JP3237842B2

JP3237842B2 - ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン

Info

Publication number: JP3237842B2
Application number: JP50093590A
Authority: JP
Inventors: クレランドパトン，ジェームズ; ジョンハンズマン，デビッド; ジョンボウルノイス，グレアム; ウイリアムアンドリュー，ピーター; ジョンミッチェル，ティモシィ; アーサーウォーカー，ジョン
Original assignee: オランダ国; ジョンハンズマン，デビッド; ジョンボウルノイス，グレアム; ウイリアムアンドリュー，ピーター; ジョンミッチェル，ティモシィ; アーサーウォーカー，ジョン
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 2001-12-10
Anticipated expiration: 2016-12-10
Also published as: AU4756490A; ATE205534T1; FI103122B; AU626961B2; DK173629B1; EP0449856B1; NO912226L; WO1990006951A1; DE68929323T2; FI912878A0; NO912226D0; FI103122B1; ES2160570T3; EP0449856A4; DK115591A; RU2121481C1; DK115591D0; CA2005704C; JPH04503948A; NO304317B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、毒素ニューモリシンのミュータント及びこれ
らミュータントに基づくニューモコッカルワンチンに関
する。

背景ストレプトコッカスニューモニエ（ニューモコッカ
ス）〔Streptococcus pneumoniae（pneumococcus）〕
は、肺炎、髄膜炎及び菌血症のような侵襲性疾患を引き
起こす、重要な病原体である。抗生物質治療が自由にな
しうる地域でさえも、肺炎球菌による肺炎の死亡率は、
入院患者で19％もあり、菌血症を伴なる患者では30−40
％に増加する。これらの高い死亡率は、S.ニューモニア
が最も普通の原因であるところの肺炎が死亡の第５位に
ランクされている米国で報告されている。事実、肺炎
は、米国において死亡の10大原因のうちで、唯一の感染
疾患である。米国において肺炎球菌髄膜炎の死亡率は13
−45％である。発展途上国では、５歳以下の300万人を
越える小供が毎年肺炎で死亡しており、S.ニューモニア
は最も普通の原因因子である。S.ニューモニアは、中耳
炎や副鼻腔炎のようなやや深刻で、よく流行している感
染症も引き起こし、これは発展途上国において保健費用
に重大なインパクトを与えている。中耳炎は幼児に特に
重要であり、副鼻腔炎は小供および成人に影響してい
る。

1970年の終りに、重大な感染症、特に細菌性肺炎の防止
および劇症肺炎球菌性疾患に特に敏感な脾臓摘出患者や
小児のようなグループを保護することを目的として、ワ
クチンがライセンスされた。このワクチンは、カプセル
状ポリサッカライドでできており、優れた肺炎球菌性表
面抗原である。しかしながら、S.ニューモニアの各セロ
タイプ（83存在）は、構造的に顕著なカプセル状のポリ
サッカライドであり、あるセロタイプでの免疫化は、残
りの大多数に対して保護を与えない。

オーストラリアで最近ライセンスされたワクチンは、23
の最も普通のセロタイプから精製されたポリサッカライ
ドを含み、このセロタイプは、この国での肺炎感染の約
90％の原因となっている。このワクチンに含まれたそれ
らのセロタイプに対してさえ保護は決して完全ではな
く、ワクチンを受けた高いリスクの固体に生じる重大
な、致命的ですらある感染のいくつかの報告がある。こ
のワクチンの効力は小児で最も弱く、アデレードでなさ
れた研究を含むいくつかの研究は、現存する製剤は、こ
のグループにほとんどか全く明白な治療的利益を持たな
いことを示している。

このワクチンの明らかな欠点は、５才以下の小供のある
種の肺炎球菌性ポリサッカライドの貧弱な免疫原性に関
係しているように思われる。我々は、抗体反応が、小供
に最も普通に病気を引き起こす５つのセロタイプ（タイ
プ６、14、18、19及び23）に特に貧弱であることを示し
た。実際、これらの肺炎球菌性ポリサッカライドに対す
る抗体反応は、ワクチン時、８歳以上の小供で成人のレ
ベルに近ずくだけである。

これを考慮すれば、カプセル状ポリサッカライド以外の
抗原を含むワクチンは肺炎感染から小児を保護すること
が必要とされているように思える。そのような抗原のひ
とつはニューモリシンで、すべての病毒性S.ニューモニ
アが生産する蛋白毒素が単離される。

この蛋白でマウスを免疫すると肺炎感染からある段階の
保護を与えることが判明した。

しかしながら、ニューモレシンはヒトに有害であるとい
う困難がある。従って、ワクチンに含まれるニューモレ
シンは、実質的に無毒でなければならない。しかしなが
ら、たいていの現在とられている方法によりニューモレ
シンを無毒にすることは、基本的な蛋白のコンフィギュ
レーションを変化させ、免疫原的にネーティブまたは野
性型のニューモレシンと異なるものとしてしまう。免疫
原的にネーティブなニューモリシンと異なる変化した蛋
白により引き出された免疫反応は小さな保護能力を持つ
か又はほとんど保護能力を持たないであろう。従って、
困難さは、無毒で且つ同時に保護的免疫反応を引き出す
べく毒性の形態に免疫原的に十分類似な変化したニュー
モリシンを製造することにある。

上記特性を有する変化したニューモリシンはワクチンに
おいてたくさんの方法で使用しうる。従って、変化した
ニューモリシンは、それ自体で免疫するのに使用するこ
とができ、又、代わりに、変化したニューモリシンは肺
炎球菌性ポリサッカライドに抱合することができ、又は
代わって、肺炎球菌性ポリサッカライドが、もうひとつ
の蛋白と抱合され且つ変化したニューモリシンが非抱合
型でのみ存在するところのワクチン中に含むことができ
る。代わって、肺炎球菌性ポリサッカライド及びニュー
モレシンが共に非抱合型で使用することができる。

発明の記述従って広くみて、発明は、実質的に無毒で、且つ野生型
ニューモリシンに反応的な動物での免疫反応を引き出す
ことのできる変化したニューモリシンに存在すると言え
る。

好ましくは、この変化したニューモリシンは、野生型ニ
ューモリシンと比較して少ない相補結合活性を有する。
この結合活性での減少は、ワクチンを投与する部位での
より少ない炎症をもたらす。

好ましくは、この変化したニューモリシンは、野生型ニ
ューモリシンについて１以上のアミノ酸の置換により変
化させられる。

このニューモリシンは、野生型ニューモリシンの残基サ
イト 367、384、385、428、433又は435のいずれかひと
つ又はひとつ以上に存在するアミノ酸が置換されるか、
除去されるか又はブロックされるという点で変化させら
れていても良い。

更に、本発明は変化したニューモリシンを含むワクチン
に存在すると言うことができ、この変化したニューモレ
シンは、無毒であり且つ野生型ニューモレシンに反応的
な動物での免疫反応を引き出すことができるものであ
る。好ましくは、ワクチンは、変化したニューモリシン
と抱合したカプセル状ポリサッカライド物質を含む。

カプセル状物質はストレプトコッカスニューモニア
セロタイプ 6A、6B、14、18C、19A、19F、23F、１、
２、３、４、５、7F、８、9N、9V、10A、11A、12F、15
B、17F、20、22F及び33Fのいずれか１つ以上から由来し
たものであって良い。

この例では、小供の病気に普通関連し、且つ小供が一般
的に弱い免疫反応を有するセロタイプを特異的に目標と
しうる（例えば、ダーニッシュセロタイプ6A、6B、14、
18C、19A、19F及び23F）。この23−価メルクシャープ
アンドドームワクチン（ニューモバックス23）に含
まれる他の通常のセロタイプも、しかし又抱合体（例え
ば、タイプ１、２、３、４、５、7F、８、9N、9V、10
A、11A、12F、15B、17F、20、22F及び33F）又は実に他
のいかなるセロタイプを合成するのに使用しうる。蛋白
キャリアに対する如何なる肺炎球菌性ポリサッカライド
の抱合は、小供での良好なＴ−細胞依存免疫原性を確実
にし、抗ポリサッカライド抗体の保護レベルが作られ
る。変化したニューモレシンとカプセル状物質とのコン
ビネーションは、特別の段階の保護、特に、そのポリサ
ッカライドは現存するワクチン製剤には含められていな
いS.ニューモニアのセロタイプに対して、を確実にす
る。ワクチンは、好ましくは、アルミナゲルのような承
認された助剤を伴なうか又は伴なわずして皮下注射によ
って投与する。

別に、本発明は、レプリコンと変化したニューモリシン
をコードするDNA配列を含むリコンビナントクローンに
存在すると言え、この変化したニューモリシンは、無毒
的で且つ野生型ニューモリシンに反応的な動物での免疫
反応を引き出すことができる。

更に、本発明は変化したニューモリシンをコードするDN
Aを有するリコンビナントクローンを含む発現システム
から変化したニューモリシンを精製する工程を含む変化
したニューモリシンを製造する方法にあると言うことが
でき、このニューモリシンは、無毒的で且つ野生型ニュ
ーモリシンに反応的な動物での免疫反応を引き出すこと
ができる。

好ましくは、この発現システムは、変化したニューモリ
シンをコードするDNAを有するリコンビナントクローン
を含むホストセルの培養である。

他に、本発明は、変化したニューモリシンをコードする
リコンビナントクローンを増幅し、クローンされた物質
のトランスクリプション及びトランスレーションをイン
デュースし、変化したニューモリシンを精製する工程、
及び変化したニューモリシンをカプセル状のポリサッカ
ライドと抱合する工程を含み、この変化したニューモリ
シンは、野生型ニューモリシンと比較して実質的に減少
した毒活性を有する、ワクチンの製造法に在ると言え
る。本発明をより理解するために、本発明の特定の例を
図を参照して述べる。ここで、図１は、野生型ニューモリシンをコードする遺伝子のDN
A配列である。

図２は、発現ベクター中にニューモリシン遺伝子をクロ
ーニングするのに使用した野生型ニューモリシンをコー
ドする変化した遺伝子のDNA配列である。

図３は、野生型ニューモリシンをコードする遺伝子のDN
A配列から由来した野生型ニューモリシンのアミノ酸配
列である。そして、図４は、部位直接変位誘発（site directed mutagenesi
s）により導入されたアミノ酸置換を示すニューモリシ
ンのアミノ酸配列を示す。リコンビナントDNA技術は、
ヒトへの投与に適した無毒ニューモリシン誘導体を構築
するために使用した。これを達成するために、ニューモ
リシンをコードするS.ニューモニア遺伝子を大腸菌中に
クローンし、その完全DNA配列を決定した。このDNA配列
を図１に示し、派生したアミノ酸配列を図３に示す。

ニューモリシンの３領域をオリゴヌクレオチド指示変異
誘発（oligonucleotide−directed mutagenesis）にか
けた。第１の領域は、蛋白配列中で、アミノ酸427−437
をコードし、図３において下線を引いて示されている。
この11アミノ酸配列は、他の関連するチオール活性化ト
キシンの類似の領域と絶対的ホモロジーを示し、従っ
て、溶血活性；従ってトキシンの毒性活性の原因となる
と考えられる。他の２つの領域は、アミノ酸257−297及
びアミノ酸368−397をコードし、図３において下線を引
いて示されている。これらの２つのトキシンの領域はヒ
トＣ−反応性蛋白（CRP）にホモロジーな重要なアミノ
酸配列を持ち、推測により、イムノグロブリンのFc領域
に結合するニューモリシンの能力の原因となり、かつ補
体を活性化するものと考えられる。１つのアミノ酸置換
から生じた、ニューモリシン遺伝子の15の別々の変異を
図４に示すように構築した。変化したニューモレシンの
構造を維持しようとする際に、コンサーバティブ置換を
行い、アミノ酸を類似の性質のアミノ酸と置換した。

溶血活性に含まれる領域にとって、Cys₄₂₈→Gly、Cys
₄₂₈→Ser、Trp₄₃₃→Phe、Glu₄₃₄→Asp及びTrp₄₃₅→Phe
それぞれは、溶血活性をそれぞれ、97％、90％、99％、
75％及び90％減少させた。この領域でのその他の変異
（Cys₄₂₈→Ala,Glu₄₃₄→Gln及びTrp₄₃₆→Phe）は、溶血
活性に影響を与えなかった。標的細胞膜に結合するのに
原因すると考えられているトキシンの別の領域を変異さ
せることも又蛋白の溶血性に影響を与えると考えられて
いる。この置換、His₃₆₇→Arg、は、溶血性を完全に阻
害する。His₃₆₇→Argは、それゆえ、溶血活性に原因と
なると考えられている11のアミノ酸での置換よりもより
この阻害活性を示すという点で、このことは全く予期し
えない知見である。

CRP−様ドメインでの変異を補体を活性化する能力のた
めテストした。Trp₃₇₉→Phe、Tyr₃₈₄→Phe、Asp₃₈₅→As
n及びTrp₃₉₇→Pheで、補体活性化は、それぞれ20％、70
％、100％及び15％減少した。図４の示すCRP−様ドメイ
ンでのその他の変異は、補体活性化を減少しない。主要
なことに、溶血活性か又は補体活性化のいずれかに影響
を与える上記変異は、ネーティブ又は野生型ニューモリ
シンと比較して蛋白の免疫原性を損なわない。

従って、His₃₆₇→Argは、溶血活性を減少させる好まし
い変異であるけれども、溶血活性を減少させる２以上の
ニュータントのコンビネーションが、溶血活性での非常
に高いレベルの減少を達成することができる。同様に、
Asp₃₈₅→Asnは、少ない補体活性化を達成するのに好ま
しい変異であるが、この活性をより低いレベルにする２
以上の他の変異のコンビネーションも又使用できる。

好ましい例では、ワクチンで使用されるニューモリシン
誘導体は上記変異のあるコンビネーションを含んでお
り、蛋白がゼロ溶血活性を持つのに加えて補体を活性化
することができない。このようなコンビネーションの例
は、１） His₃₆₇→Arg＋Asp₃₈₅→Asn、２） His₃₆₇→Arg＋Asp₃₈₅→Asn＋次のいずれか、Cys
₄₂₈→Gly又はTrp₄₃₃→Phe ３） Asp₃₈₅→Asn＋Cys₄₂₈→Gly＋Trp₄₃₃→Phe これらは、好ましいコンビネーションであるが、変異の
他のコンビネーションがワクチンで使用する変化したニ
ューモリシンを作り上げることができることを理解すべ
きである。更に、この変化したニューモリシンは、十分
に低下した活性を有するどのような個々の変異を含んで
も良い。変化したニューモリシンをコードするDNAから
の変化したニューモリシンの高レベル発現は、以下の発
現を含む多数の従来技術のどれかを用いて達成すること
ができる。即ち、現在入手しうる多数の発現ベクターの
どれかの中で適切にクローンされた、又はホスト染色体
の中で適切にクローンされたDNAを有するプロカリオチ
ックホストでの発現、発現ベクターの内でか又はホスト
の染色体の内でクローンされたかのいずれか適切にクロ
ーンされたDNAを有するオイカリオチックホスト中での
発現、又は、変化したニューモリシンの発現に必要な精
製コンポーネントを含むようなインビトロ発現システ
ム。変異したニューモリシン遺伝子の高レベル発現を達
成するため、大腸菌又は他の同様なプロカリオート内で
の発現のたの、それをベクターpKK233−２中にクローン
した。このベクターは、アンピシリンおよびテトラサイ
クリン耐性遺伝子、trcプロモーター（IPTG〔イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド〕）及びNcor制
限部位を含んだATG開始コドンに近接したlacZリボゾー
ム結合サイトを含んでいた。開始コドンからの下流直近
に、Pst IおよびHind IIIの制限部位、ひきつづき、強
力なT₁T₂トランスクリプションターミネーターがあ
る。pKK233−２への挿入に先立ち、図２に示すようにオ
リゴヌクレオチド−指向変異によりニューモリシンコー
ド配列の5'末端（開始コドン）にNco1制限部位を構築し
た。これにより、変化したニューモリシン遺伝子の近位
端がpKK233−２のNco1部位にクローンされ、ニューモリ
シンターミネーションコドンから約80塩基下流のHind I
II部位が変化した遺伝子をpKK233−２のコンパチブルな
部位にスプライスするのに使用された。このニューモリ
シン誘導体ミュータントは、しかしながら、多数の高発
現ベクターシステムのどれにもクローンすることができ
る。

このミュータントニューモリシンは、次のようにして製
造する。即ち、上記リコンビナントプラスミドを有する
大腸菌細胞を最初ルナベルタニ（Luna Bertani）（又は
他の適切な）培地、適当な抗生物質添加、37℃、空気供
給中で９リッター培養で生育させる。培養が生育のロガ
リスミックフェーズの終りに達した時、IPTGを最終濃度
20μＭになるよう添加し（変化したニューモリシンの発
現をインデュースするため）、そして培養をさらに２か
ら３時間継続する。

細胞をその後遠沈またはウルトラ濾過によりハーベスト
し、EDTA及びライソザイムによる処理、その後超音波処
理又はフレンチプレッシャーセル中での崩壊により溶解
した。

細胞破片を遠心分離により除去し、抽出物をその後10mM
リン酸ナトリウム（pH7.0）で広く透析した。この物質
をそれからDEAE−セルロースカラムにかけ、リン酸ナト
リウムの10−250mMの直線状勾配で溶出した。ニューモ
リシン誘導体のピークレベルを含むフラクションをプー
ルし、ウルトラ濾過により濃縮し、セファクリルＳ−20
0カラムにかけた。このカラムを50mMリン酸ナトリウム
（pH7.0）にディベロップし、再びニューモリシン誘導
体の高レベルフラクションをプールし、ウルトラ濾過に
より濃縮し、−15℃で50％グリセロール中に貯えた。最
終生成物は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
判定して純度95％以上である。フェニルセファロース上
疎水性インタラクションクロマトグラフィーは、使用し
うる別の精製である。しかしながら、これは変化したニ
ューモリシンのひとつの精製法にしかすぎず、他の別の
方法（高速液体クロマトグラフィーを含む）が使用でき
ることを理解すべきである。

この精製された変化ニューモリシンは、適当なレベル
で、それ自体又は他の抗原とのコンビネーションでワク
チンとして投与することができる。ニューモリシンは、
上記した肺炎球菌株の変種のいずれか１以上から由来す
るポリサッカライドと抱合しうる。

ミュータント、ニューモレシンは、一連の方法によっ
て、種々のセロタイプのポリサッカライドに抱合しう
る。まず、純粋なポリサッカライド（商業的に入手可
能）をシアノジェン−ブロミド及びアジピン酸ジヒドル
ジド（ADH）で処理することにより活性化ポリサッカラ
イドの製造を含む。このADH−ポリサッカライドはそれ
から１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド−HClの存在下、ミュータント、ニュー
モリシンと結合する。抱合された物質をセファロースCL
−4Bを通してクロマトグラフィーにより反応物から分離
する。

別に、ポリサッカライド−ミュータントニューモリシン
抱合体をＮ−スクシニミジル−６（4'−アジド−2'−ニ
トロフェニルアミノ）ヘキサノエート（SANPAH）のよう
な２官能反応体によって製造することができる。強力な
白色光源のもと、リン酸バッファー食塩水中とかした純
粋ポリサッカライドをSANPAHと反応させる。セファデッ
クスＧ−50上クロマトグラフィーにより、活性化ポリサ
ッカライドから、未反応SANPAHを分離した。活性化ポリ
サッカライドをそれから0.2Mホウ酸バッファー（pH8.
5）中でミュータント、ニューモリシンと抱合させる。
リジンにより、過剰の反応基をブロックし、ポリサッカ
ライド−蛋白抱合体を、セファロースCL−4B上のクロマ
トグラフィーにより他の反応体から分離した。抱合体
は、シアノボロハイドライドを用いて、還元性アミネー
ションによっても又製造することができる。又、非活性
化破傷風毒素のような他の蛋白を所望のポリサッカライ
ドで抱合することができ、変化したニューモリシンを、
非抱合型でこのワクチンに加えることができる。本明細
書では、本発明を実施するのに最良の方法を述べている
が、本発明は、これらに限定されないことを理解すべき
である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/09 ＡＤＺＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｐ 21/02 1:46）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ａ６１Ｋ 37/02 1:46）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:46） (73)特許権者 999999999 ボウルノイス，グレアムジョンイギリス国エルイー１９エイチエヌ, ライセスターシャー，キブワースボシャンプ，プロスペクトロード，26 (73)特許権者 999999999 アンドリュー，ピーターウイリアムイギリス国エルイー１９エイチエヌ, ライセスターシャー，リースター，チャペルレーン７ (73)特許権者 999999999 ミッチェル，ティモシィジョンイギリス国ディイー12 ７エーエースタッフォードシャー，バートン ― オン ― トレント，アップルバイマグナ，モウバイズレーン 25 (73)特許権者 999999999 ウォーカー，ジョンアーサーアメリカ合衆国38104 テネシー州，メンフィス，エス．マックリン 51，ナンバー 11，トレイモアアパートメンツ (72)発明者パトン，ジェームズクレランドオーストラリア国5063，サウスオーストラリア，パークサイド，フォスターストリート 49 (72)発明者ハンズマン，デビッドジョンオーストラリア国5067，サウスオーストラリア，ローズパーク，アレクサンドラアベニュー 66 (72)発明者ボウルノイス，グレアムジョンイギリス国エルイー１９エイチエヌ, ライセスターシャー，キブワースボシャンプ，プロスペクトロード，26 (72)発明者アンドリュー，ピーターウイリアムイギリス国エルイー１９エイチエヌ, ライセスターシャー，リースター，チャペルレーン７ (72)発明者ミッチェル，ティモシィジョンイギリス国ディイー12 ７エーエースタッフォードシャー，バートン ― オン ― トレント，アップルバイマグナ，モウバイズレーン 25 (72)発明者ウォーカー，ジョンアーサーアメリカ合衆国38104 テネシー州，メンフィス，エス．マックリン 51，ナンバー 11，トレイモアアパートメンツ (56)参考文献ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ（1986）ｐ．50−55

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に非毒性でありかつ野生型ニューモ
リシンに対して保護的免疫応答を誘導することのできる
変化したニューモリシンであって、以下に示すアミノ酸
配列のうち該アミノ酸配列の367−397及び427−437の領
域のいずれかもしくは両者の領域において少なくとも１
つのアミノ酸残基が置換によって変化している変化した
ニューモリシン。
【請求項２】野生型ニューモリシンと比較して減少した
補体結合活性を有する請求項１の変化したニューモリシ
ン。
【請求項３】野生型ニューモリシンと比較して減少した
Fc結合活性を有する請求項１又は２のいずれかの変化し
たニューモリシン。
【請求項４】変化したニューモリシンが、野生型ニュー
モリシンの１以上のアミノ酸の置換により変化させられ
た請求項１、２又は３の変化したニューモリシン。
【請求項５】次のアミノ酸配列：ここで、R₁は、His又はArgであり、R₂はTrp又はPheであ
り、R₃はTyr又はPheであり、R₄はAsp又はAsnであり、R₅
は、Trp又はPheであり、R₆は、Cys、Gly又はSerであ
り、R₇は、Trp又はPheであり、R₈は、Glu、又はAspであ
り、R₉は、Trp又はPheであり、そして、R₁、R₆、R₇、R₈
又はR₉の少くとも１つの残基が、野生型と異なってい
る、を有する変化したニューモリシン。
【請求項６】R₁がArgであり、R₂がTrpであり、R₃がTyr
であり、R₄がAsnであり、R₅がTrpであり、R₆がCysであ
り、R₇がTrpであり、R₈が、Gluであり、そしてR₉がTrp
である請求項５の変化したニューモリシン。
【請求項７】請求項１乃至６のいずれか１項の変化した
ニューモリシンをコードするDNA配列を含むリコンビナ
ントプラスミド。
【請求項８】リコンビナントプラスミドがホストセル内
でDNAをコードする変化したニューモリシンの発現を操
作できるインデューシブルエクスプレッションコントロ
ールを含む、請求項７のリコンビナントプラスミドを含
むハイブリッドホストセル。
【請求項９】請求項１乃至６のいずれか１項の変化した
ニューモリシンをコードするDNAを有するリコンビナン
トプラスミドを含む発現システムから変化したニューモ
リシンを精製する工程を含む変化したニューモリシンを
製造する方法。
【請求項１０】請求項１乃至６のいずれか１項の変化し
たニューモリシンをコードするDNAを有するリコンビナ
ントクローンを含むホストセルのカルチャーから変化し
たニューモリシンを精製する工程を含む変化したニュー
モリシンを製造する方法。