、Chi3687またはChi3181のいずれかの約109
個の細胞を用いて、経口的に感染させた。そして、微生
物の分布を数日間にわたって調べた。このマウスはCO2
により窒息死させ、その脾臓を無菌的に取り出し、そし
て組織ホモジナイザー（Brinkman instruments）によ
り均質化した。パイエル板を小腸から切り出し、BSGで
洗浄してゆるやかに付着した細菌を除去し、そして同じ
ホモジナイザーを用いて均質化した。BSG懸濁液の適当
な希釈溶液をマッコンキー寒天上に置き、細菌数を調べ
た。菌株を接種した後のパイエル板でコロニー形成に基
づく研究の結果を図１に表す。図１において、Chi3687p
hoP菌株を接種した後、およびChi3181野生型菌株を接種
した後、パイエル板から得られたCFUを黒い四角および
白い四角によりそれぞれ表した。それぞれの値は３匹の
マウスの平均CFU数を表し、そして、縦の棒線は標準偏
差を示す。Chi3181を接種したマウスは投与後８日目に
死亡した。phoP菌株Chi3687が、限られてはいるが、接
種されたマウスのパイエル板の感染を確立し得たことは
図１から明らかである。パイエル板から回収されたphoP
変異株の数は、実質的に野生型親株の数より少ない。接
種後15日には、Chi3687を接種されたマウスのパイエル
板から、微生物は単離されなかった。
接種されたマウスの脾臓から得られたChi3687およびC
hi3181の回収の結果を図２に示す。Chi3687およびChi31
81を接種したマウスの脾臓から得られたCFUを、白抜き
の棒グラフおよび斜線の棒グラフによって、それぞれ示
す。それぞれの幅の広い棒グラフは３匹のマウスの平均
CFU数を表し、そして縦の細い棒線は標準偏差を示す。
図２に見られるように、Chi3687は感染マウスの脾臓か
らほとんど単離されず、この微生物は、観察された５匹
の感染動物の内のたった３匹から、投与５日後に回収さ
れた。さらに、Chi3687は経口接種の７日後、脾臓にお
いて検出されなかった。脾種は試験された全てのChi368
7感染動物中にはみられなかった。この感染性の低さ
は、この実験の時間経過を通して、感染動物の脾臓から
回収された野生型（Chi3181）細胞の数が多いことと比
べて非常に対称的である。
S.typhimuriumのphoP変異株を接種されたマウスの保護 BALB/c雌マウスの上述のテクニックの経口投与または
腹腔内投与いずれかを用いて、phoP変異株、Chi3687を
接種した。この免疫は約108または109CFUのphoP変異株
を経口投与で、または約105または106の菌株を腹腔内投
与でのいずれかにより行われた。接種の30日後、このマ
ウスに野生型親株、Chi3181を投与した。この投与に用
いられた野生型微生物の量は、投与経路により異なり、
その量は野生型菌株のLD50の103から104倍で示される。
経口投与経路で投与および接種されたマウスの保護の
結果を表６に示す。Chi3181をLD50の103倍の用量で接種
された全てのマウスは、免疫量にかかわらず、行き残っ
た。病原性菌株を104LD50の用量で接種したとき、108CF
UのChi3687で免疫された５匹のマウスのうち４匹、およ
び109CFUのこの菌株で免疫された10匹のマウスのうち９
匹が、この感染において行き残った。全ての場合におい
て、この試験で生き残ったものは健康のままであった。
腹腔内投与経路により投与および接種されたマウスの
保護についての結果を表７に示す。105CFUまたは106CFU
のChi3687で免疫されたマウスは102CFUまたは104CFUのC
hi3181の接種に対して抵抗性を示した。後者の用量は、
非免疫マウスにおけるChi3181のLD50の104倍量に相当す
る。全ての生存個体は、接種後30日間健康であった。
S.typhimuriumのphoP変異株を接種されたマウスの遅延
型過敏応答 遅延型過敏応答（DTH）は薬剤の細胞介在性応答を引
き起こす能力を示すものである。phoP変異株に対するDT
H応答を試験するために、マウスに109CFUのChi3687を経
口投与で接種し、そしてこのDTH応答を30日後に測定し
た。この試験を免疫動物および対照動物で行った。そし
てそれは、BALB/cマウスの右後足蹠にS.typhimuriumの
全細胞溶解産物から得たタンパク質20μｇのPBS溶液50
μｌを注射することによって行われた。同容量のPBSを
反対側の足蹠に注射した。腫脹を接種２日後デジマチッ
クカリパー（digimatic caliper）（ミツトヨ、日本）
で測定した。この結果を反対側のPBSを注射したコント
ロールに対する接種された足蹠の腫脹の増加の割合
（％）として表す。
S.typhimuriumの全細胞の溶解産物を調製するため
に、SR−11をＬ培地でOD600値が0.6に達するまで増殖さ
せ、この細胞をPBSで２回洗浄し、そして遠心分離によ
り集め、そしてこの細胞ペレットを同じ緩衝液に懸濁さ
せた。次いで、この細菌細胞を細胞破砕装置（B.Braun,
Melsungen AG,西ドイツ）中で0.1mmのガラスビーズを
用いて破壊し、そして細胞残屑を10,000gで10分間遠心
分離することにより取り除いた。
DTH実験の結果を表８に示す。Chi3687、すなわちS.ty
phimuriumのphoP誘導体を経口投与により免疫したマウ
スはS.typhimuriumの全細胞の溶解産物の注射に反応し
て、コントロール動物（Ｐ＜0.02）より有意に強い足蹠
腫脹を示した。
phoP変異株のpho+復帰変異体の非病原性 Chi3687およびChi3689の両方の３株のpho+復帰変異体
を105CFUのそれぞれの変異株を腹腔内接種することによ
り病原性を試験した。この６株のPho+復帰変異株はそれ
らが由来するところの菌株の非病原性を維持した。これ
はphoP変異体においてホスファターゼの欠如は非病原性
の原因ではなく、そしてこのphoP遺伝子産生物は野生型
病原性にとって必須の１つまたはそれ以上の他の遺伝子
を制御しなければならないということを証明している。
phoP遺伝子によって制御される遺伝子の定義 phoP遺伝子産生物によって制御される重要な病原性の
決定因子（すなわち、遺伝子）の同定はいくつかの方法
のうちの１つで達成され得る。いくつかの、またはたぶ
ん全てのそのような病原性決定因子は、おそらく細菌細
胞表面上または周辺質内に位置する産生物を特定する。
アルカリホスファターゼ（AP）の構造遺伝子を含有する
トランスポゾンTnphoA［manoilおよびBeckwith（1984
年）］はこれらの遺伝子を示すのに唯一適している。AP
活性はこの酵素が細菌細胞質膜を通ってその周辺質また
はその細胞表面に移行するときのみ発現し得る。TnphoA
は切断されてシグナル配列を指定するヌクレオチド配列
が欠失しているので、AP活性は、TnphoAを細菌の周辺質
または細胞表面タンパク質の遺伝子に挿入して、周辺質
または細胞表面タンパク質のシグナル配列とTnphoAがコ
ードするAPの融合タンパク質を形成するときのみ発現し
得る。この場合、APは細胞質膜を通って移行し、そして
色素産生のAP基質BCIPを含有する培地上で増殖するコロ
ニーに青い色を与えることによって検出し得る。
上記で記載されているような病原性の決定因子を同定
するために、TnphoAライブラリーをS.typhimuriumの野
性型病原性菌株、例えば、Chi3339（表２参照）で、適
当なTnphoA置換ベクターで菌株を感染させることによっ
て製造される。［ManoilおよびBeckwith（1984年）］。
Chi3339の染色体または病原性プラスミド中へのTnphoA
挿入がカノマイシン（kanomycin）耐性を与えるので、
この感染混合物をカノマイシンおよびXPを含有する寒天
培地に植える。一晩インキュベートした後、全ての青い
コロニーを取り出し、そして精製する。全てのこのよう
な青いコロニーの細胞の混合物は、周辺質タンパク質
（periplasmic proteins）および細胞表面タンパク質
を指定する全ての遺伝子にTnphoAの挿入を有するにちが
いないTnphoAライブラリーを構成する。P22HT int形質
導入用溶解産物はこのライブラリーで作製され、そして
S.typhimurium phoP変異株、例えば、Chi3689に形質導
入するために用いる（表２参照）。カノマイシン耐性形
質導入体をBCIPを含有する寒天培地上に植える。ほとん
どの形質導入体のコロニーは青くなる；しかし、発現が
野性型phoP遺伝子産物に依存する遺伝子にTnphoAを挿入
すると白くなる。この白いコロニーは取り出され、そし
て精製され得る。これらのコロニー中の細胞がphoPによ
って制御される遺伝子に挿入を有するという証明は、こ
れらの変異体を形質導入してphoP+にすることによって
得られ、それはBCIPを含有する青いコロニーを形成させ
なければならない。遺伝子のクローニング、DNAハイブ
リダイゼーション、およびS.typhimuriumライブラリー
のスクリーニングとそれに次ぐサブクローニング、イン
ビトロにおける転写およびそれに連続する翻訳、および
最終的なDNA配列決定の標準的な方法を用いることによ
り、病原性の遺伝子およびその生産物を制御するphoPが
十分に解明される。動物および培養細胞による他の研究
は、それぞれこのようなphoPに制御される病原性遺伝子
産物が病原性に影響を及ぼす機序およびこれらの遺伝子
産物がワクチンの開発にどのように用いられ得るかを解
明するために用いられ得る。
菌株の寄託 次に挙げたものは、メリーランド州、ロックビル、パ
ークローンドライブ12301のアメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（American Type Culture Collectio
n）にブタペスト条約により寄託されている。生存試験
により生存が確認された後、下記の受託番号が付与さ
れ、必要な料金が支払われた。米国特許法施行規則1.14
および米国特許法第122条にしたがい、特許庁長官によ
り権利を与えられた者は、特許出願が係属している間、
その培養物を入手することが可能である。その出願に基
づく特許が許可されると、上記培養物の公衆に対する入
手の制限は最終的に撤廃される。さらに、この命名され
た寄託物は、寄託日から30年間、あるいは寄託物の分譲
の請求のあった最後の日から５年間；または米国特許の
存属期間；のいずれか最長の期間の間保存される。培養
物が死滅するか不測の事故により破壊されたり、あるい
はプラスミドを有する株においてそのプラスミドが脱落
した場合には、同一の分類学上の種類の生存している培
養物と差し換えられる。ここに記載されている寄託物は
便宜のためにのみ記載されているのであり、ここでの記
載内容を考慮して本願を実施するのに必要とされるもの
ではない。これらの寄託物はここに参考として組み入れ
られている。
産業上の利用可能性 病原性のない株、特に病原性のないサルモネラの菌株
により効果的に免疫を行うには、該病原性のない微生物
が、免疫された個体の腸管付属リンパ組織（GALTまたは
パイエル板）において所定の期間生存し得ることが必要
である。高度に病原性を有するサルモネラの菌株由来の
phoP変異菌株はその免疫原性を有しながら、そのような
能力を有する。従って、それらはワクチンの生産に商業
的に有用である。さらに、本発明の細胞はphoPの欠失変
異のソースとして利用され得る。このphoPはトランスポ
ゾンの変異誘発により他の株に移り得、この株が病原性
がない場合には所望のワクチンが得られる。
遺伝子操作された微生物により合成された商業的に価
値のある種々の副産物の生産が、バイオテクノロジー産
業においてなされてきた。遺伝子操作された微生物をフ
ァーメンターによる培養の条件で安定に維持することが
本発明の細胞を用いることにより容易となる。この細胞
とは例えば、phoP遺伝子またはそれと同等の遺伝子の変
異に加えて、デルタ−asd変異を有し、asd+遺伝子を選
択マーカーとして有する細胞中にポリヌクレオチド挿入
物を有する細胞である。phoP-表現型のものは微生物を
扱うときに安全性が高く、そして、増殖し、タンパクを
発現し得る細胞のみが所望の抗原をコードする。従っ
て、所望の生産物の収量が比較的安全な条件下で増加す
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:42） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01N 63/00 - 63/04 A61K 31/00 - 41/00 C12N 1/00 - 1/38 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】サルモネラ（Salmonella）によって引き起
    こされる病状に対して個体を免疫処置するためのワクチ
    ンであって、免疫原性がありphoP変異体である病原性の
    ないサルモネラを含有し、ここで該変異は、該病原性の
    ないサルモネラが由来する野生型サルモネラと比較して
    病原性を減少させる、ワクチン。
  2. 【請求項２】請求項１に記載のワクチンであって、前記
    病原性のないサルモネラがさらに少なくとも１つの変異
    を有し、ここで該変異は、該病原性のないサルモネラが
    由来する野生型サルモネラと比較して病原性を減少させ
    る、ワクチン。
  3. 【請求項３】請求項１に記載のワクチンであって、前記
    phoP変異体がまた、免疫原性を有するデルタ−cyaまた
    はデルタ−crp変異体である、ワクチン。
  4. 【請求項４】病原性微生物によって引き起こされる病状
    に対して個体を処置するためのワクチンであって、免疫
    原性がありphoP変異体である病原性のないサルモネラキ
    ャリア細胞を有し、該サルモネラキャリア細胞が、該病
    原性微生物由来の免疫原性抗原をコードする組換え発現
    ベクターにより形質転換されており、および、ここで該
    変異は、該病原性のないサルモネラが由来する野生型サ
    ルモネラと比較して病原性を減少させる、ワクチン。
  5. 【請求項５】請求項４に記載のワクチンであって、前記
    サルモネラキャリア細胞が該細胞に対して致死性の変異
    を有し、該致死性の変異を補い、平衡化された致死性宿
    主−ベクターシステムを構築する、ベクター中の組換え
    遺伝子により、該変異が平衡化されている、ワクチン。
  6. 【請求項６】請求項４に記載のワクチンであって、前記
    サルモネラキャリア細胞が、 ａ）ベータ−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲ
    ナーゼ（asd）をコードする天然の機能性染色体遺伝子
    を欠き； ｂ）機能性Asdポリペプチドをコードする組換え遺伝子
    を有し、該遺伝子が天然の染色体asd変異を補足する
    が、欠失した染色体遺伝子を組換えにより置換すること
    ができず； ｃ）該機能性Asdポリペプチドをコードする組換え遺伝
    子と免疫原性抗原をコードする組換え遺伝子との間に物
    理的な結合を有し、該機能性Asdの欠失により細胞の溶
    解が起こるような環境に細胞が置かれたときに、機能性
    Asdポリペプチドをコードする組換え遺伝子の欠失によ
    り細胞を溶解させる； ワクチン。
  7. 【請求項７】免疫原性でありphoPについての変異体であ
    る病原性のないサルモネラの単離株であって、細胞に対
    して致死性の変異を有し、該致死性の変異を補い、平衡
    化された致死性宿主−ベクターシステムを構築する、ベ
    クター中の組換え遺伝子により、該変異が平衡化されて
    おり、ここで該変異は、該病原性のないサルモネラが由
    来する野生型サルモネラと比較して病原性を減少させ
    る、サルモネラの単離株。
  8. 【請求項８】免疫原性でありphoPについての変異体であ
    る病原性のない、かつデルタ−cyaまたはデルタ−crpで
    あり、ここで該変異は、該病原性のないサルモネラが由
    来する野生型サルモネラと比較して病原性を減少させ
    る、サルモネラの単離株。
  9. 【請求項９】ATCC NO.53864、ATCC NO.53865、ATCC NO.
    53866、それらの誘導体、およびそれらの変異体でなる
    群から選択される、サルモネラの単離株。
  10. 【請求項１０】請求項１から６のいずれかに記載のワク
    チンを含有する、サルモネラによりひき起こされる疾病
    に対して個体を免疫処置するに使用するための、薬剤。
  11. 【請求項１１】疾病に対する個体の免疫処置に使用する
    ための、請求項１から６のいずれかに定義されている、
    病原性のないサルモネラphoP変異体。
  12. 【請求項１２】サルモネラによりひき起こされる病状に
    対して個体を免疫処置するために適切なワクチンを調製
    する方法であって、薬学的に受容され得る賦形剤と免疫
    原性のphoP変異体である病原性のないサルモネラとを接
    触させることを包含し、ここで該変異は、該病原性のな
    いサルモネラが由来する野生型サルモネラと比較して病
    原性を減少させる、方法。
  13. 【請求項１３】病原性微生物によりひき起こされる病状
    に対して個体を免疫処置するために適切なワクチンを調
    製する方法であって、該ワクチンが病原性のない免疫原
    性のphoP変異体であるサルモネラキャリア細胞を含み、
    該キャリア細胞を該病原性微生物由来の免疫原性抗原を
    コードする組換え発現ベクターにより形質転換すること
    を包含し、ここで該変異は、該病原性のないサルモネラ
    が由来する野生型サルモネラと比較して病原性を減少さ
    せる、方法。
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