JP2849460B2 - 新規化合物ａ―７０６１５物質及びその製造法 - Google Patents
新規化合物ａ―７０６１５物質及びその製造法Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、トレハラーゼ阻害活性を有する新規化合物
Ａ−70615及びその製造法に関する。
Ａ−70615及びその製造法に関する。
（従来の技術） 従来、トレハラーゼ阻害活性を示す物質としては、抗
もんがれ病薬として使用されている農薬用抗生物質バリ
ダマイシン（武田薬品工業）が報告されており、このバ
リダマイシンの作用メカニズムは、病原菌リゾクトニ
ア．ソラニの貯蔵糖であるトレハロースをエネルギー源
であるグルコースに転換する酵素トレハラーゼを阻害す
ることによって薬効を示すことが明らかにされている
（N.Asano et.al.J.Antibiotics Vol.40,526（1987）,
M.Ueda et,al.Agric.Biol.Chem.Vol.49,3485−3491（19
85））。
もんがれ病薬として使用されている農薬用抗生物質バリ
ダマイシン（武田薬品工業）が報告されており、このバ
リダマイシンの作用メカニズムは、病原菌リゾクトニ
ア．ソラニの貯蔵糖であるトレハロースをエネルギー源
であるグルコースに転換する酵素トレハラーゼを阻害す
ることによって薬効を示すことが明らかにされている
（N.Asano et.al.J.Antibiotics Vol.40,526（1987）,
M.Ueda et,al.Agric.Biol.Chem.Vol.49,3485−3491（19
85））。
（手段） トレハラーゼは、カビ、昆虫等の貯蔵糖であるトレハ
ロースを、エネルギー源であるグルコースに分解する酵
素である。従って、トレハラーゼ阻害剤は、抗カビ、殺
虫（昆虫制御剤）等の用途に有用であると思われる。
ロースを、エネルギー源であるグルコースに分解する酵
素である。従って、トレハラーゼ阻害剤は、抗カビ、殺
虫（昆虫制御剤）等の用途に有用であると思われる。
本発明者らは、抗カビ、殺虫活性を有する化合物とし
て、トレハラーゼを阻害する物質を探索し、鋭意研究を
重ねた結果、土壌より分離したミクロモノスポラ属に属
する菌SANK 62390株（微工研菌寄第11631号）の培養物
から、トレハラーゼ阻害活性を有する新規化合物Ａ−70
615が生産されることを見出し、本発明を完成した。
て、トレハラーゼを阻害する物質を探索し、鋭意研究を
重ねた結果、土壌より分離したミクロモノスポラ属に属
する菌SANK 62390株（微工研菌寄第11631号）の培養物
から、トレハラーゼ阻害活性を有する新規化合物Ａ−70
615が生産されることを見出し、本発明を完成した。
（発明の構成） 本発明は、新規化合物Ａ−70615及びその製造方法に
関する。
関する。
本発明の新規化合物Ａ−70615は、下記の構造式
（Ｉ）及び物性を有する。
（Ｉ）及び物性を有する。
１）構造式 ２）物性 １）性質：塩基性白色粉末 ２）溶解性：水、メタノールに可溶。アセトン、クロ
ロホルムに不溶。
ロホルムに不溶。
３）呈色試験：硫酸に陽性 ４）分子式:C13H22N2O10 ５）分子量:366（FAB−マススペクトル） ６）比旋光度：［α］D 25＋99.5゜（c0.41,水） ７）紫外線吸収スペクトル：λmaxnm（E1cm １％） 水溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、220nm
以上に特徴的な吸収を示さない。
以上に特徴的な吸収を示さない。
８）赤外線吸収スペクトル：νmax KBrcm-1 KBrディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは第１
図に示すとおりである。
図に示すとおりである。
９）1H−核磁気共鳴スペクトル：δppm 重水中、外部基準にTMS（トリメチルシラン）を使用
して測定した1H−核磁気共鳴スペクトル（400MHZ）は第
２図に示すとおりである。
して測定した1H−核磁気共鳴スペクトル（400MHZ）は第
２図に示すとおりである。
10）13C−核磁気共鳴スペクトル：δppm 13C−核磁気共鳴スペクトルは第３図に示すとおりで
ある。
ある。
11）高速液体クロマトグラフィー： 分離カラム；センシューパック（Senshu Pak）ODS−Ｈ
−2151（センシュー科学（株）製） ６φ×150mm（５μ） 移動相;10％（V/V）アセトニトリル−水 （PIC B8（ウォーターズ社製）0.5％含有） 流速;1.5ml/分 検出波長;UV 210nm カラム温度25゜のとき保持時間6.9分にピークを間作
することができた。
−2151（センシュー科学（株）製） ６φ×150mm（５μ） 移動相;10％（V/V）アセトニトリル−水 （PIC B8（ウォーターズ社製）0.5％含有） 流速;1.5ml/分 検出波長;UV 210nm カラム温度25゜のとき保持時間6.9分にピークを間作
することができた。
溶出パターンは、第４図に示すとおりである。
12）薄層クロマトグラフィー： Rf値;0.44 吸着剤；メルク社製シリカゲルプレートArt 5715 展開溶媒；アセトニトリル：酢酸：水＝6:1:3 本発明において用いられるミクロモノスポラ（Microm
onospora）属に属する菌株としては、例えばミクロモノ
スポラ．エスピー.SANK 62390株（微工研菌寄第11631
号）を挙げることができ、この菌の菌学的性状は次のと
おりである。
onospora）属に属する菌株としては、例えばミクロモノ
スポラ．エスピー.SANK 62390株（微工研菌寄第11631
号）を挙げることができ、この菌の菌学的性状は次のと
おりである。
1.形態学的性状 SANK 62390株は、菌株同定用寒天培地上28℃、７乃至
14日間の培養において普通若しくはやや貧弱に生育す
る。基生菌糸は良好に伸長、分岐し、明るい橙、橙乃至
暗い茶味灰色を示すが、ノカルディア（Nocardia）属菌
株様の断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は原
痕跡的に僅かに形成し、白乃至茶味白色を示す。胞子は
基生菌糸上にのみ観察されるが、比較的短い胞子柄の先
端に１個ずつ形成し、球状である。胞子の表面は平滑で
ある。胞子のう、菌核、車軸分岐等の特殊器官は認めら
れない。
14日間の培養において普通若しくはやや貧弱に生育す
る。基生菌糸は良好に伸長、分岐し、明るい橙、橙乃至
暗い茶味灰色を示すが、ノカルディア（Nocardia）属菌
株様の断裂やジグザグ伸長は観察されない。気菌糸は原
痕跡的に僅かに形成し、白乃至茶味白色を示す。胞子は
基生菌糸上にのみ観察されるが、比較的短い胞子柄の先
端に１個ずつ形成し、球状である。胞子の表面は平滑で
ある。胞子のう、菌核、車軸分岐等の特殊器官は認めら
れない。
2.各種培養基上の諸性質 各種培養基上で28℃、14日間培養後の性状は次表に示
したとおりである。色調の表示は日本色彩研究所版「標
準色表」のカラーチップ・ナンバーをあらわす。
したとおりである。色調の表示は日本色彩研究所版「標
準色表」のカラーチップ・ナンバーをあらわす。
3.生理学的性質 28℃で培養後、２乃至21日間に観察したSANK 62390株
の生理学的性質は次に示したとおりである。
の生理学的性質は次に示したとおりである。
又、プリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ISP 9）を使
用して、28℃、14日間培養後に観察したSANK 62390株の
炭素源の資化性は次表に示すとおりである。
用して、28℃、14日間培養後に観察したSANK 62390株の
炭素源の資化性は次表に示すとおりである。
4.菌体成分について SANK 62390株の細胞壁は、ビー・ベッカーらの方法
［B.Becker et al.,Applied Microbiology,Vol.12,421
−423（1984）］に従い検討した結果、メソージアミノ
ピメリン酸及びグリシンが検出された。又、SANK 62390
株の全細胞壁中の糖成分をエム・ピー・レシェバリエの
方法［M.P.Lechevalier,Journal of Laboratory ＆ Cli
nical Medicine,Vol.71,834（1968）］に従い検討した
結果、アラビノースとキシロースが検出された。ミコー
ル酸の存在は確認されなかった。細胞壁ペプチドグリカ
ン中のアシル型はグリコシル型であった。又、主要メナ
キノン成分としてMK−10（H6）、MK−10（H4）、MK−10
（H8）が検討された。以上のことから、本菌株は放線菌
の中でもミクロモノスポラ属に属することが判明したの
で、ミクロモノスポラ・エスピー（Micromonospora s
p.）SANK 62390（微工研菌寄第11631号）と命名され
た。
［B.Becker et al.,Applied Microbiology,Vol.12,421
−423（1984）］に従い検討した結果、メソージアミノ
ピメリン酸及びグリシンが検出された。又、SANK 62390
株の全細胞壁中の糖成分をエム・ピー・レシェバリエの
方法［M.P.Lechevalier,Journal of Laboratory ＆ Cli
nical Medicine,Vol.71,834（1968）］に従い検討した
結果、アラビノースとキシロースが検出された。ミコー
ル酸の存在は確認されなかった。細胞壁ペプチドグリカ
ン中のアシル型はグリコシル型であった。又、主要メナ
キノン成分としてMK−10（H6）、MK−10（H4）、MK−10
（H8）が検討された。以上のことから、本菌株は放線菌
の中でもミクロモノスポラ属に属することが判明したの
で、ミクロモノスポラ・エスピー（Micromonospora s
p.）SANK 62390（微工研菌寄第11631号）と命名され
た。
なお、SANK 62390株の同定は、ISP（ジ・インターナ
ショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（The In
ternational Streptomyces Project）］基準、バージー
ズ・マニュアル（Bergey′s Manual of Systematic Bac
teriology）第４巻、ジ・アクチノミセテス（The Actin
omycetes）第２巻及び放線菌に関する最近の文献によっ
て行なった。
ショナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（The In
ternational Streptomyces Project）］基準、バージー
ズ・マニュアル（Bergey′s Manual of Systematic Bac
teriology）第４巻、ジ・アクチノミセテス（The Actin
omycetes）第２巻及び放線菌に関する最近の文献によっ
て行なった。
周知のとおり、放線菌は自然界において、又は人工的
な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処
理等）により、変異を起こし易く、本発明のSANK 62390
株もこの点は同じである。本発明にいうSANK 62390株は
そのすべての変異株を包含する。又、これらの変異株の
中には、遺伝学的方法、例えば、組み替え、形質導入、
形質転換等により得られたものも包含される。すなわ
ち、本発明ではＡ−70615を生産する、SANK 62390株、
その変異株及びそれらと明確に区別されない菌株は、す
べてSANK 62390株に包含されるものである。
な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処
理等）により、変異を起こし易く、本発明のSANK 62390
株もこの点は同じである。本発明にいうSANK 62390株は
そのすべての変異株を包含する。又、これらの変異株の
中には、遺伝学的方法、例えば、組み替え、形質導入、
形質転換等により得られたものも包含される。すなわ
ち、本発明ではＡ−70615を生産する、SANK 62390株、
その変異株及びそれらと明確に区別されない菌株は、す
べてSANK 62390株に包含されるものである。
本発明の新規化合物Ａ−70615を得るため、これらの
微生物の培養は、他の醗酵生成物を生産するために用い
られるような培地中で行う。このような培地中には、微
生物が同化できる炭素源、窒素源及び無機塩を含有す
る。
微生物の培養は、他の醗酵生成物を生産するために用い
られるような培地中で行う。このような培地中には、微
生物が同化できる炭素源、窒素源及び無機塩を含有す
る。
一般に、炭素源としてグルコース、フラクトース、マ
ルトース、シュークロース、マンニトール、グリセロー
ル、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデ
ンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実
油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、或は併用して
用いる事ができる。一般には、培地量の１−10重量％で
変量する。窒素源としては、一般に蛋白質を含有する物
質を醗酵工程に用いる。
ルトース、シュークロース、マンニトール、グリセロー
ル、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデ
ンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実
油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、或は併用して
用いる事ができる。一般には、培地量の１−10重量％で
変量する。窒素源としては、一般に蛋白質を含有する物
質を醗酵工程に用いる。
適当な窒素源としては、大豆粉、フスマ、落花生粉、
綿実油、綿実粉、カゼイン加水分解物、ファーマミン、
魚粉、コーンスチープリカー、ペプチトン、肉エキス、
イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリ
ウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等である。
窒素源は、単一又は併用して培地量の0.2−６重量％の
範囲で用いる。
綿実油、綿実粉、カゼイン加水分解物、ファーマミン、
魚粉、コーンスチープリカー、ペプチトン、肉エキス、
イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリ
ウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等である。
窒素源は、単一又は併用して培地量の0.2−６重量％の
範囲で用いる。
培地中にとり入れる栄養無機塩は、ナトリウム、アン
モニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェー
ト、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることの
できる通常の塩類である。又、カリウム、カルシウム、
コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属
も含む。液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界
面活性剤等が、消泡剤として使用される。
モニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェー
ト、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることの
できる通常の塩類である。又、カリウム、カルシウム、
コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の金属
も含む。液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界
面活性剤等が、消泡剤として使用される。
ミクロモノスポラ・エスピーSANK 62390株を培養し、
Ａ−70615を生産する培地のpHは、5.0−8.0に変化でき
る。
Ａ−70615を生産する培地のpHは、5.0−8.0に変化でき
る。
菌の生育は22℃から38℃の範囲が良好であり、更にＡ
−70615の生産には22℃から28℃が好適である。Ａ−706
15は、好気的に培養して得られるが、通常用いられる好
気的培養法、例えば固体培養法、振盪培養法、通気撹拌
培養等が用いられる。
−70615の生産には22℃から28℃が好適である。Ａ−706
15は、好気的に培養して得られるが、通常用いられる好
気的培養法、例えば固体培養法、振盪培養法、通気撹拌
培養等が用いられる。
小規模な培養においては、28℃で数日間振盪培養を行
うのが良好である。
うのが良好である。
培養は、バッフル（水流調節壁）のついた三角フラス
コ中で１−２段階の種の発育工程により開始する。種発
育段階の培地は、炭素源及び窒素源を併用できる。種フ
ラスコは定温インキュベーター中で28℃、７日間振盪す
るか又は充分に成長するまで振盪する。成長した種は第
二の種培地又は生産培地に接種するのに用いる。中間の
発育工程を用いる場合には、本質的に同様の方法で成長
させ生産培地に接種するために、それを部分的に用い
る。接種したフラスコを一定温度で数日間振盪し、イン
キュベーションが終わったらフラスコの含有物を遠心分
離又は濾過する。
コ中で１−２段階の種の発育工程により開始する。種発
育段階の培地は、炭素源及び窒素源を併用できる。種フ
ラスコは定温インキュベーター中で28℃、７日間振盪す
るか又は充分に成長するまで振盪する。成長した種は第
二の種培地又は生産培地に接種するのに用いる。中間の
発育工程を用いる場合には、本質的に同様の方法で成長
させ生産培地に接種するために、それを部分的に用い
る。接種したフラスコを一定温度で数日間振盪し、イン
キュベーションが終わったらフラスコの含有物を遠心分
離又は濾過する。
大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を付けた適当
なタンクで培養するのが好ましい。この方法によれば、
栄養培地をタンクの中で作成できる。培養培地を125℃
まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地にあらかじめ成
長させてあった種を接種する。培養は28℃で通気撹拌し
て行う。この方法は、多量の化合物を得るのに適してい
る。
なタンクで培養するのが好ましい。この方法によれば、
栄養培地をタンクの中で作成できる。培養培地を125℃
まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地にあらかじめ成
長させてあった種を接種する。培養は28℃で通気撹拌し
て行う。この方法は、多量の化合物を得るのに適してい
る。
培養の経過に伴って生産されるＡ−70615の量の経時
変化は、トレハラーゼの阻害活性を測定することにより
知ることができる。通常は、72時間から150時間の培養
でＡ−70615の生産量は最高値に達する。
変化は、トレハラーゼの阻害活性を測定することにより
知ることができる。通常は、72時間から150時間の培養
でＡ−70615の生産量は最高値に達する。
培養終了後、培養液中の液体部分（及び菌体内）に存
在するＡ−70615は、菌体、その他の固形部分を珪藻土
を濾過助剤とする濾過操作又は遠心分離によって分別
し、その濾液または上清中に存在するＡ−70615を、そ
の物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得ら
れる。
在するＡ−70615は、菌体、その他の固形部分を珪藻土
を濾過助剤とする濾過操作又は遠心分離によって分別
し、その濾液または上清中に存在するＡ−70615を、そ
の物理化学的性状を利用し抽出精製することにより得ら
れる。
例えば、濾液又は上清中に存在するＡ−70615をイオ
ン交換樹脂、例えばアンバーライトIRC−50,CG−50,ダ
ウエックス50W×4,ダウエックスSBR−Ｐの層を通過させ
て不純物を付着させて取り除くか、又はＡ−70615を吸
着させた後、アンモニア水を用いて溶出させることによ
り得られる。或は吸着剤として、例えば活性炭又は吸着
用樹脂であるアンバーライトXAD−2,XAD−４（ローム・
アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンHP−10,HP−2
0,CHP20,HP−50等（三菱化成工業（株）製）が使用され
る。Ａ−70615を含む液を上記のごとき吸着剤の層を通
過させて不純物を吸着させて取り除くか又はＡ−70615
を吸着させた後、メタノール水、アセトン水等を用いて
溶出させることにより得られる。
ン交換樹脂、例えばアンバーライトIRC−50,CG−50,ダ
ウエックス50W×4,ダウエックスSBR−Ｐの層を通過させ
て不純物を付着させて取り除くか、又はＡ−70615を吸
着させた後、アンモニア水を用いて溶出させることによ
り得られる。或は吸着剤として、例えば活性炭又は吸着
用樹脂であるアンバーライトXAD−2,XAD−４（ローム・
アンド・ハース社製）等や、ダイヤイオンHP−10,HP−2
0,CHP20,HP−50等（三菱化成工業（株）製）が使用され
る。Ａ−70615を含む液を上記のごとき吸着剤の層を通
過させて不純物を吸着させて取り除くか又はＡ−70615
を吸着させた後、メタノール水、アセトン水等を用いて
溶出させることにより得られる。
このようにして得られたＡ−70615は、更にシリカゲ
ル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマ
トグラフィー、アビセル（旭化成（株）製）、セファデ
ックスLH−20（ファルマシア社製）等を用いた分配カラ
ムクロマトグラフィー及び順相、逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィー等で精製することができる。
ル、フロリジルのような担体を用いた吸着カラムクロマ
トグラフィー、アビセル（旭化成（株）製）、セファデ
ックスLH−20（ファルマシア社製）等を用いた分配カラ
ムクロマトグラフィー及び順相、逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィー等で精製することができる。
本発明の化合物Ａ−70615を農園芸用薬として用いる
場合、種々の形態、例えば、粉剤、粗粉剤、粒剤、顆粒
剤、水和剤、乳剤、液剤等に調製して用いられる。
場合、種々の形態、例えば、粉剤、粗粉剤、粒剤、顆粒
剤、水和剤、乳剤、液剤等に調製して用いられる。
次に実施例及び試験例を挙げて本発明を更に詳しく具
体的に説明するが、本発明はもちろん、それらの方法に
限定されるものではなく、培養基の種類、培養条件、採
取、精製方法等は種々変えうることは言うまでもない。
体的に説明するが、本発明はもちろん、それらの方法に
限定されるものではなく、培養基の種類、培養条件、採
取、精製方法等は種々変えうることは言うまでもない。
（実施例） 化合物Ａ−70615の精製 （Ａ）培養 ミクロモノスポラ．エスピー.SANK 62390株を培地組
成−１で示される培地80mlを含む500ml容三角フラスコ
（バッフル付）３本に一白金耳接種し、220rpmの回転振
盪培養機により28℃で216時間培養した。
成−１で示される培地80mlを含む500ml容三角フラスコ
（バッフル付）３本に一白金耳接種し、220rpmの回転振
盪培養機により28℃で216時間培養した。
この培養液40mlを培地組成−２で示される培地800ml
を含む２の三角フラスコ４本に接種し220rpmの回転振
盪培養機により28℃で96時間培養した。次いで30容ジ
ャーファーメンター２基に培地組成−２で示される培地
15を入れ、120℃で35分間加熱殺菌し28℃に冷却した
中に、種培養液1.5を接種し回転数100rpm通気量15
／分で28℃、96時間撹拌培養した。
を含む２の三角フラスコ４本に接種し220rpmの回転振
盪培養機により28℃で96時間培養した。次いで30容ジ
ャーファーメンター２基に培地組成−２で示される培地
15を入れ、120℃で35分間加熱殺菌し28℃に冷却した
中に、種培養液1.5を接種し回転数100rpm通気量15
／分で28℃、96時間撹拌培養した。
（Ｂ）単離 得られた培養液30に濾過助剤としてセライト545
（ジョンズ・マンビル・プロダクト・コーポレーション
製）を3kg加えて濾過することにより濾液29を得た。
濾液をダウエックスSBR−Ｐ（Cl-）（ダウケミカル社
製）６のカラムに通し、通過液のpHを5.0に調整して
ダウエックス50W×４（H+）（ダウケミカル社製）６
のカラムに通し、Ａ−70615を吸着させた。20のイオ
ン水で水洗後、0.5Nアンモニア水30で溶出し活性分画
13を得た。得られた溶出液13を減圧下で濃縮、凍結
乾燥してＡ−70615を含む粗粉末43.4gを得た。この粗粉
末を２の10mM、pH6.0のギ酸アンモニウム緩衝液で溶
解し、あらかじめ20mM、pH6.0ギ酸アンモニウム緩衝液
で緩衝化したダウエックス50W×４の1.5のカラムに吸
着させ、３の同緩衝液で洗浄後、２の脱イオン水で
洗浄し、0.2Nアンモニア水で溶出した。溶出液を500ml
ずつ分画していくと、Ａ−70615はフラクション２〜４
に溶出され、この画分を集め減圧下濃縮し凍結乾燥する
ことにより2.55gの粗粉末を得た。
（ジョンズ・マンビル・プロダクト・コーポレーション
製）を3kg加えて濾過することにより濾液29を得た。
濾液をダウエックスSBR−Ｐ（Cl-）（ダウケミカル社
製）６のカラムに通し、通過液のpHを5.0に調整して
ダウエックス50W×４（H+）（ダウケミカル社製）６
のカラムに通し、Ａ−70615を吸着させた。20のイオ
ン水で水洗後、0.5Nアンモニア水30で溶出し活性分画
13を得た。得られた溶出液13を減圧下で濃縮、凍結
乾燥してＡ−70615を含む粗粉末43.4gを得た。この粗粉
末を２の10mM、pH6.0のギ酸アンモニウム緩衝液で溶
解し、あらかじめ20mM、pH6.0ギ酸アンモニウム緩衝液
で緩衝化したダウエックス50W×４の1.5のカラムに吸
着させ、３の同緩衝液で洗浄後、２の脱イオン水で
洗浄し、0.2Nアンモニア水で溶出した。溶出液を500ml
ずつ分画していくと、Ａ−70615はフラクション２〜４
に溶出され、この画分を集め減圧下濃縮し凍結乾燥する
ことにより2.55gの粗粉末を得た。
次いでこの粉末をあらかじめ80％アセトニトリル−水
で充填した200mlのアビセル（旭化成工業（株）製）カ
ラムに吸着させ、700mlの80％アセトニトリル−水で洗
浄後、500mlの75％アセトニトリル−水、700mlの70％ア
セトニトリル−水で順次溶出した溶出液を19mlずつ分画
していくと、Ａ−70615はフラクション35〜50に溶出さ
れた。この分画を集め減圧下濃縮し凍結乾燥を行い、65
8mgの粉末を得た。更にこの粉末を水150mlで溶解し、pH
6.0に調整後アンバーライトCG−50（H+:NH4 +2:3）の300
mlのカラムに吸着させ、500mlの脱イオン水で洗浄後0.1
Nアンモニア水で溶出した溶出液を20mlずつ分画してい
くと、Ａ−70615はフラクション92〜121に溶出され、そ
の分画を集め減圧下濃縮し凍結乾燥を行い102.8mgの粉
末を得た。次いでこの粉末を10mlの2mM pH6.0ギ酸アン
モニウム緩衝液で溶かし同緩衝液で充填したダイヤイオ
ンCHP20P（三菱化成工業（株）製）400mlのカラムに吸
着させ同緩衝液で5mlずつ展開溶出した。Ａ−70615はフ
ラクション59〜73に溶出され、その分画を集め減圧下濃
縮し、凍結乾燥を行い18mgの粉末を得た。この粉末を再
度ダイヤイオンCHP20Pカラムで精製し、6.2mgの白色粉
末を得た。
で充填した200mlのアビセル（旭化成工業（株）製）カ
ラムに吸着させ、700mlの80％アセトニトリル−水で洗
浄後、500mlの75％アセトニトリル−水、700mlの70％ア
セトニトリル−水で順次溶出した溶出液を19mlずつ分画
していくと、Ａ−70615はフラクション35〜50に溶出さ
れた。この分画を集め減圧下濃縮し凍結乾燥を行い、65
8mgの粉末を得た。更にこの粉末を水150mlで溶解し、pH
6.0に調整後アンバーライトCG−50（H+:NH4 +2:3）の300
mlのカラムに吸着させ、500mlの脱イオン水で洗浄後0.1
Nアンモニア水で溶出した溶出液を20mlずつ分画してい
くと、Ａ−70615はフラクション92〜121に溶出され、そ
の分画を集め減圧下濃縮し凍結乾燥を行い102.8mgの粉
末を得た。次いでこの粉末を10mlの2mM pH6.0ギ酸アン
モニウム緩衝液で溶かし同緩衝液で充填したダイヤイオ
ンCHP20P（三菱化成工業（株）製）400mlのカラムに吸
着させ同緩衝液で5mlずつ展開溶出した。Ａ−70615はフ
ラクション59〜73に溶出され、その分画を集め減圧下濃
縮し、凍結乾燥を行い18mgの粉末を得た。この粉末を再
度ダイヤイオンCHP20Pカラムで精製し、6.2mgの白色粉
末を得た。
次いでこの粉末をプレパラティブTLCで精製した。粉
末6.2mgを少量の水で溶かし、メルク社製シリカゲルプ
レートArt5715（20×20cm）３枚に吸着させ、アセトニ
トリル：酢酸：水：（6:1:3）で15cm展開させ、Rf0.42
から0.5をかきとりシリカゲル粉末をカラムに充填し、1
00mlの脱イオン水で溶出した。溶出液をダウエックス50
W×４（H+）5mlのカラムに通しＡ−70615を吸着させ、
脱イオン水でカラムを洗浄し50mlの0.5Nアンモニア水で
溶出を行い、溶出液を減圧下濃縮し、凍結乾燥すること
により、高速液体クロマトグラフィーで単一ピークを示
すＡ−70615の白色粉末5.1mgを得た。
末6.2mgを少量の水で溶かし、メルク社製シリカゲルプ
レートArt5715（20×20cm）３枚に吸着させ、アセトニ
トリル：酢酸：水：（6:1:3）で15cm展開させ、Rf0.42
から0.5をかきとりシリカゲル粉末をカラムに充填し、1
00mlの脱イオン水で溶出した。溶出液をダウエックス50
W×４（H+）5mlのカラムに通しＡ−70615を吸着させ、
脱イオン水でカラムを洗浄し50mlの0.5Nアンモニア水で
溶出を行い、溶出液を減圧下濃縮し、凍結乾燥すること
により、高速液体クロマトグラフィーで単一ピークを示
すＡ−70615の白色粉末5.1mgを得た。
（試験例） 化合物Ａ−70615のカイコトレハラーゼに対する阻害活
性 カイコ５齢幼虫10頭（44）ｇを20mMクエン酸−40mMリ
ン酸二ナトリウム緩衝液（pH5.6）120ml中で氷冷下、ポ
リトロンを用い２分間ホモゲナイズし、6,000rpm、10分
間遠心分離して得た上清120mlに、氷冷下、240mlのアセ
トンを撹拌しながら加えた。これを9,000rpm、20分間遠
心分離し、沈渣を水に溶解後、凍結乾燥し、粗酵素2.0g
を得た。
性 カイコ５齢幼虫10頭（44）ｇを20mMクエン酸−40mMリ
ン酸二ナトリウム緩衝液（pH5.6）120ml中で氷冷下、ポ
リトロンを用い２分間ホモゲナイズし、6,000rpm、10分
間遠心分離して得た上清120mlに、氷冷下、240mlのアセ
トンを撹拌しながら加えた。これを9,000rpm、20分間遠
心分離し、沈渣を水に溶解後、凍結乾燥し、粗酵素2.0g
を得た。
デオキシノジリマイシンはシグマ社より購入した。
以下、カイコトレハラーゼ活性測定に、20mMクエン酸
−40mM リン酸二ナトリウム緩衝液（pH5.6）を使用し
た。試験管内に緩衝液130μｌ、試料溶液50μｌ及びカ
イコ酵素液4mg/mlを50μｌ加え、37度のウォーターバス
中で15分振盪した後、250Mmトレハロース溶液20μｌを
添加し、更に15分間反応させた。反応液を沸騰水上３分
間静置後氷水冷し、3,000rpm、10分間遠心分離して沈殿
物を除いた後、溶液中のグルコース濃度を定量した。本
反応には、和光純薬のグルコースＣ−テストワコーを用
い、標準操作法により試料液を10倍量加えて行なった。
酵素反応時に試料溶液として緩衝液を用いた場合と、基
質溶液のかわりに緩衝液を用いた場合のグルコース濃度
とそれぞれ０％及び100％阻害として阻害率を計算し、5
0％阻害濃度を算出した。結果を表１に示す。
−40mM リン酸二ナトリウム緩衝液（pH5.6）を使用し
た。試験管内に緩衝液130μｌ、試料溶液50μｌ及びカ
イコ酵素液4mg/mlを50μｌ加え、37度のウォーターバス
中で15分振盪した後、250Mmトレハロース溶液20μｌを
添加し、更に15分間反応させた。反応液を沸騰水上３分
間静置後氷水冷し、3,000rpm、10分間遠心分離して沈殿
物を除いた後、溶液中のグルコース濃度を定量した。本
反応には、和光純薬のグルコースＣ−テストワコーを用
い、標準操作法により試料液を10倍量加えて行なった。
酵素反応時に試料溶液として緩衝液を用いた場合と、基
質溶液のかわりに緩衝液を用いた場合のグルコース濃度
とそれぞれ０％及び100％阻害として阻害率を計算し、5
0％阻害濃度を算出した。結果を表１に示す。
（発明の効果） 以上から、本発明の化合物Ａ−70615は顕著なトレハ
ラーゼ阻害活性を有しており、例えば、抗カビ剤、殺虫
剤等として有用である。
ラーゼ阻害活性を有しており、例えば、抗カビ剤、殺虫
剤等として有用である。
第１図は化合物Ａ−70615の赤外線吸収スペクトルを示
し、 第２図は同物質の1H−核磁気共鳴スペクトルを示し、 第３図は同物質の13C−核磁気共鳴スペクトルを示し、 第４図は同物質の高速液体クロマトグラフィーにおける
溶出パターンを示す。
し、 第２図は同物質の1H−核磁気共鳴スペクトルを示し、 第３図は同物質の13C−核磁気共鳴スペクトルを示し、 第４図は同物質の高速液体クロマトグラフィーにおける
溶出パターンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 19/28 Ｃ１２Ｒ 1:29） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:29） (72)発明者 鳥潟 顕雄 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 春山 英幸 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 木下 武 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 岡崎 尚夫 茨城県つくば市御幸ケ丘33 三共株式会 社内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07H 17/00 C12P 19/28 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】式（Ｉ） で表わされる化合物Ａ−70615。
- 【請求項２】ミクロモノスポラ属に属するＡ−70615化
合物生産菌を培養し、その培養物より化合物Ａ−70615
を採取することを特徴とするＡ−70615の製造法。 - 【請求項３】ミクロモノスポラ属に属するＡ−70615化
合物生産菌がミクロモノスポラ．エスピー・SANK 62390
株（微工研菌寄第11631号）である、請求項２に記載の
製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2217104A JP2849460B2 (ja) | 1990-08-20 | 1990-08-20 | 新規化合物ａ―７０６１５物質及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2217104A JP2849460B2 (ja) | 1990-08-20 | 1990-08-20 | 新規化合物ａ―７０６１５物質及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0499792A JPH0499792A (ja) | 1992-03-31 |
| JP2849460B2 true JP2849460B2 (ja) | 1999-01-20 |
Family
ID=16698917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2217104A Expired - Fee Related JP2849460B2 (ja) | 1990-08-20 | 1990-08-20 | 新規化合物ａ―７０６１５物質及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2849460B2 (ja) |
-
1990
- 1990-08-20 JP JP2217104A patent/JP2849460B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0499792A (ja) | 1992-03-31 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |