JP2651483B2 - ポリメラーゼ連鎖反応によるヒト乳頭腫ウイルスの検出 - Google Patents
ポリメラーゼ連鎖反応によるヒト乳頭腫ウイルスの検出Info
- Publication number
- JP2651483B2 JP2651483B2 JP1510640A JP51064089A JP2651483B2 JP 2651483 B2 JP2651483 B2 JP 2651483B2 JP 1510640 A JP1510640 A JP 1510640A JP 51064089 A JP51064089 A JP 51064089A JP 2651483 B2 JP2651483 B2 JP 2651483B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hpv
- consensus
- probe
- primer
- primers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、HPVを検出し、そしてHPVの型を検出するた
めの医学的研究及び診断方法を提供する。この方法は分
子生物学及び遺伝子工学の分野において広く使用される
PCR、すなわちDNA増幅技法を利用する。この方法はま
た、これまで知られていないHPVの株に関する情報を付
与するためにも使用され得、そして従って、ウィルス学
の分野にも適用される。
めの医学的研究及び診断方法を提供する。この方法は分
子生物学及び遺伝子工学の分野において広く使用される
PCR、すなわちDNA増幅技法を利用する。この方法はま
た、これまで知られていないHPVの株に関する情報を付
与するためにも使用され得、そして従って、ウィルス学
の分野にも適用される。
乳頭腫ウィルスは、広範囲の重度のヒト疾患、特に生
殖器及び口内粘膜の癌に関係して来た。生殖器のHPV感
染は主に女性における癌に関連しているけれども、最近
の出来事は、HPVが男性における前立腺癌の進行に役割
を演じていることを示唆する。Brokerなど.,1986,Cance
r Cells ４:17〜36は、乳頭腫ウィルスの分子、細胞及
び臨床学的観点及びHPVと癌との関係を論じている。HPV
タイプ6,11,16,18及び33はヒトにおいて既知の生殖器HP
Vタイプであり、そしてBrokerなど.,1986,Cancer Cells
４:589〜594は、HPVタイプ6,11,16,18及び33がDNAレ
ベルで、特にL1読み取り枠で有意な相同性を共有するこ
とを開示する。
殖器及び口内粘膜の癌に関係して来た。生殖器のHPV感
染は主に女性における癌に関連しているけれども、最近
の出来事は、HPVが男性における前立腺癌の進行に役割
を演じていることを示唆する。Brokerなど.,1986,Cance
r Cells ４:17〜36は、乳頭腫ウィルスの分子、細胞及
び臨床学的観点及びHPVと癌との関係を論じている。HPV
タイプ6,11,16,18及び33はヒトにおいて既知の生殖器HP
Vタイプであり、そしてBrokerなど.,1986,Cancer Cells
４:589〜594は、HPVタイプ6,11,16,18及び33がDNAレ
ベルで、特にL1読み取り枠で有意な相同性を共有するこ
とを開示する。
HPVの同定及び型の検出は、種々のタイプのHPVが影響
を受けた個人に対して種々の危険性を付与するので、ひ
じょうに重要である。たとえば、HPV 16及びHPV 18は、
他のHPVタイプよりも頚部異形成及び癌により高い頻度
で確実に確認されて来た。Webbなど.,1987年12月、J.In
f.Disease 156（６）:912〜919は、逆−ブロッティン
グ方法を用いる、HPV DNAタイプを検出するための方法
を報告する。その方法は、４種の異なったHPVタイプか
らのゲノムDNAが結合される膜を形成し、そして次に生
物学的サンプルからのラベルされたDNAを前記膜に結合
されるDNAにハイブリダイズせしめることを包含する。C
ausseyなど.,1988年２月、J.Clin.Microbiol．26
（２）:236〜243は類似するHPV検出法を記載する。
を受けた個人に対して種々の危険性を付与するので、ひ
じょうに重要である。たとえば、HPV 16及びHPV 18は、
他のHPVタイプよりも頚部異形成及び癌により高い頻度
で確実に確認されて来た。Webbなど.,1987年12月、J.In
f.Disease 156（６）:912〜919は、逆−ブロッティン
グ方法を用いる、HPV DNAタイプを検出するための方法
を報告する。その方法は、４種の異なったHPVタイプか
らのゲノムDNAが結合される膜を形成し、そして次に生
物学的サンプルからのラベルされたDNAを前記膜に結合
されるDNAにハイブリダイズせしめることを包含する。C
ausseyなど.,1988年２月、J.Clin.Microbiol．26
（２）:236〜243は類似するHPV検出法を記載する。
Shibataなど.,1988年１月、J.Exp.Med. 167:225〜23
0は、HPV 16及びHPV 18 DNAの存在を増幅し、そして検
出するためにPCRの使用を開示する。アメリカ特許第4,6
83,195号及び第4,683,202号は、PCR及びサンプルにおけ
る核酸配列の存在又は不在を検出するためにPCRの使用
を開示する。ヨーロッパ特許第229,701号及び第269,445
号は、広範囲の種類のウィルス、たとえばAIDSウィル
ス、HTLV I及びHTLV IIに関連するDNA配列を増幅し、そ
して検出するためにPCRの使用を開示する。
0は、HPV 16及びHPV 18 DNAの存在を増幅し、そして検
出するためにPCRの使用を開示する。アメリカ特許第4,6
83,195号及び第4,683,202号は、PCR及びサンプルにおけ
る核酸配列の存在又は不在を検出するためにPCRの使用
を開示する。ヨーロッパ特許第229,701号及び第269,445
号は、広範囲の種類のウィルス、たとえばAIDSウィル
ス、HTLV I及びHTLV IIに関連するDNA配列を増幅し、そ
して検出するためにPCRの使用を開示する。
Maitlandなど.,1988年５月、Seventh International
Papillomavirus Workshop,Abstract、５ページは、タイ
プ1a,5,6a,6b,8,11,16,18及び33におけるHPV配列のPCR
による特異的増幅のためのプライマーの混合物の使用を
報告する。多くの他の研究者は、Seventh Internationa
l Papillomavirus WorkshopでHPV配列を増幅し、そして
検出するためにPCRの使用を開示する。
Papillomavirus Workshop,Abstract、５ページは、タイ
プ1a,5,6a,6b,8,11,16,18及び33におけるHPV配列のPCR
による特異的増幅のためのプライマーの混合物の使用を
報告する。多くの他の研究者は、Seventh Internationa
l Papillomavirus WorkshopでHPV配列を増幅し、そして
検出するためにPCRの使用を開示する。
HPV配列を増幅し、そして検出するためにPCRの使用に
もかかわらず、生物学的サンプルにおけるHPVを検出
し、そしてその型を検出するための単純且つ急速な方法
のための必要性がまだ残る。本発明はその必要性を満た
す方法を提供する。
もかかわらず、生物学的サンプルにおけるHPVを検出
し、そしてその型を検出するための単純且つ急速な方法
のための必要性がまだ残る。本発明はその必要性を満た
す方法を提供する。
本発明は、サンプルにおけるHPVを検出し、そしてそ
の型を検出するための方法を提供する。その方法は、サ
ンプルに存在するHPV DNAの配列を増幅し、増幅が生じ
たかどうかを決定し、そして次にその増幅されたDNAにH
PVタイプ特異的プローブをハイブリダイズせしめること
を含んで成る。本発明はまた、前記方法に使用するため
の新規プライマー及びプローブを供給する。
の型を検出するための方法を提供する。その方法は、サ
ンプルに存在するHPV DNAの配列を増幅し、増幅が生じ
たかどうかを決定し、そして次にその増幅されたDNAにH
PVタイプ特異的プローブをハイブリダイズせしめること
を含んで成る。本発明はまた、前記方法に使用するため
の新規プライマー及びプローブを供給する。
本発明は、サンプル中のHPVを検出し、そして存在す
る場合、そのHPVの型を検出するための方法を提供し、
ここで前記方法は： （ａ）コンセンサスプライマーの延長生成物が合成され
得るような条件下でコンセンサスHPVプライマー、重合
剤及びデオキシヌクレオシド５′−トリホスフェートに
よりサンプルを処理し、ここで前記コンセンサスプライ
マーは、一対のプライマーの１つのメンバーから合成さ
れる延長生成物が、その相補的鎖から分離された場合に
前記対の他のメンバーの延長生成物の合成のための鋳型
として作用することができるように、HPV DNAの鎖を分
離してそれらにハイブリダイズするために十分に相補的
な少なくとも１対のプライマーを含んで成るオリゴヌク
レオチドの混合物であり； （ｂ）もし存在するなら、その上で延長生成物が合成さ
れる鋳型からプライマー延長生成物を分離して一本鎖分
子を形成せしめ； （ｃ）もし存在するなら、段階（ｂ）で生成された一本
鎖分子のそれぞれを鋳型として使用してプライマー延長
生成物が合成される条件下で、段階（ｂ）において生成
した一本鎖分子を（ａ）のコンセンサスプライマーによ
り処理し； （ｄ）段階（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１度くり返
し； （ｅ）増幅が生じたかどうかを決定し；そして増幅が生
じた場合、 （ｆ）前記増幅されたDNAにHPVタイプ特異的DNAプロー
ブをハイブリダイズせしめ；そして （ｇ）ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを決定
する； ことを含んで成る。
る場合、そのHPVの型を検出するための方法を提供し、
ここで前記方法は： （ａ）コンセンサスプライマーの延長生成物が合成され
得るような条件下でコンセンサスHPVプライマー、重合
剤及びデオキシヌクレオシド５′−トリホスフェートに
よりサンプルを処理し、ここで前記コンセンサスプライ
マーは、一対のプライマーの１つのメンバーから合成さ
れる延長生成物が、その相補的鎖から分離された場合に
前記対の他のメンバーの延長生成物の合成のための鋳型
として作用することができるように、HPV DNAの鎖を分
離してそれらにハイブリダイズするために十分に相補的
な少なくとも１対のプライマーを含んで成るオリゴヌク
レオチドの混合物であり； （ｂ）もし存在するなら、その上で延長生成物が合成さ
れる鋳型からプライマー延長生成物を分離して一本鎖分
子を形成せしめ； （ｃ）もし存在するなら、段階（ｂ）で生成された一本
鎖分子のそれぞれを鋳型として使用してプライマー延長
生成物が合成される条件下で、段階（ｂ）において生成
した一本鎖分子を（ａ）のコンセンサスプライマーによ
り処理し； （ｄ）段階（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも１度くり返
し； （ｅ）増幅が生じたかどうかを決定し；そして増幅が生
じた場合、 （ｆ）前記増幅されたDNAにHPVタイプ特異的DNAプロー
ブをハイブリダイズせしめ；そして （ｇ）ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを決定
する； ことを含んで成る。
本発明の方法における第１段階は、サンプルに存在す
るHPV DNAからDNAの別の領域を増幅するであろうコンセ
ンサスプライマーの使用を必要とする。これらのコンセ
ンサスプライマー対はオリゴヌクレオチドであり、そし
てコンセンサスプライマーはプライマー対の混合物であ
る。この方法に使用される混合物は、サンプルに存在す
るHPVのタイプにかかわらず、“コンセンサス”配列間
の領域に対応するHPV DNAは増幅されるであろうことを
保証する。HPVがサンプルに存在する場合、コンセンサ
スプライマーから生成されるPCR生成物は、次に、存在
するHPVタイプを決定するためにタイプ特異的プローブ
とのハイブリダイゼーションにより分析される。
るHPV DNAからDNAの別の領域を増幅するであろうコンセ
ンサスプライマーの使用を必要とする。これらのコンセ
ンサスプライマー対はオリゴヌクレオチドであり、そし
てコンセンサスプライマーはプライマー対の混合物であ
る。この方法に使用される混合物は、サンプルに存在す
るHPVのタイプにかかわらず、“コンセンサス”配列間
の領域に対応するHPV DNAは増幅されるであろうことを
保証する。HPVがサンプルに存在する場合、コンセンサ
スプライマーから生成されるPCR生成物は、次に、存在
するHPVタイプを決定するためにタイプ特異的プローブ
とのハイブリダイゼーションにより分析される。
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）によるDNAの増幅は、アメ
リカ特許第4,683,202号及び第4,683,195号並びに上記ク
ロス−リファレンスに引用により導入されている関連出
願に開示されている。DNAのPCR増幅は、DNAの熱変性
し、増幅されるべきDNAセグメントを端に有する配列に
２種のオリゴヌクレオチドプライマーをアニールし、そ
してそのアニールされたプライマーをDNAポリメラーゼ
により拡張する反復サイクルを包含する。プライマーは
標的配列の反対の鎖にハイブリダイズし、そしてポリメ
ラーゼによるDNA合成がプライマー間の領域を横ぎって
進行するように配向され、DNAセグメントの量を効果的
に２倍にする。さらに、拡張生成物はプライマーに相補
的であり、そしてプライマーを結合することができるの
で、個々の連続的なサイクルは実質的に、これまでのサ
イクルで合成されるDNAの量を２倍にする。これは、サ
イクル当たり約2n（ここでｎはサイクル回数である）の
割合で、特異的な標的フラグメントの指数的な蓄積をも
たらす。
リカ特許第4,683,202号及び第4,683,195号並びに上記ク
ロス−リファレンスに引用により導入されている関連出
願に開示されている。DNAのPCR増幅は、DNAの熱変性
し、増幅されるべきDNAセグメントを端に有する配列に
２種のオリゴヌクレオチドプライマーをアニールし、そ
してそのアニールされたプライマーをDNAポリメラーゼ
により拡張する反復サイクルを包含する。プライマーは
標的配列の反対の鎖にハイブリダイズし、そしてポリメ
ラーゼによるDNA合成がプライマー間の領域を横ぎって
進行するように配向され、DNAセグメントの量を効果的
に２倍にする。さらに、拡張生成物はプライマーに相補
的であり、そしてプライマーを結合することができるの
で、個々の連続的なサイクルは実質的に、これまでのサ
イクルで合成されるDNAの量を２倍にする。これは、サ
イクル当たり約2n（ここでｎはサイクル回数である）の
割合で、特異的な標的フラグメントの指数的な蓄積をも
たらす。
PCRに使用するためのプライマーの選択は、増幅反応
の特異性を決定する。本発明の方法の増幅段階において
は、タイプに関係なく、サンプルに存在する生殖器HPV
配列を増幅するであろう“コンセンサス”プライマーが
使用される。本発明のコンセンサスプライマーは、分解
プライマー、すなわちいくつかのヌクレオチドのいづれ
か１つが、合成の間、選択された位置でプライマー中に
導入され得るように合成されたオリゴヌクレオチドの混
合物を包含することができる。コンセンサスプライマー
は、サンプルに存在するいづれかのHPVのDNA配列を増幅
するためにすべてのタイプのHPVに対して十分に相補的
である。コンセンサスプライマーはまた、個々の主要ウ
ィルスタイプに対して特異的である配列を含むDNAの領
域を増幅するようにも企画されており、その結果、増幅
されたDNAはサンプルに存在するHPVの型を検出するため
に使用され得る。
の特異性を決定する。本発明の方法の増幅段階において
は、タイプに関係なく、サンプルに存在する生殖器HPV
配列を増幅するであろう“コンセンサス”プライマーが
使用される。本発明のコンセンサスプライマーは、分解
プライマー、すなわちいくつかのヌクレオチドのいづれ
か１つが、合成の間、選択された位置でプライマー中に
導入され得るように合成されたオリゴヌクレオチドの混
合物を包含することができる。コンセンサスプライマー
は、サンプルに存在するいづれかのHPVのDNA配列を増幅
するためにすべてのタイプのHPVに対して十分に相補的
である。コンセンサスプライマーはまた、個々の主要ウ
ィルスタイプに対して特異的である配列を含むDNAの領
域を増幅するようにも企画されており、その結果、増幅
されたDNAはサンプルに存在するHPVの型を検出するため
に使用され得る。
いづれのHPVにも適用されるが、本発明は、生殖器HPV
鎖に関して下記に例示される。さらに、本発明のプライ
マー及びプローブは、下記に記載される部分以外のHPV
ゲノムの部分に標的が向けられており、但し、標的が向
けられている特定の部分はコンセンサスプライマーを用
いて増幅され得、そしてその増幅されたDNAはタイプ特
異的プローブを用いて型を検出され得る。
鎖に関して下記に例示される。さらに、本発明のプライ
マー及びプローブは、下記に記載される部分以外のHPV
ゲノムの部分に標的が向けられており、但し、標的が向
けられている特定の部分はコンセンサスプライマーを用
いて増幅され得、そしてその増幅されたDNAはタイプ特
異的プローブを用いて型を検出され得る。
本発明の方法の第１段階は、HPV配列がサンプルに存
在する場合、コンセンサスプライマーを用いてPCRによ
るその配列の増幅を包含する。本発明の例示的なコンセ
ンサスプライマーは、プライマーが増幅するために使用
されるHPVゲノムの領域により言及される。HPVゲノムは
環状である。生殖器HPVのゲノムは次の通りに配向され
る:E6,E7,E1,E2,E4,E5a,E5b,L2,L1及びURR.“E"及び
“L"は、読み取り枠を示すが、しかし多くの読み取り枠
はオーバーラップしている。たとえば、E4はE2読み取り
枠内に完全に含まれる。URRは転写調節領域である。プ
ライマーは、HPV領域の１又は複数の領域に及ぶ配列を
増幅するために使用され得る。
在する場合、コンセンサスプライマーを用いてPCRによ
るその配列の増幅を包含する。本発明の例示的なコンセ
ンサスプライマーは、プライマーが増幅するために使用
されるHPVゲノムの領域により言及される。HPVゲノムは
環状である。生殖器HPVのゲノムは次の通りに配向され
る:E6,E7,E1,E2,E4,E5a,E5b,L2,L1及びURR.“E"及び
“L"は、読み取り枠を示すが、しかし多くの読み取り枠
はオーバーラップしている。たとえば、E4はE2読み取り
枠内に完全に含まれる。URRは転写調節領域である。プ
ライマーは、HPV領域の１又は複数の領域に及ぶ配列を
増幅するために使用され得る。
たとえば、本発明のL1/E6のコンセンサスプライマー
の組合せは、いづれかの生殖器HPVからのDNAの配列を増
幅するように企画されている。増幅された配列は、URR
を横ぎってL1からE6中に延長し、そして従ってL1及びE6
領域及びそのL1及びE6の間にサンドイッチされているUR
R領域の部分を含む。従って、コンセンサスプライマー
対は、L1領域における配列に対して特異的な第１プライ
マー及びE6領域における配列に対して特異的な第２プラ
イマーから成る。第１表に示されるように、第１のL1−
特異的プライマーは、FS10,FS17又はMY01のいづれかで
あり、そして第２のE6−特異的プライマーは、JS15及び
JS16の少なくとも1:1混合物である（但し、その混合物
はまたJS16よりもJS15を含むこともできる）。第１表は
また、個々のプライマー配列及びその対応する配列（及
びその配列のヌクレオチド位置）が良く知られていたい
くつかの生殖器HPV（タイプ6,11,16,18及び33）のゲノ
ムに存在する場合、それらの配列を示す。配列における
点線は、ゲノム配列がプライマー配列と同一であること
を示す。ヌクレオチドは次の通りに略される： 第１表に示されるように、FS10は、３個がHPV 16とミ
スマッチし、そして１個がHPV 18及びHPV 33とミスマッ
チする25−マーのものである。FS17は種々のHPVと１又
は２個のミスマッチを有する劣化プライマーである。MY
01はFS17に類似し、ミスマッチを減じ、そして広範囲の
HPVを実質的に包含するために１以上の劣化塩基を含
む。JS15は、HPV 6,11,16及び33のE6における陰性鎖の
ための劣化18−マーのものであり、ところがJS16はHPV
18と同じ機能を有する19−マーのものである。
の組合せは、いづれかの生殖器HPVからのDNAの配列を増
幅するように企画されている。増幅された配列は、URR
を横ぎってL1からE6中に延長し、そして従ってL1及びE6
領域及びそのL1及びE6の間にサンドイッチされているUR
R領域の部分を含む。従って、コンセンサスプライマー
対は、L1領域における配列に対して特異的な第１プライ
マー及びE6領域における配列に対して特異的な第２プラ
イマーから成る。第１表に示されるように、第１のL1−
特異的プライマーは、FS10,FS17又はMY01のいづれかで
あり、そして第２のE6−特異的プライマーは、JS15及び
JS16の少なくとも1:1混合物である（但し、その混合物
はまたJS16よりもJS15を含むこともできる）。第１表は
また、個々のプライマー配列及びその対応する配列（及
びその配列のヌクレオチド位置）が良く知られていたい
くつかの生殖器HPV（タイプ6,11,16,18及び33）のゲノ
ムに存在する場合、それらの配列を示す。配列における
点線は、ゲノム配列がプライマー配列と同一であること
を示す。ヌクレオチドは次の通りに略される： 第１表に示されるように、FS10は、３個がHPV 16とミ
スマッチし、そして１個がHPV 18及びHPV 33とミスマッ
チする25−マーのものである。FS17は種々のHPVと１又
は２個のミスマッチを有する劣化プライマーである。MY
01はFS17に類似し、ミスマッチを減じ、そして広範囲の
HPVを実質的に包含するために１以上の劣化塩基を含
む。JS15は、HPV 6,11,16及び33のE6における陰性鎖の
ための劣化18−マーのものであり、ところがJS16はHPV
18と同じ機能を有する19−マーのものである。
サンプルがPCRのために適切な条件下で上記に示され
るL1/E6プライマーにより処理された後、本発明の方法
は、増幅が生じたかどうかの決定を必要とする。増幅が
L1/E6プライマーにより生ぜしめられる場合、HPV配列は
サンプルに存在する。PCRのためのサンプルの能力を確
保するために内部増幅制御の使用は、本発明の範囲内で
あり、そして誤った陰性結果の可能性を減じる。増幅が
生じたかどうかを決定するためには、種々の方法が存在
する。反応混合物の一部をゲル電気泳動にかけ、そして
その得られたゲルを臭化エチジウムにより染色し、そし
て予測されるサイズの生成物が存在するかどうかを観察
するために紫外線に照射する。ラベルされたプライマー
又はデオキシリボヌクレオチド５′−トリホスフェート
がPCR反応混合物に添加され、そして増幅されてDNA中へ
のラベルの導入が、増幅が生じたかどうを決定するため
に測定される。増幅が生じたかどうかを決定するための
もう１つの方法は、増幅されたDNAにのみハイブリダイ
ズするように企画されたラベルされたオリゴヌクレオチ
ドプローブにハイブリダイズする能力についてPCR反応
混合物の一部を試験することである。そのプローブは、
いづれかHPVかの増幅されたDNAが検出され得るようなコ
ンセンサスプローブであるべきである。たとえば、L1/E
6コンセンサスプライマーFS10,JS15及びJS16を用いての
HPV DNAの増幅は、L1/E6コンセンサスプライマーFS17又
はMY01を用いて検出され得る。他方、増幅の決定及びHP
Vタイプの同定は、１又は複数のタイプ特異的プローブ
にハイブリダイズするその能力についてPCR反応混合物
の一部を試験することによって１段階で行なわれる得
る。
るL1/E6プライマーにより処理された後、本発明の方法
は、増幅が生じたかどうかの決定を必要とする。増幅が
L1/E6プライマーにより生ぜしめられる場合、HPV配列は
サンプルに存在する。PCRのためのサンプルの能力を確
保するために内部増幅制御の使用は、本発明の範囲内で
あり、そして誤った陰性結果の可能性を減じる。増幅が
生じたかどうかを決定するためには、種々の方法が存在
する。反応混合物の一部をゲル電気泳動にかけ、そして
その得られたゲルを臭化エチジウムにより染色し、そし
て予測されるサイズの生成物が存在するかどうかを観察
するために紫外線に照射する。ラベルされたプライマー
又はデオキシリボヌクレオチド５′−トリホスフェート
がPCR反応混合物に添加され、そして増幅されてDNA中へ
のラベルの導入が、増幅が生じたかどうを決定するため
に測定される。増幅が生じたかどうかを決定するための
もう１つの方法は、増幅されたDNAにのみハイブリダイ
ズするように企画されたラベルされたオリゴヌクレオチ
ドプローブにハイブリダイズする能力についてPCR反応
混合物の一部を試験することである。そのプローブは、
いづれかHPVかの増幅されたDNAが検出され得るようなコ
ンセンサスプローブであるべきである。たとえば、L1/E
6コンセンサスプライマーFS10,JS15及びJS16を用いての
HPV DNAの増幅は、L1/E6コンセンサスプライマーFS17又
はMY01を用いて検出され得る。他方、増幅の決定及びHP
Vタイプの同定は、１又は複数のタイプ特異的プローブ
にハイブリダイズするその能力についてPCR反応混合物
の一部を試験することによって１段階で行なわれる得
る。
本発明の重要な観点は、本発明の方法に使用するため
に提供された新規のプローブに関する。これらのプロー
ブが、増幅が生じたかどうかを決定するためのコンセン
サスプローブであろうと又はこれらのプローブがタイプ
特異的プローブであろうと、それらのプローブは種々の
異なったハイブリダイゼーション型な使用され得る。相
補的な標的配列への核酸プローブの溶液ハイブリダイゼ
ーションは、明らかに本発明の範囲内であるが、本発明
の商品化は固定されたプローブの使用及び従って、疑似
“固相”ハイブリダイゼーションをもたらす傾向があ
る。この型においては、プローブは固体支持体に共有結
合され、そして次に標的配列がそのプローブによりハイ
ブリダイズされる。この方法においては、プローブは長
いストレッチのＴ残基により固体支持体に結合され；こ
れらのＴ残基は、ハイブリダイズする配列が合成された
後、自動合成機上でのプローブの合成の間、プローブに
付加される。種々の染料及びクロモゲン並びに対応する
ラベルが核酸検出システムのために利用できる。
に提供された新規のプローブに関する。これらのプロー
ブが、増幅が生じたかどうかを決定するためのコンセン
サスプローブであろうと又はこれらのプローブがタイプ
特異的プローブであろうと、それらのプローブは種々の
異なったハイブリダイゼーション型な使用され得る。相
補的な標的配列への核酸プローブの溶液ハイブリダイゼ
ーションは、明らかに本発明の範囲内であるが、本発明
の商品化は固定されたプローブの使用及び従って、疑似
“固相”ハイブリダイゼーションをもたらす傾向があ
る。この型においては、プローブは固体支持体に共有結
合され、そして次に標的配列がそのプローブによりハイ
ブリダイズされる。この方法においては、プローブは長
いストレッチのＴ残基により固体支持体に結合され；こ
れらのＴ残基は、ハイブリダイズする配列が合成された
後、自動合成機上でのプローブの合成の間、プローブに
付加される。種々の染料及びクロモゲン並びに対応する
ラベルが核酸検出システムのために利用できる。
本発明はひじょうに多くのこれまで知られていない
（又は少なくとも特徴化されていない）HPVタイプの発
見を誘導し、そして誘導し続けているが、しかしながら
コンセンサスプローブが、増幅が生じたかどうかを決定
するために使用される本発明の態様は重要性が衰退し続
けるであろう。これは、発見されたHPVの個々の新規タ
イプに関して、その新規タイプが検出されるであろうこ
とを確保するためのコンセンサスプローブをより一般的
にする相当する必要性が存在するからである。この問題
を克服するためには、本発明は新規タイプのコンセンサ
スプローブを供給する。この新規タイプのプローブは、
増幅に使用されるプライマーに対応するHPVゲノム上の
２種の配列間に存在するDNA配列のすべて又はほとんど
を含んで成る、１又は複数のHPVウィルスからのDNAの配
列から実質的に成る。しかしながら、そのコンセンサス
プローブは、サンプルにおけるHPV DNAを増幅するため
に使用されるいづれかのプライマーに相補的な配列を含
むべきでない。この新タイプのコンセンサスプローブ
は、それが本発明の他のコンセンサスプローブよりもハ
イブリダイゼーションのために利用できるより多くの配
列を有することでより高い多様性を有する。さらに、そ
のコンセンサスプローブは、サンプルに存在するHPV DN
A配列を増幅するために使用されるプライマーにより定
義されるDNAの領域内に存在する配列にハイブリダイズ
するプライマーと共にPCRにより生成され得る。
（又は少なくとも特徴化されていない）HPVタイプの発
見を誘導し、そして誘導し続けているが、しかしながら
コンセンサスプローブが、増幅が生じたかどうかを決定
するために使用される本発明の態様は重要性が衰退し続
けるであろう。これは、発見されたHPVの個々の新規タ
イプに関して、その新規タイプが検出されるであろうこ
とを確保するためのコンセンサスプローブをより一般的
にする相当する必要性が存在するからである。この問題
を克服するためには、本発明は新規タイプのコンセンサ
スプローブを供給する。この新規タイプのプローブは、
増幅に使用されるプライマーに対応するHPVゲノム上の
２種の配列間に存在するDNA配列のすべて又はほとんど
を含んで成る、１又は複数のHPVウィルスからのDNAの配
列から実質的に成る。しかしながら、そのコンセンサス
プローブは、サンプルにおけるHPV DNAを増幅するため
に使用されるいづれかのプライマーに相補的な配列を含
むべきでない。この新タイプのコンセンサスプローブ
は、それが本発明の他のコンセンサスプローブよりもハ
イブリダイゼーションのために利用できるより多くの配
列を有することでより高い多様性を有する。さらに、そ
のコンセンサスプローブは、サンプルに存在するHPV DN
A配列を増幅するために使用されるプライマーにより定
義されるDNAの領域内に存在する配列にハイブリダイズ
するプライマーと共にPCRにより生成され得る。
本発明は、本発明のL1/E6コンセンサスプライマーと
共に使用するための多くのタイプ特異的プローブを供給
する。これらのプローブは下記第２表に示される。当業
者は、本明細書に例示される本発明の特定のプライマー
及びプローブは一定数のヌクレオチド残基を有するけれ
ども、１又は複数のヌクレオチド残基は、本発明の方法
におけるそのプライマー又はプローブの適合性に高い衝
撃を典型的には伴わないで、付与されたプライマー又は
プローブに付加され、又はそれから欠失され得ることを
理解するであろう。
共に使用するための多くのタイプ特異的プローブを供給
する。これらのプローブは下記第２表に示される。当業
者は、本明細書に例示される本発明の特定のプライマー
及びプローブは一定数のヌクレオチド残基を有するけれ
ども、１又は複数のヌクレオチド残基は、本発明の方法
におけるそのプライマー又はプローブの適合性に高い衝
撃を典型的には伴わないで、付与されたプライマー又は
プローブに付加され、又はそれから欠失され得ることを
理解するであろう。
FS19及びJS17は、それぞれHPV 11及びHPV 16を特異的
に検出することができる。FS18は、HPV 11 PCR生成物と
のあるハイブリダイゼーションを示す。FS18配列及びHP
V 11配列を含んで成るUWGCGGAPプログラム分析は、増幅
された領域においてHPV 11に対してFS18の73％の相同性
を示す。クロス−ハイブリダイゼーションは洗浄の強さ
を高めることによって最少にされ得る。FS21はHPV 18に
対して特異的であった。
に検出することができる。FS18は、HPV 11 PCR生成物と
のあるハイブリダイゼーションを示す。FS18配列及びHP
V 11配列を含んで成るUWGCGGAPプログラム分析は、増幅
された領域においてHPV 11に対してFS18の73％の相同性
を示す。クロス−ハイブリダイゼーションは洗浄の強さ
を高めることによって最少にされ得る。FS21はHPV 18に
対して特異的であった。
上記に開示されるL1/E6プライマーは、HPV DNAの比較
的大きなセグメントの増幅を提供する。しかしながら、
より短いPCR生成物をもたらすプライマーの使用は、い
くつかの利点、たとえば減じられた拡張及び変性時間及
び低められた変性温度を有することができる。本発明の
L1コンセンサスプライマーは、そのような利点を達成す
るためにHPVゲノムの比較的小さなセグメントを増幅す
るように企画される発明のプライマーの例示である。L1
コンセンサスプライマーは、L1読み取り枠における配列
に対応するPCR生成物を生成し、そして下記第３表に示
される。
的大きなセグメントの増幅を提供する。しかしながら、
より短いPCR生成物をもたらすプライマーの使用は、い
くつかの利点、たとえば減じられた拡張及び変性時間及
び低められた変性温度を有することができる。本発明の
L1コンセンサスプライマーは、そのような利点を達成す
るためにHPVゲノムの比較的小さなセグメントを増幅す
るように企画される発明のプライマーの例示である。L1
コンセンサスプライマーは、L1読み取り枠における配列
に対応するPCR生成物を生成し、そして下記第３表に示
される。
生殖器HPVについての本発明の方法の好ましい態様
は、サンプルに存在する場合、L1コンセンサスプライマ
ーMY09及びMY11によるHPV配列の増幅；一般的な生殖器H
PVプローブとPCR反応混合物の一部のハイブリダイゼー
ションによる増幅の決定；及び最後に、タイプ特異的プ
ローブによるタイプ決定を含んで成る。HPV DNA配列の
増幅が、本発明のL1コンセンサスプライマーにより処理
されたサンプルに生じたかどうかを決定するためには、
PCR反応混合物の一部が第４表に示されるL1コンセンサ
スプローブとハイブリダイズすることができる。
は、サンプルに存在する場合、L1コンセンサスプライマ
ーMY09及びMY11によるHPV配列の増幅；一般的な生殖器H
PVプローブとPCR反応混合物の一部のハイブリダイゼー
ションによる増幅の決定；及び最後に、タイプ特異的プ
ローブによるタイプ決定を含んで成る。HPV DNA配列の
増幅が、本発明のL1コンセンサスプライマーにより処理
されたサンプルに生じたかどうかを決定するためには、
PCR反応混合物の一部が第４表に示されるL1コンセンサ
スプローブとハイブリダイズすることができる。
PCR反応混合物の一部がL1コンセンサスプローブ混合
物に含まれるプローブにハイブリダイズするDNAを含む
場合、サンプルはHPV DNAを含む。プローブがサンプル
に含まれるDNA配列にハイブリダイズしたかどうかを決
定するためには多くの手段が存在する。典型的には、プ
ローブは検出できる方法でラベルされ、標的DNA（すな
わちPCR反応緩衝液における増幅されたDNA）は固体支持
体に結合され、そしてハイブリダイゼーションが生じた
かどうかの決定はラベルがその固体支持体上に存在する
かどうかを決定することを包含する。しかしながら、こ
の方法は多様であり、そして標的がラベルされ、そして
プローブが固体支持体に結合される場合、作動する。プ
ローブ又は標的であれ、核酸をラベルするための多くの
方法は、当業界において既知であり、そして本発明の目
的のために適切である。本発明の実施を減じることにお
いて包含される実験作業においては、プローブは、放射
性ラベルされたATPの存在下でポリヌクレオチドキナー
ゼによりプローブを処理することによって放射性リン32
Pにより典型的にはラベルされた。しかしながら、商業
目的のためには、他の非放射性ラベリングシステム、す
なわちホースラディシュペルオキシダーゼ−アビジン−
ビオチンシステムが好ましい。
物に含まれるプローブにハイブリダイズするDNAを含む
場合、サンプルはHPV DNAを含む。プローブがサンプル
に含まれるDNA配列にハイブリダイズしたかどうかを決
定するためには多くの手段が存在する。典型的には、プ
ローブは検出できる方法でラベルされ、標的DNA（すな
わちPCR反応緩衝液における増幅されたDNA）は固体支持
体に結合され、そしてハイブリダイゼーションが生じた
かどうかの決定はラベルがその固体支持体上に存在する
かどうかを決定することを包含する。しかしながら、こ
の方法は多様であり、そして標的がラベルされ、そして
プローブが固体支持体に結合される場合、作動する。プ
ローブ又は標的であれ、核酸をラベルするための多くの
方法は、当業界において既知であり、そして本発明の目
的のために適切である。本発明の実施を減じることにお
いて包含される実験作業においては、プローブは、放射
性ラベルされたATPの存在下でポリヌクレオチドキナー
ゼによりプローブを処理することによって放射性リン32
Pにより典型的にはラベルされた。しかしながら、商業
目的のためには、他の非放射性ラベリングシステム、す
なわちホースラディシュペルオキシダーゼ−アビジン−
ビオチンシステムが好ましい。
ラベルシステムが使用される場合、L1コンセンサスプ
ローブがサンプルに存在するDNAを増幅するためにハイ
ブリダイズした決定が行なわれたすぐ後、その増幅され
たDNAはサンプルに存在するHPVタイプを決定するために
型を検出される。本発明の実施は、多くのこれまで特徴
づけされていないHPVタイプの発見を導びいて来た。た
とえば、本発明の方法により試験される３種の臨床サン
プルは、HPVについて公開された配列よりも著しく異な
った配列を有する５種の異なったHPVタイプを含んだ。
これらの新規配列は、タイプ特異的態様でこれらの配列
にハイブリダイズするであろうプローブが存在するの
で、本発明の重要な観点である。これらの新規配列は下
記に示される。劣化ヌクレオチドは上記に定義された通
りであり、そしてその領域を増幅するために使用される
プライマーにおける劣化ヌクレオチド及びそのタイプ内
の変種に対応する。
ローブがサンプルに存在するDNAを増幅するためにハイ
ブリダイズした決定が行なわれたすぐ後、その増幅され
たDNAはサンプルに存在するHPVタイプを決定するために
型を検出される。本発明の実施は、多くのこれまで特徴
づけされていないHPVタイプの発見を導びいて来た。た
とえば、本発明の方法により試験される３種の臨床サン
プルは、HPVについて公開された配列よりも著しく異な
った配列を有する５種の異なったHPVタイプを含んだ。
これらの新規配列は、タイプ特異的態様でこれらの配列
にハイブリダイズするであろうプローブが存在するの
で、本発明の重要な観点である。これらの新規配列は下
記に示される。劣化ヌクレオチドは上記に定義された通
りであり、そしてその領域を増幅するために使用される
プライマーにおける劣化ヌクレオチド及びそのタイプ内
の変種に対応する。
HPV単離体36A,36B,88,238A及び238BのL1増幅された領域
のDNA配列 当業者は、前記配列情報に関して、新規HPV単離体を
増幅し、そして検出するためのプライマー及びプローブ
は容易に得られることを理解するであろう。さらに、こ
れらの配列は、ウィルスを含むサンプルから完全なウィ
ルスの単離を可能にする。単離体238Bは文献に記載され
るHPV 31タイプに対応する。頚部癌単離体C14はHPV 45
の変異体である。これらの新規HPV単離体の発見は、FS1
0,MY18及びMY19と共に使用するための追加のL1コンセン
サスプローブの創造を導びく。これらのL1コンセンサス
プローブは、FS10配列への類似性を示すためにFS10プロ
ーブ配列として下記に示される。L1コンセンサスプロー
ブWD147はHPV 45 DNAにハイブリダイズするであろう。
のDNA配列 当業者は、前記配列情報に関して、新規HPV単離体を
増幅し、そして検出するためのプライマー及びプローブ
は容易に得られることを理解するであろう。さらに、こ
れらの配列は、ウィルスを含むサンプルから完全なウィ
ルスの単離を可能にする。単離体238Bは文献に記載され
るHPV 31タイプに対応する。頚部癌単離体C14はHPV 45
の変異体である。これらの新規HPV単離体の発見は、FS1
0,MY18及びMY19と共に使用するための追加のL1コンセン
サスプローブの創造を導びく。これらのL1コンセンサス
プローブは、FS10配列への類似性を示すためにFS10プロ
ーブ配列として下記に示される。L1コンセンサスプロー
ブWD147はHPV 45 DNAにハイブリダイズするであろう。
FS10 5′ C T G T G G T A G A T A C C A C A C G C A G T A C MY66 − A − − T − − − − − − − − T − − T − −
− − − C − − MY55 − − − − − − − T − − − − − T − − C −
− T − − − − − MY39 − − − − T − − G − − − − − T − − C A − A
− − C − − MY56 − − − − T − − − − − − − − T − − T A −
A − − C − − MY57 − − − − − − − − − − − − − − − −
− − − T − − − − − MY147 − − − − A − − G − − C − − T − − C − − −
− − − − − 上記に示されるように、HPVタイプの変化は、増幅さ
れた配列のほとんどすべて（但し、本発明の方法の増幅
段階に使用されるプライマー対応する部分を除く）を含
む長いコンセンサスプローブの使用を必要とする。この
HPVタイプにおける変化はまた、本発明により供給され
るタイプ特異的プローブのための必要性を示す。
− − − C − − MY55 − − − − − − − T − − − − − T − − C −
− T − − − − − MY39 − − − − T − − G − − − − − T − − C A − A
− − C − − MY56 − − − − T − − − − − − − − T − − T A −
A − − C − − MY57 − − − − − − − − − − − − − − − −
− − − T − − − − − MY147 − − − − A − − G − − C − − T − − C − − −
− − − − − 上記に示されるように、HPVタイプの変化は、増幅さ
れた配列のほとんどすべて（但し、本発明の方法の増幅
段階に使用されるプライマー対応する部分を除く）を含
む長いコンセンサスプローブの使用を必要とする。この
HPVタイプにおける変化はまた、本発明により供給され
るタイプ特異的プローブのための必要性を示す。
本発明は、L1コンセンサスプライマーから生成される
増幅されたDNAの型を検出するための多くのプローブを
供給する。これらのプローブは、下記第５表に示され
る。
増幅されたDNAの型を検出するための多くのプローブを
供給する。これらのプローブは、下記第５表に示され
る。
本発明はまた、コンセンサスプライマー及び生殖器HP
VのE6領域に対して特異的なDNA配列の検出のためのHPV
タイプのプローブを提供する。これらのプローブは、何
人かのHPV−感染された個人において、HPVゲノムは、E6
−及びE7−関連配列のみが存在するように部分的に欠失
され、又は再配列されているので、特に好ましい。本発
明のE6コンセンサスプライマー対は、１つのプライマー
がURR及びE6領域の境界近くの配列に相補的であり、そ
して他のプライマーがE6−E7境界（E6及びE7の読み取り
枠がオーバーラップする）近くのE7領域又はE6領域のい
づれかにおける配列に相補的であるプライマー対を含ん
で成る。これらのE6コンセンサスプライマーは下記第６
表に示される。
VのE6領域に対して特異的なDNA配列の検出のためのHPV
タイプのプローブを提供する。これらのプローブは、何
人かのHPV−感染された個人において、HPVゲノムは、E6
−及びE7−関連配列のみが存在するように部分的に欠失
され、又は再配列されているので、特に好ましい。本発
明のE6コンセンサスプライマー対は、１つのプライマー
がURR及びE6領域の境界近くの配列に相補的であり、そ
して他のプライマーがE6−E7境界（E6及びE7の読み取り
枠がオーバーラップする）近くのE7領域又はE6領域のい
づれかにおける配列に相補的であるプライマー対を含ん
で成る。これらのE6コンセンサスプライマーは下記第６
表に示される。
遺伝子の異なった領域に位置する追加のE6コンセンサ
ス陰性鎖プライマーは、下記に示されるように対で使用
される。３組のプライマー、WD157及びWD160;WD158及び
WD161;及びWD159及びWD162が示され、それぞれは同じゲ
ノムHPV領域に対応するが、しかし長さで異なる。プラ
イマーWD160,WD161,WD162はHPV 18特異性である。
ス陰性鎖プライマーは、下記に示されるように対で使用
される。３組のプライマー、WD157及びWD160;WD158及び
WD161;及びWD159及びWD162が示され、それぞれは同じゲ
ノムHPV領域に対応するが、しかし長さで異なる。プラ
イマーWD160,WD161,WD162はHPV 18特異性である。
当業者は、本発明のE6コンセンサスプライマーがE7 D
NAの部分を含んで成る配列を増幅することを理解するで
あろう。E6コンセンサスプライマーが本発明の方法に使
用される場合、増幅が存在したかどうかを決定するため
には、E6コンセンサスプローブが供給される。E6コンセ
ンサスプローブWD134及びWD135は小さなE6増幅生成物に
向けられ、そして混合物として一緒に使用される。E6コ
ンセンサスプローブはまた、E6コンセンサス陽性鎖プラ
イマーとしても使用され得る。E6コンセンサスプライマ
ーとして使用される場合、E6コンセンサスプローブは次
の組合せで使用される:WD65及びWD64;WD83及びWD64;及
びWD84およびWD64、E6コンセンサスプローブは第７表に
示される。
NAの部分を含んで成る配列を増幅することを理解するで
あろう。E6コンセンサスプライマーが本発明の方法に使
用される場合、増幅が存在したかどうかを決定するため
には、E6コンセンサスプローブが供給される。E6コンセ
ンサスプローブWD134及びWD135は小さなE6増幅生成物に
向けられ、そして混合物として一緒に使用される。E6コ
ンセンサスプローブはまた、E6コンセンサス陽性鎖プラ
イマーとしても使用され得る。E6コンセンサスプライマ
ーとして使用される場合、E6コンセンサスプローブは次
の組合せで使用される:WD65及びWD64;WD83及びWD64;及
びWD84およびWD64、E6コンセンサスプローブは第７表に
示される。
E6コンセンサスプライマーが本発明の方法に使用され
る場合、サンプルに存在するHPVのタイプを決定するた
めには、E6タイプ特異的プローブが供給される。これら
のプローブは第８表に示される。第６表の陽性鎖プライ
マー及びWD70及びWD71又はWD68及びWD69を含んで成るUR
R/E6コンセンサスプライマーを用いれば、第８表又は第
8A表のHPVタイプのプローブのいづれかが有効であろ
う。これらのタイプのプローブはまた、E1陰性鎖プライ
マーがURR/E6陽性鎖コンセンサスプライマーと共に増幅
のために使用される場合、有用である。
る場合、サンプルに存在するHPVのタイプを決定するた
めには、E6タイプ特異的プローブが供給される。これら
のプローブは第８表に示される。第６表の陽性鎖プライ
マー及びWD70及びWD71又はWD68及びWD69を含んで成るUR
R/E6コンセンサスプライマーを用いれば、第８表又は第
8A表のHPVタイプのプローブのいづれかが有効であろ
う。これらのタイプのプローブはまた、E1陰性鎖プライ
マーがURR/E6陽性鎖コンセンサスプライマーと共に増幅
のために使用される場合、有用である。
第8A表のタイプのプローブは、WD76,WD66及びWD154;W
D157及びWD160;WD158及びWD161;WD159及びWD162;WD66及
びWD155;WD66及びWD163;及びWD66及びWD164から選択さ
れた陽性鎖URR/E6コンセンサスプライマーと共に有用で
ある。これらのプライマーは、長さ約250個の塩基対の
小さなE6増幅生成物を生成する。
D157及びWD160;WD158及びWD161;WD159及びWD162;WD66及
びWD155;WD66及びWD163;及びWD66及びWD164から選択さ
れた陽性鎖URR/E6コンセンサスプライマーと共に有用で
ある。これらのプライマーは、長さ約250個の塩基対の
小さなE6増幅生成物を生成する。
本発明はまた、HPV E1領域における配列に対して相補
的であるプライマーを供給する。これらのE1プライマー
は、E1領域の配列のみを増幅するために使用され得、又
はE6,E7,E1からの配列及びこれらの３種の領域の組合せ
からの配列を増幅するためにE6/E7プライマーと共に使
用され得る。これらのE1プライマーは下記第９表に示さ
れる。
的であるプライマーを供給する。これらのE1プライマー
は、E1領域の配列のみを増幅するために使用され得、又
はE6,E7,E1からの配列及びこれらの３種の領域の組合せ
からの配列を増幅するためにE6/E7プライマーと共に使
用され得る。これらのE1プライマーは下記第９表に示さ
れる。
E1プライマーは、本発明の種々の態様に使用され得
る。たとえば、E1領域内の完全な増幅は、次のプライマ
ー対を用いて行なわれ得る：（１）TYP01,TYP02,TPY03
及びTYN07,TYN08;又は（２）TYP04,TYP05,TYP06及びTYN
07,TYN08。TYP03はTYP02及びTYP01の両者に類似し、そ
して増幅から削除され得ることを注目すること。E1領域
はHPV間に高く保存され、そしてサンプルの型の分類はE
1増幅により可能であるが、型の分類は、E1プライマー
が次の通りにE6又はE7プライマーと共に使用される場
合、より一層容易に達成される。たとえば、次のE1及び
E6/E7プライマー対を用いて、だれでもE6/E7領域を増幅
することができる：（１）WD72,WD76及びTYN01,TYN02,T
YN03;（２）WD64,WD65及びTYN01,TYN02,TYN03;（３）WD
72,WD76及びTYN04,TYN05,TYN06;（４）WD64,WD65及びTY
N04,TYN05,TYN06;（５）WD72,WD76及びTYN07,TYN08;及
び（６）WD64,WD65及びTYN07,TYN08。これらの後者の増
幅においては、完全なE7領域が増幅される。従って、こ
れらの増幅生成物は、下記に示されるE7コンセンサスプ
ローブにより検出され得る： 当業者は、本明細書に開示される特定のプライマー及
びプローブは本発明の単なる例示であることを理解す
る。たとえば、本発明のプライマー及びプローブは一本
鎖DNA分子であり、そして標的DNA（サンプルにおけるHP
V DNA）は二本鎖DNAであるので、本発明の有用なプライ
マー及びプローブは、本明細書に特異的に開示されるプ
ライマー及びプローブに相補的なプライマー及びプロー
ブを合成することによって単に構成され得るに過ぎな
い。本発明のプライマー及びプローブはまた、本明細書
に特別に例示されるHPVゲノム以外のHPVゲノムの領域内
で配列変種を増幅し、そして検出するために調製され得
る。
る。たとえば、E1領域内の完全な増幅は、次のプライマ
ー対を用いて行なわれ得る：（１）TYP01,TYP02,TPY03
及びTYN07,TYN08;又は（２）TYP04,TYP05,TYP06及びTYN
07,TYN08。TYP03はTYP02及びTYP01の両者に類似し、そ
して増幅から削除され得ることを注目すること。E1領域
はHPV間に高く保存され、そしてサンプルの型の分類はE
1増幅により可能であるが、型の分類は、E1プライマー
が次の通りにE6又はE7プライマーと共に使用される場
合、より一層容易に達成される。たとえば、次のE1及び
E6/E7プライマー対を用いて、だれでもE6/E7領域を増幅
することができる：（１）WD72,WD76及びTYN01,TYN02,T
YN03;（２）WD64,WD65及びTYN01,TYN02,TYN03;（３）WD
72,WD76及びTYN04,TYN05,TYN06;（４）WD64,WD65及びTY
N04,TYN05,TYN06;（５）WD72,WD76及びTYN07,TYN08;及
び（６）WD64,WD65及びTYN07,TYN08。これらの後者の増
幅においては、完全なE7領域が増幅される。従って、こ
れらの増幅生成物は、下記に示されるE7コンセンサスプ
ローブにより検出され得る： 当業者は、本明細書に開示される特定のプライマー及
びプローブは本発明の単なる例示であることを理解す
る。たとえば、本発明のプライマー及びプローブは一本
鎖DNA分子であり、そして標的DNA（サンプルにおけるHP
V DNA）は二本鎖DNAであるので、本発明の有用なプライ
マー及びプローブは、本明細書に特異的に開示されるプ
ライマー及びプローブに相補的なプライマー及びプロー
ブを合成することによって単に構成され得るに過ぎな
い。本発明のプライマー及びプローブはまた、本明細書
に特別に例示されるHPVゲノム以外のHPVゲノムの領域内
で配列変種を増幅し、そして検出するために調製され得
る。
本発明のプライマーは一般的に長さ18〜21個のヌクレ
オチドのものであり、そしてHPV配列と高い程度の相同
性を有するように企画される。たとえば、本発明の生殖
器HPVコンセンサスプライマーの構成においては、すべ
ての主要な生殖器HPV（HPVタイプ6,11,16,18及び33）と
の高い程度の相同性が必要とされた。増幅されるべき個
々の領域のためには、２つの相同領域が必要とされ、こ
こでは１つは陰性鎖プライマーのためであり、そしても
う１つは陽性鎖プライマーのためである。相同領域を同
定するためには、ウィルスの配列が比較される。相同領
域が同定された後するに、コンセンサスプライマーが企
画される。劣化塩基は、個々のウィルスが相同配列から
順に変化する位置を調節するための企画に使用され得
る。必要なだけ多くの劣化位置が製造され、その結果、
すべてのウィルスの配列はコンセンサスプライマーとの
３個よりも少ないミスマッチを有する。その劣化位置
は、最少数の劣化塩基が可能性ある最大数のウィルスの
配列を調節するように選択される。
オチドのものであり、そしてHPV配列と高い程度の相同
性を有するように企画される。たとえば、本発明の生殖
器HPVコンセンサスプライマーの構成においては、すべ
ての主要な生殖器HPV（HPVタイプ6,11,16,18及び33）と
の高い程度の相同性が必要とされた。増幅されるべき個
々の領域のためには、２つの相同領域が必要とされ、こ
こでは１つは陰性鎖プライマーのためであり、そしても
う１つは陽性鎖プライマーのためである。相同領域を同
定するためには、ウィルスの配列が比較される。相同領
域が同定された後するに、コンセンサスプライマーが企
画される。劣化塩基は、個々のウィルスが相同配列から
順に変化する位置を調節するための企画に使用され得
る。必要なだけ多くの劣化位置が製造され、その結果、
すべてのウィルスの配列はコンセンサスプライマーとの
３個よりも少ないミスマッチを有する。その劣化位置
は、最少数の劣化塩基が可能性ある最大数のウィルスの
配列を調節するように選択される。
特定のウィルスの配列がコンセンサス配列との多数の
ミスマッチを有する場合、タイプ特異的プライマーがそ
のウィルスのために製造される。タイプ特異的プライマ
ーは、コンセンサスプライマーを製造するために他のウ
ィルスのために企画された劣化プライマーと混合され
る。プライマーにおける劣化位置により調節されないい
づれかのミスマッチは、そのプライマーの３′末端から
３個以上の塩基を一般的に配置されるべきである。同様
に、いづれかの劣化位置は、プライマーの３′末端から
３個以上の塩基を配置されるべきである。
ミスマッチを有する場合、タイプ特異的プライマーがそ
のウィルスのために製造される。タイプ特異的プライマ
ーは、コンセンサスプライマーを製造するために他のウ
ィルスのために企画された劣化プライマーと混合され
る。プライマーにおける劣化位置により調節されないい
づれかのミスマッチは、そのプライマーの３′末端から
３個以上の塩基を一般的に配置されるべきである。同様
に、いづれかの劣化位置は、プライマーの３′末端から
３個以上の塩基を配置されるべきである。
劣化プライマーのための評価された最小及び最大Ｔms
は、54〜64℃の間であるべきである。Ｔmsは非実験的な
公式により評価され：個々のＧ又はＣはＴmに４℃寄与
し；個々のＡ又はＴmに２℃寄与し；そしてＴmは計算さ
れた値の合計である。最後に、プライマーはパリンドロ
ーム又は反復配列を補うように企画されるべきでない。
は、54〜64℃の間であるべきである。Ｔmsは非実験的な
公式により評価され：個々のＧ又はＣはＴmに４℃寄与
し；個々のＡ又はＴmに２℃寄与し；そしてＴmは計算さ
れた値の合計である。最後に、プライマーはパリンドロ
ーム又は反復配列を補うように企画されるべきでない。
コンセンサスプローブ企画はコンセンサスプライマー
企画に類似するが、但し、コンセンサスプローブは一般
的にコンセンサスプライマーほど多くのミスマッチを含
まない。結果として、プローブのためのＴmは、プライ
マーのためのＴmよりも高い。しかしながら、ミスマッ
チ又は劣化位置が３′末端で生じることは、それがコン
センサスプライマーのために存在するほどコンセンサス
プローブのためには臨界ではない。
企画に類似するが、但し、コンセンサスプローブは一般
的にコンセンサスプライマーほど多くのミスマッチを含
まない。結果として、プローブのためのＴmは、プライ
マーのためのＴmよりも高い。しかしながら、ミスマッ
チ又は劣化位置が３′末端で生じることは、それがコン
センサスプライマーのために存在するほどコンセンサス
プローブのためには臨界ではない。
タイプ特異的プローブは、与えられたプローブがその
プローブにより認識されるHPVタイプとは異なるHPVタイ
プからの配列と75％以下の相同性を一般的に有するであ
ろうように企画される。そのタイプ特異的プローブは長
さ18〜20個のヌクレオチドのものであり、そして58〜64
℃の範囲での推定Ｔmsを有する。
プローブにより認識されるHPVタイプとは異なるHPVタイ
プからの配列と75％以下の相同性を一般的に有するであ
ろうように企画される。そのタイプ特異的プローブは長
さ18〜20個のヌクレオチドのものであり、そして58〜64
℃の範囲での推定Ｔmsを有する。
当業者はまた、本発明の方法は種々の手段により行な
われ得ることを本発明の開示から認識するであろう。本
発明の方法は、いづれかヒト乳頭腫ウィルスに適用で
き、そして特に生殖器HPVを検出し、そしてその型を検
出するために好ましい。その方法は特定のHPVタイプ内
で単離体から単離体の変種を検出するために使用され
得、そしてまた、患者に存在するHPVにおける有意な変
化をスクリーンするためにも使用され得る。本発明の１
つの態様において、HPVゲノムのいづれかの部分が欠失
されている場合、他の領域もまた欠失され得ることを確
保する、HPV DNAの１以上の領域に対するコンセンサス
プライマーが使用されるであろう。類似する態様におい
て、増幅されたDNAの型の分類は、その増幅されたDNAの
種々の領域を認識する種々のタイプ特異的プローブを用
いて行なわれ得る。
われ得ることを本発明の開示から認識するであろう。本
発明の方法は、いづれかヒト乳頭腫ウィルスに適用で
き、そして特に生殖器HPVを検出し、そしてその型を検
出するために好ましい。その方法は特定のHPVタイプ内
で単離体から単離体の変種を検出するために使用され
得、そしてまた、患者に存在するHPVにおける有意な変
化をスクリーンするためにも使用され得る。本発明の１
つの態様において、HPVゲノムのいづれかの部分が欠失
されている場合、他の領域もまた欠失され得ることを確
保する、HPV DNAの１以上の領域に対するコンセンサス
プライマーが使用されるであろう。類似する態様におい
て、増幅されたDNAの型の分類は、その増幅されたDNAの
種々の領域を認識する種々のタイプ特異的プローブを用
いて行なわれ得る。
当業者は、本発明がサンプル存在するHPV mRNAを検出
するためにもまた使用され得ることを認識するであろ
う。あるHPV mRNA種、特にE6及びE7 mRNAの発現は、HPV
感染が癌に進行するであろう傾向の表示であることがで
きる。本発明の方法によりHPV mRNAを検出するために
は、mRNAは、cDNA分子を合成するために適切な反応混合
物において逆転写酵素により処理され得る。逆転写反応
に使用されるプライマーは本発明のコンセンサスプライ
マーであることができ、又はmRNAの３′末端近くでハイ
ブリダイズする異なったオリゴヌクレオチドであること
ができる。次に、このcDNAのコピーが二本鎖DNA分子中
に生成され、そしてこれが本発明の方法に従って検出さ
れ、そして型の分類を行なわれ得る。
するためにもまた使用され得ることを認識するであろ
う。あるHPV mRNA種、特にE6及びE7 mRNAの発現は、HPV
感染が癌に進行するであろう傾向の表示であることがで
きる。本発明の方法によりHPV mRNAを検出するために
は、mRNAは、cDNA分子を合成するために適切な反応混合
物において逆転写酵素により処理され得る。逆転写反応
に使用されるプライマーは本発明のコンセンサスプライ
マーであることができ、又はmRNAの３′末端近くでハイ
ブリダイズする異なったオリゴヌクレオチドであること
ができる。次に、このcDNAのコピーが二本鎖DNA分子中
に生成され、そしてこれが本発明の方法に従って検出さ
れ、そして型の分類を行なわれ得る。
本発明のコンセンサスプライマーはまた、ごれまで特
徴化されていないHPVタイプを検出するためにも使用さ
れ得る。たとえば、上記第４表に示されたHPV単離体36
及び88はこれまで決して特徴づけられたことはなかっ
た。従って、本発明のコンセンサスプライマーは、これ
まで未知のHPVタイプのDNA配列を増幅するために使用さ
れ得る。次に、その増幅されたDNAは配列決定され、そ
してその配列データは本発明の方法に使用するためのタ
イプ特異的プローブを生成するために使用され得る。
徴化されていないHPVタイプを検出するためにも使用さ
れ得る。たとえば、上記第４表に示されたHPV単離体36
及び88はこれまで決して特徴づけられたことはなかっ
た。従って、本発明のコンセンサスプライマーは、これ
まで未知のHPVタイプのDNA配列を増幅するために使用さ
れ得る。次に、その増幅されたDNAは配列決定され、そ
してその配列データは本発明の方法に使用するためのタ
イプ特異的プローブを生成するために使用され得る。
下記に与えられる例は本発明を単に例示するに過ぎ
ず、そして請求の範囲を限定するものではない。
ず、そして請求の範囲を限定するものではない。
例１ ポリメラーゼ鎖反応による増幅のための臨床サンプルの
調製 頚部及び外陰部のスワブ及び陰茎の切屑は典型的には
103〜105個の細胞を含む。細胞をリン酸緩衝溶液2mlに
懸濁し、遠心分離によりペレット化し、そして上清液を
すてた。細胞懸濁液が試験の前、ある期間貯蔵される場
合、抗生物質がその懸濁液に一般的に添加された（市販
の抗生物質、たとえば２×Fungi Bact Solutionがこの
目的のために適切である）。細胞数を評価し、そして血
液がサンプルに存在する場合、細胞をTE緩衝液（10mMの
トリス−HCl、pH7.5及び1mMのEDTA）1mlに懸濁し、赤血
球細胞を溶解し、そして次に再ペレット化した。約102
〜104個の細胞をPCR反応当たりに使用した。細胞をまず
初めに、50mMのトリス、pH8.5:1mMのEDTA;1％のLaureth
−12;及び200μg/mlのプロテイナーゼＫを含む緩衝液10
0μに懸濁した。この混合物を55℃で約１時間インキ
ュベートし、そして次にプロテイナーゼＫを、95℃で10
分間、前記混合物をインキュベートすることによって熱
不活性化した。次に、そのサンフルを、標準のPCR法に
従って、本発明のコンセンサスプライマーにより処理
し、存在するいづれかのHPV配列を増幅した。102〜104
個の細胞を含むアリコートを、PCR反応混合物100μ当
たりに使用した。
調製 頚部及び外陰部のスワブ及び陰茎の切屑は典型的には
103〜105個の細胞を含む。細胞をリン酸緩衝溶液2mlに
懸濁し、遠心分離によりペレット化し、そして上清液を
すてた。細胞懸濁液が試験の前、ある期間貯蔵される場
合、抗生物質がその懸濁液に一般的に添加された（市販
の抗生物質、たとえば２×Fungi Bact Solutionがこの
目的のために適切である）。細胞数を評価し、そして血
液がサンプルに存在する場合、細胞をTE緩衝液（10mMの
トリス−HCl、pH7.5及び1mMのEDTA）1mlに懸濁し、赤血
球細胞を溶解し、そして次に再ペレット化した。約102
〜104個の細胞をPCR反応当たりに使用した。細胞をまず
初めに、50mMのトリス、pH8.5:1mMのEDTA;1％のLaureth
−12;及び200μg/mlのプロテイナーゼＫを含む緩衝液10
0μに懸濁した。この混合物を55℃で約１時間インキ
ュベートし、そして次にプロテイナーゼＫを、95℃で10
分間、前記混合物をインキュベートすることによって熱
不活性化した。次に、そのサンフルを、標準のPCR法に
従って、本発明のコンセンサスプライマーにより処理
し、存在するいづれかのHPV配列を増幅した。102〜104
個の細胞を含むアリコートを、PCR反応混合物100μ当
たりに使用した。
PCRのための細胞懸濁液を調製するためのもう１つの
方法は、脱イオン水10μに細胞を懸濁し、そしてその
得られた懸濁液を100℃で10〜15分間インキュベートす
ることを包含する。
方法は、脱イオン水10μに細胞を懸濁し、そしてその
得られた懸濁液を100℃で10〜15分間インキュベートす
ることを包含する。
例２ パラフィンから組織の抽出 本発明の方法はしばしば、パラフィンにおける組織切
片がHPVを含むかどうかを決定するために使用されるで
あろう。本発明に使用するために、典型的には５〜10μ
Ｍの幅の組織切片を調製するためには、次の方法が使用
された。
片がHPVを含むかどうかを決定するために使用されるで
あろう。本発明に使用するために、典型的には５〜10μ
Ｍの幅の組織切片を調製するためには、次の方法が使用
された。
組織切片をキシレン又はアルカン、たとえばオクタン
1mlにより２度抽出し、パラフィンを除去した。個々の
抽出は約30分間行なわれた。次に組織切片を100％エタ
ノールにより２度すすぎ、抽出剤を除去し、そして回転
蒸発器により乾燥せしめた。次に切片を、界面活性剤及
びプロテイナーゼＫを含むＴaq緩衝液に懸濁し、そして
例１に記載しているようにして処理した。但し、55℃で
のインキュベーションが２〜４時間行なわれた。
1mlにより２度抽出し、パラフィンを除去した。個々の
抽出は約30分間行なわれた。次に組織切片を100％エタ
ノールにより２度すすぎ、抽出剤を除去し、そして回転
蒸発器により乾燥せしめた。次に切片を、界面活性剤及
びプロテイナーゼＫを含むＴaq緩衝液に懸濁し、そして
例１に記載しているようにして処理した。但し、55℃で
のインキュベーションが２〜４時間行なわれた。
プロテイナーゼＫの熱不活性化の後、懸濁液を遠心分
離し、残骸をペレット化し、そして上清液約１〜20μ
を個々のPCR反応のために使用した。
離し、残骸をペレット化し、そして上清液約１〜20μ
を個々のPCR反応のために使用した。
例３ PCR法 すべてのPCR法を、Perkin−Elmer/Cetus Instruments
Thermal Cycler装置を用いて行なった。典型的な反応
混合物は、50ピコモルのコンセンサス陽性鎖プライマ
ー;50ピコモルのコンセンサス陰性鎖プライマー;2.5単
位のＴaqポリメラーゼ;10μの10×PCR緩衝液（0.5Mの
KCl;100mMのトリス、pH＝8.5;20〜40mMのMgCl2;0.2mMの
個々のdNTP;約10μの臨床的又はパラフィンサンプ
ル；及び脱イオン水100μまで）を含んだ。
Thermal Cycler装置を用いて行なった。典型的な反応
混合物は、50ピコモルのコンセンサス陽性鎖プライマ
ー;50ピコモルのコンセンサス陰性鎖プライマー;2.5単
位のＴaqポリメラーゼ;10μの10×PCR緩衝液（0.5Mの
KCl;100mMのトリス、pH＝8.5;20〜40mMのMgCl2;0.2mMの
個々のdNTP;約10μの臨床的又はパラフィンサンプ
ル；及び脱イオン水100μまで）を含んだ。
臨床的サンプルと共に使用するためのPCR反応時間は
次の通りであった。機械を、サンプルを機械に配置する
前、72℃に加熱した。次にその機械を、次の温度変化を
実施するようにプログラムした:95℃で30秒、55℃で30
秒及び72℃で60秒の30サイクル;72℃で５分間；そして1
5℃で維持される。
次の通りであった。機械を、サンプルを機械に配置する
前、72℃に加熱した。次にその機械を、次の温度変化を
実施するようにプログラムした:95℃で30秒、55℃で30
秒及び72℃で60秒の30サイクル;72℃で５分間；そして1
5℃で維持される。
パラフィン切片のためには、機械は次の通りに温度変
化を実施するようにプログラムされた:95℃で50秒、55
℃で50秒及び72℃で２分間の40サイクル;72℃で５分
間；及び15℃で維持される。
化を実施するようにプログラムされた:95℃で50秒、55
℃で50秒及び72℃で２分間の40サイクル;72℃で５分
間；及び15℃で維持される。
PCR生成物が600bpよりも長いことが予測される場合、
機械は次の通りに温度変化を行なうようにプログラムさ
れた:72℃で１分;95℃への50秒間のランプ;95℃で20
秒、55℃への90秒間のランプ、55℃で30秒、72℃への50
秒間のランプ及び72℃で３分の40サイクル;72℃で５
分；及び15℃で維持された。
機械は次の通りに温度変化を行なうようにプログラムさ
れた:72℃で１分;95℃への50秒間のランプ;95℃で20
秒、55℃への90秒間のランプ、55℃で30秒、72℃への50
秒間のランプ及び72℃で３分の40サイクル;72℃で５
分；及び15℃で維持された。
増幅が生じたかどうかをコンセンサスプローブの使用
により決定するためには、約10μの反応混合物が、14
0μの脱イオン水及び50μの４×変性溶液（1.6MのN
aOH及び100mMのEDTA）に添加された。この変性された溶
液約100μを、BioRadドット−ブロット装置を用いて
正に荷電されたナイロンGenetrans膜上にスポットを付
けた。得られたドットを200μの20×SSCにより１度す
すいだ。次に、その膜をブロッターから除き、空気乾燥
せしめ、そして紫外線に照射し（光に直面するDNAを有
する）、膜にDNAを共有結合せしめた。
により決定するためには、約10μの反応混合物が、14
0μの脱イオン水及び50μの４×変性溶液（1.6MのN
aOH及び100mMのEDTA）に添加された。この変性された溶
液約100μを、BioRadドット−ブロット装置を用いて
正に荷電されたナイロンGenetrans膜上にスポットを付
けた。得られたドットを200μの20×SSCにより１度す
すいだ。次に、その膜をブロッターから除き、空気乾燥
せしめ、そして紫外線に照射し（光に直面するDNAを有
する）、膜にDNAを共有結合せしめた。
前記膜を、水槽中において68℃で少なくとも45分間、
プレ−ハイブリダイズせしめ。そのプレ−ハイブリダイ
ゼーション溶液は、６×SSC、×Denhard溶液及び0.5％
のSDSを含んだ。他方では、膜をプレ−ハイブリダイゼ
ーション溶液により単にすすぐことができる。プレ−ハ
イブリダイゼーション溶液をデカントした。約10mlのプ
レ−ハイブリダイゼーション溶液を、10mg/mlの変性さ
れたサケ精子DNA100μ及びコンセンサスプローブ1ml
当たり約１×106個のCherenkov計数（0.2ピコモル）に
添加した。この溶液を膜の裏に添加し、そしてコンセン
サスプローブを55℃で少なくとも１時間ハイブリダイズ
せしめた。ハイブリダイゼーションの後、そのハイブリ
ダイゼーション混合物をデカントし、そして膜を30〜55
℃の洗浄溶液によりすばやくすすぎ、過剰のプローブを
除いた。前記洗浄溶液は２×SSC及び0.1％のSDSから成
った。次に膜を、55℃に加熱された新しい洗浄溶液によ
り洗浄した。この洗浄段階のためには、膜は加熱された
洗浄溶液を含むトレーに置かれ、そしてそのトレは55℃
の水槽に10分間置いた。この洗浄工程を１度くり返し、
そして膜を55〜60℃に加熱された２×SSC及び0.1％SDS
の溶液によりすすいだ。他の洗浄方法は同じ工程を包含
するが、しかし異なった温度での洗浄溶液、すなわち55
℃での洗浄溶液が初めの２回の洗浄で使用され、そして
最終のすすぎでは、室温洗浄溶液が使用された。次に膜
は空気乾燥せしめられ、そしてＸ−線への７〜48時間の
照射をされた。
プレ−ハイブリダイズせしめ。そのプレ−ハイブリダイ
ゼーション溶液は、６×SSC、×Denhard溶液及び0.5％
のSDSを含んだ。他方では、膜をプレ−ハイブリダイゼ
ーション溶液により単にすすぐことができる。プレ−ハ
イブリダイゼーション溶液をデカントした。約10mlのプ
レ−ハイブリダイゼーション溶液を、10mg/mlの変性さ
れたサケ精子DNA100μ及びコンセンサスプローブ1ml
当たり約１×106個のCherenkov計数（0.2ピコモル）に
添加した。この溶液を膜の裏に添加し、そしてコンセン
サスプローブを55℃で少なくとも１時間ハイブリダイズ
せしめた。ハイブリダイゼーションの後、そのハイブリ
ダイゼーション混合物をデカントし、そして膜を30〜55
℃の洗浄溶液によりすばやくすすぎ、過剰のプローブを
除いた。前記洗浄溶液は２×SSC及び0.1％のSDSから成
った。次に膜を、55℃に加熱された新しい洗浄溶液によ
り洗浄した。この洗浄段階のためには、膜は加熱された
洗浄溶液を含むトレーに置かれ、そしてそのトレは55℃
の水槽に10分間置いた。この洗浄工程を１度くり返し、
そして膜を55〜60℃に加熱された２×SSC及び0.1％SDS
の溶液によりすすいだ。他の洗浄方法は同じ工程を包含
するが、しかし異なった温度での洗浄溶液、すなわち55
℃での洗浄溶液が初めの２回の洗浄で使用され、そして
最終のすすぎでは、室温洗浄溶液が使用された。次に膜
は空気乾燥せしめられ、そしてＸ−線への７〜48時間の
照射をされた。
増幅されたDNAのHPVタイプを決定するためには、PCR
反応混合物を、上記のようにしてタイプ特異的プローブ
にハイブリダイズした。その方法において唯一の有意な
差異は、フィルターの最終洗浄が特定のタイプ特異的プ
ローブのＴmにひじょうに近い温度で行なわれることで
あった。異なったタイプ特異的プローブにハイブリダイ
ズされたフィルターは一緒に洗浄されなかった。
反応混合物を、上記のようにしてタイプ特異的プローブ
にハイブリダイズした。その方法において唯一の有意な
差異は、フィルターの最終洗浄が特定のタイプ特異的プ
ローブのＴmにひじょうに近い温度で行なわれることで
あった。異なったタイプ特異的プローブにハイブリダイ
ズされたフィルターは一緒に洗浄されなかった。
分子生物学、医学的な診断技法、生化学、ウィルス
学、遺伝学及び関連する学問の分野の当業者に明らかで
ある上記本発明の態様の１つの変法は、請求の範囲内に
ある。
学、遺伝学及び関連する学問の分野の当業者に明らかで
ある上記本発明の態様の１つの変法は、請求の範囲内に
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ティン，イ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94709，バークレー，オクスフォード ストリート 1436 (72)発明者 ブローカー，トーマス アール. アメリカ合衆国，ニューヨーク 14618, ロチェスター，ノース カントリー ク ラブ ドライブ 20 (72)発明者 ウォリンスキ，スティーブン エム. アメリカ合衆国，イリノイ 60611，シ カゴ，イースト シカゴ アベニュ 215
Claims (32)
- 【請求項１】存在する場合、サンプル中のヒト乳頭腫ウ
イルス（HPV）を検出し、そしてそのHPVのタイプを分類
するための方法であって： （ａ）HPVが存在する場合コンセンサスプライマーの延
長生成物が合成され得るような条件下でコンセンサスHP
Vプライマー、重合剤及びデオキシヌクレオシド５′−
トリホスフェートによりサンプルを処理し、ここで前記
コンセンサスプライマーは、一対のプライマーの１つの
メンバーから合成された延長生成物が、その相補鎖から
分離された場合に前記対の他のメンバーの延長生成物の
合成のための鋳型として作用することができるように、
HPV DNAの個々の鎖にハイブリダイズするために十分な
程相補的な少なくとも１対のプライマーを含んで成るオ
リゴヌクレオチドの混合物であり； （ｂ）もし存在するなら、その上で延長生成物が合成さ
れる鋳型からプライマー延長生成物を分離して一本鎖分
子を形成せしめ； （ｃ）もし存在するなら、段階（ｂ）で生成された一本
鎖分子のそれぞれを鋳型として使用してプライマー延長
生成物が合成される条件下で、段階（ｂ）において生成
した一本鎖分子を段階（ａ）のコンセンサスプライマー
により処理し； （ｄ）段階（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも度くり返し； （ｅ）増幅が生じたかどうかを決定し；そして増幅が生
じた場合、 （ｆ）前記増幅されたDNAにタイプ特異的DNAプローブを
ハイブリダイズせしめ；そして （ｇ）ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを決定
する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】前記HPVが生殖器HPVである請求の範囲第１
項記載の方法。 - 【請求項３】前記段階（ｅ）が、ハイブリダイゼーショ
ン条件下で段階（ｄ）において調製された反応混合物を
コンセンサスプローブにより処理し、そしてハイブリダ
イゼーションが生じたかどうかを決定することを含んで
成る請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】前記コンセンサスプライマーが前記生殖器
HPVの転写調節領域の配列を増幅することができる請求
の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項５】前記コンセンサスプライマーが前記生殖器
HPVのL1読み取り枠配列を増幅することができる請求の
範囲第２項記載の方法。 - 【請求項６】前記コンセンサスプライマーが前記生殖器
HPVのE6読み取り枠配列を増幅することができる請求の
範囲第２項記載の方法。 - 【請求項７】前記コンセンサスプライマーが前記生殖器
HPVのE1読み取り枠配列を増幅することができる請求の
範囲第２項記載の方法。 - 【請求項８】前記コンセンサスプライマーが前記生殖器
HPVのE7読み取り枠配列を増幅することができる請求の
範囲第２項記載の方法。 - 【請求項９】前記コンセンサスプライマーが前記生殖器
HPVのE1,E6及びE7読み取り枠配列を増幅することができ
る請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項１０】前記タイプ特異的プローブが前記生殖器
HPVの転写調節領域の配列にハイブリダイズすることが
できる請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項１１】前記タイプ特異的プローブが前記生殖器
HPVのL1読み取り枠配列にハイブリダイズすることがで
きる請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項１２】前記タイプ特異的プローブが前記生殖器
HPVのE6及びE7配列から成る群から選択されたE6読み取
り枠配列にハイブリダイズすることができる請求の範囲
第２項記載の方法。 - 【請求項１３】前記コンセンサスプローブが前記生殖器
HPVの転写調節領域の配列にハイブリダイズすることが
できる請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項１４】前記コンセンサスプローブが前記生殖器
HPVのL1読み取り枠配列にハイブリダイズすることがで
きる請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項１５】前記コンセンサスプローブが前記生殖器
HPVのE6読み取り枠配列にハイブリダイズすることがで
きる請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項１６】前記コンセンサスプローブが前記生殖器
HPVのE1読み取り枠配列にハイブリダイズすることがで
きる請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項１７】前記コンセンサスプローブが前記生殖器
HPVのE7読み取り枠配列にハイブリダイズすることがで
きる請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項１８】前記生殖器HPVの完全なURR領域の配列が
増幅される請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項１９】前記プライマーがFS10,JS15,JS16,FS17
及びMY01から成る群から選択される請求の範囲第４項記
載の方法。 - 【請求項２０】前記プライマーがMY11及びMY09である請
求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項２１】前記プライマーがWD64,WD65,WD66,WD67,
WD68,WD69,WD70,WD71,WD72,WD73,WD76,WD77,WD83,WD84,
WD154,WD155,WD157,WD158,WD159,WD160,WD161,WD162,WD
163、及びWD164から成る群から選択される請求の範囲第
６項記載の方法。 - 【請求項２２】前記プライマーがTYN01,TYN02,TYN03,TY
N04,TYN05,TYN06,TYN07,TYN08,TYP01,TYP02,TYP03,TYP0
4,TYP05、及びTYP06から成る群から選択される請求の範
囲第７項記載の方法。 - 【請求項２３】前記生殖器HPVの完全なE7領域の配列が
増幅される請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項２４】前記プローブがMY12,MY13,MY14,MY16,MY
58,MY59,MY60,MY61,MY62,MY63,MY64,MY65,MY69,MY70,WD
74,WD126,WD127,WD128,WD150,WD151,WD152、及びWD153
から成る群から選択される請求の範囲第11項記載の方
法。 - 【請求項２５】前記プローブがWD78,WD79,WD80,WD81,WD
82,WD102,WD103,WD104,WD132,WD133,WD134,WD165,WD16
6,WD167,WD168、及びWD169から成る群から選択される請
求の範囲第12項記載の方法。 - 【請求項２６】前記プライマーが少なくとも１つのE1プ
ライマー及び少なくとも１つのE6プライマーを含んで成
る請求の範囲第13項記載の方法。 - 【請求項２７】前記コンセンサスプローブがFS10,MY18,
MY19,MY39,MY55,MY56,MY57,MY66,MYXX、及びWD147から
成る群から選択されたプローブを含んで成る請求の範囲
第14項記載の方法。 - 【請求項２８】前記コンセンサスプローブがWD64,WD65,
WD83及びWD84から成る群から選択されたプローブを含ん
で成る請求の範囲第15項記載の方法。 - 【請求項２９】前記コンセンサスプローブがTYP09及びT
YP12から成る群から選択されたプローブを含んで成る請
求の範囲第17項記載の方法。 - 【請求項３０】サンプル中のヒト乳頭腫ウイルス（HP
V）を検出し、そしてそのHPVの型を分類するための試薬
であって、少なくとも１対のコンセンサスHPVプライマ
ー及び少なくとも１つのHPVタイプ特異的DNAプローブを
含んで成り、該コンセンサスプライマーは、１対のプラ
イマーの１つのメンバーから合成された延長生成物が、
その相補鎖から分離された場合に前記対の他のメンバー
の延長生成物の合成のための鋳型として作用することが
できるように、HPV DNAの個々の鎖にハイブリダイズす
るために十分な程該鎖に対して相補的な少なくとも１対
のプライマーを含んで成るオリゴヌクレオチドの混合物
であることを特徴とする試薬。 - 【請求項３１】前記プライマーがMY11及びMY09である、
請求の範囲第30項に記載の試薬。 - 【請求項３２】前記HPV型特異的DNAプローブが、FS10,J
S15,JS16,FS17,MY01,MY11,MY09,WD64,WD65,WD66,WD67,W
D68,WD69,WD70,WD71,WD72,WD73,WD76,WD77,WD83,WD84,W
D154,WD155,WD157,WD158,WD159,WD160,WD161,WD162,WD1
63,WD164,TYN01,TYN02,TYN03,TYN04,TYN05,TYN06,TYN0
7,TYN08,TYP01,TYP02,TYP03,TYP04,TYP05,TYP06,MY12,M
Y13,MY14,MY16,MY58,MY59,MY60,MY61,MY62,MY63,MY64,M
Y65,MY69,MY70,WD74,WD126,WD127,WD128,WD150,WD151,W
D152,WD153,WD78,WD79,WD80,WD81,WD82,WD102,WD103,WD
104,WD132,WD133,WD134,WD165,WD166,WD167,WD168,WD16
9,MY18,MY19,MY39,MY55,MY56,MY57,MY66,MYXX,WD147,WD
64,WD65,WD83,WD84,YTP09、及びTYP12から成る群から選
択される、請求の範囲第30項又は第31項に記載の試薬。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24348688A | 1988-09-09 | 1988-09-09 | |
| US243486 | 1989-03-10 | ||
| US07/322,550 US5182377A (en) | 1988-09-09 | 1989-03-10 | Probes for detection of human papillomavirus |
| US322550 | 1989-03-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04500910A JPH04500910A (ja) | 1992-02-20 |
| JP2651483B2 true JP2651483B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=26935890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1510640A Expired - Lifetime JP2651483B2 (ja) | 1988-09-09 | 1989-08-29 | ポリメラーゼ連鎖反応によるヒト乳頭腫ウイルスの検出 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5182377A (ja) |
| EP (1) | EP0433396B1 (ja) |
| JP (1) | JP2651483B2 (ja) |
| AT (1) | ATE138108T1 (ja) |
| AU (1) | AU645483B2 (ja) |
| CA (1) | CA1339262C (ja) |
| DE (1) | DE68926507T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990002821A1 (ja) |
Families Citing this family (89)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1276575C (fr) * | 1984-11-30 | 1990-11-20 | Sylvie Beaudenon | Sondes a papillomavirus et procede de diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus |
| US5876922A (en) * | 1985-07-31 | 1999-03-02 | Institute Pasteur | Papillomavirus probe and a process for in vitro diagnosis of papillomavirus infections |
| KR930007580B1 (ko) | 1986-03-21 | 1993-08-13 | 엥스띠뛰 빠스뙤르 | 유두종 비루스 게놈으로부터 유도된 결정 dna 서열, 그의 시험관내 진단 목적용 용도 및 항원 조성물의 제조 방법 |
| FR2632956B2 (fr) * | 1988-05-13 | 1991-07-12 | Pasteur Institut | Sondes a papillomavirus hpv49, hpv50, hpv54, hpv55; produits genetiquement et immunologiquement lies a ce papillomavirus hpv49, hpv50, hpv54, hpv55; procede de diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus et d'immunisation in vivo contre ces papillomavirus |
| US5447839A (en) * | 1988-09-09 | 1995-09-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction |
| US5639871A (en) * | 1988-09-09 | 1997-06-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction |
| DE3838269A1 (de) * | 1988-11-11 | 1990-05-17 | Behringwerke Ag | Nachweis humaner papillomavirus dna und ihrer expression in zervix-abstrichen |
| US5106727A (en) * | 1989-04-27 | 1992-04-21 | Life Technologies, Inc. | Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequences as primers |
| US5043272A (en) * | 1989-04-27 | 1991-08-27 | Life Technologies, Incorporated | Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers |
| JP2791685B2 (ja) * | 1989-06-08 | 1998-08-27 | 寳酒造株式会社 | パピローマウイルスの検出方法 |
| US5863717A (en) * | 1989-11-03 | 1999-01-26 | Abbott Laboratories | Use of conserved oligonucleotide primers to amplify human papillomavirus DNA sequences |
| EP0662518B1 (en) * | 1989-12-01 | 2001-11-07 | VYSIS, Inc. | Nucleic acid probes for detection of HPV transcripts |
| US5580970A (en) * | 1989-12-01 | 1996-12-03 | Amoco Corporation | Detection of HPV transcripts |
| US5811232A (en) * | 1989-12-04 | 1998-09-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for Papillomavirus |
| NL9000134A (nl) * | 1990-01-19 | 1991-08-16 | Stichting Res Fonds Pathologie | Primers en werkwijze voor het detecteren van humaan papilloma virus genotypen m.b.v. pcr. |
| GB9015845D0 (en) * | 1990-07-19 | 1990-09-05 | Emery Vincent C | Diagnostic method |
| CA2052413C (en) * | 1990-09-28 | 2004-07-13 | Jeffrey L. Joseph | Nucleotides sequences useful as type-specific probes, pcr primers and lcr probes for the amplifications and detection of human papilloma virus, and related kits and methods |
| US5484699A (en) * | 1990-09-28 | 1996-01-16 | Abbott Laboratories | Nucleotide sequences useful as type specific probes, PCR primers and LCR probes for the amplification and detection of human papilloma virus, and related kits and methods |
| IT1244462B (it) * | 1990-12-06 | 1994-07-15 | Sclavo Spa | Oligonucleotidi sintetici utili per la diagnosi di infezione da tipi diversi di virus del gruppo papilloma e loro utilizzazione |
| US5538869A (en) * | 1990-12-13 | 1996-07-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | In-situ hybridization probes for identification and banding of specific human chromosomes and regions |
| FR2670797A1 (fr) * | 1990-12-20 | 1992-06-26 | Pasteur Institut | Sequences d'adn determinees derivees du genome du papillomavirus hpv39, application de ces sequences au diagnostic in vitro d'infection par ce papillomavirus, et a la production de composition immunogene. |
| IL97226A0 (en) * | 1991-02-13 | 1992-05-25 | Orgenics Ltd | Detection of high and low risk human papillomavirus by enzymatic amplification of dna |
| EP0511750A1 (en) * | 1991-04-09 | 1992-11-04 | The Regents Of The University Of California | Repeat sequence chromosome specific nucleic acid probes |
| US5427932A (en) * | 1991-04-09 | 1995-06-27 | Reagents Of The University Of California | Repeat sequence chromosome specific nucleic acid probes and methods of preparing and using |
| US5283175A (en) * | 1991-04-15 | 1994-02-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Genus-specific oligomers of Borrelia and methods of using same |
| FR2679254B1 (fr) * | 1991-07-17 | 1993-11-19 | Clonatec | Sondes oligonucleotidiques pour le typage et la detection des papillomavirus humains. |
| US5346811A (en) * | 1991-07-22 | 1994-09-13 | Cerveceria Polar | Method and products for human papillomavirus detection |
| ES2092056T3 (es) * | 1991-09-23 | 1996-11-16 | Pfizer | Procedimiento para detectar arnm y adn especificos en celulas. |
| US5589333A (en) * | 1992-02-03 | 1996-12-31 | Thomas Jefferson University | In situ polymerase chain reaction |
| US5859230A (en) * | 1992-07-30 | 1999-01-12 | Genelabs Technologies, Inc. | Non-A/non-B/non-C/non-D/non-E hepatitis agents and molecular cloning thereof |
| AU6776994A (en) * | 1993-05-06 | 1994-12-12 | Abbott Laboratories | Direct lysis buffer and the detection of hiv-1 plasma viremia |
| AU685233B2 (en) * | 1994-02-21 | 1998-01-15 | Stichting Researchfonds Pathologie | Human papilloma virus detection in a nucleic acid amplification process using general primers |
| DE4420732A1 (de) * | 1994-06-15 | 1995-12-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Vorrichtung zur Behandlung von Nukleinsäuren aus einer Probe |
| US5702886A (en) * | 1994-10-05 | 1997-12-30 | The Johns Hopkins University | Chromosome I8Q loss and prognosis in colorectal cancer |
| US5935825A (en) * | 1994-11-18 | 1999-08-10 | Shimadzu Corporation | Process and reagent for amplifying nucleic acid sequences |
| US20030055240A1 (en) * | 1995-06-06 | 2003-03-20 | Roberts Peter C. | HPV specific oligonucleotides |
| US6509149B2 (en) * | 1995-06-06 | 2003-01-21 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
| US6458940B2 (en) * | 1995-06-06 | 2002-10-01 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
| US5731150A (en) * | 1995-11-01 | 1998-03-24 | Chiron Diagnostic Corporation | IS6110 based molecular detection of mycobacterium tuberculosis |
| CA2237891C (en) | 1995-11-15 | 2013-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes complementary to human papillomavirus nucleic acid and related methods and kits |
| US6265152B1 (en) | 1995-12-22 | 2001-07-24 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for evaluation of HIV mutations |
| US6007983A (en) * | 1995-12-22 | 1999-12-28 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for evaluation of HIV mutations |
| US5795722A (en) * | 1997-03-18 | 1998-08-18 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for quantitation and nucleic acid sequencing of nucleic acid analytes in a sample |
| US5888736A (en) * | 1995-12-22 | 1999-03-30 | Visible Genetics, Inc. | Method, compositions and kit for detection and identification of microorganisms |
| US8048629B2 (en) * | 1996-03-15 | 2011-11-01 | The Penn State Research Foundation | Detection of extracellular tumor-associated nucleic acid in blood plasma or serum |
| CA2248981C (en) | 1996-03-15 | 2009-11-24 | The Penn State Research Foundation | Detection of extracellular tumor-associated nucleic acid in blood plasma or serum using nucleic acid amplification assays |
| US6511805B1 (en) * | 1996-03-15 | 2003-01-28 | The Penn State Research Foundation | Methods for detecting papillomavirus DNA in blood plasma and serum |
| WO1997039010A1 (en) * | 1996-04-15 | 1997-10-23 | The University Of New Mexico | Probes for the detection of human papillomavirus |
| US6413718B1 (en) | 1996-05-01 | 2002-07-02 | Visible Genetics Inc. | Method for sequencing of nucleic acid polymers |
| US6830887B2 (en) | 1997-03-18 | 2004-12-14 | Bayer Healthcare Llc | Method and kit for quantitation and nucleic acid sequencing of nucleic acid analytes in a sample |
| WO1999014377A2 (en) | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Innogenetics N.V. | Detection and identification of human papillomavirus by pcr and type-specific reverse hybridization |
| US6703228B1 (en) * | 1998-09-25 | 2004-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to genotyping and DNA analysis |
| US7569344B2 (en) * | 1998-10-26 | 2009-08-04 | Ventana Medical Systems, Inc. | Detection of human papilloma virus in papanicolaou (Pap) smears |
| ATE370251T1 (de) * | 1998-10-26 | 2007-09-15 | Ventana Med Syst Inc | Nachweis des humanen papilloma-virus mit hilfe des papanicolau-tests |
| SE515668C2 (sv) * | 1999-02-22 | 2001-09-17 | Quantovir Ab | Metod och kit för tidig förutsägelse av cancer |
| EP1169480A4 (en) | 1999-04-14 | 2005-02-02 | Musc Found For Res Dev | TOXIC AGENTS AND RIBOZYMES SPECIFIC TO TISSUE AND SPECIFIC PATHOGENS |
| US6420106B1 (en) | 1999-06-09 | 2002-07-16 | Quantovir Ab | Method and kit for early cancer prediction |
| US20060275784A1 (en) * | 1999-10-26 | 2006-12-07 | Ventana Medical Systems, Inc. | Detection of Human Papilloma Virus in Papanicolaou (Pap) Smears |
| US6936443B2 (en) * | 2000-04-03 | 2005-08-30 | Cytyc Corporation | Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes |
| EP1294939B1 (en) * | 2000-04-03 | 2010-01-27 | Cytyc Corporation | Detection and typing of human papillomavirus using pna probes |
| IT1316070B1 (it) * | 2000-05-05 | 2003-03-28 | Bioanalisi Ct Sud Snc Di Perse | Metodo e mezzi per l'identificazione di virus hpv |
| US20030059806A1 (en) * | 2001-01-05 | 2003-03-27 | Science & Technology Corporation @ Unm | Probes for the detection of human papillomavirus |
| US6811549B2 (en) * | 2001-02-16 | 2004-11-02 | William H. Fleming | Administration of therapeutic or diagnostic agents using interlabial pad |
| US8142819B2 (en) | 2002-10-21 | 2012-03-27 | Metaproteomics, Llc | Synergistic compositions that treat or inhibit pathological conditions associated with inflammatory response |
| US7222059B2 (en) * | 2001-11-15 | 2007-05-22 | Siemens Medical Solutions Diagnostics | Electrophoretic trace simulator |
| US7553623B2 (en) | 2002-01-07 | 2009-06-30 | Norchip A/S | Method for detecting human papillomavirus mRNA |
| HUP0200981A3 (en) | 2002-03-14 | 2004-06-28 | Genoid Kft | Pcr reactions with hybridizing probes using primers with broad genotype-specificity for detection of human papilloma-viruses and typing amplificates by using specifically hybridizing oligonucleotides |
| ATE391794T1 (de) * | 2002-04-16 | 2008-04-15 | Autogenomics Inc | Detektion von humanem papillomavirus mit hilfe eines dna-mikroarrays |
| KR100452103B1 (ko) * | 2002-07-16 | 2004-10-08 | (주)차웰빙스 | 중합효소연쇄반응에 의한 종양원성 인유두종바이러스를검출하기 위한 프라이머와 종양원성 인유두종바이러스를검출하는 방법 |
| KR100491842B1 (ko) * | 2002-11-29 | 2005-05-27 | (주)차웰빙스 | 중합효소연쇄반응에 의한 다양한 유형의인유두종바이러스를 검출하기 위한 신규한 피씨알 공통프라이머와 그를 이용한 인유두종바이러스를 검출하는 방법 |
| EP1664348B8 (en) * | 2003-09-25 | 2019-06-12 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of hpv |
| US20050130177A1 (en) * | 2003-12-12 | 2005-06-16 | 3M Innovative Properties Company | Variable valve apparatus and methods |
| US7939249B2 (en) * | 2003-12-24 | 2011-05-10 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step |
| DE102004022350A1 (de) * | 2004-04-29 | 2005-11-17 | Genid Gmbh | Diagnose von Infektionserkrankungen |
| KR100645253B1 (ko) | 2004-07-12 | 2006-11-15 | (주)차바이오메드 | 중합효소연쇄반응에 의해 인유두종바이러스 유형을결정하기 위한 유형 특이적 올리고뉴클레오타이드 및프라이머와 이를 이용한 결정 방법. |
| EP1623996A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Improved method of selecting a desired protein from a library |
| US20070238100A1 (en) * | 2004-11-30 | 2007-10-11 | Mcglennen Ronald C | Integrated methodologies for the detection and genotyping of human papillomaviruses |
| ATE476528T1 (de) | 2004-12-08 | 2010-08-15 | Gen Probe Inc | Nukleinsäuredetektion aus verschiedenen typen des humanen papillomavirus |
| US20060161076A1 (en) * | 2005-01-06 | 2006-07-20 | Diamics, Inc. | Systems and methods for collection of cell clusters |
| US20060189893A1 (en) * | 2005-01-06 | 2006-08-24 | Diamics, Inc. | Systems and methods for detecting abnormal cells |
| US20070031826A1 (en) * | 2005-08-05 | 2007-02-08 | My Gene | Diagnostic kit for determining the genotype of a human papilloma virus and method of using thereof |
| NZ571459A (en) | 2006-03-29 | 2011-09-30 | Merial Ltd | Vaccine against streptococcus equi |
| US7445786B1 (en) | 2006-04-10 | 2008-11-04 | Manuela Rehtanz | Diagnosing and protecting against tursiops truncatus papillomavirus |
| US8080643B2 (en) * | 2006-09-05 | 2011-12-20 | Third Wave Technologies, Inc. | HPV primers |
| US8398606B2 (en) * | 2007-02-28 | 2013-03-19 | QuantrRx Biomedical Corporation | Folded perineal pad |
| WO2009011472A1 (en) * | 2007-07-19 | 2009-01-22 | Hyunil Choi | Primers and proves for detection of high risk group geno-type human papillomavirus dna, a qualitative assay method of the same dna using them and a qualitative assay kit of the same dna |
| EP2576840B1 (en) | 2010-05-25 | 2018-10-17 | QIAGEN Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes |
| US10982852B2 (en) * | 2018-11-05 | 2021-04-20 | Rolls-Royce Corporation | Cowl integration to combustor wall |
| US20220177964A1 (en) * | 2019-03-27 | 2022-06-09 | Diagenode S.A. | A high throughput sequencing method and kit |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2593828B2 (fr) * | 1986-01-31 | 1990-05-04 | Pasteur Institut | Sonde a papillomavirus et procede de diagnostic in-vitro d'infections a papillomavirus |
| CA1276575C (fr) * | 1984-11-30 | 1990-11-20 | Sylvie Beaudenon | Sondes a papillomavirus et procede de diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| DE3686304T2 (de) * | 1985-04-04 | 1993-02-11 | Univ Georgetown | Typenspezifische papillomavirus-dns-sequenzen und peptide. |
| DE3853678T2 (de) * | 1987-02-26 | 1995-08-31 | Univ Sydney | Verfahren zum nachweis des karzinogenen menschlichen papillomavirus. |
| US4849331A (en) * | 1987-06-09 | 1989-07-18 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 44 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
| US4849334A (en) * | 1987-06-09 | 1989-07-18 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 43 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
| US4849332A (en) * | 1987-05-26 | 1989-07-18 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 35 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
| US4908306A (en) * | 1987-06-12 | 1990-03-13 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 56 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
| FR2629458B2 (fr) * | 1987-07-31 | 1991-08-09 | Ire Celltarg Sa | Nouvelles sondes d'acides nucleiques specifiques de differents types de virus de papillome humain |
| AU2785589A (en) * | 1987-10-02 | 1989-04-18 | Microprobe Corporation | Human papillomavirus type diagnosis with nucleotide probes |
| WO1989009940A1 (en) * | 1988-04-04 | 1989-10-19 | Oncor, Inc. | Human papilloma virus typing method and nucleic acid probes used therein |
| US5863717A (en) * | 1989-11-03 | 1999-01-26 | Abbott Laboratories | Use of conserved oligonucleotide primers to amplify human papillomavirus DNA sequences |
-
1989
- 1989-03-10 US US07/322,550 patent/US5182377A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-29 DE DE68926507T patent/DE68926507T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-29 AU AU44011/89A patent/AU645483B2/en not_active Expired
- 1989-08-29 US US07/651,356 patent/US5283171A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-29 WO PCT/US1989/003747 patent/WO1990002821A1/en active IP Right Grant
- 1989-08-29 EP EP89911432A patent/EP0433396B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-29 JP JP1510640A patent/JP2651483B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-29 AT AT89911432T patent/ATE138108T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-09-07 CA CA000610630A patent/CA1339262C/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68926507D1 (de) | 1996-06-20 |
| ATE138108T1 (de) | 1996-06-15 |
| WO1990002821A1 (en) | 1990-03-22 |
| EP0433396A1 (en) | 1991-06-26 |
| AU4401189A (en) | 1990-04-02 |
| JPH04500910A (ja) | 1992-02-20 |
| US5182377A (en) | 1993-01-26 |
| EP0433396B1 (en) | 1996-05-15 |
| AU645483B2 (en) | 1994-01-20 |
| CA1339262C (en) | 1997-08-12 |
| US5283171A (en) | 1994-02-01 |
| DE68926507T2 (de) | 1997-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2651483B2 (ja) | ポリメラーゼ連鎖反応によるヒト乳頭腫ウイルスの検出 | |
| JP4975905B2 (ja) | 複合生物試料における核酸の単工程調製及び検出 | |
| DK175944B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af en dobbeltstrenget nucleinsyre som inkluderer en promotor der er operabelt forbundet til en sekvens, som skal detekteres, og en fremgangsmåde, der er anvendelig til detektion af en specifik nucleinsyresekvens ...... | |
| JP3802110B2 (ja) | 核酸の同時増幅方法並びにそのための組成物、試験キット及び試験装置 | |
| JP2561053B2 (ja) | ナイセリア・ゴノレエの検出方法、並びにそのための試薬およびキット | |
| US5403707A (en) | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of retroviral DNA using primers having matched melting temperatures | |
| RU2441918C2 (ru) | In vitro диагностический набор для идентификации папилломавируса человека в клинических образцах | |
| AU741141B2 (en) | Specific and sensitive method for detecting nucleic acids | |
| US6265154B1 (en) | Nucleic acid primers and probes for detecting oncogenic human papillomaviruses | |
| JP2008188019A (ja) | Ｐｎａプローブを使用するヒトパピローマウイルスの検出およびタイピング | |
| JPH0398586A (ja) | プライマー３′末端におけるプライマーと標的のミスマッチを克服する診断および増幅方法 | |
| JPH0310700A (ja) | パピローマウイルスの検出方法 | |
| US6503704B1 (en) | Method, reagent and kit for genotyping human papilloma virus | |
| JPH09289900A (ja) | 核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸増幅ならびに検出用試薬キット | |
| JPH04141099A (ja) | 増幅捕捉アッセイ | |
| JPH06319597A (ja) | 似通った融点を有する２つ以上のｄｎａを増幅及び検出するための診断用組成物、要素、方法並びに試験キット | |
| JP2017533733A (ja) | ハイブリダイゼーションプローブおよび方法 | |
| JP2000511777A (ja) | クラミジア・ニューモニエ検出用核酸プライマーおよびプローブ | |
| US5968739A (en) | Nucleic acid primers and probes for detecting Legionella pneumophila | |
| WO1991002091A1 (en) | Method of identifying herpesviruses and oligonucleotides for use therein | |
| ES2253279T3 (es) | Metodos y composiciones para la deteccion de especies del complejo de mycobacterium avium. | |
| US6818397B1 (en) | Methods for detecting and differentiating enteroviruses and the primers and probes therefor | |
| JP2010516231A (ja) | ヒトエリスロウイルス | |
| CA2024978A1 (en) | Nucleic acid detection method using unequal primer concentrations in polymerase chain reaction | |
| JPH05261000A (ja) | ギアルジア・ランブリアの存在を決定するための方法及び試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090523 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100523 Year of fee payment: 13 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100523 Year of fee payment: 13 |