JP2904633B2 - 肺炎連鎖球菌からの多糖抗原 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ストレプトコッカス・ニューモニア（Stre
ptococcus pneumoniae）（肺炎球菌（Ｐneymococci），
Ｐｎ）として分類されている本病原性細菌は本微生物の
莢膜多糖類（Ｐｎ−Ｐｓ）に基づいて８４種の抗原型に
細別されている。これらの微生物に起因する疾病の状態
は肺炎、骨髄炎、中耳炎、菌結症及び慢性気管支炎の急
激な悪化、静脈洞炎、関節炎、及び血膜炎を含む。しか
し、これらの多数の疾病は８４種の既知の分離菌の限ら
れた部分集団によって起こされるのである。それ故、最
も流行している病原性分離菌のＰｎ−Ｐｓを含む多価ワ
クチンが、この種類の最も頻繁に報告された病原体を極
めて高率で防御することができる。

【０００２】多価ワクチンは成人の肺炎球菌に対する防
御的免疫応答を高めるのに効果があるので製造されてき
ている。例えば “ニューモバックス（PNEUMOVAX）（登
録商標）２３”（肺炎球菌多価ワクチン、エム・エス・
ディ（ＭＳＤ）；ピー・ディ・アール（ＰＤＲ）、１９
９０年版、１４３１頁参照）はその全ての菌がＡＴＣＣ
に寄託され、この発明のための出発物質の一つの可能な
供給源を提供している２３種の肺炎球菌の異なる、非接
合多糖類を各５０μｇ／ｍｌ含む液体組成物である。
“ニューモバックス（商標）２３”は下記の独立し、非
接合多糖類の各々を含む：１、２、３、４、５、６Ｂ、
７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１
４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、
２２Ｆ、２３Ｆ、及び３３Ｆであり、肺炎球菌の分離菌
の約９０％に相当する。しかし、これらのワクチンは肺
炎球菌の感染に最も罹りやすい一部の人々：Ｂ−細胞免
疫無防備状態の人、年配者および免疫防御をＴ−細胞応
答に依存している２才以下の幼児にしか効果がない。非
接合多糖類はＴ−細胞免疫応答の不十分な誘導物質であ
るからＰｎ−ＰｓをＴ−細胞免疫応答を誘導できる免疫
源に変換することがこの攻撃目標である人々に十分な防
御を作成する鍵である。しかし、使用はこの個々の多糖
類集団又は接合形の多糖類に限定されない。例えば、妊
娠前又は妊娠中に１種以上の新規な接合物又は非接合Ｐ
ｎ−Ｐｓを含むワクチンを雌の哺乳動物に投与すると、
そのワクチンが直接胎児又は乳児に投与されたのではな
くても発育期の胎児及び哺乳期の乳児を受動的に防御す
ることができる抗体が母体に発生する。更に、これらの
新規な非接合多糖類の混合物を含む組成物はこの発明の
新規なＰｎ−Ｐｓ製造物の純度が向上したので入手可能
な組成物以上に性質を改良してきた。そして新規な非接
合ワクチンの調剤で有用性を証明すべきである。

【０００３】先に列挙したストレプトコッカス・ニュー
モニアの莢膜多糖類の特に好ましい部分集合は、この肺
炎球菌亜類型の小集団が乳児及び幼児の肺炎球菌感染の
７５−８５％の原因であると評価されているので、亜類
型６Ｂ、２３Ｆ、１９Ｆ、１４、１８Ｃ、４、及び９Ｖ
に由来するものである。しかし、ここに示した方法は肺
炎球菌及びその他の細菌の多糖類の広い収集に適用でき
る。

【０００４】本発明の新規なＰｎ−Ｐｓ製造物は接合免
疫抗原の調製に有用である。多糖類は一般的にそれら自
身の免疫性の低いことが見出だされているが、一旦免疫
原性蛋白質（ＰＲＯ）に接合したものは極めて良好な免
疫抗原であることが示されている〔マールブルグ（Ｍar
burg）〕等、アメリカ合衆国特許Ｎｏ．４,６９５,６２
４；４,８３０,８５２；４,８８２,３１７シュニールソ
ン（Ｓchneerson）等、ニュー・ディベロップメント・
ウイズ・ヒューマン・アンド・ヴェテリナリー・ワクチ
ンズ（Ｎew Ｄev. with Ｈum ＆ Ｖet. Ｖaccines）、７
７−９４頁（１９８０年）；シュニールソン等、ジャー
ナル・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ. Ｅxptl.
Ｍed.）、１５２巻、３６１頁（１９８０年）；アンダ
ーソン（Ａnderson）、インフェクション・アンド・イ
ミュニティ（Ｉnfection and Ｉmmunity）、３９巻、２
３３頁（１９８３年）〕。しかし、このような接合体の
製造における重要な問題は多糖類出発物質の非均一性と
そのために生じる接合製造物の化学的に明確化すること
の困難さである。それ故、製造方法には出発物質が可能
な限り明確化されていること及び合成経路の各段階が製
造中間物として検査可能なことが必要である。ここに開
示する方法は接合に反応する化学的に高度に明確化した
Ｐｎ−Ｐｓ多糖類抗原を供給することによりこの必要性
を充たしている。それ故、Ｐｎ−Ｐｓの由来と同起源の
病原性に対して２才以下の乳児を免疫にするのに有用な
接合体の製造は本発明のＰｎ−Ｐｓ製造物の新規な特徴
によって容易にされる。

【０００５】マールブルグ等、〔ジャーナル・オブ・アメ
リカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ.Ａm. Ｃhem. Ｓo
c.）、１０８巻、５２８２頁（１９８６年）、及びアメ
リカ合衆国特許Ｎｏ．４,６９５,６２４； ４,８３０,
８５２； ４,８８２,３１７〕は二属スペーサーを通し
て多糖類と免疫原性蛋白質を接合させる一つの手段を開
示した。本ＰＲＯは付属の求核及び求電子基を示すよう
に誘導され（ＰＲＯ^*）、これと一対のＰｓは反対の反応
性を持つ付属基を示すように機能化された（Ｐｓ^*）。
Ｐｓ^*をＰＲＯ^*と結合させることによりＰｓをＰＲＯに
共有結合させる（Ｐｓ−ＰＲＯ）二属スペーサーが形成
された。酸加水分解により本二属スペーサーはアミノ酸
分析により定量される異常なアミノ酸として放出され、
それにより共有結合を証明する手段を提供する。

【０００６】本発明はアメリカ合衆国特許Ｎｏ．４,６
９５,６２４；４,８３０,８５２及び４,８８２,３１７
で開示されたもの以上に改良したものである。改良点は
粗製のＰｎ−Ｐｓ調製物により供給されるものよりは特
異的で、再現性があり、取扱いが容易な物性を持ち、増
加された溶解性、増加された濾過性、増加された純度
（集団特異性Ｃ−多糖類（Ｃ−ＰＳ）による汚染の減
少）及び減少された分子量、多分散性及び粘性を含むＰ
ｎ−Ｐｓ出発物質の調製を含んでいる。新規Ｐｎ−Ｐｓ
の接合は最終製品の調製の一貫性と容易さの増加、改良
された抗原性、及び改良された純度の点で特許Ｎｏ．
４,６９５,６２４の方法によって示されたもの以上に改
良されている。特に従来技術の粗製Ｐｎ−Ｐｓ調製物に
比較して、本発明のＰｎ−Ｐｓにおいては集団特異性Ｃ
−多糖類（ＣＰｓ）及びペプチドグリカンの汚染が３−
２０倍も減少していることが重要である。Ｃ−多糖類汚
染物質の存在は型特異性抗原に対して免疫応答を干渉す
るものではないが、抗Ｃ−多糖類抗体の生産が或る種の
未解決な肺炎球菌感染に見られる組織破壊と相関するか
もしれない。

【０００７】本発明の目的である多糖類もアメリカ合衆
国特許Ｎｏ.４,６９５,６２４；４,８３０,８５２；
４,８８２,３１７に開示されている以外の方法で共有接
合ワクチンを調製する実用性をもっていることが技術分
野で理解されることは明白である。

【０００８】新規な肺炎球菌多糖類（Ｐｎ−Ｐｓ）化合
物は約１×１０⁵ から１×１０⁶ の分子量で多分散性が
１．０から１．４でありＣ−多糖類汚染レベルが型特異
性多糖類の３％以下で、肺炎球菌型特異性抗体結合は粗
製多糖類の型特異性調製物に比較してＰｎ−Ｐｓ単位量
当り約７０％から１１０％を有している。

【０００９】化学的に高度に明確化されたＰｎ−Ｐｓ製
造物はＰｎ−Ｐｓの粗製調製物をＰｎ−Ｐｓの抗原完全
性を維持するために前もって測定した終末点まで部分的
に加水分解することにより調製する。部分的に加水分解
したＰｎ−Ｐｓをつぎに精製し多分散性を低下させる。
新規なＰｎ−Ｐｓは精製したＰｎ−Ｐｓの多価結合混合
物及びＰｎ−Ｐｓ−免疫原性蛋白質（ＰＲＯ）接合体
（Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ）の調製に有用である。新規のＰ
ｎ−Ｐｓ化合物はＰｎ−Ｐｓ由来の肺炎球菌亜類型によ
る感染に対して防御する免疫応答を顕在化させる。

【００１０】一般的肺炎球菌分離物から得られた部分的
に加水分解し、高度に精製したＰｎ−Ｐｓ中間物は哺乳
類における肺炎球菌感染の防御に有用である。このＴ−
細胞依存接合体は哺乳類、特にＢ−細胞免疫無防備状態
の人、年配者、及び２才以下のヒト乳児の抗肺炎球菌免
疫応答を刺激するワクチン組成物で特に有用である。ナ
イセリア・メニンギチディズｂ（Ｎeisseia meningitid
is b）からの外膜蛋白質複合物（ＯＭＰＣ）に結合した
本発明の新規なＰｎ−Ｐｓを含む接合体は次の段階を含
む方法により製造される：即ち、ストレプトコッカス・
ニューモニア（肺炎球菌、Ｐｎ）の培養物から莢膜Ｐｎ
−Ｐｓを分離し、熱、音波による破壊、化学物質又は酵
素による処理、又は物理的に本Ｐｎ−Ｐｓを剪断するこ
とにより部分的に加水分解し、Ｐｎ−Ｐｓを分画して、
本Ｐｎ−ＰｓをＯＭＰＣ又はその他の担体蛋白質又は蛋
白質複合物に共有的に接合させる。

【００１１】本発明の目的は、Ｐｎ−Ｐｓ及び免疫原性
蛋白質のＴ−細胞依存接合物の調製における中間物とし
て有用な新規な部分的に加水分解され高度に精製された
抗原性的に型特異性の肺炎球菌莢膜多糖類（Ｐｎ−Ｐ
ｓ）を提供することである。もう一つの目的は本発明の
新規なＰｎ−Ｐｓ化合物を製造する方法を提供すること
である。もう一つの目的は本新規なＰｎ−Ｐｓ化合物を
使用する方法を提供することである。これらの方法は次
のものを含む：抗肺炎球菌免疫応答の誘発に有用な免疫
原性接合物又は遊離多糖類組成物への組み込み；肺炎球
菌感染に対して受動的に乳児及び胎児を防御する母体免
疫応答の誘発。

【００１２】 Ａ．新規なＰｎ−Ｐｓ多糖類 新規な、部分的に加水分解し、高度に精製した肺炎球菌
莢膜多糖類（Ｐｎ−Ｐｓ）は異なる亜類種のストレプト
コッカス・ニューモニアの培養物に由来する抗原性多糖
類の調製物である。本Ｐｎ−Ｐｓはそれが由来する特別
な肺炎球菌亜類種に依存するが約１×１０⁵ から１×１
０⁶ の平均分子量を持つ。一般的に本新規化合物の分子
量は出発物質として使用される組成Ｐｎ−Ｐｓ調製物と
比較して要因により２−１０倍減少し、多分散性は約５
０％減少する。更に、本新規Ｐｎ−Ｐｓ調製物は約１．
０から１．４の分子サイズ・多分散性を持ち、Ｃ−多糖
類汚染レベルは約３％より下であり、抗原性指数は約
０．４から１．１である。この最後の数字は物理的又は
化学的分析によって検出されたＰｎ−Ｐｓ量と比較した
比濁率分析によって検出されたＰｎ−Ｐｓ抗原量として
計算される。粗製Ｐｎ−Ｐｓは１．０という値が与えら
れている（ＡＴＣＣでの寄託物による）。比濁率分析に
は抗体による抗原の識別及び大部分が沈殿する抗原−抗
体複合物の形成の２つを含む。それ故、“抗原性指数”
０として登録されるべき沈殿形成に依存しない、抗体に
よる抗原の識別（例えば、抗体結合）を行うことが理論
的には可能である。しかし、本発明の新規Ｐｎ−Ｐｓは
抗原性指数が上記の範囲にある方法で調製する。これは
本発明により製造されるがこの範囲よりも低い抗原性を
持つＰｎ−Ｐｓが有用ではないと言うのではない。平易
に言えば０．７よりも低い抗原性指数を持つＰｎ−Ｐｓ
が有用な抗−Ｐｎ−Ｐｓ免疫応答を減少させるのに十分
な免疫原性を保持しているかどうかはまだ知られていな
いということである。更に、新規なＰｎ−Ｐｓは抗肺炎
球菌免疫応答の発生に有用なＰｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ接合体
を生産するために免疫原性蛋白質との接合に従い、遊離
の、Ｔ−細胞独立の多糖類エピトープに対して十分に免
疫応答を増加できない、ヒトを含む乳児哺乳類にとって
特に重要である。数種の新規なＰｎ−Ｐｓ調製物の幾つ
かの物理的及び化学的特徴を下記の表Ｉと表ＩＩに示し
たが、付随する記述はそれらの特徴の測定方法を示して
いる。下記に開示した方法は本発明のＰｎ−Ｐｓ化合物
を製造するための一つの方法である。同様に、哺乳類の
抗肺炎球菌免疫応答を高めるのに有用なＰｎ−Ｐｓ−Ｐ
ＲＯ接合物の調製にこの化合物を使用する一つの方法も
ここに開示している。

【００１３】１、新規な肺炎球菌多糖類（Ｐｎ−Ｐｓ）の特徴記述 部分的に加水分解した、精製したＰｎ−Ｐｓの物理的及
び化学的特徴には粗製の細菌培養物由来多糖類と比較し
て分子サイズが２−１０倍減少していることが含まれ
る。この減少サイズは非接合Ｐｓの接合時及び接合後の
除去時に多糖類の取扱いを改良し、型特異性Ｐｎ−Ｐｓ
の精製度を高め、Ｐｎ−Ｐｓ分子サイズの多分散性を低
め、抗原性を本質的に不変にする。これらの新規なＰｎ
−Ｐｓの特徴は化学的に高度に明確化され、型特異性の
高い抗原性Ｐｎ−Ｐｓ−ＰＲＯ接合体の首尾一貫した形
成に役立たせるように使用する。

【００１４】 ｉ． Ｐｎ−Ｐｓ分子量及び多分散性 Ｐｎ−Ｐｓ調製物の多分散性は重量平均分子量、Ｍ_W、
の測定により、拡散、沈降分離又はクロマトグラフ処理
及び数平均分子量、Ｍ_N、により、粘度、氷点降下又は
沸点上昇のような束一的特性により比率Ｍ_W／Ｍ_Nとして
得られる。この数値が一定のものに近づけば近づくほど
多糖類調製物はより均一となる。幾つかのＰｎ−Ｐｓ調
製物の多分散性をここに示し、この均一性増加を達成す
るための好ましい方法も開示するものである。粗製の又
は部分的に加水分解したＰｎ−Ｐｓ分割係数

【化１】 は技術分野での既知の方法により、多糖類の一部分のサ
イズ・エクスクリュージョン（分子ふるい）・クロマト
グラフィ（ＳＥＣ）又は高性能サイズ・エクスクリュー
ジョン・クロマトグラフィ（ＨＰＳＥＣ）によって測定
する。よって得られるＫｄは多糖類調製物の平均流体力
学量の基準である。Ｐｎ−Ｐｓの分子サイズは開示した
方法に従って物理的剪断により又は熱的、音波的又は化
学的加水分解により減少するのでＰｎ−Ｐｓの溶出量、
Ｖｅは増加し、Ｋｄも増加する。

【００１５】好ましい方法では、この目的のためのカラ
ム・マトリックスはセファロースＣＬ２Ｂゲル（ファル
マシアＮｏ．１７−０１２０である。カラムの容量（Ｖ
ｏ）はブルー・デキストラン２０００（ファルマシアＮ
ｏ．１７−０３６０−０１）を使用して測定し、総浸透
量（Ｖi）は塩化ナトリウムのピーク量から測定する。
或る方法によりＰｎ−Ｐｓサンプルを２．５ｍｇ／ｍｌ
蒸留水で調製し１ｍｌの注入量を使用する。比率Ｖｏ／
Ｖｉは０．３２−０．３７の範囲になるべきである。デ
キストランＴ５００（ファルマシアＮｏ．１７−０３２
０−０１）に対するＫｄは０．３７−０．４９の間であ
る。好ましいＨＰＳＥＣシステムは、５０℃に加熱した
７．５×６００ｍｍＴＳＫ Ｇ６０００ ＰＷカラムを
含む。

【００１６】極めて好ましい方法では、ＳＥＣ又はＨＰ
ＳＥＣは溶出量測定機能として分析物の比較濃度を監視
する示差屈折計及び溶出量の測定機能として分析物の比
粘度を監視する示差粘度計と連動する。普遍的なキャリ
ブレイション・カーブ〔log（固有粘度は分子量を指定
する）対滞留量〕は一連の単分散の酸化ポリエチレン標
準物の分析により作成する。濃度と比粘度のプロフィル
はサンプルの分子量対溶出量プロフィルの計算に使用で
きるし、順番にＭ_N及びＭ_Wの計算に使用し、それにより
多分酸性指数（Ｍ_W／Ｍ_N）を計算する〔ヨー，ダブリュ
（Yau, W.W.）〕及びレメンター、エス、ダブリュ（Rem
enter,S.W.） ジャーナル・オブ・リキッド・クロマト
グラフィ（Ｊ. Ｌiq. Ｃhromatog）、１３巻、６２７−
６７５頁（１９９０年）；ナジ（Ｎａｇｙ）、ジャーナ
ル・オブ・リキッド・クロマトグラフィ 、 １３巻、６７
７−６９１頁（１９９０年）；ベノイト（Ｂｅｎｏｉ
ｔ）等、ジャーナル・オブ・ケミカル・アンド・フィジ
カル・トウム（Ｊ. Ｃｈ.Ｐhys.Ｔｏｍｅ.,６３，１５
０７−１５１４（１９６６）〕 本発明において固有粘
度は０．１Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．２で測定した。
一旦、Ｐｎ−Ｐｓ調製物の平均分子量が決まれば、分子
当りの繰り返し単位量の平均数値は、ポリマーの分子量
を繰り返し単位量の分子量で割ることにより容易に測定
される（表ＩＩ参照）。

【００１７】 ii. Ｐｎ−Ｐｓ型特異抗原性の保持 物理的剪断又は化学的、熱的、音波処理又は酵素加水分
解を行った各粗Ｐｎ−Ｐｓに対して抗原性統一性が消散
し始める終末点を決定することは重要である。この終末
点は粘度を当業界で既知の多くの免疫試験のいずれかと
関係づけることによって決定するのが便利である。好ま
しい方法では多糖溶液の一部をオキタロニー二重免疫拡
散検定により肺炎球菌亜型特異抗体を用いて測定する。
拡散後寒天中白色沈降バンドの出現は多糖の抗原として
の統一性がそのまま保たれているということである。よ
り定量的免疫検定は速度比濁分析によって得られる。

【００１８】速度比濁分析は抗原−抗体複合体の生成中
に散乱する光強度の変化速度を測定する。反応は光線が
通過する反応セル中で行なわれる。本願では特異抗体
（Ａb）が特異抗原（Ａｇ）即ちＰｎ−Ｐｓと反応する
とき溶液中で生じる免疫沈降反応によって複合体が生成
される。Ａｇ−Ａｂ複合体の生成は最適比率のＡｇ及び
Ａｂ分子の存在に依存するために一定量のＡｂに対する
複合体生成の程度は最大レベルまでのＡｇ量まで増加し
それ以上多量のＡｇは複合体生成量が減少する結果とな
る。従って一定レベルのＡｂを維持しＡｇ濃度の増加に
よる光散乱を測定することにより標準曲線が生じる。試
料をその特異Ａｂと標準曲線を展開するために用いた同
様の条件下で反応させる場合Ｐｓ（又は誘導化Ｐｓ）調
製物のＡｇ濃度を計算することが可能である。

【００１９】速度比濁分析により免疫学的に計算した濃
度と化学的又は物理的に得られる濃度（比色分析、屈折
率又は単糖類の全加水分析及び定量による−−以下参
照）との比較はＰｓ試料の抗原性指数を与える。多糖類
の乾燥重量分析は粉末調製物の揮発性含有量が既知の場
合にのみ適当である。多糖類は吸湿性であることが周知
であり、揮発分を５〜３０重量％で含有する可能性があ
る。そのような場合その乾燥重量は特に信頼できない。
かなり正確に多糖濃度を定量するために用いられる１方
法は比色検定でありこの検定は問題の多糖標準液で検定
する。例えばＰｎ６Ｂ−Ｐｓ、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ、Ｐｎ
１９Ｆ−Ｐｓ及びＰｎ２３Ｆ−Ｐｓは全てディシュ（Ｄ
ische）及びシェトルス（Ｓhettles）〔Ｊ. Ｂiol. Ｃh
em. 第１７５巻、５９５〜６０３頁（１９４８年）〕の
メチルペントース検定によって定量することができる。
Ｐｎ４−Ｐｓ、Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ、Ｐｎ１４−Ｐｓ及びＰ
ｎ１９Ｆ−Ｐｓはヘキソスアミン含有量によって定量し
Ｐｎ９Ｖもウロン酸含有量によって定量することができ
る。フェノール − 硫酸検定〔ズーボイス（Ｄubois）
等、Ａnal. Ｃhem. 第２８巻、３５０〜３５６頁（１９
５６年）〕は結合体調製中の工程試験の一部としてこれ
らのＰｎ−Ｐｓ調製物の全てを定量するのに有用であ
る。使用される他の方法は分析物質量の尺度として屈折
率シグナルを用いるものでありこれも問題の多糖標準液
で校正する。比色検定は誘導化及び結合工程中に試料の
多糖含有量を監視するために用いられるがこの方法はＨ
ＰＳＥＣ−万能検定分析による多糖調製物の物理的確認
及び抗原性指数の計算に用いられる。出発粗Ｐｎ−Ｐｓ
は抗原性指数値１．０である。相対抗原性指数は実験用
試料に対して計算され０.４〜１.１、好ましくは０.７〜
１.１が十分であると思われる。多糖が加水分解及び分
画工程中に著しく精製される場合には抗原性指数１．０
以上を得ることが可能である。またサイズ縮小だけで多
糖分子のフレキシビリティを高めて抗原エピトープの立
体障害を減少させることにより調製物の抗原性指数を増
加させることができることは理論上可能である。これら
は加水分解、分画及び誘導化Ｐｎ−Ｐｓ試料の工程チェ
ックとして行なわれる。相対抗原性＜０．４を有する試
料は除去する。即ち結合に用いない。肺炎球菌多糖類を
確認するのに有用である抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体標品は入手可
能である。抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体入手先としてはヘルスリサ
ーチ社アルバニーＮＹ及びステーテンセルンインスチチ
ュートがある。また型特異抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体は免疫源と
して市販の粗Ｐｎ−Ｐｓを用いて当業界で既知の方法に
従ってこの目的に調製することができる〔ベーカー（Ｂ
aker）等、イムノロジー第２０巻、４６９頁（１９７１
年）、ブルック（Ｂrooke）、 Ｍ. Ｓ. Ｊ. Ｉmmunol.
第９５巻、３５８頁（１９６６年）、カーニー（Ｋearn
ey）、Ｒ．及びハラデー（Ｈalladay）、Ｗ．Ｊ．Ａus
t.Ｊ.Ｅxp. Ｂiol.Ｍed. Ｓci. 第４８巻、２２７頁（１
９７０年）、シュニアソン（Ｓchneerson）、Ｒ．等、Ｐ
rog. アレルギー第３３巻、１４４頁（１９８３年）、
ロビンス（Ｒobbins）、Ｊ. Ｂ. Ｉnfect. Ｉmmun. 第
２６巻、１１１６頁（１９７９年）〕。

【００２０】更に抗原性における完全性が保持されてい
ることの指標はＰｎ−Ｐｓ調製物の正しい化学組成が維
持されていることである。例えばＰｎ６Ｂ−Ｐｓは繰り
返し単位〔α−Ｇａｌ（１−３）−α−Ｇｌｕ（１−
３）−α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１−４）−Ｄ−リビトール−
５−ＰＯ₄₍₂₎〕を有するので炭水化物成分リビトール：
ラムノース：ガラクトース：グルコースのモル比は約
１：１：１：１である。この割合は例えば多糖を３６％
フッ化水素酸で４５〜６５℃に於て約２時間次いで２Ｍ
トリフルオロ酢酸で１００℃に於て約１６時間加水分解
し、パルス電流検出による高性能アニオン交換クロマト
グラフィー処理することによって定量することができ
る。従ってほぼ等モル量の炭水化物成分を示す４本のピ
ークは全体性が維持されていることの指標である。実質
的に炭水化物成分の理論比は本発明の新規なＰｎ−Ｐｓ
化合物全てに約２０％以内で維持される。理論値からの
ずれは主として方法技術の限界によるものである。従っ
て全加水分解により

【００２１】Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓはグリセロール：ラムノ
ース：ガラクトース：グルコース＝約１：２：１：１比
を有し、 Ｐｎ１４−ＰｓはＮ−アセチル−グルコサミン：ガラク
トース：グルコース＝約１：２：１比を有し、 Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓはラムノース：マンノサミン：グルコ
ース＝約１：１：１比を有し、 Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓはグルコース：ガラクトース：ラムノ
ース：グリセロール：アセテート＝約３：１：１：１：
１を有し、 Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓはグルコース：ガラクトース：Ｎ−アセ
チル−マンノサミン：グルクロン酸：ガラクチュロン
酸：アセテート＝約２：１：１：１：１：１．７比を有
し、 Ｐｎ４−ＰｓはＮ−アセチル−マンノサミン：Ｎ−アセ
チル−フコサミン：ガラクトサミン：ガラクトース：ピ
ルベート＝約１：１：１：１：１比を有する。更にＰｎ
４−Ｐｓは最近Ｐｎ５−Ｐｓと同様に、ＨＰＬＣ分析で
同定して２−アミノニューモサミン（２−アミノ−２，
６−ジデオキシタロース）であると思われる成分を含有
することが見い出されている〔バーカー（Ｂarker）等、
炭水化物研究（Carbohydrate Res.）２２４〜２３３頁
（１９６６年）〕。Ｐn１９Ｆ−Ｐｓはもう１つ別の成
分恐らくヘキソサミンを有しこれは文献に報告されてお
らず最終的同定はまだ未決定である。これらの及び別の
理論上の多糖繰り返し組成物は次の参考文献Ｊ. Ｅ. Ｇ
バンダム（Ｖan Ｄam）等、Ｃarbohyd. Ｒes. 第１８７
巻、２６７頁（１９８８年）、Ｈ．Ｊ．ジェンニングス
（Ｊennings）、Ａｄｖ.Ｃarbohyd. Ｃhem. 第４１巻、
１５５頁（１９８３年）及びこの中の参考文献Ｊ．Ｃ.
リチャーズ（Ｒichards）及び Ｍ．ペリー（Ｐerry）、
Ｂio Ｃhem. Ｃell.Ｂiol. 第６６巻、７５８頁（１９８
８年）に報告されている。炭水化物成分のほかに問題の
Ｐｎ−Ｐｓのいくつかにはホスフェート、アセテート及
びピルベート側鎖基があり、これらのあるものは免疫優
性基である。これらの成分はそれ自体をモニターするこ
ともできる（実施例３０参照）。単糖類の定量はまた試
料中の全Ｐｎ−Ｐｓ濃度を定量するのにも有用な手段で
ある。

【００２２】更に主題の多糖類の抗原性に必要な要素
は、多糖類において“構造的にエピトープ"と呼ばれて
いるものを保持することである〔例えばウェセルス（Wes
sels）、Ｍ．Ｒ．及びカスパー（Ｋasper）、Ｄ.Ｌ.Ｊ.
Ｅxp. Ｍed. 第１６９巻、２１２１〜２１３１頁（１９
８９年）参照〕。このレベルの抗原性は多糖の高分子量
形でのみ発現されると思われここに記載される方法はこ
の多糖免疫原性レベルの保存にも向けられる。

【００２３】 iii. 最少のＣ多糖混入 もう１つの重要なパラメーターはＣ多糖混入レベルであ
る。この数値は多糖調製物を全酸加水分解し、加水分解
物のクロマトグラフィーを行ってコリンを電導度で検出
することによって示すことができる。また非加水分解多
糖をＮＭＲによってコリンを分析することができる。Ｎ
ＭＲ手法はＣ−Ｐｓ含有量を計算するためにラムノース
メチルシグナルに対するコリンシグナル比（ラムノース
を含有するＰｎ−Ｐｓ用、他のＰｎ−Ｐｓでは異なった
シグナル）を用いる。クロマトグラフィー法では電導度
検定によって定量した多糖含有量又はＰｎ−Ｐｓ成分の
１種に対するコリンシグナル比を用いてＣ−Ｐｓ含有量
を計算する。いずれの方法でも既知濃度のコリン標準品
からＣ−Ｐｓの理論上の繰り返し構造を用い、１度コリ
ン濃度が知られている多糖標品に存在するコリンレベル
を直接計算することができる〔ハーマンス（Ｈermans）
等、Ｒecl. Ｔrav. Ｃhim. Ｐays−Ｂas, 第１０７巻、
６００頁（１９８８年）〕。Ｐｎ−Ｐｓ試料の多糖濃度
は当業界で既知の方法に従って測定される。例えば全多
糖濃度は多糖の全加水分解及び特異単糖濃度の測定によ
って求めることができる。Ｃ−Ｐｓ濃度を全多糖濃度と
比較することによってＣ多糖混入度（ｗ／ｗ）が求めら
れる。全多糖の３％（ｗ／ｗ）以下のＣ多糖レベルなら
ば容認できるが更に好ましいレベルは１％以下である。
２ロットのＰｎ６Ｂ−Ｐｓ及び２ロットのＰｎ２３Ｆ−
Ｐｓの化学的および物理的性質を以下の表Ｉにまとめ
る。これらのデータは本明細書に記載される新規な方法
によって生じるロット間パラメーターの再現性を示す。

【００２４】 表 Ｉ 加水分解して分画したＰｎ−Ｐｓの特徴 Ｐｎ−Ｐｓ調製物 ６Ｂ−１ ６Ｂ−２ ２３Ｆ−１ ２３Ｆ−２ 終末粘度 １.０９４ １.１４７ １.３５０ １.３７６ Ｋｄ（ＨＰＳＥＣ） ０.６２ ０.６２ ０.４９ ０.４９ Ｋｄ（ＣＬ−２Ｂ） ０.６４ ０.６０ ０.４１ Ｎ．Ｄ． 単 糖 Ｓ Ｓ Ｓ Ｓ 抗原性 オキタロニー Ｓ Ｓ Ｓ Ｓ 比 濁 法 Ｓ Ｓ Ｓ Ｓ （フェノール：硫酸） Ｓ Ｓ Ｓ Ｓ ─────────── Ｓ：良好 ─────────── 以下の表IIには数種の粗肺炎球菌多糖類及び本発明の対
応する加水分解して分画した（Hyd+frac）化合物の化学
的及び物理的パラメーターを示す。表わされる数字は実
験誤差と調製される複合多糖化合物の検出限界内の近似
値である。

【００２５】 表 II 粗及び新規な加水分解＋分画Ｐｎ−Ｐｓ化合物の物理的及び化学的特性 Ｐｎ−Ｐｓ ピーク 固有粘度 重量平均 亜 型 Kd 分子量（Ｍ _W ） 4-crude : 0.55 ± 0.05 4.34 ± 10％ 4.2 × 10⁵ ±20％ 4-hyd+frac : 0.69 ± 0.05 1.0 - 3.0 1 × 10⁵ -5 × 10⁵ 6B-crude : 0.40 ± 0.05 2.67 ± 10％ 1.4 × 10⁶ ±20％ 6B-hyd+frac : 0.60 ± 0.05 1.0 - 2.0 3 × 10⁵ -7 × 10⁵ 9V-crude : 0.53 ± 0.05 2.29 ± 10％ 1.1 × 10⁶ ±20％ 9V-hyd+frac : 0.65 ± 0.05 1.0 - 2.0 3 × 10⁵ -7 × 10⁵ 14-crude : 0.50 ± 0.05 1.69 ± 10％ 1.1 × 10⁶ ±20％ 14-hyd+frac : 0.60 ± 0.05 0.6 - 1.6 4 × 10⁵ -1 × 10⁵ 18C-crude : 0.50 ± 0.05 5.20 ± 10％ 8.7 × 10⁵ ±20％ 18C-hyd+frac : 0.65 ± 0.05 1.5 - 3.0 2 × 10⁵ -6 × 10⁵ 19F-crude : 0.44 ± 0.05 2.95 ± 10％ 1.0 × 10⁶ ±20％ 19F-hyd+frac : 0.65 ± 0.05 1.0 - 2.0 2 × 10⁵ -6 × 10⁵ 23F-crude : 0.36 ± 0.05 4.15 ± 10％ 2.2 × 10⁶ ±20％ 23F-hyd+frac : 0.54 ± 0.10 1.5 - 3.0 4 × 10⁵ -8 × 10⁵ Ｐｎ−Ｐｓ 数平均 多分散性 繰り返し単位 Ｃ−Ｐｓ 亜 型 分子量（Ｍ _N ） （Ｍ _W ／Ｍ _N ） 数／分子 ％ 4-crude : 3.3×10⁵±20％ 1.2 - 1.6 > 600 > 3 4-hyd+frac : 2×10⁵ -4×10⁵ 1.0 - 1.4 < 600 < 3 6B-crude : 9 × 10⁵±20％ 1.5 - 2.5 >1000 > 3 6B-hyd+frac : 3×10⁵ -6×10⁵ 1.0 - 1.4 <1000 < 3 9V-crude : 9 × 10⁵±20％ 1.2 - 2.5 > 800 > 3 9V-hyd+frac : 3×10⁵ -6×10⁵ 1.0 - 1.4 < 800 < 3 14-crude : 7 × 10⁵±20％ 1.3 - 2.5 >1200 > 3 14-hyd+frac : 3×10⁵ -8×10⁵ 1.0 - 1.4 <1200 < 3 18C-crude : 6 × 10⁵±20％ 1.4 - 2.5 > 700 > 3 18C-hyd+frac : 2×10⁵ -6×10⁵ 1.0 - 1.4 < 700 < 3 19F-crude : 6 × 10⁵±20％ 1.8 - 2.5 >1000 > 3 19F-hyd+frac : 2×10⁵ -6×10⁵ 1.0 - 1.4 <1000 < 3 23F-crude : 1 × 10⁶±20％ 2.0 - 3.0 >1000 > 3 23F-hyd+frac : 2×10⁵ -6×10⁵ 1.0 - 1.4 <1000 < 3

【００２６】 Ｂ．本発明の新規なＰｎ−Ｐｓ化合物の製造方法 この方法を開示するにあたって、以下の諸段階を説明す
る： ａ）未精製肺炎球菌多糖、Ｐｎ−Ｐｓの単離； ｂ）未精製Ｐｎ−Ｐｓの部分的加水分解又は機械的剪断
（shearing） ｃ）本発明のＰｎ−Ｐｓ生成物を製造するための、大き
さ及び純度に応じた、部分的に加水分解した肺炎球菌多
糖の分画化。

【００２７】 ａ）未精製肺炎球菌多糖の単離 肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）を培養し
て、周知の方法〔実施例３、及びＷilliams, Ｃ．
Ａ．，及びＣhase, Ｍ．Ｗ．，“Ｍethods in Ｉmmunol
ogy and Ｉmmunochemistry”（「免疫学と免疫化学にお
ける方法」）、Ｖol.Ｉ．Ａcademic Ｐress （１９６
７）〕によって未精製肺炎球菌多糖を回収する。病原体
は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（商標）２３に用いられる２３
のすべての肺炎球菌多糖の未精製の製品として、ＡＴＣ
Ｃから入手できる。これらの粉末状多糖を、この方法の
出発物質として用いてもよいし、または、病原体を成長
させて多糖を以下のように単離してもよい。すなわち、
簡単に言えば、この分野で肺炎球菌の成長を維持するの
に適当であることが知られている栄養培地内で細菌を大
規模培養した後に、未精製多糖を得る。フェノール又は
トルエン等の殺菌剤を加えて生体を殺す（実施例３）。
その後、２段階の多糖のアルコール分画化を行なう。最
初の段階では低濃度のアルコールを殺菌処理したものに
加えて、未精製Ｐｎ−Ｐｓは溶液に溶かしたまま、細胞
残渣及びＣ−多糖等の他の不要な不純物を沈殿させる。
つづいて、試行規模において前もって決定しておいた濃
度の水と混和するアルコールをさらに加えて、莢膜多糖
を沈殿させて、上澄み中にさらに残った不純物をとりの
ぞく。Ｐｎ−Ｐｓを水性媒質に再懸濁した後、核酸又は
タンパク質加水分解、あるいは溶媒抽出等の周知の方法
で不純なタンパク質と核酸をとりのぞく。未精製多糖を
アルコール沈殿させて回収し、乾燥して未精製Ｐｎ−Ｐ
ｓの粉末を形成する（実施例３）。

【００２８】 ｂ）粗Ｐｎ−Ｐｓの部分加水分解又は機械的剪断 実質的に上述の通り調製した粗多糖〔以下の実施例３も
参照〕は、成人及び２才以上の子供を使用目標とした肺
炎球菌ワクチンを処方するために非結合状態で用いられ
ている。次の処理工程は結合体ワクチンの製造に有用な
ユニークな定義の化学的及び物理的性質（表ＩＩ参照）
を有する新規な部分加水分解された精製Ｐｎ−Ｐｓ生成
物を生成させる。粗Ｐｎ−Ｐｓのサイズ縮小は、高純度
Ｐｎ−Ｐｓ生成物を得るための次の精製工程の成功に効
果がある。更に結合体を調製するために用いる場合、本
発明の新規なＰｎ−Ｐｓを使用するときの結合は更に能
率がよい。これは粗多糖物質の水溶液が非常に粘性で可
溶性が不十分であり、その結合体が非常に不溶性である
ためである。そして、結合方法はこれ自体実施が困難で
あり、低収率の結合体が生じる。更に最終結合体からの
非結合Ｐｎ−Ｐｓの除去は、前結合Ｐｎ−Ｐｓがサイズ
の縮小、粘度の低下及び改良された溶解度を有する場合
に容易である。これは結合体調製物中の遊離Ｐｎ−Ｐｓ
の存在が、投与される結合体Ｐｎ−Ｐｓの実際の投与量
を推定することを困難にする点で重要であり、著しいＴ
細胞刺激作用を有する結合Ｐｎ−Ｐｓであるほど、非結
合Ｐｎ−Ｐｓの存在は免疫学的に“適切”なＰｎ−Ｐｓ
の減少を示す。

【００２９】上記で調製した乾燥粗莢膜多糖は、またＰ
ｎ１４−Ｐｓとして実施例４に示される通り、部分加水
分解の前又は後に、例えばアニオン交換クロマトグラフ
ィー、又は他のクロマトグラフィー法で精製することが
できる。クロマトグラフィー吸着−脱着は、正あるいは
負として使用することができる。正の方法では、Ｐｎ−
Ｐｓを樹脂に吸着させて溶液中に不純物を残し、Ｐｎ−
Ｐｓ脱着前に洗い流す。負の方法では、不純物をＰｎ−
Ｐｓ溶液から吸着させて捨て、精製された状態の溶液中
Ｐｎ−Ｐｓを残す。また、Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓとして実施例
２に示される通り、部分的熱加水分解又は他の既知の加
水分解手段、例えば化学的、酵素的又は物理的（例え
ば、高圧セル又は音波分解）手段に直接かけることもで
きる。溶液粘度又は高性能サイズ排除クロマトグラフィ
ーで都合よく測定される加水分解の標的終末点は、多糖
の抗原性が妨げられないようなパイロットスケールで各
々の多糖に対して予め決定される。上で述べたように抗
肺炎球菌型特異抗体を結合する名目上の能力は、同濃度
の粗Ｐｎ−Ｐｓ出発物質に示される結合の４０％以上で
あることが良好とみなされる。部分加水分解は水性媒質
中、好ましくは５〜１１０℃で、約１〜４８時間限定熱
処理によって達成される。５秒から５分の限定高エネル
ギー音波処理は、所望粘度又はＫｄ終末点に達するのに
必要な回数だけ、冷却時間をおいて繰返す。音波加水分
解法は、熱加水分解より好ましく、多糖類は複合構造を
有する（以下参照）。多糖類の部分加水分解を行なう本
技術分野で既知の他の適当な手段も利用することができ
る。例えば酸による限定化学的加水分解、細胞内崩壊酵
素処理又はブレンダー、ミル又は高圧セルに於ける物理
的剪断もまた平均Ｐｎ−Ｐｓ鎖サイズを縮小するために
使用することができる。好ましい実施態様では、Ｐｎ−
Ｐｓをホモジナイザーに所定の温度約０〜３０℃、圧力
約２，０００〜１５，０００ＰＳＩで通過させて物理的
剪断にかけてサイズ、多分散性及び抗原性の望ましい特
徴を有するＰｎ−Ｐｓ生成物を得る（実施例１８参
照）。

【００３０】溶液粘度又は高性能サイズ排除クロマトグ
ラフィーで都合よく測定される加水分解の標的終末点
は、多糖の抗原性が妨げられないようなパイロットスケ
ールで各々の多糖に対して予め決定される。上で述べた
ように抗肺炎球菌型特異抗体を結合する名目上の能力
は、同濃度の粗Ｐｎ−Ｐｓ出発物質に示される結合の４
０％以上であることが、反復単位の構造に関係のある配
列関連エピトープに加え、多糖のコンホメーションのエ
ピトープを含む点において良好とみなされる。これは実
質的に低いＭ_N、Ｍ_W又は繰り返し単位数／分子（表Ｉ
Ｉ）を有するＰｎ−Ｐｓが、この方法で生成させること
ができず速度比濁検定の場合、上で決めた４０％以上の
カットオフを反応させることができないようなＰｎ−Ｐ
ｓが結合により動物の免疫原性であることができること
を言うのではない。これは型特異抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体と結
合し沈殿させる著しい能力がないにもかかわらず、結合
状態の低分子量Ｐｎ−Ｐｓが哺乳類免疫系に認識され、
良好な型特異抗肺炎球菌応答を生じることができること
を言うのである。この場合“抗原性”は一定のＰn−Ｐs
調製物の受容又は排除の操作基準としての“免疫原性”
に置き換わるべきである。しかしながら実際には方法制
御として生体内免疫原性パラメーターより試験管内抗原
性を使用することが最も便利である。

【００３１】一般に、同様のサイズ縮小方法はほとんど
の多糖類に応用することができる。しかしながらＰn６
Ｂ−Ｐｓは、広範囲の熱的サイズ縮小で抗原性を保持す
るが、Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ及び他の複合体多糖は構造上の
統合性を失い（グリセロール−リン酸側鎖）、音波処理
又は物理的剪断手段によって達成し得る穏やかなサイズ
縮小を必要とする。例えば、ゴーリンホモジナイザーで
の物理的剪断は、いくつかの理由で好ましい方法であ
る。まずこの方法は規模を拡大することができる。第２
に音波及び熱加水分解は一般に多分散性１．０〜１．５
を得るために加水分解されたＰｎ−Ｐｓの追加分画を必
要とする。しかしながら物理的剪断方法は、一般に更に
分画せずにこの範囲に入る多分散性を有するＰｎ−Ｐｓ
生成物を生じるが、純度を更に高め、多分散性とＣＰｓ
混入の減少を得るために分画してもよい。第３に物理的
剪断方法は、熱又は音波加水分解手段と比較した場合、
一定のＰｎ−Ｐｓについて再現性及びスケール能力が高
いという長所がある。第４に物理的剪断方法は、音波又
は熱加水分解によって生成した同一サイズのＰｎ−Ｐｓ
より一定のサイズに対して高い抗原性を保持することが
あるというＰｎ−Ｐｓ生成物の生産に於ける利点がある
と思われる。

【００３２】Ｐｎ−Ｐｓ平均分子量に関係する粘度は、
監視するのに便利な工程中のパラメーターであり、サイ
ズ縮小の程度を限定及び制御するために加水分解中に容
易に続けられる。Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ及びＰｎ２３Ｆ−Ｐｓ
の化学的及び物理的に区別できるロットは多糖を一致し
た標的終末粘度（上記表Ｉ参照）までサイズを縮小する
ことによって簡単に調製されている。このような工程中
の粘度測定の使用は、広範囲の粗多糖類に応用すること
ができ、得られたＰｎ−Ｐｓ抗原性の特徴を変化させず
に加水分解サイズを減少させる。上述した通り、抗原性
の保持は例えばウフタロニー二重免疫拡散検定、速度比
濁分析又は当業界で既知の他の方法によって容易に確か
められる。０．９％塩化ナトリウム（食塩水）中数種の
Ｐｎ−Ｐｓ調製物の１ｍｇ／ｍｌ溶液の標的終末粘度を
以下の表IIIに示す。これらの数値は他のＰｎ-Ｐｓ亜型
に同様に適用することができる。 表 III 粗及び加水分解Ｐｎ−Ｐｓの溶液粘度 Ｐｎ−Ｐｓ亜型 粗Ｐｎ−Ｐｓの粘度 標的終末粘度 （センチストークス） （センチストークス） Ｐｎ４−Ｐｓ １.８ １.５−１.００ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ １.４ １.３−１.００ Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ １.４ １.３−１.００ Ｐｎ１４−Ｐｓ １.２ １.１−０.９５ Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ ２.０ １.５−１.００ Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ １.４ １.３−１.００ Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ １.６ １.５−１.００ ある肺炎球菌多糖類の場合には、部分加水分解の前又は
後にイオン交換工程のような別の精製工程を含むことが
有益である。Ｐｎ１４−Ｐｓの場合には、この工程は音
波部分加水分解の前にアニオン不純物のＷhatmanＤＥ５
２による吸着によって達成される。わずかに中正である
多糖を加水分解に備えて上清画分として回収する。同様
の操作がＰｎ７Ｆ−Ｐｓのような他の中性多糖にも適用
できることは当業者にとっては明らかである。

【００３３】Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ調製物の分子量値は、サイ
ズ縮小及び分画前は約９００キロダルトン（ＫＤ）、後
は約３００ＫＤである。Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓの各数値は前
が約１００ＫＤ以上後が約４００〜５００ＫＤである。
従って約５００±約３００キロダルトンまでのＰｎ−Ｐ
ｓサイズの縮小が各Ｐｎ−Ｐｓ亜型工程のこの相の適当
な目標である。部分加水分解された物質を、所定濃度の
アルコールで再沈降させると以下の（ｃ）項で記載され
る部分加水分解されたＰｎ−Ｐｓを回収し更に精製する
ことができる。

【００３４】 ｃ）サイズ及び純度による部分加水分解Ｐｎ−Ｐｓの分
画 Ｐｎ−Ｐｓ調製物の多分散性は、亜型特異Ｐｎ−Ｐｓ鎖
長の分散を示すばかりではなく、群特異Ｃ多糖並びに他
の混入物がＰｎ−Ｐｓ調製物に残存していることも示し
ている。上で述べた通り、残留Ｃ多糖の混入は有用では
なく逆の免疫応答に関連することさえある。狭い範囲の
多糖平均分子サイズ（多分散性の低下）の選択は、サイ
ズ縮小後示差アルコール、例えばエタノール好ましくは
イソプロパノール（ＩＰＡ）溶解によって達成するのが
便利である。この選択の根拠は、一定のＰｎ−Ｐｓ調製
物に対してアルコール溶解度が鎖長に逆比例し、また分
子量に比例することである。従ってこの方法は、出発の
サイズ縮小Ｐｎ−Ｐｓより著しく改良された均一性を有
する一致した大きさの分子集団を量的に単離するのに良
好に適用されている。ＩＰＡ分画の工程中制御は、Ｐｎ
−Ｐｓが沈降するＩＰＡの範囲を予想するパイロット実
験を行なうことによるものである。抗体特定ネフェロー
ス検定は分画を監視するために使用して量的Ｐｎ−Ｐｓ
回収を確かめる。この改良により、多くの異種肺炎球菌
単離物に共通の、Ｃ多糖群特異多糖による混入は、粗Ｐ
ｎ−Ｐｓ調製物に見られるレベルより約３〜２０倍減少
する。更にＰｎ−Ｐｓ調製物の分子サイズ多分散性は約
１．０〜１．４に付随して減少する。

【００３５】サイズ縮小Ｐｎ−ＰｓのＩＰＡ分画に対す
る別の方法は、適当なサイズ排除樹脂、例えばＣＬ−２
Ｂ樹脂又は２００〜１０００キロダルトン分子量範囲の
多糖を含み、分画することができる他の樹脂によるサイ
ズ縮小水性Ｐｎ−Ｐｓのクロマトグラフィーである。厳
密なサイズ排除マトリックスを用いるＨＰＳＥＣは、こ
の点で便利であり、分画能の遅れと増加を減少させる。
所定の粘度又は保持時間又はオンライン検出によるカラ
ムから溶離する画分の選択は、上で開示したサイズ、粘
度及び純度の望ましい特徴を有するＰｎ−Ｐｓ分子集団
を得る。ＩＰＡ又はクロマトグラフィー分画の別の工程
を用いたＰｎ-Ｐｓの調製物は、化学結合工程中、更に
一致して行動して再現性のある特徴を有する結合体を生
成させる。Ｐｓ−Ｐｓ純度の付随した著しい増加も得ら
れ、特にＣＰｓレベルは非常に低下する。上述の操作と
測定の結果としてＰｎ−Ｐｓ中間体の好ましい特徴は上
記表ＩＩに示した通りである。

【００３６】本発明の新規なＰｎ−Ｐｓ生成物は、多く
のやり方で利用できる。１つの好ましい適用において
は、Ｐｎ−ＰｓをＴ−細胞依存キャリアーに接合する。
この接合を行なう非常に好ましい方法の１つは、米国特
許第４，６９５，６２４号；第４，８３０，８５２号；
第４，８８２，３１７号；１９９１年１月２８日提出の
米国出願第６４６，５７０号（Ｍerck Ｃase ＃１８１
０８）に開示されている。本出願書中の実施例３，５，
７及びその他も参照のこと。１つの好ましい実施例にお
いては、接合生成物を水酸化アルミニウムゲルに吸着さ
せる。これは、たとえば、濃度２０μｇ／ｍｌのＰｎ−
Ｐｓと当量の接合した保存溶液を製造して行なう。一定
量を滅菌した水で１：１、１：５及び１：１０に希釈す
る。２０μｇ／ｍｌ保存溶液の一定量を含めたこれら各
サンプルの一定量を、０．８５ｍｇ／ｍｌ Ａｌ³⁺、１.
７％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ及び１００μｇ／ｍｌチメロゾ
ールを含んだ水酸化アルミニウム希釈液で１：１に希釈
する。溶液のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで約７．５に調整し
て、その結果、Ｐｎ−Ｐｓ濃度１０，５，２及び１μｇ
／ｍｌの溶液とする。これら各調合物の約０．１〜０．
５ｍｌの服用量が、様々の年齢や体重にわたる服用者に
対する投与に適している。前述のように処方した接合ワ
クチンが生後２〜３カ月のサルにおいて、Ｐｎ６Ｂ−Ｐ
ｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１４
−Ｐｓ−ＯＭＰＣ及びＰｎ２３Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣに対
するサブタイプ特異的な抗肺炎球菌多糖免疫反応をいち
じるしく高めることが知られている。さらに、Ｐｎ−Ｐ
ｓ−ＯＭＰＣ接合ワクチンは、無胸腺症マウスにおい
て、Ｔ細胞依存性があることが知られている。

【００３７】ここに述べたことから明らかなように、こ
こで定義した特性を持つ他の多糖及びそれらの特性を持
つＰｓを作る方法は、部分的に加水分解して分画化した
肺炎球菌多糖以外の接合体の製造において有用な適用が
できる。そしてこれらの接合体を、他の病原体生物がひ
きおこす疾患の予防に用いることができる。たとえば、
新生児髄膜炎の原因であるＢグループ連鎖球菌、幼児髄
膜炎の原因である髄膜炎菌（Ｎeisseria meningitidis
Ｂ）又は、尿路、髄膜又は他の通性感染症の重要な原因
である大腸菌（Ｅ．Ｃoli）を、多糖源として用いるこ
とができる。

【００３８】これらの新規なＰｎ−Ｐｓ化合物の別の利
用法は、１つ又はそれ以上の接合した形態の部分的に加
水分解して分画化したＰｎ−Ｐｓ化合物を含む混合物の
製造である。このようにして、これらの化合物の純度を
向上させることによって、２３価又は１４価のワクチン
以上の混合物を製造することができる（“Ｐhysicians
Ｄesk Ｒeference”（「医師用卓上便覧」）１９９０年
版ｐ１４３１参照）。このような混合物は、新規なＰｎ
−Ｐｓ化合物それぞれを約５０μｇ／ｍｌ含み、筋肉内
又は皮下に投与されるべきである。ここに掲げたどのＰ
ｎ−Ｐｓサブタイプも、全服用量約２５μｇ、つまり約
０．５ｍｌで十分である。接合したＰｎ−Ｐｓと遊離Ｐ
ｎ−Ｐｓのいずれも、塩化ナトリウムに防腐剤を加えた
もの等の不活性担体の他に、さらにＰedvax ＨＩＢ（商
標）等の抗菌化合物、抗インフルエンザ抗原等の抗ウイ
ルス化合物、あるいは、アジュバント等の免疫調節物質
を含んでよい。これらの多糖及び多糖による共有結合接
合体はまた、複合ワクチン処方の重要な成分を提供す
る。このような複合処方には、たとえば、免疫学的効果
を有する量のＦreundsアジュバントやＲｉｂｉアジュバ
ント、又は免疫調節化合物、たとえばインターロイキ
ン、インターフェロン（Ｍarket Ｌetter, Ｎov.３０,
１９８７, ｐ２６〜２７；Ｇenetic Ｅngineering Ｎew
s, Ｊan. １９８８，Ｖol．８，ｐ２３等を参照）、あ
るいは付加的な免疫原を含んでもよい。好ましい実施例
において、免疫学的に効果のある量の本発明のＰｎ−Ｐ
ｓを有する混合物は、Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎、非Ａ非Ｂ型
肝炎、エイズ、ジフテリア、百日咳、破傷風、はしか、
おたふくかぜ、風疹、不活化したポリオ、水痘又はイン
フルエンザ菌（Ｈaemophilus influenzae ｂ）に対する
１つ又はそれ以上のワクチンとともに含まれる。ここに
述べたものの中から選んだ、加えるのが好ましいワクチ
ンは、Ｐevax ＨＩＢ（商標）、Ｒecombivax ＨＢ（商
標）、Ｍ−Ｍ−Ｒ（商標）、及び３価ＤＴＰワクチンの
中から選択する。本発明の新規なＰｎ−Ｐｓ生成物の、
これらの及びその他すべての使用法は、当該説明の範囲
に含まれると考えるべきである。以下の実施例は、説明
をさらに明らかにするために示されるものであって、本
発明を制限するものと考えてはならない。

【００３９】

【実施例１】 ストレプトコッカス ニューモニアエ サブタイプの培養及び粗製Ｐｎ−Ｐｓの単離

【００４０】 Ｉ．ニューモコッシの培養 ニューモコッシの培養方法は当業界で公知である（Ｃha
se, Ｍ.Ｗ., Ｍethods of Ｉmmunology and Ｉmmunoch
emistry １，５２（１９６７））。ニューモコッカル
サブタイプの単離物はＡＴＣＣから入手可能である。こ
の微生物は被包性、非運動性、グラム陽性、ランセット
形の血液寒天上でα溶血性である双球菌として同定され
ている。サブタイプは特異的抗血清を使用するクエリン
グ（Quelling）反応に基づき区別されている。主及び貯
蔵種子培養物は凍結されているかあるいは８℃以下にす
ることが好ましい。好ましい培養方法においては、貯蔵
培養物を ハート インフュージョン ブロス（Ｈeart Ｉ
nfusion Ｂroth）でもとに戻し、１０％脱フィブリン化
したウサギ血液を含む、ハート インフュージョン寒天
上で培養し、３７±２℃で約１８時間インキュベートす
る。このプレート上の増殖物をハート インフュージョ
ン ブロスに再浮遊させ、この再浮遊した増殖物の一部
を１０％脱フィブリン化したウサギ血液を含むハートイ
ンフュージョン ブロス１００ｍｌに接種し、３７±２
℃で約１８時間固定培養としてインキュベートする。１
００ｍｌの液化培養物（処理種子（workingseed））の
純度をグラム染色した点及びハート インフュージョン
血液寒天プレート上の増殖に対する顕微鏡観察により調
べる。この処理種子を１４日迄の間２−８℃で保存し
て、すぐに使用する。デキストロース（２５ｇ／リッタ
ー）を含むニューモコッカス接種原培養基（ＹＵＦ）を
含む２リッターエルレンメイヤーフラスコあるいは適当
な容器に処理種子を接種し、３７±２℃で約８〜２４時
間固定インキュベートさせる。インキュベーション時間
は特に発育するストレプトコッカス ニユーモニアエの
タイプに依存して変わる。発酵のｐＨは光学密度１．５
〜４．０に到達する迄１２％炭酸水素ナトリウム溶液の
断続的な添加により目標ｐＨ範囲６．０〜７．２を維持
するように調整する。光学密度は６６０ｎｍでモニター
する。増殖物の試料を顕微鏡学的に観察し、血清学上の
凝集反応を純度のチェックのために行う。この段階の増
殖物を蒸留水、ニューモコッカス種子培地に対する成分
の乾燥充填物（ＹＵＦ）、酵母エキス限外濾過物、ＵＣ
ＯＮ、及びデキストロース（約２５ｇ／リッター）の成
分からなる４０リッターのニューモコッカス発酵培地を
含む種子発酵槽に移す。培養物を３７±２℃で温和な攪
拌下約２−１２時間インキュベートする。このｐＨを水
酸化ナトリウム溶液の断続的な添加により６．０〜７．
２に制御する。蒸留水、ニューモコッカス産生培地に対
する成分の乾燥充填物（ＹＵＦ）、酵母エキス限外濾過
物、ＵＣＯＮ及びデキストロース（約２５ｇ／リッタ
ー）の成分からなる５２５リッターのニューモコッカス
発酵培地を含む発酵槽を約５０リッターの一つの２−１
２時間種子培養物で接種する。培養物を３７±２℃で温
和な攪拌下６−３０時間（この時間は発育のタイプに依
存する）インキュベートさせる。このｐＨを水酸化ナト
リウム溶液の断続的な添加により６．０〜７．２に制御
する。この発酵の光学密度を決定し、デキストロースが
もはやｐＨを変化させないように完全に利用された時に
発酵を終了させる。発酵終了後病原性微生物をすぐに中
和する。この中和は約１％の濃縮物にフェノールを添加
させ、周囲温度で２−１２時間進行させることにより達
成される。

【００４１】 II. 粗製Ｐｎ−Ｐｓの単離 細胞破片及び核酸が浮遊するに十分な量で変性アルコー
ルを中和した培養物に添加し、遠心分離により取り除
く。次いで粗製ポリサッカライドを更なる変性エタノー
ルの添加により上清液から浮遊させる。この固形物を遠
心分離により集め上清液を捨てる。核酸の混入はポリサ
ッカライドの中性水性溶液、例えば１−５％酢酸ナトリ
ウム、あるいは０．０５Ｍリン酸緩衝液、への可溶化を
減少させるのでヌクレアーゼ及び０．０１Ｍ塩化マグネ
シウムを添加する。約３６℃で約６０−１２０分後、ｐ
Ｈを約８．０に調整し、トリプシンのようなプロテアー
ゼを蛋白質混入物の消化のために添加する。変性アルコ
ールあるいはイソプロパノールを使用する酢酸ナトリウ
ム中のポリサッカライドの再浮遊、続く蒸留水での再可
溶化により更なる不純物を除去する。約８℃でのセトリ
モニウム臭化物の添加により不純物を浮遊させ遠心分離
により除去する。酢酸ナトリウム及び一部分の変性アル
コールあるいはイソプロパノールの添加は更なる不純物
を除去させる。ポリサッカライドは更なるアルコールの
添加及び遠心分離により回収される。この浮遊物を白色
粉末が得られるまで無水エタノールで洗浄する。このポ
リサッカライドを濾過によって集め、無水エタノール及
びアセトン洗浄、真空下での乾燥により粗製Ｐｎ−Ｐｓ
を粉末として得る。

【００４２】

【実施例２】部分的に加水分解され、精製されたＰｎ６Ｂ−Ｐｓの調
製 （１）熱加水分解：粗製Ｐｎ６Ｎ−Ｐｓ粉末の３．０ｇ
部分を攪拌しながら室温で約４時間１２００ｍｌの生理
食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に溶解させ、４℃で一晩保
存した。次いで この溶液をコールドフィンガー（cold-
finger）還流冷却器中１００℃で２４時間加水分解し、
室温まで冷却した。酢酸ナトリウム試薬（５９．７ｇ）
を最終濃度３％（ｗ／ｖ）になるように添加した。 （２）血清学的プローブ：試料１０ｍｌ部分につき、イ
ソプロパノール（ＩＰＡ）分別予備研究及び抗体指示終
点ネフェローゼ検定を行ったところ、Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓは
４０−５０％ＩＰＡで浮遊することを示した。 （３）第一ＩＰＡ添加：加水分解した試料（容量１２１
０ｍｌ、上記工程１から）を９３２ｍｌＩＰＡの添加
（室温で攪拌しながらの滴下）により４３．５％ＩＰＡ
にした。この試料を１５−３０分間攪拌させ、次いで１
１０００ｘｇで３０分間遠心分離（ベックマンＪＡ−１
０ローター；８０００rpm；２０℃）した。この不毛の
ペレットを２５０ｍｌオムニミックスジャー（Ｏmnimix
jar）中無水エタノールで摩砕し、次いで６０ｍｌ焼結
ガラス漏斗上で集めた。この浮遊物を直接漏斗上で無水
エタノール、次いでアセトンで洗浄し、ＣａＣｌ₂上室温
で真空乾燥して分析用試料を調製した。 （４）第二ＩＰＡ添加及び産生物回収：４３．５％ＩＰ
Ａ上清液（容量２０２０ｍｌ、上記工程３から）を室温
で攪拌しながら９３．５ｍｌＩＰＡ滴下により４６．０
％ＩＰＡにした。この試料を熟成し、上記工程３でのよ
うに遠心分離した。このペレットを上記工程３でのよう
に摩砕、採集、洗浄、乾燥した。このＰｎ６Ｂ−Ｐｓは
１６５０ｍｇであり、Ｋｄは０．６２であり、３．３％
のリンを含んでいた。

【００４３】 実施例３Ｓ．ニューモニアエ６Ｂ−ＯＭＰＣを接合したＰｎ６Ｂ
−Ｐｓ−ＯＭＰＣ

【００４４】Ａ．ダウエックス５０×２テトラブチルア
ンンモニウム樹脂（ダウエックス５０（Ｂｕ₄Ｎ⁺））の
調製 ダウエックス５０×２（２００−４００メッシュ）Ｈ⁺
型（７２ｇ）を水にスラリーさせ、カラムに充填し、
水、６Ｎ ＨＣｌの順で洗浄し、次いで流出液がｐＨ紙
で中性になるまで水で洗浄した。水酸化テトラブチルア
ンモニウムの１０％水溶液を流出液が強アルカリになる
までカラムに通した。最後に、流出液が再び中性になる
まで水をカラムに通過させた。

【００４５】Ｂ．Ｐｎ６Ｂ（Ｂｕ₄Ｎ⁺） サイズが減少し、分別したＰｎ６Ｂ−Ｐｓ（６００ｍ
ｇ）（物理特性に対する表ＩＰｎ６Ｂ−Ｐｓロット１参
照）を滅菌蒸留水（６０ｍｌ）に溶解し、この溶液を全
ての固体が溶液になるまで（１．５時間）電磁的に攪拌
した。このポリサッカライド溶液を洗浄した樹脂に載せ
重力により通過させた（４．５時間）。このカラムを水
（１０−１２ｍｌ）洗浄し、合わせた流出液を凍結乾燥
して６４０ｍｇの乾燥Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓテトラ−ｎ−ブチ
ルアンモニウム塩、Ｐｎ６Ｂ（ｎ−Ｂｕ₄Ｎ⁺）を得た。

【００４６】Ｃ．Ｐｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂ Ｐn６Ｂ（ｎ-Ｂｕ₄Ｎ⁺）（６４０ｍｇ）をジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）（２４ｍｌ）に溶解し、電磁的に
３０分間攪拌させて全ての固体が溶液になった。この混
合物に１，１’−カルボニルジイミダゾール（４４．２
ｍｇ）を添加し、反応物を室温で攪拌した（６０分）。
別のフラスコにおいて、水（１６ｍｌ）中のブタンジア
ミン二塩酸塩（ＢｕＡ₂ ２ＨＣｌ，１.０２２ｇ）の溶
液を１０ＮＮａＯＨの添加により塩基性にした（ｐＨ１
０．２）。この溶液を０．２μｍ滅菌フィルターに通過
させ、氷浴中で冷却した。活性化ポリサッカライドを含
む熟成したＤＭＳＯ混合物を冷却ＢｕＡ₂ ２ＨＣｌ溶液
に、ゆっくり一定の流れで加え、得られた溶液を０℃で
攪拌した（１５分）。この反応混合物を室温まで暖め、
更に１時間攪拌し、その後透析管に移して以下の条件で
透析した（４℃）：１）１５リッター、０．１Ｍ、ｐＨ
７．０、りん酸ナトリウム緩衝液、６時間；２）１５リ
ッター、０．０１Ｍ、ｐＨ７．０、りん酸ナトリウム緩
衝液、１２時間；３）１５リッター、０．０１Ｍ、ｐＨ
７．０、りん酸ナトリウム緩衝液、９時間；４）１５リ
ッター、蒸留水、１７．５時間； 透析管の内容物を凍結乾燥して２２２ｍｇのＰｎ６Ｂ−
１,４-ブタンジアミン（Ｐｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂）を得た。
この物質約５ｍｇのＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ₂Ｏ）
は、Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓのブタンジアミンメチレン及びラム
ノースメチルプロトンの共鳴の積分を比較することによ
り、１００Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ繰り返しモノマー単位当り２
２ジアミン残基を載せていることを示した。

【００４７】Ｐｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃ Ｐｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂（２１０ｍｇ）をｐＨ９．０４、０.
１Ｍコルトホッフホウ酸−りん酸緩衝液（２１ｍｌ）に
溶解し、この混合物を溶液になるまで３０分間電磁的に
攪拌した。この水溶液にアセトニトリル（２．６ｍｌ）
中のｐ−ニトロフエニルブロモアセテート（２１０ｍ
ｇ）からなる混合物を添加し、反応物を一晩攪拌した
（２０時間、４℃）。この溶液を透析管に移して以下の
条件で透析した（４℃）：１）１５リッター、滅菌蒸留
水、１２.３時間；２）１５リッター、滅菌蒸留水、
８．２５時間；３）１５リッター、滅菌蒸留水、５．５
時間；この内容物から１．７ｍｌを検定（ＮＭＲ及びＨ
ＰＳＥＣ−ユニバーサル口径測定あるいは分子サイズ分
析）のために取り出し、次いで乾燥したｐＨ８のりん酸
ナトリウム緩衝塩（０．１Ｍ、ｐＨ８のりん酸ナトリウ
ム溶液の凍結乾燥により調製）０．４４９ｇを加えた。
完全に溶解した後（３０分）、この溶液を０．２μｍ滅
菌フィルターに通過させてＰｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂−ＢｒＡ
ｃのｐＨ８を得た。

【００４８】Ｐｎ６Ｂ−ＯＭＰＣ 滅菌ＯＭＰＣ（４０ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ）を４個の
１０ｍｌ遠心管中での超遠心分離（４℃、４３ｋｒｐ
ｍ、２時間）により小球化させた。各々のペレットを３
ｍｌの滅菌フィルター（０.２２μｍ）したチオール化
混合物（ｐＨ１１．０９、Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇緩衝液（３０ｍ
ｌ）中のＮ-アセチルホモシステインチオラクトン塩酸
塩（１６４ｍｇ）、エチレンジアミンテトラ酢酸二ナト
リウム塩（２５５ｍｇ）及びジチオトレイトール（５３
ｍｇ）からなる）に再懸濁させた。この再懸濁ペレット
をホモジナイズし（ダウンス）、合わせ、容器を脱気し
て窒素で被い、一晩（１９時間室温で熟成させた。この
溶液を３個の超遠心管に分け、１ＭＫＨ₂ＰＯ₄を加え、
蛋白質を小球化した（４℃、４３Ｋｒｐｍ、２時間）。
このペレットを０．１Ｍりん酸ナトリウム、ｐＨ８緩衝
液（３０ｍｌ）に再懸濁させ、ホモジナイズし（ダウン
ス）、再小球化した（４℃、４３Ｋrpm、２時間）。こ
の滅菌蛋白質ペレットを濾過したＰｎ６Ｂ−ＢｕＡ₂−
ＢrＡｃ溶液中での再懸濁に使用した。エルマン（Ｅllm
an）試験をすぐに行い、ＳＨ価は３４μｍoｌを示し
た。この反応混合物を脱気して、窒素で被い、９１時間
室温で熟成させた。この蛋白質をｐＨ８.０、０.１Ｍり
ん酸ナトリウム緩衝液５ｍｌ中のＮ−エチルマレイミド
（７５ｍｇ）からなる（０．２２μｍ滅菌フィルター）
溶液１ｍｌの添加によりキャップ化した。この混合物を
室温で４時間熟成し、その後、Ｎ−アセチルシステアミ
ン（０．２２μｍ滅菌フィルター化）３００μｌを添加
し、この溶液を更に１９．５時間熟成した。この滅菌キ
ャップ化接合体を４個の遠心管に分け、０．１Ｍ、ｐＨ
７りん酸ナトリウム緩衝液を加え、超遠心分離（４℃、
４３Ｋｒｐｍ、２時間）により小球化した。次いで滅菌
ｐＨ７、０.１Ｍ ＮａＰＯ₄緩衝液（４２ｍｌ）中で再
懸濁させ、ホモジナイズ（ダウンス）した。前記したよ
うな再遠心分離の後、このペレットを滅菌蒸留水全量５
０ｍｌ中ダウンスホモゲナイザーで再懸濁させた。４℃
で１７時間熟成後、接合調製物をＴＪ−６遠心機ＴＨ４
ローターで１０００ｒｐｍ、３．５分間遠心分離して、
少量の沈降物を除去した。この最終生成接合浮遊物を蛋
白質（ローリー）、Ｐｎ６Ｂ−ポリサッカライド（フェ
ノール／硫酸）、非接合ポリサッカライド（サイズ排除
クロマトグラフィー−速度ネフェロメトリー）及びアミ
ノ酸（アミノ酸分析）に対して検定した。その結果は以
下の様であった。 Ｐｎ６Ｂ−ポリサッカライド ０.３３ｍｇ／ｍｌ 蛋 白 質 ２.２ ｍｇ／ｍｌ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ／ＯＭＰＣ ０.１５ フリーＰｎ６Ｂ−Ｐｓ ＜５領域％ Ｓ−カルボキシメチルホモシステイン／リジン ７.７ ％ Ｓ−カルボキシメチルシステアミン／リジン １.６ ％

【００４９】

【実施例４】部分的に加水分解され、精製されたＰｎ１
４−Ｐｓの調製 （１）陰イオン交換樹脂での処理：Ｐｎ１４−Ｐｓ粉末
の２．８１ｇ部分を攪拌しながら室温で約４時間１１２
４ｍｌの蒸留水に可溶化させ、次いで４℃で一晩保存し
た。この溶液を蒸留水中約１５時間予備膨張させたＤＥ
５２（ワットマン、ジエチルアミノ−エチルセルロー
ス）ｐＨ約５−６、６０ｇに加えた。このスラリーをプ
ラットホームシェイカー上室温で約１５時間優しく振動
させた。その後、ベックマンＪＡ−１０ローターで５０
００ｒｐｍ、２０℃、１５分間遠心分離した。更にこの
上清を焼結ガラス漏斗（１５０ｍｌ、培地孔）に通して
清涼化し２リッターのサイドアームフラスコに集めた。 （２）超音波加水分解：ＤＥ５２処理Ｐｎ１４−Ｐｓ
（容量１１００ｍｌ、上記工程１から）を氷浴上プラス
チックビーカー中ブランソン超音波機（１．５インチプ
ローブ、８にセット）で２分間超音波をあてて分解させ
た。粘度を測定しながらこの試料を約１５分間冷却し、
次いで更に１分間隔で超音波をあてて分解した。最終超
音波処理後には粘度の終点は１.０９６センチストロー
クに達した。この加水分解した試料を室温にし酢酸ナト
リウム試薬（１８．０ｇ）を加えて最終濃度１％（ｗ／
ｖ）にした。 （３）血清学的プローブ：試料１０ｍｌ部分につき、イ
ソプロパノール（ＩＰＡ）分別予備研究及び抗体指示終
点ネフェローゼ検定を行ったところ、Ｐｎ１４−Ｐｓは
３５−４５％ＩＰＡの間で浮遊することを示した。 （４）第一ＩＰＡ添加：加水分解した試料（容量１０９
０ｍｌ、上記工程２から）を７０６ｍｌＩＰＡの添加
（室温で攪拌しながらの滴下）により３９．３％ＩＰＡ
にした。この試料を１５−３０分間攪拌させ、次いで１
１０００ｘｇで３０分間遠心分離（ベックマンＪＡ−１
０ローター；８０００ rpm；２０℃）し、上清を捨て
た。この不毛のペレットを２５０ｍｌオムニミックスジ
ャー中無水エタノールで摩砕し、次いで６０ｍｌ焼結ガ
ラス漏斗上で集めた。この浮遊物を直接漏斗上で無水エ
タノール、次いでアセトンで洗浄し、ＣａＣｌ₂上室温で
真空乾燥し分析用試料を調製した。 （５）第二ＩＰＡ添加及び産生物回収：３９．３％ＩＰ
Ａ上清液（容量１７１２ｍｌ、上記工程４から）を室温
で攪拌しながら７３．５ｍｌＩＰＡ滴下により４１．８
％ＩＰＡにした。この試料を熟成し、上記工程４でのよ
うに遠心分離した。このペレットを上記工程４でのよう
に摩砕、採集、洗浄、乾燥した。このＰｎ１４−Ｐｓ産
生物は１３９９ｍｇであった。 （６）透析及び凍結乾燥：上記工程５からの試料の一部
分（１３８５.６ｍｇ）を５５４ｍｌ蒸留水中室温で２
−３時間可溶化させた。この溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）
を透析管（１２０００ＭＷ切断物；４５ｍｍ）に移し、
蒸留水を２回変えながら蒸留水で２７時間透析した。次
いでこの透析試料を凍結乾燥フラスコに移し、ドライア
イス／メタノール浴で外側を凍結させ、乾燥するまで２
−１／２日間バーチス（フリーズモービル）凍結乾燥機
で凍結乾燥した。最終Ｐｎ１４−Ｐｓ生成物の回収率は
１３２６．８ｍｇであり、Ｋｄは０．５６であった。こ
の開示から、他の中性Ｐｎ−Ｐｓサブタイプ、例えばＰ
ｎ７Ｆ−Ｐｓはここで開示した方法によって調製するこ
とができ、また中性ポリサッカライドでもあるＰｎ１４
−Ｐｓに関して接合できることは当業者にとって明らか
であろう。

【００５０】

【実施例５】 外膜蛋白複合体とニューモコッカル１４多糖との結合Ｐｎ１４−Ｐｓ−ＯＭＰＣ：

【００５１】ａ． Ｐｎ１４−Ｐｓの１,４−ブタンジ
アミン誘導体（Ｐｎ１４−ＢｕＡ₂）の製造： Ｐ₂Ｏ₅上で３時間真空下においたＰｎ１４−Ｐｓの４１
０ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２６ｍｌで
被い、０．７５時間攪拌して溶解した。これにカルボニ
ルジイミダゾール６２ｍｇを加え、得られた溶液を室温
にて８０分間攪拌した。Ｈ₂Ｏ ３８.５ｍｌ中に１，４
−ブタンジアミンジヒドロクロリド（ＢｕＡ₂・２ＨＣ
ｌ）１．０６７ｇを含む溶液を調製し、そのｐＨを２．
５ＮのＮａＯＨで１０．２０に調節した。この溶液をＭ
illex ０．２μｍＧＶフィルターを通して濾過し、氷浴
中で冷却した。上記熟成ＤＭＳＯ溶液を上記冷却ＢｕＡ
₂ 溶液に加え、そのまま氷浴中でさらに１０分間攪拌し
た。次いで、室温にて５０分間静置し、その後に溶液を
長さ１２インチのＳpectrapor ２透析チューブ２本に入
れ、液面より１ｃｍ上をクリップでとめて、１）ｐＨ
７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１５リットル
で１６．５時間、２）ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液１５リットルで８時間、３）ｐＨ７.０の
０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１５リットルで８時
間、４）Ｈ₂Ｏ １５リットルで１７．５時間透析を行っ
た。次いで、これを凍結乾燥し、Ｐｎ１４−Ｐｓの１,
４−ブタンジアミン誘導体（Ｐｎ１４−ＢｕＡ₂）２１
０ｍｇを得た。試料約５ｍｇのＮＭＲスペクトルは、多
糖１００繰返し単位当り約３１個のブタンジアミン残基
が“負荷”されていることを示し、これはブタンジアミ
ンメチレンおよび（Ｐｎ１４−Ｐｓ）Ｎ−アセチルメチ
ルの共鳴の積分値の比較によって特徴づけられた。

【００５２】ｂ． Ｐｎ１４-Ｐｓのブロモアセチル化
ブタンジアミン誘導体（Ｐｎ１４-ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃ）
の製造： Ｐｎ１４−ＢｕＡ₂ （２１０ｍｇ）をｐＨ９．０の０．
１Ｍホウ酸塩−リン酸塩緩衝液３６ミリリットルで被
い、２．５時間攪拌して溶液を得た。次ぎに、アセトニ
トリル４ミリリットル中ｐ−ニトロフェニルブロモアセ
テート１９５ｍｇを加えた。得られた混合物を４℃で２
１時間攪拌した。次いで、これをＳpectrapor ２チュー
ブ中で、１）蒸留水１５リットルで６時間、２）蒸留水
１５リットルで１４．５時間、３）蒸留水１５リットル
で６時間透析した。バッグの透析物から２.０ミリリッ
トルを取って分析用に供し、次いで乾燥したｐＨ８.０
リン酸塩緩衝塩４９２ｍｇ（ｐＨ８．０の０．１Ｍリン
酸ナトリウムを凍結乾燥して調製）を加えた。溶液を２
つの０．２μｍ Ｃorning フィルターで濾過し、ｐＨ
８.０のＰｎ１４−ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃ水溶液（４３ミリ
リットル）を得た。

【００５３】ｃ． ＯＭＰＣのＰｎ１４−ＢｕＡ₂−Ｂ
ｒＡｃ−Ｐｓへの結合： ＯＭＰＣ（濃度３．２ｍｇ／ミリリットル）１５ミリリ
ットルを５本の１０ミリリットル遠心チューブに入れ、
Ｂeckman ８０ Ｔi ローター中、４３,０００ｒｐｍ（４
３Ｋ）、４℃にて２時間遠心した。Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇緩衝液
（ｐＨ１１.０）３０ミリリットル中にＥＤＴＡ（エチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）３５０ｍｇおよび
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）６４ｍｇを溶解してチオ
ール化混合物を得た。Ｎ−アセチルホモシステインチオ
ラクトン３４６ｍｇを加え、溶液を０．２μｍ Ｃornin
g フィルター（カップ型）で濾過した。上記遠心からの
各ペレットを濾過したチオール化混合物３ミリリットル
でそれぞれ取り出し（全量１５ミリリットル）、Ｄounc
e ホモジナイザーに移して再び懸濁させた。チューブに
はチオール化溶液をさらに５ミリリットル用いて順に移
すことにより洗浄した。この洗浄工程をさらに５ミリリ
ットルのチオール化溶液を用いて繰り返した。合わせた
洗浄液はＤounce に入れてホモジナイズし、再懸濁物
（２５ミリリットル）を全量１００ミリリットル丸底フ
ラスコに移した。隔膜でシールし、Ｆirestoneバルブを
用いて空気をＮ₂ で置換した後、反応混合物を２１時間
静置した。次いで、反応混合物２５ミリリットルを３本
の遠心チューブに分け、それぞれの上に１ＭのＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄（水溶液）を入れて４３Ｋｒｐｍおよび４℃にて２
時間遠心した。上澄液を除去し、ペレットをｐＨ８.０
の０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した（再懸
濁液の最終体積は全量で３０ミリリットル）。次ぎに、
第２の超遠心（２時間、４℃、４３Ｋｒｐｍ）を行っ
た。上澄液を除去した後、ペレットを上記で調製した濾
過されたＰｎ１４−ＢｕＡ₂−ＢrＡｃ溶液中にＤounce
法により再懸濁した。この時点でのＥllman 検定は全部
で２３マイクロモルのチオールを示した。Ｐｎ１４−Ｂ
ｕＡ₂−ＢrＡｃ溶液の濾過はチオール化蛋白質の再懸濁
の直前に行うことに注意する必要がある。生じた反応
（すなわちＰｎ１４−ＢｕＡ₂−ＢrＡｃとチオール化Ｏ
ＭＰＣとの反応）はＮ₂箱中で（脱気して）Ｎ₂下、室温
にて１１４時間静置した。次いで反応を次のようにして
封止（ｃａｐ）した（すなわちＰｎ１４−ＰｓおよびＯ
ＭＰＣ上の反応部位を不活化する）。ｐＨ８．０の０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５ｍＬ中にＮ-エチルマレ
イミド（ＮＥＭ）７５ｍｇを含む溶液を０．２２μｍフ
ィルターで濾過し、その１ｍＬを上記反応混合物に加え
て４時間静置した。次に、０．２２μｍフィルター（Ｍ
illex ＧＶ）で濾過したＮ−アセチルシステアミン溶液
（ｐＨ８の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液２．１ｍＬ
中に９００μＬを溶解したもの）１ｍＬを加え、混合物
をさらに２２.５時間静置した。封止した反応混合物
（３５ミリリットル）を４本の遠心チューブに分けて遠
心した（４３Ｋ、２時間、４℃）。ペレットを４０ミリ
リットルＴＥＤ緩衝液（０．１Ｍトリス、０.０１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、０．５％ＤＯＣ、ｐＨ８．５）中に再懸濁さ
せ、室温にて１９時間静置した。次いで、溶液を遠心し
た（４３Ｋ、２時間、４℃）。ペレットをｐＨ８の０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液４０ミリリットルに再懸濁
し、その後再び遠心した（４３Ｋ、２時間、４℃）。こ
れらのペレットを蒸留水４４ミリリットル中に再懸濁
し、４℃にて１７時間静置した。低速遠心（１０００ｒ
ｐｍ、３．５分）で小さなペレットが得られ、これを捨
てた。上澄液を除去するとバルクの結合体が４３ミリリ
ットル得られ、これは次のような分析特性を有してい
た。 試 験 結 果 ａ．Ｐｓ含量 ３８７ｍｃｇ／ｍＬ ｂ．蛋白質 １３００ｍｃｇ／ｍＬ Ｐｓ／蛋白質比（計算値） ０.３０ ｃ．遊離Ｐｓ ＜５面積％ ｄ．アミノ酸分析 ＳＣＭＨＣ／リシン ９.８ ％ ＳＣＭＣ／リシン ３.５ ％

【００５４】

【実施例６】部分加水分解して精製されたＰｎ２３Ｆ−Ｐｓの製造 ： （１）超音波加水分解：Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ粉末の３．０
ｇを室温で約４時間攪拌して食塩水（０．９％ＮａＣ
ｌ）１２００ｍＬに溶解した。次いで溶液を氷浴中のプ
ラスチックビーカー内でＢranson Ｓonifier（１．５イ
ンチプローブ、設定８）を用いて３分間隔で合計１５分
間超音波処理した。各間隔ごとに粘度をチェックした。
１５分間の後、さらに５分間超音波処理を行って最終粘
度１．２０６センチストークスを得た。加水分解した試
料を室温に戻し、酢酸ナトリウム試薬（５８．４ｇ）を
最終濃度３％（ｗ／ｖ）まで加えた。 （２）血清学的プローブ：イソプロパノール（ＩＰＡ）
分別試験および抗体指示終点Ｎephelose検定（antibody
-directed end-point Ｎephelose assay）を試料の１０
ｍＬについて行い、Ｐｎ２３−Ｐｓは３５〜４５％ＩＰ
Ａで沈殿することが示された。 （３）第１のＩＰＡ添加：加水分解した試料〔体積＝１
１６５ｍＬ、上記工程（１）からのもの〕にＩＰＡ８１
０ｍＬを加えて（室温にて攪拌しながら滴下）４１．０
％ＩＰＡとした。試料を１５〜３０分間攪拌し、次いで
１１，０００ｘｇで３０分間遠心した（Ｂeckman ＪＡ
−１０ローター；８,０００ｒｐｍ；２０℃）。排出ペ
レットを２５０ｍＬのＯmnimixジャー中にて無水エタノ
ールで摩砕し、次いで６０ｍＬ焼結ガラスファネル上に
捕集した。この沈殿を直接ファネル上にて無水エタノー
ル、次いでアセトンで洗浄し、室温にてＣａＣｌ₂ 上で
減圧乾燥して分析用に供した。 （４）第２のＩＰＡ添加および生成物の回収：上記の４
１．０％ＩＰＡ上澄液〔体積＝１９２５ｍＬ、上記工程
（３）からのもの〕に室温で攪拌しながらＩＰＡ８５．
０ｍＬを滴下して４３．５％ＩＰＡとした。工程（３）
と同様にして試料を攪拌し遠心した。さらに工程（３）
と同様にしてペレットを摩砕し、捕集し、洗浄し、乾燥
した。Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ生成物は１７９５ｍｇであっ
た。 （５）透析および凍結乾燥：上記工程（４）からのＰｓ
試料１５１１１−３９−２の一部（１７７９ｍｇ）を室
温にて３〜４時間かけて蒸留水７１２ｍＬに溶解した。
溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）を透析チューブ（分画分試料
１２，０００；４５ｍｍ）に移し、４℃にて２７時間蒸
留水で透析した。この間に蒸留水は２回交換した。次い
で試料を凍結乾燥フラスコに移し、ドライアイス：メタ
ノール浴中でシェル凍結し、Ｖirtis（Ｆreezemobile）
凍結乾燥器上で２〜３日凍結乾燥した。最終Ｐｓ生成物
の回収量は１７０３ｍｇであった。最終生成物はＫ_d＝
０．６０を有していた。

【００５５】

【実施例７】外膜蛋白質複合体とＰｎ２３Ｆ−Ｐｓとの結合

【００５６】ａ． Ｄowex ５０×２（２００−４００
メッシュ） テトラブチルアンモニウム形樹脂〔Ｄowex
５０（Ｂｕ₄Ｎ⁺）〕の製造： Ｈ⁺形のＤowex ５０×２（２００−４００メッシュ）７
２ｇを水でスラリーとし（この過程で用いた水はすべて
パイロジェンフリーの無菌蒸留水である）、カラムに充
填し、順に１〕Ｈ₂Ｏ ８００ｍＬ、２〕６Ｎ ＨＣｌ ４
００ｍＬ、３〕Ｈ₂Ｏ ３００ｍＬ（流出液がｐＨ試験紙
で中性になるまで）、４〕１０％水酸化テトラブチルア
ンモニウム水溶液（流出液がｐＨ試験紙で強アルカリ性
になるまで）、５〕Ｈ₂Ｏ ７５０ｍＬで洗浄した。

【００５７】ｂ． Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓテトラブチルアン
モニウム形〔Ｐn２３Ｆ（Ｂｕ₄Ｎ⁺）〕 の製造： Ｄowex ５０×２（Ｂｕ₄Ｎ⁺）の３４ｍＬカラムをＨ₂Ｏ
７０ｍＬで洗浄した。サイズをそろえたＰｎ２３Ｆ−
Ｐｓの４５０ｍｇをＨ₂Ｏ ５０ｍＬで被い、０．５時間
攪拌した。この溶液をカラムに加え、重力で通過させた
（約２時間）。ここで真空をカラムの底にかけて、さら
に１時間（真空下で）流出を続けた。カラムをＨ₂Ｏ ２
５ｍＬで洗浄し、合わせた流出液を凍結乾燥して、Ｐn２
３Ｆ（Ｂｕ₄Ｎ⁺）塩０.５ｇを得た。これを真空デシケ
ーター中Ｐ₂Ｏ₅上で約１７時間保存した。

【００５８】ｃ． Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓの１,４−ブタン
ジアミン誘導体（Ｐｎ２３Ｆ-ＢｕＡ₂） の製造： 上記工程ｂからのＰn２３Ｆ（Ｂｕ₄Ｎ⁺）０.５ｇをジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２５ｍＬで被い、１５分
間攪拌して溶解した。これにカルボニルジイミダゾール
（ＣＤＩ）２２ｍｇを加え、得られた液を室温で０.５
時間攪拌した。Ｈ₂Ｏ ３２ｍＬ中に１,４−ブタンジア
ミンジヒドロクロリド（ＢｕＡ₂・２ＨＣｌ）５０７ｍ
ｇを含む溶液を調製し、ｐＨを２．５Ｎ ＮａＯＨで１
０．２３に調節した。この溶液をＭillex ０．２μｍＧ
Ｖフィルターで濾過し、氷浴中で冷却した。静置してお
いた上記ＤＭＳＯ溶液を冷ＢｕＡ₂ 溶液に加え、さらに
１時間氷浴中で攪拌した。次いでこれを室温で１時間静
置した後、溶液を１２インチのＳpectrapor 透析チュー
ブ２本に入れ、液面から上に１ｃｍのところをクリップ
でとめて、１）ｐＨ７.０の０.１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液１５Ｌで１６時間、２）ｐＨ７.０の０.０１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液１５Ｌで１０．５時間、３）ｐＨ
７.０の０.０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で１２．５時
間、４）Ｈ₂Ｏ １５Ｌで１０．５時間の順に透析を行っ
た。次いでこれを凍結乾燥してＰｎ２３Ｆ−Ｐｓの１，
４−ブタンジアミン誘導体（Ｐｎ２３Ｆ-ＢｕＡ₂）２２
０ｍｇを得た。約６．９ｍｇのＮＭＲスペクトルは多糖
１００繰り返し単位当り約２３．５個のブタンジアミン
残基の“負荷”をしめし、これはブタンジアミンメチレ
ンおよび（Ｐｎ２３Ｆの）ラムノースメチルの共鳴の積
分値の比較により特徴づけられた。

【００５９】ｄ． Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓのブロモアセチル
化ブタンジアミン誘導体（Ｐｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂−Ｂｒ
Ａｃ）の製造： Ｐｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂−（２１４ｍｇ）をｐＨ９．０の
０.１Ｍホウ酸塩−リン酸塩緩衝液２３ｍＬで被い、３
０分間攪拌して溶液を得た。次に、アセトニトリル６ｍ
Ｌ中のｐ−ニトロフェニルブロモアセテート２３０ｍｇ
を加えた。得られた混合物を４℃で２３時間攪拌した。
次いで、Ｓpectrapor２チューブ内で、１）Ｈ₂Ｏ １５
Ｌで８時間、２）Ｈ₂Ｏ １５Ｌで１２時間、３）Ｈ₂Ｏ
１５Ｌで６時間透析した。透析後のバッグ内容物から
１．５ｍＬを評価用にとっておき、ｐＨ８．０のリン酸
塩緩衝塩乾燥物（ｐＨ８.０の０.１Ｍリン酸ナトリウム
溶液を凍結乾燥して調製）４９０ｍｇを加えた。溶解に
は約１５分間を要し、その後０．２μｍＣorning フィ
ルターで濾過してｐＨ８．０のＰｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂−
ＢｒＡｃ水溶液を得た。

【００６０】ｅ． ＯＭＰＣとＰｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂−
ＢｒＡｃ−Ｐｓとの結合： ＯＭＰＣ（３．１ｍｇ／ｍＬ）６０ｍＬを１０ｍＬ遠心
チューブ６本に入れ、Ｂeckman ８０ Ｔｉ ローター中
にて４３,０００ｒｐｍ（４３Ｋ）、４℃で２時間遠心
した。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
塩）２６０ｍｇおよびジチオトレイトール（ＤＴＴ）５
２ｍｇをＮａ₂Ｂ₄Ｏ₇ 緩衝液３０ｍＬに溶解してチオー
ル化混合物を調製し、チオラクトンを加えた後に溶液を
０．２μｍＣorning フィルター（カップ型）で濾過し
た。上記遠心からの各ペレットを濾過したチオール化混
合物３ｍＬを用いてそれぞれ取り出し（全量２０ｍ
Ｌ）、Ｄounce ホモジナイザーに移して再懸濁した。各
チューブにさらに６ｍＬのチオール化溶液を順に移動さ
せてそれらを洗浄した。この洗浄法をさらに４ｍＬのチ
オール化溶液を用いて繰り返した。合わせた洗浄物をＤ
ounce でホモジナイズし、再懸濁物の全量（２８ｍＬ）
を１００ｍＬ丸底フラスコに移した。隔膜でシールし、
Ｆirestone バルブを用いて空気をＮ₂で置換した後、反
応混合物を１９時間静置した。この反応混合物２８ｍＬ
を３本の遠心チューブに分け、それぞれの上に１Ｍリン
酸カリウム（水溶液）を加えて、Ｂeckman ８０Ｔｉロー
ター中、４３Ｋｒｐｍおよび４℃で２時間遠心した。上
澄液を除去し、ペレットをｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液に再懸濁した（最終再懸濁物の全量は
３０ｍＬ）。第２の超遠心（２時間、４℃、４３Ｋｒｐ
ｍ）を次に行った。上澄液を除去した後、Ｄounce 法に
よりペレットを濾過したＰｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂−ＢｒＡ
ｃ溶液（７．１．Ｃ．３ｄで調整したもの）中に再懸濁
した。この時点でのＥllman 検定は、得られた溶液中に
全部で約２８マイクロモルのチオールが存在することを
示した。Ｐｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃ溶液の濾過は
チオール化蛋白の再懸濁の直前に行っている点に注意さ
れたい。生ずる反応（すなわちＰｎ２３Ｆ−ＢｕＡ₂−
ＢｒＡｃとチオール化ＯＭＰＣとの反応）はＮ₂ボック
ス内、Ｎ₂下（脱気）、室温にて１１７時間エージング
した。次いで反応を以下のように封止した（すなわちＰ
ｎ２３Ｆ−ＰｓおよびＯＭＰＣ上の反応部位を不活性化
する）。ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
５ｍＬ中にＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）７５ｍｇを
含む溶液を０．２２μｍフィルターで濾過し、反応物に
加え、１８時間エージングした。封止した結合体混合物
の全量は３８．５ｍＬであり、ｐＨ８．０の０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液１．５ｍＬを加えて全量を４０ｍ
Ｌとした。この溶液３５ｍＬを１０ｍＬ遠心チューブ４
本に均等に入れ、それぞれの上にｐＨ８の０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液を加えた。これらを４３Ｋｒｐｍ、
２時間、４℃で遠心した。上澄液を除去し、各ペレット
をＴＥＤ緩衝液（１Ｍトリス、ｐＨ８.５、０.０１Ｍ
ＥＤＴＡ、０．５％Ｎａデオキシコレート）８ｍＬで取
り出し、Ｄounce ホモジナイザーに移した。遠心チュー
ブをさらに８ｍＬのＴＥＤ緩衝液で順に洗浄し、ペレッ
トを再懸濁させて（全量４０ｍＬ）、室温にて２０時間
静置した。静置したものを１０ｍＬチューブ４本に入
れ、４３Ｋ、２時間、４℃で（上記と同様に）遠心し
た。上記と同様にして、各ペレットをＴＥＤ緩衝液８ｍ
Ｌで取り出し、チューブをＴＥＤ緩衝液８ｍＬで順に洗
浄し、再懸濁し、遠心した。これらのペレットをｐＨ７
の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液全量４０ｍＬに再懸
濁し、上記のように遠心した。得られたペレットを水全
量４４ｍＬに再懸濁し、４℃で１７時間静置した。少量
の不溶物を低速遠心（１０００ｒｐｍ、３５分）で除去
して上澄液中に生成物を得た。得られた上澄液が薬物の
バルク結合体ワクチンである。この結合体は次のような
分析特性を有していた。 試 験 結 果 ａ． Ｐｓ含量 ２８４ｍｃｇ／ｍＬ ｂ． 蛋 白 質 ２０２５ｍｃｇ／ｍＬ Ｐｓ／蛋白質（計算値） ０.１４ ｃ． 遊離Ｐｓ ＜５面積％ ｄ． アミノ酸分析 ＳＣＭＨＣ／リシン ６.７ ％ ＳＣＭＣ／リシン １.６ ％

【００６１】

【実施例８】Ｇaulin ホモジナイゼーションによるＰｎ−Ｐｓの製造： 粗ニューモコッカル粉末を水中１．５ｍｇ／ｍＬ濃度で
４℃にて一晩混合することにより溶解した。より濃縮し
たＰｎ-Ｐｓ溶液も１０ｍｇ／ｍＬで調整した。５０ｍ
Ｍ ＣａＣｌ₂ の添加により、１０ｍｇ／ｍＬ溶液の粘
度を１.５ｍｇ／ｍＬ溶液の粘度まで有効に低下させる
ことができた。次いで、溶解したＰｎ−Ｐｓを、４種類
の圧力設定２０００、５０００、１００００あるいは１
５０００ＰＳＩのうちの１つに設定されたＧaulin ホモ
ジナイザーに通した。剪断されたＰｎ−Ｐｓを６０％イ
ソプロパノールの添加により捕集し、ＣａＣｌ₂ （２Ｍ
ストックからのもの）中５０ｍＭとした。ペレットをオ
ムニミキサー中１００％エタノールで洗浄し、濾過して
沈殿したＰｎ−Ｐｓを回収した。Ｐｎ−Ｐｓはフィルタ
ー上にてアセトンで洗浄し、ＣａＳＯ₄ （ドライヤライ
ト）上で乾燥し、分析するまで−７０℃で保存した。剪
断されたＰｎ−Ｐｓを少量ずつ分取して約１ｍｇ／ｍＬ
で再懸濁させ、分子サイズおよび多分散度についてはＨ
ＰＳＥＣ−ユニバーサルキャリブレーション、抗原性指
数についてはレート比濁法（rate nephelometry）で分
析した。 Ｐｎ−Ｐｓ 抗原性が低下 多分散度 サブタイプ し始めるＭＷ ６Ｂ ５００,０００ １.１９ １４ ３００,０００ １.１５ １９Ｆ ２５０,０００ １.０９ ２３Ｆ ２５０,０００ １.１５

【００６２】

【実施例９】マウスＴ細胞刺激： この試験は、Ｐｎ−Ｐｓ結合体ワクチンのマウスにおけ
るＴ細胞依存性／Ｔ免疫原性を確立するために行った。
このモデルを採用したのは、２歳未満の子供はＴ依存性
抗原に通常よく応答するからである。無胸腺マウスは異
常な胸腺上皮を有し、それゆえＴ依存性抗原に対するそ
れらの応答は、正常な同属同腹子よりも著しく低い。ワ
クチンを１回で希釈して多糖の投与量０．５μｇとした
ものを、アダルト無胸腺マウス群（ｎｎ／ｎｎ）および
それらの同属対照同腹子群（ｎｎ／＋）に対して、０日
目、７日目、２８日目に腹膜内注射した。マウスは１週
間後に採血し、それぞれの血清についてラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）で抗体応答を調べた。ＲＩＡにおい
て、各マウス血清をＣ¹⁴で標識したＰｎ−Ｐｓと合わせ
た。次いで、生成した抗原抗体複合体は飽和硫酸アンモ
ニウムを添加して沈殿させた。処理した試料のそれぞれ
についてベータカウンターで１分間計数した。本発明の
Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１４−Ｐｓ−ＯＭＰ
Ｃ、およびＰｎ２３Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ結合体をこのよ
うにして試験し、Ｎｕ／＋Ｔマウスにおいて良好なＴ細
胞刺激を引きおこすことがわかった。

【００６３】

【実施例１０】アカゲザル幼獣におけるＰｎ−Ｐｓ結合体の免疫原性： この試験は、Ｐｎ−Ｐｓ−ＯＭＰＣまたはＰｎ−Ｐｓ−
ＭＩＥＰ結合体ワクチンのバルク結合体または容器充填
物の幼猿における免疫原性を確立するために行う。この
幼猿モデルはＰedvax ＨＩＢ（商標）結合体ワクチンの
ためのすぐれた臨床予測試料であることが示されており
〔Ｖellaら、Ｐediatrics（小児科学）、４月５日補、
６６８−６７５頁（１９９０年）〕、そのためＰｎ−Ｐ
ｓ結合体ワクチンの評価のためのモデルとして選ばれた
ものである。投与量のワクチンを月令２箇月ないし３箇
月の幼猿に０日目および２８日目に筋肉内注射する
（０．２５ｍＬずつ２箇所）。猿は０日目、２８日目お
よび４２日目に採血し、それぞれの血清についてラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）で抗体応答を調べる。ＲＩＡ
において、それぞれの猿血清はＣ¹⁴で標識したＰｎ−Ｐ
ｓと合わせる。生成した抗原抗体複合体は、次いで飽和
硫酸アンモニウムを加えて沈殿させる。それぞれ処理し
た試料はベータカウンターで１分間計数する。ワクチン
に対する免疫原性応答は、もし試験動物の少なくとも５
０％が２回のワクチンの投与を受けた後に少なくとも１
μｇ抗体応答を有すれば満足できるものである。Ｐｎ６
Ｂ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐ
ｎ１９Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣおよびＰｎ１４−Ｐｓ−ＯＭ
ＰＣは、強い抗型特異性抗体応答をひき起こすことがわ
かった。加えて、Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ２３
Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ、Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ−ＯＭＰＣおよ
びＰｎ１４−Ｐｓ−ＯＭＰＣから成る４価組成物は、４
種の血清型すべてに対して良好な抗Ｐｎ−Ｐｓ抗体応答
を示した。

【００６４】

【実施例１１】チンチラにおけるニューモコッカル結合体の保護的効果： 各チンチラに対し、Ａｌ（ＯＨ）₃に吸着させた０μ
ｇ、０．２５μｇ、１.０μｇまたは４．０μｇのＰｎ
６Ｂ−Ｐｓ−ＯＭＰＣを皮下もしくは筋肉内注射した。
チンチラは０週目、２週目、４週目、６週目および８週
目に採血した。注射の８週間後にこれらの動物に対して
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pn
eumoniae）６Ｂを攻撃させ、検耳法（otoscopy）と鼓室
測定（tympanometry）で１〜３日ごとにモニターした。
中耳浸出液を吸引して培養し、攻撃２週間後に動物を殺
した。殺した動物について中耳の組織病理分析を行っ
た。結合体を受けていない動物の致死率は６０％であっ
たのに対し、最低投与量の場合でも致死率は０％であっ
た。結合体を受けていない動物における化膿性中耳炎に
対しては保護はなかったのに対し、結合体を受けたもの
はすべての投与範囲にわたって６０ないし１００％の水
準で保護された。

【００６５】

【実施例１２】２〜５歳の子供における抗ニューモコッカル免疫応答 Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓを０．５μｇまたは５μｇずつ２回投与
した２〜５歳の子供について、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ
により抗Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ抗体の産生を調べた。抗Ｐｎ６
Ｂ−Ｐｓ抗体の著しい上昇が観察された。

【００６６】

【実施例１３】ニューモコッカル多糖のレート比濁測定 この検定の目的は、遊離Ｐｎ−Ｐｓおよび結合体調製物
の多糖含量および抗原性指数を、レート比濁法を用いて
測定することである。レート比濁法の標準曲線の範囲
は、単位Ｐｎ−Ｐｓ質量当りの応答として種々のＰｎ−
Ｐｓについて異なり、またＰｎ−Ｐｓ抗原濃度プロフィ
ールに対する応答の直線部分はそれぞれのＰｎＰｓにつ
いて異なる。ここに例示する手法はＰｎ６Ｂ結合体につ
いてのものであり、他のＰｎ−Ｐｓ型結合体には必ずし
も適用できるわけではない。また、アルミに吸着した試
料およびそれらについての各標準物は、以下に示すよう
な０．９％ＮａＣｌではなく３％クエン酸ナトリウムで
稀釈される。水性の結合体および標準物（すなわちアル
ミ上のものでないもの）は０．９％ＮａＣｌで希釈し、
さらに標準曲線の限界内にあると予想される所定濃度ま
で希釈される。

【００６７】 Ａ）試薬 食塩水：０．９％ＮａＣｌ水溶液 抗Ｐｎ−Ｐｓ血清：抗血清（Ｈealth Ｒesearch,Ｉｎ
ｃ., Ａlbany, ＮＹ）を食塩水で３０倍に希釈する。 標準物：１．０、１．５、２．０、２．５、３．０およ
び４．０ｍｃｇ／ｍＬのＰｎ−Ｐｓ結合体標準物を３８
７μｇ／ｍＬのストック溶液から調製する。ストック溶
液の濃度は多糖に対するフェノール硫酸検定で測定し
た。 試験用試料：クエン酸ナトリウムストック液においてク
エン酸ナトリウムの濃度が最終的に３％となるように調
製し、試験用試料の順に希釈して１.０、２.０および
３．０ｍｃｇ／ｍＬのＰｎ−Ｐｓ理論濃度とする。

【００６８】 Ｂ）操作 すべての試料および標準物をBeckman ＩＣＳレート比濁
計を用いて重複測定により検定する。標準曲線から試料
中の濃度を定める。試料濃度に希釈率を乗じ、各試料に
ついて値を平均する。上記したように、この方法で抗原
性指数が７０％より低いとわかったものは結合体形成か
ら除外し、用いられるＰｎ−Ｐｓが所望の免疫学的特性
を有するようにする。

【００６９】

【実施例１４】ナイセリア メニンジチディスＢ１１抗原型 ２ ＯＭＰＣの調製 Ａ． 醗酵

【００７０】 １．ナイセリア メニンジチディスグループＢ１１ ナイセリア メニンジチディスの凍結乾燥培養物を含む
管（ドクター エムアーテンシュタイン（Dr. M. Arten
stein）、ワルター リード アーミー インスティテュ
ート オブ リサーチ（Walter Reed Army Institute o
f Research（ＷＲＡＩＲ）、ワシントンＤ．Ｃ．）を開
封し、ユーゴンブロス（Eugonbroth（ＢＢＬ））を添加
した。培養物をミュエラーヒントン（Mueller Hinton）
寒天の斜面に画線培養し、５％ＣＯ₂下３７℃で３６時
間インキュベートし、この時に、この増殖物を１０％ス
キムミルク培地（Difco）中へ採収し、一部分を−７０℃
で凍結した。この微生物の同定はＷＲＡＩＲにより提供
される特異的抗血清との凝集及びＤifcoにより提供され
る血清の型を検査することにより確認した。第２通路か
らの培養物のビンを解凍しコロンビア羊血寒天プレート
（ＣＢＡＢ−ＢＢＬ）上に画線培養した。このプレート
を５％ＣＯ₂下 ３７℃で１８時間インキュベートし、こ
の後、この増殖物を１０％スキムミルク培地１００ｍｌ
中へ採収し、一部分を０．５ｍｌ量採り−７０℃で凍結
した。この微生物は特異的抗血清との凝集、糖化発酵及
びグラム染色によりプラスであると同定した。この通路
からの培養物のビンを解凍し、ミユエラーヒントンブロス
で希釈し４０ミュエラーヒントン寒天プレート上に画線
培養した。このプレートを６％ ＣＯ₂下３７℃で１８時
間インキュベートし、この後、この増殖物を１０％スキ
ムミルク培地１７ｍｌ中へ採収し、一部分を０．３ｍｌ
量採り−７０℃で凍結した。この微生物はグラム染色、
特異的抗血清との凝集及びオキシダーゼ試験によりプラ
スであると同定した。

【００７１】 ２．発酵及び細胞ペーストの採集 ａ．接種原発育 接種原をナイセリア メニンジチディ
スグループＢ、上記からのＢ−１１（通路４）の一つの
凍結ビンから発育させた。１０個のミュエラーヒントン
寒天斜面に接種し、約１８時間後に６個を採集し、ｐＨ
６．３５のゴットシュリッヒ酵母透析培地の３×２５０
ｍｌフラスコに対する接種原として使用した。ＯＤ₆₆₀
を０．１８に調整しＯＤ₆₆₀が１〜１．８の間になるま
でインキュベートした。この培養物１ｍｌを５×２リッ
ター、エルレンメイヤーフラスコ（各々１リッターの培
養液をを含む；下記参照）の接種に使用し振盪機中２０
０ｒｐｍ、３７℃でインキュベートした。このＯ．Ｄ．
を接種後一時間毎にモニターした。４リッターのブロス
培養物は、ＯＤ₆₆₀が１．２８であった。 ７０リッター種子発酵槽 約４リッターの種子培養物を約４０リッターの完全産生
培地（下記参照）を含む滅菌７０リッター発酵槽の接種
に使用した。７０リッター発酵の条件は、３７℃、毎分
１０リッターでの空気散布１８５ｒｐｍ、ｐＨ約７．０
の一定ｐＨ下、約２時間であった。このバッチに対する
最終ＯＤ₆₆₀は２時間後で０.７３２であった。 ８００リッター産生発酵槽 約４０リッターの種子培養物を５６８.２リッターの完
全産生培地（下記参照）を含む滅菌８００リッター発酵
槽の接種に使用した。このバッチを、３７℃、毎分６０
リッターでの空気散布１００ｒｐｍ、ｐＨ７．０の一定
ｐＨ下でインキュベートした。このバッチに対する最終
ＯＤは接種後１３時間で５.５８であった。

【００７２】３．エルレンメイヤーフラスコ、７０−及
び８００−リッター発酵槽に対する完全培地 ──────────────────────────────────── 画 分 Ａ ｇ／リッター ──────────────────────────────────── Ｌ−グルタミン酸 １．５ ＮａＣｌ ６．０ Ｎａ₂ＨＰＯ₄（無水） ２．５ ＮＨ₄Ｃｌ １．２５ ＫＣｌ ０．０９ Ｌ−システインＨＣｌ ０．０２ ──────────────────────────────────── 画分Ｂ（ゴットシュリッヒ酵母透析物） １２８０ｇのディフコ酵母エキスを６．４リッターの蒸
留水に溶解した。この溶液を３個のＨ１０ＳＭカートリ
ッジを有する２アミコンＤＣ−３０ホローファイバー透
析機で透析した。３８４ｇＭｇＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ及び３２０
０ｇデキストロースをこの透析物に溶解させ、全容量を
蒸留水で１５リッターにした。このｐＨをＮａＯＨで
７．４に調整し、０．２２μフィルターに通過させて滅
菌し、画分Ａを含む発酵槽に移した。 エルレンメイヤーフラスコ：１リッターの画分Ａ及び２
５ｍｌの画分Ｂを添加し、このｐＨをＮａＯＨで７．０
〜７．２に調整した。 ７０リッター発酵槽：４１．８リッターの画分Ａ及び９
００ｍｌの画分Ｂを添加し、このｐＨをＮａＯＨで７．
０〜７．２に調整した。 ８００リッター発酵槽：５５３リッターの画分Ａ及び１
５．０リッターの画分Ｂを添加し、このｐＨをＮａＯＨ
で７．１〜７．２に調整した。 ｂ．採収及び不活性化 発酵終了後、フェノールを別の容器に添加し、そこへ細
胞ブロスを移し、最終フェノール濃度を約０．５％にし
た。培養物がもはや生育しなくなるまで（約２４時間）
この物質を弱く攪拌しながら室温に保持した。 ｅ．遠心分離 ４℃で約２４時間後、６１４．４リッターの不活性培養
液をシャープレス継続流動遠心機で遠心分離した。フェ
ノール処理後の細胞ペーストの重量は３．８７５ｋｇで
あった。更にフェノールで中和した発酵ブロスは以下に
記載する透析濾過により採収した。

【００７３】 Ｂ．ＯＭＰＣ分離 工程１．濃縮及び透析濾過 フェノールで不活性化した培養物を約３０リッターに濃
縮し０．２μｍホローファイバーフィルター（ＥＮＫ
Ａ）を使用して滅菌蒸留水で透析濾過を行った。 工程２．抽出 等量の２Ｘ ＴＥＤ緩衝液（０.１Ｍ トリス、０．０
１Ｍ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ８．５、０．５％ナトリウ
ム デオキシコレート）を濃縮した透析濾過細胞に添加
した。この懸濁物をＯＭＰＣ抽出用の温度制御したタン
クに５６℃で攪拌しながら３０分にわたり移した。この
抽出物をシャープレス継続流動遠心機で流速約８０ｍｌ
／分、約４℃、約１８０００ｒｐｍで遠心分離した。次
いで、粘性の上清液を集め４℃で保存した。この抽出し
た細胞ペレットを前記したようにＴＥＤ緩衝液で再抽出
した。上清液を合わせ４℃で保存した。 工程３．限外濾過による濃縮 合わせた抽出物をＡＧ−Ｔｅｃｈ０．１μｍポリスルホ
ンフィルターに取り付けた温度制御した容器に移した。
抽出物の温度は濃縮工程において容器中２５℃に保っ
た。この試料を平均膜内外圧１１〜２４ｐｓｉの間で１
０倍濃縮した。 工程４．ＯＭＰＣの採集及び洗浄 工程３からの保有物を流速３００〜５００ｍｌ／分の間
で継続流動遠心機で約１６００００ｘｇ（３５０００ｒ
ｐｍ）、約７０℃で遠心分離し上清液を捨てた。 この
ＯＭＰＣペレットをＴＥＤ緩衝液（１９０ｍｌ緩衝液；
２０ｍｌ／ｇペレット）に懸濁させ、工程２及び工程４
を２回繰り返した（工程３省略）。 工程５．ＯＭＰＣ産生物の回収 工程４からの洗浄したペレットを１００ｍｌ蒸留水に懸
濁させガラス棒及びダウンスホモゲナイザー（Dounce h
omogenizer）で完全な懸濁物とした。次いでこの水性Ｏ
ＭＰＣ浮遊物を０．２２μｍフィルターを通過させるこ
とによりフィルター滅菌し、０．１μｍホローファイバ
ーフィルターを使用して滅菌蒸留水にさらす透析濾過に
よってＴＥＤ緩衝液を水で置換した。

【００７４】

【実施例１５】ＯＭＰＣのサブユニットの精製 ポリアクリルアミドゲルによるＯＭＰＣあるいはリコン
ビナント細胞からの精製ＭＩＥＰの調製 アクリルアミド／ＢＩＳ（３７．５：１）ゲル、１８×
１４ｃｍ、３ｍｍ厚を使用した。スタッキングゲルは４
％ポリアクリルアミドであり、分離ゲルは１２％ポリア
クリルアミドであった。約５μｇのＯＭＰＣ蛋白あるい
はリコンビナント宿主細胞蛋白をゲル当り使用した。１
ｍｌのＯＭＰＣに試料緩衝液（４％グリセロール、３０
０ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭトリス、０.００１％ブロモ
フェノールブルー、ｐＨ７．０）０．５ｍｌを添加し
た。この混合物を２０分間１０５℃に加熱し、ゲルに載
せる前に室温に冷却した。ブロモフェノールブルーがゲ
ルの底部に到達するまで、冷却しながら２００〜４００
ミリアンプでゲルを作動させた。ゲルの垂直片を切り出
し（約１−２ｃｍ幅）コマッシー／酢酸銅（０.１％）
で染色した。ＭＩＥＰバンド（約３８ＫＤ）が見えるま
でその切片から汚れを取り除いた。次いでその切片を元
のゲル位置に置きＭＩＥＰ領域をゲルの残部からメスで
摘出した。この摘出領域を正方形に切り（約５ｍｍ）、
０．０１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．１で溶出させた。溶
出の２サイクル後、溶出物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで
評価した。この溶出物を溶出物の共通プールと合わせ４
８時間６０ｍＭアンモニア−蟻酸、ｐＨ１０で透析し
た。別法として、溶出した蛋白は水中の５０％酢酸で透
析することができる。透析後溶出した蛋白を蒸発乾固し
た。この物質をＰＤ１０サイズカラム（ファルマシア、
ピスキャタウエイ、ニュージャージー州）に通過させて
更に精製し、室温で保存した。

【００７５】

【実施例１６】Ｐｎ−Ｐｓ調製物中のＣ−ポリサッカライド含有量の定量測定 ＮＭＲ、酵素又はクロマトグラフによる方法に基づいて
いくつかのシステムがＣ−ポリサッカライドの定量のた
めに開発されている。この場合においては、加水分解さ
れたＰｎ−Ｐｓのサンプルからの塩素（Ｃ−Ｐｓの成
分）のクロマトグラフ分離を利用し、これらの他の方法
と比較した。塩素を下位伝導度検出（suppressed condu
ctivity detection）と 組合せたカチオン交換カラムに
おいて分離した。Ｐｎ−Ｐｓのサンプルを、４５〜６５
℃で２時間３６％フッ化水素酸で処理した後、１００℃
で１６時間２Ｍトリフルオロ酢酸で処理することによっ
て完全に加水分解する。加水分解に次いで、２００〜３
００μｇのサンプルをDionex BioＬＣクロマトグラフィ
ーシステムに注入した。このシステムは Ｏmnipac ＰＣ
Ｘ−５００分析及びガードカラム、Ｉｏｎ Ｐａｃ Ｃ
ＴＣ−１カチオントラップカラム、ＣＭＭＳ−２ミクロ
メンブラン サプレッサー（５０ｍＭテトラブチルアン
モニウムハイドロオキサイド（１０ｍｌ／ｍｉｎ）で再
生された）、及び１μジーメン（Siemen）の感度にセッ
トされた伝導度検出計を持っている。５％２００ｍＭ
ＨＣｌ、５％ ２０％アセトニトリル、８５％ Milli Q
water（逆浸透水）、５％ ２０ｍＭジアミノプロピオン
酸を平等に使用してサンプルを溶出した。塩素は、約１
０分後にシャープなピークとして溶出した。精製Ｃ−Ｐ
ｓ（Statens Serum Institutから得られた）を、この方
法を使用して塩素含有量について分析し、５．４重量％
塩素の値を得た。この値はＣ−Ｐｓの塩素含有量の公表
された報告と一致している。このファクターを使用し
て、ＨＰＬＣによって得られた塩素のナノモル量を質量
値に換えることによってＰｎ−Ｐｓ調製物の種々なサン
プル中のＣ−Ｐｓ濃度を計算した。重量で５．４％塩素
の変換を利用して、Ｃ−Ｐｓの質量を重量で計算した。
３％を越えるＣ−Ｐｓ濃度を有するサンプルは結合のた
めに許容できないので排除した。次の表はＮＭＲ及び酵
素による方法とこの方法の相互関係を示し、そして純度
が変化するＰｎ−Ｐｓ調製物の典型的なＣ−Ｐｓ汚染水
準を示す。 サンプル ＮＭＲ 酵素 ＨＰＬＣ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ ２０％ Ｎ．Ｄ． １８.４％ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ １.６％ ０.３−１.０％ １.２％ Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ Ｎ．Ｄ． ２.８％ ３.７％ Ｐｎ１４−Ｐｓ ２.９％ ２.４％ ３.２％ Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ ２.７％ ２.６％ ２.６％

【００７６】

【実施例１７】ＭＩＥＰをコードするゲノムＤＮＡのクローニング フェノールで不活性化したＮ．メニンギチジス（mening
itidis）細胞（実施例１参照）を約０．１ｇ新しいチュ
ーブにとる。このフェノールで不活性化した細胞をＴＥ
緩衝液〔１０ｍＭ ＴＲｌＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０〕５６７μＬに再懸濁する。この再懸濁
した細胞群に１０％ＳＤＳを３０μＬ、および２０ｍｇ
／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｓigma）を３μＬ加えた。
細胞群を混合し、３７℃で約１時間培養した後、５Ｍ
ＮａＣｌ を１００μＬ加えて十分に混合した。次いで
０.７Ｍ ＮａＣｌ中の１％臭化セチルトリメチルアンモ
ニウム（ＣＴＡＢ）を８０μＬ加えて十分に混合し、６
５℃で１０分間培養した。等体積（約０.７〜０.８ｍ
Ｌ）の クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：
１）を加えて十分に混合し、約１０,０００ｘｇで約５
分間遠心した。水性相（上層）を新しいチューブに移
し、有機相を廃棄した。等体積のフェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を上記
水性相に加えて十分に混合し、１０，０００ｘｇで約５
分間遠心した。水性相（上層）を新しいチューブに移
し、０．６体積（約４２０μＬ）のイソプロピルアルコ
ールを加えて十分に混合し、沈殿したＤＮＡを１０,０
００ｘｇで１０分間遠心した。上澄液を廃棄し、ペレッ
トを７０％エタノールで洗浄した。このＤＮＡペレット
を乾燥し、ＴＥ緩衝液１００μＬに再懸濁した。これは
Ｎ．メニンギチジス（meningitidis）のゲノムＤＮＡで
ある。ＭＩＥＰ遺伝子の５’末端およびＭＩＥＰ遺伝子
の３’末端に対応する２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド
を合成した〔Murakami, E. C. ら、（１９８９）、Infe
ction and Immunity（感染と免疫）、５７、２３１８−
２３頁〕。ＭＩＥＰ遺伝子の５’末端に特徴的なＤＮＡ
オリゴヌクレオチドの配列は、 ５’−ＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧ−３’ であり、ＭＩＥＰ遺伝子の３’末端に特徴的な配列は、 ５’−ＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴ−３’ であった。これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、１０
ナノグラムのＮ．メニンギチジス（meningitidis）のゲ
ノムＤＮＡを用いるＭＩＥＰ遺伝子のポリメラーゼ鎖伸
長反応（ＰＣＲ）増幅のためのプライマーとして用い
た。ＰＣＲ増幅工程はメーカー（Perkin Elmer）による
操作手順に従って行った。増幅したＭＩＥＰ ＤＮＡを
次に制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。Ｍ
ＩＥＰを完全にコードする領域を含む１．３キロベース
（ｋｂ）ＤＮＡ断片を１.５％アガロースゲル上の電気
泳動で単離し、電気溶出（electroelution）でゲルから
回収した〔Current Protocols in Molecular Biology
（分子生物学における最近の方法）、（１９８７）、Aus
ubel，R. M., Brent, R., Kingston,R.E., Moore, D.
D., Smith, J.A., Seidman, J. G. および Struhl, K
著、Greene Publishing Assoc.〕。プラスミドベクター
ｐＵＣ−１９をＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
ゲル精製したＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ ＭＩＥＰ ＤＮＡ
を ＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩｐＵＣ−１９ベクターに連結
し、これを用いてＥ．コリ（coli）ＤＨ５株の形質転換
を行った。ｐＵＣ−１９ベクターと１．３ｋｂｐ ＭＩ
ＥＰ ＤＮＡを含む形質変換体は制限酵素地図により同
定し、ＭＩＥＰ ＤＮＡの配列決定によりその同一性を
保証した。

【００７７】

【実施例１８】ｐＣ１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔベクターの構成 Ｇａｌ １０プロモーターを、Ｓａｎ ３Ａ及びＨｉｄ
IIIでの切断後に得られた０．５キロ塩基対（ｋｂｐ）
をゲル精製することによってプラスミドＹＥｐ５２〔Br
oach等、（１９８３）遺伝子発現の実験操作（Experime
ntal Manipulation of Gene Expression,イノウエ（Ino
uye）、Ｍ（Ｅｄ）Academic Press ８３〜１１７ペー
ジ〕から分離した。ＡＤＨＩターミネーターを、Ｈｉｎ
ｄ III及びＳｐｅ Ｉでの切断によって得られた０.３５
ｋｂｐ断片をゲル精製することによってベクターｐＧＡ
Ｐ．ｔＡＤＨ２〔Kniskern 等、（１９８６）、遺伝子、
第４６巻、１３５〜１４１ページ〕から分離した。２つ
の断片を、親ベクターｐＧaｌ１０−ｔＡＤＨ１を造る
ためにＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで切断されたゲル精製ｐ
ＵＣ１８ΔＨｉｎｄ IIIベクター（Ｈｉｎｄ IIIでｐＵ
Ｃ１８を消化し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノウ断片でブラントエンドにし そしてＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで結合することによって、ヒンドIIIサイト
を除去した）に Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合した。 これ
は、Ｇａｌ １０ｐ．ＡＤＨＩｔ接合部に唯一のＨｉｎ
ｄ III クローニンクグサイトを持っている。そのｐＧ
ａｌ １０．ｔＡＤＨ１の唯一のＨｉｎｄ IIIクローニ
ングサイトを、Ｈｉｎｄ IIIでｐＧａｌ１０．ｔＡＤＨ
１を切断し、そのカットＤＮＡをゲル精製し、そしてＴ
４ ＤＮＡリガーゼを使用して次のＨｉｎｄ III−Ｂａ
ｍＨＩリンカーに結合することによって唯一のＢａｍＨ
Ｉクローニングサイトに変えた。 ５’−ＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧ−３' ３’−ＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡ−５’ 得られたプラスミドｐＧａｌ １０（Ｂ）ｔＡＤＨ１は
Ｈｉｎｄ III サイトが除去され、唯一のＢａｍＨＩク
ローニングサイトを生じた。そのＧａｌ １０ｐ.ｔＡＤ
Ｈ１断片を、Ｓｍａ Ｉ及びＳｐｈ Ｉでの切断によって
ｐＧａｌ １０（Ｂ）ｔＡＤＨ１から分離し、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼでブラントエンドにし、そしてゲル精製
した。酵母シャトルベクターｐＣ１／１〔Brake 等、
（１９８４）、Proc. Nat'l. Acad. Sci. ＵＳＡ、第８
１巻、４６４２〜４６４６ページ〕をＳｐｈ Ｉで切断
し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドにし、そ
して精製した。この断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼでベク
ターに結合した。次に、この接合反応混合物を使用して
Ｅ．ｃoli ＨＢ１０１細胞をアンピシリン耐性に形質転
換し、形質転換体を、³²ＰでラベルしたＨｉｎｄ III−Ｂ
ａｍＨＩリンカーの一本鎖へのハイブリット形成によっ
てスクリーニングした。この新しいベクターの構成ｐＣ
１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔは ＨｉｎｄII
I及びＢａｍ ＨＩでの切断によって確認された。

【００７８】

【実施例１９】ＭＩＥＰ＋リーダーＤＮＡ配列を有する酵母ＭＩＥＰ発現ベクターの構成 ＭＩＥＰの完全なコード域を含むＤＮＡ断片を、Ｓｐｅ
Ｉ及びＥｃｏＲ ＩでのｐＵＣ１９．ＭＩＥＰ＃７の切
断によって生成し、そのＭＩＥＰ ＤＮＡをゲル精製
し、そしてＴ４ＤＮＡでブラントエンドにした。酵母内
発現ベクターｐＣ１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ
１ｔをＢａｍ ＨＩで切断し、子ウシ腸アルカリホスフ
ァターゼで脱リン酸し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
でブラントエンドにした。そのＤＮＡを、未切断ベクタ
ーを除去するためにゲル精製した。ＭＩＥＰの１．１ｋ
ｂｐブラントエンド断片をブラントエンドｐＣ１／１．
Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔベクターに結合し、その
結合反応混合物を用いてコンピテントなE．coli ＤＨ５
細胞アンピシリン耐性に形質転換した。形質転換体を³²
ＰでラベルしたＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’．．．
ＡＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＴ
Ｇ．．．３’）へのハイブリッド形成によってスクリー
ニングした。このオリゴヌクレオチドはＭＩＥＰベクタ
ー結合部に重さなる配列と相同するようにデザインされ
ている。ＤＮＡの調製物をハイブリッド形成が陽性の形
質転換体から作り、Ｋｐｎ Ｉ及びＳａｌ Ｉで切断して
ＭＩＥＰ断片がＧaｌ １０プロモーターから、発現のた
めの正しい配向にあることを確認した。さらに、Ｇaｌ
１０プロモーターからＭＩＥＰコード域へのジデオキシ
配列決定によってＤＮＡ構成の確証を得た。形質転換体
によるＭＩＥＰの発現をウエスタン ブロットによって
検出した。形質転換体において産生された組換え型のＭ
ＩＥＰは、ポリアクリルアミドゲル上をＯＭＰＣベシク
ルから精製されたＭＩＥＰと共に移動した、そしてＭＩ
ＥＰに対して特異的な抗体と免疫学的に反応性であっ
た。

【００７９】

【実施例２０】５’−修飾ＭＩＥＰ ＤＮＡ配列を有する酵母ＭＩＥＰ発現ベクターの構成 Ｈｉｎｄ IIIサイト、保存酵母５'非翻訳リーダー（Ｎ
ＴＬ）、メチオニン スタート コドン（ＡＴＧ）、成熟
ＭＩＥＰの最初の８９個のコドン（位置＋２０でＡｓｐ
によって始まる）及び Ｋｐｎ Ｉサイト（位置＋８９）
を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ チェ
イン リアクション（ＰＣＲ）を利用して生成した。こ
のＰＣＲはプラスミドｐＵＣ１９ＭＩＥＰ４２＃７を鋳
型としてかつ次のオリゴマーをプライマーとして用い
て、製造業者（Perkin Elmer Cetus）によって説明され
たように行なわれた。 5'CTAAGCTTAACAAAATGGACGTTACCTTGTACGGTACAATT 及び 5'ACGGTACCGAAGCCGCCTTTCAAG3′． ＭＩＥＰクローンの５'域を除去するために、プラスミ
ドｐＵＣ１９ ＭＩＥＰ４２＃７をＫｐｎ Ｉ及びＨｉｎ
ｄ IIIで切断し、３.４ｋｂｐベクター断片をアガロー
スゲル精製した。２８０ｂｐＰＣＲ断片をＫｐｎ I及び
Ｈｉｎｄ IIIで切断し、アガロースゲル精製し、そして
３.４ｋｂｐベクター断片と結合した。Ｅ．coli ＨＢ１
０１（ＢＲＬ）の 形質転換体をＤＮＡオリゴヌクレオ
チドハイブリッド形成によってスクリーニングし、陽性
の形質変換体からのＤＮＡを制限酵素切断によって分析
した。変異がＰＣＲ工程の際に導入されていないことを
確かめるために、陽性形質転換体の２８０ｂｐのＰＣＲ
で生成されたＤＮＡを配列決定した。得られたプラスミ
ドは、酵母ＮＴＬ、ＡＴＧコドン、及びＡｓｐコドン
（アミノ酸＋２０）で始じまるＭＩＥＰの全オープン
リーディング フレーム（ＯＲＦ）からなるＨｉｎｄ II
I−Ｅｃｏ ＲＩ挿入断片を含む。酵母ＭＩＥＰ発現ベク
ターは次のように構成された。ｐＧＡＬ １０／ｐＣ１／
１及びｐＧＡＰ／ｐＣ１／１ベクター〔Vlasuk, G. P.
等、（１９８９）J. B.C., 第２６４巻、１２，１０６
〜１２，１１２頁〕をＢａｍ ＨＩで切断し、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウ断片でフラッシュエンドにし、そ
して子ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸した。
これらの直鎖ベクターを、処理したクレノウ及びゲル精
製した上記Ｈｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ断片（ｐＧａｌ
１０／ｐＣ１／１-ＭＩＥＰ及びｐＧＡＰ／ｐＣ１／１
−ＭＩＥＰを形成する酵母ＮＴＬ、ＡＴＧ及びＭＩＥＰ
のＯＲＦを含む）と結合した。サッカロミセス セレビ
シアエ（Ｓaccharomyces cerevisiae）株Ｕ９（ｇａｌ
１０ ｐｇａｌ ４−）をプラスミドｐＧａｌ １０／ｐ
Ｃ１／１で形質転換した。組換え型クローンを分離し、
ＭＩＥＰの発現について試験した。クローンを、３７℃
で約６.０のＯ.Ｄ.₆₆₀まで２％グルコース（w／v）を含
む合成培地中で振とうしながら成育した。次に、ガラク
トースを２％（w／v）に加えてＧaｌ １０プロモーター
からのＭＩＥＰ発現を誘発した。細胞を、約９.０のＯ.
Ｄ.₆₀₀までのガラクトース誘発に次いでさらに４５時間
成育した。その後、細胞を遠心によって収集した。細胞
ペレットを蒸留水で洗浄し、凍結した。

【００８０】組換え型ＭＩＥＰのウエスタン ブロット 酵母がＭＩＥＰを発現しているか否か調べるために、ウ
エスタン ブロット分析を行った。１２パーセント、１
ｍｍ、１０〜１５ウェルNovex Laemmli ゲルを使用し
た。酵母細胞を、水中でガラスビーズを用いて破砕した
（ナトリウム ドデシル サルフェート（ＳＤＳ）を破
砕工程に２％で使用することができる）。細胞破砕を、
１分間１０，０００ｘｇで遠心することによって除去し
た。上清を、ＭＩＥＰのポリアクリルアミドゲル精製に
ついて説明したように、サンプル ランニング バッフ
ァと混合した。サンプルを、３５ｍＡで、ＯＭＰＣを参
照対照として使用して、ブロモフェノール ブルー ダ
イ マーカーがゲルを流れ出るまで流した。タンパク質
を、ＮＯＶＥＸ転写装置を使用して、０．４５μポア
サイズ ニトロセルロース紙上に転写した。転写後、ニ
トロセルロース紙を、リン酸塩で緩衝した塩類液中５％
ウシ血清アルブミンで１時間ブロックし、その後、ラビ
ット抗−ＭＩＥＰ抗血清（標準手順を使用するゲル精製
ＭＩＥＰでの免疫化によって生成された）の１：１００
０希釈液の１５ｍｌを加えた。室温で一晩中インキュベ
ートした後、アルカリホスファーゼ複合ヤギ抗ラビット
ＩｇＧの１：１０００希釈液の１５ｍｌを加えた。２時
間インキュベートした後、ＦＡＳＴ ＲＥＤ ＴＲＳＡＬ
Ｔ（Sigma）及びナフトール−ＡＳ−ＭＸホスフェート
（Sigma）を用いてブロットを顕出させた。

【００８１】

【実施例２１】組換え型ＭＩＥＰの微生物発現 １．３キロ塩基対ＭＩＥＰ遺伝子挿入断片を含むプラス
ミドｐＵＣ１９−ＭＩＥＰを、制限エンドヌクレアーゼ
Ｓｐｅ Ｉ and Ｅｃｏ ＲＩで切断した。当業界におい
て既知の標準的な方法を用いて１．１ｋｂｐ断片を分離
し、アガロースゲルにおいて精製した。プラスミドｐＴ
ＡＣＳＤ（２つのシストロンＴＡＣプロモーター及び唯
一のＥｃｏ ＲＩサイトを含んでいる）をＥｃｏ ＲＩで
切断した。製造業者の指示に従ってＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Boehringer Mannheim）を 使用して、１．３ｋｂ
ｐ ＭＩＥＰ ＤＮＡ及びｐＴＡＣＳＤベクターの両方に
ブラントエンドを形成した。ブラントエンドにした１.
３ｋｂｐ ＭＩＥＰ ＤＮＡを、製造業者の指示に従って
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim）を 用いて
ブラントエンドにしたベクターに結合した。結合された
ＤＮＡを使用して、製造業者の指示に従ってＥ. coli
株ＤＨ５ａＩＱＭＡＸ（ＢＲＬ）を形質転換した。形質
転換細胞を、２５μｇカナマイシン／ｍｌ及び５０μｇ
ペニシリン／ｍｌを含むアガー皿の上に塗布し、３７℃
で約１５時間インキュベートした。ＭＩＥＰと相同する
配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを³²Ｐでラベル
し、そして標準的なＤＮＡハイブリッド形成技術を用い
て形質転換体の皿から溶解した変性コロニーを含むニト
ロセルロースフィルターをスクリーニングするために使
用した。ハイブリッド形成によって陽性であったコロニ
ーについて、制限エンドヌクレアーゼを用いて遺伝子地
図上で位置を決めてＭＩＥＰ遺伝子の配向を決定した。
形質転換体によるＭＩＥＰの発現はウエスタン ブロッ
ト分析によって検出された。形質転換体において産生さ
れた組換え型ＭＩＥＰはポリアクリルアミドゲル上をＯ
ＭＰＣベシクルから精製されたＭＩＥＰと共に移動し
た、そしてＭＩＥＰに対して特異的な抗体と免疫学的に
反応性であった。

【００８２】

【実施例２２】Ｎ．メニンギチジス（meningitidis）ＭＩＥＰへのＰｎ−Ｐｓの結合 化学的結合が、米国特許第４，８８２，３１７に開示さ
れている方法に従って行なわれた。０．１Ｍホウ酸塩バ
ッファ（ｐＨ１１．５）３ｍｌ中のＭＩＥＰの１０ｍｇ
をエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ、
Ｓigma Ｃhemicals）の１０ｍｇ及び ジチオトレイトー
ル（Ｓigma Ｃhemicals）の４ｍｇと混合する。タンパ
ク質溶液をＮ₂で十分にフラッシュする。Ｎ-アセチルホ
モシステインチオラクトン（Ａldrich Chemicals）をＭ
ＩＥＰ溶液に加え、混合物を室温で１６時間インキュベ
ートする。次に、それを、窒素下で４ｍＭ ＥＤＴＡを
含む０.１Ｍホウ酸塩バッファ（ｐＨ９.５）の２ｌに対
して２４時間室温で２回透析する。次に、チオール化タ
ンパク質をエルマン（Ellman's）試薬（Ｓigma Chemica
ls）によってチオール含量についてアッセイし、タンパ
ク質濃度をブラドフォード（Ｂrad ford）試薬（Ｐierc
e Ｃhemicals）によって測定する。Ｐｎ−ＰｓへのＭＩ
ＥＰの結合のために、１．５倍過剰（ｗｔ／ｗｔ）のブ
ロモアセチル化Ｐｎ−ＰｓをＭＩＥＰ溶液に加え、ｐＨ
を１Ｎ ＮａＯＨで９〜９.５に調節する。反応時間の終
りにＮ-アセチルシステアミン（Chemical Dynamics）の
２５μｌをその混合物に加え、窒素下室温で１８時間放
置する。結合体溶液を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ３〜４の間ま
で酸性にし、１０，０００ｘｇで１０分間遠心を行う。
上清流体の１ｍｌを、ＦＰＬＣ Superose ６Ｂ（１.６
×５０ｃｍ、Pharmacia）のカラムに直接かけて、結合
体をＰＢＳで溶出する。ポリサッカライド−タンパク質
結合体（Ｐｎ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ）を含む空隙率ピークを
プールする。次に、結合体溶液を滅菌のために０．２２
μｍフィルターを通して濾過する。

【００８３】

【実施例２３】Ｐｎ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ結合体の免疫原性の証明 免疫化：雄Ｂａｌ ｂ／ｃマウス（Charles River, Wilm
ington, MA）を、前もって形成したミョウバン０．５ｍ
ｌ中の２．５μｇＰｎ−Ｐｓを使用してＭＩＥＰへ供有
結合されたＰｎ−Ｐｓで腹腔内（ｉ.ｐ.）に免疫する。
対照マウスを、Ｐｎ−Ｐｓ−ＣＲＭ〔Anderson, M. E.
等、（１９８５）、J. Pediatrics, 第１０７巻、３４６
〜３５１ページ〕（２．５μｇ Ｐｎ−Ｐｓ／６．２５
μｇ ＣＲＭ；ヒト用量の１／４）、Ｐｎ−Ｐｓ−ＤＴ
（２．５μｇ Ｐｎ−Ｐｓ／１.８μｇ ＤＴ；一定量の
Ｐｎ−Ｐｓを複数回使用するようなヒト用量の１／１
０）、及びＰｎ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ（２．５μｇ Ｐｎ−Ｐ
ｓ／３５μｇ ＯＭＰＣ；ヒト用量の１／４）として与
えられた当量のＰｎ−Ｐｓで免疫する。Ｉnfant Ｒhesu
sサル（６〜１３.５週令）を、ミョウバンに吸着された
Ｐｎ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ結合体で免疫する。各々のサルは
０.５ｍｌの全用量について０．２５ｍｌの結合体を二
つの別の場所の注射で受ける。サルを、０、２８、及び
３０日に免疫して、血液サンプルを２〜４週間毎に取
る。抗体応答を、免疫グロブリン応答のクラスとサブク
ラスを区別するＥＬＩＳＡによって測定する。総抗Ｐｎ
−Ｐｓ抗体を定量するＲＩＡも使用してサル応答を評価
する。Ｐｎ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ結合体は、ＩｇＧ抗Ｐｎ−
Ｐｓ抗体からなるマウスの免疫応答及び記憶応答を発生
させることができる。これは、測定可能な抗Ｐｎ−Ｐｓ
抗体を顕在化させないＰｎ−Ｐｓ−ＣＲＭ及びＰｎ−Ｐ
ｓ−ＤＴと対照的である。このように、ＭＩＥＰはＰｎ
−Ｐｓのための免疫学的キャリヤー・タンパク質として
機能し、Ｐｎ−Ｐｓ抗原へ共有結合した場合、抗Ｐｎ−
Ｐｓ抗体応答を発生させることができる。従って、精製
ＭＩＥＰは微生物ポリサッカライド結合体ワクチンの構
成において異種ＯＭＰＣを置換する効果的な免疫学的キ
ャリヤー・タンパク質である。

【００８４】

【実施例２４】部分的に加水分解された精製Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓの調製 （１）音波加水分解：Ｐｎ１８Ｃ Ｐｓ粉末の３.０ｇ分
を、室温で約３〜４時攪拌しながら１２００ｍｌ塩類液
（０．９％ＮａＣｌ）中で可溶性にした後、カバーをし
て、一晩中４℃で保存した。次に、この溶液を、２０分
（５分間バーストにおいて）の 間隔で全部で４０分ま
で Branson Sonifier（１／２インチフローブ、設定
８）を用いて氷浴中のプラスチックビーカーの中で音波
処理した。各間隔の後に、粘度を調べた。４０分間後
に、さらに１０分間の音波処理を行い、１．２１８セン
チストークスの粘度終点を得た。加水分解されたサンプ
ル（体積１１８８ｍｌ）を室温にし、酢酸ナトリウム試
薬（５９.２ｇ）を３％（ｗ／ ｖ）の最終濃度まで加え
た。 （２）血清プローブ：イソプロパノール（ＩＰＡ）分別
プローブ及び抗体指示終点比濁（Ｎephelose）アッセイ
（サンプルの１０ｍｌ分について行った）は、Ｐｎ１８
Ｃ−Ｐｓが４０〜５０％の間のＩＰＡで沈殿することを
示した。 （３）１回目ＩＰＡ添加：加水分解されたサンプル〔体
積＝１２００ｍｌ（上記工程１からのもの）〕を、８９
４ｍｌ ＩＰＡの添加（室温で攪拌しながら一滴づつ加
えた）によって４２．７％ＩＰＡにした。サンプルを１
５〜３０分間攪拌した後、３０分間１１，０００ｘｇで
遠心した（Beckman ＪＡ−１０ローター；８,０００ｒ
ｐｍ；２０℃）。廃物のペレットを２５０ｍｌ Omnimix
ジャーの中で無水ＥｔＯＨと摩砕し、次に６０ｍｌ焼
結ガラスロウ斗に集めた。沈澱物を、ロウ斗上で直接無
水ＥｔＯＨ、次にアセトンで洗浄し、分析の用意に真
空、ＣａＳＯ₄（Drierite）上、室温で乾燥した。 （４）２回目ＩＰＡ添加及び中間生成物回収：４２．７
％ＩＰＡ上澄み流体〔体積＝２０１６ｍｌ（上記工程３
から）〕を、室温で攪拌しながら９２．０ｍｌＩＰＡを
一滴づつ加えることによって４５.２％にした。サンプ
ルを熟成し、上記工程３と同様な遠心を行った。上記工
程３と同様に摩砕し、集め、洗浄しそして乾燥した。Ｐ
ｎ１８Ｃ−Ｐｓ中間体生成物の重量は１．６０９ｍｇで
あった。 （５）透析及び凍結乾燥：上記工程４からのサンプルの
一部分（１６１２．５ｍｇ)を、室温で約２時間６４５
ｍｌの蒸留水中で可溶性にした。この溶液（２．５ｍｇ
／ｍｌ）を、透析チューブ（１２，０００ＭＷカットオ
フ；４５ｍｍ）に移し、蒸留水に対して４℃で３０時間
透析した、このとき蒸留水を２回別のものに取り替え
た。次に、サンプルを凍結乾燥フラスコへ移し、ドライ
アイス：メタノール浴中でシェル凍結し、そしてVirtis
（Freezemobile）凍結乾燥機において２〜３日間凍結乾
燥した。最終Ｐｓ生成物の回収は１４８７ｍｇであっ
た。

【００８５】

【実施例２５】 Ｓ．ニューモニアエ（Pneumoniae）１８Ｃ−ＯＭＰＣ結合体、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ Ａ． Ｄowex ５０×２（２００〜４００ メッシュ）テ
トラブチルアンモニウム型樹脂〔Ｄowex ５０（Ｂｕ₄Ｎ
⁺〕の調製： Ｄowex ５０×２（２００〜４００メッシュ）Ｈ⁺ 型
（５００ｇ）をＨ₂Ｏ中でスラリーにし、カラムに充填
し、１）６００ｍｌの水；２）１０００ｍｌの６Ｎ Ｈ
Ｃｌ；３）４００ｍｌのＨ₂Ｏ（流出液がｐＨ紙に対し
て中性になるまで）；４）７２ｇの１０％水性テトラブ
チルアンモニウムハイドロオキサイド溶液（流出液がｐ
Ｈ紙に対して強アルカリになるまで）;５）１０００ｍ
ｌのＨ₂Ｏ（中性まで）の順序で洗浄した。

【００８６】Ｂ． Ｓ．ニューモニエ タイプ１８Ｃポ
リサッカライド テトラアンモニウム型〔Ｐｎ１８Ｃ（Ｂｕ₄Ｎ⁺）〕の調
製： Ｄowex ５０×２（Ｂｕ₄Ｎ⁺）の６０ｍｌカラムを２５
０ｍｌのＨ₂Ｏで洗浄した。Ｐｎ１８Ｃ−ポリサッカラ
イド（還元ｍ.ｗ.（６５０ｍｇ））を６５ｍｌのＨ₂Ｏ
でカバーし、１時間攪拌した（その時点ですべてが溶液
状であるように見えた）。この溶液をカラムにかけて重
力によって浸透させた（２時間、次に真空下で１時
間）。カラムを１５０ｍｌのＨ₂Ｏで洗浄し、一緒に合せ
た溶出液を凍結乾燥して６５５ｍｇの１８Ｃ（Ｂｕ
₄Ｎ⁺）塩を得た。２５ｍｇをＮＭＲ分析及び保留材料用
に取り出した。

【００８７】Ｃ． １８Ｃの１，４−ブタンジアミン誘
導体（１８Ｃ−ＢｕＡ₂）の調製： １８Ｃ（Ｂｕ₄Ｎ⁺）（６３０ｍｇ）を１４３ｍｌのＤＭ
ＳＯ（ジメチルスルフォキシド）でカバーし、３．２５
時間攪拌した。この時点ですべての固形物が溶解され
た、そして１ｍｌを水含有量についてのカールフィッシ
ャー滴定用に取り出した。Ｈ₂Ｏ／ｍｌの値は２８.２マ
イクロモルであることが分った（全部で４ミリモル）。
この溶液に１６５．１ｍｇのカルボニルジイミダゾール
（ＣＤＩ）を加え、得られた溶液を室温で２．０時間攪
拌した。４０ｍｌのＨ₂Ｏ中に１.２６０ｇの１,４−ブ
タンジアミンジヒドロクロリド（ＢｕＡ₂・２ＨＣｌ）
を含む溶液を調製し、そのｐＨを２.５Ｎ ＮａＯＨで１
０．２０に調節した。この溶液を氷浴中で冷却した。熟
成ＤＭＳＯ溶液を冷ＢｕＡ₂ 溶液に徐々に加え、氷浴中
でさらに１０分間攪拌した。次に、それを室温で５０分
間攪拌した後、その溶液をＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ２透析
チユーブに充填し、液の上部から１／２”を切り取り、
そして次のように透析した：１）１３．０時間ｐＨ７.
０ ０.１Ｍ ＮａＰＯ₄バッファの１５ｌに対して；
２）１１時間ｐＨ７.０ ０.０１Ｍ ＮａＰＯ₄バッファ
の１５ｌに対して；３）１０．８時間ｐＨ７.０ ０.０
１Ｍ ＮａＰＯ４バッファの１５ｌに対して；４）９.５
時間Ｈ₂Ｏの１５ｌに対して。この時点で体積は１９０
ｍｌであった。７．５ｍｌアリコートを取り出し、ＮＭ
Ｒアッセイ用に別に凍結乾燥した。残りの１８２．５ｍ
ｌを、１８Ｃの１，４−ブタンジアミン誘導体（Ｐｎ１
８Ｃ−ＢｕＡ₂）の ４１６ｍｇに凍結乾燥した。約５ｍ
ｇのＮＭＲスペクトルは、ブタンジアミン内部メチレン
及びラムノースメチル（１８Ｃの）共鳴の積分を比較す
ることによって明確にされたポリサッカライドの１００
くり返し単量体単位当り１０ブタンジアミン残基の“負
荷 （loading）”を示した。

【００８８】Ｄ． １８Ｃのブロモアセチル化ブタンジ
アミン誘導体（Ｐn１８Ｃ−ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃ）の調
製： １８Ｃ−ＢｕＡ₂（４１６ｍｇ）を、０．１Ｍ ｐＨ９．
０４バッファ（Kolthoff ホウ酸塩-リン酸塩）の３６ｍ
ｌでカバーし、攪拌して溶液を作った。次に、４.４８ｍ
ｌのアセトニトリル中の２５６ｍｇ ｐ−ニトロフェニ
ルブロモアセテートを加えた。得られた混合物を４℃で
２０時間攪拌した。それをＳＰＥＣＴＲＡＰＯＲ２チュ
ーブにおいて次のように透析した：１）６時間１５ｌ
Ｈ₂Ｏに対して；２）６時間１５ｌ Ｈ₂Ｏに対して；
３）６時間１５ｌ Ｈ₂Ｏに対して。この時点で６０ｍｌ
の体積があり、それから１．７ｍｌをアッセイ（ＮＭ
Ｒ，Ouchterlony 及び Viscotek）のために取り出した
後、２.４２ｇの乾燥ｐＨ８リン酸塩バッファ塩（０．
１Ｍ ｐＨ８ＮａＰＯ₄溶液を凍結乾燥することによって
調製した）を加えた。溶解した後、それを０．２ミクロ
ンＣＯＲＮＩＮＧフィルターを通して濾過して、１８Ｃ
-ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃの水性ｐＨ８溶液を得た。濾過はゆ
っくりであり、４カップフィルターを必要とした。

【００８９】Ｅ． Ｐｎ１８Ｃ-ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃへの
ＯＭＰＣ（Ｎ．メニンギチジス）の結合： 外膜タンパク質複合体（Ｎ．メニンギチジズ、ＯＭＰＣ
３．２ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｌ）を４つの２５ｍｌ遠心チ
ューブに充填し、４℃で２時間６０Ｔｉローターにおい
て４３，０００ｒｐｍ（４３Ｋ）で遠心した。チオール
化混合物を、４０ｍｌのｐＨ１１.０９Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇バッ
ファに６８０ｍｇのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸
二ナトリウム塩）及び１２０ｍｇのジチオトレイトール
（ＤＴＴ）を溶解することによって調製した。３２０ｍ
ｇのＮ−アセチルホモシステインチオラクトンを加え、
次にこの溶液を０．２μコーニングフィルター（カップ
タイプ）を通して濾過した。上記遠心からのペレットを
濾過されたチオール化混合物（全部で２０ｍｌ）の５ｍ
ｌで取り出し、ＤＯＵＮＣＥホモジナイザーへ移し、再
懸濁させた。チューブを、チオール化溶液の別の２／１
０ｍｌを連続的に移すことによってすすいだ。一緒に合
せた溶液をＤＯＵＮＣＥ中でホモジナイズし、全再懸濁
物質（４０ｍｌ）を１００ｍｌ丸底フラスコへ移した。
ガラス器具をチオール化溶液の別の２０ｍｌですすぎ、
反応フラスコに加えた。フラスコを隔膜でシールしそし
てＦＩＲＥＳＴＯＮＥバルブを用いて空気をＮ₂ で置換
した後、反応混合物を１８．５時間熟成した。次に、６
０ｍｌを４つの遠心チューブに分け、その各々に１Ｍ
ＫＨ₂ＰＯ₄（水性）をのせて、４３Ｋ、４℃で２時間遠
心した。上清を除き、ペレットを０.１Ｍ ＮａＰＯ₄ ｐ
Ｈ８バッファ中に再懸濁した（全量４０ｍｌが最終再懸
濁液体積であった）。この溶液を２つの２５ｍｌ遠心チ
ューブ（ポリカーボネート）へ等しく移し、ガラス器具
（ＤＯＵＮＣＥ等）を約１０ｍｌのｐＨ８リン酸塩バッ
ファですすぎ、遠心チューブの仕上げをするために使用
した。次に、２回目の超遠心（２時間、４℃、４３Ｋ）
を行った。ペレットを３０ｍｌのｐＨ８、０.１Ｍ ＰＯ
₄バッファ中に再懸濁した。Ellmanアッセイは全部で２
４マイクロモルのＳＨ又は約１００ナノモル／ｍｇのＯ
ＭＰＣを示した。チオール化タンパク質を１００ｍｌ丸
底フラスコへ移し、それに濾過された１８Ｃ−ＢｕＡ₂
−ＢrＡｃ溶液を加えた。得られた反応物（すなわち、
チオール化ＯＭＰＣを有する１８Ｃ−ＢｕＡ₂−ＢｒＡ
ｃ）を室温で８９時間Ｎ₂ボックス中のＮ₂下で（ガス抜
きしながら）熟成した。反応物を次のように仕上げた：
５ｍｌのｐＨ８、０．１Ｍ ＮａＰＯ₄バッファ中に７５
ｍｇＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含む溶液を０．
２２ミクロンフィルターを通して濾過し、上記反応混合
物に２ｍｌを加えて４時間熟成した。２．５ｍｌの０.
１Ｍ ｐＨ８ ＰＯ₄バッファ中のＮ−アセチルシステア
ミンの０．５ｍｌを０.２２ミクロンフィルターを通し
て濾過し、この溶液の１.０ｍｌを反応物に加えて２
２．５時間熟成した。完成された生成物を４つの２５ml
遠心チューブに等しく充填し、全部で８ｍｌのｐＨ８
０.１Ｍ ＰＯ₄バッファをのせて、４３Ｋ、４℃で２時
間遠心した。上清を除去した後、ペレットをＤＯＵＮＣ
Ｅホモジナイザーにおいて全部で４０mlのＴＥＤバッフ
ァ中に再懸濁し、ガラス器具をＴＥＤバッファの別の１
０ｍｌですすぎ、その溶液を２つの２５ｍｌチューブに
移した。これらのチューブを室温で１５.２５時間保存
した後、４３Ｋ ｒｐｍ、２４℃で２時間遠心した。得
られたペレットをＤＯＵＮＣＥホモジサイザーにおいて
全部で３０ｍｌのＴＥＤバッファ中に再懸濁し、２つの
２５ｍｌ遠心チューブに移し、ガラス器具をＴＥＤバッ
ファの別の２０ｍｌですすぎ、そして４３Ｋ、４℃で２
時間再遠心した。ペレットを５０ｍｌのｐＨ７リン酸塩
バッファ中に再懸濁し、３回目の遠心に４３Ｋ、４℃で
２時間かけた。ペレットを８２ｍｌの水に再懸濁し、２
０.５ｍｌ部分において２つの５０ｍｌプラスチック無
菌（ＦＡＬＣＯＮ）遠心チューブへ移した。４℃で１８
時間熟成した後、結合体調製物をＴＪ−６遠心機のＴＨ
ローターにおいて１０００ｒｐｍで３．５分間遠心し
た。最終生成物結合体懸濁液を、タンパク質（Lowry）、
１８Ｃポリサッカライド（フェノール／硫酸）、非結合
ポリサッカライド（サイズ排除クロマトグラフィー−速
度ネフェロメトリー（rate Nephelometry））及びアミ
ノ酸（ＳＰＩＮＣＯ）についてアッセイした。 ポリサッカライド＝３３９マイクログラム／ｍｌ タンパク質＝２．５７ｍｇ／ｍｌ 遊離ポリサッカライド：＜５％（実験誤差の限界） Ｓ−カルボキシメチルホモシステイン／リシン＝０．０
２５ Ｓ−カルボキシメチルシステアミン／リシン＝０．００
５

【００９０】

【実施例２６】Ｐｎ４−Ｐｓ中間体の作成 （１）音波加水分解 Ｐｎ４−Ｐｓ粉末の０．１ｇを４００ｍｌの食塩水
（０．９％ＮａＣｌ）に入れ、室温で約４時間攪拌して
溶解した。この溶液をプラスチックビーカー中氷浴上
で、ブランソン音波発生機（Branson Sonifier、１．５
インチプローブ、セッティングＢ）を用いて１０分間
隔、全部で２０分間音波処理した。一区切りごとに粘度
をチェックした。２０分後には粘度は１．２６７センチ
ストロークとなった。加水分解産物を室温に戻してか
ら、酢酸ナトリウム試薬（１８．７ｇ）を加えて終濃度
を３％（ｗ／ｖ）とした。 （２）血清学的プローブ サンプルの１０ｍｌを用いて、イソプロパノール（ＩＰ
Ａ）分画の予備試験と抗体による終点比濁アッセイを行
なうと、Ｐｎ４−Ｐｓは４５−５５％ＩＰＡで沈殿する
ことが分かった。 （３）第一回ＩＰＡ添加 加水分解したサンプル（液量３８５ｍｌ、上記工程
（１）で得られたもの）に３７９ｍｌのＩＰＡを室温で
攪拌しながら滴下して加え、ＩＰＡ濃度を４９．７％と
した。サンプルは１５−３０分攪拌を続けた後、１１，
０００ｘｇで３０分間遠心した（ベックマンＪＡ−１０
ローター、８，０００ｒｐｍ、２０℃）。ペレットは純
ＥｔＯＨとともに２５０ml容のオムニミックスジャー
（Omnimix Jar）中で摩砕し、６０ｍｌ容焼結ガラスロ
ート上に集めた。析出物はロート上で直接純ＥtＯＨ、
アセトンの順で洗浄し、真空下、室温、ＣａＳＯ₄（Ｄ
ＲＩＥＲＩＴＥ）で乾燥して分析用に供した。 （４）第二回目のＩＰＡ添加と生成物の回収 ４９.７％ＩＰＡ上清液（液量７２７ｍｌ、上記工程
（３）から得られたもの）に３８mlのＩＰＡを室温で攪
拌しながら加えることにより、ＩＰＡ濃度を５２．２％
とした。サンプルは熟成後、工程（３）と同様に遠心し
た。工程（３）と同様にペレットを摩砕し、回収し、洗
浄し、乾燥した。Ｐｎ４−Ｐｓ生成物の重量は５１６ｍ
ｇであった。 （５）透析と凍結乾燥 工程（４）で得られたＰｎ４−Ｐｓサンプルの一部（５
００mg）を２００ｍｌの蒸留水に室温で２−３時間かけ
て溶解した。この溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）を透析チュ
ーブ（分画分子量１２,０００、４５ｍｍ）に移し、蒸
留水に対して、４℃、２７時間透析した。途中で２回蒸
留水を交換した。ついでサンプルを凍結乾燥用の容器に
移し、ドライアイス：メタノール浴中で薄く凍らせ、Vi
rtis（Freezemobile）凍結乾燥機で２−３日間凍結乾燥
した。回収されたＰｎ４−Ｐｓの最終製品は４９１ｍｇ
で、Ｋ_dは０．６９であった。この開示から、当業者に
とって他のカルボキシル基を含むＰｎ−Ｐｓのサブタイ
プ、たとえばＰｎ１−Ｐｓ、Ｐｎ５−Ｐｓもここに示し
た方法により調製でき、おなじく酸性多糖であるＰｎ４
−ＰｓあるいはＰｎ９Ｖ−Ｐｓと同様に結合体とするこ
とができることは自明である。

【００９１】

【実施例２７】Ｓ. pneumoniae type４−ＯＭＰＣ結合体であるＰｎ４−Ｐｓ−ＯＭＰＣ Ａ． ダウエックス５０×２（２００−４００メッシ
ュ）のテトラブチルアンモニウム型樹脂の調製〔ダウエ
ックス５０（Ｂｕ₄Ｎ⁺）〕 ダウエックス５０×２（２００-４００メッシュ）のＨ
型（５００ｇ）をＨ₂Ｏ中でスラリーとし、カラムに充
填して順番に、１）Ｈ₂Ｏ ６００ｍｌ、２）６ＮＨＣｌ
１０００ｍｌ、３）Ｈ₂Ｏ ４００ｍｌ（流出液がｐＨ
試験紙で中性になるまで）、４）１０％テトラブチルア
ンモニウムヒドロキシド水溶液７２ｇ（流出液がｐＨ試
験紙で強アルカリになるまで）、５）Ｈ₂Ｏ １０００ｍ
ｌ（中性になるまで）で洗浄した。

【００９２】Ｂ． Ｐneumoniae type ４ 多糖のテトラ
ブチルアンモニウム型〔Ｐｎ４（Ｂｕ₄Ｎ⁺）〕の調製 ダウエックス５０×２（Ｂｕ₄Ｎ⁺）の ６５ｍｌのカラ
ムを５２０ｍｌのＨ₂Ｏで洗浄した。Ｐｎ４−多糖（ｍ.
ｗ.還元型４００ｍｇ）を ３５ｍｌのＨ₂Ｏで覆い、全
部が水面下にあるように気を付けながら２０分間攪拌し
た（攪拌は１晩継続した）。この溶液をカラムにのせ、
重力により浸透させ、カラムを１５０ｍｌのＨ₂Ｏで洗浄
した。溶出液を合し、凍結乾燥して５０４ｍｇのＰｎ４
（Ｂｕ₄Ｎ⁺）塩を得た。

【００９３】Ｃ． Ｐｎ４の１，４−ブタンジアミン誘
導体（Ｐｎ４−ＢｕＡ₂）の調製 Ｐｎ４（Ｂｕ₄Ｎ⁺）（９７ｍｇ）を１６ｍｇのＤＭＳＯ
（ジメチルスルホキシド）で覆い、溶液となるまで５２
℃で１５分かけて攪拌した。この時点で固体はすべて溶
解し、この溶液を室温まで冷却した。この溶液に、１６
０μＬのＤＭＳＯに溶解した２ｍｇのカルボニルジイミ
ダゾール（ＣＤＩ）を加え、できた溶液を室温で１.０
時間攪拌した。５ｍｌのＨ₂Ｏに０.５００ｇの１,４−
ブタンジアミンジヒドロクロリド（ＢｕＡ₂・２ＨＣ
ｌ）を溶解した液を調製し、ｐＨを５.０Ｎ ＮａＯＨで
１０．２０に調節した。この溶液を氷浴中で冷却し、熟
成させたＤＭＳＯ溶液を冷ＢｕＡ₂ 溶液に徐々に加え氷
浴中でさらに５分間攪拌した。ついでこれを室温で１時
間攪拌し、その後溶液をスペクトロポア−２の透析チュ
ーブに入れ、液の上面から２分の１インチのところをク
リップでとめ、以下のように透析した。１）ｐＨ７．０
の０.１Ｍ ＮａＰＯ₄緩衝液４リットル、１５．０時
間、２）ｐＨ７．０の０.０１Ｍ ＮａＰＯ₄緩衝液４リ
ットル、９時間、３）Ｈ７．０の０．０１Ｍ ＮａＰＯ₄
緩衝液４リットル、２１時間、４）Ｈ₂Ｏ４リットル、
２０時間。ついで溶液を凍結乾燥して、７０ｍｇのＰｎ
４の１,４−ブタンジアミン誘導体（Ｐｎ４−ＢｕＡ₂）
を得た。約５ｍｇのサンプルについてのＮＭＲスペクト
ルから、１００個の多糖繰り返し単位あたり、２２個の
ブタンジアミン残基が付加されたことが、ブタンジアミ
ン内部のメチレンと（Ｐｎ４の）Ｎ−アセチルメチル基
との共鳴の積分を比較することにより求められた。

【００９４】Ｄ． Ｐｎ４のブロモアセチル化ブタンジ
アミン誘導体（Ｐｎ４−ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃ）の調製 Ｐｎ４−ＢｕＡ₂（５４ｍｇ）を、５．５ｍｌの０．１
ＭｐＨ９.０４緩衝液（コルトフのホウ酸−リン酸）で
覆い、溶液となるまで攪拌した。１．０ｍｌのアセトニ
トリル中の５５ｍｇのｐ-ニトロフェニルブロモアセテ
ートをこれに加え、生じた混液を１７時間４℃で攪拌し
た。これをスペクトロポア−２の透析チューブ中で以下
の様に透析した。１）１６リットルの水に対して２４時
間、２）１６リットルの水に対して８時間、３）１６リ
ットルの水にたいして２３時間。この時点で容積は１
２．５ｍｌであり、これから１．０ｍｌをとって分析に
供し（ＮＭＲ、オキタクロニー、ビスコテック）、残り
に２７５ｍｇの乾燥ｐＨ７リン酸緩衝塩（０.１Ｍのｐ
Ｈ８ＮａＰＯ₄溶液を凍結乾燥して調製）を加えた。溶
解させた後、０.２ミクロンのコーニングフィルターで
濾過すると、Ｐｎ４−ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃのｐＨ８溶液
が得られた。

【００９５】Ｅ． ＯＭＰＣ（N. meningitidis）のＰ
ｎ４−ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃへの結合 外膜蛋白複合体（N. meningitidis, ＯＭＰＣ、４.３４
ｍｇ／ｍｌ）（５ml）を８０Ｔｉローター中４３，００
０ｒｐｍ（４３Ｋ）で４℃、２時間遠心した。チオール
化用混合液は８５ｍｇのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四
酢酸二ナトリウム塩）と１５ｍｇのジチオスレイトール
（ＤＴＴ）を１０ｍｌのｐＨ１１．０９Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇緩
衝液に溶解して調製した。５０ｍｇのＮ-アセチルホモ
システインチオラクトンを加え、溶液を０．２ミクロン
フィルターで濾過した。上述した遠心のペレットを５ｍ
ｌの濾過したチオール化用混液ではがし、ドーンスホモ
ジナイザーに移して再懸濁させた。再懸濁を遠心管に移
し、蓋をしてファイアストンバルブを用いて空気を窒素
に置換した。反応混液を１９時間熟成させ、遠心管に移
し、１ＭＫＨ₂ＰＯ₄水溶液を上層して２時間４℃４３Ｋ
で遠心した。上清を除き、ペレットを１０ｍｌの０.１
ＭＮａＰＯ₄ｐＨ８緩衝液に再懸濁した。この液を遠心
管に移し、２回目の超遠心を行なった（２時間、４℃、
４３Ｋ）。ペレットをセクションＤで調製した１１.５
ｍｌのＰｎ４−ＢｕＡ₂−ＢｒＡｃに再懸濁した。エル
マン検定から合計３．４４マイクロモルのＳＨすなわち
約１５８ナノモルのＳＨ／ｍｇのＯＭＰＣであった。得
られた反応物（チオール化ＯＭＰＣとＰｎ４−ＢｕＡ₂
−ＢｒＡｃ）は窒素下で（脱気して）Ｎ₂ボックス中室
温で６６時間熟成させた。反応物は以下のようにキャッ
プ化した：５ｍｇのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を
１ｍｌのｐＨ８、０.１ＭＮａＰＯ₄緩衝液に溶解したも
のを０．２２ミクロンのフィルターで濾過し、上記の反
応混液に加え、混液を５時間熟成させた。ついで０．１
ｍｌのＮ−アセチルシステアミンを０．４ｍｌの０．１
ＭｐＨ８リン酸緩衝液に加えたものを０．２２ミクロン
のフィルターで濾過し、この液を反応混液に加えて１
４．５時間熟成させた。反応混液を４３Ｋ、４℃、２時
間遠心し、ペレットを８ｍｌの１×ＴＥＤ緩衝液に再懸
濁した。この液を室温で一晩熟成させ、ついで４３Ｋ、
４℃、２時間遠心した。ペレットを８ｍｌのＴＥＤ緩衝
液に再懸濁し、直ちに４３Ｋ、４℃、２時間の再遠心を
行なった。ペレットを１０ｍｌのｐＨ７．０、０．１Ｍ
のリン酸緩衝液に再懸濁し、４３Ｋ、４℃、２時間の再
遠心を行なった。最終ペレットは７．５ｍｌの水に懸濁
した。４℃で一晩熟成させたのち、懸濁液を１０００ｒ
ｐｍで３分遠心し上清を最終結合体として回収した。 分析：ローリー法による蛋白質：０．９２０ｍｇ／ｍｌ フェノール−硫酸法：０．２１２ｍｇ／ｍｌ Ｐｓ／Ｐｒｏ＝０．２３ ＳＣＭＨＣ／ｌｙｓ＝０．０３１ ＳＣＭＣ／ｌｙｓ＝０．０２２ この結合体をマウスあるいはアフリカミドリザルに投与
すると、高力価の抗Ｐｎ４−Ｐｓ抗体が誘導された（Ｐ
ｎ４−Ｐｓ特異的ＥＬＩＺＡ検定で測定）。

【００９６】

【実施例２８】Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ中間体の作成 （１）音波加水分解 Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ粉末の０．１ｇを４００ｍｌの食塩水
（０．９％ＮａＣｌ）に入れ、室温で約４時間攪拌して
溶解した。この溶液をプラスチックビーカー中氷浴上
で、ブランソン音波発生機（Branson Sonifier, １．５
インチプローブ、セッティングＢ）を用いて３分間音波
処理した。このあと粘度をチェックした。１３分後、も
う一分音波処理すると粘度は１．１１７センチストロー
クとなった。加水分解産物を室温に戻してから、酢酸ナ
トリウム試薬（１９．５ｇ）を加えて終濃度を３％（ｗ
／ｖ）とした。 （２）血清学的プローブ サンプルの１０ｍｌを用いて、イソプロパノール（ＩＰ
Ａ）分画の予備試験と抗体による終点比濁アッセイを行
なうと、Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓは４０−４５％ＩＰＡで沈殿す
ることが分かった。 （３）第一回ＩＰＡ添加 加水分解したサンプル（液量３９１ｍｌ、上記工程
（１）で得られたもの）に２８１ｍｌのＩＰＡを室温で
攪拌しながら滴下して加え、ＩＰＡ濃度を４１．８％と
した。サンプルは１５−３０分攪拌を続けた後、１１，
０００ｘｇで３０分間遠心した（ベックマンＪＡ−１０
ローター、８，０００ｒｐｍ．２０℃）。ペレットは
純ＥｔＯＨとともに２５０ｍｌ容のオムニミックスジャ
ー（OmnimixJar）中で摩砕し、６０ｍｌ容焼結ガラスロ
ート上に集めた。析出物はロート上で直接純ＥtＯＨ、
アセトンの順で洗浄し、真空下、室温、ＣａＳＯ₄（Ｄ
ＲＩＥＲＩＴＥ）で乾燥して分析用に供した。 （４）第二回目のＩＰＡ添加と生成物の回収 ４１.８％ＩＰＡ上清液（液量６３７ｍｌ、上記工程
（３）から得られたもの）に２８．６ｍｌのＩＰＡを室
温で攪拌しながら加えることにより、ＩＰＡ濃度を４
４.３％とした。サンプルは熟成後、工程（３）と同様
に遠心した。工程（３）と同様にペレットを摩砕し、回
収し、洗浄し、乾燥した。Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ標品の重量は
３４２．２ｍｇであった。 （５）透析と凍結乾燥 工程（４）で得られたＰｎ９Ｖ−Ｐｓサンプルの一部
（３４７ｍｇ）を１３９ｍｌの蒸留水に室温で４−５時
間かけて溶解した。この溶液（２.５ｍｇ／ｍｌ）を透
析チューブ（分画分子量１２,０００、４５ｍｍ）に移
し、蒸留水に対して、４℃、２５時間透析した。途中で
２回蒸留水を交換した。ついでサンプルを凍結乾燥用の
容器に移し、ドライアイス：メタノール浴中で薄く凍ら
せ、Virtis（Freezemobile）凍結乾燥機で２−３日間凍
結乾燥した。回収されたＰｎ９Ｖ−Ｐｓの最終製品は３
０３．５ｍｇ、Ｋ_d＝０．６０であった。 （６）第三回目のＩＰＡ添加と生成物の回収 ４４.３％ＩＰＡ上清液（液量６５５ｍｌ、上記工程
（４）から得られたもの）に３０．８ｍｌのＩＰＡを室
温で攪拌しながら加えることにより、ＩＰＡ濃度を４
６.８％とした。サンプルは成熟後、工程（３）と同様
に遠心した。工程（３）と同様にペレットを摩砕し、回
収し、洗浄し、乾燥した。Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ生成物の重量
は４１０．８ｍｇであった。 （７）透析と凍結乾燥 工程（６）で得られたＰｎ９Ｖ−Ｐｓサンプルの一部
（４２０．４ｍｇ）を１６８ｍｌの蒸留水に室温で４−
５時間かけて溶解した。この溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）
を透析チューブ（分画分子量１２，０００、４５ｍｍ）
に移し、蒸留水に対して、４℃、２５時間透析した。途
中で２回蒸留水を交換した。ついでサンプルを凍結乾燥
用の容器に移し、ドライアイス：メタノール浴中で薄く
凍らせ、Virtis（Freezemobile）凍結乾燥機で２−３日
間凍結乾燥した。回収されたＰｎ９Ｖ−Ｐｓの最終製品
は３４２．５ｍｇ、Ｋ_d＝０．６５であった。 （８）当業者にとって工程（４）および（６）の標品が
各サブフラクションの加重平均特性的分析特性を有する
単一標品として、より多数のＩＰＡを加えて一緒に回収
し、ついで透析、凍結乾燥を行なえるものであることは
あきらかである。また当業者にとってＰｎ１−Ｐｓ、Ｐ
ｎ５−ＰｓもＰｎ４−ＰｓあるいはＰｎ９Ｖ−Ｐｓと同
様に調製できることは自明のことである。

【００９７】

【実施例２９】Ｐｎ９Ｖ−ＰｓとＯＭＰＣの結合 実施例２８で調製したＰｎ９Ｖ−Ｐｓは実施例２７にし
めしたＰｎ４−Ｐｓと同様の方法で結合体とした。

【００９８】

【実施例３０】Ｐｎ９Ｖ／１８Ｃ中のアセテート及びＰｎ４中のピルベートの量的決定 肺炎双球菌（Ｐｎ）のカプセル状ポリサッカライド（Ｐ
ｓ）の製造の間にＰｎ４−Ｐｓ中のＯ−ピルベート並び
にＰｎ９Ｖ−Ｐｓ及びＰｎ１８Ｃ−Ｐｓ中のＯ−アセテ
ート基の残留量の量を測るため一つの方法が開発され
た。Ｏ−アセチル若しくはＯ−ピルベート基は加水分解
により最初に放出され、それから、抑制された伝導性で
連結された高効率陰イオン交換クロマトグラフィを利用
して、ＰｎＰｓ水解物中のアセテートとピルベートは同
定され計量された。未置換の及び処置されたＰｎ４、Ｐ
ｎ９Ｖ、及びＰｎ１８Ｃのサンプルはこの方法で分析さ
れた。予備的な結果は、未処置の及びサイズ化されたＰ
ｎ４に対して各Ｐｓ繰り返し単位に対するピルベートが
約１：１及び０．８：１のモル比を示した。Ｐｎ１８Ｃ
−Ｐｓにおける各Ｐｓ繰り返し単位に対するアセテート
のモル比は、未処置のそしてサイズ化されたサンプルに
対して各々１：１及び０．８：１、そして未処置のそし
てサイズ化されたＰｎ９Ｖに対して各々１．７：１及び
１．５：１であることが発見された。Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ
−ＯＭＰＣ結合水性バルクのサンプルは又各Ｐｓ繰り返
し単位に対するＯ−アセテートのモル比について分析さ
れ、約０．５：１であることが見いだされた。ピルベー
ト基は第４型カプセル状ポリサッカライドにおける有力
な免疫検出物であり、その除去は免疫学的特性において
特徴づけられた変化を生じさせるいうことが報告されて
いる〔Heidelberger, M., Dudman, W. F.,及び Nimmic
h, W.,'Immunochemical relationships of certain cap
sular polysaccharides of Klebsiella, pneumococci,
及び Rhizobia'J. Immunol.,１０４:１３２１-１３２
８，（１９７０）；Higginbotham, J. O., Heidelberge
r, M., 及び Gotschlich E.,' Degradation of a pneUm
ococcal type-specific polysaccharide with exposure
of group-spicificity.' Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, ６７：１３２−１４２，（１９７０）〕。同様に、
型Ｐｎ１８Ｃ−ＰｓポリサッカライドにおけるＯ−アセ
テート基の除去はその免疫学的特性を破棄する〔Estrad
a-Parra, S.,及び Heidelberger, M., 'The specific p
olysaccharide of type XVIII pneumococcus' Biochemi
stry, ２：１２８８−１２９４（１９６３）〕。従っ
て、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ及びＰｎ４におけるアセテートと
ピルベートの決定のための量的な方法を開発することが
必須であった。デ−Ｏ−アセチレート化されたＰｎ９Ｖ
は比濁計測定によって決定されるような抗原反応性を有
しなかったことから、Ｐｎ９ＶにおけるＯ−アセチル基
はまたＰｎ９Ｖの免疫学的構造における重要な役割をも
演ずることができる。我々は、Ｏ−アセテートはアルカ
リ条件（ｐＨ１１）下４℃においてＰｎ９Ｖ及びＰｎ１
８Ｃ−Ｐｓから容易に放出されること及びＯ−ピルベー
トは６５℃で加熱の上でＰｎ４から容易に放出されるこ
とを発見した。我々はアセテートとピルベートは０.９
８ｍＭ ＮａＯＨの１ｍｌ／ｍｉｎの流量及び移動相と
して２％ＭｅＯＨで ＯmniPac ＰＡＸ５００カラムを用
いて加水分解されたＰｎＰｓ試料から分離できることを
発見した。検出は再生試薬として１０ｍｌ／ｍｉｎの流
量で２５ｍＭ Ｈ₂ＳＯ₄を用いる被抑制伝導性検出（sup
pressed conductivity detection）によって成された。
各々Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ、９Ｖ及びＰｎ４からのＯ−アセ
テート及びＯ−ピルベートの量的ＨＰＬＣ分析のための
最も望ましい加水分解条件は、この例中に開示される。

【００９９】装置編成 Ｄionex Ｂio ＬＣ が ＯmniＰac ＰＡＸ−５００ガー
ド、及び 分析カラム（４．６×２５０ｍｍ）とともに
用意された。被抑制伝導性検出は再生試薬として２５ｍ
Ｎ硫酸を用いて成された。流量はＤionex オートレジェ
ンユニットで１０ｍｌ／ｍｉｎに設定された。加水分解
されたＰｎＰｓの試料からアセテートとピルベートを分
離するための移動相及び勾配プログラムは以下の表に示
される： 緩衝液１ − １ｍＭ水酸化ナトリウム 緩衝液２ − １００％メタノール 緩衝液３ − ２００ｍＭ水酸化ナトリウム 緩衝液４ − 水 時間 緩衝液１/% 緩衝液２/％ 緩衝液３/％ 緩衝液４/％ 流量/（ml/min） 0 98 2 0 0 1 12.5 98 2 0 0 1 12.6 58 2 0 40 1.5 20.0 58 2 0 40 1.5 20.1 98 2 0 0 1.5 30.0 98 2 0 0 1.5 30.1 98 2 0 0 1 50.0 98 2 0 0 1 これらの条件と３μジーメンスの感度の検出器を用い
て、およそ５.２及び９.５分の保持時間で溶出するアセ
テート及びピルベートの各々４ｎｍｏｌが、それぞれ容
易に検出された。

【０１００】試料調製 メルク社製造部門からの精製されたＰｎＰｓ試料を、Ａ
quastar Ｖ３００容積測定式水分滴定計を用いることに
よってカール・フィッシャー滴定に付し、残余量のＨ₂
Ｏを含むと決定された。それからｍｌあたり１．０ｍｇ
乾量の濃度でＭilli−Ｑ Ｈ₂Ｏ中に溶解させた。試料
（１００μｇ／ｍｌ）が 室温で１６時間２ｍＭ ＮａＯ
Ｈにて処理され、Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ及びＰｎ１８Ｃ-Ｐｓ
試料からＯ−アセテートが分離された。Ｐｎ４−Ｐｓ試
料はＰｂ４からのＯ−ピルベートの分離のため６５℃で
１６時間 １ｍＭ ＨＣｌ中で加水分解された。サイズ化
されたＰｎ９Ｖ及びＰｎ１８Ｃ−Ｐｓ及びＰｎ１８Ｃ−
Ｐｓ−ＯＭＰＣ結合水性バルクの試料もまた高ｐＨ陰イ
オン交換クロマトグラフィーによってモノサッカライド
構成分析及びパルス電流滴定検出に付された。モノサッ
カライド構成分析は、サイズ化され水性結合大の試料中
のＰｎＰｓの正確な濃度を得るために行われた。アセテ
ート、ピルベート及びＮ−アセチルマンノスアミン標準
物はＭilli−ＱＨ₂Ｏ中に２００ｎｍｏｌ／ｍｌの濃度
で溶解された。

【０１０１】試料及び標準の加水分解 Ｐn１８Ｃ−Ｐｓのデ−Ｏ−アセチルアクションが、四
つのＮａＯＨ濃度（１，２，５，及び５０ｍＭ）、種々
の温度（４，２５，４５，及び６５℃）及び種々の時間
（３，５，及び１６時間）でＰｎ１８Ｃ−Ｐｓを処理す
ることで検討された。アセテート、ピルベート及びＮ−
アセチルマンノスアミンの標準溶液も、デ−Ｏ−アセチ
レーションのために必要な条件はまたアセテート／ピル
ベートの減成に若しくはＮ−アセチル基の損失に帰着す
るかどうかを決定する研究中に含まれた。種々の濃度
（１，１０，１００ｍＭ）、時間（３，５，及び１６時
間）、そして温度（６５，８５，及び１００℃）におけ
る水酸化ナトリウム（５０ｍＭ／１００℃／１６ｈ）若
しくは塩酸での処理を続けてＰｎ４からのピルベートの
分離が研究された。

【０１０２】比濁計 デ−Ｏ−アセチレーション若しくはデ−Ｏ−ピルビレー
ション前後のＰｎ９Ｖ−Ｐｓ、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ、及び
Ｐｎ４−Ｐｓの比濁分析的活性が測定された。試料は
１，１．５，５，及び２．５μｇ／ｍｌに希釈された。

【０１０３】高性能分子ふるいクロマトグラフィー（Hi
gh Performance Size Exclusion Chromatography：ＨＰ
ＳＥＣ） デ−Ｏ−アセチレーションまたはデ−Ｏ−ピルビレーシ
ョン前後のＰｎ９Ｖ−Ｐｓ、Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ及びＰｎ
４のＨＰＳＥＣが測定された。流量制限器を装備した
７．５ｘ６００ｍｍＴＳＫＧ６０００ＰＷカラムが５０
℃、８００−１０００ｐｓｉで加熱され０．２Ｍ酢酸ナ
トリウム０．３ｍｌ／ｍｉｎで平衡にさせた。試料６０
μｇ（１ｍｇ／ｍｌ）をカラムに注入し、移動速度０．
３ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。カラム溶離剤は０．５ｍｌ
／ｍｉｎの流速で０.５Ｍ ＮａＯＨの後カラム追加物と
混合し、Dionex パルス電流滴定検出器でモニターし
て、Ｋdを測定した。

【０１０４】アッセイ感受性及び線型性 検出器線の線型性及び感受性がピルベート及びアセテー
トの両方に対して３μジーメンスで決定された。ピルベ
ート及びアセテートは低い方の限界として０．１２５ｎ
ｍｏｌまで検出可能であった。双方の成分の検出器応答
はピルベート及びアセテートにつき各々０．９９９９及
び０．９９９２の相関係数で２ｎｍｏｌを通じて線型で
ある。

【０１０５】Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓから分離されるＯ−アセ
テートのオムティミゼーション 時間進行加水分解Ｐ１８Ｃ−Ｐｓの予備的研究は、低温
でのアルカリ加水分解に対するＯ−アセチル基の不安定
性を明らかにした。２ｍＭ水酸化ナトリウムは１６時間
の培養でＰｎ１８Ｃ−Ｐｓを完全にデ−Ｏ−アセチレー
トへ十分であった。より高い温度（＞２５℃）処理がＰ
n９Ｖ Ｏ−アセテートの測定を妨げるＮ-アセチルマン
ノスアミンからのＮ−アセテートを放出することが見い
だされた。ＰｎＰｓからのＯ−アセテートの除去のため
の最も望ましい加水分解条件は４℃で１６時間であるこ
とが見いだされた。１％以下のアセテートが室温で１６
時間２ｍＭ ＮａＯＨで処理されたＮ-アセチルマンノス
アミンの標準から分離されることが見いだされた。

【０１０６】Ｐｎ４から除去するＯ−ピルベートのオプ
ティミゼーション Ｐｎ４の加水分解研究は当初水酸化ナトリウム加水分解
を用いることによって請け負われた。水酸化ナトリウム
が用いられたときピルベートは殆ど回収されなかったと
いうことが速やかに発見された。初期の制御研究で、ピ
ルベートは１００℃でＨ₂Ｏ中のＰn４から分裂されたと
いうことを明らかにされた。この情報で、上昇温度での
ＨＣｌ加水分解を用いてＰｎ４からのＯ−ピルベート放
出のオプティミゼーション研究を行うことが決定され
た。ピルベートの幾らかの減成がより高い温度で見られ
た。これはＰｎ４同様の条件の下で加水分解されたピル
ベート標準の例で明示できる。６５℃で１６時間 １ｍ
Ｍ ＨＣｌ中で加水分解が行われたときピルベートの最
大の回収が生じた。

【０１０７】ＰｎＰｓ試料でのＯ−アセテート及びＯ−
ピルベートの分析 出発ＰｎＰｓ、サイズ化されたＰｎＰｓそして一つのＰ
ｎ１８Ｃ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ結合物を代表する種々の試料
が、Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ／１８Ｃ中のＯ−アセテートを放出
するため室温下 ２ｍＭ ＮａＯＨ中での若しくはＰｎ４
−Ｐｓ中のＯ−ピルベートを放出するため６５℃下 １
ｍＭ ＨＣｌ中での加水分解の後上述されたＨＰＬＣ法
によってＯ−アセテート／ピルベートに関して分析され
た。この研究の結果を以下に示す： 試 料 各Ｐｓ繰り返し単位に対するピルベート／ア セテートの比 Ｐｎ４、試料１ １.０ Ｐｎ４、試料２ ０.８ Ｐｎ９Ｖ、試料１ １.７ Ｐｎ９Ｖ、試料２ １.５ Ｐｎ１８Ｃ-Ｐｓ、試料１ １.０ Ｐｎ１８Ｃ-Ｐｓ、試料２ ０.８ Ｐｎ１８Ｃ-Ｐｓ-ＯＭＰＣ 水性大 ０.５ 結果は、サイズ化されたＰｎＰｓ中の側鎖基の保持はＰ
ｎ９Ｖ−Ｐｓに関しておよび９０％、そしてＰｎ４及び
１８Ｃに関して８０％であった。Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ−Ｏ
ＭＰＣ接合水性大におけるＯ−アセテートの保持はおよ
そ５０％であった。Ｐｎ１８Ｃ−ＰｓとＰｎ４の理論的
な値はＰｓ繰り返し単位１ｍｏｌ当たりアセテート若し
くはピルベート１ｍｏｌでありＰｎ９Ｖに対してその比
が２：１である。〔Jansson, P-E., Lindberg, B., 及
び Lindquist, U.'Structural studies of the capsula
r polysaccharides from Streptococcus pneumoniae Ty
pe4.'Carbohyd. Pes., ９５：７３−８０，（１９８
１）。Lugrowski, C. 及び Jennings, H. J.'Structura
l determination of the capsular polysaccharide ofS
treptococcus pneumoniae Type 18C.'Carbohyd. Pes.
１３１：１１９-１２９，（１９８４）。Perry, M. B.,
Daoust, V., 及び Carlos, D. J.' The specific caps
ular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Ty
pe 9V.'Can. J.Biochem. ５９：５２４-５３３，（１９
８１）〕。Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ−ＯＭＰＣ接合物において
見出されるＯ−アセテートのより低い保持は、低温での
アルカリ条件に対してのＯ−アセチル基加水分解の感受
性から予想される。試料Ｐｎ４、Ｐｎ９Ｖ、及びＰｎ１
８Ｃ−Ｐｓ及びデ−Ｏ−ピルビレート化された若しくは
デ−Ｏ−アセチレート化された試料の比濁計的活性が測
定された。結果は、たとえ未処理試料のＫｄでも比濁活
性はこれらの側鎖基の除去の後には完全に失われた、と
いうことを示した。Ｋｄのは上述したＨＰＳＥＣ法によ
って得られた。しかしながら、穏やかな酸加水分解によ
るデ−Ｏ−ピルビレーション後のＰｎ４のＫｄは０．６
０から０．６８に上昇し、その出現はその塩の体積に近
い。Ｐｎ４及びＰｎ１８Ｃ−Ｐｓのための抗原性日数
は、肺炎双球菌ポリサッカライド免疫学的反応性におけ
るこれらの側鎖基の重要性に関して他の調査者の仕事を
支持する。Ｐｎ９Ｖに関する結果はグルクロン酸に加え
て、この分子のＯ−アセチル基が同様に重要な免疫学的
決定因であることを示唆している。以上のように、この
方法によって、Ｐｎ４中のＯ−ピルビルケタール並びに
Ｐｎ９Ｖ及びＰｎ１８Ｃ−Ｐｓ中のＯ−アセテートの量
的分析のための、迅速で敏感な手段が開発された。この
手段はＰｎ４、Ｐｎ９Ｖ、及びＰｎ１８Ｃ−Ｐｓという
ポリサッカライドの抗原的構造を残すためにそれらのサ
イズ化と結合のための正しい過程を定義することにおい
て有意義である。

【０１０８】

【実施例３１】Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ結合物の単離 １．２つの結合反応混合物試料（一つは他方のＨ₂Ｏ透
析された試料を表わす）が使用されるまで３−８℃で保
存された。 ２．０.２ＭＯＰＳ ｐＨ７．２緩衝剤が該試料に加えら
れ、約７ｍＭという最終濃度が得られた。固体ＧｕＨＣ
ｌが該試料に加えられ、４．２Ｍという最終の濃度が達
成された（註：ＧｕＨＣｌ １.４２ｇ／試料ｍｌが、固
体のＧｕＨＣｌの添加のために体積の増加を補償するた
めに加えられなければならない。同様に、体積増加を勘
案するために緩衝剤添加が調整されなければならない。
その結果試料組成がカラム溶出液組成により接近する。
あるいは、試料はクロマトグラフィに付す前にカラム溶
出液に対し透析されることができよう）。 ３．試料の２．８ｍｌ（ローリープロテインアッセイ
（lowry protein assay）に基づいたプロテイン約１ｍ
ｇを含有する）を、０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速で６ｍＧ
ｕＨＣｌ １０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７.２において平衡に
達したセパクリル（sephacryl）Ｓ−１０００の１２.６
×９６ｃｍカラムに注入した。カラム溶出液が２８０ｎ
Ｍで連続的にモニター（perkin Elmer LC ２３５ダイオ
ードアレイ検出器）され、３ｍｌのフラクションが収集
された。 ４．プロテイン分配はＡ２８０に基づいており（スペク
トルと同じく）そしてＰｎ６Ｂ−Ｐｓ分配はＰｎ６Ｂ−
Ｐｓ特定のＲＩＡアッセイに基づいている。Ｐｎ６Ｂ−
Ｐｓ−ＢｒＡｃ単独の溶出部分に基づいて、そして不活
性化されたＭＩＥＰとの物理的な混合物において、ＰＳ
とプロテインの両方を含む断片溜を作成し、該Ｐｎ６Ｂ
−Ｐｓ−ＢｒＡｃについて観察される位置から明確に溶
出したものがＰｎ６Ｂ−Ｐｓ−ＭＩＥＰ結合物として推
定に基づいて明示された。 ５．溜はＹＭ−３０膜を用いての限外ろ過によって濃縮
され、Ｍilli−Ｑ Ｈ₂Ｏを用いてろ過された。プロテイ
ンとＰｎ６Ｂ−Ｐｓ内容量は量的組成研究から見積もら
れた。ＳＣＭＨＣはアミノ酸分析によって検出された。

【０１０９】

【実施例３２】肺炎双球菌ポリサッカライドＰｎ１８Ｃ
−Ｐｓ直接ＲＩＡアッセイ このアッセイは肺炎双球菌ポリサッカライド型１８Ｃの
計量のために用いられる。それは多層サンドイッチＲＩ
Ａアッセイである。ラビット（Rabbit）ａｎｔｉ−Ｐｎ
１８Ｃ−Ｐｓがポリスチレンビーズにヒートされる。ビ
ーズはＰｎ１８Ｃ−Ｐｓを含有する試料溶液中にて培養
される。培養後、ビーズは洗浄され、Ｐｎ１８Ｃ−ＯＭ
ＰＣに対するマウス抗体を含有する第二溶液中で再培養
される。この培養後、ビーズは洗浄され¹²⁵Ｉ-ヤギ抗マ
ウスＩｇＧを含有する溶液中で３回培養する。プレート
は再度洗浄され、その後ビーズは計量のためプラスチッ
クチューブに移される。Ｐ１８Ｃ−Ｐｓの未知の試料は
計量のため標準曲線に比較される。

【０１１０】装 置 １. ＲＩＡキット：Abbot Labs、診断法部門、カタロ
グＮｏ.６１７１−１０ ２. クイックウォッシュシステム、Abbot Labs、診断
法部門 ３. 可調整ピペット及び 使い捨てピベットチップ（エ
ッペンドルフデジタルを参照）。 ４. ガンマカウンター（Abbott Autologic 参照） ５. 鏡面仕上げの１／４”ポリスチレンビーズ、Ｐrec
ision Ｐlastic ＢallＣo., ３０００ Ｎ, Ｃicero Ａv
e., Ｃhicago, Ｉllinois ６０６４１。

【０１１１】試 薬 １． ニューヨーク州公共医療施設Ａｎｔｉ−Ｐｎ１８
Ｃ−Ｐｓ抗体ロットＲ１８−４４若しくはその等価物。 ２． マウスａｎｔｉ−Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ ＯＭＰＣア
ンチセラ（ｐｏｏｌ １１２６０−２３５若しくはその
等価物）。 ３． ゴート、アンチ−マウスＩｇＧ¹²⁵Ｉ−ラベルさ
れたアンチセラ：ＭＡ０２１１８、ボストン、アルバニ
ーストリート５４９、ニューイングランドヌクレアー、
ＮＥＸ１５９ ４． インキュベーション緩衝剤：次のものを含有する
ＲＣＭ８ １．０％ ＢＳＡ Sigma Ａ２１５３ ０．１％ アジド Sigma Ｓ２００２ ５． 希釈液 胎児牛血清 ８部 Sigma Ｆ３８８５ ヤギ血清 １部 Sigma Ｇ６７６７ ウサギ血清 １部 Sigma Ｒ４５０５ TWEEN 20 ０.０５％ Sigma Ｐ１３７９ アジド ０.１％ Sigma Ｇ２００２ ３． ａｎｔｉ−Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓコートされたビーズ
１個を試料若しくは標準物を含むプレートの各ウェルに
加え、全てのビーズが完全に緩衝物で覆われることを請
け合うために穏やかに浸透する。 ４． プレートをＲＩＡキットで供給された粘着性の裏
張で覆い、６時間室温にてプレートを培養する。 ５． プレートをクイックウォッシュ（Qwik Wash）装
置と脱イオン水を用いて洗浄する。 ６． マウスａｎｔｉ−１８Ｃ抗体を希釈液中１：１０
００に希釈する。 ７． この溶液２００μｌをビーズ一個を含む各ウェル
に加える。 ８． プレートを覆い、室温で一晩培養する。 ９． プレートをクイックウォッシュ装置と脱イオン水
を用いて洗浄する。 10. ¹²⁵Ｉ−ラベルされたヤギ、アンチ−マウス抗体
を希釈液に１５０００ｃｐｍ／１０μｌまで希釈（〜
１：１６０希釈）する。 11. この溶液２０μｌをビーズ一個を含む各ウェルに
加える。 12. プレートを覆い、３７℃で２時間培養する。 13. プレートをクイックウォッシュ装置と脱イオン水
を用いて洗浄する。 14. ＲＩＡキットで供給されるプラスチックチューブ
にビーズを移し、好適なガンマカウンターでカウントす
る。

【０１１２】計 算 １． 各サンプル、標準、及び培養緩衝コントロールの
それぞれについて平均を得るために複数の測定を共に合
わせる。全ての標準及び試料から培養緩衝コントロール
を基礎とする。 ２． 統計的な計算のために用意された計算機を使用し
て、標準線のためのデータを入力する。そして相関係数
と線の勾配を計算する。 ３． 好適な標準線を使用して（自由部分は自由部分
に、結合部分は結合部分に）、試料の応答を計算し、希
釈のために調製する。上述した同様の手段は置換型の特
定の試薬によって他のＰｎ−Ｐｓ種のいかなるものに対
しても適当である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 アーピ ハゴピアン アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴァ ニア，ランスデール，ハートレイ ドラ イヴ 771 (72)発明者 ウィリアム ジェー．ミラー アメリカ合衆国，19454 ペンシルヴァ ニア，ノース ウェールズ，オールド チャーチ ロード 232 (72)発明者 シャーロッテ シー．イプ アメリカ合衆国，19422 ペンシルヴァ ニア，ブルー ベル，チャドウィック アヴェニュー 1665 (72)発明者 ジョン ピー．ヘネシー，ジュニア アメリカ合衆国，18917 ペンシルヴァ ニア，ダブリン，フォックス ホロー ロード 114 (72)発明者 デニス ジェー．キュベク アメリカ合衆国，26426 ウエスト ヴ ァージニア，セイレム，キャロライナ アヴェニュー 76 (72)発明者 パメラ デー．バーク アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴァ ニア，ランスデール，ヨークタウン ス トリート 862 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C08B 37/00 C12P 19/04 A61K 39/00 A61K 39/09

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １分子当たり平均約１２００以下のオリ
   ゴ糖反復単位を有し、約１．０ないし１．４の範囲の多
   分散性があり、分子量約１×１０⁵ ないし１×１０⁶
   で、肺炎球菌グループ特異的なＣ多糖の混入の程度がタ
   イプ特異的な多糖の３．０％以下である肺炎連鎖球菌
   （Streptococcus pneumoniae）莢膜多糖（Ｐｎ−Ｐ
   ｓ）。
2. 【請求項２】 ０．７ないし１．１の範囲の抗原性指数
   を有し、０．６ないし３．０ｄｌ／ｇの範囲の固有粘度
   があり、サブタイプ１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、
   ８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５
   Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、
   ２３Ｆ、及び３３Ｆのいずれかから選ばれる肺炎連鎖球
   菌（Streptococcus pneumoniae）に由来する請求項１記
   載の多糖。
3. 【請求項３】 １．０ないし１．４の範囲のサイズ多分
   散性があり、タイプ特異的な多糖に対するＣ多糖の混入
   の程度が３％以下であって： １）該多糖が、 ａ）約３×１０⁵ ないし６×１０⁵ の範囲のＭ_N 、 ｂ）約０．６０±０．０５のＫｄ（ピーク）、 ｃ）約３×１０⁵ ないし７×１０⁵ の範囲のＭ_W 、 ｄ）ｐＨ７．２、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で１．０
   ないし２．０の範囲の固有粘度、及び ｅ）平均して１分子あたり約１０００以下の反復単位を
   有する肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）６
   Ｂ； ２）該多糖が、 ａ）約３×１０⁵ ないし８×１０⁵ の範囲のＭ_N 、 ｂ）約０．６０±０．０５のＫｄ（ピーク）、 ｃ）約４×１０⁵ ないし１×１０⁶ の範囲のＭ_W 、 ｄ）ｐＨ７．２、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で０．６
   ないし１．６の固有粘度、及び ｅ）平均して１分子あたり約１２００以下の反復単位を
   有する肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）１
   ４； ３）該多糖が、 ａ）約２×１０⁵ ないし６×１０⁵ の範囲のＭ_N 、 ｂ）約０．６５±０．０５のＫｄ（ピーク）、 ｃ）約２×１０⁵ ないし６×１０⁵ の範囲のＭ_W 、 ｄ）ｐＨ７．２、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で１．０
   ないし２．０の範囲の固有粘度、及び ｅ）平均して１分子あたり約１０００以下のモノマー反
   復単位を有する肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoni
   ae）１９Ｆ； ４）該多糖が、 ａ）約２×１０⁵ ないし６×１０⁵ の範囲のＭ_N 、 ｂ）約０．５４±０．０５のＫｄ（ピーク）、 ｃ）約４×１０⁵ ないし８×１０⁵ の範囲のＭ_W 、 ｄ）ｐＨ７．２、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で１．５
   ないし３．０の範囲の固有粘度、及び ｅ）平均して１分子あたり約１０００以下のモノマー反
   復単位を有する肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoni
   ae）２３Ｆ； ５）該多糖が、 ａ）約２×１０⁵ ないし４×１０⁵ の範囲のＭ_N 、 ｂ）約０．６５±０．０５のＫｄ（ピーク）、 ｃ）約２×１０⁵ ないし５×１０⁵ の範囲のＭ_W 、 ｄ）ｐＨ７．２、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で１．０
   ないし３．０の範囲の固有粘度、及び ｅ）平均して１分子あたり約６００以下のモノマー反復
   単位を有する肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia
   e）４； ６）該多糖が、 ａ）約３×１０⁵ ないし６×１０⁵ の範囲のＭ_N 、 ｂ）約０．６５±０．０５のＫｄ（ピーク）、 ｃ）約３×１０⁵ ないし７×１０⁵ の範囲のＭ_W 、 ｄ）ｐＨ７．２、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で１．０
   ないし２．０の範囲の固有粘度、及び ｅ）平均して１分子あたり約８００以下のモノマー反復
   単位を有する肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia
   e）９Ｖ；又は ７）該多糖が、 ａ）約２×１０⁵ ないし６×１０⁵ の範囲のＭ_N 、 ｂ）約０．６５±０．０５のＫｄ（ピーク）、 ｃ）約２×１０⁵ ないし６×１０⁵ の範囲のＭ_W 、 ｄ）ｐＨ７．２、０．１Ｍリン酸ナトリウム中で１．５
   ないし３．０の範囲の固有粘度、及び ｅ）平均して１分子あたり約７００以下のモノマー反復
   単位を有する肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia
   e）１８Ｃに由来する請求項２記載の多糖。
4. 【請求項４】 １ないし７つのサブタイプの肺炎連鎖球
   菌（Streptococcuspneumoniae ）に対するワクチンとし
   て有用であって、不活性担体及び１つ又はそれ以上の接
   合していない形態の請求項３記載のＰｎ−Ｐｓ化合物を
   含み、任意に、さらに抗ウイルス、抗菌又は免疫調節作
   用のある免疫原か化合物を含む組成物であって、前記の
   付加的な抗ウイルス、抗菌又は免疫調節作用のある化合
   物が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、又は
   ミョウバン、又はＦｒｅｕｎｄｓアジュバントかＲｉｂ
   ｉアジュバント、インターロイキンかインターフェロン
   の中から選ばれるか、あるいは、Ｂ型肝炎、Ａ型肝炎、
   非Ａ非Ｂ型肝炎、エイズ、ジフテリア、百日咳、破傷
   風、はしか、おたふくかぜ、風疹、不活化したポリオ、
   水痘及びインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）
   ６に対する１つ又はそれ以上のワクチンの中から選ばれ
   る組成物。
5. 【請求項５】 １分子当たり約１２００以下のオリゴ糖
   反復単位を持ち、分子量が１×１０⁵〜１×１０⁶であ
   り、１．４以下の多分散性を有する肺炎連鎖球菌（Stre
   ptococcus pneumoniae）莢膜多糖（Ｐｎ−Ｐｓ）の製造
   方法であって： ａ）ｉ）肺炎連鎖球菌を培養し、病原体生物を殺して、
   未精製莢膜多糖を単離するか、あるいは、 ii）ＡＴＣＣから入手できる未精製の肺炎連鎖球菌莢膜
   多糖を可溶化し； ｂ）酵素的処理、化学的処理、加熱処理、もしくは音波
   処理によって多糖を部分的に加水分解するか、または、
   多糖を物理的に剪断し； ｃ）工程（ｂ）の生成物を分画することを含む莢膜多糖
   の製造方法。
6. 【請求項６】 前記工程（ｂ）と（ｃ）が、 ｂ）ｉ）前記Ｐｎ−Ｐｓを部分的に加水分解する前に、
   任意に、不純物のイオン交換吸着によって未精製Ｐｎ−
   Ｐｓを精製し； ii）未精製Ｐｎ−Ｐｓを部分的に加水分解するか、又は
   機械的に剪断し；そして ｃ）大きさと純度に応じて、部分的に加水分解したＰｎ
   −Ｐｓを分画化する請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 前記工程（ｂ）と（ｃ）が、 ｂ）ｉ）ｐＨ約５の溶液で、任意に陰イオン不純物をＷ
   hatman ＤＥ５２ に吸着し； ii）以下のようにして、溶液中のＰｎ−Ｐｓを部分的に
   加水分解して、抗肺炎球菌にタイプ特異的な抗体に結合
   するＰｎ−Ｐｓを未精製Ｐｎ−Ｐｓの３０％を超えない
   ように減少させるように前もって決定した最終粘度にす
   る。すなわち： １．５０ないし１５０℃で１ないし４８時間加熱し； ２．音波処理プローブの出力設定に応じて５秒ないし５
   分間の音波処理を行なった後、冷却時間をおいてさらに
   音波処理をするか；又は、 ３．Ｇaulin ホモジナイザー内で圧力２０００ないし１
   ５０００ＰＳＩで多糖を物理的に剪断し；そして ｃ）以下の方法で、加水分解したＰｎ−Ｐｓを分画化し
   て、１×１０⁵ ないし１×１０⁶ の範囲の分子量を有す
   る分画を抜き出す。すなわち： ｉ）所望の範囲の分子量のＰｎ−Ｐｓを沈殿させるよう
   に前もって決定した濃度のイソプロパノールを用いて、
   アルコール可溶性の差を利用するか；又は ii）分子量１×１０⁴ ないし１×１０⁶ の範囲の多糖を
   とりこんで分画化することのできるサイズ排除液体クロ
   マトグラフィーで分画化する請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 加水分解又は剪断の終点を、下に掲げる
   各サブタイプのＰｎ−Ｐｓに対する終点に従って、０．
   ９Ｍ塩化ナトリウム中の１ｍｇ／ｍｌ溶液の粘度法によ
   って、あるいは、多糖のクロマトグラフィーによって決
   定する、請求項７記載の方法。 Ｐｎ−Ｐｓサブタイプ 目標終点粘度 目標終点Ｋｄ（ピーク） （センチストローク） Ｐｎ４−Ｐｓ １.５ − １.００ ０.６５ ± ０.０５ Ｐｎ６Ｂ−Ｐｓ １.３ − １.００ ０.６０ ± ０.０５ Ｐｎ９Ｖ−Ｐｓ １.３ − １.００ ０.６５ ± ０.０５ Ｐｎ１４−Ｐｓ １.２ − ０.９５ ０.６０ ± ０.０５ Ｐｎ１８Ｃ−Ｐｓ １.５ − １.００ ０.６５ ± ０.０５ Ｐｎ１９Ｆ−Ｐｓ １.３ − １.００ ０.６５ ± ０.０５ Ｐｎ２３Ｆ−Ｐｓ １.５ − １.００ ０.５４ ± ０.０５
9. 【請求項９】 請求項５記載の方法で製造したＰｎ−Ｐ
   ｓ。