JP2564611B2 - 生物細胞用遠心分離装置及び細胞の分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生物細胞含有液中から細胞を分離回収する装
置及び方法に係り、特に生物細胞を損傷せずかつ微生物
の侵入のない好適な遠心分離装置及び分離方法に関す
る。

〔従来の技術〕

動物細胞を培養するには、培養槽内に細胞を捕捉した
状態で栄養成分を含む液体培地と、老廃成分を含む廃液
とを交換する、いわゆる潅流培養が必要である。潅流培
養により細胞の増殖を維持するには脆弱な細胞を機械的
に損傷せず、生理的条件下でかつ微生物フリーで１ヶ月
以上の長期間、細胞の分離操作を反復して行うことが要
求される。

従来、細胞の分離操作は一般に実験室レベルの手作業
での分離操作により行われている〔日立評論第69巻No.4
（1987年）P13〜17〕。すなわち、作業者が無菌室内
で、微生物汚染のない様に細心の注意を払いつつ、遠沈
管に培養液を充填して、開放型の遠心分離機で分離し、
上清を捨て、沈澱した細胞をフレッシュ培地に再懸して
培養槽に戻していた。本操作は極めて微生物汚染のリス
クが高く、かつ小量づつ分けて操作する必要がある。か
つ、１バッチに１〜２時間を要するため、その間細胞は
酸素欠乏、栄養源欠乏、温度低下等非生理的条件下にお
かれることをよぎなくされる。

一方、最近、病院内で血液と血清とを分離するため、
クローズド系での遠心分離装置も開発されている。しか
し、細胞含有液が高速で固体面と接触し、かつ回転軸が
外部へ貫通するメカニカルシールのため、脆弱な細胞を
損傷し、シール部からの微生物侵入のリスクが高い。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は上記従来技術の欠点を改善し、培養液
が固体面と高速で接触せず、かつロータを耐圧密封構造
をとれる形とし、分離濃縮した細胞を媒液に再懸濁する
ことのできる遠心分離装置を創案し、この装置を用いて
細胞を分離する方法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の生物細胞用遠心分離装置の第１の特徴は、ス
チーム耐圧性の壁からなる密閉ロータ室に回動自在のロ
ータとロータ内の液面下及び液面上に上下動自在に設置
したバッフルとから成り、前記バッフルを少なくとも遠
心分離時のみ液面上に移動させるようにしたことにあ
る。

本発明の第２の特徴は、上記ロータの回転をロータ室
壁外に設置して磁力伝達機構で水平方向に行うようにし
たことである。

本発明の第３の特徴は、 ａ） 細胞含有液導入配管、遠心分離上清液排出用配
管、細胞懸濁用バッフル、媒液導入用配管、細胞再懸濁
液排出用配管を兼ね、 ｂ） ロータ室中でロータ内液面下及び液面上に上下伸
縮可能で、 ｃ） ロータ室壁に固定され壁外に通ずる配管に連通す
る、管状体を装備していることである。これにより回転
する液と高周速で接触する部分を完全に回避できる。さ
らに、遠心上清の排出、細胞の再懸濁を効果的に行うこ
とができる。

本発明第４の特徴は、ロータ室外へ通ずる全配管が室
外でバルブによりシールされていることである。これに
より、外界と完全に遮断した状態で液の取扱いが可能に
なる。

次いで、本発明の内容を順次説明する。

本発明の耐スチーム製ロータ室及び、ロータ室から室
外に出ている配管及び配管上のバルブは次の条件を満た
す材料及び構造を有する必要がある。

１） スチーム殺菌に有効な温度、すなわち120℃以上
で、少なくとも10分以上保持できる。

２） 少なくとも気体及び液が接触する内面は実質的に
毒性成分を溶出しない材料で構成する。

上記に適する材料の例としてはSUS 316,SUS 316L,チ
タニウム等があげられる。耐圧のための壁厚は、適宜使
用材質により選択される。

本発明の遠心分離装置は、上方に開口部を持つ凹状、
例えば椀型のロータを用い、これをロータ室内で水平方
向に回転することにより、細胞をロータ室側壁側に沈降
分離することにある。この際の回転力は、ロータ室底壁
の下に配置した永久磁石を軸に取り付けたモータによっ
て行われる。ロータ底部にもモータの回転力を受けるた
めの永久磁石を配置してあり、ロータ底面をロータ室底
部との潤滑によりロータが回転する。潤滑方法として
は、耐スチーム製であれば、従来公知の技術が選択され
る。例えばボールベアリング等が用いられる。ロータの
回転速度はロータの直径により選定されるが、少なくと
も細胞が沈降するに必要な2000Gの得られる回転速度が
必要である。例えば、半径15cmのロータでは約2000rpm
が必要である。なお、ロータ室底部は非磁性材料また低
磁性材料で形成される。

本発明における液のロータ中への供給排出及び細胞の
再懸濁用バッフルを兼ねる上下伸縮性の配管は具体的に
は第１図〜第６図に示すような構造を有する。

上述した遠心分離装置の特徴をさらに具体的に説明と
次の通りである。

１） スチーム耐圧性の壁からなるロータ室内にロータ
を内蔵する。

２） 上方に開口部を有する椀状のロータが、ロータ室
底部の壁外にある電動機の回転力をロータ室底部壁を介
する磁力により伝達を受け、水平方向に回転する。

３） ロータ室内に次の特徴を有する管状体を有する。

ａ） 細胞含有液導入配管、遠心分離上清液排出用配
管、細胞懸濁用バッフル、細胞懸濁用媒液導入用配管、
細胞再懸濁液排出用配管を兼ねる。

ｂ） ロータ室の中でロータ内の液面下及び液面上に上
下伸縮可能。

ｃ） ロータ室内に固定され、壁外に通ずる配管に連通
する。

４） ロータ室から室外に出る全配管が室外でバルブに
よりシールされている。

さらに、具体的方法及構造は次通りである。前述の遠
心分離装置に於て、 １） 管状体中を移動する流体の流路が管状体と並行に
なるフレキシブルチューブにより連絡するようにした構
造。

２） 前記フレキシブルチューブが剛性材のラセン管で
構成する構造。

３） 前記管状体が外筒と内筒とを接続した管から構成
する構造。

４） 前記管状体の外筒と内筒のどちらか一方が上下方
向に固定され、他方が上下に移動できる構造。

５） 前記外筒と内筒との接触面がシール性の高い表面
を有するか、もしくは、筒壁面に弾性を有するＯリング
等のシール材を配置した構造。

６） バッフルが板状でかつ管状体の上下動する筒の外
壁に固定されることにより、該筒と共にバッフルがロー
タの内外に移動できるようにした構造。

７） 前記のバッフルが管壁に対して垂直方向に付設さ
れ管壁に平行に移動する構造。

８） 管状体の上下動する方の筒の外面と接する円板を
配置し、円板の回転により、筒の上下動を行う構造。

９） 上述の管状体に於て、上下動する側の筒の外面と
円板との接する両面間がまさつ抵抗を有する材料で構成
する構造。例えば、筒外側が平歯車、円板側が歯車とす
る構造。

10） ロータ室内上壁に上端が接続し、かつ管外壁下方
に電磁石もしくはソレノイドを装着した外筒と、上部に
磁性金属もしくは永久磁石と下部にバッフルを付した内
筒を有し、電磁石又はソレノイドへの電流の入切によ
り、内筒外壁が外筒内壁と上下方向に摺動可能とした構
造。

11） 管状体に於て、上下動する方の筒が柔軟性を有す
る線状物を介してロータ室内のまきあげ機構に接続され
ている構造。

12） ロータ底部面に永久磁石を配置したロータを用い
る構造。

13） ロータ側面が垂直方向に凹状を呈するロータの構
造。ロータ側壁内面の直径が下方向にそって増加するこ
とを特徴とする構造のロータ。

14） ロータ回転時のロータ室内容積の少なくとも20％
以上の容積の液を保持することを可能にした構造のロー
タ。

15） ロータ室底部壁内面と接するロータ底面の外側に
潤滑機構を有する構造。潤滑機構の例としてはベアリン
グがある。

16） 前述のロータに於て、ロータの回転軸が移動しな
い様に、ロータをロータ室底面のロータ受台にはめ込む
ことができるロータ保持機構を有する構造。例として
は、ロータ底部とロータ側マグネットとの間に頚部を構
成し、頚部側面と摺動可能でロータ室内壁に固定された
支持機構によりロータを支持する構造。さらに、支持機
構側かロータ頚部の摺動面のどちらか一方がベアリング
で構成する構造。

17） ロータ室もしくはロータを少なくとも上下にセパ
ラブルな構造とするロータ室もしくはロータ。

18） ロータ室壁のうち、少なくとも底部の壁が非磁性
もしくは低磁性の材料で構成する構造。

19） ロータ室外からロータ室に２本以上のスチーム耐
圧性の配管を接続する構造。

20） ロータ室に接続するスチーム用及び気体用の配管
の途中に無菌フィルタを配置した構造。

21） ロータ室、ロータ室内部構造物及び配管が120℃
以上の温度のスチームにかつ少なくとも10分以上保持で
き、かつ実質的に毒性成分を溶出しない材料で気液接触
部を構成する構造。

22） ロータ室内の温度を40℃以下の設定温度に調節す
る機構を有する構造。

23） 温度調節機構の伝熱面がロータ室内部にある構
造。

24） 少なくともロータ室側面の恒温水循環ジャケット
によりロータ室内温度調節を行う構造。

25） ロータ室内に恒温の無菌処理空気を導入すること
によりロータ室内の温度を調節する構造。

26） 導入される空気が調湿されているものであるこ
と。

27） ロータ回転速度の上昇、定速比、降下をモータの
回転数制御で行う構造。

28） 温度履歴を設定できる構造。

29） 遠心分離装置と培養槽もしくは細胞含有液貯槽、
遠心上清液貯槽、液体培地貯槽とを配管で接続し、各要
素をプロセスシーケンサにより配管上の弁を開閉するこ
とを特徴とする細胞培養システム。

30） 遠心分離装置のスチーム殺菌処理後に、細胞含有
液を遠心分離すること及び、細胞含有液の遠心分離のサ
イクルを反復して繰り返すことを特徴とする細胞含有液
から細胞を分離する方法。

31） スチーム殺菌を次の工程で行うことを特徴とする
細胞の分離方法。

１） ロータ室中へのスチーム導入 ２） 120℃以上10分以上保持 ３） ロータ室から出る配管の弁を閉 ４） 冷却 ５） ロータ室への無菌空気導入によるロータ室内気圧
を外圧と平衡化 ６） ロータ室内のドレイン排出 ７） 管状構造物の内筒をロータ内設定液面よりも上方
へ引きあげる。

32） 次の遠心分離操作を行うことを特徴とする細胞の
分離方法。

１） 管状構造物からロータ内への細胞含有液の定量供
給 ２） ロータ回転による遠心分離 ３） ロータ停止 ４） 内筒のロータ底部への降下 ５） 管状構造物からの遠心上清のロータ室外への排出 ６） ロータ内への細胞懸濁用媒液の定量供給 ７） ロータ低速回転による細胞の再懸濁 ８） 管状構造物からの細胞懸濁液のロータ室外への排
出 ９） 管状構造物の内筒引きあげ 10） 待機 33） 前記32）に於て、第10工程から第１工程に戻すこ
とからなる細胞の分離方法。

34） 細胞含有液として細胞培養液を用い、培液として
液体培地を用いかつ、細胞懸濁液を細胞懸濁液貯槽に貯
留することからなる細胞の分離方法。

35） 細胞懸濁液貯槽に無菌空気を導入することからな
る細胞の分離方法。

36） 細胞再懸濁液を培養槽に返送することからなる請
求項34記載の細胞の分離方法。

〔作用〕

上記のように構成された生物細胞用遠心分離装置に生
物細胞の培養液を供給し、遠心分離すると遠心分離時に
はバッフル板が上部にあげられているため細胞とバッフ
ル板との接触による機械的損傷はない。そして、ロータ
の回転はロータ室外に設置した駆動源からの磁力伝達機
械により行われるための遠心分離が完全な密閉系のもと
で行うことができる。その結果、細胞の微生物による汚
染のリスクもなく安全に培養液からの細胞の分離を行う
ことができる。

〔実施例〕

次に本発明を実施例により説明する。但し、本発明は
この実施例により限定されるものではない。

実施例１ 第１図により説明する。

ロータ室１はスチーム耐圧性の壁、配管、バルブによ
り系外と遮断されている。材質としてはロータ室、ロー
タ室内機構及び配管の内部が少なくとも120℃以上の温
度でかつ少なくとも10分以上保持できる耐熱、耐圧、耐
水性で、さらに実質的に重金属等の毒性成分を溶出しな
い材料、例えばSUS 316,SUS 316L、チタニウム等で構成
される。

ロータ２は磁力伝達式で水平方向に回転し、上方に開
口部を持つ椀型を呈する。遠心分離の際、少なくともロ
ータ内容積の20％以上の液を保持する構造とする。ロー
タ外面底部には、ロータ室底部と円滑に摺動する様にベ
アリングを介して設置する。またロータ底部には永久磁
石７が組み込まれる。ロータ室底部の下側にはモータ８
と連結した永久磁石７が配置され、モータの回転に同期
して磁力伝達によりロータ２が水平面で回転する機構と
なっている。ロータ室上部からロータ開口部内に上下に
伸縮する配管機構を有している。本機構は内筒４、外筒
3,2本で構成され、外筒３は外側垂直方向に平歯車のみ
ぞを有し、これとかみ合う歯車により上下に伸縮する。
外筒下方には細胞懸濁用のバッフル５を設けてある。

実施例２ 本実施例を第２図に示す。

実施例１の上下動する配管機構の代りに、管状体中を
移動する流体の流路が管状体と並行にあるフレキシブル
チューブ23により連絡している。他の構成は実施例１と
全く同じものである。

実施例３ 本実施例を第３図に示す。

実施例２の上下動する配管機構のフレキシブルチュー
ブの代りに剛性材のラセン状配管14で構成する。他の構
成は実施例１と全く同じものである。

実施例４ 本実施例を第４図に示す。

実施例１の上下動する配管機構６の代りに、内筒の流
路中に電磁弁16を挿入し、流路の開閉を行うようにして
ある。電磁弁閉の状態で外筒から流体、例えば無菌空気
もしくは液体を導入することにより内筒をロータ内に下
降させることができる。内筒下降した状態で培養液や培
地のロータ内への導入、ロータからの遠心上清や細胞懸
濁液を排出することができる。他の構成は実施例１と全
く同じである。

実施例５ 本実施例を第５図に示す。

実施例１の代りに、（１）管状体が、バッフル５の付
いた管が内筒４を構成し、ロータ室１と接続する管が内
筒４を構成し、両筒間の摺動により、気密性を保持しつ
つ外筒が上下する構造を有すると共に、（２）外筒壁に
接し電磁石又はソレノイド18を配置し、内筒外壁に磁性
金属７′を装着して、ロータ室１外部の電源を入切する
ことにより内筒４を上下方向に駆動する構造とする。

実施例６ マグネット駆動部（動力伝達部）に関し、実施例１〜
５の代案を第６図に示す。第６図の遠心分離装置の管状
体の部分は実施例１のそれで表わしてある。本実施例の
マグネット駆動部は、ロータ室側の磁性金属７′とロー
タ底部との間の頚部側面をロータ室壁面から支持された
ベアリング20で支えている。

実施例７ 遠心分離装置の使用プロセスの例を第７図にフローと
して示す。

本発明の遠心分離装置106のロータ室を通り、ロータ
内に又はロータ外に液を移送する配管が、少なくとも培
養槽101、培地貯槽102、廃液貯槽（細胞除去培養液用貯
槽）103及びスチーム発生器104と配管で接続し、かつ、
各配管内に挿入したバルブをプロセスシーケンサ105に
より開閉して、第８図に示す生物細胞の遠心分離のプロ
セスを実行する装置システム。

実施例８ 実施例１の遠心分離装置を実施例７のシステムによ
り、次のプロセスで生物細胞を遠心分離する。プロセス
概略を第８図に示す。

１） スチームをボイラーからロータ室中へ導入する。

２） 120℃以上で10分以上保持する。

３） ロータ室から出る配管の弁をすべて閉じる。

４） 37℃付近に冷却する。

５） ロータ室への無菌空気導入によりロータ室内圧力
を外圧と平衡化する。

６） ロータ内のドレインをロータ室の管状体を経由し
てロータ室外に排出する。

７） 管状体の内筒をロータ内設定液面よりも上方へ引
きあげる。

８） 管状体からロータ内に、培養槽から培養液を導入
する。

９） ロータ回転による遠心分離する。

10） ロータを停止する。

11） 内筒のロータを底部へ降下させる。

12） 遠心上清液を管状体を経由してロータ室外への排
出する。

13） 培地貯槽から新鮮な培地を管状体を経由してロー
タ室内に導入する。

14） ロータの低速回転により細胞を再懸濁する。

15） ロータ内の細胞再懸濁液を管状体を経て、培養槽
に返送する。

16） 管状体をロータ上部に引きあげる。

17） 一定時間待機。

18） １）に戻る。

〔発明の効果〕

本発明の遠心分離装置及びその使用方法により、細胞
を損傷せずに、生理活性を損なわない短時間内に、無菌
的に反復して細胞含有液から細胞を分離回収することが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜６図は本発明なる遠心分離装置の構造概略を示
す。第７図は本遠心分離装置を含む培養システムのフロ
ーを示す。第８図は、本遠心分離装置の操作フローを示
す。 １……ロータ室、２……ロータ、３……外筒、４……内
筒、５……バッフル、６……外筒上下機構、７……永久
磁石、８……モータ、９……細胞含有液、10……細胞懸
濁用媒液、11……空気、12……スチーム、13……Ｏリン
グ、14……ラセン状配管、15……支持棒、16……電磁
弁、17……電磁弁電気配線、18……ソレノイド、19……
ソレノイド電気配線、20……ベアリング、21……ベアリ
ング支持、22……ロータ頸部、23……フレキシブルチュ
ーブ

Claims (18)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】スチーム耐圧性の壁からなる密閉ロータ室
   内に回動自在のロータとロータ内の液面下及び液面上に
   上下動自在に設置したバッフルとから成り、前記バッフ
   ルは少なくとも遠心分離時に液面上に移動し得るように
   したことを特徴とする生物細胞用遠心分離装置。
2. 【請求項２】ロータの回転をロータ室壁外に設置した磁
   力伝達機構により行うようにしたことを特徴とする請求
   項１記載の遠心分離装置。
3. 【請求項３】ロータ室内に、細胞含有液導入配管、遠心
   分離上清液排出用配管、細胞懸濁用バッフル、細胞懸濁
   用媒液導入用配管、細胞再懸濁液排出用配管の各機能を
   併せ有し、ロータ室内でロータ内液面下及び液面上に上
   下伸縮可能でかつ、ロータ室内に固定されロータ室外に
   通ずる配管に連通する管状体を設けたことを特徴とする
   請求項１又は２記載の遠心分離装置。
4. 【請求項４】管状体中とロータ室内に固定されロータ室
   外に通じる配管とを移動する流体が管状体とフレキシブ
   ルチューブで連絡するようにしたことを特徴とする請求
   項３記載の遠心分離装置。
5. 【請求項５】管状体の外筒と内筒のどちらか一方が上下
   方向に固定され、他方が上下に移動できる構造であるこ
   とを特徴とする請求項３記載の遠心分離装置。
6. 【請求項６】管状体の下方部分に水平方向に固定された
   板状バッフルを有することを特徴とする請求項３乃至５
   のいずれかの項記載の遠心分離装置。
7. 【請求項７】ロータ室内上壁に上端が接続しかつ管外壁
   下方に電磁石もしくはソレノイドを装着した外筒と、上
   部に磁性金属もしくは永久磁石と下部にバッフルを付し
   た内筒を有し、電磁石又はソレノイドへの電流の入切に
   より内筒外壁が外筒内壁と上下方向に摺動可能にしたこ
   とを特徴とする遠心分離装置。
8. 【請求項８】ロータがその底部面に永久磁石を配したも
   のであることを特徴とする請求項１記載の遠心分離装
   置。
9. 【請求項９】ロータの側部が回転中心軸に対し凹状を呈
   し、ロータ側壁内面の直径が下方向にそって増加するよ
   うにしたものであることを特徴とする請求項１記載の遠
   心分離装置。
10. 【請求項１０】ロータ室底部壁内面と接するロータ底面
    の外側に装着した潤滑機構を有することを特徴とする請
    求項１又は８項記載の遠心分離装置。
11. 【請求項１１】ロータの回転軸が移動しないようにロー
    ター室底面にロータ保持機構を有することを特徴とする
    請求項１又は８乃至10のいずれかの項記載の遠心分離装
    置。
12. 【請求項１２】ロータ側マグネットとの間に頚部を構成
    し、該頚部側面と摺動可能で、ロータ室内壁に固定され
    た支持機構によりロータを支持し、支持機構側かロータ
    頚部の摺動面のどちらか一方にベアリングを具備するこ
    とを特徴とする請求項11記載の遠心分離装置。
13. 【請求項１３】ロータ室を上下にセパラブルな構造とす
    ることを特徴とすることからなる請求項１又は８乃至11
    のいずれかの項記載の遠心分離装置。
14. 【請求項１４】ロータ室壁の少なくとも底部壁が非磁性
    もしくは低磁性の材料で構成することを特徴とする請求
    項１又は８乃至13のいずれかの項記載の遠心分離装置。
15. 【請求項１５】少なくともロータ室側面にロータ室内温
    度調節用の恒温水循環ジャケットを装着することを特徴
    とする請求項１記載の遠心分離装置。
16. 【請求項１６】請求項１乃至15のいずれかの項記載の遠
    心分離装置と培養槽もしくは細胞含有液貯槽、遠心上清
    液貯槽、液体培地貯槽とを配管で接続し、各要素をプロ
    セスシーケンサにより配管上の弁を開閉することを特徴
    とする細胞培養システム。
17. 【請求項１７】請求項１乃至16のいずれかの項記載の遠
    心分離装置を用い次の遠心分離操作により細胞の分離を
    行うことを特徴とする細胞の分離方法。 １） 管状体からロータ内への細胞含有液の定量供給 ２） ロータ回転による遠心分離 ３） ロータ停止 ４） 内筒のロータ底部への降下 ５） 管状体からの遠心上清のロータ室外への排出 ６） ロータ内への細胞懸濁液の定量供給 ７） ロータ低速回転による細胞の再懸濁 ８） 管状体からの細胞再懸濁液のロータ室外への排出 ９） 管状構造物の内筒引きあげ 10） 待機
18. 【請求項１８】遠心分離装置のスチーム殺菌を次の工程
    で行うことを特徴とする請求項17記載の細胞の分離方
    法。 １） ロータ室内へのスチーム導入 ２） 120℃以上10分以上保持 ３） ロータ室から出る配管の弁を閉 ４） 冷却 ５） ロータ室への無菌空気導入によるロータ室内気圧
    を外圧と平衡化 ６） ロータ内のドレイン排出 ７） 管状構造物の内筒をロータ内設定液面よりも上方
    へ引きあげる