JP2835855B2 - ヒトサイトメガロウイルスの検出方法 - Google Patents
ヒトサイトメガロウイルスの検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（以下、HCMVと
略記する）の特定のDNA領域の検出方法に関する。
略記する）の特定のDNA領域の検出方法に関する。
本発明はまた、このような検出のための検出キットに
関する。
関する。
HCMVは、ヘルペス属のウイルスで、世界中に広くまん
延している。日本人の大多数は出生時の産道感染、生後
の経母乳感染あるいは水平感染によりHCMV初感染を受け
るが、ほとんどの場合は不顕性に経過し、潜伏したウイ
ルスを体内に終生保有するものと考えられている。HCMV
が病原性を発揮して臨床上問題たなるのは、胎児・新生
児期感染、輸血・臓器移植などによる医原的感染、ある
いは免疫不全状態における日和見感染などの場合であ
り、時に致死的経過をとることが知られている。
延している。日本人の大多数は出生時の産道感染、生後
の経母乳感染あるいは水平感染によりHCMV初感染を受け
るが、ほとんどの場合は不顕性に経過し、潜伏したウイ
ルスを体内に終生保有するものと考えられている。HCMV
が病原性を発揮して臨床上問題たなるのは、胎児・新生
児期感染、輸血・臓器移植などによる医原的感染、ある
いは免疫不全状態における日和見感染などの場合であ
り、時に致死的経過をとることが知られている。
HCMV感染症の診断に際しては、細胞培養法、免疫学的
方法、ウイルスDNAの検出法、病理組織学的診断法が用
いられている。
方法、ウイルスDNAの検出法、病理組織学的診断法が用
いられている。
HCMV感染症の診断法の中で現在最も確実な方法は細胞
培養法によるウイルスの分離であるが、試料によっては
２週間の期間を要する場合がある。他の方法においても
診断に要する期間、検出感度の点で限界がある。
培養法によるウイルスの分離であるが、試料によっては
２週間の期間を要する場合がある。他の方法においても
診断に要する期間、検出感度の点で限界がある。
近年、遺伝子診断の技術が進歩し、試料中のHCMV DNA
を検出する方法が迅速診断法として取入れられるように
なった。しかし、従来用いられてきたサザンハイブリダ
イゼーション法では、細胞当りウイルスDNAが0.2〜１コ
ピー以上ないと検出できないこと、元の試料として最低
10〜100mg程度の組織試料は必要であることなど、検出
法として限界がある。
を検出する方法が迅速診断法として取入れられるように
なった。しかし、従来用いられてきたサザンハイブリダ
イゼーション法では、細胞当りウイルスDNAが0.2〜１コ
ピー以上ないと検出できないこと、元の試料として最低
10〜100mg程度の組織試料は必要であることなど、検出
法として限界がある。
HCMVは血液や種々の臓器に存在するほか尿、子宮頚管
分泌液、母乳、唾液、精液、涙液、便の中にも排出され
る。これらの試料からHCMV DNAを検出する際、ウイルス
が活性化された状態で存在している場合でさえ、細胞当
りのコピー数はかなり低いといわれており、高感度検出
法が要求されている。
分泌液、母乳、唾液、精液、涙液、便の中にも排出され
る。これらの試料からHCMV DNAを検出する際、ウイルス
が活性化された状態で存在している場合でさえ、細胞当
りのコピー数はかなり低いといわれており、高感度検出
法が要求されている。
近年、高感度遺伝子診断法としてPCR〔ポリメラーゼ
チェーン リアクション（Polymerase Chain Reactio
n）〕法が開発された〔サイキ（Saiki）ら：サイエンス
（Science）、第230巻、第1350〜1354頁（1985）〕。PC
R法は目的とする遺伝子DNAあるいはその一部のみを特異
的に酵素的に増幅させ、微量試料から高感度に目的遺伝
子を検出する方法である。このPCR法を用いれば、10万
個に１個の感染細胞中のウイルス遺伝子をも検出可能で
ある。したがって、PCR法はHCMV DNAの高感度検出法に
極めて有効である。また、このPCR法のもう１つの利点
は純化されていないDNAに対しても有効であることであ
る。したがって、尿や血液の試料からDNAを簡単に粗精
製し、HCMV DNAを検出することが可能である。
チェーン リアクション（Polymerase Chain Reactio
n）〕法が開発された〔サイキ（Saiki）ら：サイエンス
（Science）、第230巻、第1350〜1354頁（1985）〕。PC
R法は目的とする遺伝子DNAあるいはその一部のみを特異
的に酵素的に増幅させ、微量試料から高感度に目的遺伝
子を検出する方法である。このPCR法を用いれば、10万
個に１個の感染細胞中のウイルス遺伝子をも検出可能で
ある。したがって、PCR法はHCMV DNAの高感度検出法に
極めて有効である。また、このPCR法のもう１つの利点
は純化されていないDNAに対しても有効であることであ
る。したがって、尿や血液の試料からDNAを簡単に粗精
製し、HCMV DNAを検出することが可能である。
HCMV DNAの検出のもう１つの問題点はHCMV DNAが他の
ヘルペス属ウイルスDNAと相同性が高いため、試料中に
混在する他のヘルペス属ウイルスDNAを誤って検出して
しまう可能性がある。PCR法は、目的遺伝子領域を一対
のプライマーDNAにより任意に限定できる。したがっ
て、他のヘルペス属ウイルスDNAと相同性が低い領域をH
CMV DNA中に設定することが可能である。
ヘルペス属ウイルスDNAと相同性が高いため、試料中に
混在する他のヘルペス属ウイルスDNAを誤って検出して
しまう可能性がある。PCR法は、目的遺伝子領域を一対
のプライマーDNAにより任意に限定できる。したがっ
て、他のヘルペス属ウイルスDNAと相同性が低い領域をH
CMV DNA中に設定することが可能である。
本発明の目的は、PCR法を用いてHCMV DNA中の特異的
検出領域を明らかにし、HCMVの高感度検出方法及びそれ
に用いる検出キット入を提供することにある。
検出領域を明らかにし、HCMVの高感度検出方法及びそれ
に用いる検出キット入を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はHCMVの特
定のDNA領域を、下記式II: で表される一対のオリゴヌクレチドプライマーを用いて
増幅させることを特徴とするHCMV DNAの検出方法に関す
る。
定のDNA領域を、下記式II: で表される一対のオリゴヌクレチドプライマーを用いて
増幅させることを特徴とするHCMV DNAの検出方法に関す
る。
更に、第２の発明は上記第１の発明の方法を用いて検
出を行うための検出キットであって、上記式IIで表され
る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有している
ことを特徴とするHCMV DNA検出キットに関する。
出を行うための検出キットであって、上記式IIで表され
る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有している
ことを特徴とするHCMV DNA検出キットに関する。
本発明者らは前記課題を解決するためにHCMV AD169株
の短鎖特異領域（Short unique region）Hind IIIフラ
グメントＶ〔ジャーナル オブ モレキュラー バイオ
ロジー（J.Mol.Biol.）、第192巻、第1771〜208頁（198
6）〕内に他のヘルペス属ウイルスDNAと比較的相同性の
低い305bpの領域を設定し、増幅に必要な一対のオリゴ
ヌクレオチドプライマーDNAを合成した。続いて、HCMV
感染細胞を用いて本領域をPCR法で増幅させ、本領域が
効率よく増幅され、オリゴヌクレオチドプローブによ
り、高感度で検出されることを見出した。
の短鎖特異領域（Short unique region）Hind IIIフラ
グメントＶ〔ジャーナル オブ モレキュラー バイオ
ロジー（J.Mol.Biol.）、第192巻、第1771〜208頁（198
6）〕内に他のヘルペス属ウイルスDNAと比較的相同性の
低い305bpの領域を設定し、増幅に必要な一対のオリゴ
ヌクレオチドプライマーDNAを合成した。続いて、HCMV
感染細胞を用いて本領域をPCR法で増幅させ、本領域が
効率よく増幅され、オリゴヌクレオチドプローブによ
り、高感度で検出されることを見出した。
以下、順を追って本発明を具体的に説明する。
HCMV AD169株の短鎖特異領域は既にクローニングされ
ており、その塩基配列はジャーナル オブ モレキュラ
ー バイオロジー第192巻、第177〜208頁（1986）に記
載されている。
ており、その塩基配列はジャーナル オブ モレキュラ
ー バイオロジー第192巻、第177〜208頁（1986）に記
載されている。
短鎖特異領域の中で他のヘパルス属と相同性の低いHi
nd IIIフラグメントＶの範囲で305bpの増幅領域を選定
した。それは下記式Ｉで表される。
nd IIIフラグメントＶの範囲で305bpの増幅領域を選定
した。それは下記式Ｉで表される。
本領域を増幅させるためには、一対のオリゴヌクレオ
チドプライマーDNA、すなわち増幅領域の５′末端から2
0塩基のセンス配列及び３′末端から20塩基のアセチセ
ンス配列を有するプライマーDNA対が必要である。
チドプライマーDNA、すなわち増幅領域の５′末端から2
0塩基のセンス配列及び３′末端から20塩基のアセチセ
ンス配列を有するプライマーDNA対が必要である。
このプライマーは前述の選定領域にアニーリングでき
るものであれば良いが、その１例として下記式IIで表さ
れる様なプライマーDNAをDNA合成機により合成でき、HP
LCにて精製できる。
るものであれば良いが、その１例として下記式IIで表さ
れる様なプライマーDNAをDNA合成機により合成でき、HP
LCにて精製できる。
検出するHCMV DNAはHCMV AD169株及びデービス（Davi
s）株を感染させたヒト細胞株、尿等より調製すること
ができる。
s）株を感染させたヒト細胞株、尿等より調製すること
ができる。
細胞からのDNAの調製は公知の確立された方法を用い
ればよい。
ればよい。
PCR法についてはタックーポリメラーゼ（Taq−Polyme
rase）を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置
がパーキンエルマーシータス社から市販されており、こ
れらと本発明のプライマー対を用い、特定のDNA領域の
増幅反応を行えばよい。増幅後のHCMV DNAの検出は、例
えばアガロースゲル電気泳動及びドッドハイブリダイゼ
ーションを用いることができる。ドットハイブリダイゼ
ーションの際、増幅領域内のHCMVに特異的な領域、例え
ば下記表１に示すオリゴヌクレオチドプローブDNAを用
いることによりHCMV DNAを特異的に検出することができ
る。
rase）を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置
がパーキンエルマーシータス社から市販されており、こ
れらと本発明のプライマー対を用い、特定のDNA領域の
増幅反応を行えばよい。増幅後のHCMV DNAの検出は、例
えばアガロースゲル電気泳動及びドッドハイブリダイゼ
ーションを用いることができる。ドットハイブリダイゼ
ーションの際、増幅領域内のHCMVに特異的な領域、例え
ば下記表１に示すオリゴヌクレオチドプローブDNAを用
いることによりHCMV DNAを特異的に検出することができ
る。
このプローブDNAは、上記プライマーDNAと同様に合成
及び精製することができる。
及び精製することができる。
プローブDNAは標識化することにより、高感度な検出
が可能となる。標識化の方法は放射性同位元素標識法に
限らず、酵素標識、蛍光標識、ビオチン・アビジン系標
識、ケミプローブ標識法等公知の方法なら何でも良い。
が可能となる。標識化の方法は放射性同位元素標識法に
限らず、酵素標識、蛍光標識、ビオチン・アビジン系標
識、ケミプローブ標識法等公知の方法なら何でも良い。
選定されたプライマー対及びプローブを用いることに
より、HCMV DNA配列の中で特異的、かつ高感度に検出で
きる領域が明らかになった。
より、HCMV DNA配列の中で特異的、かつ高感度に検出で
きる領域が明らかになった。
実際、尿試料から70％の検出率でHCMV DNAを検出する
ことができた。
ことができた。
また、HCMVの特定DNA領域を増幅させるためのプライ
マー対及び増幅されたDNA領域を検出するためのプロー
ブをそろえてキットとしておくことでHCMV DNAの検出を
簡便に行うことができる。なお、キットに用いる試薬は
溶液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。
マー対及び増幅されたDNA領域を検出するためのプロー
ブをそろえてキットとしておくことでHCMV DNAの検出を
簡便に行うことができる。なお、キットに用いる試薬は
溶液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
が、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１ PCR法によるHCMV DNAの増幅と検出 （１−１） HCMV感染細胞からのDNAの調製 HCMV AD169株又はデービス株を感染させたヒト胎児肺
細胞（HEL細胞）をDME〔ダルベッコの改良イーグル培地
（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）フロー・ラボ
ラトリー社〕、10％FBS〔ウシ胎児血清（Fatal Bovine
Serum）フロー・ラボラトリー社〕、100ユニット/mlス
トレプトマイシン（明治製菓）、100ユニット/mlペニシ
リンＧ（萬有製薬）を含む培地で6cmカルチャーディッ
シュ中で培養した。約106個の細胞数になったところで
培養を終了し、培地を除去した。TE緩衝液〔10mMトリス
（Tris）−HCl、pH8.0、1mM EDTA〕、0.1M NaClを含む5
mlの溶液で細胞を洗浄した後、TE緩衝液、0.5％SDSを含
む5mlの溶液を加え、室温、20分間放置しディッシュよ
り細胞をはがし取り、ポリスチレン製チューブに回収し
た。100μg/mlになるようにプロテネースＫを加え、70
℃、２時間処理した。次にフェノールとクロロホルムの
等量混合液5mlを加え、静かにかくはんし、12000rpm、
５分間遠心後、水層を分離した。この水層に5mlのクロ
ロホルムを加え、静かにかくはんし、同様に遠心して水
層を分離した。この水層に、0.5mlの3M酢酸ナトリウ
ム、10mlのエタノールを加え、充分かくはんし、−70
℃、15分間放置後、12000rpm、10分間遠心して、DNAの
沈殿を回収した。沈殿は80％のエタノールで洗浄した
後、乾燥させ、1mlの滅菌水に溶解した。約100μｇのDN
Aを回収することができた。
細胞（HEL細胞）をDME〔ダルベッコの改良イーグル培地
（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）フロー・ラボ
ラトリー社〕、10％FBS〔ウシ胎児血清（Fatal Bovine
Serum）フロー・ラボラトリー社〕、100ユニット/mlス
トレプトマイシン（明治製菓）、100ユニット/mlペニシ
リンＧ（萬有製薬）を含む培地で6cmカルチャーディッ
シュ中で培養した。約106個の細胞数になったところで
培養を終了し、培地を除去した。TE緩衝液〔10mMトリス
（Tris）−HCl、pH8.0、1mM EDTA〕、0.1M NaClを含む5
mlの溶液で細胞を洗浄した後、TE緩衝液、0.5％SDSを含
む5mlの溶液を加え、室温、20分間放置しディッシュよ
り細胞をはがし取り、ポリスチレン製チューブに回収し
た。100μg/mlになるようにプロテネースＫを加え、70
℃、２時間処理した。次にフェノールとクロロホルムの
等量混合液5mlを加え、静かにかくはんし、12000rpm、
５分間遠心後、水層を分離した。この水層に5mlのクロ
ロホルムを加え、静かにかくはんし、同様に遠心して水
層を分離した。この水層に、0.5mlの3M酢酸ナトリウ
ム、10mlのエタノールを加え、充分かくはんし、−70
℃、15分間放置後、12000rpm、10分間遠心して、DNAの
沈殿を回収した。沈殿は80％のエタノールで洗浄した
後、乾燥させ、1mlの滅菌水に溶解した。約100μｇのDN
Aを回収することができた。
（１−２） オリゴヌクレオチドプライマーDNA及びプ
ローブDNAの合成及び精製 式II、表１に示したプライマーDNA及びプローブDNAを
アプライドバイオシステムズ社のDNA合成機を用いて合
成し、脱保護の後イオン交換HPLC（TSKゲル、DEAE−2SW
カラム）で精製し、セプ−パク（Sep−pak）C18（ウォ
ーターズ社）で脱塩し、各DNAを約50μｇ得た。
ローブDNAの合成及び精製 式II、表１に示したプライマーDNA及びプローブDNAを
アプライドバイオシステムズ社のDNA合成機を用いて合
成し、脱保護の後イオン交換HPLC（TSKゲル、DEAE−2SW
カラム）で精製し、セプ−パク（Sep−pak）C18（ウォ
ーターズ社）で脱塩し、各DNAを約50μｇ得た。
（１−３） HCMV DNAのPCR法による増幅 （１−１）で調製したHCMV AD169株及びデービス株を
感染させたHEL細胞DNA、HCMVを感染させていないHEL細
胞DNAのそれぞれ１μｇを0.5ml用チューブ（バイオビッ
ク社）に取り、94℃、10分間加熱処理した後、ジーン
アンプTMキット（Gene AmpTMKit）パーキンエルマー・
シータス社）に含まれている10μの10×増幅用緩衝液
〔100mMトリス−HCl、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、
0.1％（w/v）ゼラチン〕、16μの1.25mMdNTP混合液
（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、１μの20μＭプライマ
ー１、１μの20μＭプライマー２、0.5μの５ユニ
ット／μタック−ポリメラーゼを加え、更に滅菌水を
加えて100μの溶液にした。
感染させたHEL細胞DNA、HCMVを感染させていないHEL細
胞DNAのそれぞれ１μｇを0.5ml用チューブ（バイオビッ
ク社）に取り、94℃、10分間加熱処理した後、ジーン
アンプTMキット（Gene AmpTMKit）パーキンエルマー・
シータス社）に含まれている10μの10×増幅用緩衝液
〔100mMトリス−HCl、pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、
0.1％（w/v）ゼラチン〕、16μの1.25mMdNTP混合液
（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、１μの20μＭプライマ
ー１、１μの20μＭプライマー２、0.5μの５ユニ
ット／μタック−ポリメラーゼを加え、更に滅菌水を
加えて100μの溶液にした。
この反応液は上層に100μのミネラルオイル（シグ
マ社）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマル−サイ
クラー（Thermal−Cycler）（パーキンエルマー・シー
タス社）により増幅反応を行った。反応条件は、94℃、
１分間の変性→55℃、２分間のプライマーのアニーリン
グ→72℃、２分間の合成反応のサイクルを30サイクル行
った。
マ社）を加えた後、自動遺伝子増幅装置サーマル−サイ
クラー（Thermal−Cycler）（パーキンエルマー・シー
タス社）により増幅反応を行った。反応条件は、94℃、
１分間の変性→55℃、２分間のプライマーのアニーリン
グ→72℃、２分間の合成反応のサイクルを30サイクル行
った。
反応後、上層のミネラルオイルを除去した後、反応液
の10μを取り、３％ヌシーブ（NuSieve）GTGアガロー
ス−１％シー−ケム（Sea−Kem）アガロース（FMC社）
ゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでDNAを染
色し、増幅されたDNAを確認した。HCMV AD169株及びデ
ービス株を感染させたHEL細胞DNAからは共に305bpのバ
ンドを確認した。HCMVを感染させていないHEL細胞DNAか
らはDNAの増幅は認められなかった。
の10μを取り、３％ヌシーブ（NuSieve）GTGアガロー
ス−１％シー−ケム（Sea−Kem）アガロース（FMC社）
ゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでDNAを染
色し、増幅されたDNAを確認した。HCMV AD169株及びデ
ービス株を感染させたHEL細胞DNAからは共に305bpのバ
ンドを確認した。HCMVを感染させていないHEL細胞DNAか
らはDNAの増幅は認められなかった。
（１−４） ドットハイブリダイゼーションによるHCMV
DNAの検出 （１−３）で得た反応液を、94℃で、10分間処理し、
氷中で急冷してDNAを変性させた。この反応液５μを
ナイロンメンブラシ〔シュライヘル ウント、シュエル
（Shleicher ＆ Shuell）〕上にスポットし、紫外線ト
ランスイルミネーター（254nm）により10分間照射さ
せ、DNAをメンブランに固定させた。
DNAの検出 （１−３）で得た反応液を、94℃で、10分間処理し、
氷中で急冷してDNAを変性させた。この反応液５μを
ナイロンメンブラシ〔シュライヘル ウント、シュエル
（Shleicher ＆ Shuell）〕上にスポットし、紫外線ト
ランスイルミネーター（254nm）により10分間照射さ
せ、DNAをメンブランに固定させた。
このメンブランは、プレハイブリデーションバッファ
ー（５×デンハーツ液、５×SSC、0.1％SDS、100μg/ml
サケ精子DNA）10ml中で37℃、２時間プレハイブリダイ
ゼーションを行った。次に32Pにて５′未満をラベルし
た表１に示したプローブ１を加え、37℃、２時間ハイブ
リダイゼーションを行った。
ー（５×デンハーツ液、５×SSC、0.1％SDS、100μg/ml
サケ精子DNA）10ml中で37℃、２時間プレハイブリダイ
ゼーションを行った。次に32Pにて５′未満をラベルし
た表１に示したプローブ１を加え、37℃、２時間ハイブ
リダイゼーションを行った。
プローブ１の32P−ラベルはメガラベルキット（MEGAL
ABBL Kit）（宝酒造）を用いて次のように行った。10mo
leのプローブ１、１μの10×リン酸バッファー、50μ
Ciの〔γ−32P〕ATP（アマシャム社）、10ユニットのT4
−ポリヌクレオチドキナーゼを含む反応液に滅菌水を加
えて10μにし、37℃、30分間反応させた。反応後65
℃、10分間処理し、この反応液の２μ（約108cpm）を
ハイブリダイゼーションに用いた。
ABBL Kit）（宝酒造）を用いて次のように行った。10mo
leのプローブ１、１μの10×リン酸バッファー、50μ
Ciの〔γ−32P〕ATP（アマシャム社）、10ユニットのT4
−ポリヌクレオチドキナーゼを含む反応液に滅菌水を加
えて10μにし、37℃、30分間反応させた。反応後65
℃、10分間処理し、この反応液の２μ（約108cpm）を
ハイブリダイゼーションに用いた。
ハイブリダイゼーション後、メンブランを2xSSC、0.1
％SDSを含む洗浄液１で室温10分間で２回洗浄し、続い
て2.0×SSC、0.1％SDSを含む洗浄液２で55℃、20分間で
２回洗浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ線フィル
ム（富士フィルム）を入れたカセット内で−70℃、３時
間感光させ、オートラジオグラフをとった。
％SDSを含む洗浄液１で室温10分間で２回洗浄し、続い
て2.0×SSC、0.1％SDSを含む洗浄液２で55℃、20分間で
２回洗浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ線フィル
ム（富士フィルム）を入れたカセット内で−70℃、３時
間感光させ、オートラジオグラフをとった。
この結果、HCMV AD169株及びデービス株を感染させた
HEL細胞DNAからはドットが現われたが、HCMVを感染させ
ていないHEL細胞DNAからはドットが認められなかった。
HEL細胞DNAからはドットが現われたが、HCMVを感染させ
ていないHEL細胞DNAからはドットが認められなかった。
これらのことは、プライマー１及び２によりHCMV DNA
が特異的に増幅され、プローブ１とのハイブリダイゼー
ションによりHCMV DNAが特異的に検出できることを示す
ものである。
が特異的に増幅され、プローブ１とのハイブリダイゼー
ションによりHCMV DNAが特異的に検出できることを示す
ものである。
実施例２ HCMVの増幅・検出キットの作成 検体中のHCMVのDNAを増幅・検出するためのキットを
作成した。
作成した。
DNA増幅用プライマーとしてプライマー１、プライマ
ー２が各20μＭ溶液となるようにTEバッファー20μに
溶解し、HCMVプライマー液（Ａ剤）とした。
ー２が各20μＭ溶液となるようにTEバッファー20μに
溶解し、HCMVプライマー液（Ａ剤）とした。
DNA検出用プローブとして、表１記載のプローブ１の
２μｇをTEバッファー20μに溶解し、HCMVプローブ液
（Ｂ剤）とした。Ａ剤、Ｂ剤を１組とし、HCMV増幅・検
出キットとした（表２）。
２μｇをTEバッファー20μに溶解し、HCMVプローブ液
（Ｂ剤）とした。Ａ剤、Ｂ剤を１組とし、HCMV増幅・検
出キットとした（表２）。
（３−１） ウイルス感染細胞DNAの調製 HCMV DNA検出の特異性を確認するため、以下に示す４
種の他のヘパルス属ウイルス感染細胞DNAをテンプレー
トに用い増幅及び検出を行った。
種の他のヘパルス属ウイルス感染細胞DNAをテンプレー
トに用い増幅及び検出を行った。
エプスタイン−バール ウイルス（Epstein−Barr Vi
rus）（EBV）の感染したバッキット リンフォーマ腫Ra
ji細胞、単純ヘパルス ウイルス（Herpes Simplex Vir
us）１（HSV1）Ｆ株、単純ヘルペスウイルス２（HSV2）
Ｇ株及び水痘−帯状ヘルペスウイルス（Varicella−Zos
ter Virus）（VZV）岡株をそれぞれ感染させたHEL細胞
を（１−１）に示す方法で培養し、DNAをそれぞれ約50
μｇ回収した。
rus）（EBV）の感染したバッキット リンフォーマ腫Ra
ji細胞、単純ヘパルス ウイルス（Herpes Simplex Vir
us）１（HSV1）Ｆ株、単純ヘルペスウイルス２（HSV2）
Ｇ株及び水痘−帯状ヘルペスウイルス（Varicella−Zos
ter Virus）（VZV）岡株をそれぞれ感染させたHEL細胞
を（１−１）に示す方法で培養し、DNAをそれぞれ約50
μｇ回収した。
（３−２） PCR法による増幅とドットハイブリダイゼ
ーション （３−１）で調製したEBV、HSV1、HSV2、VZVを感染さ
せた細胞DNA1μｇを用い、（１−３）に示した方法でHC
MV増幅・検出キットＡ剤を用い30サイクルの増幅反応を
入った。反応後、反応後の10μと、HCMV増幅・検出キ
ットＢ剤を用い（１−４）に示す方法でドットハイブリ
ダイゼーションを行った。オートラジオグラフィーの結
果、いずれのヘルペス属ウイルスを感染させた細胞から
もドットは認められなかった。
ーション （３−１）で調製したEBV、HSV1、HSV2、VZVを感染さ
せた細胞DNA1μｇを用い、（１−３）に示した方法でHC
MV増幅・検出キットＡ剤を用い30サイクルの増幅反応を
入った。反応後、反応後の10μと、HCMV増幅・検出キ
ットＢ剤を用い（１−４）に示す方法でドットハイブリ
ダイゼーションを行った。オートラジオグラフィーの結
果、いずれのヘルペス属ウイルスを感染させた細胞から
もドットは認められなかった。
これらのことより、HCMV DNA中の式Ｉに示す305bpの
領域をPCR法の検出に用いることにより、他のヘルペス
属ウイルスは全く検出することなくHCMV DNAのみを特異
的に検出できることが示された。
領域をPCR法の検出に用いることにより、他のヘルペス
属ウイルスは全く検出することなくHCMV DNAのみを特異
的に検出できることが示された。
実施例４ 尿試料からのHCMV DNAの検出 （４−１） 尿試料からのDNAの調製 尿試料5mlを25,000rpm、1.5時間超遠心し、沈殿を回
収し、沈殿は、TE緩衝液（10mMトリス−CHl、pH8.0、1m
M EDTA）10.5％SDSを含む0.5mlの溶液に懸濁し、100μg
/mlになるようにプロテネースＫを加え70℃、２時間処
理した。次に、フェノールとクロロホルムの等量混合液
0.5mlを加え、静かにかくはんし、12000rpm、５分間遠
心後、水層を分離した。この水層に0.5mlのクロロホル
ムを加え、静かにかくはんし、同様に遠心して水層を分
離した。この水層に50μの3M酢酸ナトリウム、1mlの
エタノールを加え、充分かくはんし、−70℃、15分間放
置後、12000rpm、10分間遠心し、DNAの沈殿を回収し
た。沈殿は80％のエタノールで洗浄した後、乾燥させ
た。DNAは50μの滅菌水に溶解し、94℃、10分間加熱
処理した後、（１−３）に示す方法でジーン アンプTM
キット、HCMV増幅・検出キットＡ剤等を用いて増幅反応
液を調製し、30サイクルの増幅反応を行った。増幅後、
反応液の５μと、HCMV増幅・検出キットＢ剤を用い
（１−４）に示す方法でドットハイブリダイゼーション
を行った。
収し、沈殿は、TE緩衝液（10mMトリス−CHl、pH8.0、1m
M EDTA）10.5％SDSを含む0.5mlの溶液に懸濁し、100μg
/mlになるようにプロテネースＫを加え70℃、２時間処
理した。次に、フェノールとクロロホルムの等量混合液
0.5mlを加え、静かにかくはんし、12000rpm、５分間遠
心後、水層を分離した。この水層に0.5mlのクロロホル
ムを加え、静かにかくはんし、同様に遠心して水層を分
離した。この水層に50μの3M酢酸ナトリウム、1mlの
エタノールを加え、充分かくはんし、−70℃、15分間放
置後、12000rpm、10分間遠心し、DNAの沈殿を回収し
た。沈殿は80％のエタノールで洗浄した後、乾燥させ
た。DNAは50μの滅菌水に溶解し、94℃、10分間加熱
処理した後、（１−３）に示す方法でジーン アンプTM
キット、HCMV増幅・検出キットＡ剤等を用いて増幅反応
液を調製し、30サイクルの増幅反応を行った。増幅後、
反応液の５μと、HCMV増幅・検出キットＢ剤を用い
（１−４）に示す方法でドットハイブリダイゼーション
を行った。
結果は表３に示すように、24例中17例にHCMV DNAを検
出することができた。
出することができた。
細胞培養法では24例中９例の検出率であった。したが
って、細胞培養法と比較してPCR法を用いることにより
検出率が著しく上昇した。
って、細胞培養法と比較してPCR法を用いることにより
検出率が著しく上昇した。
〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明によりPCR法を用
いたHCMV DNAの高感度検出に有効な特定領域が明らかに
なり、試料中のHCMVゲノムの高感度検出方法及び検出キ
ットが提供された。
いたHCMV DNAの高感度検出に有効な特定領域が明らかに
なり、試料中のHCMVゲノムの高感度検出方法及び検出キ
ットが提供された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ 192 ｐ．177 −208 （1986) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/38 ＣＡ（ＳＴＮ) ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ
Claims (2)
- 【請求項１】下記式I: で表される特定のDNA領域を、下記式II: で表される一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用い
て増幅させることを特徴とするヒトサイトメガロウイル
スDNAの検出方法。 - 【請求項２】請求項１記載の方法を用いて検出を行うた
めの検出キットであって、請求項１記載の式IIで表され
る一対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有している
ことを特徴とするヒトサイトメガロウイルスDNA検出キ
ット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20037089A JP2835855B2 (ja) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | ヒトサイトメガロウイルスの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20037089A JP2835855B2 (ja) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | ヒトサイトメガロウイルスの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0365200A JPH0365200A (ja) | 1991-03-20 |
| JP2835855B2 true JP2835855B2 (ja) | 1998-12-14 |
Family
ID=16423181
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20037089A Expired - Fee Related JP2835855B2 (ja) | 1989-08-03 | 1989-08-03 | ヒトサイトメガロウイルスの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2835855B2 (ja) |
-
1989
- 1989-08-03 JP JP20037089A patent/JP2835855B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９２ ｐ．１７７−２０８ （１９８６） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0365200A (ja) | 1991-03-20 |
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