JP2948405B2 - 微生物の迅速測定方法 - Google Patents
微生物の迅速測定方法Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は食品、排水、工業用純水
などの液中に存在する生体（微生物）の数を迅速に計数
する検査法に関する。
などの液中に存在する生体（微生物）の数を迅速に計数
する検査法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物の検出法として、従来から寒天培
養による方法が使用されているが、この方法は培養操作
を必要とするため、測定に２４時間〜数日の長時間を必
要とする。このため、微生物測定時間の短縮が試みられ
ている。たとえば、５（６）−カルボキシフルオレッセ
ン ジアセテート｛ 5(and-6)-CARBOXYFLUORESCEIN DIA
CETATE) ｝（以下、ＦＤＡという）を用いる方法が提案
されている。ＦＤＡ法はＦＤＡを微生物細胞に作用させ
るとＦＤＡが細胞膜を通過して、その後に反応式１に示
すように細胞内のエステラーゼ（酵素）によって分解さ
れ蛍光物質であるフルオレッセイン( Fluorescein ) に
変化する。細胞内に留まったフルオレッセインに励起光
が照射されると蛍光を発するので、この蛍光を検出する
ことにより微生物を検出する方法である。エステラーゼ
によるＦＤＡの分解は生細胞では起こるが、死んだ細胞
では起きないので検出対象は生細胞のみとなり、死んだ
細胞については検出できない。また、生細胞内で生じた
フルオレッセインの大部分は細胞内に留まるが、細胞外
への漏出があるので生細胞と細胞の周囲の蛍光強度の差
が減少して計測上のＳ／Ｎ比が減少する不具合がある。
養による方法が使用されているが、この方法は培養操作
を必要とするため、測定に２４時間〜数日の長時間を必
要とする。このため、微生物測定時間の短縮が試みられ
ている。たとえば、５（６）−カルボキシフルオレッセ
ン ジアセテート｛ 5(and-6)-CARBOXYFLUORESCEIN DIA
CETATE) ｝（以下、ＦＤＡという）を用いる方法が提案
されている。ＦＤＡ法はＦＤＡを微生物細胞に作用させ
るとＦＤＡが細胞膜を通過して、その後に反応式１に示
すように細胞内のエステラーゼ（酵素）によって分解さ
れ蛍光物質であるフルオレッセイン( Fluorescein ) に
変化する。細胞内に留まったフルオレッセインに励起光
が照射されると蛍光を発するので、この蛍光を検出する
ことにより微生物を検出する方法である。エステラーゼ
によるＦＤＡの分解は生細胞では起こるが、死んだ細胞
では起きないので検出対象は生細胞のみとなり、死んだ
細胞については検出できない。また、生細胞内で生じた
フルオレッセインの大部分は細胞内に留まるが、細胞外
への漏出があるので生細胞と細胞の周囲の蛍光強度の差
が減少して計測上のＳ／Ｎ比が減少する不具合がある。
【化１】
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は細胞と作用し
た後に生ずる蛍光物質が細胞の周辺に漏出して測定にお
けるＳ／Ｎ比を低下させることが少なく、また生きた細
胞と死んだ細胞で発光量に明瞭な差が得られる菌の検出
方法を得る方法を提供しようとするものである。
た後に生ずる蛍光物質が細胞の周辺に漏出して測定にお
けるＳ／Ｎ比を低下させることが少なく、また生きた細
胞と死んだ細胞で発光量に明瞭な差が得られる菌の検出
方法を得る方法を提供しようとするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は検体中の微生物
と直接反応して、非発光物質から蛍光・燐光などの発光
物質に変化する物質に励起光を照射し、これにより発生
する光を検出することによって検体中の微生物の数を計
測する方法において、上記物質がマレイミド官能基を有
するＮ−（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリニ
ル）マレイミドを用いることを特徴とする微生物の迅速
測定方法である。
と直接反応して、非発光物質から蛍光・燐光などの発光
物質に変化する物質に励起光を照射し、これにより発生
する光を検出することによって検体中の微生物の数を計
測する方法において、上記物質がマレイミド官能基を有
するＮ−（７−ジメチルアミノ−４−メチルクマリニ
ル）マレイミドを用いることを特徴とする微生物の迅速
測定方法である。
【０００５】本発明では酵素反応という間接的作用を通
して蛍光物質化するのではなく、微生物細胞と直接的に
反応して非蛍光物質を蛍光物質に変換できるマレイミド
誘導体を検体に添加して、微生物からの発光を光電子倍
増管で検出し計数する手段を採用した。発光プローブと
してはマレイミド誘導体の一種であるＮ−（７−ジメチ
ルアミノ−４−メチルクマリニル）マレイミド〔 N-(7-
Dimethylamino-4-methy lcoumarinyl)maleimide 〕（以
下、ＤＡＣＭという）を用いるものである。
して蛍光物質化するのではなく、微生物細胞と直接的に
反応して非蛍光物質を蛍光物質に変換できるマレイミド
誘導体を検体に添加して、微生物からの発光を光電子倍
増管で検出し計数する手段を採用した。発光プローブと
してはマレイミド誘導体の一種であるＮ−（７−ジメチ
ルアミノ−４−メチルクマリニル）マレイミド〔 N-(7-
Dimethylamino-4-methy lcoumarinyl)maleimide 〕（以
下、ＤＡＣＭという）を用いるものである。
【０００６】
【作用】マレイミド誘導体は一般には非発光性であり、
微生物細胞に存在するＳＨ基と反応し結合して蛍光物質
となる。従って、先に述べたＦＤＡの如くに蛍光物質化
した物が生細胞の外に漏出する度合いは少ないのでＳ／
Ｎ比を高く出来るために計測上有利である。
微生物細胞に存在するＳＨ基と反応し結合して蛍光物質
となる。従って、先に述べたＦＤＡの如くに蛍光物質化
した物が生細胞の外に漏出する度合いは少ないのでＳ／
Ｎ比を高く出来るために計測上有利である。
【０００７】マレイミド誘導体を微生物（生体）に作用
させた際に蛍光物質に変換される反応式２を下記に示
す。
させた際に蛍光物質に変換される反応式２を下記に示
す。
【化２】
【０００８】
【実施例】本発明の一実施例を図１によって説明する。
反応槽３に被検体である検体溶液を検体溶液流入ライン
１にて流入させて、ここで蛍光薬品注入ライン２を介し
て蛍光プローブ、すなわちＤＡＣＭと混合させる。薬品
量は概略０．０１〜１ｍｇ／ミリリットルとする。混合
して微生物による発光体を含んだ試料液は一定の滞留時
間を反応槽３内で経た後に、検体液流入ライン４を経て
連続的にフローセル５に達する。ここで、励起光を励起
光源７より光の幅を制限するスリット８、一定波長の光
を得るフィルタ９および集光レンズ１０を介してフロー
セル５内の試料に照射すると、微生物による発光体は特
定波長の光を発光する。この光を集光レンズ１１と特定
の発光波長を検出するフィルタ１２を介して光電子増倍
管１３で検出し、この数を光量子カウンタ１４でカウン
トすることにより検体液中の微生物個数が計測できる。
反応槽３に被検体である検体溶液を検体溶液流入ライン
１にて流入させて、ここで蛍光薬品注入ライン２を介し
て蛍光プローブ、すなわちＤＡＣＭと混合させる。薬品
量は概略０．０１〜１ｍｇ／ミリリットルとする。混合
して微生物による発光体を含んだ試料液は一定の滞留時
間を反応槽３内で経た後に、検体液流入ライン４を経て
連続的にフローセル５に達する。ここで、励起光を励起
光源７より光の幅を制限するスリット８、一定波長の光
を得るフィルタ９および集光レンズ１０を介してフロー
セル５内の試料に照射すると、微生物による発光体は特
定波長の光を発光する。この光を集光レンズ１１と特定
の発光波長を検出するフィルタ１２を介して光電子増倍
管１３で検出し、この数を光量子カウンタ１４でカウン
トすることにより検体液中の微生物個数が計測できる。
【０００９】この実施例では蛍光プローブとしてＤＡＣ
Ｍを用いた。励起波長として４２８ｎｍを用い、蛍光波
長４７０ｎｍを検出すれば高いＳ／Ｎ比で微生物細胞を
識別できる。図２〜図５にＤＡＣＭを用いた微生物（大
腸菌）の測定例を示す。図２は励起スペクトル、図３は
生きた大腸菌が検体内にある場合の蛍光スペクトル、図
４は死んだ大腸菌が検体内にある場合の蛍光スペクト
ル、図５は検体液中に菌が存在しない場合のスペクトル
を示す。蛍光波長４７０ｎｍにおける強度を比較する
と、生菌あり（図３）：死菌あり（図４）：菌なし（図
５）＝５．００：２．８４：０．６２＝８．１：４．
６：１．０となっており生菌あり（図３）：死菌あり
（図４）＝１．８：１．０、死菌あり（図４）：菌なし
（図５）＝４．６：１．０であり、十分に生きた菌と死
んだ菌を菌が存在する液中においてＤＡＣＭを発光プロ
ーブとして使用することで識別できる。
Ｍを用いた。励起波長として４２８ｎｍを用い、蛍光波
長４７０ｎｍを検出すれば高いＳ／Ｎ比で微生物細胞を
識別できる。図２〜図５にＤＡＣＭを用いた微生物（大
腸菌）の測定例を示す。図２は励起スペクトル、図３は
生きた大腸菌が検体内にある場合の蛍光スペクトル、図
４は死んだ大腸菌が検体内にある場合の蛍光スペクト
ル、図５は検体液中に菌が存在しない場合のスペクトル
を示す。蛍光波長４７０ｎｍにおける強度を比較する
と、生菌あり（図３）：死菌あり（図４）：菌なし（図
５）＝５．００：２．８４：０．６２＝８．１：４．
６：１．０となっており生菌あり（図３）：死菌あり
（図４）＝１．８：１．０、死菌あり（図４）：菌なし
（図５）＝４．６：１．０であり、十分に生きた菌と死
んだ菌を菌が存在する液中においてＤＡＣＭを発光プロ
ーブとして使用することで識別できる。
【００１０】
【発明の効果】本発明により、従来２４時間〜数日の長
時間を要していた微生物細胞の計数測定が５〜４０分
で、連続的に実施可能となり、また生きた細胞と死んだ
細胞を蛍光強度の差から分別して計測ができる。従っ
て、本発明により食品製造に用いる水や溶液さらに半導
体製造時の洗浄用純水などに含まれる微生物の検出と計
数を速やかに行え、かつ生きた微生物と死んだ微生物を
分別して計数できるので殺菌工程の殺菌効率の迅速なチ
ェックに用いることが可能となり、検査の省力化や品質
管理の向上など経済的・技術的効果が得られる。
時間を要していた微生物細胞の計数測定が５〜４０分
で、連続的に実施可能となり、また生きた細胞と死んだ
細胞を蛍光強度の差から分別して計測ができる。従っ
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数を速やかに行え、かつ生きた微生物と死んだ微生物を
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管理の向上など経済的・技術的効果が得られる。
【図１】本発明の一実施例に使用する装置の説明図。
【図２】本発明で使用するＤＡＣＭの励起スペクトルを
示す図表。
示す図表。
【図３】ＤＡＣＭを適用した時の生きた大腸菌が検体内
にある場合の蛍光スペクトルを示す図表。
にある場合の蛍光スペクトルを示す図表。
【図４】ＤＡＣＭを適用した時の死んだ大腸菌が検体内
にある場合の蛍光スペクトルを示す図表。
にある場合の蛍光スペクトルを示す図表。
【図５】ＤＡＣＭを適用した時の検体内に菌が存在しな
い場合の蛍光スペクトルを示す図表。
い場合の蛍光スペクトルを示す図表。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/06 G01N 21/78 C12Q 1/44 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 検体中の微生物と直接反応して、非発光
物質から蛍光・燐光などの発光物質に変化する物質に励
起光を照射し、これにより発生する光を検出することに
よって検体中の微生物の数を計測する方法において、上
記物質がマレイミド官能基を有するＮ−（７−ジメチル
アミノ−４−メチルクマリニル）マレイミドを用いるこ
とを特徴とする微生物の迅速測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4524792A JP2948405B2 (ja) | 1992-03-03 | 1992-03-03 | 微生物の迅速測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4524792A JP2948405B2 (ja) | 1992-03-03 | 1992-03-03 | 微生物の迅速測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05236994A JPH05236994A (ja) | 1993-09-17 |
| JP2948405B2 true JP2948405B2 (ja) | 1999-09-13 |
Family
ID=12713936
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4524792A Expired - Fee Related JP2948405B2 (ja) | 1992-03-03 | 1992-03-03 | 微生物の迅速測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2948405B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6329165B1 (en) * | 1999-12-30 | 2001-12-11 | Nalco Chemical Company | Measurement and control of sessile and planktonic microbiological activity in industrial water systems |
| JP5743558B2 (ja) * | 2011-01-12 | 2015-07-01 | 株式会社東芝 | 分析装置 |
-
1992
- 1992-03-03 JP JP4524792A patent/JP2948405B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05236994A (ja) | 1993-09-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19990608 |
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