JP2646081B2 - 生物学的に活性な蛋白質の回収方法 - Google Patents
生物学的に活性な蛋白質の回収方法Info
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- C07K—PEPTIDES
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は精製され、かつ生物学的に活性な形態におい
て蛋白質を回収する方法に関し、蛋白質は最初微生物中
に不溶性で、生物学的に不活性な封入体として生成さ
れ、この微生物は蛋白質の発現を指示する組換え型DNA
発現ベクターにより形質転換されたものである。より詳
細には、本発明は蛋白質の凝集および沈殿の結果、処理
中に生じる損失を最小とすることにより改良された収率
をもってこの種蛋白質を回収する方法に関する。
て蛋白質を回収する方法に関し、蛋白質は最初微生物中
に不溶性で、生物学的に不活性な封入体として生成さ
れ、この微生物は蛋白質の発現を指示する組換え型DNA
発現ベクターにより形質転換されたものである。より詳
細には、本発明は蛋白質の凝集および沈殿の結果、処理
中に生じる損失を最小とすることにより改良された収率
をもってこの種蛋白質を回収する方法に関する。
組換え型DNA技術は、外来の（異種）DNAを微生物に持
ち込むベクターの挿入を、それが異種DNAを発現させる
方法において行わせるものであり、すなわち、そのベク
ターは微生物に非相同DNAシーケンスの一部により暗号
づけされる蛋白質の生成を指示する遺伝インストラクシ
ョンを含有するものである。発酵槽中で形質転換性微生
物を成長させ、かつそれらを非相同DNAが発現される条
件下に置くことにより、有益な蛋白質を比較的低コスト
で大量に生成することができる。
ち込むベクターの挿入を、それが異種DNAを発現させる
方法において行わせるものであり、すなわち、そのベク
ターは微生物に非相同DNAシーケンスの一部により暗号
づけされる蛋白質の生成を指示する遺伝インストラクシ
ョンを含有するものである。発酵槽中で形質転換性微生
物を成長させ、かつそれらを非相同DNAが発現される条
件下に置くことにより、有益な蛋白質を比較的低コスト
で大量に生成することができる。
不幸なことに、形質転換性微生物中で生成される多く
の非相同蛋白質は宿主細胞雰囲気において、それら固有
の三次元配座に折たたまれない。発現蛋白質の不適切な
フォールディングは数種類の不利な結果を伴う。第一
に、不適当に折たたまれた蛋白質は凝集体を生ずる傾向
があり、これは宿主細胞中で不溶である。これら不溶性
凝集体は「封入体」あるいはまた、ときに「リフラクチ
ル（refractile）体」と称される細胞中で認識可能であ
る。封入体の生成もまた、分子内ジスルフィド結合の生
成を経由する蛋白質のオリゴマー化により部分的に行わ
せることができる。不適切な折たたまれた蛋白質は不溶
性であるばかりでなく、それらはまた生物学的に不活性
である。宿主細胞内の発現の結果、不溶性で生物学的に
不活性な封入体を生成する非相同蛋白質の代表例とし
て、ウシ成長ホルモンおよびブタ成長ホルモンのような
動物成長ホルモンを挙げることができる。
の非相同蛋白質は宿主細胞雰囲気において、それら固有
の三次元配座に折たたまれない。発現蛋白質の不適切な
フォールディングは数種類の不利な結果を伴う。第一
に、不適当に折たたまれた蛋白質は凝集体を生ずる傾向
があり、これは宿主細胞中で不溶である。これら不溶性
凝集体は「封入体」あるいはまた、ときに「リフラクチ
ル（refractile）体」と称される細胞中で認識可能であ
る。封入体の生成もまた、分子内ジスルフィド結合の生
成を経由する蛋白質のオリゴマー化により部分的に行わ
せることができる。不適切な折たたまれた蛋白質は不溶
性であるばかりでなく、それらはまた生物学的に不活性
である。宿主細胞内の発現の結果、不溶性で生物学的に
不活性な封入体を生成する非相同蛋白質の代表例とし
て、ウシ成長ホルモンおよびブタ成長ホルモンのような
動物成長ホルモンを挙げることができる。
有益な蛋白質を生成するために、不適切に折たたまれ
た封入体蛋白質をそれら固有の配座に転化させる必要が
あり、そうすることによりそれらは可溶性となり、かつ
生物学的に活性となる。更に、汚染された細胞細片なら
びに宿主細胞蛋白質を除去するために蛋白質を精製する
必要がある。封入体蛋白質をそれらの可溶性、固有配座
に転化し、かつその蛋白質を精製して化学的に受容可能
な生成物とするために、数多くの案が提案されて来た。
提案された全ての案は、初期の展開（unfolding）また
は変性ステップにより特徴づけられており、蛋白質分子
を展開し、かつそれらを可溶性とするために、封入体蛋
白質は強変性剤〔ときには、ケイオトロープ（chaotrop
e）と称される〕によって処理される。塩酸グアニジン
がこの目的のために最も一般的に使用される強力変性剤
である。回収プロセスにおける次の工程で、変性剤が除
去されるので展開蛋白質分子をそれら固有の配座に再フ
ォールディングすることができ、この工程はまた、本明
細書中で「リネーチュアレーション（再生）（renatura
tion）」とも称する。
た封入体蛋白質をそれら固有の配座に転化させる必要が
あり、そうすることによりそれらは可溶性となり、かつ
生物学的に活性となる。更に、汚染された細胞細片なら
びに宿主細胞蛋白質を除去するために蛋白質を精製する
必要がある。封入体蛋白質をそれらの可溶性、固有配座
に転化し、かつその蛋白質を精製して化学的に受容可能
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提案された全ての案は、初期の展開（unfolding）また
は変性ステップにより特徴づけられており、蛋白質分子
を展開し、かつそれらを可溶性とするために、封入体蛋
白質は強変性剤〔ときには、ケイオトロープ（chaotrop
e）と称される〕によって処理される。塩酸グアニジン
がこの目的のために最も一般的に使用される強力変性剤
である。回収プロセスにおける次の工程で、変性剤が除
去されるので展開蛋白質分子をそれら固有の配座に再フ
ォールディングすることができ、この工程はまた、本明
細書中で「リネーチュアレーション（再生）（renatura
tion）」とも称する。
米国特許第4,511,503号は上に説明したタイプの典型
的な回収案を開示している。精製および／または収率向
上を指向する付加的処理工程を含むこの案に関する数多
くの変更も提案された。このように、たとえば米国特許
第4,511,502号は可溶化蛋白質／変性剤溶液を分子篩を
通過させるか、あるいは高速で遠心分離させてより高分
子量の成分を除去する方法を開示している。米国特許第
4,518,526号は形質転換性細胞培養物を、十分なイオン
強度を有する緩衝液で処理して宿主細胞蛋白質の大部分
を可溶化する一方、異種蛋白質を不溶性のままとする方
法を開示している。次に、これらの細胞を溶解させ、可
溶化宿主細胞蛋白質を含有する上澄み液を除去し、そし
て不溶性封入体を強変性剤中で可溶化させる。
的な回収案を開示している。精製および／または収率向
上を指向する付加的処理工程を含むこの案に関する数多
くの変更も提案された。このように、たとえば米国特許
第4,511,502号は可溶化蛋白質／変性剤溶液を分子篩を
通過させるか、あるいは高速で遠心分離させてより高分
子量の成分を除去する方法を開示している。米国特許第
4,518,526号は形質転換性細胞培養物を、十分なイオン
強度を有する緩衝液で処理して宿主細胞蛋白質の大部分
を可溶化する一方、異種蛋白質を不溶性のままとする方
法を開示している。次に、これらの細胞を溶解させ、可
溶化宿主細胞蛋白質を含有する上澄み液を除去し、そし
て不溶性封入体を強変性剤中で可溶化させる。
封入体蛋白質を、それらの可溶性、固有配座に転化さ
せるための変性／リネーチュアレーション案を開示して
いる他の刊行物には、PCT公告WO83/04418号、欧州特許
出願公告第０ 123 928号、欧州特許出願公告第０ 12
1 775号、欧州特許出願公告第０ 116 778号、および
欧州特許出願公告第０ 114 507号がある。
せるための変性／リネーチュアレーション案を開示して
いる他の刊行物には、PCT公告WO83/04418号、欧州特許
出願公告第０ 123 928号、欧州特許出願公告第０ 12
1 775号、欧州特許出願公告第０ 116 778号、および
欧州特許出願公告第０ 114 507号がある。
回収プロセスの或る地点で、望ましくない宿主細胞蛋
白質のような異物を除去するために可溶化蛋白質を精製
工程にかけることが必要である。イオン交換クロマトグ
ラフィー、親和クロマトグラフィー等を含む蛋白質精製
に関する慣用技術がこの目的のために通常用いられる。
精製工程は、或る場合には変性剤の除去に先立って行わ
れ、また他の場合には変性剤の除去に引き続いて行われ
る。理論的には上に論述した変性／リネーチュアレーシ
ョン案が、異物を含まない可溶性で生物学的に活性な形
態をもって封入体蛋白質を回収するという問題に関し、
容易な解決をもたらす。しかしながら、これら案の実際
上の実施では低収率および不経済な操作の問題で悩まさ
れて来た。
白質のような異物を除去するために可溶化蛋白質を精製
工程にかけることが必要である。イオン交換クロマトグ
ラフィー、親和クロマトグラフィー等を含む蛋白質精製
に関する慣用技術がこの目的のために通常用いられる。
精製工程は、或る場合には変性剤の除去に先立って行わ
れ、また他の場合には変性剤の除去に引き続いて行われ
る。理論的には上に論述した変性／リネーチュアレーシ
ョン案が、異物を含まない可溶性で生物学的に活性な形
態をもって封入体蛋白質を回収するという問題に関し、
容易な解決をもたらす。しかしながら、これら案の実際
上の実施では低収率および不経済な操作の問題で悩まさ
れて来た。
これらの問題は殆ど可溶化蛋白質が再凝集することに
由来し、これは変性剤除去の結果蛋白質が不適当に再フ
ォールディングされるか、あるいは精製の行われる条件
が蛋白質を可溶状態に維持する能力を妨げることに基因
するものである。我々は、グアニジン可溶化と引き続く
グアニジン除去の採用が蛋白質を再フォールディング
し、かつイオン交換クロマトグラフィーカラムに対する
精製が封入体中に存在する所望蛋白質量を基準として約
４％乃至約12％を回収するということを見出した。これ
らの収量は経済的な観点から最小の受容可能値と考えら
れるものより遥かに低いものである。
由来し、これは変性剤除去の結果蛋白質が不適当に再フ
ォールディングされるか、あるいは精製の行われる条件
が蛋白質を可溶状態に維持する能力を妨げることに基因
するものである。我々は、グアニジン可溶化と引き続く
グアニジン除去の採用が蛋白質を再フォールディング
し、かつイオン交換クロマトグラフィーカラムに対する
精製が封入体中に存在する所望蛋白質量を基準として約
４％乃至約12％を回収するということを見出した。これ
らの収量は経済的な観点から最小の受容可能値と考えら
れるものより遥かに低いものである。
本発明は、実質的に改良された収率をもって不溶性封
入体から精製し、可溶化した生物学的活性蛋白質を回収
する方法を提供するものである。本発明方法において、
再凝集蛋白質を含む側ストリーム沈殿物がクロマトグラ
フ精製を伴う主プロセス・ストリームから回収される。
次いで、それらは回収されたサイドストリーム蛋白質の
溶液が主プロセス・ストリーム中の蛋白質溶液と相溶性
である条件下で再可溶化され、かつ主プロセス・ストリ
ームに復帰させる。
入体から精製し、可溶化した生物学的活性蛋白質を回収
する方法を提供するものである。本発明方法において、
再凝集蛋白質を含む側ストリーム沈殿物がクロマトグラ
フ精製を伴う主プロセス・ストリームから回収される。
次いで、それらは回収されたサイドストリーム蛋白質の
溶液が主プロセス・ストリーム中の蛋白質溶液と相溶性
である条件下で再可溶化され、かつ主プロセス・ストリ
ームに復帰させる。
本発明の一実施態様においては、不溶性蛋白質凝集体
を、可溶性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方
を含有する精製用カラム流出液から単離し、単離された
蛋白質凝集体を変性剤中で可溶化し、この溶液をより弱
い変性剤を含む溶液に対し透析して蛋白質を部分的にリ
ネーチュアレーションし、部分的にリネーチュアレーシ
ョンした蛋白質の溶液を変性剤を含まない緩衝液に対し
透析して変性剤を除去すると共に蛋白質のリネーチュア
レーションを完了させ、そしてリネーチュアレーション
した蛋白質溶液を精製用カラムから得た可溶性、精製蛋
白質と混合する。
を、可溶性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方
を含有する精製用カラム流出液から単離し、単離された
蛋白質凝集体を変性剤中で可溶化し、この溶液をより弱
い変性剤を含む溶液に対し透析して蛋白質を部分的にリ
ネーチュアレーションし、部分的にリネーチュアレーシ
ョンした蛋白質の溶液を変性剤を含まない緩衝液に対し
透析して変性剤を除去すると共に蛋白質のリネーチュア
レーションを完了させ、そしてリネーチュアレーション
した蛋白質溶液を精製用カラムから得た可溶性、精製蛋
白質と混合する。
本発明の他の実施態様においては、蛋白質凝集体を可
溶性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方を含有
する精製用カラム流出液から単離し、単離された蛋白質
凝集体を変性剤で可溶化し、この溶液を変性剤を含まな
い緩衝液に対し直接透析して可溶性蛋白質および不溶性
蛋白質凝集体双方を含有する溶液を入手し、不溶性蛋白
質凝集体をこの溶液から除去し、そして可溶性蛋白質を
含有する溶液を精製用カラムから得た可溶性、蛋白質溶
液と混合する。
溶性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方を含有
する精製用カラム流出液から単離し、単離された蛋白質
凝集体を変性剤で可溶化し、この溶液を変性剤を含まな
い緩衝液に対し直接透析して可溶性蛋白質および不溶性
蛋白質凝集体双方を含有する溶液を入手し、不溶性蛋白
質凝集体をこの溶液から除去し、そして可溶性蛋白質を
含有する溶液を精製用カラムから得た可溶性、蛋白質溶
液と混合する。
リネーチュアレーションした蛋白質凝集体の２段透析
を伴う本発明の前者の実施態様は、可溶性蛋白質の若干
のものが弱結合物質の形態を有しているが、可溶性蛋白
質の75％程度の高い回収をもたらす。リネーチュアレー
ションした蛋白質凝集体の１段透析を伴う本発明の後者
の実施態様は、可溶性蛋白質の実質的により低い回収を
もたらすが、得られた可溶性蛋白質の殆ど全ては弱結合
物質の形態を有している。いずれの場合にも、回収され
た側ストリーム凝集体の精製および回収工程への導入は
可溶性、生物学的活性蛋白質における実質的増加をもた
らす。
を伴う本発明の前者の実施態様は、可溶性蛋白質の若干
のものが弱結合物質の形態を有しているが、可溶性蛋白
質の75％程度の高い回収をもたらす。リネーチュアレー
ションした蛋白質凝集体の１段透析を伴う本発明の後者
の実施態様は、可溶性蛋白質の実質的により低い回収を
もたらすが、得られた可溶性蛋白質の殆ど全ては弱結合
物質の形態を有している。いずれの場合にも、回収され
た側ストリーム凝集体の精製および回収工程への導入は
可溶性、生物学的活性蛋白質における実質的増加をもた
らす。
先に説明したように、本発明は形質転換性微生物中で
不溶性、生物学的不活性封入体として生成された蛋白質
の回収に関する精製および活性化プロセスにおいて得ら
れる可溶性、生物学的活性蛋白質の合計収量を改良する
方法を提供するものである。本発明の方法は形質転換性
微生物、すなわち非相同蛋白質についての遺伝子暗号づ
けの発現を指示する組換え型DNAベクターで形質転換さ
せた微生物内で、不溶性、生物学的不活性封入体の形態
で生成される凡ゆる蛋白質を回収するために利用するこ
とができる。本発明の具体的実施態様において、高収率
で回収される蛋白質は動物成長ホルモン、たとえばウシ
成長ホルモン（bGH）またはブタ成長ホルモン（pGH）で
ある。
不溶性、生物学的不活性封入体として生成された蛋白質
の回収に関する精製および活性化プロセスにおいて得ら
れる可溶性、生物学的活性蛋白質の合計収量を改良する
方法を提供するものである。本発明の方法は形質転換性
微生物、すなわち非相同蛋白質についての遺伝子暗号づ
けの発現を指示する組換え型DNAベクターで形質転換さ
せた微生物内で、不溶性、生物学的不活性封入体の形態
で生成される凡ゆる蛋白質を回収するために利用するこ
とができる。本発明の具体的実施態様において、高収率
で回収される蛋白質は動物成長ホルモン、たとえばウシ
成長ホルモン（bGH）またはブタ成長ホルモン（pGH）で
ある。
ここで理解すべきは、本明細書中で言及される蛋白質
一般に……たとえば、ホルモンおよび酵素……あるいは
具体的な蛋白質、たとえばbGHおよびpGHは天然蛋白質の
完全なアミノ酸シーケンスを有する分子種に対する限定
を意図するものではないことである。それどころが、削
除したシーケンスの様々な部分を有する蛋白質の破片の
包含ならびに分子の生物学的活性を破壊しない、それら
天然のシーケンスにおける各種の置換または変形を伴う
それらの破片の包含をもまた、意図するものである。
一般に……たとえば、ホルモンおよび酵素……あるいは
具体的な蛋白質、たとえばbGHおよびpGHは天然蛋白質の
完全なアミノ酸シーケンスを有する分子種に対する限定
を意図するものではないことである。それどころが、削
除したシーケンスの様々な部分を有する蛋白質の破片の
包含ならびに分子の生物学的活性を破壊しない、それら
天然のシーケンスにおける各種の置換または変形を伴う
それらの破片の包含をもまた、意図するものである。
bGHおよびpGHの遺伝子は発現ベクター上にクローンさ
れ、かつ利用されてエシェリヒア・コリ（E.coli）宿主
細胞を形質転換する。欧州特許出願公告第０ 103 395
号はΔ９（Ser）bGH（その9N−末端アミノ酸以下のbGH
で、かつＮ−末端において付加的セリン残基を有するも
の）についてλPLプロモーターオペレータの制御下で暗
号づけする第１のプラスミドを含むエシェリヒア・コリ
の形質転換性菌株の構造であって、バクテリオファージ
muに由来するシャイン−ダルガーノ領域を有するものを
説明している。この形質転換体はまた、cl857感温性リ
プレッサー蛋白質の生成について暗号づけする第２のプ
ラスミド、pcl857をも含有している。リプレッサー蛋白
質は温度を約42℃に上昇させることにより不活性化させ
ることができ、それによりΔ９（Ser）bGHの発現を誘導
する。このタイプの形質転換性菌株、エシェリヒア・コ
リHB101（PL−mu−Δ９（Ser）bGHおよびpcl857）はメ
リーランド州、ロックヴィルのジ・アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（The American Type cult
ure Collection）に受け入れ番号No.53030により表示、
エシェリヒア・コリ、IMC No.1をもって寄託されてい
る。
れ、かつ利用されてエシェリヒア・コリ（E.coli）宿主
細胞を形質転換する。欧州特許出願公告第０ 103 395
号はΔ９（Ser）bGH（その9N−末端アミノ酸以下のbGH
で、かつＮ−末端において付加的セリン残基を有するも
の）についてλPLプロモーターオペレータの制御下で暗
号づけする第１のプラスミドを含むエシェリヒア・コリ
の形質転換性菌株の構造であって、バクテリオファージ
muに由来するシャイン−ダルガーノ領域を有するものを
説明している。この形質転換体はまた、cl857感温性リ
プレッサー蛋白質の生成について暗号づけする第２のプ
ラスミド、pcl857をも含有している。リプレッサー蛋白
質は温度を約42℃に上昇させることにより不活性化させ
ることができ、それによりΔ９（Ser）bGHの発現を誘導
する。このタイプの形質転換性菌株、エシェリヒア・コ
リHB101（PL−mu−Δ９（Ser）bGHおよびpcl857）はメ
リーランド州、ロックヴィルのジ・アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（The American Type cult
ure Collection）に受け入れ番号No.53030により表示、
エシェリヒア・コリ、IMC No.1をもって寄託されてい
る。
Δ7pGH（その最初の7N−末端アミノ酸以下のブタ成長
ホルモン）の生成について暗号づけする類似の形質転換
性菌株の構造は欧州特許出願公告第０ 104 920号中に
記載されている。このタイプの形質転換性菌株、エシェ
リヒア・コリHB101（PL−mu−Δ7pGHおよびpcu857）は
メリーランド州、ロックヴィルのジ・アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションに受け入れ番号No.53031
により表示、エシェリヒア・コリ、IMC No.2をもって寄
託されている。
ホルモン）の生成について暗号づけする類似の形質転換
性菌株の構造は欧州特許出願公告第０ 104 920号中に
記載されている。このタイプの形質転換性菌株、エシェ
リヒア・コリHB101（PL−mu−Δ7pGHおよびpcu857）は
メリーランド州、ロックヴィルのジ・アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションに受け入れ番号No.53031
により表示、エシェリヒア・コリ、IMC No.2をもって寄
託されている。
エシェリヒア・コリ、IMC No.1およびエシェリヒア・
コリ、IMC No.2はそれぞれΔ９（Ser）bGHおよびΔ7pGH
の多産のプロデューサ（producer）である。両者の場合
共、発現蛋白質は顕微鏡下で可視である不溶性、生物学
的不活性封入体の形態である細胞内に封鎖されている。
コリ、IMC No.2はそれぞれΔ９（Ser）bGHおよびΔ7pGH
の多産のプロデューサ（producer）である。両者の場合
共、発現蛋白質は顕微鏡下で可視である不溶性、生物学
的不活性封入体の形態である細胞内に封鎖されている。
本発明による回収方法の好ましい実施態様は以下の図
表Ｉおよび図表IIを参照することによって、より良く理
解することができる。図表Ｉを参照すれば、発酵槽中で
成長し、かつ封入体の形態で蛋白質を蓄積した形質転換
性細胞が、機械的、化学的または酵素的に溶解されて、
細胞内に封入されている封入体の単離を行っている。こ
の封入体は遠心分離および緩衝液中の洗浄によって細胞
物質の残りの大部分から分離させ、湿潤封入体ペースト
を生成することができる。
表Ｉおよび図表IIを参照することによって、より良く理
解することができる。図表Ｉを参照すれば、発酵槽中で
成長し、かつ封入体の形態で蛋白質を蓄積した形質転換
性細胞が、機械的、化学的または酵素的に溶解されて、
細胞内に封入されている封入体の単離を行っている。こ
の封入体は遠心分離および緩衝液中の洗浄によって細胞
物質の残りの大部分から分離させ、湿潤封入体ペースト
を生成することができる。
湿潤封入体ペースト中の封入体蛋白質は、強変性剤を
含む緩衝液中への抽出により可溶化させる。本明細書中
で用いるように術語「強変性剤」はグアニジンまたは尿
素変性剤を指称し、これらは濃度約6M乃至約8Mにおいて
封入体蛋白質を完全に、しかし可逆的に変性することが
可能である。この目的のための好ましい変性剤にはグア
ニジン塩類、特に塩酸グアニジンがある。所望により、
洗剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）または
「トライトン（Triton）X100」を濃度約１％で強変性剤
として使用することができる。英国特許出願GB2 138
004号中に開示されるように、9.0乃至11.5の範囲に及び
pHを有するアルカリ水溶液もまた、強変性剤として利用
可能である。
含む緩衝液中への抽出により可溶化させる。本明細書中
で用いるように術語「強変性剤」はグアニジンまたは尿
素変性剤を指称し、これらは濃度約6M乃至約8Mにおいて
封入体蛋白質を完全に、しかし可逆的に変性することが
可能である。この目的のための好ましい変性剤にはグア
ニジン塩類、特に塩酸グアニジンがある。所望により、
洗剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）または
「トライトン（Triton）X100」を濃度約１％で強変性剤
として使用することができる。英国特許出願GB2 138
004号中に開示されるように、9.0乃至11.5の範囲に及び
pHを有するアルカリ水溶液もまた、強変性剤として利用
可能である。
封入体蛋白質の強変性剤への抽出は、蛋白質分子を非
フォールディングさせ、そして可溶とする。この時点
で、溶液は、たとえば遠心分離により透明にして凡ゆる
懸濁不溶解物質を除去する。
フォールディングさせ、そして可溶とする。この時点
で、溶液は、たとえば遠心分離により透明にして凡ゆる
懸濁不溶解物質を除去する。
次に変性剤を、たとえば何倍容量もの変性剤を含まな
い緩衝液に対して透析させることにより除去して、蛋白
質をリネーチュアレーションする。リネーチュアレーシ
ョンした蛋白質を含む緩衝液は、リネーチュアレーショ
ン工程中に生成されるかも知れない凡ゆる再凝集物質を
除去するために遠心分離させることが可能である。次い
で、リネーチュアレーションした封入体蛋白質をクロマ
トグラフ法により精製する。
い緩衝液に対して透析させることにより除去して、蛋白
質をリネーチュアレーションする。リネーチュアレーシ
ョンした蛋白質を含む緩衝液は、リネーチュアレーショ
ン工程中に生成されるかも知れない凡ゆる再凝集物質を
除去するために遠心分離させることが可能である。次い
で、リネーチュアレーションした封入体蛋白質をクロマ
トグラフ法により精製する。
蛋白質についての、如何なる慣用のクロマトグラフ法
精製手段も利用可能である。たとえば、蛋白質は親和力
クロマトグラフィー、サイズ・エクスクルージョン（si
ze exclusion）クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーまたは他の凡ゆる知られ、かつ従来使用さ
れているクロマトグラフ技法により精製することができ
る。これらの技法は単一で、もしくは次々に利用しても
よい。図表Ｉ及び図表IIに示したように、可溶化蛋白質
を精製する好ましい方法はアニオン交換クロマトグラフ
ィーである。好ましいアニオン交換カラムには、「QAE
−セファデックス（Sephadex）A25」「DEAEセファロー
ス（Sepharose）CL−6B、DE−53」セルロース、「DE−5
2」セルロース、「DE−51」セルロース、「セルフィン
（Cellufine）AM」、「インジオン（Indion）DEAE」、
「インジオンQAE」または「ゼタプレップ（Zetaprep）Q
AE」がある。アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製は慣用の方法により行われる。精製用カラムからの溶
離によって、可成りの量の蛋白質の再凝集が通常は生ず
ることになる。その結果、カラムからの流出液は可溶お
よび不溶性蛋白質双方を含む濁った溶液を含有してい
る。カラム中に残る如何なる連行蛋白質凝集体をも除去
するために、このカラムを緩衝液で洗浄することが可能
である。
精製手段も利用可能である。たとえば、蛋白質は親和力
クロマトグラフィー、サイズ・エクスクルージョン（si
ze exclusion）クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーまたは他の凡ゆる知られ、かつ従来使用さ
れているクロマトグラフ技法により精製することができ
る。これらの技法は単一で、もしくは次々に利用しても
よい。図表Ｉ及び図表IIに示したように、可溶化蛋白質
を精製する好ましい方法はアニオン交換クロマトグラフ
ィーである。好ましいアニオン交換カラムには、「QAE
−セファデックス（Sephadex）A25」「DEAEセファロー
ス（Sepharose）CL−6B、DE−53」セルロース、「DE−5
2」セルロース、「DE−51」セルロース、「セルフィン
（Cellufine）AM」、「インジオン（Indion）DEAE」、
「インジオンQAE」または「ゼタプレップ（Zetaprep）Q
AE」がある。アニオン交換クロマトグラフィーによる精
製は慣用の方法により行われる。精製用カラムからの溶
離によって、可成りの量の蛋白質の再凝集が通常は生ず
ることになる。その結果、カラムからの流出液は可溶お
よび不溶性蛋白質双方を含む濁った溶液を含有してい
る。カラム中に残る如何なる連行蛋白質凝集体をも除去
するために、このカラムを緩衝液で洗浄することが可能
である。
再び図表Ｉを参照すると、不溶性、再凝集蛋白質は好
ましくは遠心分離により精製用カラム流出液から単離さ
れる。次に、再凝集蛋白質（側ストリーム蛋白質）を含
んで成る沈殿物は再可溶化させる。
ましくは遠心分離により精製用カラム流出液から単離さ
れる。次に、再凝集蛋白質（側ストリーム蛋白質）を含
んで成る沈殿物は再可溶化させる。
我々は、蛋白質が一度精製されると、再凝集した蛋白
質の可溶化は、湿潤封入体ペーストからの最初の可溶化
について必要とされるよりも低い濃度において若干弱い
変性剤を用いることにより、あるいは強変性剤を使用す
ることにより達成し得ることを見出した。封入体を可溶
化するのに一般に塩酸グアニジン６乃至8Mを必要とする
のに対し（尿素溶液は一般に封入体を可溶化することは
できない）、精製用カラム流出液から得た凝集かつ精製
した蛋白質は塩酸グアニジン３−6Mまたは尿素溶液６−
8M中で満足に可溶化することができる。塩酸グアニジン
は高価な試薬なので、比較的弱い変性剤を用いて精製用
カラム流出液から側ストリーム凝集体を再可溶化するそ
の能力が、回収工程を経済的に有効なものとする。更
に、蛋白質を可溶化するための比較的弱い変性剤の使用
が、変性剤の除去による再凝集の危険を減少させ、それ
によって収率を高めることができる。
質の可溶化は、湿潤封入体ペーストからの最初の可溶化
について必要とされるよりも低い濃度において若干弱い
変性剤を用いることにより、あるいは強変性剤を使用す
ることにより達成し得ることを見出した。封入体を可溶
化するのに一般に塩酸グアニジン６乃至8Mを必要とする
のに対し（尿素溶液は一般に封入体を可溶化することは
できない）、精製用カラム流出液から得た凝集かつ精製
した蛋白質は塩酸グアニジン３−6Mまたは尿素溶液６−
8M中で満足に可溶化することができる。塩酸グアニジン
は高価な試薬なので、比較的弱い変性剤を用いて精製用
カラム流出液から側ストリーム凝集体を再可溶化するそ
の能力が、回収工程を経済的に有効なものとする。更
に、蛋白質を可溶化するための比較的弱い変性剤の使用
が、変性剤の除去による再凝集の危険を減少させ、それ
によって収率を高めることができる。
側ストリーム蛋白質を再可溶化させるに際して使用す
る好ましい変性剤は、グアニジン−HCl3−6Mである。典
型的に、不溶性側ストリーム蛋白質はグアニジン−HCl3
M中に蛋白質の40vol./グラムをもって溶解される。溶解
は一般に２−３時間以内で完了する。所望により還元
剤、たとえば5mMのグルタチオンを添加して、分子内ジ
スルフィド結合の生成を阻止してもよいが、我々は、殆
ど分子内ジスルフィド結合が生じないので、これは一般
に不要であることを見出した。
る好ましい変性剤は、グアニジン−HCl3−6Mである。典
型的に、不溶性側ストリーム蛋白質はグアニジン−HCl3
M中に蛋白質の40vol./グラムをもって溶解される。溶解
は一般に２−３時間以内で完了する。所望により還元
剤、たとえば5mMのグルタチオンを添加して、分子内ジ
スルフィド結合の生成を阻止してもよいが、我々は、殆
ど分子内ジスルフィド結合が生じないので、これは一般
に不要であることを見出した。
図表Ｉに示した本発明の実施態様によれば、精製用カ
ラム流出液からの変性蛋白質凝集体は段階的な方法にお
いてリネーチュアされる。第１のステップにおいて、蛋
白質を部分的に再フォールディングさせるために、変性
蛋白質の溶液を、比較的薄い変性剤を含む何倍容量もの
緩衝液に対して透析する。典型的に、希薄変性剤溶液は
３−6Mの尿素であり、好ましくは尿素約3.5Mである。次
いで、より弱い変性剤を除去し、かつ蛋白質をその固有
の配座に再折たたみさせるために、部分的に再折たたみ
された蛋白質および希薄変性剤を含有する溶液を、変性
剤を含まない緩衝液に対して透析させる。
ラム流出液からの変性蛋白質凝集体は段階的な方法にお
いてリネーチュアされる。第１のステップにおいて、蛋
白質を部分的に再フォールディングさせるために、変性
蛋白質の溶液を、比較的薄い変性剤を含む何倍容量もの
緩衝液に対して透析する。典型的に、希薄変性剤溶液は
３−6Mの尿素であり、好ましくは尿素約3.5Mである。次
いで、より弱い変性剤を除去し、かつ蛋白質をその固有
の配座に再折たたみさせるために、部分的に再折たたみ
された蛋白質および希薄変性剤を含有する溶液を、変性
剤を含まない緩衝液に対して透析させる。
好ましいのは、部分的にリネーチュアレーションした
蛋白質を含む溶液を第１にNaCl約0.1乃至1.0Mを含有す
る変性剤を伴わない緩衝液に対して透析し、引き続いて
NaClを含まない緩衝液に対して第２の透析を行うもので
ある。NaCl含有緩衝液への中間の透析は、生物学的に活
性ではない可溶性蛋白質凝集体の選択的沈殿を行わせる
一方、生物学的に活性な単量体蛋白質の可成りの部分を
再折たたみさせる。
蛋白質を含む溶液を第１にNaCl約0.1乃至1.0Mを含有す
る変性剤を伴わない緩衝液に対して透析し、引き続いて
NaClを含まない緩衝液に対して第２の透析を行うもので
ある。NaCl含有緩衝液への中間の透析は、生物学的に活
性ではない可溶性蛋白質凝集体の選択的沈殿を行わせる
一方、生物学的に活性な単量体蛋白質の可成りの部分を
再折たたみさせる。
我々は、側ストリーム蛋白質の回収中に、工程中で利
用するpHおよび温度を制御することにより再凝集を阻止
し得ることを見出した。好ましいのは、緩衝液が約9.0
乃至約10.0の範囲のpHを有し、かつ該液の温度が約４℃
乃至約10℃に維持されることである。この範囲で使用さ
れる好ましい緩衝液はエタノールアミンHCl、グリシンN
aOHおよびコーネル（Cornell）緩衝液（炭酸塩−炭酸水
素塩緩衝液）である。
用するpHおよび温度を制御することにより再凝集を阻止
し得ることを見出した。好ましいのは、緩衝液が約9.0
乃至約10.0の範囲のpHを有し、かつ該液の温度が約４℃
乃至約10℃に維持されることである。この範囲で使用さ
れる好ましい緩衝液はエタノールアミンHCl、グリシンN
aOHおよびコーネル（Cornell）緩衝液（炭酸塩−炭酸水
素塩緩衝液）である。
回収した側ストリーム蛋白質の主プロセス・ストリー
ムへの再導入を行わせるためには、それに対し回収され
た側ストリーム蛋白質が透析される最終緩衝液が再導入
の時点で主プロセス・ストリーム中で使用される緩衝液
と相溶性を有するか、好ましくは同一物質であることが
必須である。回収された側ストリーム蛋白質の最終緩衝
液をクロマトグラフィーカラム溶出緩衝液と整合させる
ことにより、２つの流れをこの時点で混合して可溶性
で、生物学的活性蛋白質の高められた収率を得ることが
できる。
ムへの再導入を行わせるためには、それに対し回収され
た側ストリーム蛋白質が透析される最終緩衝液が再導入
の時点で主プロセス・ストリーム中で使用される緩衝液
と相溶性を有するか、好ましくは同一物質であることが
必須である。回収された側ストリーム蛋白質の最終緩衝
液をクロマトグラフィーカラム溶出緩衝液と整合させる
ことにより、２つの流れをこの時点で混合して可溶性
で、生物学的活性蛋白質の高められた収率を得ることが
できる。
図表IIを参照すると、例示された実施態様と図表Ｉの
実施態様との本質的な差異は再可溶化された側ストリー
ム蛋白質がリネーチュアレーションされる方法中に存在
することが理解できる。図表II中に示される実施態様に
おいて、再可溶化された蛋白質凝集体は変性剤を含まな
い緩衝液に対して直接透析することにより、すなわ中間
段階の希薄変性剤を用いることなくリネーチュアレーシ
ョンされる。
実施態様との本質的な差異は再可溶化された側ストリー
ム蛋白質がリネーチュアレーションされる方法中に存在
することが理解できる。図表II中に示される実施態様に
おいて、再可溶化された蛋白質凝集体は変性剤を含まな
い緩衝液に対して直接透析することにより、すなわ中間
段階の希薄変性剤を用いることなくリネーチュアレーシ
ョンされる。
この方法はリネーチュアレーション・プロセス中に、
若干の蛋白質の再凝集をもたらすが、我々は溶液中に残
留する蛋白質が本質的には全て単量体であることを見出
した。従って、本実施態様において側ストリームから回
収される可溶性蛋白質は、そのグラム当たりの生物学的
活性について、図表Ｉに示す実施態様において回収され
た蛋白質よりも若干高いレベルを有する可能性がある。
変性剤を含まない緩衝液に対する透析に引き続いて、得
られた溶液を遠心分離し、そして可溶性、生物学的活性
蛋白質を含有する上澄み液を、主プロセス・ストリーム
中の可溶性リネーチュアレーション蛋白質内に再導入す
る。沈殿物中の再凝集蛋白質を図示のように再循環する
ことができる。
若干の蛋白質の再凝集をもたらすが、我々は溶液中に残
留する蛋白質が本質的には全て単量体であることを見出
した。従って、本実施態様において側ストリームから回
収される可溶性蛋白質は、そのグラム当たりの生物学的
活性について、図表Ｉに示す実施態様において回収され
た蛋白質よりも若干高いレベルを有する可能性がある。
変性剤を含まない緩衝液に対する透析に引き続いて、得
られた溶液を遠心分離し、そして可溶性、生物学的活性
蛋白質を含有する上澄み液を、主プロセス・ストリーム
中の可溶性リネーチュアレーション蛋白質内に再導入す
る。沈殿物中の再凝集蛋白質を図示のように再循環する
ことができる。
以下の実施例は本発明の実施を更に例示することを意
図するものであるが、いずれにしても本発明の範囲に関
する限定を意図するものではない。
図するものであるが、いずれにしても本発明の範囲に関
する限定を意図するものではない。
実施例 Ｉ Δ９（Ser）bGHについて暗号づけするプラスミドなら
びにプラスミドpcl857により形質転換されたエシェリヒ
ア・コリ宿主菌株、MC1061をΔ９（Ser）bGH−生成条件
下で培養した。これらの細胞を溶解し、かつΔ９（Se
r）bGH−含有封入体を遠心分離により沈殿させた。異物
を除去するための洗浄操作に引き続いて、封入体を、グ
アニジンHCl8Mおよび還元グルタチオン5mMを含有する
（40容量）のグリシンNaOH（pH9.8）50mM中に溶解させ
た。次いで、可溶化封入体を尿素3.5M、スクロース10
％、還元グルタチオン1.0mMおよび酸化グルタチオン0.1
mMを含有し、そしてpH9.8であるグリシンNaOH50mMに対
し透析して（蛋白質を部分的に再折たたみし）、引き続
きスクロース10％を含み、pH9.8であるエタノールアミ
ンHCl60mMに対して透析（を行って蛋白質を完全に再折
たたみ）した。沈殿した蛋白質を遠心分離により除去
し、その上澄み液のpHを9.0に調整した。次に、サンプ
ルをワットマンDE−52セルロースカラム（最大充填量、
蛋白質7g/樹脂リットル）に対し充填するが、該カラム
はスクロース５％を含み、pH9.0のエタノールアミン60m
Mにより予め平衡させたものとする。成長ホルモン含有
画分（カラムの漏出画分中に流出したもの）をpH9.8に
調節し、そして「アミコン（Amicon）DC−50UF」限外濾
過装置を使用して略10倍に濃縮した。次いで、濃縮成長
ホルモンサンプルを遠心分離し、上澄み液は下流の仕上
げ工程のために残し、そして沈殿物は再循環のために残
した。
びにプラスミドpcl857により形質転換されたエシェリヒ
ア・コリ宿主菌株、MC1061をΔ９（Ser）bGH−生成条件
下で培養した。これらの細胞を溶解し、かつΔ９（Se
r）bGH−含有封入体を遠心分離により沈殿させた。異物
を除去するための洗浄操作に引き続いて、封入体を、グ
アニジンHCl8Mおよび還元グルタチオン5mMを含有する
（40容量）のグリシンNaOH（pH9.8）50mM中に溶解させ
た。次いで、可溶化封入体を尿素3.5M、スクロース10
％、還元グルタチオン1.0mMおよび酸化グルタチオン0.1
mMを含有し、そしてpH9.8であるグリシンNaOH50mMに対
し透析して（蛋白質を部分的に再折たたみし）、引き続
きスクロース10％を含み、pH9.8であるエタノールアミ
ンHCl60mMに対して透析（を行って蛋白質を完全に再折
たたみ）した。沈殿した蛋白質を遠心分離により除去
し、その上澄み液のpHを9.0に調整した。次に、サンプ
ルをワットマンDE−52セルロースカラム（最大充填量、
蛋白質7g/樹脂リットル）に対し充填するが、該カラム
はスクロース５％を含み、pH9.0のエタノールアミン60m
Mにより予め平衡させたものとする。成長ホルモン含有
画分（カラムの漏出画分中に流出したもの）をpH9.8に
調節し、そして「アミコン（Amicon）DC−50UF」限外濾
過装置を使用して略10倍に濃縮した。次いで、濃縮成長
ホルモンサンプルを遠心分離し、上澄み液は下流の仕上
げ工程のために残し、そして沈殿物は再循環のために残
した。
沈殿した物質を、還元グルタチオン5mMを含有するグ
リシンNaOH緩衝液（pH9.8）50mM中の40容量（ml/g）の
グアニジンHCl3M内に溶解させた。溶解時間は25℃で４
時間であった。（この時点までの全先行工程ならびに全
ての後行工程は４−10℃で行われた。）この可溶化沈殿
物を、スクロース５％、還元グルタチオン50mMを含有す
るグリシンNaOH（pH9.8）50mM中の10容量の尿素3.5Mに
対して透析し、引き続きスクロース５％およびNaCl1Mを
含有する10容量の60mMエタノールアミンに対し透析し
た。最終透析は、NaClを伴わないこの同一エタノールア
ミン緩衝液に対し行われた。次に、このサンプルを10分
間に亘り10,000xgで遠心分離し、そして得られた上澄み
液をブラッドフォード（Bradford）法（「Anal.Bioche
m.」、72:248−254〔1976年〕）を用いて可溶性蛋白質
につき分析した。この物質はまた、「SDS−PAGE」およ
び「YM−100」隔膜限外濾過により（高分子量異物の存
在に関する試験として）分析された。この物質はジェー
・ロス（J.Roth）により「酵素学の方法（Methods of E
nzymology）」37:66−81〔1975年〕中に記載されるよう
に、ラット肝臓レセプター結合アッセイによって適切な
折たたみ／三次構造に関し試験された。
リシンNaOH緩衝液（pH9.8）50mM中の40容量（ml/g）の
グアニジンHCl3M内に溶解させた。溶解時間は25℃で４
時間であった。（この時点までの全先行工程ならびに全
ての後行工程は４−10℃で行われた。）この可溶化沈殿
物を、スクロース５％、還元グルタチオン50mMを含有す
るグリシンNaOH（pH9.8）50mM中の10容量の尿素3.5Mに
対して透析し、引き続きスクロース５％およびNaCl1Mを
含有する10容量の60mMエタノールアミンに対し透析し
た。最終透析は、NaClを伴わないこの同一エタノールア
ミン緩衝液に対し行われた。次に、このサンプルを10分
間に亘り10,000xgで遠心分離し、そして得られた上澄み
液をブラッドフォード（Bradford）法（「Anal.Bioche
m.」、72:248−254〔1976年〕）を用いて可溶性蛋白質
につき分析した。この物質はまた、「SDS−PAGE」およ
び「YM−100」隔膜限外濾過により（高分子量異物の存
在に関する試験として）分析された。この物質はジェー
・ロス（J.Roth）により「酵素学の方法（Methods of E
nzymology）」37:66−81〔1975年〕中に記載されるよう
に、ラット肝臓レセプター結合アッセイによって適切な
折たたみ／三次構造に関し試験された。
可溶性物質の略60％の回収が、可溶化したDE−52沈殿
物から達成された。この物質の約75％が「YM−100」
（分子量100,000カットオフ）限外隔膜を通過し、その
サンプル中に少量の高分子量物質のみを示した。（この
方法は通常、単量体成長ホルモンの実際量よりも低い評
価を与える。） 「SDS−PAGE」の結果もまた、標本中に二三の高分子
量異物を示した。このサンプルのレセプター結合活性は
重量基準割合（天然bGH、標準活性約53％を有する）で
僅かに減少したが、これは標本中の少量の異物に基因す
るものと考えられる。
物から達成された。この物質の約75％が「YM−100」
（分子量100,000カットオフ）限外隔膜を通過し、その
サンプル中に少量の高分子量物質のみを示した。（この
方法は通常、単量体成長ホルモンの実際量よりも低い評
価を与える。） 「SDS−PAGE」の結果もまた、標本中に二三の高分子
量異物を示した。このサンプルのレセプター結合活性は
重量基準割合（天然bGH、標準活性約53％を有する）で
僅かに減少したが、これは標本中の少量の異物に基因す
るものと考えられる。
実施例 II Δ９（Ser）bGHをDE−52カラムに対する精製を含むこ
の工程に至るまで実施例Ｉに記載したのと同一の方法に
より生成かつ処理した。このポストDE−52カラムbGH沈
殿物を単離し、かつ還元グルタチオン5mMを含有するグ
リシンNaOH緩衝液（pH9.8）50mM中の（40容量）グアニ
ジンHCl3M内に溶解させた。
の工程に至るまで実施例Ｉに記載したのと同一の方法に
より生成かつ処理した。このポストDE−52カラムbGH沈
殿物を単離し、かつ還元グルタチオン5mMを含有するグ
リシンNaOH緩衝液（pH9.8）50mM中の（40容量）グアニ
ジンHCl3M内に溶解させた。
これらのサンプルはスクロース５％を含有するグリシ
ンNaOH（pH9.8）50mM中の尿素3.5Mに対して透析した。
この透析に引き続き、これらサンプルはスクロース５％
を含みNaClを含有しないpH9.8のエタノールアミン緩衝
液60mMに対し透析した。この透析の後、この物質を10分
間に亘り10,000xgで遠心分離し、かつ上澄み液を実施例
Ｉにおけるように分析した。（3Mのグアニジン溶解ステ
ップを除き全工程は４−10℃で行った。） グアニジン3Mの再折たたみした後、この物質の本質的
に全ては可溶性のままであったが、「SDS−PAGE」およ
び「YM−100」限外濾過は、この物質が可成りの量の高
分子量凝集体を含むことを示した。この物質のレセプタ
ー結合活性は（基準重量当たりで）対照標準bGHの25％
であり、これは多分高分子量異物の比較的低活性を反映
しているのであろう。たとえ、この物質がそれ（ポスト
DE−52濃縮−遠心分離ステップ）からもたらされるプロ
セス・ストリーム中に再導入するには凝集され過ぎてい
たとしても、この物質をDE−52クロマトグラフィーステ
ップにおいて、その工程の更に上流に再導入することは
できる。
ンNaOH（pH9.8）50mM中の尿素3.5Mに対して透析した。
この透析に引き続き、これらサンプルはスクロース５％
を含みNaClを含有しないpH9.8のエタノールアミン緩衝
液60mMに対し透析した。この透析の後、この物質を10分
間に亘り10,000xgで遠心分離し、かつ上澄み液を実施例
Ｉにおけるように分析した。（3Mのグアニジン溶解ステ
ップを除き全工程は４−10℃で行った。） グアニジン3Mの再折たたみした後、この物質の本質的
に全ては可溶性のままであったが、「SDS−PAGE」およ
び「YM−100」限外濾過は、この物質が可成りの量の高
分子量凝集体を含むことを示した。この物質のレセプタ
ー結合活性は（基準重量当たりで）対照標準bGHの25％
であり、これは多分高分子量異物の比較的低活性を反映
しているのであろう。たとえ、この物質がそれ（ポスト
DE−52濃縮−遠心分離ステップ）からもたらされるプロ
セス・ストリーム中に再導入するには凝集され過ぎてい
たとしても、この物質をDE−52クロマトグラフィーステ
ップにおいて、その工程の更に上流に再導入することは
できる。
実施例 III Δ９（Ser）bGHをDE−52カラムを含むこの工程に至る
まで実施例ＩおよびIIに記載するように調整し、かつ処
理し、そしてDE−52カラムからの沈殿物を再び還元グル
タチオン5mMを含有するグリシンNaOH（pH9.8）50mM中の
グアニジンHCl3M中に溶解させた（25℃）。この可溶化
させた沈殿物を５℃で、スクロース５％を含むpH9.8の2
x20容量の60mMエタノールアミンHClに対し透析した。こ
れらの再折たたみしたサンプルを10分間に亘り10,000xg
で遠心分離し、そして実施例ＩおよびIIにおけるように
分析した。
まで実施例ＩおよびIIに記載するように調整し、かつ処
理し、そしてDE−52カラムからの沈殿物を再び還元グル
タチオン5mMを含有するグリシンNaOH（pH9.8）50mM中の
グアニジンHCl3M中に溶解させた（25℃）。この可溶化
させた沈殿物を５℃で、スクロース５％を含むpH9.8の2
x20容量の60mMエタノールアミンHClに対し透析した。こ
れらの再折たたみしたサンプルを10分間に亘り10,000xg
で遠心分離し、そして実施例ＩおよびIIにおけるように
分析した。
この方法によっては、可溶性蛋白質の比較的低い回収
が達成されたが（溶液中に3Mグアニジン可溶化物質15％
が残留した）、「SDS−PAGE」および「YM−100」限外濾
過により判定したとき、この物質は全体的に単量体Δ９
（Ser）bGHであった（限外濾過により90％以上が透過可
能であり、これは天然のbGHスタンダードにより得られ
るものと同程度に良好なものである）。この物質はま
た、ラット肝臓隔膜レセプター結合アッセイにおいて活
性85％を示し、かつそれが、もたらされる所（ポストDE
−52濃縮／遠心分離上澄み液）からのプロセス・ストリ
ーム中に直接再導入させることができた。
が達成されたが（溶液中に3Mグアニジン可溶化物質15％
が残留した）、「SDS−PAGE」および「YM−100」限外濾
過により判定したとき、この物質は全体的に単量体Δ９
（Ser）bGHであった（限外濾過により90％以上が透過可
能であり、これは天然のbGHスタンダードにより得られ
るものと同程度に良好なものである）。この物質はま
た、ラット肝臓隔膜レセプター結合アッセイにおいて活
性85％を示し、かつそれが、もたらされる所（ポストDE
−52濃縮／遠心分離上澄み液）からのプロセス・ストリ
ーム中に直接再導入させることができた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−161321（ＪＰ，Ａ)
Claims (16)
- 【請求項１】形質転換性微生物中で生成された封入体か
ら純粋で、生物学的に活性な蛋白質を回収する方法であ
って、前記封入体の蛋白質は第一の変性剤で可溶化さ
れ、前記第一の変性剤の除去によって再生され、そして
クロマトグラフィーカラムによって精製され、さらに、 （ａ）不溶性蛋白質凝集体を前記クロマトグラフィーカ
ラムの流出液から単離する工程、 （ｂ）前記単離された蛋白質凝集体を塩酸グアニジン３
〜6M又は尿素６〜8Mである前記第一の変性剤より弱い第
二の変性剤を含む緩衝液で可溶化する工程、 （ｃ）前記可溶化された蛋白質凝集体の溶液を、前記第
二の変性剤より弱い第三の変性剤を含む緩衝剤で透析し
て、前記蛋白質を一部再生する工程、 （ｄ）前記一部再生した蛋白質の溶液を、変性剤を含ま
ない緩衝液に対して透析して前記蛋白質の再生を完了さ
せて、生物学的に活性な蛋白質溶液を生成する工程、 とを具備する生物学的に活性な蛋白質の回収方法。 - 【請求項２】前記一部再生した蛋白質の溶液を、最初Na
Clを約0.1乃至1.0M含み変性剤は含まない緩衝液に対し
て透析し、次にNaClも変性剤も含まない緩衝液に対して
透析する特許請求の範囲第１項記載の生物学的に活性な
蛋白質の回収方法。 - 【請求項３】さらに、工程（ｄ）で生成した前記生物学
的に活性な蛋白質溶液と、前記クロマトグラフィーカラ
ムの流出液として得られた生物学的に活性な蛋白質溶液
とを組み合わせる工程を含む特許請求の範囲第１項記載
の生物学的に活性な蛋白質の回収方法。 - 【請求項４】前記第三の変性剤が、約3.5Mの尿素溶液で
ある特許請求の範囲第１項記載の生物学的に活性な蛋白
質の回収方法。 - 【請求項５】前記蛋白質が動物成長ホルモンである特許
請求の範囲第１項記載の生物学的に活性な蛋白質の回収
方法。 - 【請求項６】前記蛋白質がウシ成長ホルモン又はブタ成
長ホルモンである特許請求の範囲第１項記載の生物学的
に活性な蛋白質の回収方法。 - 【請求項７】工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の可溶化及
び再生が、pH約９乃至約10の緩衝液内で行われる特許請
求の範囲第１項記載の生物学的に活性な蛋白質の回収方
法。 - 【請求項８】工程（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の可溶化及
び再生溶液が、温度約４℃乃至約10℃に維持される特許
請求の範囲第１項記載の生物学的に活性な蛋白質の回収
方法。 - 【請求項９】前記クロマトグラフィーカラムがアニオン
交換カラムである特許請求の範囲第１項記載の生物学的
に活性な蛋白質の回収方法。 - 【請求項１０】形質転換性微生物中で生成された封入体
から、純粋で生物学的に活性な蛋白質を回収する方法で
あって、前記封入体の蛋白質は第一の変性剤で可溶化さ
れ、前記第一の変性剤の除去によって再生され、そして
クロマトグラフィーカラムによって精製され、さらに、 （ａ）不溶性蛋白質凝集体を前記クロマトグラフィーカ
ラムの流出液から単離する工程、 （ｂ）前記単離された蛋白質凝集体を塩酸グアニジン３
〜6M又は尿素６〜8Mである前記第一の変性剤より弱い第
二の変性剤を含む緩衝液で可溶化する工程、 （ｃ）前記可溶化された蛋白質凝集体の溶液を、変性剤
を含まない緩衝液に対して透析して前記蛋白質を再生さ
せ、生物学的に活性な蛋白質を含む溶液を生成する工
程、 （ｄ）前記溶液から再凝集した蛋白質を除去する工程、 とを具備する生物学的に活性な蛋白質の回収方法。 - 【請求項１１】さらに、工程（ｄ）で得た溶液と、前記
クロマトグラフィーカラムの流出液として得られた生物
学的に活性な蛋白質溶液とを組み合わせる工程を含む特
許請求の範囲第10項記載の生物学的に活性な蛋白質の回
収方法。 - 【請求項１２】前記蛋白質が動物成長ホルモンである特
許請求の範囲第11項記載の生物学的に活性な蛋白質の回
収方法。 - 【請求項１３】前記蛋白質がウシ成長ホルモン又はブタ
成長ホルモンである特許請求の範囲第11項記載の生物学
的に活性な蛋白質の回収方法。 - 【請求項１４】工程（ｂ）及び（ｃ）の可溶化及び再生
溶液がpH約９乃至約10である特許請求の範囲第11項記載
の生物学的に活性な蛋白質の回収方法。 - 【請求項１５】工程（ｂ）及び（ｃ）の可溶化及び再生
溶液が、温度約４℃乃至約10℃に維持される特許請求の
範囲第11項記載の生物学的に活性な蛋白質の回収方法。 - 【請求項１６】前記クロマトグラフィーカラムがアニオ
ン交換カラムである特許請求の範囲第11項記載の生物学
的に活性な蛋白質の回収方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/773,671 US4656255A (en) | 1985-09-09 | 1985-09-09 | Protein recovery |
| US773671 | 1996-12-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6277332A JPS6277332A (ja) | 1987-04-09 |
| JP2646081B2 true JP2646081B2 (ja) | 1997-08-25 |
Family
ID=25098959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61209746A Expired - Lifetime JP2646081B2 (ja) | 1985-09-09 | 1986-09-08 | 生物学的に活性な蛋白質の回収方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4656255A (ja) |
| EP (1) | EP0215625B1 (ja) |
| JP (1) | JP2646081B2 (ja) |
| AT (1) | ATE113960T1 (ja) |
| CA (1) | CA1267497A (ja) |
| DE (1) | DE3650135T2 (ja) |
| DK (1) | DK430486A (ja) |
| IE (1) | IE67259B1 (ja) |
| IL (1) | IL79972A (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio- Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US5332805A (en) * | 1984-02-03 | 1994-07-26 | Celltech Limited | Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate |
| US5792450A (en) * | 1985-02-05 | 1998-08-11 | Chiron Corporation | Purified human CSF-1 |
| GB8508340D0 (en) * | 1985-03-29 | 1985-05-09 | Creighton T E | Production of protein |
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| AU597924B2 (en) * | 1985-12-11 | 1990-06-14 | Natinco Nv | Solubilization of protein aggregates |
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