JP2589682B2

JP2589682B2 - ヒト非▲下−▼小細胞肺癌に関するモノクローナル抗体および抗原

Info

Publication number: JP2589682B2
Application number: JP61500278A
Authority: JP
Inventors: ヘルストーム、インゲゲルド; ピーブラウン、ジヨセフ; イーヘルストーム、カール; ホーン、ダイアン; リンスレイ、ペーター
Original assignee: ONKOOGEN LP
Current assignee: ONKOOGEN LP
Priority date: 1984-12-21
Filing date: 1985-12-13
Publication date: 1997-03-12
Anticipated expiration: 2012-03-12
Also published as: US4935495A; ZA859761B; US5091177A; MX9203607A; JPS62502165A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景発明の分野ヒト肺癌は男性における癌腫による多くの死亡の原因
となるものであり、また女性における癌腫死亡の最も頻
繁な原因としての乳癌の侵襲の過程である（キャンサー
ファクツアンドフィガーズ,1983年［Cancer Fa
cts and Figures,1983］）。この疾患は、４つの主な組
織学的タイプ、すなわち類表皮腫（エピデルモイド）
（30％）、腺癌（35％）、未分化大細胞（15％）および
小細胞（20％）に分けることができる。肺癌の多くの症
例は、化学療法および照射療法によって治癒不可能であ
る。小細胞肺癌は、大きさにおける低減によって化学療
法および照射療法に応答するが、全体的な治癒ではな
い。腫瘍の完全な外科手術的除去が唯一有効な療法であ
ると見なされている。しかしながら、予期せぬことに
は、肺癌患者の30％未満が、診断で完全に切除され得る
腫瘍を有しており、また肺癌患者の1/3未満が、外科手
術的完全除去の後５年間生存している。それゆえ、肺癌
のより早期の診断、癌延展の程度のより良好な限定、お
よびより効果的な療法を可能とする方法に対する大きな
必要性が存在する。

モノクローナル抗体は、これらのすべての目的のため
に用いられ得るものである。しかしながら、必須条件
は、正常成人組織においてよりもより肺癌において強く
発現される抗原に対する抗体を見出すことである。腫瘍
細胞集団の公知の不均質性、同じ抗原におけるいくつか
の決定基の存在、治療学的標的と比較した場合における
診断マーカーとしてのこれらの好適性に関する抗体間の
予期された違い、および同じ抗原に対する異なる抗体の
異なる生物学的特性の見地において、いくつかの異なる
抗体が必要とされる。

先行技術の記載肺癌抗原に対するヒトモノクローナル抗体は、シコラ
ら［Sikora et al.］ブリテッシュジャーナルオブ
キャンサー（1981年）［Br.J.Cancer（1981）］によ
って述べられている。いくつかのタイプのヒト肺癌に関
して特異性を示すモノクローナル抗体は、カッチッタら
［Cuttitta et al.］（プロシーディングオブザ
ナショナルアカデミーオブサイエンシズオブ
ザユナイテッドステートオブアメリカ（1981
年）78:4591〜4595［Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（198
1）78:4591−4595］）によって開示されている。モノク
ローナル抗体によって限定されたヒト肺腺癌に関連する
抗原が、バルキら［Varki et al.］（キャンサーリサ
ーチ（1984年）44:681〜687［Cancer Research（1984）
44:681−687］）によって述べられている。

糖脂質ガングリオ−Ｎ−トリオシルセラミド（アシア
ロGM₂［acialo GM₂］）に対するマウスモノクローナル
抗体は、ヤングら，ジャーナルオブエクスペリメン
タルメディシン，（1979年）150:1008［Young,et al.
J.Exp.Med.（1979）150:1008］によって述べられる。ホ
ジキシ病の患者からの細胞におけるアシアロGM₂の発現
は、ナイプら，ジャーナルオブイムノロジイ（1983
年）131:1591〜1594［Kniep,et al.,J.Immunol.（198
3）131:1591−1594］によって述べられている。

1984年11月２日に出願された米国特許出願一連番号第
667,521号は、ヒト非−小細胞肺癌に関するいくつかの
モノクローナル抗体を開示している。

予め定められた特異性の抗体を分泌する融合細胞の連
続培養がケーラーら，ネイチャー（1975年）265:495〜4
97［Kohler et al.,Nature（1975）265:495−497］によ
って述べられている。

発明の概要本発明は、非−小細胞肺癌（NSCLC,［non−small cel
l lung carcinoma］）細胞に関連する糖脂質［glycolip
id］抗原における決定部位を限定する新規なモノクロー
ナル抗体に関するものである。“NSCLC細胞”なる用語
は、類表皮癌細胞、腺癌細胞および大細胞の未分化癌細
胞を含むものである。決定部位はまた、例えば、乳房の
いくつかの癌などのいくつかの他の癌の抗原において見
い出されることができ、そして、これゆえ本発明の抗体
は、これらの他の癌細胞に対しても結合する。本発明の
モノクローナル抗体は腫瘍細胞に対するよりもより低い
度合で正常成人細胞に結合する。”より低い度合での結
合”なる用語は、結合が免疫組織学的技術によって検知
することが不可能であろうことおよび腫瘍細胞に対する
よりも正常細胞に対してより弱い結合であるだろうこと
を意味する。このモノクローナル抗体は、マウスハイブ
リドーマによって分泌される。

本発明はまた、ヒト肺組織およびその他のヒト組織に
おける悪性状態の存在を測定するための方法を含むもの
である。この方法は、末端炭水化物配列： GalNAcβ１−4Galβ１→3GalNAc β１→4Galβ１を有する糖脂質抗原およびカングリオ−Ｎ−トリオシル
セラミド、例えばアシアロGM₂、のような関連抗原の存
在に関する組織の観察を含むものである。例えば、組織
は、上記の末端炭水化物配列を有する細胞関連糖脂質抗
原における決定部位を限定する抗体、あるいはこのよう
な抗体の機能的等価体もしくはフラグメントと接触され
得る。

これゆえ本発明は、本発明のモノクローナル抗体を用
いるいくつかの診断方法に関するものである。このよう
な方法のひとつは、NSCLC細胞の存在の、このような細
胞を含んでいるであろうと疑われる検体における、測定
を包含するものである。この検体は、モノクローナル抗
体と接触させられ、そしてこのことは、この検体におい
て存在し得る他の細胞タイプから、このような細胞を識
別できるものである。接触は、抗体のこのような細胞へ
の結合のための条件下で行なわれる。接触の後、検体に
おける抗体のこのような細胞への結合の存在あるいは不
在が測定される。この結合は、検体におけるNSCLC細胞
の存在あるいは不在に関連するものである。一般に、検
体は、モノクローナル抗体に関する標識された特異的結
合パートナーと接触させられる。この標識は、検知可能
な信号を発し得るものである。他の診断方法は、特有に
標識された（例えば放射性同位元素で）、そしてその後
患者中へ注射される抗体あるいは抗体フラグメントの腫
瘍への局在化を包含するものである。この方法は、疾患
の程度に関して癌患者を段階づけるためおよび療法に応
じての変化を観察するためのより良好な方法を提供し得
る。

本発明はまた治療的適用を有するものである。抗体
は、腫瘍細胞表面で高い濃度にて発現される上記の抗原
と反応し得る。それは、抗体依存性細胞障害（ADCC）を
媒介し得る。すなわちそれは、ヒトリンパ球もしくはマ
クロファージの存在下においてNSCLC細胞（およびいく
つかのその他のヒト癌細胞）を殺し得るものであり；ま
たそれは例えばヒト血清の存在下においてNSCLC細胞を
殺すように、ヒト補体を活性化し得るものである。それ
はまた、化学療法製薬剤および放射性同位元素を含む
（しかしながらこれらに限定されるわけではない。）抗
腫瘍効果を有する種々の作用物質の担体として用いるこ
とができる。

特定の実施態様の詳述本発明は、ヒトNSCLC細胞における抗原に対して結合
する新規な抗体に関するものであり、またこのような抗
体を用いる診断学的および治療学的方法に関するもので
ある。本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミル
ステイン［Ｋhler and Milstein］の標準的技法（上
記）によって製造され得る。例えば、複数の滲出液から
のヒト肺癌細胞、またはヒト非−小細胞肺癌からの培養
細胞、または正常胎児肺からの細胞が、免疫原として用
いられる。これらの細胞は、マウス中へ注射され、十分
な時間の後にマウスは屠殺されそして脾細胞が得られ
る。所望の免疫グロブリンをコードする脾細胞染色体
は、一般的にはポリエチレングリコールの存在下におい
て、脾細胞を骨髄腫細胞とあるいはリンパ腫細胞と融合
することによって不滅化される。融合されたハイブリド
ーマを含む得られた細胞は、HAT培地などのごとき選択
培地において増殖させられ、そして生存細胞がこのよう
な培地において限界希釈条件を用いて増殖される。細胞
は、例えば微小力価ウェル（窪み）［microtiter wel
l］などのような適当な容器中にて増殖され、そして上
澄み液が所望の特異性を有するモノクローナル抗体に関
してスクリーニングされた。

モノクローナル抗体の収率を高めるために種々の技術
が存在し、例えばハイブリドーマ細胞を受け入れる哺乳
動物宿主の腹腔内へハイブリドーマ細胞を注入し、そし
て腹水を収獲するといったようなことがある。腹水中に
十分な量のモノクローナル抗体が集められない場合、該
抗体は宿主の血液から収獲される。種々の周知の方法
が、モノクローナル抗体を他のタンパク質あるいは他の
不純物から遊離するための、モノクローナル抗体の単離
および精製に関して存在する（ケーラーとミルステイ
ン，上記，を参照のこと。）本発明によるモノクローナル抗体の１つは、L6と呼称
される。それは、ヒトNSCLC細胞およびいくつかのその
他のヒト癌からの細胞の特性として我々が認めている細
胞表面糖脂質抗原を限定する。いくつかの公知の糖脂質
のL6抗体との交差反応およびアシアロGalNAc−GM₁のL6
抗体との反応性に基づいて、我々は、L6糖脂質抗原が以
下の末端配列： GalNAcβ１→4Galβ１→3GalNAcβ１→4Galβ１→Ｒ（式中、Ｒは今だ不確定である炭水化物である。）を有
するものであるという結論に達した。上記抗原の特に新
規な特徴は、シアル酸残基のないことであり、そしてこ
れまでヒト組織と関連するものであることが知られてい
なかった。上記の末端配列のシアロシル誘導体は、スベ
ナーホルムら，（1973年），ジャーナルオブバイオ
ロジカルケミストリー248:740〜742［Svennerholm et
al.,（1973）J.Biol.Chem.248:740−742］によって、
またイワモリら，（1978年），ジャーナルオブバイ
オケミストリー84:1601［Iwamori et al.,（1978）,J.B
iochem,84:1601］によって述べられている。さらに、上
記の配列のシアル酸誘導体がまた、ドナルドら，（1984
年），バイオケミカルソサエティトランスアクショ
ン12:596〜599［Donald et al.,（1984）,Biochem.Soc.
Trans.12:596−599］によって、またブランチャード
ら，（1983年），ジャーナルオブバイオロジカル
ケミストリー258:7691〜7695［Blanchard et al.,（198
3）J.Biol.Chem.258:7691−7695］によって血液型Sd抗
原として認識されている。それゆえ、本発明の１つの観
点は、末端炭水化物配列： GalNAcβ１→4Galβ１→3GalNAcβ１→4Galβ１→ を有する精製形態における糖脂質抗原である。

L6抗体はまた、生合成的に標識されたNSCLC細胞から
のタンパク質抗原を沈降する。この抗原は、約20,000ド
ルトンの分子量を有するドデシル硫酸ナトリウム−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）における１
つのバンドで特徴づけられる。この抗体は、IgG2aイソ
タイプのものである。それは、主要臓器の線維芽細胞、
内皮細胞あるいは上皮細胞のような正常細胞に対して検
知可能に結合するものではない。L6抗体は、L6マウスハ
イブリドーマによって産生される。

本発明の範畴にはまた、例えばFab、（Fab′）_２、Fv
フラグメントなどのような上記モノクローナル抗体の有
用な結合フラグメントが含まれる。これらの抗体フラグ
メントは周知の技法によって得られる。例えば、有用な
結合フラグメントは、パパインあるいはペプシンを用い
る抗原のペプチターゼ分解によって調製され得る。

本発明の新規な抗体の特定の実施例は、それぞれの抗
原上の特異的決定部位に結合し、そしてマウス源からの
IgG2サブクラスのものである１つの抗体に向けられたも
のであるが、これは、限定であることを意味するもので
はない。上記の抗体およびマウス源、ヒトを含む他の哺
乳動物源もしくはその他の源のいずれからかの上記抗体
と機能的等価性を有する抗体群、またはそれらの組合せ
は、他のイソタイプと同様、本発明の範畴内に含まれる
ものである。“機能的等価性”なる用語は、抗体が上記
に述べた決定部位に結合することができ、そしてこのよ
うな部位に関し本発明の特定の抗体と競合し得ることを
意味するものである。すなわち、このような抗体は、こ
のような決定部位を有する細胞もしくは細胞フラグメン
トを含む検体と組合せられた場合に、このような決定部
位に結合し、そしてこのような部位への結合から本発明
の抗体を阻害するものであろう。さらにまた、本発明の
抗原が１つ以上の決定部位を有するゆえに、本発明は、
前記のモノクロナール抗体により限定された決定部位以
外の決定部位を限定するモノクロナール抗体群を含むも
のである。

本発明はまた、ヒトにおけるL6抗原ならびに例えばア
シアロGalNAc−GM₁およびアシアロGM₂などのような関連
抗原の診断学的および治療学的使用を含むものである。
該抗原は、ヤングら，ジャーナルオブエクスペリメ
ンタルメディシン，（1979年）150:1008〜1019［Youn
g,et al.J.Exp.Med.（1979）150:1008−1019］によって
述べられたような免疫沈降のような周知の方法によって
精製され得る。

本発明の一方法は、被験者からの肺組織あるいは他の
ヒト組織を、L6抗原の特性を有する糖脂質抗原のもしく
はガングリオ−Ｎ−トリオシルセラミドの存在に関して
調べることによる、被験者の肺組織あるいは他のヒト組
織における悪性状態の存在の測定を包含するものであ
る。“悪性状態”なる用語は、癌そのもの、新生物形成
の［neoplastic］、悪性の［malignant］ないしは腫瘍
［tumor］細胞、あるいは同様のものを含む意味での形
成異常細胞の存在に関するものである。“〜の特性を有
する”なる用語はL6抗原またはアシアロGalNAc−GM₂も
しくはアシアロGM₂のごとき関連抗原を識別する抗体と
抗原が反応性であることを意味するものである。例え
ば、検体は、L6抗体のような本発明のモノクロナール抗
体またはヤングら，上記あるいはナイプら、上記により
述べられたような同様の特性を有する抗体と接触あるい
は組合せられ得る。接触は、抗体の悪性細胞への結合の
ための条件下で行なわれる。接触の後、検体における悪
性細胞への抗体の結合の存在が観察される。すなわち検
体は、抗体と抗原部位との免疫複合体に関して調べられ
る。この免疫複合体形成は、検体における悪性細胞の存
在に関するものである。本発明はまたL6抗体もしくはL6
抗原の免疫複合体を包含するものである。

本発明による方法の特定の実施例（説明のために挙げ
られるもので本発明を限定するものではない。）は、切
除細胞における腫瘍細胞の検体方法である。上記方法
は、腫瘍の除去の後に得られた腫瘍の一切片である検体
に対して適用される。切除される腫瘍は、切片を得るた
めに処理され、この処理は、切除直後に、通常の冷凍で
ある、腫瘍もしくは組織を冷凍することを最初に含むも
のである。組織の冷凍層は、次に、例えば低温槽を用い
て、切片へと切断される。

上記のようにして得られた腫瘍の切片は、本発明のモ
ノクローナル抗体と接触させられ、そして次に検知可能
な標識で標識された、上記モノクローナル抗体に対する
第２の抗体と接触させられる。

切除された検体、例えば腫瘍の切片は、第１のモノク
ローナル抗体と、該抗体の悪性細胞への結合のための条
件下で接触させられる。インキュベーションは、例えば
ガラス製ペトリ皿のような適当な容器において、約20〜
30℃の温度で約15〜30分間の間、例えば少量の窒化ナト
リウムを含有するリン酸緩衝食塩水などのような水性培
地中で通常行なわれる。用いられる抗体の量は、通常検
知可能な結合を提供する、すなわち抗体と問題の決定部
位ないしは抗原部位との間の免疫複合体の検知可能な数
を提供するのに十分なものである。

インキュベーションに続き、切片は、非特異的に結合
した抗体を低減ないし消去するために洗浄され、そして
次に、抗原部位を保持する検知の細胞へのモノクローナ
ル抗体の結合によるものである上記の複合体を観察する
ために調べられる。結合は、切片における悪性細胞の存
在に関するものである。従って、結合は、例えば、検知
を該モノクローナル抗体に関する標識された特異的結合
パートナーと接触させることによって測定される。標識
は検知可能な信号を発し得るものであり、放射性標識、
例えば蛍光体などのような発色団、酵素などであり得
る。

上記のアプローチを用いる技術の一例は、免疫蛍光染
色法である。この技術において、腫瘍の冷凍切片は、ア
セトンを用いてガラス製スライド上に固定され、そして
例えばペトリ皿にて、モノクローナル抗体とインキュベ
ートされる。例えばリン酸緩衝食塩水などのような適当
な緩衝液で洗浄の後、この切片は、ペトリ皿上に移さ
れ、そして例えば、用いられたモノクローナル抗体に関
して特異的な標識化抗体であり得る、モノクローナル抗
体に関する標識された特異的結合パートナーと接触させ
られる。ほとんどの場合において、モノクローナル抗体
はマウス源由来のものであるので、モノクローナル抗体
に関し特異的な標識された抗マウス免疫グロブリンが用
いられ得る。このような免疫グロブリンは、適当な宿主
をマウス抗体で注射し、十分な時間をおき、そして注射
された宿主の血液から抗マウス免疫グロブリンを収穫す
ることによる標準的技術により産生され得る。

該スライドの、例えば水性緩衝液を用いての二度目の
洗浄の後に、切片は、蛍光抗体含有流体およびカバーグ
ラスで覆われ、そして次に該切片に対するモノクローナ
ル抗体の結合を測定するために蛍光顕微鏡で調べられ
た。結合の測定はまた、検知中でこのような結合の位置
の識別をも含むものである。

検体へのモノクローナル抗体の結合はまた、放射性物
質、染料および蛍光体を含む発色団、あるいは酵素など
のような検知可能な信号を発し得る標識に共有結合され
たモノクローナル抗体を用いることによって測定され得
る。抗体当りの用いられた標識の数は、標識された抗体
が用いられる診断方法の必要条件および抗体へ標識を結
合するための部位の有効性によって通常決定される。

抗体および抗体フラグメントへ標識を結合させるため
の方法は当分野において周知のものである。このような
方法は、米国特許第4,220,450号、第4,235,869号、第3,
935,074号および第3,996,345号中に見い出される。

本発明のモノクローナル抗体が用いられる技術のさら
に別の例は、イムノペルオキシダーゼ標識［Immunopero
xidase labeling］（ガリギュースら，インターナショ
ナルジャーナルオブキャンサー（1982年）29:511〜
515により変更されたようなステロンベーガー，イムノ
サイトケミストリー，ジョンウィリーアンドサン
ズ，ニューヨーク,1979年，第104〜109頁［Sternberge
r,Immunocytochemistry,John Wiley ＆ Sons,New York,
1979,pp104−169 as modified by Garrigues et al.,In
t.J.Cancer（1982）29:511−515］）である。試験され
るべき組織は、ガラス製スライドなどのような支持体上
に、アセトンなどのような適当な溶媒を用いて固定され
る。次に、組織は、モノクローナル抗体とインキュベー
トされ、そして洗浄されて結合していない抗体が除かれ
る。次に組織はウサギ抗マウスIgGとインキュベートさ
れ、結合していない抗体を除去するために洗浄され、マ
ウスペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体と組
合され、結合していない接合体を除去するために洗浄
し、そして次に酵素に関する基質で処理される。この処
理に続き、該スライドは、検知可能な信号に関して調べ
られる。

本発明の抗体は、例えば、痰のような肺からの剥脱性
細胞検体におけるあるいは子宮頸部塗抹標本における、
悪性状態の存在を測定する方法に用いられ得る。“剥脱
性”なる用語は、検体が、組織の表面をこするあるいは
洗浄することによって得られた単離細胞あるいは細胞の
凝集物（それらの細胞は個々に、あるいは鱗片ないしは
層として取り出される。）からなるものであることを意
味するものである。剥脱性細胞検体は、生検によって得
られたもののような、切除された組織から識別されるべ
きである。検体と抗体との間の接触は、抗原部位への抗
体の結合のための条件下で行なわれる。接触の後、抗原
部位への抗体の結合の存在あるいは不在が測定され、そ
してこれは肺における悪性状態の存在に関するものであ
る。

肺における悪性の存在を測定するために、痰試料は、
この方法において使用される剥脱性細胞検体を与える。
この方法は、気管支、あるいは咽頭口部、口を含む胃腸
路などからの剥脱性細胞検体における悪性状態の検知に
おいて利用性を見出すものである。

剥脱性細胞検体は次に、抗原−抗体複合体を形成する
ために、検体の特異的抗原部位への抗体の結合のための
条件下で前述の抗体と接触させられる。この抗原部位
は、検体における細胞あるいは細胞フラグメント上に存
在され得る。一般に、検体は例えば通常ガラスあるいは
その他の適当な物質からなるスライドのような適当な支
持体上へ載置される。剥脱性細胞検体は、通常、スライ
ドの表面上に検体の薄層を与えるようにスライド上で塗
抹される。抗体と検体との間の接触は、通常、水性緩衝
化培地中にて行なわれる。用いられる緩衝液は、リン酸
塩、トリス、重炭酸塩などを含む。pHは、検体および抗
体の状態に関係するものであって、通常５〜８の範囲内
にある。水性培地は、約０〜40％の量の有機極性溶媒を
さらに含んでいてもよい。有機極性溶媒は水溶性であ
り、通常約１〜10個の炭素原子と約１〜４個の酸素原子
を有している。抗体は、水性培地中に約１〜100μg/m
l、好ましくは約10〜20μg/mlの濃度で存在する。検体
の抗体との接触の間の温度は、約４〜40℃、好ましくは
10〜30℃である。接触の期間は、通常約15〜120分、好
ましくは約30〜60分間である。

検体と抗体との間の接触の後、支持体は通常未反応抗
体を除去するために処理される。通常、これは支持体を
水性の、通常緩衝化された、培地で洗浄することにより
なされる。

次に、検体における抗原部位へ結合した抗体（ここで
この結合は、該位置での悪性状態の存在に関するもので
ある。）の存在が観察される。すなわち、検体は、形成
された抗原−抗体（免疫）複合体の数を測定するために
調べられる。いくつかの例においては、問題の抗原部位
の極めて少ない数が、剥脱性細胞検体において見い出さ
れ得ることに注意すべきである。しかしながら、悪性状
態においては、多数の抗原部位が存在し、この後者の状
態は、多数の抗原−抗体複合体が、悪性状態が存在して
いる場合には計測可能であるゆえに、この方法により、
非悪性状態以上に容易に識別できる。結合の存在の測定
を行なうために、検知可能な信号を発する手段が、検定
系に組入れられる。例えば、検定において用いられた抗
体を検知可能な信号を発し得る標識へ結合させることが
できる。標識は、放射性物質、染料および蛍光体を含む
発色団、酵素あるいは同様のものであり得る。抗体に対
して用いられる標識の数は、方法の必要条件および抗体
へ標識を結合させるための部位の有効性によって通常決
定される。

あるいはまた、洗浄されたスライドを、例えば用いら
れた抗体に対して特異的な標識された抗体であり得る、
抗体に対する標識された特異的結合パートナーと接触さ
せることも可能である。モノクローナル抗体がマウス源
由来のものである場合には、該方法において用いられた
抗体に対して特異性の標識された抗マウス免疫グロブリ
ンが用いられ得る。このような免疫グロブリンは、適当
な宿主にモノクローナル抗体を注射し、適当な時間をお
き、そして注射された宿主の血液から抗マウス免疫グロ
ブリンを収獲することによる標準的技術によって産生さ
れ得る。抗体に対する標識された特異的結合パートナー
が用いられる場合、スライドは、該スライドを蛍光に関
して調べる前に再度、水性培地で洗浄されなければなら
ない。

本発明はまた、L6抗体に対する応答において調製され
た抗インディオタイプ抗体を包含するものであり、この
ような抗体は、関連腫瘍抗原のものと同様の特性を有し
て調製されうる（ネポムら，（1984年）プロシーディン
グオブザナショナルアカデミーオブサイエン
シズ 18:2864［Nepom et al.,（1984） Proc.Natl.Aca
d.Sci,81:2864］）。

蛍光体標識が用いられる場合において抗体と細胞検体
との間の結合の存在を測定するために、スライドは、通
常は蛍光顕微鏡を用いて、蛍光に関して調べられる。蛍
光体以外の標識が用いられる場合には、スライドないし
検体は、沈澱物、色彩等の形成に関して調べられる。

上記の説明は、免疫蛍光検査技術における本発明の抗
体使用に主として注がれたものである。しかしながら本
発明の抗体は、抗原−抗体反応を含むほとんどの検定法
において用いられることができるものである。該検定法
群は、均質性［homogeneous］でも不均質性［heterogen
eous］でもよい。均質性検定方法においては、検体は、
血清、尿および同様なもののごとき生物学的流体であり
得、または、検体は溶解されそして屑を除去するために
清澄化され得る。免疫学的反応は、通常特異的抗体、標
識された被分析物および関心の資料を含むものである。
標識から生じる信号が、抗体の標識された被分析物への
結合において直接的にあるいは間接的に変化される。免
疫学的反応およびその程度の検知の双方が、均質溶液に
おいて行なわれる。用いられ得る免疫化学標識は、フリ
ーラジカル類、蛍光染料類、酵素類、バクテリオファー
ジ類、補酵素類などが含まれる。

不均質性検定方法においては、試薬は、通常、検体、
特異性抗体、および検知可能な信号を発するための手段
である。検知はプレートあるいはスライドなどのような
支持体上に通常載置され、そして液相中で抗体と接触さ
せられる。支持体は次に液相から分離され、支持体相あ
るいは液相のいずれかが、検知可能な信号に関して、こ
のような信号を発する手段を用いて調べられる。この信
号は、検体における被分析物の存在に関するものであ
る。検知可能な信号を発する手段は、放射性標識類、蛍
光体類、酵素類などの使用を含むものである。不均質性
免疫検定法の例としては、放射性標識免疫検定法（ラジ
オイムノアッセイ）、免疫蛍光検査方法、酵素結合免疫
学的検定法などが含まれる。

上記の免疫学的検定技術の詳細な論議に関しては、エ
ドワードティーマギオ［Edward I Maggio］）シー
アールシープレスインコーポレーテッド，ボカラ
トン，フロリダ,1980年［CRC Press Inc.,Boca Raton,F
lorida,1980］）による“エンザイム−イムノアッセイ
［Enzyme−Immunoassay］”を参照のこと。例えば、米
国特許第3,690,834号、第3,791,932号、第3,817,837
号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、
第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,9
96,345号および第4,098,876号（この列挙は、余す所な
く掲げることを意図するものではない。）もまた参照の
こと。

本発明の抗体はまた、ジェイ．ナクル．メド．（1983
年）24:123〜129［J.Nucl.Med.（1983）24:123−129］
中におよびジャーナルオブクリニカルインベステ
ィゲーション（1983年）72:2101〜2114［J,Clin.Inves
t.（1983）72:2101−2114］中に悪性骨髄腫に関して述
べられたものと同様ば方法において、NSCLCを保持する
ヒト患者での転移性沈積物を画像とするために用いられ
得る。抗体またはそのフラグメントは、放射性標識さ
れ、そして患者へ静脈内的に投与され、その後該患者は
例えばガンマ線カメラなどを用いて画像とされる。

ヒト肺癌を異種移植された胸腺を欠いた”ヌード”マ
ウスにおいて行なわれた研究は、L6から調製された¹³¹I
標識Fabフラグメントが移植腫瘍において選択的に局在
化することを示した。このことは、黒色腫における先の
研究（ジェイ．ナクル．メド．（1983年）24:123〜129;
ジャーナルオブクリニカルインベスティゲーショ
ン（1983年）72;2101〜2114［J.Nucl.Med.（1983）24:1
23−129;J.Clin.Invest.（1983）72:2101−2114］）を
基礎として、L6およびL6から調製された抗体フラグメン
トの腫瘍選択的局在化は、ヒト患者の注射に伴なうもの
に似ていることを示すものである。

本発明はまた、上記に述べた方法を実施するための診
断キットを含むものである。１つの実施態様において
は、診断キットは、（ａ）上記により詳細に定義された
モノクローナル抗体および（ｂ）上記モノクローナル抗
体に対する特異結合パートナーと検知可能な信号を発し
得る標識との接合体からなる。この試薬はまた、緩衝化
剤、および例えば、ポリサッカライド類のようなタンパ
ク質安定化剤などのごとき補助的作用物質をも含み得
る。この診断キットはさらにまた、必要に応じて、該標
識が一構成成分である信号発生系の他の構成成分、試験
におけるバックグラウンド干渉を低減するための作用物
質、対照試薬、試験を行なうための装置などを含み得る
ものである。他の実施態様においては、診断キットは、
本発明のモノクローナル抗体と検知可能な信号を発し得
る標識との接合体からなるものである。上記したような
補助的作用物質はまた存在し得る。

本発明の抗体は、治療学的に用いられ得る。固有の生
物学的特性を有する抗体は、直接治療剤として有用であ
り得る。抗体L6は、ヒトリンパ球もしくはマクロファー
ジと組合された場合に、試験管内において［in vitro］
抗体依存性細胞障害（ADCC）を媒介することができるゆ
えに、このような特性を有するものである。すなわち、
例えば癌細胞が⁵¹Crで標識されそしてリンパ球および抗
体とインキュベートされる技術を用いることによって、
それは、検知可能なようにヒトNSCLC細胞の破壊を引き
起こすことができる。同様な研究が抗黒色腫抗体で行な
われてきており、そして高いADCCを有する抗体はヌード
マウスにおいてヒト黒色腫の成長を阻止し得ることが示
されている。L6抗体はIgG2aイソタイプのものであるゆ
え、マクロファージを活性化することもまた可能であろ
う。（シェアーズら，コントル．オンコル．カーガー，
バッセル（1984年）19:180〜192［Sears,et al.,Contro
l.Oncol.Karger,Basel,（1984）19:180−192］）。さら
にまた、抗体は、免疫毒素を形成するために毒素へ、ま
た放射線製薬的または製薬的に形成するために放射性物
質または薬剤へ結合され得る。抗体の免疫毒素あるいは
放射線製薬品を製造する方法は、周知である（例えばキ
ャンサートリートメントレポーツ（1984年）68:317
〜328［Cancer Treatment Reports（1984）68:317−32
8］を参照のこと。）。さらに、L6抗体は、例えばヒト
血清の存在下においてNSCLC細胞を殺すように、ヒト補
体を活性化し得る。

それゆえ、本発明は、宿主に対し、非−小細胞肺癌細
胞の集団の減少ないしは消失を引き起すのに十分な量の
L6抗体またはその誘導体を投与することでなる、宿主に
おける非−小細胞肺癌細胞の集団を減少ないしは消失す
るための方法を包含するものである。L6抗体の誘導体と
は、L6抗体が、例えば毒素あるいは放射性物質のよう
な、このような細胞の集団を減少ないしは消失すること
において補助する物質に結合されることを意味する。

本発明のモノクローナル抗体の他の治療的用途は、免
疫源として本発明のモノクローナル抗体の１つを使用す
ることにより産生される抗イディオタイプ抗体での患者
免疫処置である。このような免疫処置は、能動的抗腫瘍
活性をもたらし得る（例えば、ネポムら，プロシーディ
ングオブザナショナルアカデミーオドサイ
エンシズオブザユナイテッドステートオブ
アメリカ（1984年）81:2864〜2867［Nepom et al.,Pro
c.Matl.Sci.U.S.A.（1984）81:2864−2867］を参照のこ
と。）。同様のアプローチにおいて、患者は、糖製形態
におけるL6抗原、あるいは該抗原の修飾形態で免疫化さ
れ得る。

本発明の興味ある観点は、本抗体は例えば1984年11月
２日に出願された米国特許出願−連番号第667,521号に
開示されるもののようなNSCLCに対する他の抗体と組み
合わせることができることである。この組合せは、少な
くとも上記したような肺癌のタイプ、すなわち、未分化
大細胞肺癌、腺癌および類表皮癌を検知することにおい
て有効である。

本発明のモノクローナル抗体はまた、乳癌などのよう
なその他の癌に関連する抗原における決定部位を限定す
る。従って、本発明の抗体は、このような癌に対して指
向する診断的あるいは治療的製品における使用を見い出
し得るものである。

実施例本発明は、以下の例示的実施例によってさらに論証さ
れる。いくつかの用いられた手段が最初に述べられる。

免疫組織学的技術冷凍断片における免疫組織学的研究のために、ガリギ
ュースら［Garrigues et al.］（インターナショナル
ジャーナルオブキャンサー（1982年）29:511〜515
［Int.J.Cancer（1982）29:511−515］）によって修正
されるようなイムノケミストリー，ジョンウイリー
アンドサンズ，ニューヨーク,1979年，第104〜169頁
［Immunochemistry,John Wiley ＆ Sons,New York,197
9,pp:104−169］中のステルンベーガー［Sternberger］
の非標識化抗体技術［unlabelled antibody techniqu
e］が用いられた。これらの試験に関する標的組織は、
外科手術で得られそして液体窒素中で予め冷却されたい
たイソペンタン中での剥離の４時間以内で冷凍された。
組織は、そして使用するまで、液体窒素中であるいは−
70℃で貯蔵された。ウサギ抗マウスIgG（ステルンベー
ガー−メイヤーイムノケミカルズインコーポレーテ
ッド，メリーランド州ジャレッティスビル［Sternberge
r−Meyer Immunochemicals,Inc.Jarettsville,MD］）が
1/50の希釈で用いられた。特に精製されたマウスペルオ
キシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体2mg/mlを含有す
るマウスペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体
（PAP,ステルンベーガー−メイヤーイムノケミカルズ
インコーポレーテッド）が1/80の希釈で用いられた。
冷凍切片が調製され。乾燥され、アセトンで処理されそ
して乾燥された（ガリギュースら［Garrigues et a
l.］,1982年）。組織学的評価に関して用いられる切片
は、ヘマトキシリンで染色された。非特異的バックグラ
ウンドを減少するために、切片は、1/5に希釈された正
常ヒト血清と予備的にインキュベートされた（ガリギュ
ースら,1982年）。マウス抗体、ヤギ抗マウスIgGおよび
マウスPAPが10％正常ヒト血清および３％ウサギ血清の
溶液中に希釈された。

染色手順は、一連の切片を2.5時間特異的抗体あるい
は対照抗体のいずれかで処理し、1/50に希釈されたウサ
ギ抗マウスIgGと30分間インキュベートされ、そして1/8
0に希釈されたマウスPAP複合体に30分間されされること
から成るものであった。抗体とのそれぞれの処理の後、
スライドはリン酸緩衝食塩水（PBS）中で２度ずつ洗浄
された。免疫組織化学的反応は、0.05Mトリス、pH7.6中
の新たに調製された0.05％、3,3′−ジアミノベンジジ
ンテトラハイドロクロライド（シグマ，ミズーリー州セ
ントルイス）および0.01％過酸化水素を８分間用いて発
色させられた。蒸留水中の１％ OsO₄溶液へ20分間さら
にさらすことは、着色を強烈なものにした。切片は水で
すすがれ、アルコール中で脱水化され、キシレン中で透
明とされ、スライド上に載置された。切片はそれぞれコ
ード下で研究され、コードされた資料はひとりの無関係
な研究者によって調査された。代表的なスライドは微分
干渉差異光学（ゼイス−ノマルスキー［Zeiss−Nomarsk
i］）を用いることによって写真とされた。抗体着色の
程度は、Ｏ（反応性なし）、＋（わずかの陽性細胞）、
＋＋（少なくとも1/3の細胞陽性）、＋＋＋（多くの細
胞陽性）、＋＋＋＋（ほぼ全ての細胞強い陽性）として
評価された。＋とＯの着色の間の差異は、＋＋と＋との
間の差異よりもより明確さの低いわかれ目であったの
で、＋＋ないしはそれ以上として程度づけされた着色を
“陽性”として数えることを決定した。腫瘍細胞および
支質細胞の双方が腫瘍試料中に観察されたが、支質細胞
は全く着色されないかあるいは腫瘍細胞よりもより弱く
着色されるゆえ、着色は、腫瘍細胞のものに関連して記
録された。

抗原位置の決定抗原の細胞下局在は、非イオン性界面活性剤での透過
化の前あるいは後の細胞に対して結合する抗体を計測す
ることによって測定された。完全な培養細胞の細胞表面
へ結合する抗体は、¹²⁵I標識された抗体を用いての直接
結合検定法（ブラウンら，プロシーディングオブザ
ナショナルアカデミーオブサイエンシズオブ
ザユナイテッドステートオブアメリカ（1981
年）78:539〜543［Brown et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.（1981）78:539−543］）によってあるいは、（F
ACS）II細胞識別器を用いる間接蛍光によって固定され
た。細胞内位置に結合する抗体は、パラホルムアルデヒ
ドで固定化し、続いて非イオン性界面活性剤NP−40で透
過性にした後、¹²⁶I標識された抗体を細胞に直接結合さ
せることによって測定された。

結合検定法ａ）放射性標識された抗体を用いることによって行なわ
れる結合検定法（ブラウンら，上記）のために、培養細
胞（10⁶）は、培養培地中で熱活性化（56℃で30分間）
胎児ウシ血清100μｌ中の¹²⁵I標識された抗体10⁶cpmと
４℃で30分間インキュベートされた。PBS 5mlの添加の
後、細胞は250×ｇで10分間遠心分離することによって
ペレット化された。上澄み液は吸い出され、そしてペレ
ットは¹²⁵Iに関して計数された。非特異的結合を計測す
るために、並行的インキュベーションが競合物として標
識されていない抗体10μｇを用いて行なわれた（ブラウ
ンら，上記）。いくつかの例においては、結合検定法
は、類似の様式においてプラスチック性培養皿へ付着し
た細胞単一層上で行なわれた。

ｂ）FACSII細胞識別器において行なわれる結合検定法の
ために、細胞は、5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）
を含むPBSを用いて、それらの基質から除去された。１
×10⁵細胞を含有する試料は最初に２μg/mlの濃度でモ
ノクローナル抗体とインキュベートされ、続いて1:200
の希釈でフルオレセイン結合ヤギ抗マウス抗体とインキ
ュベートされた。細胞は次に洗浄されそして培養培地中
に再懸濁された。FACS分析の直前に、ヨウ化プロピシウ
ムが非生存細胞を染色するために１μg/mlの最終濃度へ
と添加された。FACS分析の間、赤色蛍光を発する細胞
が、生存細胞のみを調べるために、電子的に追出され
た。フルオレセイン蛍光の平均強度が、次にそれぞれの
抗体に関して測定された。陰性の比較対照はモノクロー
ナル抗体のない試料から構成されており。一方陽性の比
較対照は、HLAタイプ１組織適合性抗原に対するモノク
ローナル抗体からなるものであった。平均チャンネルフ
ルオレセインが少なくともバックグラウンドの３倍であ
った場合に、着色は陽性であると見なされた。

タンパク質抗原測定タンパク質抗原を同定するために、肺癌細胞が表面放
射ヨウ素化あるいは³⁵S−メチオニンで代謝的に標識さ
れた。抗原は、モノクロナール抗体とのインキュベーシ
ョン、ヤギ抗マウスIgGの添加、そして、スタフィロコ
ッカス・アウレウス［S.aureus］への吸着によって細胞
溶解物から単離された。免疫沈降物は、洗浄され、そし
て述べられた（ブラウンら，上記）ようにドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−P
AGE）（10〜20％アクリルアミド）によって分析され
た。

糖脂質に対する抗体の反応性の測定抗体は、微量試験ウェルに吸収させた精製糖脂質（コ
レステロールおよびレシチンを伴う）とのおよび糖脂質
が分画されている薄層クロマトグラフィープレートとの
インキュベーションによって糖脂質抗原への反応性に関
して試験された。結合抗体は、マウス免疫グロブリンに
対する抗血清および放射性ヨウ素結合プロテインＡとの
インキュベーションによって測定された。

イソタイプ測定ａ）オークターロニー免疫拡散法特定のハイブリドーマの上澄液の部分標本が２％寒天プ
レートの中央ウェル中へ入れられた。単特異性ウサギ抗
マウスIgイソタイプ抗体（メロイ［Meloy］）が外側の
ウェル中へ入れられそしてプレートは室温で２時間、さ
らに４℃で一晩インキュベートされた。

ｂ）可撓性ポリ塩化ビニル製の96ウェルプレート（コー
スター［Coster］）が37℃で２時間0.1mg/mlヤギ抗マウ
スIg抗体で被覆され、そして37℃で２時間３％BSA溶液
で逆被覆された。ハイブリドーマ上澄液が次に37℃で２
時間インキュベートされた。PBSで洗浄した後、ウシ血
清アルブミン（BSA）プレートは、37℃で２時間ペルオ
キシダーゼに結合した単特異性ウサギ抗マウスIgイソタ
イプ抗体（ザイムド［Zymed］）とインキュベートされ
た。洗浄の後、プレートは0.1Mクエン酸緩衝液pH4.5中
の1mg/mlオルソフェニレンジアミンおよび0.03％H₂O₂と
インキュベートされた。630nmでの光学密度がダイナテ
ック酵素結合免疫吸着剤検定プレート読取器［Dynatec
ELISA plate reader］において測定された。

スタフィロコッカスプロテインＡ結合測定方法微小力価プレートがPBSに0.02％NaN₃）を加えたものの
中の５％NCSとインキュベートされそして上澄液は吸い
出された。表皮細胞の懸濁液（２×10⁷細胞/ml）の25μ
ｌが、それぞれのウェルへ加えられ、そして室温で１時
間、特定の抗体25μｌとインキュベートされた。プレー
トは1200rpmで７分間遠心分離され、50％ NCS/PBS/NaN₃
で二度洗浄され、そして¹²⁵I−スタフィロコッカスプ
ロテインＡ（約50,000cpm/25l）25μｌが添加された。
プレートは25℃で１時間インキュベートされ、５％ NCS
/PBS/NaN₃で２度洗浄され、そして乾燥された。ウェル
の底部が切断されそしてガンマーカウンター中で計数さ
れた。

実施例モノクローナル抗体の調製モノクローナル抗体は、３カ月齢のBALB/cマウスを４
つの異なる源のうちの１つのヒト組織と免疫処置するこ
とで産生された：（１）転移性非−小細胞肺癌を病んで
いる患者からの胸膜滲出液、（２）非−小細胞肺癌から
の培養細胞、および（３）３〜４カ月齢ヒト胎児からの
肺組織。免疫処置は、約10⁷細胞でマウスを腹空内的に
３〜４回注射することにより行なわれた。最後の免疫処
置の３日後、脾臓が除去され、培養培地中に懸濁されそ
してNS1マウス骨髄腫細胞と融合された（ケーラーとミ
ルステイン、上記）。混合物は、単一融合細胞（クロー
ン）を起源として発する低濃度培養株を形成するために
接種された。ハイブリッド形成のために用いられるこの
技術は、イェイら［Yeh et al.）（インターナショナルジャーナルオブキャンサー（1979年）29:269〜275
［Int.J.Cancer（1979）29:269−275］によってすでに
のべられている。

ハイブリッド細胞からの上澄み液は、酵素結合免疫吸
着剤検定法およびオートラジオグラフィー的間接¹²⁵I−
標識化プロテインＡ検定法［autoradiographic indirec
t ¹²⁵I−iabelled protein A assey］（ブラウンら，ジ
ャーナルオブイムノロジーメソッズ（1979年）3
1:201〜209［Brown et al.,J.Immunol.Meth.（1979）3
1:201−209］）の双方を用いることによって、とりわけ
細胞膜を含有する免疫設置に用いられた腫瘍からの抽出
物に対してスクリーニングされた。これらの抽出物は、
コルカーら［Colcher et al.］（キャンサーリサーチ
（1981年）42:1451〜1459［Cancer Res.,（1981）42:14
51−1459］）：イェイら（上記）から修正された方法を
用いて調製された。このために、組織はPBSで洗浄され
そして懸濁され、完全な腫瘍に関するものは、ステンレ
ス鋼製ふるいを通して圧搾することによってなされた。
この後に、1mMフェニルメチルスルフォニルフルオライ
ド（カルビオケム−ベーリングコーポレーションカ
ルフォルニア州サンディエゴ［Calbiochem−Behring Co
rp.,San Diego,CA］）を含む1mM NaHCO₃が添加され、原
料は、次にデューンス［Dounce］ホモジナイザーのＢ乳
棒の50ストロークで、氷上において均質化された。27,0
00×ｇで15分間の遠心分離の後、上澄み液が除去され、
そしてペレットはPBS中に再懸濁され、１分間音波処理
され、−70℃で貯蔵された。

細胞膜抽出物に結合する抗体を産生したハイブリドー
マは、クローン化され、試験管内で増殖され、そして抗
体特異性に関してさらに試験された。この試験は、上記
した免疫組織学的技術を用いることによって行なわれ、
肺癌、他の腫瘍および正常ヒト組織の冷凍切片に結合す
るための抗体の能力が試験された。ヒト肺癌腫に対する
顕性特異性の抗体を産生するこれらのハイブリドーマは
再クローンされ、増殖され、そしてプリスタン処理され
た３カ月齢BALB/cマウス中へ注射され、そこで、これら
は腹水腫瘍として増殖した。

腹水中へ分泌される抗体は、プロテインＡセファロー
ス［Sepharose］において（エイら，イムノケミストリ
ー，（1978年）15;429［Ey et al.,Immunochemistry（1
978）15:429］）あるいはセファクリルＳ−300［Sephac
ryl S−300］中でのゲル濾過によって精製された。精製
抗体は、免疫組織学による付加的な特異性試験、該抗体
が細胞表面に結合したことを測定するための完全細胞に
おける結合検定、および上記したような放射性免疫沈降
試験を含むなお一層の特性づけのために用いられた。

モノクローナル抗体L6は、上記したような相応するハ
イブリドーマから産生された。この抗体は、本明細書に
おいて上記に示した特性を表わすものであった。

L6と呼称される細胞系は1984年12月６日にA.T.C.Cに
寄託され、そして受託番号HB8677を与えられた。

実施例 L6抗体とのいくつかの糖脂質の反応性 L6抗体の反応性における研究は、カンナジら，（1983
年）キャンサーリサーチ 43:4997〜5005［Kannagi e
t al.（1983）Cancer Research 43:4997−5005］および
ヌードルマンら（1982年）ジャーナルオブバイオロ
ジカルケミストリー257:12752〜12756［Nudelman et
al（1982）J.Biol.Chem.257:12752−12756］によって述
べられたような標準的手法に従い行なわれた。限定され
た糖脂質が、L6抗体との反応性に関して検定された。TL
C上で分離された糖脂質は、抗体によって免疫染色さ
れ、そして固相ラジオイムノアッセイがプラスチック製
ウェル上に被覆された糖脂質において行なわれた。デー
タは、第１表に要約される。

L6個抗体は、アシアロGalNAc−GM₁とで観察された最
も強い反応とともに、アシアロGalNAc−GM₂およびアシ
アロGM₂と特異的に反応した。弱い反応性がガングリオ
テトラオシルセラミド（アシアロGM₁）およびx₂糖脂質
（第１表に定義される構造）とで見られた。グロボシ
ド、グロボトリアオシルセラミド、ラクトシルセラミ
ド、パラグロボシド（ラクトテトラオシルセラミド）、
Le^xおよびLe^y構造を有する糖脂質類、ガングリオ−およ
びラクト−シリーズ構造を有するガングリオシド類は、
すべて陰性であった。それゆえ、L6抗体は次の配列を識
別するものと思われる。

GalNAcβ１→4Galβ１→3GalNAcβ１→4Galβ１→Ｒ（式中Ｒは限定されていない炭水化物である。）実施例抗体依存性細胞傷害（ADCC）この研究は、ヘルストームら，ビーエヌエイエス，8
2:1499,1985年［Hellstorm et al.,PNAS 82:1499,198
5］によってすでに述べられた方法により、⁵¹Cr標識標
的細胞（2981肺癌）、抗体（種々の希釈度）およびリン
パ球の混合物（リンパ球と標的細胞の間の種々の割合）
を４時間インキュベートし、そして上澄液中へ放出され
た⁵¹Crの量を計測することによって実行された。実験お
よび結果は第２表に要約される。

第２表 L6抗体（μg/ml （ADCCの細胞傷害％） 10μg/ml,バッチ１ 84 10μg/ml,バッチ２ 76 10μg/ml,バッチ３ 83 10μg/ml,バッチ４ 66 10μg/ml,バッチ５ 74 0μg/ml, 18 （ヒトリンパ球なし、バッチ１）０これゆえ抗体L6は、L6抗原を発現する標的細胞におい
て試験された場合に、ADCCを媒介した。

実施例ヒト補体存在下における抗体媒介細胞傷害抗体L6がヒト補体の存在下において腫瘍細胞を破壊し
得るか否かを試験するために、⁵¹Cr標識された標的細胞
（2981肺癌）が確立された手法（ヘルストームら，ピー
エヌエイエス，82:1499,1985年）に従い、抗体およびヒ
ト補体と４時間インキュベートされた。実験および結果
は第３表に要約される。

第３表 L6抗体（μg/ml）細胞傷害 50 ３ 10 54 1 43 50（補体なし）１ 10（補体なし）３標的細胞＋培地０ヒト補体を活性化する抗体は、少なくとも２つの理由
から興味あるものである：これらは、腫瘍細胞を直接的
に殺すものであろうし、またこれらは、正常細胞に比較
して腫瘍性細胞に対して選択的に細胞溶解性である活性
化されたマクロファージおよび他の細胞と共に腫瘍エリ
アにおいて炎症性応答を引き起こし得るものであろう。

実施例種々の腫瘍に対する免疫組織学での特異性試験組織抗体L6 肺癌腺 18/19 鱗状 8/10 小細胞 2/6 大細胞 2/2 乳癌 13/16 結腸癌 9/9 黒色腫 1/4 “その他の腫瘍”（肉腫など） 1/9 本発明は上記の実施態様に特に言及して詳細に述べら
れた。しかしながら種々の変更と修正が本発明の精神と
視野の範囲内でもたらされ得ることが理解されるであろ
う。

、

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）審判番号平7−22976 (72)発明者ブラウン、ジヨセフピーアメリカ合衆国ワシントン州 98109 シアトルニユートンストリート 409 (72)発明者ヘルストーム、カールイーアメリカ合衆国ワシントン州 98105 シアトルノースイーストサーバードライブ 39―25 (72)発明者ホーン、ダイアンアメリカ合衆国ワシントン州 98119 シアトルウエストオリンピツクプレースナンバー404 202 (72)発明者リンスレイ、ペーターアメリカ合衆国ワシントン州 98119 シアトルナインスウエスト 2430 (56)参考文献Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，79［15］（1982）Ｐ．4650 −4654 細胞工学，１［１］（1982）Ｐ．23− 34

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】その抗原結合部位が、（ａ）薄層クロマトグラフィで単離され、その末端配列
がGalNAcβ１→4Galβ１→3GalNAcβ１→4Galβ１→で
ある炭水化物および、（ｂ）ヒト非−小細胞肺癌に由来する約20,000ダルトン
の分子量を有するタンパク質抗原に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項２】Fab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片である請
求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】検出可能な信号を発生し得る標識に結合さ
れた請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項３記載のモノクローナル抗
体。
【請求項５】検出可能な信号を発生し得る標識に結合さ
れた請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項５記載のモノクローナル抗
体。
【請求項７】IgGイソタイプの請求項１記載のモノクロ
ーナル抗体。
【請求項８】IgG_2aイソタイプの請求項７記載のモノク
ローナル抗体。
【請求項９】L6と称する請求項８記載のモノクローナル
抗体。
【請求項１０】ATCCに寄託されて受託番号HB8677を指定
されたマウスハイブリドーマ細胞系により生産される、
請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】該抗体の抗原結合部位が、ATCCに寄託さ
れたハイブリドーマHB8677により生産されるモノクロー
ナル抗体L6のその標識抗原への免疫特異的結合を競合物
に阻害する、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】Fab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片である
請求項11記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】検出可能な信号を発生し得る標識に結合
された請求項11記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項13記載のモノクローナル抗
体。
【請求項１５】検出可能な信号を発生し得る標識に結合
された請求項12記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項15記載のモノクローナル抗
体。
【請求項１７】（ｉ）組織検体をモノクローナル抗体と
接触させ、ここで該モノクローナル抗体の抗体結合部位
は、（ａ）薄層クロマトグラフィで単離され、その末端配列
がGalNAcβ１→4Galβ１→3GalNAcβ１→4Galβ１→で
ある炭水化物および、（ｂ）ヒト非−小細胞肺癌に由来する約20,000ダルトン
の分子量を有するタンパク質抗原に結合し；そして（ｃ）該モノクローナル抗体が組織検体に免疫特異的に
結合するかどうかを検出し、その組織検体への該モノク
ローナル抗体の免疫特異的結合が組織検体における悪性
疾患の存在を示すものである；ことからなる、個体から得られた組織検体における悪性
疾患の存在の検定方法。
【請求項１８】組織検体へのモノクローナル抗体の結合
が、該モノクローナル抗体の特異的結合相手と検出可能
な信号を発生し得る標識との複合体を組織検体と接触さ
せることにより工程（ｂ）において検出され、その際組
織検体に結合された信号の検出が組織検体への該モノク
ローナル抗体の結合を示す、請求項17記載の方法。
【請求項１９】結合相手がモノクローナル抗体に対して
特異的な抗体である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】モノクローナル抗体が検出可能な信号を
発生し得る標識に結合され、組織検体に結合された信号
の検出が組織検体への該モノクローナル抗体の結合を示
す、請求項17記載の方法。
【請求項２２】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項21記載の方法。
【請求項２３】組織検体が肺、結腸または乳房組織検体
である請求項17記載の方法。
【請求項２４】（ａ）組織検体を前記モノクローナル抗
体のFab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片と接触させ；そし
て（ｂ）Fab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片が組織検体に免
疫特異的に結合するかどうかを検出し、その際組織検体
へのFab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片の免疫特異的結合
が悪性疾患の存在を示すものである；ことからなる、請求項17記載の方法。
【請求項２５】組織検体へのFab、Ｆ（ab′）_２またはF
v断片の結合が、Fab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片の特異
的結合相手と検出可能な信号を発生し得る標識との複合
体を組織検体と接触させることにより工程（ｂ）におい
て検出され、その際組織検体に結合された信号の検出が
組織検体へのFab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片の結合を
示す、請求項24記載の方法。
【請求項２６】結合相手がFab、Ｆ（ab′）_２またはFv
断片に対して特異的な抗体である、請求項25記載の方
法。
【請求項２７】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項25または26記載の方法。
【請求項２８】Fab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片が検出
可能な信号を発生し得る標識に結合され、組織検体に結
合された信号の検出が組織検体へのFab、Ｆ（ab′）_２
またはFv断片複合体の結合を示す、請求項24記載の方
法。
【請求項２９】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項28記載の方法。
【請求項３０】組織検体が肺、結腸または乳房組織検体
である請求項24記載の方法。
【請求項３１】（ａ）組織検体を、ATCCに寄託されて受
託番号HB8677を指定されたハイブリドーマ細胞系により
生産されるモノクローナル抗体L6と接触させ；そして（ｂ）モノクローナル抗体L6が組織検体に免疫特異的に
結合するかどうかを検出し、その際組織検体へのモノク
ローナル抗体L6の結合が組織検体における悪性疾患の存
在を示すものである；ことからなる、請求項17記載の方法。
【請求項３２】組織検体へのモノクローナル抗体L6の結
合が、該モノクローナル抗体L6の特異的結合相手と検出
可能な信号を発生し得る標識との複合体を組織検体と接
触させることにより工程（ｂ）において検出され、その
際組織検体に結合された信号の検出が組織検体への該モ
ノクローナル抗体L6の結合を示す、請求項31記載の方
法。
【請求項３３】結合相手がモノクローナル抗体L6に対し
て特異的な抗体である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項32または33記載の方法。
【請求項３５】モノクローナル抗体L6が検体可能な信号
を発生し得る標識に結合され、組織検体に結合された信
号の検出が組織検体へのモノクローナル抗体L6複合体の
結合を示す、請求項31記載の方法。
【請求項３６】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項35記載の方法。
【請求項３７】組織検体が肺、結腸または乳房組織検体
である請求項31記載の方法。
【請求項３８】（ａ）組織検体を、前記モノクローナル
抗体L6のFab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片と接触させ；
そして（ｂ）Fab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片が組織検体に免
疫特異的に結合するかどうかを検出し、その際組織検体
へのFab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片の免疫特異的結合
が悪性疾患の存在を示すものである；ことからなる、請求項31記載の方法。
【請求項３９】組織検体へのFab、Ｆ（ab′）_２またはF
v断片の結合が、Fab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片の特異
的結合相手と検出可能な信号を発生し得る標識との複合
体を組織検体と接触させることにより工程（ｂ）におい
て検出され、その際組織検体に結合された信号の検出が
組織検体へのFab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片の結合を
示す、請求項38記載の方法。
【請求項４０】結合相手がFab、Ｆ（ab′）_２またはFv
断片に対して特異的な抗体である、請求項38記載の方
法。
【請求項４１】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項39または40記載の方法。
【請求項４２】Fab、Ｆ（ab′）_２またはFv断片が検出
可能な信号を発生し得る標識に結合され、組織検体に結
合された信号の検出が組織検体へのFab、Ｆ（ab′）_２
またはFv断片複合体の結合を示す、請求項38記載の方
法。
【請求項４３】前記標識が蛍光物質、放射性標識、発色
団、または酵素である請求項42記載の方法。
【請求項４４】組織検体が肺、結腸または乳房組織検体
である請求項38記載の方法。