JP2834514B2 - 血液細胞処理剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液細胞に作用して有用物質を産生させ得
る血液細胞処理剤に関する。

（従来の技術） 生理活性物質を不溶性担体に固定化したものはアフィ
ニティークロマトグラフ用吸着剤、治療用血液処理剤、
抗菌性材料その他分析用試薬などとして広く利用されて
おり、今後さらに幅広い応用が期待される重要な物質で
ある。

治療用血液処理剤のなかでも血液細胞を対象としたも
のとしてはグラム陰性菌細胞壁由来のリポ多糖体を固定
化したもの（特開昭59−21145）やポークウッドマイト
ジェン等の植物レクチンを固定化したもの〔須賀原ほ
か、人工臓器 18（３）,1401（1989）〕等が知られて
いるが、これ等は毒性の強い物質を固定化したものであ
る。従って、それらの使用時にこれらリガンドの溶出が
あってはならないが、化学構造が複雑な天然物を固定化
したものであるため、その可能性が皆無である補償がな
い欠点があり、また、リガンドが高分子であるためその
分子の中に複数の活性部位を持ち、それ故その作用が複
雑である欠点がある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、かかる従来技術の問題点に鑑み、毒性
のない低分子化合物を不溶性担体に固定化し、これを血
液細胞と接触させることによって有用なサイトカイン等
を産生させられないか検討した結果、グルクロン酸を固
定化したものが単核球系細胞にインターロイキン−１、
TNF、Ｇ−CSFおよびGM−CSF等を産生させることを見出
だし、本発明に到達した。

（課題を解決するための手段） 本発明は、以下の（１）〜（６）の技術的手段から構
成される。

（１）不溶性担体の表面にグルクロン酸をアミド結合で
固定化して成る血液細胞処理剤。

（２）不溶性担体が、シャーレ、瓶、膜、繊維、中空
糸、粒状物またはこれ等を用いた組み立て品であること
を特徴とする上記（１）記載の血液細胞処理剤。

（３）白血球を上記（１）記載の血液細胞処理剤と接触
させることを特徴とするサイトカインの製造方法。

（４）サイトカインが、インターロイキン−１であるこ
とを特徴とする上記（３）記載のサイトカインの製造方
法。

（５）サイトカインが、コロニー刺激因子であることを
特徴とする上記（３）記載のサイトカインの製造方法。

（６）不溶性担体がスチレンまたはα−メチルスチレン
の重合体成型品の表面にアミノメチル基を導入したもの
であることを特徴とする上記（１）記載の血液細胞処理
剤。

本発明でいう不溶性担体とは、実質上不溶性で、第１
級または第２級アミノ基を有し、かつ、グルクロン酸を
アミド結合で固定することのできる担体を意味する。該
不溶性担体の形状はシャーレ、瓶、管、膜、繊維、中空
糸、粒状物またはこれ等を用いた組み立て品のいずれで
もよいが、とりわけ、これ等に光透過性があると細胞の
観察が容易にでき、細胞の管理がしやすいので好まし
い。

本発明でいう不溶性担体の具体例をあげると、スチ
レンまたはα−メチルスチレンの単独重合体もしくはこ
れらを主成分とする芳香族ビニル系共重合体をシャー
レ、試験管、管、フィルム、瓶、注射筒、カテーテルな
どに成型したものの表面にアミノメチル基を導入したも
の、スチレン／エチレン・ブチレンのABAブロックコ
ポリマの膜にアミノメチル基を導入したもの、ポリプ
ロピレン補強ポリスチレン繊維の表面にアミノメチル基
を導入したもの、ポリスチレンまたはスチレン・ジビ
ニルベンゼン共重合体ビーズに、アミノメチル基を芳香
核置換基として導入したもの、アミノプロピル化ガラ
スビーズなどがあげられるが、これ等に限定されるもの
ではない。また、これらのなかでも、とが光透過性
が高く、且つ、取り扱いやすいので、特に、好ましく用
いられる。

の場合、成型品の厚みには特に制限はないが、実用
に耐える強度を維持するためには、通常、100ミクロン
以上の厚みを持つものが好ましく用いられる。また、そ
の光透過性に関しては該成型品の底面または側面の反対
側に存在する物質の形を確認可能にするに十分な光透過
性を有することが望ましい。該成型品の光透過性は主と
して表面での散乱によって決まるので、表面が完全に平
滑でなければならない。該成型品の場合、500〜700ナノ
メーターの波長の光に対する吸光度が３以下であること
が必要である。この吸光度が小さいほど該成型品の光透
過性が良く、吸光度が１以下であればさらに好ましい。

本発明血液細胞処理剤の製造は、不溶性担体をグルク
ロン酸とカルボジイミドの混合溶液に加えるが、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルで代表されるグルクロ
ン酸の活性エステルまたはグルクロノラクトンの溶液中
に浸漬することにより容易に達成される。

本発明でいうサイトカインとはインターロイキン−
１、インターロイキン−２等で代表されるインターロイ
キン類、GM−CSF、GM−CSF等で代表されるコロニー刺激
因子、インターフェロン、TNF等を意味する。

コロニー刺激因子は軟寒天中で顆粒球、マクロファー
ジの幹細胞を刺激して、成熟した顆粒球やマクロファー
ジから成るコロニーを形成させる特異的刺激因子として
知られている糖蛋白質である。コロニー刺激因子の中に
は、GM−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−CSF等があることが知られ
ている。また、これ等は単球、マクロファージ、繊維芽
細胞、血管内皮細胞、骨髄ストローマ等によって産生さ
れることが知られている。GM−CSFは白血球の数の増加
だけでなく、顆粒球機能の亢進の作用もあることが知ら
れており、骨髄性白血病の治療、AIDSや癌の化学療法後
の白血球減少症の治療のためにも使われている｛実験医
学 ７ （15）（増刊）198−203（1989）｝。また、Ｇ
−CSFも同様に重症感染症の予防や治療に用いられる
｛実験医学 ７ （15）（増刊）191−197（1989）｝。

インターロイキン−１は白血球が産生する発熱物質と
して古くから知られているが最近ではいろんな作用のあ
ることが知られており、特に抗腫瘍効果や造血促進作用
があり、臨床への利用が試みられている｛実験医学 ７
（15）（増刊）170−177（1989）｝。

血液細胞を本発明の血液細胞処理剤と接触させながら
培養すると、実施例３に示すように高濃度の種々のサイ
トカインを産生し、且つ、非固定リポポリサッカライド
の様に細胞に対する損傷も認められなかった。この場
合、血液細胞の中から単球だけを取り出して処理するこ
ともできるし、いろんな血液細胞の混合物を処理する利
用方法もある。産生されたサイトカインはin vivoおよ
びin vitroでの白血球増加剤として利用できる。

本発明の血液細胞処理剤の利用としては血液回路、細
胞培養用器具、体外循環用カラム充填材料等への利用が
あげられる。

（発明の効果） 本発明の血液細胞処理剤は、サイトカイン等の有用
物の産生に用いることができること、化学的に安定な
アミド結合で固定化されているので、溶出の心配がない
こと、万一、溶出しても無毒な化合物であること、
細胞を傷めない等の利点を有する。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明す
る。

なお、実施例中の評価方法は、以下に従った。

1.芳香族ビニル系重合体成型品の化学的解析 成型品を塩化メチレンでソックスレー抽出すると不溶
性の膜状物が得られるので、これを真空乾燥し、重量を
量り、赤外線吸収スペクトル測定等を行った。

2.赤外線吸収スペクトル 島津フーリエ変換赤外分光光度計FTIR−4300を用いKb
r錠剤法で測定した。

3.成型品の光透過性の測定 島津分光光度計UV2100を用い、500ナノメーターで板
状成型品に垂直方向の吸光度を測定した。対照として同
じ厚さのポリスチレン板状成型品の吸光度を測定し、両
者の差をA₅₀₀とした。従って、その値が小さいほど成型
品の光透過性が高いことになる。

4.サイトカインの定量 GM−CSF、Ｇ−CSF、インターロイキン−１はＴ法｛T.
Mosman,ジャーナル オブ ザイミュノロジカル メソ
ッズ 65 55〜63（1983）｝により分析した。

TNFはL929をインジケーターセルとした殺細胞能によ
り定量した。

実施例1. １−ニトロプロパン500mlと硫酸272mlの混合溶液を０
℃に冷却し、20.4gのＮ−メチロール−α−クロルアセ
トアミドを加え、０〜10℃で溶解した。

この溶液を10℃に昇温したのち、φ3.5cm×1.2mmHの
ポリスチレン製培養皿（厚み1mm）に11mlずつ入れ、室
温で1hr反応させた。反応液を捨て、培養皿を零下20℃
のメタノールに浸し、さらにメタノーおよび水で洗った
後、真空乾燥して、内部表面だけクロルアセトアミドメ
チル化された成型品Ａを得た。この成型品のA₅₀₀は0.05
0であった。

上記で得た成型品A1個を、塩化メチレンでソックスレ
ー抽出したところ、薄膜状の不溶物3.1mgが得られた。
培養皿の反応面の表面積は21cm²であるので、反応部の
厚みは大体1.2μと考えられる。また、この不溶物の赤
外線吸収スペクトルでは、1659cm^-1（アミド−Ｉ）、15
29cm^-1（アミド−II）および3297cm^-1（Ｎ−Ｈ）にアミ
ド基の強い吸収が認められたことからその構造を確認し
た。

上記で得た成型品A40個を、2000mlの10％ジメチルア
ミノエタノール・ジメチルスルホキサイド溶液中に浸
し、室温で18hr静置した後、2000mlの10％ジメチルアミ
ノエタノール水溶液中、70℃で2hr加熱した。成型品を
水洗後、乾燥して、アミノメチル化成型品Ｂを得た。こ
の成型品のA₅₀₀は0.05であった。

上基本発明の成型品B1個を、塩化メチレンでソックス
レー抽出したところ、薄膜状の不溶物2.3mgが得られ
た。この不溶物の赤外線吸収スペクトルでは、成型品Ａ
で認められた1659cm^-1（アミド−Ｉ）および1529cm
^-1（アミド−II）の第一級アミド基の強い吸収cm^-1が完
全に消失していたことからその構造を確認した。

上記本発明の成型品B10個を500mlの水に浸し、N/100
−塩酸でpH5〜６に調整した後、成型品Ｂの内部に0.2mg
/mlのグルクロン酸ナトリウム水溶液5mlと１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩8mgを加え、室温で48hr静置した。反応液を捨て、
水洗して、本発明の血液細胞処理剤である成型品Ｃを得
た。母液中のグルクロン酸の濃度はフェノール硫酸法に
よる分析から、0.085mg/mlであったことから0.060mg固
定化されたことが確認された。また、成型品上のグルク
ロン酸はN/40−NaOHで洗浄しても溶出の無いことを確認
した。

実施例2. ポリスチレン製細胞培養用マルチプレート12F（住友
ベークライト製）の各ウエルに実施例１のアミドメチル
化反応液を5mlずつ入れ、室温で60min.反応させた。反
応液を捨て、零下20℃のメタノールに投じ、実施例１と
同様に処理して、内部表面だけクロルアセトアミドメチ
ル化された成型品Ｄを得た。

これを実施例１と同様に10％ジメチルアミノエタノー
ル・ジメチルスルホキサイド溶液および10％ジメチルア
ミノエタノール水溶液で処理して、内部表面だけアミノ
メチル化された成型品Ｅを得た。

成型品Ｅを1000mlの水に浸し、N/100−塩酸でpH5〜６
に調整した後、風乾し、次に、成型品Ｅの６個のウエル
に0.2mg/mlのグルクロン酸ナトリウム水溶液2mlと１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩3.2mgを加え、室温で48hr静置した。反応
液を捨て、水洗して、本発明の血液細胞処理剤である成
型品Ｆを得た。母液中のグルクロン酸の濃度はフェノー
ル硫酸法による分析から0.065mg固定化されたことが確
認された。の 実施例３ マウスマクロファージ株TME9｛小川恭喜ほか、日本免
疫学会総会・学術集会記録、17 599（1987）｝を３×1
0^-5Mの２−メルカプトエタノール、50U/mlのペニシリン
（万有）、50μg/mlのストレプトマイシン（明治製菓）
およびウシ胎児血清を10％含むRPMI1640（Gibco）に３
×10^-5個/ml浮遊したものを、実施例２で得られた成型
品F1個（紫外線照射滅菌）のグルクロン酸を固定化した
６個のウエルとグルクロン酸を固定化しなかった６個の
ウエルとに1mlずつ入れ、インキュベーター中（37℃、
５％CO²）で20hr培養した。細胞の様子を顕微鏡で観察
したが、傷害を受けている様子は認められなかった。培
養上清を取ってその中のサイトカインを調べたところ、
グルクロン酸を固定化した６個のウエルではGM−CSFは
8.5U/ml、Ｇ−CSFは22.2U/ml、IL−１は16.7U/ml、TNF
は8.4U/mlといずれも高い活性が認められた。一方、グ
ルクロン酸を固定化しなかった６個のウエルではGM−CS
Fは1.6U/ml以下、Ｇ−CSFは1.2U/ml以下、IL−１は1U/m
l以下、TNFは2U/ml以下といずれも活性が認められ無か
った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｍ 1/24 Ｃ１２Ｍ 1/24 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 須藤 哲央 神奈川県横浜市栄区田谷町１番地 株式 会社バイオマテリアル研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 C12M 1/00 - 1/42 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】不溶性担体の表面にグルクロン酸をアミド
   結合で固定化して成る血液細胞処理剤。
2. 【請求項２】不溶性担体の形状が、シャーレ、瓶、膜、
   繊維、中空糸、粒状物またはこれ等を用いた組み立て品
   であることを特徴とする請求項第（１）項記載の血液細
   胞処理剤。
3. 【請求項３】白血球を請求項第（１）項記載の血液細胞
   処理剤と接触させることを特徴とするサイトカインの製
   造方法。
4. 【請求項４】サイトカインが、インターロイキン−１で
   あることを特徴とする請求項第（３）項記載のサイトカ
   インの製造方法。
5. 【請求項５】サイトカインが、コロニー刺激因子である
   ことを特徴とする請求項第（３）項記載のサイトカイン
   の製造方法。
6. 【請求項６】不溶性担体がスチレンまたはα−メチルス
   チレンの重合体成型品の表面にアミノメチル基を導入し
   たものであることを特徴とする請求項第（１）項記載の
   血液細胞処理剤。