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JP2668403B2 - Atl抗体測定試薬 - Google Patents

Atl抗体測定試薬

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Publication number
JP2668403B2
JP2668403B2 JP63192925A JP19292588A JP2668403B2 JP 2668403 B2 JP2668403 B2 JP 2668403B2 JP 63192925 A JP63192925 A JP 63192925A JP 19292588 A JP19292588 A JP 19292588A JP 2668403 B2 JP2668403 B2 JP 2668403B2
Authority
JP
Japan
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atl
antibody
liposome
atlv
measurement
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
JP63192925A
Other languages
English (en)
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JPH0242360A (ja
Inventor
衛 梅田
昇 岩瀬
貴久 上野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nissui Seiyaku Co Ltd
Original Assignee
Nissui Seiyaku Co Ltd
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Publication date
Application filed by Nissui Seiyaku Co Ltd filed Critical Nissui Seiyaku Co Ltd
Priority to JP63192925A priority Critical patent/JP2668403B2/ja
Publication of JPH0242360A publication Critical patent/JPH0242360A/ja
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
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  • Epidemiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、成人T細胞白血病(ATL)抗体の測定試
薬、更に詳細には、補体依存性リポソーム膜損傷反応を
利用した、簡単な自動的操作によつてATL抗体を測定す
ることのできるATL抗体測定試薬に関する。
〔従来の技術およびその課題〕
日本の南西部に多発しているATLについては、1977年
高月らにより報告されて以外数多くの研究がなされてお
り、1981年日沼らにより、ATL患者由来細胞(MT−1)
からのHTLV−1の分離、このウイルス感染細胞(MT−1,
MT−2)を抗原とする間接蛍光抗体法によるATL患者血
清中の抗体の照明がなされ、更に該抗体陽性者はウイル
スキヤリヤーであることが照明された。
現在では、血球成分を含む輸血とウイルスキヤリヤー
の家族内集積率が高いことから、母乳中のリンパ球を介
する星感染、夫婦間感染がその主な自然感染経路である
ことが判明し、これをコントロールすることが感染防止
上最も有効であるとされている。従つて、HTLV−1キヤ
リヤーの把握は、単に白血病患者におけるウイルス関与
特殊症型の鑑別を目的とするだけでなく、献血者や妊婦
を対象とする検診及び入院時の一般検査に組み入れる必
要性が高まつている。
従来、ATL抗体の測定法としては、間接蛍光抗体法、E
IA法、凝集法、Western−blot法等が採用されている
が、上述のようなHTLV−1の臨床上の重要性に鑑み、測
定法の自動化が望まれている。しかしながら、間接蛍光
抗体法及びWestern−blot法は操作が煩雑であり、自動
化は困難である。EIA法は洗浄操作が必要であるため、
自動化するには洗浄機構を必要とするという問題があ
る。また凝集法は、操作は比較的簡単であるが、判定が
目視であるため、測定結果に個人差を生ずるという問題
があつた。
〔課題を解決するための手段〕
斯かる実状において、本発明者は、上記課題を解決せ
んと鋭意研究を行つた結果、補体依存性リポソーム膜損
傷反応を利用することにより、上記目的が達成されるこ
とを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、リン脂質及びコレステロールを
主要構成成分とするリポソームの表面に、デオキシコー
ル酸ナトリウムで可溶化処理したATLV関連抗原を架橋剤
を介して結合させ、かつ該ルポソーム内に親水性標識物
質を封入したことを特徴とするATL抗体測定試験を提供
するものである。
本発明において、リポソームはリン脂質及びコレステ
ロールを主要構成成分とするものであれば、従来使用さ
れている何れのものでもよいが、リン脂質とコレステロ
ールの比が1:1前後であるとき、安定なリポソームが得
られ易い。またリン脂質中の脂肪酸残基は、炭素原子数
が12〜18であることが好ましく、更には偶数であること
がより好ましい。
リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であつ
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により蛍光は示さないが、低濃度(10-3M
以下)で非常に強い蛍光を発するカルボキシルフルオレ
セインのような蛍光性化合物;リポソーム外で酸化反応
により発光するルミノールやルシフエリンのような発行
性化合物;可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有
する吸光性化合物(水溶性色素等);酸化酵素の作用に
より分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたら
すグルコース及びシユークロースなどの糖類;テトラペ
ンチルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物;ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)の
ような補酵素類;メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。
本発明のATLV関連抗原としては、ATLウイルス、MT−
2等をデオキシコール酸ナトリウム等で可溶化処理した
ものが使用される。
本発明のATL抗体測定試薬は、例えば次の方法で製造
される。
まずリン脂質とコレステロールをフラスコに入れ、溶
媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引乾燥す
る。しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ内に所
定の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振とうし、標
識物質封入リポソームを得る。
一方、ATLV関連抗原と架橋剤とを緩衝液中で反応させ
て架橋基を導入し、しかる後、必要であれば、該架橋基
を還元する試薬(例えばジチオスレイトール;DTT)と更
に反応させて、修飾抗原を得る。
最後に、標識物質封入リポソームと修飾抗原とを緩衝
液中で反応せしめることにより、本発明のATLV関連抗原
感作リポソームが得られる。かかるATL抗原測定試薬
は、通常、標識物質を内包し、表面に固定化された抗原
を担持したマイクロカプセウとして得られる。
上記製造法における架橋剤としては、例えば、N−ス
クシンイミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネ
ート(SPDP)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイ
ミドフエニル)ブチレート(SMPB)、N−スクシンイミ
ジル4−(p−マレイミドフエニル)アセテート(SMP
A)、N−スクシンイミジル4−(p−マレイミドフェ
ニル)プロピオネート(SMPP)、N−(γ−マレイミド
ブチリルオキシ)スクシンイミド(GMBS)及びN−(ε
−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(EMC
S)が挙げられる。
このようにして調製したATL抗体測定試薬を用いて、
被検体中のATL抗体を測定するには、被検体中に該試薬
及び補体を加え、抗原−抗体と補体との結合反応を引き
起こさせる。すると、かかる反応量に比例して、リポソ
ーム内から標識物質が放出されてくる。次いで、この標
識物質に応じた分析方法(例えば、標識物質が蛍光物質
であれば、蛍光分析法)により定量を行い、例えば、予
め作成した検量線により、試料中の抗体の量を測定する
ことができる。
この測定操作において使用する補体は、格別限定され
ないが、通常、モルモツト血清が用いられる。しかし、
ウサギ、マウス、ヒト等の形成を使用してもよい。
〔発明の効果〕
叙上の如く、本発明のATL抗体測定試薬を使用すれ
ば、簡単な操作で正確に被検体中のATL抗体を測定する
ことができ、しかもその自動化が可能である。
〔実施例〕
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明する。
実施例1 (1) ATLV関連抗原の調製: サイトテツク社から購入した精製ATLウイルスをデオ
キシコール酸ナトリウム処理して可溶化タンパクを得
た。可溶化処理は、下記の方法で行なつた。ATLウイル
ス懸濁液(2mg/ml)を0.2%デオキシコール酸ナトリウ
ム含有ベロナール緩衝液(pH7.5)20mlに添加し、4℃
で20時間攪拌した。攪拌後、遠心分離し、上清を分取
し、さらに濃縮した。このものを0.15M NaCl含有0.01M
へペス緩衝液(pH7.5)に透析後、遠心分離し、可溶化
タンパクを得た。同様な方法で、MT−2細胞から得られ
た抗原も可溶化することができる。
(2) ATLV抗原感作リポソームの調製: (i) リポソームの調製 ジパルミトイルホスフアチジルコリン(DPPC)1μモ
ル、コレステロール(Chol)1μモルおよびジチオピリ
ジル化ジパルミトイルホスフアチジルエタノールアミン
(DTP−DPPE)0.05μモルをナシ型フラスコにとり、脂
質を溶解していたクロロホルムをエバポレーターで留去
した。さらに1時間真空デシケーターで乾燥後、ナシ型
フラスコに0.2Mカルボキシフルオレセイン(CF)200μ
を入れ、激しく振とうし、ナシ型フラスコのガラス壁
上の脂質薄膜をはがしてCF封入リポソームを調製した。
未封入のCFは、0.01Mへペス緩衝液(0.15M NaCl含有;pH
7.5)で遠心洗浄を3回行なつて分離した。
(ii) ATLV関連抗原のリポソームへの感作(1)で可
溶化したATLV関連タンパク(1.5mg/ml)を遠心分離し、
上清を分取した。これに30mM N−サクシンイミジル−3
−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)2.0μ
を添加し、室温で30分間反応させた。引き続き、過剰
のSPDPを除去するために、20mM MES緩衝液(pH6.0)で
平衡化したセフアデツクスG−25でゲル濾過した。ゲル
濾過より得られたタンパク分画(1.5ml)は、ジチオス
レイトール(DTT)20mgを添加し、室温で30分間反応さ
せた後、0.01Mへペス緩衝液で予じめ平衡化しておいた
セフアデックスG−25でゲル濾過し、過剰のDTTとタン
パク分画を分離した。こうして得られたタンパク分画1m
lに(i)で遠心洗浄して得られたリポソームペレット
を懸濁させ、6〜10℃で18〜20時間ゆつくり攪拌しなが
ら反応させた。反応後は、リポソーム懸濁液を遠心洗浄
し、未感作のタンパク溶液を除去し、0.1%NaN3含有ゼ
ラチンベロナール緩衝液(pH7.4)1mlに再懸濁した。
(3) ATLV関連抗原感作リポソームを用いた抗ATLV抗
体の測定: 96穴のマイクロプレート(住友ベイクライト)を用い
て測定を行なつた。リポソームと検体との希釈には0.5m
M MgCl2と0.15mM CaCl2を含むゼラチンベロナール緩衝
液(GVB2+)を用いた。(2)で調製したATLV関連抗原
感作リポソームをGVB2+で400倍希釈したもの50μに、
非動化処理したヒト血清をGVB2+で適当に希釈したもの2
5μを添加した。引き続き、モルモツト補体25μを
添加し、37℃で2時間反応させた。反応は、10mM EDTA
含有ペロナール緩衝液(pH7.5)を100μ添加すること
で停止させた。ATL抗体価に依存したCF遊出量は、蛍光
側定機(励起490nm、蛍光530nm)で測定した。
ATL抗体陽性検体の希釈系列を組み、上記に従つてア
ツセイした時の標準曲線を第1図に示す。第1図から明
らかな如く、抗体量に依存したCFリリースが見られ、ま
た1.5〜5CH50/mlまで補体量を変えて上記に従つてアツ
セイした時、補体量に依存して感度が上昇した。
(4) 反応のタイムコース: ATLV関連抗原感作リポソームを用いて、反応のタイム
コースを調べた。すなわち、ATL抗体陽性検体を40〜128
0倍に希釈し、補体濃度は5CH50/mlとした。(3)に従
つてアツセイし、180分まで反応を調べた。その結果は
第2図のとおりであり、CFリリースは反応時間に依存し
て増したが、2時間以上であれば測定感度としては問題
ないことが判る。
(5) 本測定法と従来法との比較: 本測定法と従来法(凝集法)との比較を15検体で行な
つた。従来法の値は凝集する検体の最高希釈倍数であら
わし、本側定法では5%以上のCFリリースがみられる検
体の最高希釈倍数であらわした。尚、凝集法は2倍希釈
からはじめ、本測定法は10倍希釈からはじめた。その結
果は表1のとおりであり、本側定法はATL固体測定法と
して満足のいくものであることを示している。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明のATL抗体測定試薬を用いて被検血清中
のATL抗体を測定したときの標準曲線であり、第2図
は、該試薬を用いて被検血清中のATL抗体を測定したと
きの反応タイムコースを示す図面である。

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】リン脂質及びコレステロールを主要構成成
    分とするリポソームの表面に、デオキシコール酸ナトリ
    ウムで可溶化処理したATLV関連抗原を架橋剤を介して結
    合させ、かつ該リポソーム内に親水性標識物質を封入し
    たことを特徴とするATL抗体測定試薬。
JP63192925A 1988-08-02 1988-08-02 Atl抗体測定試薬 Expired - Lifetime JP2668403B2 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06100601B2 (ja) * 1983-11-30 1994-12-12 株式会社東芝 免疫分析用試薬及びそれを用いた分析方法
JPS61133864A (ja) * 1984-12-05 1986-06-21 Toshiba Corp ヒト−ガン胎児性抗原(cea)分析用試薬および分析方法
JP2501569B2 (ja) * 1986-11-14 1996-05-29 協和醗酵工業株式会社 抗成人t細胞白血病ウイルス抗体の検出法

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