JP2717964B2 - グリチルリチンの製造法 - Google Patents
グリチルリチンの製造法Info
- Publication number
- JP2717964B2 JP2717964B2 JP62259656A JP25965687A JP2717964B2 JP 2717964 B2 JP2717964 B2 JP 2717964B2 JP 62259656 A JP62259656 A JP 62259656A JP 25965687 A JP25965687 A JP 25965687A JP 2717964 B2 JP2717964 B2 JP 2717964B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycyrrhizin
- licorice
- cultivation
- root
- months
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、トリテルペノイド系サポニンの一種である
グリチルリチンを製造する方法に関するものである。 グリチルリチンは抗アレルギー作用、抗炎症作用、抗
潰瘍作用等を有することが知られており、慢性肝炎の治
療等に広く使用されている。グリチルリチンはまた砂糖
の約300倍の甘味を有し、甘味料として醤油、漬物等、
食品の製造に多量に使用されるほか、タバコ等の着香料
としても使われている。 〔従来の技術〕 グリチルリチンは、マメ科の多年性植物である甘草
（Glycyrrhiza glabra Linn.,G.uralensis Fisher,G.in
flata Batal,G.lepidota Linn等の Glycyrrhiza属植
物）の根および根茎（以下、根部という）に含まれてい
る。したがって、グリチルリチンは、従来、野生の甘草
の根部から抽出し精製する方法により製造されてきた。
原料の甘草は日本国内に自生せず、すべて中国、ソ連、
アフガニスタン、パキスタン、トルコ等からの輸入品に
依存しているが、近年、上記甘草産出国における農業開
発その他の進展にともない甘草自生地が減少しており、
資源の枯渇が心配されている。 甘草を日本国内で栽培することもかって検討された
が、栽培地域、天候、収穫時期等によりグリチルリチン
含有量に大差を生じ、グリチルリチン原料として使用で
きるものを量的にも質的にも安定して得るのは困難であ
ること、栽培コストが高くつくこと、などが障害になっ
て、実施されるには至っていない。 このような現状を背景に、近年発達した植物組織培養
法を用いてグリチルリチンを製造する方法が検討され、
その成果の一つとして特開昭50−16440号公報には、甘
草をカルス化し、そのカルスからたばこ加香用甘草エキ
スを得る方法が記載されている。しかしながら、この方
法による甘草エキスには、天然の甘草エキスと比べる
と、グリチルリチンはごく微量しか含まれていないの
で、グリチルリチンとしての製造コストはきわめて高い
ものになる。また、特開昭53−91188号公報には、甘草
カルスを器官分化させ、その後にグリチルリチンを採取
する方法が記載されている。しかしながら、この方法
も、本発明者らの研究によれば、甘草カルスからの器官
分化はそれほど困難でないにしても、記載されているよ
うな著量のグリチルリチンの蓄積は認められないから、
特に有利な方法とは言えない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、上述のような現状に鑑み、供給に不
安のある天然の甘草に依存することなくグリチルリチン
を効率よく製造する方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明が提供するグリチルリチンの製造法は、甘草を
養液栽培し、得られた甘草の根部からグリチルリチンを
採取することを特徴とするものである。 養液栽培は、周知のように通常の土壌を全く使用しな
い栽培法であって、倍地の種類や培養液および空気の与
え方によって水耕法、空気耕法（噴霧耕法等）、固定倍
地耕法）砂耕法、くん炭耕法、ロックウール耕法等）が
あるが、本発明における養液栽培は根部を収穫するため
のものであるから、上記方法のなかでも根部を収穫し易
い水耕法、空気耕法等が特に適している。しかしなが
ら、後述する本発明の効果の点では、他のいずれの方法
によっても大差のない結果が得られるから、状況に応じ
て、任意の方法を採用することができる。 養液栽培された甘草は、その理由は明らかでないが、
特別の養液を用いなくても、通常の土壌で栽培されたも
のよりも根部の収量が多く、しかも、根部に含まれるグ
リチルリチンの量が多い。さらに、養液栽培の特長とし
て、栽培条件を人為的に好適条件に維持し易いから、甘
草を養液栽培し、得られた甘草根部を原料にすると、グ
リチルリチンを従来よりもはるかに効率よく安定的に供
給することが可能になる。 養液栽培する甘草としては、根部にグリチルリチンを
蓄積する性質を有するものであれば何でもよく、たとえ
ば、グルチルリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza glabra L
inn.）、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glycyrrhiza
uralensis Fisher）、グリチルリーザ・インフラータ
（Glycyrrhiza inflata Batal）、グリチルリーザ・レ
ピドータ（Glycyrrhiza lepidota Linn）、その他これ
らのグリチルリーザ属植物の変種等を、いずれも使用す
ることができる。 養液栽培用の培養液には、各種植物の養液栽培に工夫
された周知の合成栄養培地、すなわち、無機塩類、有機
成分、ビタミン類、アミノ酸類、生育調節物質等を含む
ものを用いることができるが、外にも、根部の生長やグ
リチルリチンの蓄積に有用であるならば、任意の物質を
含有させることができる。具体的な培地組成の代表的な
例を示すと、いわゆる園試処方均衡培養液［Ca（NO3）
２・4H2O:0.95g/、KNO3:0.81g/、MgSO4・7H2O:0.5g
/、NH4H2PO4:0.155g/、NaFe−EDTA:20mg/、H3B
O4:3mg/、MnSO4・4H2O:2mg/、ZnSO4・7H2O:0.22mg/
、CuSO4・5H2O:0.05mg/、Na2MoO4・2H2O:0.02mg/
］、微粉ハイポネックス（ハイポネックス社製、窒素
6.5％、可溶性リン酸6.0％、水溶性カリ19.0％）の100
〜4000倍希釈液等があるが、その他の市販されている養
液栽培用肥料も、いずれも用いることができる。 培養液のpHは約5.0〜10.0、培養温度は約５〜50℃の
範囲に管理することが望ましい。培養中、培養液の更
新、照度の管理等は、養液栽培の常法にしたがって行え
ばよいが、照度はやや高いほうが好ましい結果を与える
ことが分かっている。 培養が好ましい条件で行われた場合、甘草は約４カ月
頃から収穫可能になる。 収穫した甘草の根部からグリチルリチンを抽出するの
に特別の方法は必要なく、天然甘草から抽出する場合と
同様に、根部の粉砕物から水、親水性有機溶媒、または
これらの混合物を用いて抽出すればよい。 〔実施例〕 以下、実施例を示して本発明を説明する。なお、各例
において示したグリチルリチン含量の値は次のようにし
て測定したものであり、甘草根部のグリチルリチン含量
を示すと共に抽出可能な（したがって本発明の製造法で
甘草根部から採取可能な）グリチルリチン量をも示す。 グリチルリチン定量法：収穫した甘草根部を乾燥し、ブ
レンダーで粉砕する。得られた粉砕物100mgを精秤し、5
0％メタノール10mlを加え、密栓して45℃で一晩静置
し、ろ過して得られたろ液について、高速液体クロマト
グラフィーによりグリチルリチンを定量する。なお、高
速液体クロマトグラフィーの条件は次のとおりである。 カラム：μ−Bondopak C18 移動相:2％酢酸／水（20/11） カラム温度:40℃ 検出:UV 254nm 実施例１ ソ連起源の甘草苗（種子から発芽させ、草丈約10cmに
生長させたもの）一株の茎部をウレタンフォームで包
み、培養液（微粉ハイポネックスの1000倍希釈液）の入
った広口びん（高さ30cm、開口部径10cm、容量1500ml）
の口部に固定し、広口びん下部より通気を行う。温度25
℃、照度10,000ルクスで４カ月間栽培を続け、その間、
１カ月ごとに根部の新鮮重量を測定し、収穫時にグリチ
ルリチン含量を測定した。比較のため、同じ苗を用いて
同期間土壌栽培し、同様の測定を行なった。 結果を表１に示す。 表 １ 養液栽培 土壌栽培 根部重量（ｇ） １カ月後 0.26 0.04 ２カ月後 1.03 0.12 ３カ月後 2.98 0.26 ４カ月後 4.83 0.32 グリチルリチン含量（％） 0.30 0.04 実施例２ 中国起源の甘草を実施例１と同様にして栽培して、根
部について同様の測定を行なった。その結果を表２に示
す。 表 ２ 養液栽培 土壌栽培 根部重量（ｇ） １カ月後 0.20 0.04 ２カ月後 0.97 0.13 ３カ月後 2.63 0.21 ４カ月後 4.08 0.35 グリチルリチン含量（％） 0.25 0.01 実施例３ 実施例１で用いたのと同様の甘草苗の茎部をウレタン
フォームでつつみ、円筒状水槽（内径15cm、高さ60cm）
の上部に固定する。水槽下部より１日10回、0.5／分
の流量で30分間培養液を供給し、その後、ポンプを停止
する。ポンプが止まると水槽内の培養液はサイフォンに
よりすべて排出され、甘草の根は空気にさらされる。培
養液として園試処方均衡培養液20を用い、２週間に１
度、その10を更新し、屋外で４カ月間、栽培する。 上記栽培法で甘草を栽培した結果を、同じ苗を同期間
土壌栽培した結果とともに第３表に示す。 表 ３ 養液栽培 土壌栽培 根部重量（ｇ） １カ月後 3.87 0.04 ２カ月後 12.35 0.12 ３カ月後 28.51 0.20 ４カ月後 40.03 0.32 グリチルリチン含量（％） 0.42 0.04
グリチルリチンを製造する方法に関するものである。 グリチルリチンは抗アレルギー作用、抗炎症作用、抗
潰瘍作用等を有することが知られており、慢性肝炎の治
療等に広く使用されている。グリチルリチンはまた砂糖
の約300倍の甘味を有し、甘味料として醤油、漬物等、
食品の製造に多量に使用されるほか、タバコ等の着香料
としても使われている。 〔従来の技術〕 グリチルリチンは、マメ科の多年性植物である甘草
（Glycyrrhiza glabra Linn.,G.uralensis Fisher,G.in
flata Batal,G.lepidota Linn等の Glycyrrhiza属植
物）の根および根茎（以下、根部という）に含まれてい
る。したがって、グリチルリチンは、従来、野生の甘草
の根部から抽出し精製する方法により製造されてきた。
原料の甘草は日本国内に自生せず、すべて中国、ソ連、
アフガニスタン、パキスタン、トルコ等からの輸入品に
依存しているが、近年、上記甘草産出国における農業開
発その他の進展にともない甘草自生地が減少しており、
資源の枯渇が心配されている。 甘草を日本国内で栽培することもかって検討された
が、栽培地域、天候、収穫時期等によりグリチルリチン
含有量に大差を生じ、グリチルリチン原料として使用で
きるものを量的にも質的にも安定して得るのは困難であ
ること、栽培コストが高くつくこと、などが障害になっ
て、実施されるには至っていない。 このような現状を背景に、近年発達した植物組織培養
法を用いてグリチルリチンを製造する方法が検討され、
その成果の一つとして特開昭50−16440号公報には、甘
草をカルス化し、そのカルスからたばこ加香用甘草エキ
スを得る方法が記載されている。しかしながら、この方
法による甘草エキスには、天然の甘草エキスと比べる
と、グリチルリチンはごく微量しか含まれていないの
で、グリチルリチンとしての製造コストはきわめて高い
ものになる。また、特開昭53−91188号公報には、甘草
カルスを器官分化させ、その後にグリチルリチンを採取
する方法が記載されている。しかしながら、この方法
も、本発明者らの研究によれば、甘草カルスからの器官
分化はそれほど困難でないにしても、記載されているよ
うな著量のグリチルリチンの蓄積は認められないから、
特に有利な方法とは言えない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、上述のような現状に鑑み、供給に不
安のある天然の甘草に依存することなくグリチルリチン
を効率よく製造する方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明が提供するグリチルリチンの製造法は、甘草を
養液栽培し、得られた甘草の根部からグリチルリチンを
採取することを特徴とするものである。 養液栽培は、周知のように通常の土壌を全く使用しな
い栽培法であって、倍地の種類や培養液および空気の与
え方によって水耕法、空気耕法（噴霧耕法等）、固定倍
地耕法）砂耕法、くん炭耕法、ロックウール耕法等）が
あるが、本発明における養液栽培は根部を収穫するため
のものであるから、上記方法のなかでも根部を収穫し易
い水耕法、空気耕法等が特に適している。しかしなが
ら、後述する本発明の効果の点では、他のいずれの方法
によっても大差のない結果が得られるから、状況に応じ
て、任意の方法を採用することができる。 養液栽培された甘草は、その理由は明らかでないが、
特別の養液を用いなくても、通常の土壌で栽培されたも
のよりも根部の収量が多く、しかも、根部に含まれるグ
リチルリチンの量が多い。さらに、養液栽培の特長とし
て、栽培条件を人為的に好適条件に維持し易いから、甘
草を養液栽培し、得られた甘草根部を原料にすると、グ
リチルリチンを従来よりもはるかに効率よく安定的に供
給することが可能になる。 養液栽培する甘草としては、根部にグリチルリチンを
蓄積する性質を有するものであれば何でもよく、たとえ
ば、グルチルリーザ・グラブラ（Glycyrrhiza glabra L
inn.）、グリチルリーザ・ウラレンシス（Glycyrrhiza
uralensis Fisher）、グリチルリーザ・インフラータ
（Glycyrrhiza inflata Batal）、グリチルリーザ・レ
ピドータ（Glycyrrhiza lepidota Linn）、その他これ
らのグリチルリーザ属植物の変種等を、いずれも使用す
ることができる。 養液栽培用の培養液には、各種植物の養液栽培に工夫
された周知の合成栄養培地、すなわち、無機塩類、有機
成分、ビタミン類、アミノ酸類、生育調節物質等を含む
ものを用いることができるが、外にも、根部の生長やグ
リチルリチンの蓄積に有用であるならば、任意の物質を
含有させることができる。具体的な培地組成の代表的な
例を示すと、いわゆる園試処方均衡培養液［Ca（NO3）
２・4H2O:0.95g/、KNO3:0.81g/、MgSO4・7H2O:0.5g
/、NH4H2PO4:0.155g/、NaFe−EDTA:20mg/、H3B
O4:3mg/、MnSO4・4H2O:2mg/、ZnSO4・7H2O:0.22mg/
、CuSO4・5H2O:0.05mg/、Na2MoO4・2H2O:0.02mg/
］、微粉ハイポネックス（ハイポネックス社製、窒素
6.5％、可溶性リン酸6.0％、水溶性カリ19.0％）の100
〜4000倍希釈液等があるが、その他の市販されている養
液栽培用肥料も、いずれも用いることができる。 培養液のpHは約5.0〜10.0、培養温度は約５〜50℃の
範囲に管理することが望ましい。培養中、培養液の更
新、照度の管理等は、養液栽培の常法にしたがって行え
ばよいが、照度はやや高いほうが好ましい結果を与える
ことが分かっている。 培養が好ましい条件で行われた場合、甘草は約４カ月
頃から収穫可能になる。 収穫した甘草の根部からグリチルリチンを抽出するの
に特別の方法は必要なく、天然甘草から抽出する場合と
同様に、根部の粉砕物から水、親水性有機溶媒、または
これらの混合物を用いて抽出すればよい。 〔実施例〕 以下、実施例を示して本発明を説明する。なお、各例
において示したグリチルリチン含量の値は次のようにし
て測定したものであり、甘草根部のグリチルリチン含量
を示すと共に抽出可能な（したがって本発明の製造法で
甘草根部から採取可能な）グリチルリチン量をも示す。 グリチルリチン定量法：収穫した甘草根部を乾燥し、ブ
レンダーで粉砕する。得られた粉砕物100mgを精秤し、5
0％メタノール10mlを加え、密栓して45℃で一晩静置
し、ろ過して得られたろ液について、高速液体クロマト
グラフィーによりグリチルリチンを定量する。なお、高
速液体クロマトグラフィーの条件は次のとおりである。 カラム：μ−Bondopak C18 移動相:2％酢酸／水（20/11） カラム温度:40℃ 検出:UV 254nm 実施例１ ソ連起源の甘草苗（種子から発芽させ、草丈約10cmに
生長させたもの）一株の茎部をウレタンフォームで包
み、培養液（微粉ハイポネックスの1000倍希釈液）の入
った広口びん（高さ30cm、開口部径10cm、容量1500ml）
の口部に固定し、広口びん下部より通気を行う。温度25
℃、照度10,000ルクスで４カ月間栽培を続け、その間、
１カ月ごとに根部の新鮮重量を測定し、収穫時にグリチ
ルリチン含量を測定した。比較のため、同じ苗を用いて
同期間土壌栽培し、同様の測定を行なった。 結果を表１に示す。 表 １ 養液栽培 土壌栽培 根部重量（ｇ） １カ月後 0.26 0.04 ２カ月後 1.03 0.12 ３カ月後 2.98 0.26 ４カ月後 4.83 0.32 グリチルリチン含量（％） 0.30 0.04 実施例２ 中国起源の甘草を実施例１と同様にして栽培して、根
部について同様の測定を行なった。その結果を表２に示
す。 表 ２ 養液栽培 土壌栽培 根部重量（ｇ） １カ月後 0.20 0.04 ２カ月後 0.97 0.13 ３カ月後 2.63 0.21 ４カ月後 4.08 0.35 グリチルリチン含量（％） 0.25 0.01 実施例３ 実施例１で用いたのと同様の甘草苗の茎部をウレタン
フォームでつつみ、円筒状水槽（内径15cm、高さ60cm）
の上部に固定する。水槽下部より１日10回、0.5／分
の流量で30分間培養液を供給し、その後、ポンプを停止
する。ポンプが止まると水槽内の培養液はサイフォンに
よりすべて排出され、甘草の根は空気にさらされる。培
養液として園試処方均衡培養液20を用い、２週間に１
度、その10を更新し、屋外で４カ月間、栽培する。 上記栽培法で甘草を栽培した結果を、同じ苗を同期間
土壌栽培した結果とともに第３表に示す。 表 ３ 養液栽培 土壌栽培 根部重量（ｇ） １カ月後 3.87 0.04 ２カ月後 12.35 0.12 ３カ月後 28.51 0.20 ４カ月後 40.03 0.32 グリチルリチン含量（％） 0.42 0.04
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．甘草を養液栽培し、得られた甘草の根および根茎か
らグリチルリチンを採取することを特徴とするグリチル
リチンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62259656A JP2717964B2 (ja) | 1987-10-16 | 1987-10-16 | グリチルリチンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62259656A JP2717964B2 (ja) | 1987-10-16 | 1987-10-16 | グリチルリチンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01102092A JPH01102092A (ja) | 1989-04-19 |
| JP2717964B2 true JP2717964B2 (ja) | 1998-02-25 |
Family
ID=17337078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62259656A Expired - Fee Related JP2717964B2 (ja) | 1987-10-16 | 1987-10-16 | グリチルリチンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2717964B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPN411195A0 (en) * | 1995-07-10 | 1995-08-03 | Cathay Herbal Laboratories Pty Ltd | Medicinal composition |
| WO2004056374A1 (en) * | 2002-12-23 | 2004-07-08 | Hpc Healthcare & Pharma Consulting Ag | Use of glycyrrhizin for the treatment of standard therapy-resistant hepatitis c patients |
| US8652532B2 (en) | 2003-11-21 | 2014-02-18 | Nestec S.A. | Food composition comprising glucosamine |
| CN101175501B (zh) * | 2005-05-13 | 2012-03-21 | 雀巢技术公司 | 由植物物种生产葡糖胺 |
| US20080200666A1 (en) * | 2005-05-13 | 2008-08-21 | Nestec S.A. | Production Of Glucosamine From Plant Species |
| JP5974211B2 (ja) * | 2009-08-31 | 2016-08-23 | 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | 新規ウラルカンゾウ及びその栽培用ストロン |
| JP6029013B2 (ja) * | 2013-05-17 | 2016-11-24 | 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 | 植物生長促進剤および植物生長促進剤の製造方法 |
| JP5876444B2 (ja) * | 2013-05-30 | 2016-03-02 | 鹿島建設株式会社 | カンゾウ属植物の薬用成分濃度向上方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5016440A (ja) * | 1973-06-11 | 1975-02-21 | ||
| JPS6092219A (ja) * | 1983-10-24 | 1985-05-23 | Nissin Food Prod Co Ltd | 養液栽培による薬用物質の製造法 |
-
1987
- 1987-10-16 JP JP62259656A patent/JP2717964B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01102092A (ja) | 1989-04-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Francois et al. | Salt Tolerance of Safflower 1 | |
| Lavini et al. | Yield, quality and water consumption of Stevia rebaudiana Bertoni grown under different irrigation regimes in Southern Italy | |
| JPH10271928A (ja) | ステビア・レバウディアナ・ベルトニーに属する新植物 | |
| CN103749289A (zh) | 一种养生保健枸杞叶茶新品种选育方法及其制备方法 | |
| CN110178690B (zh) | 碳纳米溶胶在培育草莓中的应用、一种草莓苗培育培养基、基质以及草莓苗培育方法 | |
| CN104221668B (zh) | 一种紫云英的栽培方法 | |
| CN108617452A (zh) | 一种鸡头黄精种植方法 | |
| CN106561258B (zh) | 一种高产粉葛根头苗的培育方法 | |
| CN105794473B (zh) | 一种黄芩的栽培方法 | |
| JP2717964B2 (ja) | グリチルリチンの製造法 | |
| Pandey et al. | Pelargonium graveolens L.(Rose-scented geranium): New hope for doubling Indian farmers’ income | |
| El-Gengaihi et al. | Alkylamides of Echinacea purpurea L. as influenced by plant ontogony and fertilization | |
| CN110622808B (zh) | 一种促进白芨生长及有效成分积累的种植方法 | |
| CN102523862B (zh) | 一种苦碟子注射液用抱茎苦荬菜的人工栽培方法 | |
| CN103503654A (zh) | 梨园间作荠菜种植方法 | |
| CN105009905A (zh) | 一种伊贝母的种植方法 | |
| CN104221701A (zh) | 一种青天葵人工栽培方法 | |
| KR102251845B1 (ko) | 유효성분이 강화된 엉겅퀴의 재배방법 | |
| CN106234149A (zh) | 一种龙冠樱桃的杂交育苗方法 | |
| CN108718861A (zh) | 一种杈杷果树一年两熟的种植方法 | |
| FI80982C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en ny kamomillsort (benaemning manzana) och dess anvaendning. | |
| Dewers et al. | Effect of soil water stress on initiation of ovulate primordia in loblolly pine | |
| Hall et al. | Physiology of the lowbush blueberry | |
| Martini et al. | Comparative evaluation of rooting cuttings of five Mediterranean sage species (Salvia sp.) native to Greece | |
| Liu et al. | Provenance variation in camptothecin concentrations of Camptotheca acuminata grown in China |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |