JP2647931B2 - 免疫学的測定方法 - Google Patents
免疫学的測定方法Info
- Publication number
- JP2647931B2 JP2647931B2 JP27563088A JP27563088A JP2647931B2 JP 2647931 B2 JP2647931 B2 JP 2647931B2 JP 27563088 A JP27563088 A JP 27563088A JP 27563088 A JP27563088 A JP 27563088A JP 2647931 B2 JP2647931 B2 JP 2647931B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substance
- measured
- magnetic
- well
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 8
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 title claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 53
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 22
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 11
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 8
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229940071089 sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫学的凝集反応により抗原又は抗体の存
在を検出し判定するための方法に関する。
在を検出し判定するための方法に関する。
免疫学的な凝集反応に基づいて凝集又は非凝集粒子の
分布パターンを形成し分析する方法においては、サンプ
ル中の抗原又は抗体を特定の指標粒子に固定された抗原
又は抗体と混合して結合させると共に、これら反応成分
を反応容器の壁面に移動させ、かつ未結合の指標粒子を
同壁面の一部に集めて分離している。このような方法
は、一般に混合凝集法（mixed agglutination）と呼ば
れ、Wiensr,A.S.とHerman,M.,J.Immunol.,36,255（193
9）において報告されて以来、Coombs,R.R.A.とBedford,
D.,Voxsang.,５,111（1955）及びCoombs,R.R.A.ら,Lanc
et,i,461（1956）の報告により血液型の判定を行なうま
でに発展確立された。例えば、各種血液型について応用
したものにUSP 4608246号明細書、USP 4275053号明細書
（特公昭62−44221号）やUSP4328183号明細書がある。
また、固体表面で血液型の判定を行なって感度の向上を
図ったものにUSP 2770572号明細書がある。更に、Rosen
field R.E.ら,Paris,Proc.15Th Cong.Intl.Soc.Blood T
rasfusion,27（1976）では混合凝集法の原理を利用して
固体表面で赤血球抗原と抗体との反応を行なっている。
分布パターンを形成し分析する方法においては、サンプ
ル中の抗原又は抗体を特定の指標粒子に固定された抗原
又は抗体と混合して結合させると共に、これら反応成分
を反応容器の壁面に移動させ、かつ未結合の指標粒子を
同壁面の一部に集めて分離している。このような方法
は、一般に混合凝集法（mixed agglutination）と呼ば
れ、Wiensr,A.S.とHerman,M.,J.Immunol.,36,255（193
9）において報告されて以来、Coombs,R.R.A.とBedford,
D.,Voxsang.,５,111（1955）及びCoombs,R.R.A.ら,Lanc
et,i,461（1956）の報告により血液型の判定を行なうま
でに発展確立された。例えば、各種血液型について応用
したものにUSP 4608246号明細書、USP 4275053号明細書
（特公昭62−44221号）やUSP4328183号明細書がある。
また、固体表面で血液型の判定を行なって感度の向上を
図ったものにUSP 2770572号明細書がある。更に、Rosen
field R.E.ら,Paris,Proc.15Th Cong.Intl.Soc.Blood T
rasfusion,27（1976）では混合凝集法の原理を利用して
固体表面で赤血球抗原と抗体との反応を行なっている。
ところで、従来の混合凝集法の多くは底面に収束部を
有する形状の反応容器中での指標粒子の自然沈降による
ものである。従って、指標粒子が底面に一様に沈降し、
なおも未反応の粒子が収束部に沈積してパターンを形成
するまでに多大な時間を要していた。単に沈降速度を高
めるためならば粒径を大きくしたり、比重の大きな材質
を利用することが考えられるが、パターンが荒くならな
い程度に粒径及び比重を選定しなければならない点に限
界を生じ、大幅な時間の短縮は望めない。
有する形状の反応容器中での指標粒子の自然沈降による
ものである。従って、指標粒子が底面に一様に沈降し、
なおも未反応の粒子が収束部に沈積してパターンを形成
するまでに多大な時間を要していた。単に沈降速度を高
めるためならば粒径を大きくしたり、比重の大きな材質
を利用することが考えられるが、パターンが荒くならな
い程度に粒径及び比重を選定しなければならない点に限
界を生じ、大幅な時間の短縮は望めない。
そこで、USP 4297104号明細書（特公昭62−31299号）
では対称軸上に収束点を有する容器壁面及び指標粒子と
しての赤血球表面に抗体（例えばIgG）を固定し、予め
サンプル中の抗原と赤血球表面及び容器壁面の抗体に対
する抗IgG抗体を加え、更に第１及び第２の遠心処理に
より抗原と未反応である赤血球とを容器の収束点に集め
ることによりパターンの形成を行なっている。しかしな
がら、遠心による凝集反応は粒子の沈降を促進させる点
で有効であるものの、遠心機が必要となること自体に操
作上の制約が生じてしまう。即ち、サンプリングから反
応、判定、廃棄等を実施する際に、反応容器のハンドリ
ングの流れがスムーズにならず、特に遠心力のかかる方
向に対して反応容器の対称軸を精密に一致させなければ
ならない。また、異なる項目の分析においては夫々粒子
の沈降条件を変える必要があるが、同一の遠心処理中に
遠心の精度やタイミングを複数設定することは困難であ
るから、その都度工程をやり直すか、或いは複数の遠心
機に接続する等の構成を必要とする。更に、遠心機を用
いることで不可避的な装置が大型になる。
では対称軸上に収束点を有する容器壁面及び指標粒子と
しての赤血球表面に抗体（例えばIgG）を固定し、予め
サンプル中の抗原と赤血球表面及び容器壁面の抗体に対
する抗IgG抗体を加え、更に第１及び第２の遠心処理に
より抗原と未反応である赤血球とを容器の収束点に集め
ることによりパターンの形成を行なっている。しかしな
がら、遠心による凝集反応は粒子の沈降を促進させる点
で有効であるものの、遠心機が必要となること自体に操
作上の制約が生じてしまう。即ち、サンプリングから反
応、判定、廃棄等を実施する際に、反応容器のハンドリ
ングの流れがスムーズにならず、特に遠心力のかかる方
向に対して反応容器の対称軸を精密に一致させなければ
ならない。また、異なる項目の分析においては夫々粒子
の沈降条件を変える必要があるが、同一の遠心処理中に
遠心の精度やタイミングを複数設定することは困難であ
るから、その都度工程をやり直すか、或いは複数の遠心
機に接続する等の構成を必要とする。更に、遠心機を用
いることで不可避的な装置が大型になる。
本発明は、上記従来の課題を解決するためになされた
もので、遠心機を用いずに凝集反応の判定に要する時間
を短縮すると共に、凝集パターンの明瞭化を達成するこ
とが可能な免疫学的測定方法を提供しようのするもので
ある。
もので、遠心機を用いずに凝集反応の判定に要する時間
を短縮すると共に、凝集パターンの明瞭化を達成するこ
とが可能な免疫学的測定方法を提供しようのするもので
ある。
本発明は、反応容器の壁面に測定すべき物質と特異的
に反応するかもしくは競合する物質を0.2×106セル/cm2
〜1.2×106セル/cm2の密度で固定し、この容器内に測定
すべき物質と該物質に特異的に反応するかもしくは競合
する磁性粒子を含む反応液を入れた後、前記磁性粒子が
前記反応容器の内面に固定された物質に沿って収束する
ような磁場をかけることにより前記磁性粒子の分布パタ
ーンを形成して前記容器内面に固定された物質と測定す
べき物質との結合状態を測定することを特徴とする免疫
学的測定方法である。
に反応するかもしくは競合する物質を0.2×106セル/cm2
〜1.2×106セル/cm2の密度で固定し、この容器内に測定
すべき物質と該物質に特異的に反応するかもしくは競合
する磁性粒子を含む反応液を入れた後、前記磁性粒子が
前記反応容器の内面に固定された物質に沿って収束する
ような磁場をかけることにより前記磁性粒子の分布パタ
ーンを形成して前記容器内面に固定された物質と測定す
べき物質との結合状態を測定することを特徴とする免疫
学的測定方法である。
以下、本発明を第１図（Ａ）、（Ｂ）及び第２図〜第
４図を参照して詳細に説明する。ここで、第１図（Ａ）
は本発明の免疫学的測定方法に使用されるマイクロプレ
ート及びマグネット等からなる装置を示す平面図、同図
（Ｂ）は同図（Ａ）の正面図である。図中の１は、上面
に複数の円板状フェライトマグネット２を支持した支持
台である。この支持台１の上方には、反応容器としての
マイクロプレート３が配置されており、かつ該マイクロ
プレート３は前記各マグネット２に対応して配置された
底部がＵ字形をなす有底円筒形の複数のウェル４を備え
ている。
４図を参照して詳細に説明する。ここで、第１図（Ａ）
は本発明の免疫学的測定方法に使用されるマイクロプレ
ート及びマグネット等からなる装置を示す平面図、同図
（Ｂ）は同図（Ａ）の正面図である。図中の１は、上面
に複数の円板状フェライトマグネット２を支持した支持
台である。この支持台１の上方には、反応容器としての
マイクロプレート３が配置されており、かつ該マイクロ
プレート３は前記各マグネット２に対応して配置された
底部がＵ字形をなす有底円筒形の複数のウェル４を備え
ている。
まず、測定すべき物質、例えばウイルス、細菌、タン
パク質等の抗原ないし抗体に対して特異的に反応するか
又は競合する物質、例えば抗体ないし抗原等を公知の磁
性体を含む磁性粒子の表面に固定する。磁性粒子として
は、市販のDYNABEADSM−450（DYNAI社製）又は磁性ラテ
ックス（estapor）［RHONE−POULENC社製］等や磁性体
を含むゼラチン粒子（特開昭59−195161号参照）等を使
用することが可能である。また、前記磁性粒子に前記物
質を固定化する方法は種々の公知の方法を適用できる。
パク質等の抗原ないし抗体に対して特異的に反応するか
又は競合する物質、例えば抗体ないし抗原等を公知の磁
性体を含む磁性粒子の表面に固定する。磁性粒子として
は、市販のDYNABEADSM−450（DYNAI社製）又は磁性ラテ
ックス（estapor）［RHONE−POULENC社製］等や磁性体
を含むゼラチン粒子（特開昭59−195161号参照）等を使
用することが可能である。また、前記磁性粒子に前記物
質を固定化する方法は種々の公知の方法を適用できる。
次いで、第１図（Ａ）、（Ｂ）に示すマイクロプレー
ト３の各ウェル４内にサンプル中の測定すべき物質と特
異的に反応するかもしくは競合する物質を入れ、第２図
に示すように該ウェル４内面に前記物質５を固定する。
かかる物質５のウェル４内面への固定にあたっては、0.
2×106セル/cm2〜1.2×106セル/cm2の密度となるように
固定する。前記物質の固定密度を限定した理由は、その
密度を0.2×106セル/cm2未満にすると本来、磁性粒子の
分布パターンが陽性パターンとなるものが陰性パターン
となり、一方その密度を1.2×106セル/cm2を越えると本
来、磁性粒子の分布パターンが陰性パターンとなるもの
が偽陽性パターンとなるからである。なお、ウェル壁面
への測定すべき物質と特異的に反応するかもしくは競合
する物質の固定化法は従来の公知方法を使用できる。つ
づいて、前記各ウェル４内にサンプルを加え、該サンプ
ル中の測定すべき物質と該ウェル内面に固定した物質と
の反応を行ない、更に前述した磁性粒子を加える。この
後、マイクロプレート３とマグネット２が支持された支
持台１とを相対的に移動させ（例えば支持台１をその上
の各マグネット２が前記マイクロプレート３の各ウェル
４の底部に接近するように移動させ）、磁性粒子をウェ
ル４の少なくとも一部壁面に沿って収束するように磁場
をかける。
ト３の各ウェル４内にサンプル中の測定すべき物質と特
異的に反応するかもしくは競合する物質を入れ、第２図
に示すように該ウェル４内面に前記物質５を固定する。
かかる物質５のウェル４内面への固定にあたっては、0.
2×106セル/cm2〜1.2×106セル/cm2の密度となるように
固定する。前記物質の固定密度を限定した理由は、その
密度を0.2×106セル/cm2未満にすると本来、磁性粒子の
分布パターンが陽性パターンとなるものが陰性パターン
となり、一方その密度を1.2×106セル/cm2を越えると本
来、磁性粒子の分布パターンが陰性パターンとなるもの
が偽陽性パターンとなるからである。なお、ウェル壁面
への測定すべき物質と特異的に反応するかもしくは競合
する物質の固定化法は従来の公知方法を使用できる。つ
づいて、前記各ウェル４内にサンプルを加え、該サンプ
ル中の測定すべき物質と該ウェル内面に固定した物質と
の反応を行ない、更に前述した磁性粒子を加える。この
後、マイクロプレート３とマグネット２が支持された支
持台１とを相対的に移動させ（例えば支持台１をその上
の各マグネット２が前記マイクロプレート３の各ウェル
４の底部に接近するように移動させ）、磁性粒子をウェ
ル４の少なくとも一部壁面に沿って収束するように磁場
をかける。
上記磁場をかけることにより、第３図に示すようにウ
ェル４の壁面に引き寄せられた磁性粒子６はサンプル中
の測定すべき物質７を介してウェル４内面に固定された
物質５と結合してウェル４の内面に一様に広がった分布
パターンを形成する。これに対し、サンプル中に測定す
べき物質が存在しない場合には、磁性粒子６は磁場によ
りウェル４の壁面に引き寄せられ、更に内面に沿って移
動して第４図に示すように内面の一部に収束して集めら
れる。なお、磁性粒子にはサンプル中の測定すべき物質
と競合する物質を固定しておき、一定量の測定すべき物
質と結合反応する物質を添加して行なう公知の凝集抑制
反応を用いてもよい。
ェル４の壁面に引き寄せられた磁性粒子６はサンプル中
の測定すべき物質７を介してウェル４内面に固定された
物質５と結合してウェル４の内面に一様に広がった分布
パターンを形成する。これに対し、サンプル中に測定す
べき物質が存在しない場合には、磁性粒子６は磁場によ
りウェル４の壁面に引き寄せられ、更に内面に沿って移
動して第４図に示すように内面の一部に収束して集めら
れる。なお、磁性粒子にはサンプル中の測定すべき物質
と競合する物質を固定しておき、一定量の測定すべき物
質と結合反応する物質を添加して行なう公知の凝集抑制
反応を用いてもよい。
従って、反応容器の内面に測定すべき物質と特異的に
反応するかもしくは競合する物質を特定の密度で固定
し、この容器内に測定すべき物質と該物質に特異的に反
応するかもしくは競合する磁性粒子を含む反応液を入れ
た後、前記磁性粒子が前記反応容器の壁面に固定された
物質に沿って収束するような磁場をかけることにより、
磁性粒子の反応容器壁面への移動を促進できるため、反
応容器内面に固定された物質とサンプル中の測定すべき
物質を介して結合した磁性粒子の分布パターンを迅速に
形成できる。また、前記反応容器内面にサンプル中の測
定すべき物質と反応するかもしくは競合する物質を特定
の密度で固定することによって、前記磁性粒子の分布パ
ターンを明瞭に形成できる。その結果、凝集反応の判定
に要する時間を短縮できると共に、その明瞭な分布パタ
ーンからサンプル中の測定すべき物質の存在を高感度で
検出できる。
反応するかもしくは競合する物質を特定の密度で固定
し、この容器内に測定すべき物質と該物質に特異的に反
応するかもしくは競合する磁性粒子を含む反応液を入れ
た後、前記磁性粒子が前記反応容器の壁面に固定された
物質に沿って収束するような磁場をかけることにより、
磁性粒子の反応容器壁面への移動を促進できるため、反
応容器内面に固定された物質とサンプル中の測定すべき
物質を介して結合した磁性粒子の分布パターンを迅速に
形成できる。また、前記反応容器内面にサンプル中の測
定すべき物質と反応するかもしくは競合する物質を特定
の密度で固定することによって、前記磁性粒子の分布パ
ターンを明瞭に形成できる。その結果、凝集反応の判定
に要する時間を短縮できると共に、その明瞭な分布パタ
ーンからサンプル中の測定すべき物質の存在を高感度で
検出できる。
以下、本発明の実施例を詳細に説明する。
＜赤血球固定化のためのWGA（小麦胚芽レクチン）プレ
ートの作製＞ NUNC社のＵ型プレート（Micro well Module 2×8 wel
l round bottom High binding Capacity No.469264）に
WAG（生化学工業・製造番号92107）を0.01M PBS、pH7.0
で３μg/mlに溶解したものを50μ／ウェル分注し、室
温で30分間インキュベート後、0.01M PBSでウェルを満
たして２回洗浄した。つづいて、0.05％Tween 20を含む
0.01M PBSで１回洗浄し、水切りした後、風乾し、冷蔵
保存した ＜WGAプレートへの赤血球の否定＞ 測定すべき物質であるIgGが未感作の血球としてサー
ジスクリーン（ortho社、製造番号3SS888）と測定すべ
き物質であるIgGが感作された血球としてクームスコン
トロール（ortho社、製造番号K804）を用いた。各々の
血球懸濁液を0.01％サルコシネートLN（ニッコーケミカ
ル社、製造番号5063）を含むLiss、pH6.7を用いて希釈
し、1.0％、0.9％、0.7％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1
％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％に調整し
た。希釈した各々の血球を前記WGAプレートに50μ／
ウェルずつ分注し、室温で10分間インキュベートし、0.
01M PBSを用いて200μ／ウェルで３回洗浄した。洗浄
後、0.01M PBSを200μ／ウェル分注し、血球が乾燥し
ないように冷蔵保存した。こうして作製した赤血球コー
ティングプレートを顕微鏡にて200倍で鏡検し、ウェル
底面への結合セル数をカウントし、1cm2当りの赤血球数
を求めた。その結果を下記第１表に示した。
ートの作製＞ NUNC社のＵ型プレート（Micro well Module 2×8 wel
l round bottom High binding Capacity No.469264）に
WAG（生化学工業・製造番号92107）を0.01M PBS、pH7.0
で３μg/mlに溶解したものを50μ／ウェル分注し、室
温で30分間インキュベート後、0.01M PBSでウェルを満
たして２回洗浄した。つづいて、0.05％Tween 20を含む
0.01M PBSで１回洗浄し、水切りした後、風乾し、冷蔵
保存した ＜WGAプレートへの赤血球の否定＞ 測定すべき物質であるIgGが未感作の血球としてサー
ジスクリーン（ortho社、製造番号3SS888）と測定すべ
き物質であるIgGが感作された血球としてクームスコン
トロール（ortho社、製造番号K804）を用いた。各々の
血球懸濁液を0.01％サルコシネートLN（ニッコーケミカ
ル社、製造番号5063）を含むLiss、pH6.7を用いて希釈
し、1.0％、0.9％、0.7％、0.5％、0.3％、0.2％、0.1
％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％に調整し
た。希釈した各々の血球を前記WGAプレートに50μ／
ウェルずつ分注し、室温で10分間インキュベートし、0.
01M PBSを用いて200μ／ウェルで３回洗浄した。洗浄
後、0.01M PBSを200μ／ウェル分注し、血球が乾燥し
ないように冷蔵保存した。こうして作製した赤血球コー
ティングプレートを顕微鏡にて200倍で鏡検し、ウェル
底面への結合セル数をカウントし、1cm2当りの赤血球数
を求めた。その結果を下記第１表に示した。
＜抗ヒトIgG感作磁性ビーズの調製＞ 粒径1.7μｍ、磁性ラテックス（estapor）［ROHNE−P
OULENC社、製造番号LMP233］にAnti−HumanIgG［Cappel
社、Affinity Purrif.Goat−anti−Human IgG製造番号2
9971）とAnti−HumanIgG F（ab′）２［Cappel社.F（a
b′）2Fragment of Affinity Purrif.Goat−anti−Huma
n IgG製造番号29596）を夫々感作させた。即ち、0.1M G
ly−NaOH、pH8.3に前記ビーズは0.4％、抗体は20μg/ml
に希釈し、各1mlを混合して37℃で１時間反応させた。
つづいて、0.2％BSA、0.14M NaClを含む0.02MのGly−Na
OH、pH8.5、2mlで各々のビーズを３回洗浄し、同バッフ
ァ2mlに懸濁して抗ヒトIgG磁性ビーズ及び抗ヒトIgG F
（ab′）２磁性ビーズを冷蔵保存した。
OULENC社、製造番号LMP233］にAnti−HumanIgG［Cappel
社、Affinity Purrif.Goat−anti−Human IgG製造番号2
9971）とAnti−HumanIgG F（ab′）２［Cappel社.F（a
b′）2Fragment of Affinity Purrif.Goat−anti−Huma
n IgG製造番号29596）を夫々感作させた。即ち、0.1M G
ly−NaOH、pH8.3に前記ビーズは0.4％、抗体は20μg/ml
に希釈し、各1mlを混合して37℃で１時間反応させた。
つづいて、0.2％BSA、0.14M NaClを含む0.02MのGly−Na
OH、pH8.5、2mlで各々のビーズを３回洗浄し、同バッフ
ァ2mlに懸濁して抗ヒトIgG磁性ビーズ及び抗ヒトIgG F
（ab′）２磁性ビーズを冷蔵保存した。
また、未感作磁性ビーズは抗体を用いずに同様な操作
を行なった。
を行なった。
＜抗ヒトIgGビーズを用いた分析＞ 前記赤血球コーティングプレートに２種の抗ヒトIgG
磁性ビーズ［抗ヒトIgG磁性ビーズ、抗ヒトIgG F（a
b′）２磁性ビーズ］と未感作ビーズの懸濁液を25μ
／ウェルずつ分注した。つづいて、第１図（Ａ）、
（Ｂ）に示す支持台１をその上のマグネット（直径8m
m、厚さ3mm、残留磁束密度2000ガウス）２が前記マイク
ロプレート３の各ウェル４の底部に接近するように移動
させて、各ウェル４底面の垂直方向に磁界を作用させ、
室温で２分間反応させた。
磁性ビーズ［抗ヒトIgG磁性ビーズ、抗ヒトIgG F（a
b′）２磁性ビーズ］と未感作ビーズの懸濁液を25μ
／ウェルずつ分注した。つづいて、第１図（Ａ）、
（Ｂ）に示す支持台１をその上のマグネット（直径8m
m、厚さ3mm、残留磁束密度2000ガウス）２が前記マイク
ロプレート３の各ウェル４の底部に接近するように移動
させて、各ウェル４底面の垂直方向に磁界を作用させ、
室温で２分間反応させた。
しかして、各ウェル底面に形成された抗ヒトIgG磁性
ビーズ、抗ヒトIgG F（ab′）２磁性ビーズ及び未感作
ビーズの分布パターンを調べたところ、同第１表に示す
結果を得た。なお、第１表中の反応パターンは第５図
（Ａ）のようにビーズがウェル底面に一様に広がったも
のを陽性（＋）、同図（Ｂ）に示すようにビーズの分布
が中心が薄く、その回りが少し濃く分布して陰性、陽性
のどちらかとも区別できないものを偽陽性（±）、同図
（Ｃ）に示すようにウェル底面に中心にビーズが集まっ
たものを陰性（−）として判定した結果である。
ビーズ、抗ヒトIgG F（ab′）２磁性ビーズ及び未感作
ビーズの分布パターンを調べたところ、同第１表に示す
結果を得た。なお、第１表中の反応パターンは第５図
（Ａ）のようにビーズがウェル底面に一様に広がったも
のを陽性（＋）、同図（Ｂ）に示すようにビーズの分布
が中心が薄く、その回りが少し濃く分布して陰性、陽性
のどちらかとも区別できないものを偽陽性（±）、同図
（Ｃ）に示すようにウェル底面に中心にビーズが集まっ
たものを陰性（−）として判定した結果である。
第１表から明らかなように、ウェル底面に固定する血
球の密度を0.2×106セル/cm2〜1.2×106セル/cm2の範囲
とすることによって、陽性、陰性の判別が明瞭となるこ
とがわかる。これに対し、ウェル底面に固定する血球の
セル密度を0.2×106セル/cm2未満では本来、陽性（＋）
パターンになるものが陰性（−）パターンになってしま
い、一方、同血球の密度が1.2×106セル/cm2を越えると
本来、陰性（−）パターンになるものが偽陽性（±）パ
ターンになり不明瞭となる。
球の密度を0.2×106セル/cm2〜1.2×106セル/cm2の範囲
とすることによって、陽性、陰性の判別が明瞭となるこ
とがわかる。これに対し、ウェル底面に固定する血球の
セル密度を0.2×106セル/cm2未満では本来、陽性（＋）
パターンになるものが陰性（−）パターンになってしま
い、一方、同血球の密度が1.2×106セル/cm2を越えると
本来、陰性（−）パターンになるものが偽陽性（±）パ
ターンになり不明瞭となる。
以上詳述した如く、本発明の免疫学的測定方法によれ
ば遠心機を用いずに凝集反応の判定に要する時間を短縮
すると共に、凝集パターンを明瞭化をでき、ひいては検
出時間の短縮と陽性、陰性の検出感度の向上を達成で
き、更に反応容器内面に固定するための測定すべき物質
と特異的に反応もしくは競合する物質（赤血球など）の
使用量を低減できる等顕著な効果を奏する。
ば遠心機を用いずに凝集反応の判定に要する時間を短縮
すると共に、凝集パターンを明瞭化をでき、ひいては検
出時間の短縮と陽性、陰性の検出感度の向上を達成で
き、更に反応容器内面に固定するための測定すべき物質
と特異的に反応もしくは競合する物質（赤血球など）の
使用量を低減できる等顕著な効果を奏する。
第１図（Ａ）、（Ｂ）はマイクロプレート及びマグネッ
トを備えた免疫学的測定装置を示し、同図（Ａ）は平面
図、同図（Ｂ）は同図（Ａ）の正面図、第２図は前記装
置のウェルに測定すべき物質と特異的に反応するかもし
くは競合する物質を固定した状態を示す模式図、第３図
は本発明による陽性時での粒子間の結合状態を示す模式
図、第４図は本発明による陰性時での粒子間の結合状態
を示す模式図、第５図は（Ａ）は陽性時におけるビーズ
の反応パターンを示す模式図、同図（Ｂ）は偽陽性時に
おけるビーズの反応パターンを示す模式図、同図（Ｃ）
は陰性時におけるビーズの反応パターンを示す模式図で
ある。 １……支持台、２……円板状フェライトマグネット、３
……マイクロプレート、４……ウェル、５……測定すべ
き物質と特異的に反応するかもしくは競合する物質、６
……磁性粒子、７……測定すべき物質。
トを備えた免疫学的測定装置を示し、同図（Ａ）は平面
図、同図（Ｂ）は同図（Ａ）の正面図、第２図は前記装
置のウェルに測定すべき物質と特異的に反応するかもし
くは競合する物質を固定した状態を示す模式図、第３図
は本発明による陽性時での粒子間の結合状態を示す模式
図、第４図は本発明による陰性時での粒子間の結合状態
を示す模式図、第５図は（Ａ）は陽性時におけるビーズ
の反応パターンを示す模式図、同図（Ｂ）は偽陽性時に
おけるビーズの反応パターンを示す模式図、同図（Ｃ）
は陰性時におけるビーズの反応パターンを示す模式図で
ある。 １……支持台、２……円板状フェライトマグネット、３
……マイクロプレート、４……ウェル、５……測定すべ
き物質と特異的に反応するかもしくは競合する物質、６
……磁性粒子、７……測定すべき物質。
Claims (1)
- 【請求項１】反応容器の壁面に測定すべき物質と特異的
に反応するかもしくは競合する物質を0.2×106セル/cm2
〜1.2×106セル/cm2の密度で固定し、この容器内に測定
すべき物質と該物質に特異的に反応するかもしくは競合
する磁性粒子を含む反応液を入れた後、前記磁性粒子が
前記反応容器の内面に固定された物質に沿って収束する
ような磁場をかけることにより前記磁性粒子の分布パタ
ーンを形成して前記容器内面に固定された物質と測定す
べき物質との結合状態を測定することを特徴とする免疫
学的測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27563088A JP2647931B2 (ja) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | 免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27563088A JP2647931B2 (ja) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | 免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02122266A JPH02122266A (ja) | 1990-05-09 |
| JP2647931B2 true JP2647931B2 (ja) | 1997-08-27 |
Family
ID=17558135
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27563088A Expired - Fee Related JP2647931B2 (ja) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | 免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2647931B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2679660B1 (fr) * | 1991-07-22 | 1993-11-12 | Pasteur Diagnostics | Procede et dispositif magnetique d'analyse immunologique sur phase solide. |
| JPH05297001A (ja) * | 1992-04-15 | 1993-11-12 | Fujirebio Inc | 磁性粒子を用いた自動免疫測定方法及び装置 |
| GB0413752D0 (en) * | 2004-06-19 | 2004-07-21 | Hall Effect Technologies Ltd | Method of determining the presence and/or concentration of substances of interest in fluids |
-
1988
- 1988-10-31 JP JP27563088A patent/JP2647931B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02122266A (ja) | 1990-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5558839A (en) | Magnetic device for immunological analysis of a solid phase | |
| JP5223676B2 (ja) | 特に血液型の抗体／抗原複合体の存在の証明のための磁気的免疫診断方法 | |
| US4925788A (en) | Immunoassay system and procedure based on precipitin-like interaction between immune complex and Clq or other non-immunospecific factor | |
| US20030049864A1 (en) | Immunoassay method using magnetic marker particles | |
| JPH07121330B2 (ja) | 磁気分離のための装置および方法 | |
| EP0194156B1 (en) | Method of measuring the amount of immune antibody in serum | |
| JPS6231299B2 (ja) | ||
| US20110207151A1 (en) | Utilisation de ferrofluides pour le phenotypage sanguin et applications derivees | |
| JP2647931B2 (ja) | 免疫学的測定方法 | |
| GB1590525A (en) | Biological analysis | |
| JP2642697B2 (ja) | 固相指示薬の赤血球およびその調製法 | |
| WO1993019371A1 (en) | Determination of binding affinity using magneticaly-labeled binding members | |
| JPH02124464A (ja) | 磁性マーカー粒子を用いた免疫学的測定方法 | |
| JPH07117541B2 (ja) | 磁性粒子を用いた免疫学的測定方法 | |
| JP2614997B2 (ja) | 凝集反応のための反応促進装置 | |
| JP2716227B2 (ja) | 磁性マーカー粒子を用いた免疫学的測定方法 | |
| EP0417301A1 (en) | Method for assaying indirect agglutination | |
| WO1986007463A1 (en) | Microtiter - surface - flocculation assay for antigen or antibody screening | |
| US5288610A (en) | Detecting reagent for antiplatelet antibody | |
| JPH0827285B2 (ja) | 固定化赤血球を用いた免疫学的測定方法 | |
| JPH03191864A (ja) | 間接凝集免疫測定方法及び装置 | |
| JP3598701B2 (ja) | 不溶性担体を用いた免疫化学的測定方法 | |
| JPH06148188A (ja) | 免疫学的再検査方法 | |
| JPH11304801A (ja) | 間接抗原固定化による自己抗体検出方法 | |
| JP2505088B2 (ja) | 固相免疫測定用試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |