JP2727391B2 - 高発現ベクター及び該高発現ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 - Google Patents
高発現ベクター及び該高発現ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バイオテクノロジーに
関するものであり、更に詳細には、本発明は、新規高発
現ベクター及び高発現ベクターに外来遺伝子を結合して
なるベクターをバチルス・ブレビスに保有せしめてなる
微生物、並びに該微生物を培養し、培養物中に外来遺伝
子産物を生成蓄積せしめこれを採取することを特徴とす
る該産物の製造法に関する。
関するものであり、更に詳細には、本発明は、新規高発
現ベクター及び高発現ベクターに外来遺伝子を結合して
なるベクターをバチルス・ブレビスに保有せしめてなる
微生物、並びに該微生物を培養し、培養物中に外来遺伝
子産物を生成蓄積せしめこれを採取することを特徴とす
る該産物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】鵜高らはバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼを生産しな
い菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・ブ
レビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０−５
８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９号公報参
照）の主要菌体外タンパク質（Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９（１
９８７）；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８
（１９８７）および特開昭６２−２０１５８３号公報に
それぞれ“ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａ
ｎｄ ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ”、
“主要菌体外タンパク質”として記載されている。）遺
伝子のプロモーターおよび該主要菌体外タンパク質の１
種であるＭＷタンパク質（ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドをコードする領域を
用いて分泌ベクターを作製し、本菌株を宿主としてα−
アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８３号公報、Ｈ．Ｙ
ａｍａｇａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６
９，１２３９（１９８７）やブタペプシノーゲン（鵜高
重三、日本農芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ
８３７−８３８；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１、
６８（１９８７））の分泌生産に成功している。
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）にはプロテアーゼを生産しな
い菌株が多いことを見いだし、その１菌株バチルス・ブ
レビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４：特開昭６０−５
８０７４号公報、特開昭６２−２０１５８９号公報参
照）の主要菌体外タンパク質（Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９（１
９８７）；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１，６８
（１９８７）および特開昭６２−２０１５８３号公報に
それぞれ“ｏｕｔｅｒ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ａ
ｎｄ ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ”、
“主要菌体外タンパク質”として記載されている。）遺
伝子のプロモーターおよび該主要菌体外タンパク質の１
種であるＭＷタンパク質（ｍｉｄｄｌｅ ｗａｌｌ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドをコードする領域を
用いて分泌ベクターを作製し、本菌株を宿主としてα−
アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８３号公報、Ｈ．Ｙ
ａｍａｇａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６
９，１２３９（１９８７）やブタペプシノーゲン（鵜高
重三、日本農芸化学会昭和６２年度大会講演要旨集、ｐ
８３７−８３８；塚越規弘、日本農芸化学会誌、６１、
６８（１９８７））の分泌生産に成功している。
【０００３】また、高木らはバチルス・ブレビスのプロ
テアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブレビス
ＨＰＤ３１（なお、この菌株はバチルス・ブレビスＨ１
０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株である）
を分離し、これを宿主として耐熱性α−アミラーゼの高
分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，
２７７９−２３８０（１９８９））や、山形らによるヒ
トＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｈ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５８９−３５９３（１９
８９））に成功している。
テアーゼを菌体外に生産しない菌株バチルス・ブレビス
ＨＰＤ３１（なお、この菌株はバチルス・ブレビスＨ１
０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）と同一菌株である）
を分離し、これを宿主として耐熱性α−アミラーゼの高
分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５８，
２７７９−２３８０（１９８９））や、山形らによるヒ
トＥＧＦの高分泌生産（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｈ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５８９−３５９３（１９
８９））に成功している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】バチルス・ブレビスを
宿主菌とする外来遺伝子産物の生産性については、遺伝
子組換え技術を適用する以前の生産量及び大腸菌を宿主
菌とする系に比べ飛躍的に向上しているが、産業上必要
な量を安価に供給するにはもう一段の技術開発が必要と
されている。従来、バチルス・ブレビスを宿主菌とする
系で使用しているベクターは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０をベースとす
るもので、バチルス・ブレビスとの属の違いなどから菌
体内に安定に保持することが困難であり、その結果、宿
主の能力を十分に引き出すことが出来ず、目的遺伝子産
物の生産が少ないと言うことが頻繁に認められ、より安
定でかつ宿主菌と適合性、調和性のよいベクターの開発
が望まれていた。
宿主菌とする外来遺伝子産物の生産性については、遺伝
子組換え技術を適用する以前の生産量及び大腸菌を宿主
菌とする系に比べ飛躍的に向上しているが、産業上必要
な量を安価に供給するにはもう一段の技術開発が必要と
されている。従来、バチルス・ブレビスを宿主菌とする
系で使用しているベクターは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０をベースとす
るもので、バチルス・ブレビスとの属の違いなどから菌
体内に安定に保持することが困難であり、その結果、宿
主の能力を十分に引き出すことが出来ず、目的遺伝子産
物の生産が少ないと言うことが頻繁に認められ、より安
定でかつ宿主菌と適合性、調和性のよいベクターの開発
が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記した業界のニーズに
加え、更に、バチルス・ブレビスが汎用性の高い宿主と
して利用可能であること、また同菌がコンピテントな菌
を冷凍保存できること、そしてまた電気パルス法等によ
り形質転換が容易であること等に鑑み、バチルス・ブレ
ビスの工業的有用性に着目して、バチルス・ブレビスで
安定でかつ高発現のベクターを開発すべく鋭意検討した
結果、バチルス・ブレビス由来のプラスミドを利用し、
且つ、バチルス・ブレビス由来の強力なプロモータ−を
用いて非常に有効なベクターを構築することに成功し本
発明を完成した。
加え、更に、バチルス・ブレビスが汎用性の高い宿主と
して利用可能であること、また同菌がコンピテントな菌
を冷凍保存できること、そしてまた電気パルス法等によ
り形質転換が容易であること等に鑑み、バチルス・ブレ
ビスの工業的有用性に着目して、バチルス・ブレビスで
安定でかつ高発現のベクターを開発すべく鋭意検討した
結果、バチルス・ブレビス由来のプラスミドを利用し、
且つ、バチルス・ブレビス由来の強力なプロモータ−を
用いて非常に有効なベクターを構築することに成功し本
発明を完成した。
【０００６】すなわち本発明は、バチルス・ブレビスで
高発現するベクターに関するものである。また更に、本
発明はこのベクターに目的とする外来遺伝子を連結して
なる高発現ベクター、それを保有する形質転換体、及び
この形質転換体を培養することによる外来遺伝子産物の
大量分泌生産方法にも関するものである。以下、本発明
について詳しく説明する。
高発現するベクターに関するものである。また更に、本
発明はこのベクターに目的とする外来遺伝子を連結して
なる高発現ベクター、それを保有する形質転換体、及び
この形質転換体を培養することによる外来遺伝子産物の
大量分泌生産方法にも関するものである。以下、本発明
について詳しく説明する。
【０００７】本発明の高発現ベクターの構築に使用する
プラスミドはバチルス・ブレビス由来のプラスミドであ
れば何れでも良いが、例えば、バチルス・ブレビスＨＰ
９２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３８２）より調製されるプ
ラスミドｐＨＴ９２６が有効に使用される。プラスミド
の調製は既知の方法例えば田中らの方法（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１２９，１４８７−１４９４（１９７
７））が挙げられる。
プラスミドはバチルス・ブレビス由来のプラスミドであ
れば何れでも良いが、例えば、バチルス・ブレビスＨＰ
９２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３８２）より調製されるプ
ラスミドｐＨＴ９２６が有効に使用される。プラスミド
の調製は既知の方法例えば田中らの方法（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１２９，１４８７−１４９４（１９７
７））が挙げられる。
【０００８】プロモーターとしてはバチルス・ブレビス
で機能するものであれば何れでも良いが、バチルス・ブ
レビス由来のプロモーターが好ましく、例えばバチルス
・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）の
主要菌体外タンパク質遺伝子（ＨＷＰ遺伝子）のプロモ
ーターなどが挙げられる。プロモーター領域を含有する
ＤＮＡは上記プロモーター以外にＳＤ配列、翻訳開始コ
ドンなどを有していることが必要である。
で機能するものであれば何れでも良いが、バチルス・ブ
レビス由来のプロモーターが好ましく、例えばバチルス
・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）の
主要菌体外タンパク質遺伝子（ＨＷＰ遺伝子）のプロモ
ーターなどが挙げられる。プロモーター領域を含有する
ＤＮＡは上記プロモーター以外にＳＤ配列、翻訳開始コ
ドンなどを有していることが必要である。
【０００９】上記のように、バチルス・ブレビスＨＰＤ
３１のＨＷＰプロモーター領域を含有するＤＮＡは既知
であるので（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１３
１２−１３２０（１９９０））、必要部分を制限酵素で
切断しておき、これをサブクローニング用ベクター（形
質転換体としてＥ．ｃｏｌｉを用いる場合には、ｐＵＣ
１１８、ｐＵＣ１１９等のｐＵＣ系プラスミド又はｐＢ
Ｒ３２２系のプラスミドが好適である）に挿入し、その
ＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉを形質転換しておけば、目的とす
るプロモーター領域を含有するＤＮＡが保存される。し
たがって必要ある場合に、形質転換体からプラスミドを
取り出し、必要あれば更に制限酵素処理、リンカー処理
等を行ってプラスミドを調製しておけば、目的とするプ
ロモーターを含むＤＮＡ断片を自由に取り出すことがで
きる。
３１のＨＷＰプロモーター領域を含有するＤＮＡは既知
であるので（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１３
１２−１３２０（１９９０））、必要部分を制限酵素で
切断しておき、これをサブクローニング用ベクター（形
質転換体としてＥ．ｃｏｌｉを用いる場合には、ｐＵＣ
１１８、ｐＵＣ１１９等のｐＵＣ系プラスミド又はｐＢ
Ｒ３２２系のプラスミドが好適である）に挿入し、その
ＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉを形質転換しておけば、目的とす
るプロモーター領域を含有するＤＮＡが保存される。し
たがって必要ある場合に、形質転換体からプラスミドを
取り出し、必要あれば更に制限酵素処理、リンカー処理
等を行ってプラスミドを調製しておけば、目的とするプ
ロモーターを含むＤＮＡ断片を自由に取り出すことがで
きる。
【００１０】また、本発明の高発現ベクターに連結する
外来遺伝子はバチルス・ブレビスで発現可能な遺伝子で
あれば何れでも良く、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子、ヒト
ＥＧＦ遺伝子等が挙げられる。
外来遺伝子はバチルス・ブレビスで発現可能な遺伝子で
あれば何れでも良く、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子、ヒト
ＥＧＦ遺伝子等が挙げられる。
【００１１】プラスミドを構築する方法としては、常法
で適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニング，
ア・ラボラトリー・マニュアル，コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８２）に記載の方法などが例示され
る。
で適宜用いられ、例えばモレキュラー・クローニング，
ア・ラボラトリー・マニュアル，コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８２）に記載の方法などが例示され
る。
【００１２】バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−
７２２４）のＭＷＰプロモーター領域の下流にバチルス
・リケニフォルミスのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子
を連結したＤＮＡフラグメントを保有するプラスミドは
既知であるので（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，
１２３９−１２４５（１９８７））、これを制限酵素処
理した後、上記によって調製したプラスミドから取り出
したＨＷＰプロモーター領域断片をつないでバチルス・
ブレビスを形質転換して、ＭＷＰプロモーターがＨＷＰ
プロモーターにかわったプラスミドを得る。このプラス
ミドを制限酵素処理、リガーゼ処理、リンカー処理する
ことによってＢＬＡ遺伝子領域を除去した本発明の目的
とする高発現ベクターｐＨＴが得られる。
７２２４）のＭＷＰプロモーター領域の下流にバチルス
・リケニフォルミスのα−アミラーゼ（ＢＬＡ）遺伝子
を連結したＤＮＡフラグメントを保有するプラスミドは
既知であるので（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，
１２３９−１２４５（１９８７））、これを制限酵素処
理した後、上記によって調製したプラスミドから取り出
したＨＷＰプロモーター領域断片をつないでバチルス・
ブレビスを形質転換して、ＭＷＰプロモーターがＨＷＰ
プロモーターにかわったプラスミドを得る。このプラス
ミドを制限酵素処理、リガーゼ処理、リンカー処理する
ことによってＢＬＡ遺伝子領域を除去した本発明の目的
とする高発現ベクターｐＨＴが得られる。
【００１３】このようにして調製した高発現ベクターｐ
ＨＴのＨＷＰプロモーター、シグナルペプチドの下流側
に、目的とする外来遺伝子を常法にしたがってｉｎ ｆ
ｒａｍｅ挿入し、微生物を形質転換すれば、外来遺伝子
を多量に分泌生産しうる形質転換体を得ることができ
る。
ＨＴのＨＷＰプロモーター、シグナルペプチドの下流側
に、目的とする外来遺伝子を常法にしたがってｉｎ ｆ
ｒａｍｅ挿入し、微生物を形質転換すれば、外来遺伝子
を多量に分泌生産しうる形質転換体を得ることができ
る。
【００１４】外来遺伝子を組み込んだベクターを形質転
換する微生物としては、バチルス・ブレビスに属する微
生物であれば何れでも良く、例えば、バチルス・ブレビ
ス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、バチルス・ブレビ
スＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）が挙げられ
るが、好適にはバチルス・ブレビスＨＰＤ３１が用いら
れる。バチルス・ブレビスを形質転換する方法は、公知
の方法で良く、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法
（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０（１９
８３））またはＴａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１９
８９））等が例示される。
換する微生物としては、バチルス・ブレビスに属する微
生物であれば何れでも良く、例えば、バチルス・ブレビ
ス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、バチルス・ブレビ
スＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）が挙げられ
るが、好適にはバチルス・ブレビスＨＰＤ３１が用いら
れる。バチルス・ブレビスを形質転換する方法は、公知
の方法で良く、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法
（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１３０（１９
８３））またはＴａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９−３１００（１９
８９））等が例示される。
【００１５】得られた形質転換体の培養に用いる培地
は、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を
産生しうるものであれば如何なるものでも良い。
は、形質転換体が生育して目的とする外来遺伝子産物を
産生しうるものであれば如何なるものでも良い。
【００１６】該培地に含有される炭素源としては、例え
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、尿素、有機酸などが考えられる。
該培地に含有させる窒素源としては、カゼイン、ポリペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と無
機窒素源を主とする合成培地を用いて培養しても良い。
栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培
地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸
類、ビタミン類、核酸、塩類などが挙げられる。
ばグルコース、シュークロース、グリセロール、澱粉、
デキストリン、糖蜜、尿素、有機酸などが考えられる。
該培地に含有させる窒素源としては、カゼイン、ポリペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、グリシン
などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源などが用いられ
る。その他、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸
二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムなどの
無機塩が必要に応じて培地に加えられる。また、糖と無
機窒素源を主とする合成培地を用いて培養しても良い。
栄養要求性を示す菌は、その生育に必要な栄養物質を培
地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸
類、ビタミン類、核酸、塩類などが挙げられる。
【００１７】また、培養に際して必要があれば、培地に
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリンなどが加えられる。更に必要により、消泡
剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤などを培地
に加えてもよい。
抗生物質例えばペニシリン、エリスロマイシン、クロラ
ムフェニコール、バシトラシン、Ｄ−サイクロセリン、
アンピシリンなどが加えられる。更に必要により、消泡
剤例えば大豆油、ラード油、各種界面活性剤などを培地
に加えてもよい。
【００１８】培地の初発ｐＨは５．０〜９．０であり、
さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通
常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃で
あり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好まし
くは２４〜９６時間である。
さらに好ましくは６．５〜７．５である。培養温度は通
常１５℃〜４２℃、さらに好ましくは２４℃〜３７℃で
あり、培養時間は通常１６〜１６６時間、さらに好まし
くは２４〜９６時間である。
【００１９】培養終了後、それ自体公知の方法、例えば
遠心分離、ろ過などで菌体と上清とを分離する。
遠心分離、ろ過などで菌体と上清とを分離する。
【００２０】形質転換する微生物として、例えばバチル
ス・ブレビスＨＰＤ３１等を使用すれば、電気パルス法
等によって容易に形質転換することができるのみでな
く、目的とする産物を菌体外に生産するというすぐれた
性質を有しているので、上記のようにして得られた培養
上清に含まれる外来遺伝子産物は、例えば塩析、等電点
沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ハイ
ドロオキシアパタイト、高速液体クロマトグラフィーな
どに従って精製すればよく、このようにして目的とする
外来遺伝子産物を容易に得ることが出来る。
ス・ブレビスＨＰＤ３１等を使用すれば、電気パルス法
等によって容易に形質転換することができるのみでな
く、目的とする産物を菌体外に生産するというすぐれた
性質を有しているので、上記のようにして得られた培養
上清に含まれる外来遺伝子産物は、例えば塩析、等電点
沈澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ハイ
ドロオキシアパタイト、高速液体クロマトグラフィーな
どに従って精製すればよく、このようにして目的とする
外来遺伝子産物を容易に得ることが出来る。
【００２１】以下、本発明を実施例により更に詳しく説
明する。
明する。
【００２２】
【実施例１】
【００２３】 ［（１）プラスミドｐＨＴ９２６の単離（図１）］ プラスミドｐＨＴ９２６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅ
ｖｉｓＨＰ９２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３８２）が保有
する多コピープラスミドである。本菌株をＴ２液体培地
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４０，５２３
（１９７６））中で３７℃で１晩振とう培養後、培養液
から菌体を遠心分離にて集め、次いで集菌した菌体より
アルカリ・ＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，７，１５１３（１９７９））によりプラスミド
ｐＨＴ９２６を得た。ｐＨＴ９２６は、アガロースゲル
電気泳動上で約１．８Ｋｂのプラスミドであり、その制
限酵素地図を図１に示す。
ｖｉｓＨＰ９２６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３８２）が保有
する多コピープラスミドである。本菌株をＴ２液体培地
（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４０，５２３
（１９７６））中で３７℃で１晩振とう培養後、培養液
から菌体を遠心分離にて集め、次いで集菌した菌体より
アルカリ・ＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，７，１５１３（１９７９））によりプラスミド
ｐＨＴ９２６を得た。ｐＨＴ９２６は、アガロースゲル
電気泳動上で約１．８Ｋｂのプラスミドであり、その制
限酵素地図を図１に示す。
【００２４】［（２）ｐＨＴ９２６を用いたＢ．ｂｒｅ
ｖｉｓ４７Ｂ．ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１の形質転換（図
２、図３）］プラスミドｐＥ１９４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１５０，２，８０４−８１４（１９８２））
をＳａｃＩとＣｌａＩで消化し、エリスロマイシン耐性
遺伝子（Ｅｍ ｒ遺伝子）を含む９６０ｂｐのＳａｃＩ
−ＣｌａＩ断片を得、プラスミドｐＵＣ１１９のＳａｃ
Ｉ−ＡｃｃＩ部位に挿入、結合した後、Ｅ．ｃｏｌｉＪ
Ｍ１０９を形質転換し、ｐＵＣ１１９・Ｅｍ ｒプラス
ミドを有する株を選択した。本菌株よりプラスミドｐＵ
Ｃ１１９・Ｅｍ ｒを調製し、このプラスミドをＥｃｏ
ＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、Ｅｍ ｒ遺伝子を含む
９８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得た。
この断片の両端をＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ
ｆｒａｇｍｅｎｔ）により平滑化し、ｐＨＴ９２６のＨ
ｐａＩ部位に挿入、結合し、プラスミド ｐＨＴ１００
を得た。これを用いてＢ．ｂｒｅｖｉｓ４７をＴｒｉｓ
−ＰＥＧ法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１
３０（１９８３））により、そしてまたＢ．ｂｒｅｖｉ
ｓＨＰＤ３１をエレクトロポレーション法（Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９（１９８
９））により、形質転換を試みた。
ｖｉｓ４７Ｂ．ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１の形質転換（図
２、図３）］プラスミドｐＥ１９４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１５０，２，８０４−８１４（１９８２））
をＳａｃＩとＣｌａＩで消化し、エリスロマイシン耐性
遺伝子（Ｅｍ ｒ遺伝子）を含む９６０ｂｐのＳａｃＩ
−ＣｌａＩ断片を得、プラスミドｐＵＣ１１９のＳａｃ
Ｉ−ＡｃｃＩ部位に挿入、結合した後、Ｅ．ｃｏｌｉＪ
Ｍ１０９を形質転換し、ｐＵＣ１１９・Ｅｍ ｒプラス
ミドを有する株を選択した。本菌株よりプラスミドｐＵ
Ｃ１１９・Ｅｍ ｒを調製し、このプラスミドをＥｃｏ
ＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理し、Ｅｍ ｒ遺伝子を含む
９８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得た。
この断片の両端をＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ
ｆｒａｇｍｅｎｔ）により平滑化し、ｐＨＴ９２６のＨ
ｐａＩ部位に挿入、結合し、プラスミド ｐＨＴ１００
を得た。これを用いてＢ．ｂｒｅｖｉｓ４７をＴｒｉｓ
−ＰＥＧ法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５６，１１
３０（１９８３））により、そしてまたＢ．ｂｒｅｖｉ
ｓＨＰＤ３１をエレクトロポレーション法（Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９（１９８
９））により、形質転換を試みた。
【００２５】形質転換処理を行った菌体をＥｍを含むＴ
２固体培地（プレート）に塗布し、３７℃で２日間培養
したところ、プレート上に生育するコロニーが高頻度で
得られた。Ｔ２・Ｅｍプレート上の生育コロニーを液体
培養し、菌体よりプラスミドを調整した。得られたプラ
スミドは、宿主がＢ．ｂｅｖｉｓ４７、Ｂ．ｂｒｅｖｉ
ｓＨＰＤ３１のいずれにおいても、ｐＨＴ９２６にＥｍ
ｒ遺伝子が挿入された目的どおりのもの（ｐＨＴ１０
０）を有していた（図２、図３）。以上より、ｐＨＴ９
２６はＢ．ｂｒｅｖｉｓ４７及びＢ．ｂｒｅｖｉｓＨＰ
Ｄ３１において複製可能なプラスミドであることが立証
された。
２固体培地（プレート）に塗布し、３７℃で２日間培養
したところ、プレート上に生育するコロニーが高頻度で
得られた。Ｔ２・Ｅｍプレート上の生育コロニーを液体
培養し、菌体よりプラスミドを調整した。得られたプラ
スミドは、宿主がＢ．ｂｅｖｉｓ４７、Ｂ．ｂｒｅｖｉ
ｓＨＰＤ３１のいずれにおいても、ｐＨＴ９２６にＥｍ
ｒ遺伝子が挿入された目的どおりのもの（ｐＨＴ１０
０）を有していた（図２、図３）。以上より、ｐＨＴ９
２６はＢ．ｂｒｅｖｉｓ４７及びＢ．ｂｒｅｖｉｓＨＰ
Ｄ３１において複製可能なプラスミドであることが立証
された。
【００２６】［（３）高分泌発現ベクターｐＨＴ１１０
構築（図４）］ｐＨＴ１００をＡｐａＬＩで消化後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼにて切断部分を平滑化し、次いでこの
部分をＴ４リガーゼにより連結し、ＡｐａＬＩサイトを
欠失せしめたｐＨＴ１００Ａを得た。そして、Ｂ．ｂｒ
ｅｖｉｓ ＨＰＤ３１のＨＷＰプロモーター、シグナル
ペプチド及び構造遺伝子の一部を含むファージＤＮＡφ
ＳＫ−１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１３
１２（１９９０））より、ＨＷＰプロモーター及びシグ
ナル部分の５００ｂｐ ＰｓｔＩ−ＨｐａＩ断片を得
た。一方、図５に示すＢ．ｂｒｅｖｉｓ ４７のＭＷＰ
シグナルペプチドの一部及びマルチクローニングサイト
を含む１１０ｂｐ ＨｐａＩ−ＰｓｔＩ断片を合成し
た。
構築（図４）］ｐＨＴ１００をＡｐａＬＩで消化後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼにて切断部分を平滑化し、次いでこの
部分をＴ４リガーゼにより連結し、ＡｐａＬＩサイトを
欠失せしめたｐＨＴ１００Ａを得た。そして、Ｂ．ｂｒ
ｅｖｉｓ ＨＰＤ３１のＨＷＰプロモーター、シグナル
ペプチド及び構造遺伝子の一部を含むファージＤＮＡφ
ＳＫ−１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１３
１２（１９９０））より、ＨＷＰプロモーター及びシグ
ナル部分の５００ｂｐ ＰｓｔＩ−ＨｐａＩ断片を得
た。一方、図５に示すＢ．ｂｒｅｖｉｓ ４７のＭＷＰ
シグナルペプチドの一部及びマルチクローニングサイト
を含む１１０ｂｐ ＨｐａＩ−ＰｓｔＩ断片を合成し
た。
【００２７】ｐＨＴ１００ＡをＰｓｔＩで消化した後、
上記によって得た２つの断片をＴ４リガーゼによって連
結し、目的とする分泌ベクターｐＨＴ１１０を得た。
上記によって得た２つの断片をＴ４リガーゼによって連
結し、目的とする分泌ベクターｐＨＴ１１０を得た。
【００２８】ｐＨＴ１１０のマルチクローニングサイト
部分に外来遺伝子をアミノ酸の読み取りが合う様に（ｉ
ｎ ｆｒａｍｅ）挿入し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３
１を形質転換することによってプラスミドｐＨＴ１１０
Ｘを保有し目的遺伝子産物を多量に分泌生産する組換え
体を得た。
部分に外来遺伝子をアミノ酸の読み取りが合う様に（ｉ
ｎ ｆｒａｍｅ）挿入し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３
１を形質転換することによってプラスミドｐＨＴ１１０
Ｘを保有し目的遺伝子産物を多量に分泌生産する組換え
体を得た。
【００２９】［（４）高分泌発現ベクターｐＨＴ２１０
の構築（図６、図７）］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）のＭＷＰプロモータ
ー及びシグナルペプチド（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
１６９，１２３９−１２４５（１９８７））の下流に
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ（Ｂ
ＬＡ）遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９６，１１４７
−１１５６（１９８５））を直結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ
４８１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５３１）から単離したＢ．ｂ
ｒｅｖｉｓで安定に保持されるプラスミドｐＨＹ４８１
（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９，１
０７６−１０７９（１９８５）に挿入し、プラスミドｐ
ＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１６９，１
２３９−１２４５（１９８７））を調製した。ｐＨＹ４
８３１より特願平３−１２３１８３号の方法にしたがっ
て調製したプラスミドｐＨＹ４８３１ＨをＰｓｔＩとＢ
ｃｌＩで消化し、ＨＷＰプロモーターとＢ．ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子（ＢＬＡ遺伝
子）が直結した２．２ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｃｌＩ断片を
得た。
の構築（図６、図７）］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）のＭＷＰプロモータ
ー及びシグナルペプチド（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
１６９，１２３９−１２４５（１９８７））の下流に
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ（Ｂ
ＬＡ）遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９６，１１４７
−１１５６（１９８５））を直結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ
４８１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５３１）から単離したＢ．ｂ
ｒｅｖｉｓで安定に保持されるプラスミドｐＨＹ４８１
（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９，１
０７６−１０７９（１９８５）に挿入し、プラスミドｐ
ＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）１６９，１
２３９−１２４５（１９８７））を調製した。ｐＨＹ４
８３１より特願平３−１２３１８３号の方法にしたがっ
て調製したプラスミドｐＨＹ４８３１ＨをＰｓｔＩとＢ
ｃｌＩで消化し、ＨＷＰプロモーターとＢ．ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子（ＢＬＡ遺伝
子）が直結した２．２ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｃｌＩ断片を
得た。
【００３０】次いで、この断片の両端をＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて平滑化した。前項で得たｐＨＴ１００をＡ
ｐａＬＩで消化後ＤＮＡポリメラーゼにて切断部分を平
滑化し、この部分に先に得た２．２ｋｂのＨＷＰプロモ
ーターＢＬＡ遺伝子断片をＴ４リガーゼを用いて連結
し、ｐＨＴ２００・ＢＬＡを得た。ｐＨＴ２００・ＢＬ
ＡをＳａｌＩで消化後ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化
した後、ＥｃｏＲＩリンカーを付加したｐＨＴ２００Ｅ
を得た。ｐＨＴ２００ＥをＰｓｔＩで消化後、ＤＮＡポ
リメラーゼにより平滑末端化した後Ｔ４リガーゼにてそ
の平滑末端部分を連結し、ＰｓｔＩ切断点を無くし、次
いでＡｐａＬＩとＥｃｏＲＩで消化して、４．０ｋｂの
ＡｐａＬＩ−ＥｃｏＲＩ断片を得た。この４．０ｋｂ
ＡｐａＬＩ−ＥｃｏＲＩ断片に図８に示す合成ヌクレオ
チド９０ｂｐ ＡｐａＬＩ−ＥｃｏＲＩ断片を連結し、
ｐＨＴ２１０を得た（図７）。ｐＨＴ２１０のマルチク
ローニングサイト部分に外来遺伝子をアミノ酸の読み取
りが合う様に（ｉｎ ｆｒａｍｅ）挿入し、Ｂ．ｂｒｅ
ｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換することにより、プラス
ミドｐＨＴ２１０Ｘを保有し目的遺伝子産物を多量に分
泌生産する組換え体を得た。
ーゼを用いて平滑化した。前項で得たｐＨＴ１００をＡ
ｐａＬＩで消化後ＤＮＡポリメラーゼにて切断部分を平
滑化し、この部分に先に得た２．２ｋｂのＨＷＰプロモ
ーターＢＬＡ遺伝子断片をＴ４リガーゼを用いて連結
し、ｐＨＴ２００・ＢＬＡを得た。ｐＨＴ２００・ＢＬ
ＡをＳａｌＩで消化後ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化
した後、ＥｃｏＲＩリンカーを付加したｐＨＴ２００Ｅ
を得た。ｐＨＴ２００ＥをＰｓｔＩで消化後、ＤＮＡポ
リメラーゼにより平滑末端化した後Ｔ４リガーゼにてそ
の平滑末端部分を連結し、ＰｓｔＩ切断点を無くし、次
いでＡｐａＬＩとＥｃｏＲＩで消化して、４．０ｋｂの
ＡｐａＬＩ−ＥｃｏＲＩ断片を得た。この４．０ｋｂ
ＡｐａＬＩ−ＥｃｏＲＩ断片に図８に示す合成ヌクレオ
チド９０ｂｐ ＡｐａＬＩ−ＥｃｏＲＩ断片を連結し、
ｐＨＴ２１０を得た（図７）。ｐＨＴ２１０のマルチク
ローニングサイト部分に外来遺伝子をアミノ酸の読み取
りが合う様に（ｉｎ ｆｒａｍｅ）挿入し、Ｂ．ｂｒｅ
ｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換することにより、プラス
ミドｐＨＴ２１０Ｘを保有し目的遺伝子産物を多量に分
泌生産する組換え体を得た。
【００３１】［実施例２］
【００３２】［（５）ｐＨＴ１１０・ＢＬＡの構築（図
９）］ｐＨＹ４８３１をＡｐａＬＩとＢｃｌＩで消化し
て、ＭＷＰのシグナルペプチドの一部とＢ．ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子とを含む１．
７ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢｃｌＩ断片を得た。一方、ｐＨ
Ｔ１１０をＡｐａＬＩとＢａｍＨＩで消化して、２．８
Ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。この断片と
先に得た１．７Ｋｂ断片とをＴ４リガーゼで連結し、
Ｂ．ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１を形質転換した。組換え体
よりプラスミドｐＨＴ１１０．ＢＬＡを得た。
９）］ｐＨＹ４８３１をＡｐａＬＩとＢｃｌＩで消化し
て、ＭＷＰのシグナルペプチドの一部とＢ．ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子とを含む１．
７ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢｃｌＩ断片を得た。一方、ｐＨ
Ｔ１１０をＡｐａＬＩとＢａｍＨＩで消化して、２．８
Ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。この断片と
先に得た１．７Ｋｂ断片とをＴ４リガーゼで連結し、
Ｂ．ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１を形質転換した。組換え体
よりプラスミドｐＨＴ１１０．ＢＬＡを得た。
【００３３】［（６）ｐＨＴ２１０・ＢＬＡの構築（図
１０）］ｐＨＹ４８３１をＡｐａＬＩとＢｃｌＩで消化
し、ＭＷＰのシグナルペプチドの一部とＢ．ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子を含み１．７
ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢｃｌＩ断片を得た。ｐＨＴ２１０
をＡｐａＬＩとＢａｍＨＩで消化し、３．９ｋｂ Ａｐ
ａＬＩ−ＢａｍＨＩ断片を得、これと先に得た１．７ｋ
ｂ断片をＴ４リガーゼにて連結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ
ＨＰＤ３１を形質転換した。組換え体よりプラスミドｐ
ＨＴ２１０・ＢＬＡを得た。
１０）］ｐＨＹ４８３１をＡｐａＬＩとＢｃｌＩで消化
し、ＭＷＰのシグナルペプチドの一部とＢ．ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓのα−アミラーゼ遺伝子を含み１．７
ｋｂ ＡｐａＬＩ−ＢｃｌＩ断片を得た。ｐＨＴ２１０
をＡｐａＬＩとＢａｍＨＩで消化し、３．９ｋｂ Ａｐ
ａＬＩ−ＢａｍＨＩ断片を得、これと先に得た１．７ｋ
ｂ断片をＴ４リガーゼにて連結し、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ
ＨＰＤ３１を形質転換した。組換え体よりプラスミドｐ
ＨＴ２１０・ＢＬＡを得た。
【００３４】［実施例３］
【００３５】［（７）ｐＨＴ１１０・ＢＬＡ、ｐＨＴ２
１０・ＢＬＡを用いてのＢＬＡの分泌生産］ｐＨＴ１１
０・ＢＬＡ、ｐＨＴ２１０・ＢＬＡを保持するＢ．ｂｒ
ｅｖｉｓＨＰＤ３１を５′ＰＹ培地（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９（１９８９））に接
種し、３０℃で６日間振とう培養した。この培養液を遠
心分離し、その上清のアミラーゼ活性を可溶性澱粉を基
質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０（１９７３））を用いて
測定し、下記表１の結果を得た。
１０・ＢＬＡを用いてのＢＬＡの分泌生産］ｐＨＴ１１
０・ＢＬＡ、ｐＨＴ２１０・ＢＬＡを保持するＢ．ｂｒ
ｅｖｉｓＨＰＤ３１を５′ＰＹ培地（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９（１９８９））に接
種し、３０℃で６日間振とう培養した。この培養液を遠
心分離し、その上清のアミラーゼ活性を可溶性澱粉を基
質として斎藤の方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．，１５５，２９０（１９７３））を用いて
測定し、下記表１の結果を得た。
【００３６】
【表１】
【００３７】培養上清からα−アミラーゼを山形らの方
法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９〜１
２４５（１９８７））に従い、ＳＤＳ・ＰＡＧＥ上一本
のバンドになるまで精製を行った。本アミラーゼ精製品
の比活性は１×１０６Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであ
り、上記培養液（ｐＨＴ１１０・ＢＬＡ−６日、ｐＨＴ
２１０・ＢＬＡ−６日）にはそれぞれ４．５ｇ／Ｌのア
ミラーゼが分泌されていることになる。これに対して、
α−アミラーゼ（ＢＬＡ）の生産量は、従来法（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ４７／ｐＮＵ１００：従来の
技術の項において記載した、塚越規弘、日本農芸化学会
誌、６１、６８（１９８７））においては、わずか０．
７ｇ／Ｌにすぎず、本発明によって予想をはるかにこえ
た格別顕著な効果が奏されることが確認された。
法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，１２３９〜１
２４５（１９８７））に従い、ＳＤＳ・ＰＡＧＥ上一本
のバンドになるまで精製を行った。本アミラーゼ精製品
の比活性は１×１０６Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであ
り、上記培養液（ｐＨＴ１１０・ＢＬＡ−６日、ｐＨＴ
２１０・ＢＬＡ−６日）にはそれぞれ４．５ｇ／Ｌのア
ミラーゼが分泌されていることになる。これに対して、
α−アミラーゼ（ＢＬＡ）の生産量は、従来法（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ４７／ｐＮＵ１００：従来の
技術の項において記載した、塚越規弘、日本農芸化学会
誌、６１、６８（１９８７））においては、わずか０．
７ｇ／Ｌにすぎず、本発明によって予想をはるかにこえ
た格別顕著な効果が奏されることが確認された。
【００３８】［実施例４］
【００３９】［（８）ｐＨＴ１１０．ＥＧＦの構築（図
１２）］図１１に示すＭＷＰシグナルペプチドの一部及
びＥＧＦ構造遺伝子部分を含む１９４ｂｐ ＡｐａＬＩ
−ＢａｍＨＩ断片を合成した。ｐＨＴ１１０をＡｐａＬ
ＩとＢａｍＨＩで消化して、３．３５ｋｂ ＡｐａＬＩ
−ＢａｍＨＩ断片を得、これと上記によって合成した１
９４ｂｐ断片とをＴ４リガーゼを用いて連結し、Ｂ．ｂ
ｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換した。組換え体より
プラスミドｐＨＴ１１０・ＥＧＦを得た。
１２）］図１１に示すＭＷＰシグナルペプチドの一部及
びＥＧＦ構造遺伝子部分を含む１９４ｂｐ ＡｐａＬＩ
−ＢａｍＨＩ断片を合成した。ｐＨＴ１１０をＡｐａＬ
ＩとＢａｍＨＩで消化して、３．３５ｋｂ ＡｐａＬＩ
−ＢａｍＨＩ断片を得、これと上記によって合成した１
９４ｂｐ断片とをＴ４リガーゼを用いて連結し、Ｂ．ｂ
ｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１を形質転換した。組換え体より
プラスミドｐＨＴ１１０・ＥＧＦを得た。
【００４０】［実施例５］
【００４１】［（９）ｐＨＴ１１０・ＥＧＦを用いての
ｈ−ＥＧＦの生産］ ｐＨＴ１１０・ＥＧＦを保持するＢ．ｂｒｅｖｉｓ Ｈ
ＰＤ３１及び対照となるＢ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１
を５′ＰＹ培地を用いて３０℃で６日間振とう培養を行
った。その培養液を遠心分離し、上清のヒトＥＧＦ濃度
を抗ヒトＥＧＦ血清を用いたＥＬＩＳＡ法により求め
た。その結果を下記の表２に示す。その結果から明らか
なように、本発明によれば、ｈ−ＥＧＦの生産量は３．
２９ｇ／Ｌに達する。これに対して、従来法（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１／ｐＮＵ２００：
従来の技術の項において記載した、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５８９〜３５
９３（１９８９））においては、わずか０．２４ｇ／Ｌ
にすぎず、これでは工業生産レベルには到底到達し得な
い。このように、本発明によれば、ｈ−ＥＧＦといった
ヒト由来のホルモンが工業生産可能なレベルにまで製造
することが可能となり、全く予測し得なかった量の外来
遺伝子の生産量の増加がもたらされ、本発明によって予
想をはるかにこえた格別顕著な効果が奏されることが確
認された。
ｈ−ＥＧＦの生産］ ｐＨＴ１１０・ＥＧＦを保持するＢ．ｂｒｅｖｉｓ Ｈ
ＰＤ３１及び対照となるＢ．ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１
を５′ＰＹ培地を用いて３０℃で６日間振とう培養を行
った。その培養液を遠心分離し、上清のヒトＥＧＦ濃度
を抗ヒトＥＧＦ血清を用いたＥＬＩＳＡ法により求め
た。その結果を下記の表２に示す。その結果から明らか
なように、本発明によれば、ｈ−ＥＧＦの生産量は３．
２９ｇ／Ｌに達する。これに対して、従来法（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１／ｐＮＵ２００：
従来の技術の項において記載した、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５８９〜３５
９３（１９８９））においては、わずか０．２４ｇ／Ｌ
にすぎず、これでは工業生産レベルには到底到達し得な
い。このように、本発明によれば、ｈ−ＥＧＦといった
ヒト由来のホルモンが工業生産可能なレベルにまで製造
することが可能となり、全く予測し得なかった量の外来
遺伝子の生産量の増加がもたらされ、本発明によって予
想をはるかにこえた格別顕著な効果が奏されることが確
認された。
【００４２】
【表２】
【００４３】
【発明の効果】本発明により、バチルス・ブレビス由来
の高発現ベクターを開発した。この高発現ベクターは目
的とする外来遺伝子を挿入することが可能であるので、
このベクターにより形質転換した微生物を培養すること
により、目的とする各種の外来遺伝子産物を菌体外に著
量分泌生産することができる。
の高発現ベクターを開発した。この高発現ベクターは目
的とする外来遺伝子を挿入することが可能であるので、
このベクターにより形質転換した微生物を培養すること
により、目的とする各種の外来遺伝子産物を菌体外に著
量分泌生産することができる。
【図１】ｐＨＴ９２６の制限酵素地図である。
【図２】ｐＨＴ１００の構築図である。
【図３】ｐＨＴ１００の制限酵素地図である。
【図４】ｐＨＴ１１０の構築図である。
【図５】マルチクローニングサイトを有する１１０ｂｐ
合成ヌクレオチドを示す。
合成ヌクレオチドを示す。
【図６】ｐＨＴ２１０の構築図である。
【図７】ｐＨＴ２１０の制限酵素地図である。
【図８】マルチクローニングサイトを有する１９４ｂｐ
合成ヌクレオチドを示す。
合成ヌクレオチドを示す。
【図９】ｐＨＴ１１０ ＢＬＡの構築図である。
【図１０】ｐＨＴ２１０ ＢＬＡの構築図である。
【図１１】ヒト−ＥＧＦ構造遺伝子に相当する合成ヌク
レオチドを示す。
レオチドを示す。
【図１２】ｐＨＴ１１０ ＥＧＦの構築図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:08）
Claims (7)
- 【請求項１】 下記の制限酵素地図で示されるプラスミ
ドｐＨＴ９２６、 ＨＷＰプロモーター、及び、下記に示されるマルチクロ
ーニングサイトを有する塩基配列を含有し、 下記の制限酵素地図で示される高発現ベクターｐＨＴ１
１０。 - 【請求項２】 下記の制限酵素地図で示されるプラスミ
ドｐＨＴ９２６、 ＨＷＰプロモーター、及び、下記に示されるマルチクロ
ーニングサイトを有する塩基配列を含有し、 下記の制限酵素地図で示される高発現ベクターｐＨＴ２
１０。 - 【請求項３】 請求項１に記載の高発現ベクターｐＨＴ
１１０に外来遺伝子を結合してなる高発現ベクターｐＨ
Ｔ１１０Ｘ。 - 【請求項４】 請求項２に記載の高発現ベクターｐＨＴ
２１０に外来遺伝子を結合してなる高発現ベクターｐＨ
Ｔ２１０Ｘ。 - 【請求項５】 請求項３又は４に記載の高発現ベクター
ｐＨＴ１１０Ｘ又はｐＨＴ２１０Ｘを保有するバチルス
・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）。 - 【請求項６】 バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ）が、高発現ベクターｐＨＴ１１０Ｘ又
はｐＨＴ２１０Ｘを保有するバチルス・ブレビスＨＰＤ
３１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＨＰＤ３１）
であること、を特徴とする請求項５に記載のバチルス・
ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）。 - 【請求項７】 請求項３又は４に記載の高発現ベクター
ｐＨＴ１１０Ｘ又はｐＨＴ２１０Ｘを保有するバチルス
・ブレビスを培養することにより外来遺伝子産物を培養
物中に生成、蓄積せしめ、これを採取すること、を特徴
とする該産物の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4216605A JP2727391B2 (ja) | 1992-07-23 | 1992-07-23 | 高発現ベクター及び該高発現ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS63294788A (ja) * | 1987-05-27 | 1988-12-01 | Nikka Uisukii Kk | ベクタ−、遺伝子の検出方法及び蛋白質の発現方法 |
-
1992
- 1992-07-23 JP JP4216605A patent/JP2727391B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
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| US7332331B2 (en) | 2001-02-14 | 2008-02-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Plasmid shuttle vector between Escherichia coli and Brevibacillus |
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| JPH06133782A (ja) | 1994-05-17 |
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