JP2985446B2 - 核酸の検出及び測定方法 - Google Patents
核酸の検出及び測定方法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特定核酸領域を有する
核酸を検出又は測定する方法に係り、特に、特定核酸領
域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、
この増幅された特定核酸領域を検出又は測定することに
より標的核酸の検出又は測定を行う核酸検出方法に関す
る。
核酸を検出又は測定する方法に係り、特に、特定核酸領
域をポリメラーゼチェーンリアクションにより増幅し、
この増幅された特定核酸領域を検出又は測定することに
より標的核酸の検出又は測定を行う核酸検出方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】従来より、ウイルス、細菌等による感染
症の臨床検査等の分野においては、組織、体液、便等の
生体関連の検体の培養を行い、病原体の同定を行うこと
が行われている。しかしながら、このような方法は、検
体の培養に長時間を要し、又検体の培養自体が困難な場
合もあり、必ずしも満足のいく結果が得られるものでは
ない。また、検体の培養に際して、実施者に病原体が感
染する危険性もある。
症の臨床検査等の分野においては、組織、体液、便等の
生体関連の検体の培養を行い、病原体の同定を行うこと
が行われている。しかしながら、このような方法は、検
体の培養に長時間を要し、又検体の培養自体が困難な場
合もあり、必ずしも満足のいく結果が得られるものでは
ない。また、検体の培養に際して、実施者に病原体が感
染する危険性もある。
【０００３】また、迅速に病原体の同定を行う方法とし
て、抗原抗体反応を利用した抗原検出方法又はＤＮＡプ
ローブによる核酸の検出方法も行われている。しかしな
がら、抗原抗体反応を利用した抗原検出方法において
は、病原体の抗原部分が隠蔽されているような場合に
は、病原体を検出できないおそれがある。また、細菌等
においては非常に多くの抗原部分を有する場合があり、
特定の細菌種に固有な特定共通抗原部分を見い出すこと
は必ずしも容易でない。また、検出にはある程度の数又
は濃度の細菌又は細胞が必要であり、細胞数等が不足す
ることにより病原体を検出できない場合があり、感度的
にも問題がある。
て、抗原抗体反応を利用した抗原検出方法又はＤＮＡプ
ローブによる核酸の検出方法も行われている。しかしな
がら、抗原抗体反応を利用した抗原検出方法において
は、病原体の抗原部分が隠蔽されているような場合に
は、病原体を検出できないおそれがある。また、細菌等
においては非常に多くの抗原部分を有する場合があり、
特定の細菌種に固有な特定共通抗原部分を見い出すこと
は必ずしも容易でない。また、検出にはある程度の数又
は濃度の細菌又は細胞が必要であり、細胞数等が不足す
ることにより病原体を検出できない場合があり、感度的
にも問題がある。
【０００４】これに対して、ＤＮＡプローブによる核酸
検出方法においては、細菌種固有の核酸領域を見い出す
ことは比較的容易で、この核酸領域をクローニングし又
は合成することにより、核酸プローブとして用いること
ができるといった利点がある。また、近年ポリメラーゼ
チェーンリアクション（SCIENCE,230,1350-1354,1985）
なる核酸増幅方法が報告さている。このポリメラーゼチ
ェーンリアクションは核酸分子中の特定核酸領域を試験
管内で１００万倍にも増幅するものである。このポリメ
ラーゼチェーンリアクションを利用することにより標的
核酸の特定核酸領域を増幅された状態で検出することが
可能となり、感度的には１分子の核酸から病原体を検出
することも可能となっている。そして、この増幅された
特定核酸領域の一般的な検出方法としては、ポリメラー
ゼチェーンリアクション終了後の反応溶液をアガロース
電気泳動により分離した後染色し、バンドの大きさ（分
子量）で判別する方法や、前記反応溶液をドットハイブ
リタイゼーション法により検出する方法が行われてい
る。
検出方法においては、細菌種固有の核酸領域を見い出す
ことは比較的容易で、この核酸領域をクローニングし又
は合成することにより、核酸プローブとして用いること
ができるといった利点がある。また、近年ポリメラーゼ
チェーンリアクション（SCIENCE,230,1350-1354,1985）
なる核酸増幅方法が報告さている。このポリメラーゼチ
ェーンリアクションは核酸分子中の特定核酸領域を試験
管内で１００万倍にも増幅するものである。このポリメ
ラーゼチェーンリアクションを利用することにより標的
核酸の特定核酸領域を増幅された状態で検出することが
可能となり、感度的には１分子の核酸から病原体を検出
することも可能となっている。そして、この増幅された
特定核酸領域の一般的な検出方法としては、ポリメラー
ゼチェーンリアクション終了後の反応溶液をアガロース
電気泳動により分離した後染色し、バンドの大きさ（分
子量）で判別する方法や、前記反応溶液をドットハイブ
リタイゼーション法により検出する方法が行われてい
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このポ
リメラーゼチェーンリアクションを利用した核酸検出方
法においては、一旦、ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン終了後の反応溶液を反応容器から取り出して処理する
ものであるため、増幅された特定核酸領域が環境中に飛
散し、この飛散した特定核酸領域が実験室内の他の検体
に混入することにより、この核酸が次のポリメラーゼチ
ェーンリアクションの鋳型核酸となり、他の検体の検査
において偽陽性の原因となるおそれがあり、ポリメラー
ゼチェーンリアクションを利用した核酸検出方法を実施
するにあたって大きな障害となっている。また、ポリメ
ラーゼチェーンリアクションの欠点として、試料中の標
的核酸の初期濃度がわかりにくいという問題もある。
リメラーゼチェーンリアクションを利用した核酸検出方
法においては、一旦、ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン終了後の反応溶液を反応容器から取り出して処理する
ものであるため、増幅された特定核酸領域が環境中に飛
散し、この飛散した特定核酸領域が実験室内の他の検体
に混入することにより、この核酸が次のポリメラーゼチ
ェーンリアクションの鋳型核酸となり、他の検体の検査
において偽陽性の原因となるおそれがあり、ポリメラー
ゼチェーンリアクションを利用した核酸検出方法を実施
するにあたって大きな障害となっている。また、ポリメ
ラーゼチェーンリアクションの欠点として、試料中の標
的核酸の初期濃度がわかりにくいという問題もある。
【０００６】本発明は以上のような問題点に鑑み創案さ
れたものであり、ポリメラーゼチェーンリアクションに
より標的核酸の特定核酸領域を増幅した後、密封したま
まの状態で核酸の検出又は定量を行うことが可能な核酸
検出方法を提供することを目的とする。
れたものであり、ポリメラーゼチェーンリアクションに
より標的核酸の特定核酸領域を増幅した後、密封したま
まの状態で核酸の検出又は定量を行うことが可能な核酸
検出方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本願発明者はポリメラー
ゼチェーンリアクションを利用した核酸検出方法につい
て鋭意研究を行った結果、標的核酸の特定核酸領域と結
合することにより蛍光特性が変化する蛍光色素と、ポリ
メラーゼチェーンリアクションにより増幅された核酸配
列を反応させ、蛍光強度を測定することにより、標的核
酸の有無を判別できることを見い出し本発明を完成し
た。さらに、本願発明者は、前記蛍光色素の存在下でポ
リメラーゼチェーンリアクションを行ない、ポリメラー
ゼチェーンリアクション過程における蛍光強度の変化を
追跡したところ、あるサイクル数を経た時点で蛍光強度
が急激に変化し、かつ、この急激に変化する時点が標的
核酸の初期濃度に依存して変化することを見出し、この
現象を利用して試料中の標的核酸の定量又は初期量の比
較を行なうことができることを見出し本発明を完成し
た。
ゼチェーンリアクションを利用した核酸検出方法につい
て鋭意研究を行った結果、標的核酸の特定核酸領域と結
合することにより蛍光特性が変化する蛍光色素と、ポリ
メラーゼチェーンリアクションにより増幅された核酸配
列を反応させ、蛍光強度を測定することにより、標的核
酸の有無を判別できることを見い出し本発明を完成し
た。さらに、本願発明者は、前記蛍光色素の存在下でポ
リメラーゼチェーンリアクションを行ない、ポリメラー
ゼチェーンリアクション過程における蛍光強度の変化を
追跡したところ、あるサイクル数を経た時点で蛍光強度
が急激に変化し、かつ、この急激に変化する時点が標的
核酸の初期濃度に依存して変化することを見出し、この
現象を利用して試料中の標的核酸の定量又は初期量の比
較を行なうことができることを見出し本発明を完成し
た。
【０００８】即ち、本発明は、核酸と反応することによ
り蛍光特性が変化する蛍光色素の存在下で、被検試料中
の標的核酸の特定核酸領域をポリメラーゼチェーンリア
クションにより増幅し、前記蛍光特性の変化を測定する
ことからなる、被検試料中の標的核酸の測定方法を提供
する。また、本発明は、核酸と反応することにより蛍光
特性が変化する蛍光色素と、ポリメラーゼチェーンリア
クションにより標的核酸を増幅するための試薬とを同一
の容器内に含む、被検試料中の標的核酸の測定用キット
を提供する。さらに、本発明は、核酸と反応することに
より蛍光特性が変化する蛍光色素と、ポリメラーゼチェ
ーンリアクションにより標的核酸を増幅するための試薬
とを容器内に含む、上記本発明の測定方法を行うための
キットを提供する。なお、上記本願発明において、「被
検試料中の標的核酸を測定」することには、該標的核酸
を検出すること及び該標的核酸を定量することの両者が
包含される。また、上記本願発明において、「蛍光特性
の変化を測定する」とは、ポリメラーゼチェーンリアク
ションの前後にそれぞれ蛍光特性を測定し、その変化を
調べること及びポリメラーゼチェーンリアクションの最
中に連続的又は断続的に蛍光特性を測定してその変化を
調べることの両者が包含される。
り蛍光特性が変化する蛍光色素の存在下で、被検試料中
の標的核酸の特定核酸領域をポリメラーゼチェーンリア
クションにより増幅し、前記蛍光特性の変化を測定する
ことからなる、被検試料中の標的核酸の測定方法を提供
する。また、本発明は、核酸と反応することにより蛍光
特性が変化する蛍光色素と、ポリメラーゼチェーンリア
クションにより標的核酸を増幅するための試薬とを同一
の容器内に含む、被検試料中の標的核酸の測定用キット
を提供する。さらに、本発明は、核酸と反応することに
より蛍光特性が変化する蛍光色素と、ポリメラーゼチェ
ーンリアクションにより標的核酸を増幅するための試薬
とを容器内に含む、上記本発明の測定方法を行うための
キットを提供する。なお、上記本願発明において、「被
検試料中の標的核酸を測定」することには、該標的核酸
を検出すること及び該標的核酸を定量することの両者が
包含される。また、上記本願発明において、「蛍光特性
の変化を測定する」とは、ポリメラーゼチェーンリアク
ションの前後にそれぞれ蛍光特性を測定し、その変化を
調べること及びポリメラーゼチェーンリアクションの最
中に連続的又は断続的に蛍光特性を測定してその変化を
調べることの両者が包含される。
【０００９】本発明の原理は、例えばインターカレータ
ー性蛍光色素等の蛍光色素が水溶液中で遊離した状態と
２本鎖核酸と結合（インターカレート）した状態とで
は、その蛍光特性が著しく変化することを利用する。即
ち、ポリメラーゼチェーンリアクション前の検体を含む
溶液には極微量の鋳型となる核酸、最低１組の一本鎖合
成ＤＮＡ（プライマー）、酵素及びモノヌクレオチド三
燐酸等が含まれており、これらの成分は蛍光色素に一定
の蛍光特性を与える。しかしながら、仮に、標的となる
核酸が含まれておらず特定核酸領域の増幅が起こらなか
った場合、ポリメラーゼチェーンリアクション前後で蛍
光特性はそれほど変化しない。一方、標的核酸が含まれ
ている場合、ポリメラーゼチェーンリアクションにより
特定核酸領域が増幅され、この増幅された二本鎖核酸は
蛍光色素と結合して相対的に蛍光特性が変化する。従っ
て、ポリメラーゼチェーンリアクション前後の蛍光特性
の変化を調べることにより標的核酸の有無を検出するこ
とが可能になる。
ー性蛍光色素等の蛍光色素が水溶液中で遊離した状態と
２本鎖核酸と結合（インターカレート）した状態とで
は、その蛍光特性が著しく変化することを利用する。即
ち、ポリメラーゼチェーンリアクション前の検体を含む
溶液には極微量の鋳型となる核酸、最低１組の一本鎖合
成ＤＮＡ（プライマー）、酵素及びモノヌクレオチド三
燐酸等が含まれており、これらの成分は蛍光色素に一定
の蛍光特性を与える。しかしながら、仮に、標的となる
核酸が含まれておらず特定核酸領域の増幅が起こらなか
った場合、ポリメラーゼチェーンリアクション前後で蛍
光特性はそれほど変化しない。一方、標的核酸が含まれ
ている場合、ポリメラーゼチェーンリアクションにより
特定核酸領域が増幅され、この増幅された二本鎖核酸は
蛍光色素と結合して相対的に蛍光特性が変化する。従っ
て、ポリメラーゼチェーンリアクション前後の蛍光特性
の変化を調べることにより標的核酸の有無を検出するこ
とが可能になる。
【００１０】また、本発明においては、標的核酸を含ま
ない検体を用いて陰性対象実験を行い、結果を比較する
ことにより、核酸の有無を検出ことも可能である。この
場合、標的核酸が極微量（ナノグラム以下）であること
が好ましい。
ない検体を用いて陰性対象実験を行い、結果を比較する
ことにより、核酸の有無を検出ことも可能である。この
場合、標的核酸が極微量（ナノグラム以下）であること
が好ましい。
【００１１】蛍光色素は、密封状態での測定を可能にす
るために、ポリメラーゼチェーンリアクション前に予め
反応系に加えておく。
るために、ポリメラーゼチェーンリアクション前に予め
反応系に加えておく。
【００１２】また、蛍光色素をポリメラーゼチェーンリ
アクションの前に加えておき、ポリメラーゼチェーンリ
アクション過程における蛍光強度をモニターすることに
より試料中の標的核酸の初期量を定量し又は比較するこ
とが可能になる。すなわち、後述の実施例において明ら
かになるように、ポリメラーゼチェーンリアクション過
程における蛍光強度の変化を追跡したところ、あるサイ
クル数を経た時点で蛍光強度が急激に変化し、かつ、こ
の急激に変化する時点が標的核酸の初期濃度に依存して
変化することを見出した。すなわち、試料中の標的核酸
の初期濃度が高ければより早いサイクル数にて蛍光強度
の急激な変化が起き、一方、初期濃度が低い場合にはそ
の分遅いサイクル数にて蛍光強度の変化が起きる。従っ
て、濃度既知の試料を用いて予めサイクル数と蛍光強度
の関係を求めた検量線を作成しておけば、濃度未知の試
料においても標的核酸の初期量を定量することが可能に
なる。また、標的核酸の初期量の単なる比較であれば検
量線を作成しなくても可能である。
アクションの前に加えておき、ポリメラーゼチェーンリ
アクション過程における蛍光強度をモニターすることに
より試料中の標的核酸の初期量を定量し又は比較するこ
とが可能になる。すなわち、後述の実施例において明ら
かになるように、ポリメラーゼチェーンリアクション過
程における蛍光強度の変化を追跡したところ、あるサイ
クル数を経た時点で蛍光強度が急激に変化し、かつ、こ
の急激に変化する時点が標的核酸の初期濃度に依存して
変化することを見出した。すなわち、試料中の標的核酸
の初期濃度が高ければより早いサイクル数にて蛍光強度
の急激な変化が起き、一方、初期濃度が低い場合にはそ
の分遅いサイクル数にて蛍光強度の変化が起きる。従っ
て、濃度既知の試料を用いて予めサイクル数と蛍光強度
の関係を求めた検量線を作成しておけば、濃度未知の試
料においても標的核酸の初期量を定量することが可能に
なる。また、標的核酸の初期量の単なる比較であれば検
量線を作成しなくても可能である。
【００１３】本発明の方法に用いる蛍光色素としては、
核酸に対するインターカレーター性蛍光色素が好まし
い。核酸に対するインターカレーター性蛍光色素として
は既に多くの化合物が報告されており、本発明に用いら
れるインターカレーター性蛍光色素は特に限定されるも
のではない。しかしながら、ポリメラーゼチェーンリア
クションにおいては、その反応溶液中にタンパク質が含
まれるため、蛍光物質としては水溶性で、かつタンパク
質の影響を受けにくいものが好ましい。また、ポリメラ
ーゼチェーンリアクションにおいては室温から高温への
温度変化を繰り返し行うため熱的にも安定なものが好ま
しい。具体的には、 (1) エチジュームブロマイド及びその誘導体（例えばBi
ochemistry 27, 7919 (1988); J. Cell Biol. 59, 766
(1973); Biochemistry 17, 5078 (1978)及びBiochemist
ry 22, 3231 (1983)に記載のもの） (2) アクリジンオレンジ及びその誘導体（例えばCytome
try 9, 325 (1988); Proc. Natl. Acad. sci. 72, 2915
(1975) 及び Biochemistry 17, 5071 (1978) に記載の
もの） (3) ビスベンチミド及びその誘導体（例えばExp. Cell
Res. 174, 388 (1988);Cold Harbor Symposia on Quan
t. Biol. 51, 151 (1986) 及びNucleic Acids Res. 15,
10589 (1987) 記載のもの） (4) ジアミノフェニルインドール及びその誘導体（例え
ばPlant Sci. 55, 151 (1988) 及びProc. Natl Acad. s
ci 83, 2934 (1986)記載のもの） (5) アクチノマイシン及びその誘導体（例えばCytometr
y 1, 2 (1980) 及びHistochem. 72, 11 (1981)記載のも
の） (6) チアゾールオレンジ及びその誘導体（例えばCytome
try 7, 508 (1986); Cytometry 8, 568 (1987)及び日本
感光色素社カタログNK-321、 NK-731等に記載のもの） (7) クロモマイシン及びその誘導体（例えばAntibiot.
Chemoth. 12, 182 (1962) 及びAnticancer Research,
1, 341 (1981)に記載のもの 等を用いることが好ましい。
核酸に対するインターカレーター性蛍光色素が好まし
い。核酸に対するインターカレーター性蛍光色素として
は既に多くの化合物が報告されており、本発明に用いら
れるインターカレーター性蛍光色素は特に限定されるも
のではない。しかしながら、ポリメラーゼチェーンリア
クションにおいては、その反応溶液中にタンパク質が含
まれるため、蛍光物質としては水溶性で、かつタンパク
質の影響を受けにくいものが好ましい。また、ポリメラ
ーゼチェーンリアクションにおいては室温から高温への
温度変化を繰り返し行うため熱的にも安定なものが好ま
しい。具体的には、 (1) エチジュームブロマイド及びその誘導体（例えばBi
ochemistry 27, 7919 (1988); J. Cell Biol. 59, 766
(1973); Biochemistry 17, 5078 (1978)及びBiochemist
ry 22, 3231 (1983)に記載のもの） (2) アクリジンオレンジ及びその誘導体（例えばCytome
try 9, 325 (1988); Proc. Natl. Acad. sci. 72, 2915
(1975) 及び Biochemistry 17, 5071 (1978) に記載の
もの） (3) ビスベンチミド及びその誘導体（例えばExp. Cell
Res. 174, 388 (1988);Cold Harbor Symposia on Quan
t. Biol. 51, 151 (1986) 及びNucleic Acids Res. 15,
10589 (1987) 記載のもの） (4) ジアミノフェニルインドール及びその誘導体（例え
ばPlant Sci. 55, 151 (1988) 及びProc. Natl Acad. s
ci 83, 2934 (1986)記載のもの） (5) アクチノマイシン及びその誘導体（例えばCytometr
y 1, 2 (1980) 及びHistochem. 72, 11 (1981)記載のも
の） (6) チアゾールオレンジ及びその誘導体（例えばCytome
try 7, 508 (1986); Cytometry 8, 568 (1987)及び日本
感光色素社カタログNK-321、 NK-731等に記載のもの） (7) クロモマイシン及びその誘導体（例えばAntibiot.
Chemoth. 12, 182 (1962) 及びAnticancer Research,
1, 341 (1981)に記載のもの 等を用いることが好ましい。
【００１４】上述のように、インターカレーター性蛍光
色素を用いる場合、インターカレーター性蛍光色素が水
溶液中で遊離した状態と、２本鎖核酸中にインターカレ
ートした状態で蛍光特性が変化することを利用する。こ
の蛍光特性の変化は実際的には蛍光強度の変化として捉
えることができるが、本質的には蛍光スペクトルの変化
に由来している。この蛍光スペクトルの変化は次の４つ
の場合に分類される。すなわち、２本鎖ＤＮＡ存在下あ
るいは非存在下での励起光スペクトル、放射光スペクト
ルのそれぞれの最大波長を比較した場合、 (1) 励起光スペクトルのピーク波長及び放射光スペクト
ルのピーク波長共に変化しない（すなわち、この場合に
は蛍光強度のみが変化する） (2) 励起光スペクトルのピーク波長は変化するが放射光
スペクトルのピーク波長は変化しない。 (3) 励起光スペクトルのピーク波長は変化しないが放射
光スペクトルのピーク波長が変化する。 (4) 励起光、放射光スペクトルのピーク波長が共に変化
する。
色素を用いる場合、インターカレーター性蛍光色素が水
溶液中で遊離した状態と、２本鎖核酸中にインターカレ
ートした状態で蛍光特性が変化することを利用する。こ
の蛍光特性の変化は実際的には蛍光強度の変化として捉
えることができるが、本質的には蛍光スペクトルの変化
に由来している。この蛍光スペクトルの変化は次の４つ
の場合に分類される。すなわち、２本鎖ＤＮＡ存在下あ
るいは非存在下での励起光スペクトル、放射光スペクト
ルのそれぞれの最大波長を比較した場合、 (1) 励起光スペクトルのピーク波長及び放射光スペクト
ルのピーク波長共に変化しない（すなわち、この場合に
は蛍光強度のみが変化する） (2) 励起光スペクトルのピーク波長は変化するが放射光
スペクトルのピーク波長は変化しない。 (3) 励起光スペクトルのピーク波長は変化しないが放射
光スペクトルのピーク波長が変化する。 (4) 励起光、放射光スペクトルのピーク波長が共に変化
する。
【００１５】アクリジンオレンジ等は励起光スペクトル
のピーク波長が数ｎｍ変化しているが(1) の例として挙
げることができる。またビスベンチミド等（例えば後述
の実施例で用いるヘキスト３３２５８等）は(3) のケー
スに近いといえる。また多くのインターカレーター性蛍
光色素は(4) のケースに含まれる（厳密に言えばアクリ
ジンオレンジ、ヘキスト３３２５８も(4) に入る）
のピーク波長が数ｎｍ変化しているが(1) の例として挙
げることができる。またビスベンチミド等（例えば後述
の実施例で用いるヘキスト３３２５８等）は(3) のケー
スに近いといえる。また多くのインターカレーター性蛍
光色素は(4) のケースに含まれる（厳密に言えばアクリ
ジンオレンジ、ヘキスト３３２５８も(4) に入る）
【００１６】従って、ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン前後あるいは過程の蛍光スペクトルをとることによっ
ても増幅の判定を行なうことは可能である。しかし、一
般的には２本鎖ＤＮＡの存在下での至適条件にて（励起
光スペクトルのピーク波長近辺で励起し、放射光スペク
トルのピーク波長近辺で測定する）蛍光強度の変化を測
定することで核酸の増幅を検出又は測定することが簡便
で好ましい。
ン前後あるいは過程の蛍光スペクトルをとることによっ
ても増幅の判定を行なうことは可能である。しかし、一
般的には２本鎖ＤＮＡの存在下での至適条件にて（励起
光スペクトルのピーク波長近辺で励起し、放射光スペク
トルのピーク波長近辺で測定する）蛍光強度の変化を測
定することで核酸の増幅を検出又は測定することが簡便
で好ましい。
【００１７】また、反応溶液に添加するインターカレー
ター性蛍光物質の量は、ポリメラーゼチェーンリアクシ
ョンにより、最終的に生成するであろう二本鎖核酸の数
塩基対ないし１００塩基対当りに１分子の蛍光色素が結
合する程度の量が好ましい。
ター性蛍光物質の量は、ポリメラーゼチェーンリアクシ
ョンにより、最終的に生成するであろう二本鎖核酸の数
塩基対ないし１００塩基対当りに１分子の蛍光色素が結
合する程度の量が好ましい。
【００１８】蛍光強度を測定する方法としては、従来か
ら行われている蛍光光度計により数値的に測定する方法
が好ましい。しかしながら、結果を定性的に判別するだ
けであれば肉眼、写真等により蛍光の濃淡を判別する方
法も用いることができる。本発明に係る核酸の検出方法
においては、特定核酸領域の検出を行う際、密封した状
態で行うことが望ましいので、ポリメラーゼチェーンリ
アクションを行った容器を密封したままの状態でそのま
ま蛍光光度計に適用することが好ましい。従って、ポリ
メラーゼチェーンリアクションを行う反応容器は蛍光色
素の励起光を通し、耐熱性に優れかつタンパク質の吸着
が少ない材料で成形されていることが好ましく、具体的
には、ポリプロピレン樹脂、シリコンコートされたガラ
ス、ポリメチルペンテン樹脂等の材料で成形された容器
を用いることが好ましい。
ら行われている蛍光光度計により数値的に測定する方法
が好ましい。しかしながら、結果を定性的に判別するだ
けであれば肉眼、写真等により蛍光の濃淡を判別する方
法も用いることができる。本発明に係る核酸の検出方法
においては、特定核酸領域の検出を行う際、密封した状
態で行うことが望ましいので、ポリメラーゼチェーンリ
アクションを行った容器を密封したままの状態でそのま
ま蛍光光度計に適用することが好ましい。従って、ポリ
メラーゼチェーンリアクションを行う反応容器は蛍光色
素の励起光を通し、耐熱性に優れかつタンパク質の吸着
が少ない材料で成形されていることが好ましく、具体的
には、ポリプロピレン樹脂、シリコンコートされたガラ
ス、ポリメチルペンテン樹脂等の材料で成形された容器
を用いることが好ましい。
【００１９】
【発明の効果】本発明によれば、ポリメラーゼチェーン
リアクションを利用した核酸の検出又は測定を密封した
状態で行うことができるため、従来問題となっていたポ
リメラーゼチェーンリアクションにより増幅された特定
核酸領域が環境中へ飛散し、これが他の検体に混入する
といった問題を克服できる。また、本発明は、従来から
用いられてきたポリメラーゼチェーンリアクション反応
溶液に微量の蛍光色素を添加するたけなので、操作が簡
単であり、技術的な熟練を必要としない。従って、検体
の大量処理が可能であり、ポリメラーゼチェーンリアク
ションを用いたスクリーニング等にも適用が可能とな
る。また、特定核酸領域の増幅が起こったか否かを数値
的に判断できるため、操作の自動化も容易である。
リアクションを利用した核酸の検出又は測定を密封した
状態で行うことができるため、従来問題となっていたポ
リメラーゼチェーンリアクションにより増幅された特定
核酸領域が環境中へ飛散し、これが他の検体に混入する
といった問題を克服できる。また、本発明は、従来から
用いられてきたポリメラーゼチェーンリアクション反応
溶液に微量の蛍光色素を添加するたけなので、操作が簡
単であり、技術的な熟練を必要としない。従って、検体
の大量処理が可能であり、ポリメラーゼチェーンリアク
ションを用いたスクリーニング等にも適用が可能とな
る。また、特定核酸領域の増幅が起こったか否かを数値
的に判断できるため、操作の自動化も容易である。
【００２０】
【実施例】以下、本発明の実施例を説明するが、本発明
はこれに限定されるものではない。
はこれに限定されるものではない。
【００２１】実施例１ 宝酒造製ＤＮＡキット（Gene AmpTM）を用いてポリメラ
ーゼチェーンリアクション法による核酸の増幅を行っ
た。ポリメラーゼチェーンリアクションを行う反応溶液
はキット添付の検定用λＤＮＡ及び１組のプライマーを
用いて、キット添付のプロトコールに従って調製した。
この反応溶液にインターカレーター性蛍光色素としてヘ
キスト３３２５８色素を最終濃度１μｇ／ｍｌになるよ
うに添加した。そして、変性（９４゜Ｃ、１分）、アニ
ーリング（３７゜Ｃ、１分）、Taqポリメラーゼによる
ＤＮＡの伸張（７２゜Ｃ、１分）のサイクルを３０サイ
クル行った。反応溶液の組成は以下のとうりである。 反応溶液の組成 λＤＮＡ（0.1 μg/ml） 10μl 10 x 反応緩衝液 10μl Hoechst33258(10 μg/ml) 10 μl プライマー１及びプライマー２(20 μM) 各5 μl dNTP混合物（各2.5 mM) 8 μl H20 51.5 μl Taq ポリメラーゼ(5単位／μl) 0.5 μl 上記の10 x 反応緩衝液の組成は以下のとうりである。 10 x 反応緩衝液 塩化カリウム 0.5M トリス−塩酸緩衝液(pH8.3) 0.1M 塩化マグネシウム 15mM ゼラチン 0.01%(w/v) 使用したプライマー１及び２の塩基配列は以下のとうり
である。 プライマーの塩基配列 プライマー１：λＤＮＡの7131-7155 （一鎖に相補的） GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG プライマー２：λＤＮＡの7606-7630 （＋鎖に相補的） GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC
ーゼチェーンリアクション法による核酸の増幅を行っ
た。ポリメラーゼチェーンリアクションを行う反応溶液
はキット添付の検定用λＤＮＡ及び１組のプライマーを
用いて、キット添付のプロトコールに従って調製した。
この反応溶液にインターカレーター性蛍光色素としてヘ
キスト３３２５８色素を最終濃度１μｇ／ｍｌになるよ
うに添加した。そして、変性（９４゜Ｃ、１分）、アニ
ーリング（３７゜Ｃ、１分）、Taqポリメラーゼによる
ＤＮＡの伸張（７２゜Ｃ、１分）のサイクルを３０サイ
クル行った。反応溶液の組成は以下のとうりである。 反応溶液の組成 λＤＮＡ（0.1 μg/ml） 10μl 10 x 反応緩衝液 10μl Hoechst33258(10 μg/ml) 10 μl プライマー１及びプライマー２(20 μM) 各5 μl dNTP混合物（各2.5 mM) 8 μl H20 51.5 μl Taq ポリメラーゼ(5単位／μl) 0.5 μl 上記の10 x 反応緩衝液の組成は以下のとうりである。 10 x 反応緩衝液 塩化カリウム 0.5M トリス−塩酸緩衝液(pH8.3) 0.1M 塩化マグネシウム 15mM ゼラチン 0.01%(w/v) 使用したプライマー１及び２の塩基配列は以下のとうり
である。 プライマーの塩基配列 プライマー１：λＤＮＡの7131-7155 （一鎖に相補的） GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG プライマー２：λＤＮＡの7606-7630 （＋鎖に相補的） GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC
【００２２】ポリメラーゼチェーンリアクション終了
後、反応容器を密封した状態で、蛍光分光光度計（日立
８５０型）を用いて、励起３４３nm、発光４８３nm（PM
ゲイン：High、応答：２秒、EMフィルター：３５０nm）
にて蛍光強度を測定した。
後、反応容器を密封した状態で、蛍光分光光度計（日立
８５０型）を用いて、励起３４３nm、発光４８３nm（PM
ゲイン：High、応答：２秒、EMフィルター：３５０nm）
にて蛍光強度を測定した。
【００２３】また、陰性対照実験として、λＤＮＡを添
加しなかった他は上述の反応溶液と同一組成の反応溶液
を用い、同一条件でポリメラーゼチェーンリアクション
と蛍光強度の測定を行った。
加しなかった他は上述の反応溶液と同一組成の反応溶液
を用い、同一条件でポリメラーゼチェーンリアクション
と蛍光強度の測定を行った。
【００２４】その結果、陰性対照区では蛍光強度が２７
５であるのに対し、陽性対照区では蛍光強度が１２６０
であり、明らかに差異が認められた。
５であるのに対し、陽性対照区では蛍光強度が１２６０
であり、明らかに差異が認められた。
【００２５】さらに、ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン終了後の反応溶液の一部を１％アガロースゲル（トリ
ス、ホウ酸、ＥＤＴＡを含む緩衝液系）に供し、室温で
３０分、１００Ｖの条件下で電気泳動にかけたところ、
図１に示されるような電気泳動図が得られた。なお、図
１中、レーン１は分子量マーカーの泳動パターン、レー
ン２はポリメラーゼチェーンリアクションでＤＮＡを増
幅した陽性対照区の電気泳動パターン、レーン３は陰性
対照区の電気泳動パターンを示す。この電気泳動図から
も陽性対照区でλＤＮＡの特定核酸領域の増幅が起こっ
ていることが確認された。以上の結果から本発明の効果
は明らかであった。
ン終了後の反応溶液の一部を１％アガロースゲル（トリ
ス、ホウ酸、ＥＤＴＡを含む緩衝液系）に供し、室温で
３０分、１００Ｖの条件下で電気泳動にかけたところ、
図１に示されるような電気泳動図が得られた。なお、図
１中、レーン１は分子量マーカーの泳動パターン、レー
ン２はポリメラーゼチェーンリアクションでＤＮＡを増
幅した陽性対照区の電気泳動パターン、レーン３は陰性
対照区の電気泳動パターンを示す。この電気泳動図から
も陽性対照区でλＤＮＡの特定核酸領域の増幅が起こっ
ていることが確認された。以上の結果から本発明の効果
は明らかであった。
【００２６】実施例２ 実施例１と同一条件でポリメラーゼチェーンリアクショ
ンの反応溶液を調製し、陽性対照区と陰性対照区の各々
について、ポリメラーゼチェーンリアクションを行う前
と、ポリメラーゼチェーンリアクションの終了後、それ
ぞれ密封した状態で蛍光強度を測定した。尚、蛍光強度
の測定も実施例１と同一の条件により行った。
ンの反応溶液を調製し、陽性対照区と陰性対照区の各々
について、ポリメラーゼチェーンリアクションを行う前
と、ポリメラーゼチェーンリアクションの終了後、それ
ぞれ密封した状態で蛍光強度を測定した。尚、蛍光強度
の測定も実施例１と同一の条件により行った。
【００２７】結果は以下の通りである。 ＰＣＲ：ポリメラーゼチェーンリアクション
【００２８】陰性対照区においてもポリメラーゼチェー
ンリアクションにより若干の蛍光強度の増加が認められ
るが、その増加率は１．２倍である。これに対し、陽性
対照区においては、蛍光強度の増加率は５．７倍であ
り、明らかに差異が認められた。 以上の結果からも本
発明の効果は明らかであった。
ンリアクションにより若干の蛍光強度の増加が認められ
るが、その増加率は１．２倍である。これに対し、陽性
対照区においては、蛍光強度の増加率は５．７倍であ
り、明らかに差異が認められた。 以上の結果からも本
発明の効果は明らかであった。
【００２９】実施例３（細菌由来の染色体ＤＮＡの検
出） Mycobacterium smegmatis をDubos の培地で５日間培養
した後、菌体を遠心分離により収集し、そのうち１００
ｍｇを標準菌体とした。この標準菌体を下記の組成を有
する緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、これに０．１ｍｌの２
０％ドデシル硫酸ナトリウムを加え、等量のフェノール
／クロロフォルム混合溶液（１：１）を加え激しく混和
した後、６０゜Ｃで１０分間静定した。
出） Mycobacterium smegmatis をDubos の培地で５日間培養
した後、菌体を遠心分離により収集し、そのうち１００
ｍｇを標準菌体とした。この標準菌体を下記の組成を有
する緩衝液０．５ｍｌに懸濁し、これに０．１ｍｌの２
０％ドデシル硫酸ナトリウムを加え、等量のフェノール
／クロロフォルム混合溶液（１：１）を加え激しく混和
した後、６０゜Ｃで１０分間静定した。
【００３０】この溶液を遠心分離にかけ水相を分離し、
この水相に２．５倍量のエタノールを加え、−８０゜Ｃ
で３０分静定した後、遠心分離により核酸を沈澱させ
た。この沈澱を７０％エタノールで洗浄し、真空中で乾
燥させた後、１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、検定用
ＤＮＡとした。尚、上記緩衝液の組成は以下のとうりで
ある。
この水相に２．５倍量のエタノールを加え、−８０゜Ｃ
で３０分静定した後、遠心分離により核酸を沈澱させ
た。この沈澱を７０％エタノールで洗浄し、真空中で乾
燥させた後、１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、検定用
ＤＮＡとした。尚、上記緩衝液の組成は以下のとうりで
ある。
【００３１】この検定用ＤＮＡについてポリメラーゼチ
ェーンリアクションを行い、染色体上の１６ＳｒＲＮＡ
遺伝子の増幅を行った。そして、ポリメラーゼチェーン
リアクションを行う前とポリメラーゼチェーンリアクシ
ョンの終了後、それぞれ密閉した状態で蛍光強度の測定
を行った。尚、ポリメラーゼチェーンリアクションの反
応溶液の組成は以下のとうりである。 反応溶液の組成 検定用ＤＮＡ 1 μl 10 x 反応緩衝液 10μl Hechst33258(10μg/ml) 10 μl プライマー１ 5 μl プライマー２ 5 μl dNTP混合物（2.5 mMずつ） 8 μl H20 60.5 μlTaq ポリメラーゼ 0.5 μl プライマー１及び２の塩基配列は以下のとうりである。 プライマーの塩基配列 プライマー１ 5'TAACACATGCAAGTCGAACGG3' プライマー２ 5'AACTGAGACCGGCTTTTAAGGATT3' ポリメラーゼチェーンリアクション及び蛍光強度の測定
は実施例１と同一方法により行った。
ェーンリアクションを行い、染色体上の１６ＳｒＲＮＡ
遺伝子の増幅を行った。そして、ポリメラーゼチェーン
リアクションを行う前とポリメラーゼチェーンリアクシ
ョンの終了後、それぞれ密閉した状態で蛍光強度の測定
を行った。尚、ポリメラーゼチェーンリアクションの反
応溶液の組成は以下のとうりである。 反応溶液の組成 検定用ＤＮＡ 1 μl 10 x 反応緩衝液 10μl Hechst33258(10μg/ml) 10 μl プライマー１ 5 μl プライマー２ 5 μl dNTP混合物（2.5 mMずつ） 8 μl H20 60.5 μlTaq ポリメラーゼ 0.5 μl プライマー１及び２の塩基配列は以下のとうりである。 プライマーの塩基配列 プライマー１ 5'TAACACATGCAAGTCGAACGG3' プライマー２ 5'AACTGAGACCGGCTTTTAAGGATT3' ポリメラーゼチェーンリアクション及び蛍光強度の測定
は実施例１と同一方法により行った。
【００３２】その結果、ポリメラーゼチェーンリアクシ
ョン前では蛍光強度が５３０であるのに対し、ポリメラ
ーゼチェーンリアクション終了後では蛍光強度が９０２
であり、約１．７倍の蛍光強度の増加が認められ、ＤＮ
Ａの特定領域の増幅を通してＤＮＡの存在が確認され
た。以上の結果からも本発明の効果は明らかであった。
ョン前では蛍光強度が５３０であるのに対し、ポリメラ
ーゼチェーンリアクション終了後では蛍光強度が９０２
であり、約１．７倍の蛍光強度の増加が認められ、ＤＮ
Ａの特定領域の増幅を通してＤＮＡの存在が確認され
た。以上の結果からも本発明の効果は明らかであった。
【００３３】実施例４ 実施例１と同じようにポリメラーゼチェーンリアクショ
ンの反応溶液６００μｌを調製し（ただし鋳型となるλ
ＤＮＡの濃度は実施例１の１０分の１濃度）、各５０μ
ｌづつに１２等分し、マイクロチューブに分注した。ポ
リメラーゼチェーンリアクションの各濃度条件は変性
（９４℃，３０秒）、アニーリング（４５℃，２０
秒）、ＴａｇポリメラーゼによるＤＮＡの伸長（７２
℃，１分）で２５サイクル行った。０，９，１２，１
４，１６，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２５
サイクル目で各チューブを取り出し、７２℃に温度調節
されたホルダーをセットされた蛍光検出器（自作、励起
光３５０ｎｍ、エミッション４５０ｎｍ）で測定した。
図２はサイクル数を横軸に相対蛍光強度を縦軸にプロッ
トしたものである。これらの結果から蛍光強度を測定す
ることでポリメラーゼチェーンリアクションの過程を密
封した状態でモニターできることが確認された。これら
の結果からも本発明の効果は明らかであった。
ンの反応溶液６００μｌを調製し（ただし鋳型となるλ
ＤＮＡの濃度は実施例１の１０分の１濃度）、各５０μ
ｌづつに１２等分し、マイクロチューブに分注した。ポ
リメラーゼチェーンリアクションの各濃度条件は変性
（９４℃，３０秒）、アニーリング（４５℃，２０
秒）、ＴａｇポリメラーゼによるＤＮＡの伸長（７２
℃，１分）で２５サイクル行った。０，９，１２，１
４，１６，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２５
サイクル目で各チューブを取り出し、７２℃に温度調節
されたホルダーをセットされた蛍光検出器（自作、励起
光３５０ｎｍ、エミッション４５０ｎｍ）で測定した。
図２はサイクル数を横軸に相対蛍光強度を縦軸にプロッ
トしたものである。これらの結果から蛍光強度を測定す
ることでポリメラーゼチェーンリアクションの過程を密
封した状態でモニターできることが確認された。これら
の結果からも本発明の効果は明らかであった。
【００３４】実施例５ 実施例１と同じように鋳型濃度の異なる３種類のポリメ
ラーゼチェーンリアクションの反応溶液３００μｌを調
製し（但し、各プライマー濃度は１／５濃度とした。ま
た鋳型ＤＮＡは１００ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ，１
ｎｇ／ｍｌの３種類とした）、これを１２等分し各２５
μｌづつチューブに分注し、変性（９４℃，１分）、ア
ニーリング（３７℃，１分）、伸長反応（７２℃，１
分）の条件でポリメラーゼチェーンリアクション２６サ
イクル行った。これらを実施例４と同様に０，５，１
０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６
サイクル目にそれぞれ各チューブを取り出し、室温にて
各チューブの相対蛍光強度を測定した。それぞれの結果
を同一グラフ上にプロットしたものが図３である。これ
らの結果から明らかなように、鋳型ＤＮＡの初期濃度が
高いものほど、早い時期に蛍光が増大し始めることが判
る。このことからポリメラーゼチェーンリアクションの
過程をモニターすることにより、試料中に含まれる目的
核酸の量を比較が可能で有ることが確認された。以上の
結果からも本発明の効果は明らかである。
ラーゼチェーンリアクションの反応溶液３００μｌを調
製し（但し、各プライマー濃度は１／５濃度とした。ま
た鋳型ＤＮＡは１００ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌ，１
ｎｇ／ｍｌの３種類とした）、これを１２等分し各２５
μｌづつチューブに分注し、変性（９４℃，１分）、ア
ニーリング（３７℃，１分）、伸長反応（７２℃，１
分）の条件でポリメラーゼチェーンリアクション２６サ
イクル行った。これらを実施例４と同様に０，５，１
０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６
サイクル目にそれぞれ各チューブを取り出し、室温にて
各チューブの相対蛍光強度を測定した。それぞれの結果
を同一グラフ上にプロットしたものが図３である。これ
らの結果から明らかなように、鋳型ＤＮＡの初期濃度が
高いものほど、早い時期に蛍光が増大し始めることが判
る。このことからポリメラーゼチェーンリアクションの
過程をモニターすることにより、試料中に含まれる目的
核酸の量を比較が可能で有ることが確認された。以上の
結果からも本発明の効果は明らかである。
【図１】ポリメラーゼチェーンリアクション終了後の反
応溶液の電気泳動図の模式図。
応溶液の電気泳動図の模式図。
【図２】ポリメラーゼチェーンリアクションのサイクル
数と相対蛍光強度との関係を示す図。
数と相対蛍光強度との関係を示す図。
【図３】異なる濃度の鋳型ＤＮＡを含む３種類の試料を
試験した場合における、ポリメラーゼチェーンリアクシ
ョンのサイクル数と相対蛍光強度との関係を示す図。
試験した場合における、ポリメラーゼチェーンリアクシ
ョンのサイクル数と相対蛍光強度との関係を示す図。
Claims (6)
- 【請求項１】 核酸と反応することにより蛍光特性が変
化する蛍光色素の存在下で、被検試料中の標的核酸の特
定核酸領域をポリメラーゼチェーンリアクションにより
増幅し、前記蛍光特性の変化を測定することからなる、
被検試料中の標的核酸の測定方法。 - 【請求項２】 前記特定核酸領域の増幅及び前記蛍光特
性の変化の測定は密閉された状態で行なわれる請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 前記蛍光色素はインターカレーター性蛍
光色素である請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 核酸と反応することにより蛍光特性が変
化する蛍光色素と、ポリメラーゼチェーンリアクション
により標的核酸を増幅するための試薬とを同一の容器内
に含む、被検試料中の標的核酸の測定用キット。 - 【請求項５】 核酸と反応することにより蛍光特性が変
化する蛍光色素と、ポリメラーゼチェーンリアクション
により標的核酸を増幅するための試薬とを容器内に含
む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の測定方法
を行うための測定用キット。 - 【請求項６】 前記蛍光色素はインターカレーター性蛍
光色素である請求項４又は５記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29430590 | 1990-10-31 | ||
| JP2-294305 | 1990-10-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05237000A JPH05237000A (ja) | 1993-09-17 |
| JP2985446B2 true JP2985446B2 (ja) | 1999-11-29 |
Family
ID=17805976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3313616A Expired - Lifetime JP2985446B2 (ja) | 1990-10-31 | 1991-10-31 | 核酸の検出及び測定方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0487218B1 (ja) |
| JP (1) | JP2985446B2 (ja) |
| DE (1) | DE69128520T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010046063A (ja) * | 1996-06-04 | 2010-03-04 | Univ Of Utah Research Foundation | Ｐｃｒ中のハイブリダイゼーションのモニタリング |
Families Citing this family (66)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5994056A (en) * | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| DE69327326T2 (de) * | 1992-07-24 | 2001-08-16 | Diatech Pty. Ltd., Brisbane | Vervielfältigungs- und detektionsprozess |
| FR2694768B1 (fr) * | 1992-07-30 | 1994-12-23 | Pasteur Institut | Séquences d'oligonucléotides pour la détection spécifique de mollicutes par amplication de gènes conservés. |
| DE69333991T2 (de) * | 1992-11-27 | 2006-12-14 | Canon K.K. | Verfahren und Sonde zum Nachweis von Nukleinsäuren |
| JP3247001B2 (ja) * | 1992-12-21 | 2002-01-15 | キヤノン株式会社 | ピリリウム化合物を用いた２本鎖核酸の検出方法、ピリリウム化合物を含有するプローブ及びそれを用いた標的核酸の検出方法、新規ピリリウム化合物 |
| JP3451667B2 (ja) * | 1993-08-24 | 2003-09-29 | 東ソー株式会社 | 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 |
| ATE207966T1 (de) * | 1993-09-13 | 2001-11-15 | Canon Kk | Bestimmung von nukleinsäuren durch pcr, messung der anzahl von mikrobiellen zellen, genen oder genkopien durch pcr und kit zu ihrer verwendung |
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| GB2282138B (en) * | 1993-09-28 | 1997-09-03 | Tosoh Corp | Method of extracting nucleic acids and method of detecting specified nucleic acid sequences |
| JPH07233065A (ja) | 1993-12-27 | 1995-09-05 | Canon Inc | ピリリウム塩又はピリリウム類似塩を含む光化学治療薬 |
| CA2148140C (en) * | 1994-04-29 | 2010-08-10 | John W. Sutherland | Homogeneous method for assay of double-stranded nucleic acids using fluorescent dyes and kit useful therein |
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