JP2909316B2 - 酵素含有組成物及び酵素活性の安定化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】一般的には、本発明は臨床化学に
関する。詳細には、本発明はクレアチンキナーゼ活性の
安定化方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】クレアチンキナーゼ（本明細書では、Ｃ
Ｋと略書きするが、またクレアチンホスホキナーゼ及び
ＣＰＫとして既知である）の活性を測定することは、進
行性筋ジストロフィー、皮膚筋炎及び心筋梗塞のような
疾患の診断に有用である。ＣＫは、ヒト体液及び組織中
に、異なるイソ酵素の形状で存在し、例えば、筋肉では
ＣＫ−ＭＭ、脳ではＣＫ−ＢＢ及び心筋ではＣＫ−ＭＢ
が存在する。一般的には、ＣＫ−ＢＢは血流中に移行し
ないので、健康なヒト血清中に存在するＣＫ活性は、通
常ＣＫ−ＭＭイソ酵素によるものである。健康なヒトで
は、一般的にはＣＫ−ＭＢは特定の器官、例えば、心筋
に限定される。しかしながら、心筋硬塞の場合のよう
に、心筋が傷害を受ける場合、ＣＫ−ＭＢが血清中に放
出され、そしてその中から検出できる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】血清中のＣＫもしくは
ＣＫ−ＭＢの量を測定する臨床デバイスは、診断デバイ
スが適切に操作されているかどうかを示すために、常に
品質管理並びに較正を必要とする。このような品質管理
もしくは較正に用いられる組成物類（以下本明細書で
は、対照組成物と称される）は、既知活性のアッセイし
ようとする酵素を含有する。このような対照の酵素活性
が、時間に対応して、実質的に変化しないことが公理で
ある。更に、対照組成物中に存在する酵素が患者サンプ
ル中に存在する酵素と同様に挙動することが重要であ
る。

【０００４】活性消失に対して酵素（例えば、クレアチ
ンキナーゼ）を保護する幾つかの試みは、何らかの方法
で酵素自身を修飾することに主に集中している。例え
ば、米国特許第４，９３１，３９２号明細書は、（ａ）
酵素のジスルフィド修飾、及び（ｂ）クレアチンキナー
ゼに対する活性化炭水化物の共有結合、を含んで成る２
段階方法を教示する。

【０００５】この方法に伴う課題は、対照酵素が変性さ
れ、従ってそれがヒト血清中に見い出される天然の酵素
とは異なることである。この変性された状態では、酵素
は、天然の生理学的活性酵素と同様に挙動もしくは反応
しないかもしれず、従って患者サンプル中の酵素活性は
予測されないかもしれない。このような差異は、不正確
な結果を導き出しうる。更に、このような変性された酵
素は、市販されておらず、そしてそれらの製造は、アッ
セイの総経費を増大するであろう。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、非反応性スル
フヒドリル基を有するタンパク質中、還元型状態でスル
フヒドリル基を有する酵素を含んで成る組成物を提供す
ることにより、上記課題を解決する。

【０００７】また、本発明は、（ａ）非反応性であるス
ルフヒドリル基を有するタンパク質の水溶液を調製する
段階、及び（ｂ）還元型状態でスルフヒドリル基を有す
る酵素を前記水溶液に添加する段階、を含んで成る前記
酵素の活性を安定化させる方法を提供する。

【０００８】また別の様相では、本発明は、請求項１も
しくは２の組成物の１つが較正用組成物として使用され
る、酵素活性を検出するためのデバイスを較正する方法
を提供する。

【０００９】非反応性スルフヒドリル基を有するタンパ
ク質を含む溶液中における酵素活性の安定化を教示する
従来技術文献がないことに、本発明者らは気付いてい
る。従来技術方法は、酵素自体を修飾することを試みて
いる。発明者らの研究の経過中に、発明者らは、予期せ
ずに、溶液中に用いられるタンパク質のスルフヒドリル
基の反応性に依存して、酵素活性が変化することを見い
出した。

【００１０】

【具体的な態様】本明細書で使用される「対照組成物」
の語は、一般的には、既知酵素活性を有する水性もしく
は凍結乾燥された組成物を表す。それは、酵素活性を試
験するための方法、分析要素もしくは装置の正確さを調
査するのに用いられる。対照組成物は、既知酵素活性を
有する標品として使用してもよく、又、それは、装置を
較正するのに用いてもよい。

【００１１】「反応性スルフヒドリル基」の語は、酵素
上のスルフヒドリル基と反応できるタンパク質上の遊離
スルフヒドリル基を称する。「非反応性スルフヒドリル
基」は、実質的に反応性スルフヒドリル基を持たないタ
ンパク質を称する。

【００１２】「修飾されたスルフヒドリル」の語は、タ
ンパク質上のスルフヒドリル基が遮断され（また、当該
技術分野では「保護され」と表される）、そしてそれに
より酵素上のスルフヒドリル基と非反応性にされたこと
を意味する。

【００１３】酵素活性の安定性に影響を及ぼす重要な機
構は、酵素上の遊離スルフヒドリル基の酸化及びその結
果生じるジスルフィドの形成である。これらのスルフヒ
ドリルが還元型状態である場合、酵素は活性であり、酸
化型状態である場合、酵素は不活性である。

【００１４】通常遭遇するほとんどのタンパク質は、遊
離スルフヒドリル基を含有する。これらのスルフヒドリ
ル基の１つ以上が、別の遊離スルフヒドリル基と反応で
き、そして酸化されうる。一般的には、酸化は、酵素活
性の消失をもたらす。

【００１５】反応性スルフヒドリルを有する酵素が、反
応性タンパク質溶液中に保たれる場合、タンパク質上の
スルフヒドリル基と酵素上のスルフヒドリル基の間の反
応が、酵素上のスルフヒドリル基を酸化できると発明者
らは仮定した。従って、タンパク質由来の遊離スルフヒ
ドリルの排除は、酵素不活性化率を低減するであろう。

【００１６】スルフヒドリル基は、多くの試薬類を用い
て非反応性にできる。下記本発明の具体例には、遮断さ
れたスルフヒドリル基を有するＢＳＡの市販製剤を用い
た。スルフヒドリル基を遮断するのに有用な試薬として
は、ヨードアセテート、Ｎ−エチルマレイミド、５，
５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）
（Ellman試薬）、ｐ−マーキュリベンゾエート（ｐ−ｍ
ｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏａｔｅ）、２−メルカプトエタ
ノール、シスチン、還元グルタチオン及びチオグリコレ
ートが挙げられる。これらの試薬の使用方法は、「The
Tools of Biochemistry 」、Terrence A. Cooper、(197
7)及び「Means and Teeney」タンパク質の化学修飾、Ho
lden and Day, Inc., (1977), に記載されているが、し
かしタンパク質溶液中のスルフヒドリル基が還元型状態
に維持されそして酵素上の遊離スルフヒドリル基と相互
作用しない限り、いずれかの方法が有用であるだろう。
いずれか過剰の遮断試薬（すなわち、スルフヒドリル基
を遮断しない遮断試薬）を酵素と反応しないように除去
することが重要である。

【００１７】非反応性タンパク質の多様な製剤（スルフ
ヒドリル基を遮断することを意味する）は、商業的に入
手可能である。本発明の組成物は、非反応性にされたス
ルフヒドリル基を有するタンパク質基質で製造される。
このようなタンパク質は、動物の血清及び血清アルブミ
ン、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）より選ばれ
る。市販されている各種の製剤が存在し、そしてこれら
が精製され、分析され、そして製造業者らにより詳細に
記載されているように、より限定され、より一貫した材
料であるため、ＢＳＡが好ましい。このような材料を用
いる場合、結果は、再現可能である。

【００１８】本発明の組成物に関して、発明者らは、研
究室で処理し、そして未修飾品種(grade) より十分に少
ない遊離スルフヒドリル基を有することが確認された、
スルフヒドリル修飾品種のＢＳＡ(Miles, Inc.) を用い
た。

【００１９】本発明の酵素組成物は、４℃〜２５℃で液
状で貯蔵できるのみならず、２５℃までのいずれかの温
度で凍結乾燥した状態で貯蔵できる。従来技術の方法を
用いて、凍結乾燥状態から再構成された組成物は、冷蔵
温度でほんの数時間しか安定性を維持できない。思いが
けないことに、本発明方法に従って調製された酵素組成
物は、室温で７日間まで、そして冷蔵した場合には１４
日間安定性を保持する。スルフヒドリル修飾タンパク質
溶液で調製されなかった別の組成物は、確実に酵素活性
が低減し始め、それらのほとんどが、室温で直ちに消失
する。

【００２０】この発明は、非安定性酵素溶液が前述のよ
うであることを必要とせず、そして新たな調製方法で置
き換えられることを必要としていないので、この発明
は、酵素アッセイの再現性及び正確さを改良し、そして
このようなアッセイを遂行する経費を低減する。

【００２１】

【実施例】材料： ＣＫ−ＭＢは、Scripps 、カタログ＃Ｃ１２２３、San
Diego 、ＣＡ ９２１３１より得た。Scripps 由来のＣ
Ｋ−ＭＢを、５０％グリセロール、５ミリモル コハク
酸塩、１０ミリモル 塩化ナトリウム、２ミリモル Ｂ
−メルカプトエタノール、１ミリモル ＥＤＴＡ中、約
pＨ７．０で安定化した。調製物を−２０℃で貯蔵しそ
して貯蔵期間中光から保護することをすすめる。

【００２２】本明細書に記載される実施例のタンパク質
溶液は、Miles. Inc., Kankakee, Il 60901 市販のスル
フヒドリル修飾ＢＳＡを含んで成る。Miles の製品カタ
ログは、スルフヒドリル修飾品種のＢＳＡにおける遊離
スルフヒドリル修飾ＢＳＡがＬ−シスチンで遮断されて
いることを提示し、そして発明者らの研究室で行われた
試験は、このＢＳＡ品種が遊離スルフヒドリルをほとん
ど有さないもしくは全く有さないことを確認した。

【００２３】酢酸マグネシウム、１，４−ピペラジンビ
ス（エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液
及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、すべて市
販品である。総ＣＫもしくはＣＫのＣＫ−ＭＢサブユニ
ットをアッセイするための乾式分析要素を、イーストマ
ン・コダック・カンパニー、臨床製品部門、ロチェスタ
ー、ＮＹ １４６５０より入手した。また、５，５′−
ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）をコダ
ックから入手した。

【００２４】例１スルフヒドリル修飾非反応性ＢＳＡを用いたＣＫ−ＭＢ
の組成物 本発明の組成物を製造するために、まずタンパク質溶液
を調製した。タンパク質溶液は、選択された酵素を除い
て、組成物のすべての成分から成る。貯蔵溶液の容量
は、必要とされる最終容量より約１０％多い量で製造す
べきである。過剰のタンパク質溶液は、必要とされる酵
素濃度に最終組成物を調整するために使用する。

【００２５】１，４−ピペラジンビス（エタンスルホン
酸）（ＰＩＰＥＳ緩衝液）（２５ミリモル、シグマ Ｐ
−６７５７、ＭＷ＝３０２．４）７．５６ｇ；酢酸マグ
ネシウム（３ミリモル、ＭＷ＝２１４．４６）０．６４
３４ｇ；ＥＤＴＡ（１ミリモル、ＭＷ＝３７２．２３）
０．３７２２ｇ；及びウシ血清アルブミン（Miles のス
ルフヒドリル修飾品種）３０ｇを、イオン交換蒸留水
（以下本明細書では、水と称する）５００mLに添加し、
そしてすべての成分が溶解するまで攪拌することによ
り、タンパク質溶液を調製した。水約１００mLを添加
し、そして数分間攪拌し続けた。クロラムフェニコール
（シグマ、Ｃ−０３７８）６０mg；硫酸ゲンタマイシン
（Ｕ．Ｓ．バイオケミカル Corp.、カタログ＃１６０５
１ ＣＡＳ １４０５−４１−０）２５mg；及びメチル
パラベン（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、コダック）
１．５０ｇを添加し、そして混合物を再度すべての成分
が溶解するまで攪拌した。その溶液を、１０Ｎ ＮａＯ
Ｈで pＨ約７．０〜８．５まで調整し、そして２５℃で
一晩冷蔵した。次いで溶液を容量１リットルのフラスコ
に移し、そして容量１リットルまで水を添加した。フラ
スコを反転してタンパク質溶液を混合した。

【００２６】また、組成物の最終 pＨが約７．０〜８．
５であり、そして緩衝剤が組成物の別の成分に悪影響を
及ぼさないことを条件として、別のモル濃度のＰＩＰＥ
Ｓ緩衝液及び別の緩衝剤が有用である。また、別のマグ
ネシウム塩、例えば塩化マグネシウムを用いてもよい。
エチレングリコールビス（Ｂ−アミノエチルエーテル）
（ＥＧＴＡ）もしくは別の金属キレート化剤をＥＤＴＡ
の代わりに用いてもよい。また、非反応性スルフヒドリ
ル基を有するいずれか適当なタンパク質を用いてもよ
い。また、微生物の成長に対してタンパク質溶液を保護
するために、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン及
びメチルパラベンの代わりに、別の抗生物質類もしくは
微生物成長の阻害剤類を用いてもよい。

【００２７】組成物中、１〜５００Ｕ／Ｌの間のＣＫ−
ＭＢ活性を提供するのに十分なＣＫ−ＭＢをタンパク質
溶液に添加することにより、最終組成物を製造した。組
成物中の総タンパク質は約０．３〜約１０．０ｇ／dLで
あるが、好ましくは約０．７〜約５．０ｇ／dLである。

【００２８】更なる試験のために、上記組成物（スルフ
ヒドリル修飾ＢＳＡ３ｇ／dL含有、pＨ７．５）を２つ
に分け、下記更なる実験のために、１つ半量を冷蔵し、
残りの半量を室温で保存した。

【００２９】Ａ．冷蔵庫の温度で貯蔵されたＣＫ−ＭＢ
の組成物 冷蔵（４℃）した例１の上記組成物の一部を、サンプル
Ａと表示し、そしてＣＫ−ＭＢ活性について１００時間
に亘ってアッセイした。サンプルＡ１０μＬを、ＣＫ−
ＭＢアッセイ用コダック・エクタケム(Ektachem)（商
標）分析要素上にスポットした。ＣＫ−ＭＢ活性をエク
タケム（商標）自動分析器で測定した。結果を図１に示
す。

【００３０】Ｂ．室温で貯蔵したＣＫ−ＭＢの組成物 安定性試験を行う場合に当該技術分野で慣例であるよう
に、別に取っておいた例１記載の組成物の一部（サンプ
ルＢと表示）は、熱的なストレスを受けるまで室温で貯
蔵した。サンプルＤは、 pＨ７．０、反応性ヒト血清
５．３ｇ／dLのタンパク質溶液で調製された従来技術由
来のＣＫ組成物を表し、そしてそれは、還元剤、Ｂ−チ
オ−Ｄ−グルコース（３ミリモル）、ヒト心臓由来のＣ
Ｋ−ＭＢ及びヒト血清中に認められるＣＫ−ＭＭを含
む。サンプルＢ及びＤを、サンプルＡと同様の方法でＣ
Ｋ−ＭＢ活性についてアッセイした。

【００３１】また、図１に示される結果は、本発明の組
成物が冷蔵されていようと、冷蔵されていなかろうと、
約９６時間までＣＫ−ＭＢ活性を保持することを具体的
に示している。約９６時間冷蔵していない状態を維持さ
せた後でさえ、冷蔵していないサンプルは十分なＣＫ−
ＭＢ活性を示す。サンプルＤ中の酵素活性は、０時間
（開始時間）から確実に減少した。

【００３２】Ｃ．非反応性ＢＳＡの増加に伴うＣＫ−ＭＢ安定性 ＣＫ−ＭＢ組成物を、スルフヒドリル修飾ＢＳＡの濃度
を増加させて例１のように調製した。また、タンパク質
を含まない対照を調製した。コダック・エクタケム(Ekt
achem)（商標）７００分析器でＣＫ−ＭＢ活性を測定す
る間、組成物を冷蔵したままにした。図２の結果は、タ
ンパク質溶液が、組成物中のＣＫ−ＭＢの活性を安定化
するのに必要とされることを示している。溶液中にタン
パク質が全く存在しない場合には、ＣＫ−ＭＢの活性は
速やかに消失する。非反応性ＢＳＡ３ｇ／dLを用いた調
製物が、最も安定な酵素活性を有することが明らかであ
る。

【００３３】例２ 総ＣＫを用いた組成物 本発明の組成物における総ＣＫ活性の長期間安定性を測
定する研究を行った。総ＣＫは、サブユニットもしくは
イソ酵素、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、及びＣＫ−ＢＢを
含んで成る。

【００３４】この試験では、ＣＫ−ＭＢ活性のアッセイ
用に先に規定された組成物、サンプルＢにＣＫ−ＭＭを
添加してサンプルＣを生成した。本試験用のＣＫ−ＭＭ
は、Scripps 、カタログ＃Ｃ１３２４より入手したが、
また別の供給源のＣＫ−ＭＭが有用であろう。コダック
・エクタケム（商標）ＣＫ分析要素を用いてコダック・
エクタケム（商標）自動分析器で測定したサンプルＣの
初期のＣＫ活性は、１００Ｕ／Ｌであり、約２５Ｕ／Ｌ
はＣＫ−ＭＢを表し、そして残りのＣＫ活性はＣＫ−Ｍ
Ｍとして表した。

【００３５】サンプルＤは、 pＨ７．０、反応性ヒト血
清５．３ｇ／dLのタンパク質溶液で調製した従来技術の
ＣＫ組成物を表し、そしてそれは、還元剤、Ｂ−チオ−
Ｄ−グルコース（３ミリモル）、ヒト心臓由来のＣＫ−
ＭＢ、及びヒト血清中に認められるＣＫ−ＭＭを含む。
両サンプルＣ及びＤを、熱的ストレスを受けるまで室温
で貯蔵し、そして７日間に亘ってＣＫ活性安定性につい
て試験した。試験期間の継続時間が異なることを除い
て、この試験を例１のように行った。

【００３６】図３に、本発明の組成物（サンプルＣ）及
び従来技術の組成物（サンプルＤ）の総ＣＫ活性の安定
性を示す。図３のグラフは、本発明のＣＫ組成物が７日
後にＣＫ活性消失をわずかしか示さず、同時に、従来技
術の組成物が非常に早い日時から確実に低減されること
を示している。これらの結果は、本発明方法が、総ＣＫ
と同様にＣＫ−ＭＢに適応できることを具体的に示して
いる。

【００３７】

【発明の効果】還元型状態でスルフヒドリル基を有する
酵素は、非反応性スルフヒドリル基を有するタンパク質
中で安定化される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の２つの組成物（一方は冷蔵し
たものであり、もう一方は、室温で保存したものであ
る）についての経過時間に対応するＣＫ−ＭＢ活性を示
すグラフである。

【図２】図２は、多様な濃度のスルフヒドリル修飾ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む各種の組成物について
の経過時間に対応するＣＫ−ＭＢ活性を示すグラフであ
る。

【図３】図３は、本発明の組成物及び従来技術の組成物
についての総ＣＫの安定性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/96 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非反応性スルフヒドリル基を有するタン
   パク質中に、還元型状態でスルフヒドリル基を有する酵
   素を含んで成る組成物。
2. 【請求項２】 （ａ）非反応性であるスルフヒドリル基
   を有するタンパク質及び（ｂ）クレアチンキナーゼ、を
   含んで成る組成物。
3. 【請求項３】 請求項１もしくは２の組成物の１つが較
   正用組成物として使用される、酵素活性を検出するため
   のデバイスを較正する方法。
4. 【請求項４】 （ａ）非反応性であるスルフヒドリル基
   を有するタンパク質の水溶液を調製する段階、及び
   （ｂ）還元型状態でスルフヒドリル基を有する酵素を前
   記水溶液に添加する段階、を含んで成る前記酵素の活性
   を安定化させる方法。
5. 【請求項５】 （ａ）非反応性であるスルフヒドリル基
   を有するタンパク質の水溶液を調製する段階、及び
   （ｂ）クレアチンキナーゼを溶液に添加する段階、を含
   んで成るクレアチンキナーゼの活性を安定化させる方
   法。