JPS58162294A - 固定化複合酵素組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化複合酵素組成物に関するものであり、さ
らに詳しくは酵素電極用固定化複合酵素膜と安定化剤を
含む緩衝液に関するものである。

周知の如く、酵素は基質特異性が高く、温和な反応条件
で反応を行なわしめることができるという長所を有する
反面）熱や酸化により変性を受は易い不安定な物質であ
る０そのため１はとんどの酵素または酵素を含む試薬は
その酵素に適した安定化剤や活性化剤を用いて安定化さ
れている。例えばエチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴ
Ａと略す）、牛血清アルブミン、グリシン、メルカプト
エタノール、ジチオスライトール、還元型グルタチオン
、グリセロール、カテコールアミン、ＮＡＤＨ，カルシ
ウムイオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ア
ンモニウムイオン、鉛イオン、ノニオン系活性剤等が安
定化剤または活性剤として用いられている。

しかし１異なる酵素特性を有する酵素２種以上を同時に
同じ反応系で用いるとき、これらの酵素を同時に安定化
することは難しい◇例えは活性点に金属を必要とする酵
素と金属イオンで阻害を受ける酵素を同時に安定化する
ことは齢しい。また活性点にスルフヒドリル基を有する
酵素を安定化するためには酵素の酸化による失活を防護
する目的で、メルカプトエタノール、ジチオスライトー
ル、還元型グルタチオン等の酵素と同じスルフヒドリル
基を有する化合物が一般によく用いられている。

ところが１これらの安定化剤は化合物そのものが不安定
で長時間にわたる効果が期待できないばかりか、過酸化
水素を検知物質として利用する酵素比色法あるいは酵素
電極法では、これらの還元性物質と過酸化水素が反応し
て測定を妨害したり電極表面で酸化されて電極を汚染し
て感度を低下させるという大きな欠点がある０また固定
化技術によって酵素を安定化させることができるが、一
層安定に為そして耐久性を付与するために１固定化酵素
に対しても安定化剤や活性化剤を用いることが要求され
ている０ 本発明者等は異なる酵素特性を有する酵素２種以上を固
定化してなる固定化複合酵素を長期間安定に保持する目
的で種々鋭意検討したところ、安定化剤として金属キレ
ート剤および還元剤を含む緩衝液を使用することを見出
し、本発明に到達した。

すなわち本発明は金属キレート剤および還元剤を含む緩
衝液と固定化複合酵素からなる固定化複合酵素組成物で
ある。

本発明では金属キレート剤および還元剤を含む緩衝液を
使用することにより、２種以上の酵素を固定化してなる
固定化複合酵素、特に酵素電極用固定化酵素膜を安定に
長期間保持できる０また為複合酵素としてクレアチニン
アミドヒドロラーゼ、タレアチンアミジノヒドロラーゼ
およびザルコシンオキシダーゼの３種の酵素を使用する
例、タレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシン
オキシダーゼの２種の酵素を使用する例において、その
効果は大きく、クレアチニンおよびクレアチンを精度よ
く、簡便に、しかも長期間安定に測定を行なうことがで
きる。

本発明の安定化剤は電極反応を妨害したり１電極を汚染
しない特徴を有する。

本発明に用いる金属キレート剤としては１例えばマンガ
ン、コバルト、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、カルシ
ウム、鉄、バリウム、鉛、カドミウム等のエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の部分塩などがある。

本発明に用いる還元剤としては、例えば亜リン酸、次亜
リン酸あるいはこれらの塩やエステルが挙げられる。具
体的には亜リン酸１亜リン酸ナトリウム、亜リン酸モノ
エチルエステル、亜リン酸ジエチルエステル、次亜リン
酸、次亜リン酸ナトリウム〆等が挙げられる。

金属キレート剤あるいは還元剤は２種以上併用してもよ
い。

本発明に用いる緩衝液は、用いる酵素により、種々異な
るものであるが、例えばリン酸バッファー、アセテート
バッファー、ホウ酸バッファー、トリスバッファー等が
使用できる０ 上記金属キレート剤および還元剤は本発明の固定化複合
酵素と混合してから、緩衝液と混合してもよい。また固
定化複合酵素を有する系に１上記金属キレート剤および
還元剤を含む緩衝液が存在すれば、該系は本発明の固定
化複合酵素組成物に包含される。

金属キレート剤の含有量は緩衝液に対して０．１ｍ１以
上が適当である０好ましくは１〜１ｏｉｙである。０．
１ｍＭより少ないと、酵素の活性化に必要な金属濃度が
不足したり１水銀１銀１銅等の活性を阻害する金属を不
活化させるだけのキレ−５− 還元剤の含有量は緩衝液に対して０．１〜２０１１１Ｍ
（最終濃度）が適当である。好ましくは０．５〜５ｍｌ
である００ｍ　ｌ　ｍ　Ｍより少ないと、酸化による固
定化複合酵素の失活を防止するだけの還元力が不足する
。また２０ｍｙ、を越えると、電極反応を妨害して測定
感度を低下させる場合がある。

本発明の固定化複合酵素とは、担体に固定化してなる２
種以上の酵素を意味する０ 担体としては例えば、セルロースアセテート、ポリスチ
レン、コラーゲン、キトサン１ポリアクリルアミド、多
孔性ガラスピーズなどがある。

その形状としては粉末、溶液、ビーズ）繊維）チューブ
、中空糸、膜あるいは加工成形品などがある。

酵素としては例えばクレアチニンアミドヒドロラーゼ、
タレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオキ
シダーゼからなる３醇素系、タレアチンアミジノヒドロ
ラーゼおよびザルコシンオキシダーゼからなる２酵素系
、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオ
キシダーゼからなる２酵素系α−グルコシダーゼおよび
グルコースオキシダーゼからなる２酵紫系アセチルコエ
ンザイムＡシンセターゼおよびアセチルコエンザイム人
オキシダーゼからなる２酵素系１グリセロキナーゼおよ
びグリセロ−３−リン酸オキシダーゼからなる２酵素系
などがある。

担体に２種以上の酵素を固定化させる方法は特に制限さ
れるものではなく、例えばグルタルアルデヒド等の２官
能性試薬による架橋法、ゼラチンやキトサン等を用いる
包括法あるいはアミノ基やアルデヒド基を有する担体へ
の共有結合法等がある０ 本発明の固定化複合酵素組成物は安定剤として金属キレ
ート剤および還元剤を使用することにより、２種以上の
酵素を固定化してなる固定化複合酵素の酵素活性を大幅
に失することなく、長期間安定に保持することが可能で
ある。本発明の固定化複合酵素組成物を使用して、体液
中の種々の成分）クレアチニン為クレアチン、コレステ
ロール、マルトース、α−アミラーゼ〜不飽和脂肪酸１
中性脂肪等を正確に精度よく、長期間にわたって測定す
ることができる。

フ ジノヒドロラーゼ（以下０工と略記する）およびザルコ
シンオキシダーゼ（以下ＳＯと略記する）あるいは０工
およびＳＯを用いて、クレアチニンあるいはクレアチン
を測定する場合について詳述する。

ＯＮ、ＯＩおよびＳＯの各酵素は下記反応を触媒する。

クレアチニン十Ｈｌトーーークレアチン一 クレアチン十Ｈ，Ｏ−−ラザルコシン＋尿素ザルコシン
＋Ｏ，＋Ｈ，０２−−ラＨ２Ｏ２＋グリシン＋ホ會ムア
ルデビドＯＮ、ＯＩおよびＳＯの三酵素を固定化してな
る系では過酸化水素を検知物質として比色法あるいは電
極法によって測定し１試料中のクレアチニンとクレアチ
ンの総置を測定できる。

Ｃ工およびＳＯの二酵素を固定化してなる系では、過酸
化水素を検知物質として比色法あるいは電極法によって
測定し、試料中のクレアチン量を測定できる。

クレアチニンの量はＯＮ、ＯＩおよびＳｏ、１％にて測
定したクレアチニンとクレアチンの総量から、ＯＩおよ
びＳＯ系にて測定したクレアチンの量を差し引くことに
より求める。

上記酵素を担体固定化した固定化複合酵素の具体的形状
は例えば粉末状、溶液状、ビーズ状、センイ状、チュー
ブ状、中空糸状１膜状もしくはこれらを加工成形した成
形品等がある。比色法ではビーズ状固定化複合酵素をカ
ラムに充填したものあるいはチューブ状固定化複合酵素
を使用することが好都合であり、酵素電極法ではこの他
に、膜状固定化複合酵素を電極と一体化して用いること
が好都合である。

測定システムの一例を図面でもって示す。

第１図は固定化複合酵素を用いた酵素比色法によるクレ
アチニン）クレアチン測定のフローダイヤグラムである
。図中・１は安定剤を含む緩衝液、２は試料、３は呈色
試薬１ｓｔは呈色試薬１．５は四方パルプ、６は固定化
複合酵素１．７は固定化複合酵素ｆｔ　　ｓはミキシン
グコイルを示す。

第２図は酵素電極法の７０−ダイヤグラムである。図中
、１は安定剤を含む緩衝液、２は試料、３は三方バルブ
、４．５は過酸化水素電極、６は固定化複合酵素Ｉ’ｓ
　’ｙは固定化複合酵素１．８はアンプ、９は演算シス
テムを示す。

第１図および第２図において、固定化複合酵素Ｉの系で
はクレアチニンとクレアチンの総量を、そして固定化複
合酵素Ｉの系ではクレアチンの量を吸光度または電流値
として連続的に検知し、演算により試料中のクレアチニ
ン値とクレアチン値とを同時に測定することができる。

１１１定システムはフローシステムに限定されるもので
はなく、特に全面サンプルを用いる時はセミフローシス
テム、ディスクリートシステム、バッチシステム等が好
都合な場合もある。

本発明の固定化複合酵素組成物を使用する臨床分析では
、少量のサンプルで血液、尿、その他の体液中に含まれ
る微量のクレアチニン、クレアチンを同時に短時間で精
度よく長期間安定に耐久性よく、経済的に測定すること
が可能となった。次に実施例によって本発明をさらに詳
しく説明するが、本発明は、これらによって何んら限定
されるものではない。

実施例１ 平均膜厚５．３μ篇の非対称構造をもつアセチルセルロ
ース膜の多孔質側を上にして為ガラス板で水平に保持し
た。ＯＮ（東洋紡績族）１０００単位、ＣＩ（東洋紡績
族）１０５単位、ＳＩ（盛進製薬製）３８単位および牛
血清アルブミだ。この酵素溶液をアセチルセルロース膜
の多孔質側の１５−に流延した。４℃で６０分間、ゲル
化させた後、１Ｍグリシンを含む５０ｍＭリン酸カリウ
ムバッファーに室温で１６時間浸漬した。多孔層側に多
孔性ポリカーボネート膜をラミネートして４℃で風乾し
た。ＯＮ活性０．６０単位／ｃＪ！、０工活性０．０９
単位／ｃｗｔ、Ｓ。

活性０．０１５単位／Ｃｌ１１を有する固定化複合酵素
膜■を得た。全く同様にして、ＣＩ、ＳＯの２種類の酵
素を用いて、０工活性０．１２単位／ｄ・ＳＯ活性０．
０１９単位／ｃ＋＋Ｉを有する固定化複合酵素膜ｌを得
た。

２種類の固定化複合酵素膜ｌおよびＩを各々クラーク型
過酸化水素電極と組合せて酵素電極を構成した０　５　
ｍ　Ｍ　ＦｉＤＴＡ　ａ２ＮＢ＋＋Ｍｇ、　ｌ　ｍ　Ｍ
次亜リン酸ナトリウム、および０．２１１１Ｍアジ化ナ
トリウムを含む５０ｍ１Ｊリン酸カリウムバツフアーを
用いて、３２℃、ｐＨ７，５の条件でディスクリート方
式により為市販管理血清バリデートおよびバリデートＡ
中のクレアチニンおよびクレアチン値の測定に供した。

セル容量は０．５−そして検体量は２５μｅであった０
検体をマイクロシリンジで注入し、固定化複合酵素の一
連の反応でクレアチニンまたはクレアチンから生成する
過酸化水素の酸化電流を検知して、クレアチニンおよび
クレアチン値を計算して求めた。結果を第１表に示す。

同じ測定系において、固定化複合酵素膜ｌを用いて、繰
返し測定に対する各々の酵素活性の耐久性を調べた結果
を第３図に示す０１１日間にわたり５００検体の血清中
の総クレアチニン測定後も固定化複合酵素は安定でＯＮ
、０工およびＳＯの相対活性は初期活性の各々８３％、
９１％、１０５％を保持した０ 比較例１ 実施例１と同じ固定化複合酵素膜ＩおよびＩを用いて、
Ｏ，ｇｌ１Ｍアジ化ナトウムとｌ＊ＭＥＤＴＡを含む５
０ｍＭリン酸カリウムバッファを実施例１と全く同じシ
ステムに供した。１日であり、長期間にわたり安定にク
レアチニン、クレアチンを測定することは出来なかった
０

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の固定化複合酵素を用いて酵素比色法に
よって、クレアチニン、クレアチンを測定するフローダ
イヤグラムの一例である。図中１は本発明の緩衝液２は
試料１３は呈色試薬Ｉｓ’は呈色試薬１％６は四方バル
ブ、６は固定化複合酵素１％７は固定化複合酵素ｊｓ８
はミキシングコイルである。 第２図は同じく酵素電極法による場合の７０−ダイヤグ
ラムの一例である。１は本発明の緩衝液１２は試料、３
は三方バルブ、４およびδは過酸化水素電極、６は固定
化複合酵素膜１ｓ’ｙは固定化複合酵素膜Ｉ・８はアン
プＳ９は演算システムである。 第３図は本発明の固定化複合酵素組成物の測定安定性を
示した図である。 特許出願人　　東洋紡績株式会社 　１５− 第１図 ５６７５　　８　８ 第２１！Ｉ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 金属キレート剤および還元剤を含む緩衝液と固定化複合
   酵素からなる固定化複合酵素組成物〇