JP3489865B2 - ヒト成長ホルモンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、異種遺伝子としてヒト
成長ホルモン（以下、「ｈＧＨ」と略記する場合もあ
る）をコードするＤＮＡを保持したバチルス・ブレビス
（Bacillus brevis）によるｈＧＨの製造法、ならびに
前記ＤＮＡおよびそのＤＮＡを保持したバチルス・ブレ
ビスに関する。

【０００２】

【従来の技術】ｈＧＨは１９１個のアミノ酸からなり、
そのアミノ酸配列は既に明らかにされている（Bancrof
t,F.C., Expl.Cell Res.,79,275-278(1973)または、Dav
id V.Goeddel ら，Nature, 281,544-548(1979)参
照）。本物質は、成長促進、脂肪代謝及び糖代謝作用等
を有することから小人症等の治療薬として古くから利用
され、さらに近年は老人性痴呆症の治療薬としても注目
されている。

【０００３】今日まで多くの組換えＤＮＡ研究は、大腸
菌（E.coli）を用いて成されており、既に多くの異種蛋
白質が大腸菌内で生産されている。しかし、この方法で
は、生産された異種蛋白質は菌体内に蓄積されるため、
目的産物の菌体からの抽出及びその抽出液からの精製に
多大の時間と労力を要するだけでなく、目的とする物質
を完全な形で純粋に得ることが容易ではない。

【０００４】一方、バチルス属に属する微生物は、古く
から種々の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用され
ている。これら菌体外酵素のうち、バチルス・アミロリ
クイフアシエンス（Bacillus amyloliquefaciens ) の
α−アミラーゼ遺伝子（I.Palva ら，Gene, 22,229(198
3)) 、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus lichen
iformis ）のペニシリナーゼ遺伝子（S.Chang ら，Mole
cular Cloning and Gene Regulation in Bacilli,Acade
mic Press,659,(1982)) や枯草菌（Bacillussubtilis)
のα−アミラーゼ遺伝子（H.Yamazakiら， J.Bacterio
l., 156,327(1983)) などが既にクローン化され、これ
らのプロモーター或いはシグナルペプチドを利用した異
種蛋白質の分泌生産が報告されている。

【０００５】上記したバチルス属菌における異種蛋白質
の分泌生産には、主に枯草菌が宿主として用いられてい
るが、この微生物は菌体外プロテアーゼを多量に生産す
るため、組換えＤＮＡ技術により分泌された異種蛋白質
は分解を受け、その蓄積量は著しく減少する傾向があ
る。

【０００６】これに対し、鵜▲高▼らは菌体外にプロテ
アーゼをほとんど生産しないバチルス・ブレビス４７
（特開昭６０−５８０７４号、同６２−２０１５８３号
公報；ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）を宿主とし、そして本
菌株の主要菌体外蛋白質の一つであるＭＷＰ（Middle W
all Protein)(H.Yamagata ら， J.Bacteriol., 169,123
9(1987) 、塚越規弘、日本農芸化学会誌、61,68(1987)
参照) のプロモーター及びシグナルペプチドを利用し
て、α−アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８３号公
報、H.Yamagataら， J.Bacteriol., 169,1239(1987))や
ブタペプシノーゲン（鵜▲高▼重三、日本農芸化学会昭
和６２年度大会講演要旨集ｐ８３７−ｐ８３８；塚越規
弘、日本農芸化学会誌、61,68(1987))の分泌生産に成功
している。

【０００７】また、鵜▲高▼らはバチルス・ブレビスの
菌体外プロテアーゼを生産しない菌株バチルス・ブレビ
スＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７) を分離し、
これを宿主として耐熱性α−アミラーゼ( 特開昭６３−
５６２７７号公報、日本農芸化学会昭和６２年度大会講
演要旨集、ｐ２７）、ヒトＥＧＦ（H.Yamagataら， Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA , 86,3589(1989) 、特開平２−３
１６８２号公報）の高分泌生産に成功している。

【０００８】ｈＧＨについては、大腸菌（David V.Goed
del ら，Nature, 281,544-548(1979),Chang C N. ら，
Gene, 55,189-196(1987)) 、枯草菌(M.Honjoら、J.Biot
ech.,6 ，191-204(1987))、酵母（R.Hiramatsu ら，App
l.Environ.Microbiol. , 57,2052-2056(1991)) 、動物
細胞（Lupker J H. ら，Gene, 24,281-287(1983)) を宿
主とした生産が既に報告されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】前述のように大腸菌、
酵母及び動物細胞などを宿主としてｈＧＨの生産が試み
られているが、いずれも精製の煩雑さや生産性などの点
で満足できるものとはいいがたい。したがって、本発明
の目的は、ｈＧＨの効率のよい生産を可能にする宿主−
ベクター系を提供すること、ならびにそれらを使用する
ｈＧＨの効率のよい製造法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】鵜▲高▼らは、異種蛋白
質生産のための宿主−ベクター系の開発を行ってきた
が、宿主としてバチルス・ブレビスが有利に使用できる
ことを見い出し、数種の異種蛋白質生産への利用を提案
してきた（例えば、前記特開昭６３−５６２７７号公
報）。一方、これらの宿主菌でｈＧＨをコードするＤＮ
Ａを効率よく発現できる組換えプラスミドを作出すべく
研究を重ねたところ、宿主菌となるバチルス・ブレビス
に由来するプロモーターや、分泌に必要なＤＮＡを特定
の態様で使用すると、ｈＧＨの発現にも有効であること
を見い出した。

【００１１】したがって、前記課題は、バチルス・ブレ
ビス由来のプロモーター領域を含有するＤＮＡの３′末
端にｈＧＨをコードするＤＮＡを結合させた組換えＤＮ
Ａの使用によって解決される。すなわち、本発明によれ
ば、前記組換えＤＮＡ、その組換えＤＮＡを保持するバ
チルス・ブレビス及びかかるバチルス・ブレビスを栄養
培地に培養することにより、培養物からｈＧＨを採取す
ることを特徴とするｈＧＨの製造法が提供される。

【００１２】

【具体的な態様】本発明で使用するｈＧＨをコードする
ＤＮＡは、直接ヒトの脳下垂体から分離されたＤＮＡの
他、公知のｈＧＨのアミノ酸配列に基づき化学合成され
たＤＮＡ（Ikehara ら， Proc.Natl.Acad.Sci.USA , 8
1,5956(1984))のいずれでもよい。プロモーターは、バ
チルス・ブレビス（以下、「Ｂ・ブレビス」と略記する
場合もある）で機能するものであればＢ・ブレビスに属
するいずれの株に由来するものも使用できる。

【００１３】例えば、具体的なものとしてはＢ・ブレビ
ス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）またはブレビスＨＰ
Ｄ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）の主要菌体外蛋白
質遺伝子のプロモーターが挙げられる。プロモーター領
域を含有するＤＮＡは、上記プロモーター以外に、ＳＤ
配列、翻訳開始コドンなどを有していることが必要であ
り、さらに主要菌体外蛋白質遺伝子の一部を含んでいて
もよい。

【００１４】これらのプロモーター領域を含有するＤＮ
Ａの３′末端にｈＧＨをコードするＤＮＡを結合させる
には、Ｂ・ブレビスの染色体から切り出してきたＤＮＡ
（T.Adachiら、J.Bacteriol ., 171 , 1010-1016(198
9) の３′末端にｈＧＨをコードするＤＮＡを結合させ
ればよい。ｈＧＨはＢ．ブレビスの菌体内、菌体外のい
ずれに蓄積されてもよいが、菌体外にｈＧＨを蓄積する
場合、プロモーター領域を含有するＤＮＡの３′末端側
にシグナルペプチドをコードする領域も含まれている必
要がある。シグナルペプチドとしては、例えば、Ｂ・ブ
レビス４７あるいはＢ・ブレビスＨＰＤ３１の主要菌体
外蛋白質のシグナルペプチドなどが挙げられる。特に、
Ｂ・ブレビス４７のＭＷＰ（Middle Wall Protein)のシ
グナルペプチドはその一例である。

【００１５】前記プロモーター領域を含有し、ｈＧＨ遺
伝子の発現に用いる発現ベクターとしては、例えばｐＨ
Ｙ５００，ｐＮＵ２００（特開平２−３１６８２号公
報、鵜▲高▼重三、日本農芸化学会誌、61,669(1987))
などが挙げられる。これらの発現ベクターと上記ＤＮＡ
を用いてｈＧＨ発現プラスミドを構築する方法は、例え
ば、Molecular Cloning 2nd.Ed.,A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory(1990))に記載される
ように当該技術分野で既知であり、これらの方法に従っ
て目的の組換えＤＮＡ（ｈＧＨ発現プラスミド）を構築
することができる。

【００１６】かかる、ｈＧＨ発現プラスミドの好ましい
ものとしては、後述の実施例で調製されるようなｐＮＵ
２００−ＧＨなどを挙げることができる。プラスミドの
構築に用いる宿主としては、大腸菌、枯草菌、Ｂ・ブレ
ビスに属する微生物であればいずれでも良く、例えば大
腸菌ＨＢ１０１、大腸菌ＪＭ１０９、枯草菌ＲＭ１４１
（ J.Bacteriol., 158,1054(1984))、Ｂ・ブレビス４７
（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）などが挙げられる。

【００１７】また遺伝子の発現に用いる宿主としては、
Ｂ・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）、Ｂ・ブ
レビス４７−５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６６４） 、Ｂ・
ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７) を始
めとする前記プラスミドの発現により生産されるｈＧＨ
に対して宿主自体が著しい悪影響を与えないものであれ
ばいずれも使用できる。特に、好ましいものとしては、
Ｂ・ブレビスＨＰＤ３１からの変異処理で得られたＢ・
ブレビス３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３) を挙
げることができる。この変異菌は、ｈＧＨに対してプロ
テアーゼ活性を実質的に示さないので、培養物（特に、
菌体外）中に産生、蓄積したｈＧＨを安定に維持でき
る。

【００１８】宿主Ｂ・ブレビスを、前記ｈＧＨ発現プラ
スミドで形質転換するには、例えばTakahashi らの方法
（ J.Bacteriol., 156,1130(1983))あるいはエレクトロ
ポレーションによる方法（H.Takagiら、Agric.Biol.Che
m., 53, 3099-3100(1989))などに記載される方法に従え
ばよい。こうして創製される形質転換体は、それらを栄
養培地で培養することにより、ｈＧＨを多量に生産しそ
の大部分は菌体外に分泌する。なお、宿主としてＢ・ブ
レビス３１−ＯＫを使用した場合には、菌体外に分泌さ
れたｈＧＨが安定に維持できるので、培養物からｈＧＨ
を効率よく採取することが可能になる。

【００１９】培養に用いる栄養培地には炭素源、窒素源
の他、無機塩類が必要に応じて含められる。また、糖と
無機塩類を主とする合成培地を用いて培養してもよい。
栄養要求性を示す菌株を用いる場合には、その生育に必
要な栄養物質を培地に添加することが望ましい。さら
に、必要であれば、培地に抗生物質や消泡剤などを加え
てもよい。培養条件としては、培地の初発pHを５．０〜
９．０、好ましくは６．５〜７．５に調節する。培養温
度は、通常１５℃〜４２℃、好ましくは２４〜３７℃で
あり、培養時間は通常１６〜３６０時間、好ましくは２
４〜１４４時間である。

【００２０】培養終了後、培養物からｈＧＨを採取する
には、例えば遠心分離、ろ過などで菌体と上清を分離す
る。菌体内に産生されたｈＧＨは、当該技術分野におけ
る常法、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法などに
より菌体を破砕し、さらに必要ならば界面活性剤を加え
ることにより抽出される。次いで、このようにして得ら
れた培養上清または菌体抽出液中に含まれるｈＧＨは、
常用されている蛋白質精製法、例えば塩析、等電点沈
澱、ゲルろ過、イオン交換、逆層などの各種クロマトグ
ラフィーなどにより精製され、目的とするｈＧＨを得る
ことができる。

【００２１】得られたｈＧＨは、抗ｈＧＨ抗体を用いた
酵素免疫測定法、あるいはＨＰＬＣを用いて定量するこ
とができる。また３Ｔ３−Ｌ１細胞に対する脂肪細胞分
化活性（細胞培養の技術（第２版）日本組織培養学会
編）からもｈＧＨを定量することができる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。実施例１ ．ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現ベクターの
構築及び形質転換体の調 製 プラスミドｐＧＨ−Ｌ９(Ikeharaら， Proc.Natl.Acad.
Sci.USA .,81,5956-5960(1984)参照) よりｈＧＨをコー
ドする５６５ｂｐ ＨｉｎｆＩ−ＳａｌＩ断片を単離し
た。ＭＷＰのシグナルペプチドとｈＧＨとを連結するた
めに、ＤＮＡリンカーを化学合成した。その合成リンカ
ーと前記のｈＧＨ遺伝子を含むＨｉｎｆＩ−ＳａｌＩ断
片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、５９６ｂｐ Ｎ
ｃｏＩ−ＳａｌＩ断片を得た。

【００２３】一方、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ
Ｐ−７２２４）の主要膜蛋白質の一つＭＷＰ（Middle
Wall Protein)のシグナルペプチドの内、Ｃ末端領域を
含むプラスミドｐＢＲ−ＡＮ２（特開平２−２５７８７
６号公報参照）から２７ｂｐＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片を
除去し、これに上記の５９６ｂｐ ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ
断片を挿入してプラスミドｐＢＲ−ＡＮ２−ＧＨを得
た。

【００２４】プラスミドｐＢＲ−ＡＮ２−ＧＨを、制限
酵素ＡｐａＬＩ，ＨｉｎｄIII で処理して６５６ｂｐ
ＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄIII 断片を単離した。一方、プラ
スミドｐＮＵ２００（鵜▲高▼重三、日本農芸化学会
誌、61,669-676(1987)参照）を制限酵素ＡｐａＬＩ，Ｈ
ｉｎｄIII で切断し、その大きい断片と上記６５６ｂｐ

【００２５】ＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄIII 断片とをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結させた反応液を用いて、Takahashi
らの方法（ J.Bacteriol., 156,1130(1983) 参照) によ
ってバチルス・ブレビス４７−５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
６６４，ＩＦＯ １４６９８) の形質転換を行った。得
られたエリスロマイシン耐性の形質転換体からアルカリ
抽出法（ Molecular Cloning 2nd ed.,A laboratory Ma
nual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)参照) によ
ってプラスミドを単離し、これをｐＮＵ２００−ＧＨと
命名した。

【００２６】さらに、プラスミドｐＮＵ２００−ＧＨを
制限酵素ＡｐａＬＩ，ＢｃｌＩで切断し、ｈＧＨ遺伝子
を含むＡｐａＬＩ−ＢｃｌＩ断片を得た。また、ＭＷＰ
シグナル配列（図５（ＭＷＰ）；配列番号：１）の疎水
領域にＬｅｕ３個、正電荷領域にＡｒｇ２個を付加した
改良シグナル配列Ｒ２Ｌ４（図５（Ｒ２Ｌ４）；配列番
号：２）を有するプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４を制限酵素
ＡｐａＬＩ，ＢｃｌＩで切断し、得られた約３．８ｋｂ
ｐ ＡｐａＬＩ−ＢｃｌＩ断片と上記ｈＧＨ遺伝子を含
むＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、プラス
ミドｐＮＵＲ２Ｌ４−ＧＨを得た。

【００２７】上記のプラスミドｐＮＵ２００−ＧＨ及び
ｐＮＵＲ２Ｌ４−ＧＨを Takahashiの方法（ J.Bacteri
ol., 156,1130(1983) 参照）によりバチルス・ブレビス
３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７３) に導入し、形
質転換体を得た。得られた形質転換体の中から安定株を
分離し、これをバチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ
２００−ＧＨ）及びバチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐ
ＮＵＲ２Ｌ４−ＧＨ）と命名した。

【００２８】実施例２．形質転換体の培養およびｈＧＨ
の分泌生産 実施例１で得られた形質転換体バチルス・ブレビス３１
−ＯＫ（ｐＮＵ２００−ＧＨ）、バチルス・ブレビス３
１−ＯＫ（ｐＮＵＲ２Ｌ４−ＧＨ）及びその対照となる
バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００）、バチ
ルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵＲ２Ｌ４）をポリペ
プトン３％、酵母エキス０．２％、グルコース３％、Ｍ
ｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０１％、ＣａＣｌ₂ ・７Ｈ₂
Ｏ ０．０１％、ＭｎＳＯ₄ ・４Ｈ₂ Ｏ ０．００１
％、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ₄
・７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％およびエリスロマイシン１
０mg／Ｌ（pH７．２）からなる培地で３０℃、３〜６日
間培養した。

【００２９】上記培養液を遠心分離し、その上清のｈＧ
Ｈ濃度を抗ｈＧＨ抗体を用いた酵素免疫測定法により求
めた（表１）。なお、ｈＧＨの標準品としては、 Biopr
oducts社（生化学工業（株））から購入した物を用い
た。

【００３０】

【表１】

【００３１】次に、上記の培養上清を Laemmliの方法
（Nature, 227,680(1970)参照) に準じてＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、Burnetteの方
法（Anal.Biochem.,112,195(1981) 参照) に準じて抗ｈ
ＧＨ抗体を用いてウェスタンブロティングを行った。そ
の結果、バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００
−ＧＨ）およびバチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ
Ｒ２Ｌ４−ＧＨ）の培養上清にはｈＧＨが認められ、そ
の分子量は標準品のそれと一致した（図１）。

【００３２】実施例３．ｈＧＨの精製 実施例２で得られた培養上清１００mlを限外ろ過（Fitr
on,Minisette Omega,10k cutoff)により前処理した後、
イオン交換（Pharmacia)、逆層（Pharmacia)、逆層（Wa
ters) の各クロマトグラフィーの順に精製してｈＧＨの
精製標品２．３ｍｇを得た。

【００３３】実施例４．ｈＧＨ精製標品の性質 実施例３で得られたｈＧＨ精製標品の諸特性は以下の通
りであった。 ＨＰＬＣの保持時間 逆層ＨＰＬＣで調べた結果、得られたｈＧＨ精製標品は
ほぼ単一であり（図２）、その保持時間はｈＧＨ標準品
(Bioproducts社製) のそれと一致した。 ＰＡＧＥ ０．１％ＳＤＳを含む１６％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で調べた結果、還元条件下、非還元条件下のいず
れの場合も、精製標品は標準品と同じ挙動を示した（図
３）。

【００３４】 Ｎ末端アミノ酸配列 パルスリキッド自動エドマン分解（Applied Biosystems
社製、４７３Ａ型）により精製標品のＮ末端アミノ酸配
列を調べた結果、精製標品の配列は文献（Bancroft,F.
C., Expl.Cell Res.,79,275-278(1973),David V.Goedde
lら，Nature, 281,544-548(1979)参照) のそれと、下
記のとおり一致した。

【００３５】

【表２】

【００３６】 生物活性 ３Ｔ３−Ｌ１細胞に対する脂肪細胞への分化能を指標と
してｈＧＨの生物活性（日本組織培養学会編、組織培養
の技術（第２版）ｐ110-115 参照) を調べた結果、精製
標品は標準品と同等の生物活性を有していた（図４）。

【００３７】参考例１．バチルス・ブレビス（Bacillus
brevis)３１−ＯＫの創製 実施例１で得たプラスミドｐＮＵ２００−ＧＨを、Taka
hashi らの方法により親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３
１（特開昭６３−５６２７７号公報、ＦＥＲＭＢＰ−１
０８７）に導入し、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐ
ＮＵ２００−ＧＨ）を得た。その形質転換体をＴ２培地
に希釈懸濁し、Ｔ２プレートに塗抹した後、紫外線（２
Ｊ／ｍ² ）に暴露した。

【００３８】３０℃で一晩培養し、得られたコロニーを
５ＹＣ培地に植菌し、３０℃で６日間培養した。３日目
と６日目の培養液を採取し、培養上清液中に含まれるｈ
ＧＨ量を酵素免疫測定法により測定した。この際に、３
日目から６日目にかけて培養上清中のｈＧＨ量が増加し
ている１株を選択分離した。変異株と親株を比較する
と、親株では培養上清中のｈＧＨ量が３日目から６日目
にかけて減少するのに対して、得られた変異株は、３日
目以降もｈＧＨ量が増加するという顕著な違いを示し
た。変異株よりプラスミドを除去するために、変異株を
エリスロマイシンを含まないＴ２培地で繰り返し継代培
養した後、エリスロマイシン感受性でかつｈＧＨを生産
しない株が容易に得られた。本菌株をバチルス・ブレビ
ス３１−ＯＫと命名した。

【００３９】バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４５７３）の菌学的性質は、親菌株バチルス・
ブレビスＨＰＤ３１（特開昭６３−５６２７７号公報参
照）と特定の異種蛋白質に対する作用が異なる点を除き
ほぼ同様な性状を示した。以下に、その主要な性質を示
す。

【００４０】

【００４１】

【００４２】 ゼラチンの分解 − グルコースから酸の生成 − キシロース分解 − ラクトース分解 − マルトース分解 − アルギニン加水分解 − 生育できる pH ５．５〜８．５

【００４３】形態的性質 細胞の大きさ 液体培地；０．９〜１．２×
３．９〜５．８μｍ 寒天培地；０．９〜１．２×２．９〜４．２μｍ 細胞の形 桿菌 細胞の多形性の有無 無 運動性の有無 有

【００４４】参考例２．プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４の調
製 （１）プラスミドＭ１３ＭＷＰの構築 ｐＮＵ２００を制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄIII(宝酒
造社製）で消化し、得られた約６７０ｂｐのＤＮＡ断片
を、プラスミドＭ１３ｍｐ１８をＥｃｏＲＩ，Ｈｉｎｄ
III で消化したものに挿入し、プラスミドＭ１３ＭＷＰ
を得た。ＭＷＰプロモーターからシグナル配列までの塩
基配列は図５（ＭＷＰ）（配列番号：１）に示した。

【００４５】（２）プラスミドＭ１３Ｒ２の構築 前記で得たＭ１３ＭＷＰ一本鎖ＤＮＡを鋳型として、合
成プライマーＲ２（図６）（配列番号：３）を用いて部
位特異的変異を行った。部位特異的変異はアマーシャム
キット (Oligonucleotide-directed in vitro mutagene
sis system, Amersham) によった。次にＤＮＡの塩基配
列を確認し、得られた目的のプラスミドをＭ１３Ｒ２と
した。

【００４６】（３）プラスミドＭ１３Ｌ４の構築 プラスミドＭ１３ＭＷＰ一本鎖ＤＮＡを鋳型として、合
成プライマーＬ４（図６）（配列番号：４）を用いて参
考例２−（２）と同様の方法にてプラスミドＭ１３Ｌ４
を得た。 （４）プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４の構築 （２）で得たＭ１３Ｒ２をＥｃｏＲＩ，ＨｐａＩで消化
し、得られた２２８ｂｐのＤＮＡ断片を（３）で得たＭ
１３Ｌ４をＨｐａＩ，ＨｉｎｄIII で消化し得られた１
０８ｂｐのＤＮＡ断片とを、ｐＮＵ２００をＥｃｏＲ
Ｉ，ＨｉｎｄIIIで消化したものに挿入しプラスミドｐ
ＮＵＲ２Ｌ４を得た。本シグナル配列（Ｒ２Ｌ４）は図
５（Ｒ２Ｌ４）（配列番号：２）に示した。

【００４７】

【発明の効果】本発明によれば、ヒト成長ホルモン（ｈ
ＧＨ）を効率よく生産できる宿主−ベクター系が提供さ
れる。すなわち、宿主としてバチルス・ブレビスを使用
し、ｈＧＨ発現プラスミドとしてバチルス・ブレビス由
来のプロモーター領域を含有するＤＮＡの３′末端にｈ
ＧＨをコードするＤＮＡを結合させた組換えＤＮＡを使
用することによりｈＧＨを効率よく生産することができ
る。特に、宿主としてｈＧＨに対してプロテアーゼ活性
を実質的に示さない変異バチルス・ブレビスを使用する
ことが有利である。

【００４８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：バチルス・ブレビス (Bacillus brevis) 株名：４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４） 特徴：バチルス・ブレビス４７のＭＷＰのシグナル配列 配列 ATG AAA AAG GTC GTT AAC AGT GTA TTG GCT AGT GCA CTC GCA CTT 45 Met Lys Lys Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 ACT GTT GCT CCC ATG GCT TTC GCT GCAG 73 Thr Val Ala Pro Met Ala Phe Ala 20

【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：８８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 起源 プラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４ 特徴：バチルス・ブレビス４７のＭＷＰのシグナル配列
を改良したシグナル配列 配列 ATG AAA AAA AGA AGG GTC GTT AAC AGT GTA TTG CTT CTG CTA GCT 45 Met Lys Lys Arg Arg Val Val Asn Ser Val Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 AGT GCA CTC GCA CTT ACT GTT GCT CCC ATG GCT TTC GCT GCAG 88 Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro Met Ala Phe Ala 20 25

【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CACTGTTAAC GACCCTTCTT TTTTTCATGA CCTTGTGTTC 40

【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CCGTGCACTA GCTAGCAGAA GCAATACACT GTTAACG 37

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で得られた培養上清中のｈＧＨと標準
品ｈＧＨをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた後、ウェスタンブロッティングを行った結果を示
す。

【図２】実施例４で得られたｈＧＨ精製標品の逆層ＨＰ
ＬＣの結果を示す。（横軸は保持時間（分）を、↓はｈ
ＧＨが溶出した時間（分）を示す。）

【図３】実施例４で得られたｈＧＨ精製標品のＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターンを還元、非
還元の両条件で標準品のそれと比較した結果を示す。

【図４】実施例４で得られたｈＧＨ精製標品と標準品の
３Ｔ３−Ｌ１細胞に対する脂肪細胞への分化能を指標と
する生物活性を比較して示すグラフである。

【図５】バチルス・ブレビス４７のＭＷＰのシグナル配
列（ＭＷＰとして示す）（配列番号：１）、およびこの
ＭＷＰのシグナル配列を改良したシグナル配列（Ｒ２Ｌ
４として示す）（配列番号：２）を示す図である。

【図６】ＭＷＰのシグナル配列をコードするＤＮＡの部
位特異的変異に用いた合成プライマー（配列番号：３お
よび４）を図示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:08） (72)発明者 梶野 勉 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 太田 陽子 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 平井 正名 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 山田 幸生 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 星野 文彦 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41 番地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (56)参考文献 特開 平２−31682（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−257876（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−201583（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，1979年，Ｖｏｌ281, Ｎｏ．5732，ｐ．544−548 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｅ ｒｇｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｍ ｂｒａｎｅｓ，1990年，Ｖｏｌ．22， Ｎｏ．３，ｐ．233−269 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＰｕｂＭｅｄ

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス・ブレビス（Bacillus brevi
   s）由来のプロモーター領域を含有するDNAの３′末端に
   ヒト成長ホルモンをコードするDNAを結合させた組換えD
   NAであって、前記プロモーター領域を含有するDNAの
   ３′末端側にバチルス・ブレビス47のMWP(Middle Wall
   Protein）由来の改良シグナル配列R2L4のアミノ酸配列
   （配列番号：２）をコードするDNAが含まれている組換
   えDNA。
2. 【請求項２】 前記改良シグナル配列R2L4のアミノ酸配
   列（配列番号：２）をコードするDNAが配列番号：２のD
   NAである請求項１記載の組換えDNA。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載の組換えＤＮＡを
   保持するバチルス・ブレビス。
4. 【請求項４】 請求項３記載のバチルス・ブレビスを栄
   養培地で培養し、培養物からヒト成長ホルモンを採取す
   ることを特徴とするヒト成長ホルモンの製造法。
5. 【請求項５】 バチルス・ブレビス（Bacillus brevis)
   由来のプロモーター領域を含有するDNAの３′末端側に
   バチルス・ブレビス47のMWP由来の改良シグナル配列の
   アミノ酸配列（配列番号：２）をコードするDNAを有
   し、更に前記シグナル配列の３′末端側にヒト成長ホル
   モンをコードするDNAを結合させた組換えDNAを保持する
   バチルス・ブレビスを栄養培地で培養し、培養物からヒ
   ト成長ホルモンを採取することを特徴とするヒト成長ホ
   ルモンの製造法。
6. 【請求項６】 培養されるバチルス・ブレビスがバチル
   ス・ブレビス31-OK(FERM-4573）である、請求項４また
   は５記載のヒト成長ホルモンの製造法。