JP2520107B2

JP2520107B2 - 胃腸管癌のインビトロ検出

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Publication number: JP2520107B2
Application number: JP60502755A
Authority: JP
Inventors: ウイリアムリンナネ，アンソニー
Original assignee: BYUUHAITSU Pty Ltd
Current assignee: BYUUHAITSU Pty Ltd
Priority date: 1984-06-25
Filing date: 1985-06-21
Publication date: 1996-07-31
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Description

【発明の詳細な説明】本発明は、第一に粘膜性癌、特に胃腸管の癌、そして
また胸部、肺、胃、卵巣等の癌の診断のための方法およ
び診断用キットに関する。

胃腸管の癌による死亡率は、男性における肺癌および
女性における胸部癌のそれに対してのみ第２位にある。
多くの注目がこれらの病気に対して払われているけれど
も死亡率は近年著しく減少してはいない。初期検出は、
生存数において生じる改善のために必須である。癌細胞
は、時々健康な個体においては検出できないかまたは非
常に低い水準においてのみ見出される物質を産生する。
この特徴は、革新的な診断技術を開発するために使用で
きる。これら癌−結合物質の検出を狙う試験は、健康な
個体との比較における癌を有する個体間の区別において
大きな助けとなる。

癌胎児性抗原〔carcinoembryonic antigen（CEA）〕
は、胃腸管癌と結合した最も広く試験された抗原、そし
て実際すべての腫瘍−結合抗原の最も研究されたもので
ある。この抗原は、人胎児胃腸管中に存在するが、正常
成人結腸中には存在しないかまたは低水準でしか存在し
ない。CEAは、最初に、ゴールド（Gold）およびフリー
ドマン（Freedman）により1965に人結腸癌から実証され
た^９。CEAは、そのような癌患者の血液中に存在し、従
つて当初は人消火器系の癌の初期診断に大きな希望を与
えた腫瘍胎児性抗原とみなされた。その後、血液中のCE
Aの検定は、それが喫煙者の気管支炎および肝疾患を包
含する多数の非腫瘍状態においてしばしば高められるの
で、胃腸管癌の初期診断に価値があるには充分に特異的
でないことが示された¹⁰。たとえば、正常人口の10％
は、それら個体が高められた血液CEA水準を有するとい
う意味において偽陽性の結果を示すけれども、彼等は癌
あるいは良性腫瘍さえも有していない。第２に、CEAは
かなり大きな腫瘍を有する患者においてさえもしばしば
検出できず^11〜13、即ちかなりの偽の陰性率がある（胃
腸管癌を有する患者の約50％は、増加した血液CEA水準
を示さない）。しかしながら、それら制限にもかかわら
ず、CEA検定は、癌患者の術前評価および術後管理にお
いてなおかなりの価値を有している。CEA検定は、現行
癌試験の約40％を数える。

アルフア−フエトプロテイン（alpha fetoprotein（A
FP）〕は、胎児には高水準で見出されるが正常成人には
見出されない他の腫瘍胎児性抗原である。AFPの増加し
た血液水準は、第一次肝癌、肝の第二次腫瘍を有する患
者、精巣癌の若干の型（奇形腫）の事例の多くのもの；
しかしまた毒性肝障害および肝硬変において存在する。
この明らかに限定された有用性にもかかわらず、AFPは
現在行われている癌試験の約20％を示す。

最近、腫瘍−結合抗原CA19-9〔商標〕の測定のための
モノクロナール抗体−基礎放射免疫検定が、商業的に使
用しうるようになつた^14〜19。このCA-19-9〔商標〕検
定は、すべての段階の膵臓癌に高い感受性および特異性
を有すると称しているけれども、結腸直腸癌の検出に関
しては、この検定は低い感受性を有するらしい。

1980年に、新らしいムチン糖蛋白抗原が、大腸の癌か
ら単離された^１。この物質はまた、正常成人小腸の存在
し、従つて“小腸ムチン抗原”（“small intestine mu
cin antigen"）（SIMA）と命名された。SIMAは、８〜12
週令胎児において胃腸管全体に見出され、誕生の時には
正常の環境中にもはや検出されないので腫瘍胎児性抗原
であることが示され、しかしSIMAは、胃腸管および他の
器官の多くの部分の癌中に見出される。“大腸ムチン抗
原”（“large intestine mucin antigen"）（LIMA）と
して示される他のムチン物質がまた、正常な大腸から単
離された。LIMAはまた、腫瘍胎児性抗原であることが示
され、そして多数の癌により種々の程度に産生される。
広範な免疫組織学的研究は、LIMAがSIMAと抗原的に異つ
ていること、および両者がまたCEAと区別されることを
示した。それらの腸−結合ムチン抗原はまた、胃、胆の
う、肺、胸部および卵巣の若干の腫瘍中に、そしてまた
上記器官の前癌状態において検出された（引用文献１〜
８）。

抗−SIMAおよび抗−LIMAモノクロナールおよびポリク
ロナール抗体を使用した正常胎児および成人組織、なら
びに各種器官の癌の免疫組織学的染色の結果を、表１に
示す。

表１人組織中のSIMAおよびLIMA分布の要約−免疫組織
化学的研究胎児組織（８〜40週）SIMA LIMA 胃＋＋小腸＋ − 大腸８〜12週＋ − 13〜40週 − ＋正常成人組織胃 − − 小腸＋ − 大腸 − ＋胆のう − − 卵巣 − − 胸部 − − 肺癌 − ＋癌結腸癌＋＋胃癌＋＋卵巣癌＋＋胆のう癌＋＋胸部癌＋ − 肺 − ＋初めて、それらムチン性糖蛋白質の高分子量にもかか
わらず、SIMAおよびLIMAは、診断抗体検定の使用によ
り、大腸癌の患者の高比率の血清中に検出できることが
ここに発見された。SIMAおよびLIMAは、健康な対照の血
清中には、測定しうる量において見出されないかまたは
非常に低い量において見出される。事例の小さな群を包
含する最初の研究は、SIMAおよびLIMA試験の組合せが使
用できて、結腸直腸癌の患者の80％を検出することを既
に示し、一方CEA試験のみの使用は、そのような癌の約5
6％のみを検出する。これらSIMAおよびLIMA検定はま
た、段階ＢおよびＢ〔デユーク（Duke）の分類）の癌の
検出においてCEA検出に比しより感受性である。加え
て、LIMAは、結腸の潰瘍性大腸炎を有する患者の血液中
に高比率で検出できる。そのような患者は、普通には大
腸癌を発現する。同様に、SIMAおよびLIMAは、前癌状態
の存在を検出するために使用できる。

この明細書を通して使用されるSIMAおよびLIMAなる語
は、以下に詳細に記載するムチン抗原ばかりでなく、生
理的液体、特に血清または血漿中に存在しうるそれに抗
原的に関連するそれらの部分もまた示すために使用され
る。

本発明に従えば、患者においてムチン抗原を産生する
癌細胞または他の細胞の存在を検出するためのインビト
ロ診断方法が提供され、その方法は患者から採取した生
理的液体の検体を試験して、該検体中におけるSIMAおよ
び（または）LIMAの存在または不存在を検出する工程か
らなる。

好ましくは、該方法は、患者から採取した生理的液体
の検体を、SIMAおよび（または）LIMAに対するモノクロ
ナールまたはポリクロナール抗体、または該抗体の断
片、あるいは検出しうる信号を提供しうる標識で標識化
した該抗体またはそれらの断片と接触させ、そしてそれ
らの対応抗原に対する該抗原またはそれらの断片、ある
いは該標識化抗体またはそれらの断片の結合の存在を検
出する工程からなる。

それらの診断方法における使用のための特に好ましい
生理的液体は、血液、血清または血漿である。

なお他の態様においては、患者においてムチン抗原を
産生する癌細胞または他の細胞の存在を検出するための
インビトロ診断キツトまたは方式が提供され、そのキツ
トまたは方式が、患者から採取した生理的液体の検体中
におけるSIMAおよび（または）LIMAの存在を検出するた
めの手段からなる。

本発明の１つの特定の態様においては、患者から採取
した生理的液体、たとえば血液または血清の検体中にお
けるSIMAおよび（または）LIMAの存在を検出するための
インビトロ診断キツトまたは方式が提供され、そのキツ
トまたは方式は、該抗体とそれらの対応の抗原との間の
免疫反応の存在を指示するための指示手段と一緒で、SI
MAおよび（または）LIMAと免疫反応しうるモノクロナー
ルまたはポリクロナール抗体、あるいはそれらの断片か
らなる。

本発明のこの態様の特定の具体化においては、診断用
キツトは更に、固体支持体に結合したそれらの成分から
なり、該成分は（ｉ）SIMAおよび（または）LIMA、ある
いは（ii）SIMAおよび（または）LIMAと免疫反応しうる
該抗体のいずれかからなる。

本発明のこの態様は、異つた形の指示手段を利用する
多数の具体的方法を包含する。本発明の１つの態様にお
いては、指示手段は検出しうる信号を提供しうる標識か
らなり、該標識はSIMAおよび（または）LIMAと免疫反応
しうる該抗体に結合される。しかしながら、他の態様に
おいては、指示手段は検出しうる信号を提供しうる標識
からなり、該標識は第２の抗体に結合され、該第２の抗
体は該第１に指名した抗体に対し上昇され、そして該第
１に指名した抗体に対し結合することにより該免疫反応
の存在を指示する。更に他の態様においては、指示手段
は、それに結合した標識を有するスタフイロコツカル・
プロテイン・エイ（Stapnylococcal Protein A）からな
りうる。このような具体例で使用される標識は、公知の
酵素、放射活性元素、螢光化学物質または化合物たとえ
ばビオチンからなりうる。

SIMAおよびLIMAのための免疫検定の使用は、結腸直腸
癌のすべての段階においてそれらムチン抗原の検出を可
能とした。従つて、それらの結果は、この方式を上記に
論述したCA19-9〔商標〕またはCEA検定に比し強力によ
り有用でそして価値あるものとする。

本発明は、第１にムチン性癌の検出を指向するけれど
も、SIMAおよびLIMAの免疫検定は炎症状態、たとえば潰
瘍性大腸炎または消化性潰瘍の検出、そしてまた前癌状
態の検出において価値のあることがまた認められる。

上記の記載から明らかなように、ここに示したムチン
抗原SIMAおよびLIMAは、第１に、それらが単離される
（以下に詳細に記載する方法を使用して）給源により特
徴づけることができる。更に、それら抗原の特徴づけお
よび同定は、ポリクロナールおよびモノクロナール抗−
SIMAおよび抗LIMA抗体の使用により、そしてたとえば、
特異胃腸管組織に対する抗−SIMAまたは抗−LIMA抗血清
の結合の阻害により抗原活性を検出するための“競合”
免疫検定技術を使用する免疫組織化学的技術により達成
できる。

更に、本発明の詳細を以下に論述する。しかしなが
ら、本発明に従うSIMAおよび（または）LIMAの免疫検定
は、特に、腫瘍担持の範囲の指標を得るために癌患者の
術前処置において、そして外科的に、または任意の他の
モダリテイ（modality）（たとえば、放射療法、化学療
法）により治療された患者の術後フオローアツプのため
の基礎値を得るために、治療しうる段階における再発を
検出するために、あるいは治療有効性を追跡するため
に、患者において癌細胞または他のムチン抗原産生細胞
の検出のための高度に感受性の診断手段を提供する。そ
のような適用において、本発明な診断方式は、それらの
情況において現在使用されているCEAまたは他の公知の
腫瘍結合抗原のための免疫検定と最初に組合せうる。加
えて、SIMA/LIMA（随意に、CEAとの組合せにおいて）診
断方式は、腸癌を発現する高度の危険性のある人間、た
とえば潰瘍性大腸炎、消化性潰瘍、CEA診断方式単独
が、最初の試験の後に、診断的価値を何も有していない
と認められた領域の患者のスクリーニングに適用しう
る。

本発明に導く作業において、いくつかのモノクロナー
ル抗体が大腸癌から抽出されたムチン製剤で免疫化され
たマウスにより産生された。組織の免疫組織化学染色
は、抗−SIMA（大腸癌および正常小腸と反応する）とし
てのそれらのモノクロナール抗体の５分画、および抗−
LIMA（大腸癌および正常大腸と反応する）としての５分
画を分類するために使用された。免疫化学分析は、抗体
の親和性が各種類において100倍ほども変化することを
示した。

以下の実施例で、ムチン抗原の製造および特徴づけ、
SIMAおよびLIMAに対するポリクロナールおよびモノクロ
ナール抗体の産生において現在使用されている方法、な
らびに本発明に従う患者において癌または他のムチン抗
原産生細胞の存在の検出のためのインビトロ診断方法に
おけるそれらモノクロナール抗体の使用を説明する。

例１ A.ムチン抗原の精製および特徴づけムチンを結腸直腸癌組織の切除から得た外科材料から
抽出した。腫瘍に対し遠位の正常な大腸の領域は、腫瘍
を取除いた組織から得、そして使用に先立ち、光学顕微
鏡により試験して、それらの正常な外観を確認した。正
常な十二指腸、空腸および結腸の検体をまた、偶発事故
の犠牲者から剖検で得た。ムチンは、結腸癌（LIMAおよ
びSIMA）、正常大腸（LIMA）、あるいは正常十二指腸ま
たは空腸（SIMA）の検体から、上記に略述する方法によ
り抽出した。

モノクロナール抗体産生およびスクリーニングのため
にマウスを免疫するのに使用されるムチン調製物は、Ｓ
字結腸の“部分的ムチン性”腺癌と組織学的に診断され
た癌試料から製造した。組織試料（約5g）を小切片に切
断し、ついでEDTA24mM、Ｎ−エチルマレイミド10-mMお
よびベンズアミジンHC1mMを含有する4Mグアニジン塩
酸塩10容量中でホモジナイズした。20,000×ｇで20分間
遠心分離の後、ペレツトを新たなグアニジン塩酸塩で再
抽出した。貯蔵した上澄液中のムチンをついで塩化セシ
ウムで1.35g/mlの密度に調節し、そして105,000×ｇで6
4時間遠心分離した。生成したグラジエントを、1.25か
ら1.55g/mlまでの密度の範囲内の６つの新しい画分に分
離した。各画分を蒸留水に対し透析し、蛋白質〔変形ブ
ラツドフオード（Bradford）検定〕およびヘキソース21
を検定し、そしてまた抗原活性について、抗−SIMAおよ
び抗−LIMAによる、そしてモノクロナール抗体を使用す
る免疫検定（詳細は下記参照）による胃腸管組織の特異
免疫螢光染色を阻害するその能力を決定することにより
検定した。最高の抗原活性を含有する画分をCsClグラジ
エント上で再分画し、そして画分を上記の如く検定し
た。

（ｉ）LIMA LIMAは、1.34から1.55g/mlまでの密度でのグラジエン
トの底の２または３画分中に見出された。LIMAは多分散
性であるが、通常約1.4±0.08における最高抗原活性中
に見出された。LIMA調製物の典型的な第3CsClグラジエ
ント遠心分離の各画分の抗原活性、ヘキソースおよび蛋
白質含量を第1aに示す。画分２および３のヘキソース／
蛋白質比率（重量／重量）は、それぞれ0.5および0.25
であつた。ヘキソース、蛋白質および抗原活性のピーク
は一致せず；画分３は抗原活性の大部分を含有した。酵
素結合免疫検定（EIA）により決定された典型的実験か
らのLIMAの全工程収率は、組織ホモジエネート中に存在
するそれの約35％である。LIMAの全工程精製は1000倍程
度である。SIMAは、正常大腸からのLIMA精剤中には通常
検出されない。サンドイツチ免疫検定（同じモノクロナ
ール抗体が分子に１回以上結合しなければならない）に
おけるLIMA調製物の首尾よい使用は、モノクロナール抗
体により認識される抗原決定子が分子上少くとも２回繰
返されなければならないことを示す。

LIMAの高分子量は、７％ポリアクリルアミド電気泳動
ゲル中へ貫通するその無能力により示された。更に、ゲ
ル濾過クロマトグラフイを使用する研究は、LIMA抗原が
セフアロース6B（大略分子量範囲:1×10⁴〜４×10⁶にお
ける球状蛋白質、および分子量10⁴〜10⁶のデキストラン
を分離する−フアルマシア・カタログ・スペシフイケー
シヨンズ）、およびセフアロース2B（分子量範囲７×10
⁴〜４×10⁷のデキストランを分画する）の空容量中に溶
出することを示した。10mMホスフエート緩衝化塩水中に
溶出するセフアクリル1000カラム（1cm×65.5cm）上のL
IMAのゲル−クロマトグラフイを図2aに示す。LIMA抗原
活性の大部分は、このマトリツクス中に包含され、そし
てLIMA調製物の多分散性を示しうる巾広いピークとして
溶出した。同程度の多分散性は、多くの他のプロテオグ
リカン分子でみられ、そして、たとえば分子量に影響を
与える構造における変化または凝集から生じうるが、そ
のような分子の抗原性からは生じない。

LIMAの大きさをよりよく評価するために、多数の調製
物を、沈降係数を決定するために〔ベツクマン（Beckma
n）SW50Tiローター、22,000rpm×15時間または42,000rp
m×５時間、４℃）、グリセロールグラジエント（10％
から20％まで）上の超遠心に付した。グラジエントを分
画し、そして各画分を、抗原活性につきサンドイツチ検
定により検定した。典型的なLIMAグラジエントを図3aに
示す。この実験および他の１連操作から、測量した平均
ｓ値を次の等式に従い決定した：式中、ωは角速度であり、ｔは遠心分離の時間（時間）
であり、Roはグラジエントの頂上に対する回転の半径で
あり、そしてRtは抗原性のピークが移動を測量した平均
半径である。いくつかの異つた実験から計算した平均Ｓ
値は、9.5±1.5であつた。

抗原の性質について更に情報を得るために、LIMAを多
数の異つた物理的、化学的および酵素的処理に付した；
それらの表２に要約する。サンドイツチ検定におけるLI
MAの抗原性は、40℃で少くとも１ケ月の貯蔵に対して、
或いは100℃で５分間の貯蔵に対して、安定であった。1
0分間またはそれより長い煮沸は、活性の40％損失を生
じた。煮沸に対するLIMAのこの安定性は、この抗原が広
範にグリコシル化された分子でありうること、ならびに
エピトープが炭水化物を包含しまたは炭水化物により保
護されていることを示唆する。炭水化物と蛋白質との間
のｏ−グリコシド結合を開裂するために、LIMAのアルカ
リ処理をKOHのいくつかの濃度:0.01M、0.05M、0.10M、
0.25M、0.50M（４℃で２、４または16時間）、で遂行
し、その後抗原活性のそれぞれ85％、70％、70％、55％
および45％が処理後に残留した。親核物質たとえば２−
メルカプトエタノール（0.1M）の添加は、緩和な条件
（0.01MKOH、４℃で４時間）下に、抗原活性の55％の損
失で、β−脱離反応の遂行を可能とした。LIMAのアルカ
リ処理から生じる抗原活物の部分的損失に加えて、グリ
セロールグラジエント上での分析は、減少した分子量を
示す秤量した平均Ｓ値（5.5）における著しい減少を示
した（図3a）。試みたLIMAの還元（6MグアニジンHCl、
0.5MトリスpH8.1、0.002MEDTA、10mMジチオスレイトー
ル中、50℃で２時間、４時間または16時間、引続いて0.
4Mヨウド酢酸で４℃において１夜アルキル化）は、抗原
活性に対する著しい効果を有しなかつた。

多数の高度に精製された酵素での消化実験を行つて、
LIMA抗原の化学的性質を決定した。処理後、検体を５分
間煮沸しまたは中和（ペプシン）して、免疫検定に先立
ち酵素を不活性化した。ペプシンもクロストリペインも
（いくつかの酵素濃度においてLIMAと２、４または16時
間インキユベートして試験した）、LIMAの抗原活性に対
しどのような著しい効果を示さなかつた（表２）。LIMA
のパパイン消化（0.1または1.0mg/ml）は、抗原活性の
著しい損失を生じ、サンドイツチ検定で検定したとき、
活性の20％のみが２、４または16時間後に残留した。競
合ELISAで検定したとき（その検定は抗原上のエピトー
プの多価に依存しない）、パパインで２時間消化後に残
留する活性は75％であり、４時間後−65％、そして16時
間後−35％であつた。これは、緩和な条件のパパイン消
化下に、LIMAはその大部分がエピトープ１個のみを有
し、従つてサンドイツチ検定で検出されないが競合検定
では検出される断片に分解されうることを意味する。こ
の結果は、本抗原がパパインに対しある程度の感受性を
有するが、ペプシンおよびクロストリペインに対し基本
的に抵抗性であることを確定する。

（ii）SIMA SIMAは、1.29および1.45g/mlの間の密度を有するグラ
ジエントの２または３画分中に見出された。SIMA調製物
は多分散性であるが、抗原活性の大部分は通常1.38±0.
05の密度において見出された。SIMA調製物の典型的な第
3CsClグラジエント遠心分離の各画分の抗原活性、ヘキ
ソースおよび蛋白質含量を、図1bに示す。抗原活性の大
部分が生じる画分３および４のヘキソース／蛋白質比率
（重量／重量）は、それぞれ1.5および0.3であつた。典
型的な結腸癌標品からのSIMAの収率は、EIAにより決定
して約40％であつた。それら方法により達成される精製
は、LIMAの精製と同じ約1000倍である。大部分の結腸直
腸癌組織は、かなりのLIMA、そしてまたSIMAを含有する
ことが見出され、他方正常十二指腸および空腸の検体か
らの抽出物は、SIMAを含有するが、LIMAは検出できなか
つた。LIMAは、結腸直腸癌標品に由来する“SIMA"調製
物から、混合ムチン抽出物を抗−LIMAモノクロナール抗
体アフイニテイカラムに通すことにより除去できた。調
製物中のSIMAの同定は、モノクロナール抗体との反応、
ならびにポリクロナールおよびモノクロナール抗体によ
る小腸の免疫螢光染色の阻害に基いている。LIMAにつき
記載した如く、サンドイツチ免疫検定におけるSIMAの使
用は、抗原分子上の繰返しエピトームの存在を指示す
る。

LIMAでそうであつたように、SIMAは７％ポリアクリル
アミド電気泳動ゲルを貫通しなかつた。しかしながら、
4MグアニジンHClを含有する25mMトリスpH8.0中に溶出す
るセフアロース2Bカラム（1.5cm×7cm）上のゲル濾過に
よる分析は、SIMAがゲル中に包含され、そして多分散性
であり、多数のピーク中に溶出し（図４）、そしてLIMA
に比しより小さな分子量であることを示した。SIMAをま
たセフアクリル1000上で操作し、そしてまた全LIMA調製
物に比しより小さな分子量の巾広いピークとして溶出し
た（図2aおよびｂ参照）。

Ｓ値は、LIMAにつき上記に記載した如く、10％から20
％までのグリセロールグラジエント上で、多数のSIMAに
つき決定した。典型的SIMAグラジエントを、図3bに示
す。これは、多数の実験から計算したＳ値が4.8±1.4で
あることを意味し、それはLIMAの値に比しより低値であ
る。

SIMAは、アルカリ処理および煮沸に対し、LIMAに比し
より安定であることが見出された。LIMAのアルカリ処理
につき上記に記載した如き条件を使用して、抗原活性に
おける著しい変更は何も観察されなかつた。加えて、SI
MA抗原活性は、５分間の煮沸により著しい影響をうけ
ず、そして10分間の煮沸の後に、活性の６％のみが損失
した（表２参照）。

SIMAは、LIMAにつき上記に記載した如き多数の高度に
精製した酵素で消化された（表２）。クロストリペイン
は、サンドイツチEIAで検定してSIMAの抗原活性に効果
を何も有しなかつた。パパインで２時間のSIMAの消化は
効果を何も有せず、他方抗原活性の50％が16時間の消化
の後に失われた。SIMAのペプシン消化は抗原活性の70％
損失を生じ、それはペプシンに対し抵抗性であつたLIMA
と対照的であつた（10μg/ml、室温で１夜）。

表２ムチン抗原に対する各種分解方法の効果処理処理後の残留パーセント活性 LIMA SIMA 煮沸（10分間） 60 94 アルカリ処理 45 100 ペプシン消化 100 30 パパイン消化２時間 20 100 パパイン消化16時間 20 50 クロストリペイン消化 100 100 ジスルフアイド還元 100 行わず多数の精製が、次の如くムチン精製法に導入しうる： 1.過クロル酸（1M）、酢酸ナトリウムでの処理、および
70℃での加熱または煮沸５分間または、ムチン製剤の純
度を富化するために使用しうる。

2.繰返しCsClグラジエント超遠心は、ムチン製剤の純度
を顕著に（10倍まで）改善することを実証した。

3.モノクロナール抗体アフイニテイクロマトグラフイは
２方法で使用できる：第１に、SIMA調製物からLIMAを除
去するために抗−LIMAモノクロナールを使用する（およ
びその逆）；そして第２に、SIMAを他の夾雑蛋白質から
精製するために、抗−SIMAモノクロナール上のムチン
（SIMA）の吸収および溶出を使用する。

4.ムチン抗原はまた、正常および癌性組織から、レクチ
ンカラム、ゲル電気泳動、イオン交換またはゲル濾過ク
ロマトグラフイの使用により精製しうる。

ムチン調製物の精製における各種工程は、調製物のSI
MAおよびLIMA組成を決定するために、ポリクロナールお
よびモノクロナール抗体試験を使用する競合免疫組織化
学およびEIAにより追跡される。

B.ポリクロナール抗血清の産生それら研究において使用される抗−SIMAポリクロナー
ル抗血清は、マ（Ma）等（1980）^１により家兎中に産生
されたものであつた。LIMAを認識するポリクロナール抗
血清は、マ（Ma）等（1980）^１に従い正常大腸から抽出
されたムチン調製物での家兎の免疫を含む同様の技術に
より産生された。それらの型の抗血清は、比較的非特異
生および交叉反応性にあるけれども、ムチン精製工程を
追跡するために最初に使用した。高度に精製されたSIMA
およびLIMAから製造したポリクロナール抗体は、以下に
記載する“２部位”サンドイツチ免疫検定において使用
しうる。

C.モノクロナール抗体の製造免疫スケジユール約８週令の雌バルブ（Balb）/Cマウスを、最初完全フ
ロインドアジユバント中の部分精製した癌ムチン調製物
50μg/マウスで、４回の皮下および１回の腹腔内注射に
おいて、引続き４週間後に不完全アジユバント中の同様
の注射のセツトで免疫した。２回目の免疫の約12日後
に、マウスを尾静脉から採血し、そして血清抗体力価を
ELISAにより決定した。２回目の免疫の３週間後に、高
血清力価を有するマウスにPBS中の癌ムチン調製物10μ
ｇの腹腔内注射４連続日によりブースター注射し、引続
いて５日目に動物を殺し、脾臓を取出し、そしてマウス
骨髄腫ラインで通常の細胞融合をした。

細胞融合、ハイブリドーマ生育、クローニング脾臓細胞懸濁液を、免疫化マウスの脾臓から、ホスフ
エート緩衝化生理的（GKN）溶液中の緩和な引き裂き（g
entle teasing）により製造した。脾臓細胞を、標準方
法に従い、骨髄腫細胞５×10⁷〔X63Ag 8.6.5.3〕〔スタ
ーヘリン（T.Stahelin）ホフマン・ラ・ロツシユ（Hoff
man La Roche）、バーゼル、スイスから得た〕と融合し
た。脾臓細胞および骨髄腫細胞を50％‐PEG（GC品質）
中で混合し、60秒間かかつてゆつくり加えた。90秒間放
置した後、PEG中に懸濁した細胞をGKN溶液7mlでゆつく
り希釈し（５分間かかつて加えた）、ついで10％牛胎児
血清、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン
を含有するRPMI1640培地約300mlで希釈した。希釈した
細胞懸濁液を、ついで１ウエル当り腹腔マクロフアージ
10⁵を含有する24−ウエルマルチ−デイツシユの288ウエ
ル中に分散した。培地を約７日後に、そしてその後細胞
生育に従い必要に応じて取り替えた。

EIAによるスクリーニングの後、ムチンに対する抗体
を分泌するハイブリドーマを、腹腔マクロフアージを含
有するマイクロタイターデイツシユ中、限定希釈により
２回クローン化した。モノクロナール抗体の大規模産生
のためには、抗体分泌ハイブリドーマは、腹腔内注射し
たプリスタン0.5mlで１〜７日先に感作した８〜12週令
のマウスにおける腹腔腫瘍として生育せさた。腹水を細
胞の注射の２〜４週後に採取し、そして−20℃で貯蔵し
た。免疫グロブリン類は、必要に応じ、蛋白質Ａ−セフ
アロースアフイニテイクロマトグラフイにより、腹水か
ら精製した。

ハイブリドーマスクリーニング（ｉ）EIAポリスチレンマイクロタイタープレートのウ
エルを、粗癌ムチン調製物（▲HCO^- ₃▼／▲CO^- ₃ ^-▼バツ
フア−pH9.6中、10μg/ml）で、37℃において３時間被
覆した。ウエルをついでPBS/ツウイーン中で４回洗滌し
た。ハイブリドーマ培養上澄液をウエル中で１時間イン
キユベートし、ついでPBS/ツウイーンで４回洗滌した。
ウエルをついでアルカリホスフアターゼ−結合ヒツジ抗
−マウス免疫グロブリンとインキユベートした。PBS/ツ
ウイーン、引続いて蒸留水で洗滌した後、ｐ−ニトロフ
エニルホスフアートを基質として加え、そして陽性ウエ
ル（ムチンに対する抗体を含有する上澄液を示す）は、
黄色生成物、ｐ−ニトロフエノールを含有するものとし
て同定した。

（ii）螢光免疫組織化学EIAにおける第１回目のスクリ
ーニングにより同定された“陽性”ハイブリドーマを、
ついで免疫螢光技術により、正常および癌性胃腸器官の
組織切片における特異細胞または組織を染色する産生さ
れたモノクロナール抗体の能力につきスクリーニングし
た。ハイブリドーマ培養上澄液を、スライド上で、組織
切片とインキユベートした。牛血清アルブミン溶液で非
特異結合部位を遮断した後、組織をフルオレツセイン−
結合家兎抗マウス免疫グロブリンとインキユベートし
た。過剰の標識した抗体を洗滌により除去し、そして組
織切片をU-Vまたは狭いバンドの青色励起を使用して螢
光顕微鏡により試験した。

上記技術を使用して、５抗−SIMAモノクロナール抗体
（正常小腸ムチンおよび結腸直腸癌ムチンと反応する）
および５抗−LIMAモノクロナール抗体（正常大腸および
結腸直腸癌ムチンと反応する）を同定した。

モノクロナール抗体の特徴づけ抗体のサブクラスを、酵素カツプリング抗−IgGおよ
び抗−IgM抗体（CSL）の使用して決定した。すべてのモ
ノクロナール抗体は、IgGサブクラスのものであると認
められた。

モノクロナール抗体を完全に特徴づけるために、それ
らの相対親和性を２方法により測定した。第１に、精製
されたIgGを、各モノクロナール抗体につき、蛋白質Ａ
−セフアロースアフイニテイクロマトグラフイにより得
た。精製されたIgGをついでEIAにより力価測定し、そし
て力価測定曲線（EIAにおける反応対蛋白質濃度）を抗
体の相対親和性の尺度として比較した。第２に、競合EI
Aを開発した（下記参照）。相対親和性定数は、抗−SIM
Aモノクロナール抗体の阻害剤としてSIMA調製物、そし
て抗−LIMAモノクロナール抗体についての阻害剤として
LIMA調製物を使用して計算した。相対親和性定数の計算
は次式に基いた：競合EIAで50％阻害を導く抗原（ムチン）の濃度にお
いて、遊離および結合抗体の濃度は等しく、即ち〔Ab〕
＝〔AbAg〕は等しい。従つて、相対親和性定数である。それらの計算に基くデータを表３に示す。実際
の抗原濃度はより低いてあろう（もしも調製物が100％
純度でなく、そして他の夾雑蛋白質が存在するならば）
から、Kaの値は最小値であり、そして実際にはより高い
ものでありうる。

表３抗体相対親和性定数（1/モル）抗−SIMAモノクロナール 4D1 4.2×10¹⁰ 4C2 3.3×10¹⁰ 3C5 2.4×10¹⁰ 4D3 1.6×10¹⁰ 2A1 1.0×10¹⁰ 抗−LIMAモノクロナール 3B4 2.4×10¹⁰ 3D4 1.5×10¹⁰ 3C3 8.9×10⁹ 2D3 2.8×10⁹ 2C3 2.4×10¹⁰ フリゲツト（Friguet）等の方法（1983）²⁰の方法
を、一方において抗−SIMAモノクロナール、そして他方
において抗−LIMAモノクロナールの各各が、それぞれSI
MAおよびLIMA分子上の同じ決定因子に結合するかどうか
を決定するために使用した。プレートを被覆する限定さ
れた量の抗原を使用して、各抗体を個々におよびすべて
の可能な対合において力価測定する。現行の実験におい
て産生されるすべてのモノクロナールは、分子上の等し
いかまたは重なりあう抗原決定因子に結合することが見
出された。

例２インビトロ診断免疫検定血液検体中において循環するムチンの検出のために開
発された２種の免疫検定を以下に略記する： A.競合ELISA （ｉ）この検定に含まれる工程を、図５に略記する。予
備実験は、ヘパリン添加またはEDTA処理または未処理−
血液に添加したムチンがすべて希釈した血漿または血清
中において回収されそして定量されうることを指示し
た。免疫検定に加えた未希釈血漿または血清は干渉を生
じ、他方1/10に希釈した血漿を使用して、検定（たとえ
ば、水性バツフアー）に対し効果は観察されなかつた。
従つて、結腸直腸癌患者、潰瘍性大腸炎患者および健康
人対照からの１連の血液検体を、競合ELISAを使用してS
IMAおよびLIMAにつき検定した。加えたSIMAまたはLIMA
を含有する健康な個体からの血漿を標準として使用し
た。高水準のSIMAおよび（または）LIMAが各種段階の結
腸直腸癌の患者の13/23（約60％）において検出され、
そして高水準のLIMA（しかしSIMAはなし）が潰瘍性大腸
炎の4/5例において検出された。この方法によりSIMAもL
IMAも健康人対照７名からの血液中には検出されなかつ
た。

（ii）ムチンが低水準において検定できるかどうかを決
定するために、血漿検体からムチンを抽出しそして濃縮
するための方法の工夫した。等容量の2M過クロル酸（PC
A）を、血清または血漿検体に、室温で15分間加えた。
検体を8,000×ｇで２分間遠心分離し、上澄液を除き、
そしてペレツトをもとの検体容量の２倍のPBSで洗滌
し、混合し、そして上記の如く遠心分離した。PBSを合
せた合澄液に、もとの検体容量の10Xの最終容量まで加
えた。検体をついでミニコン（Minicon）B15コンセント
レーター〔分子量カツトオフ15,000、アミコン・カンパ
ニー（Amicon Co.）〕中で10倍に濃縮／透析した。検体
をついでもとの検体容量の10Xに希釈し、そして50倍に
濃縮した。生成したPCA抽出液は、もとの検体容量の５
分の１であつた。この検体を、ついで先に記載した如き
競合ELISAにより検定した。加えそして上記の方法を取
つた各種濃度のムチンを有する健康な志願者からの血漿
検体を、標準として使用した。結腸直腸癌患者39名、胸
部癌患者２名、潰瘍性大腸炎患者５名および対照７名か
らの検体に対するSIMA検定の結果は、SIMA抗原活性が若
干の対照患者において低水準で、そして癌患者の２名を
除いて全てにおいてより高い水準で検出できることを示
した。段階Ｂ結腸直腸癌（他の器官に明らかに拡がつて
いないそれら癌と限定される）の患者からの検体の60
％、段階Ｃ（局所リンパ節中への検出しうる転移を有す
るそれら癌と限定される）からの91％、および段階Ｄ
（遠位の器官、たとえば肝臓へ拡がつた拡散した癌）か
らの86％は、対照範囲と比較して高められたムチン水準
を含有した。SIMAはまた、段階Ａ結腸直腸癌の患者から
得た１血液検体、および胸部癌の患者２名に検出され
た。

LIMA検定は、SIMA検定で使用した濃縮／透析工程なし
の希釈した血清検体のみで行つた。初期段階の結腸直腸
癌の患者に低い比率のみで測定しうるLIMAを含有し、段
階Ｂの11％、段階Ｃの29％であつたが、高比率（80％）
の段階Ｄ癌患者は高められた血清LIMA水準を有した。潰
瘍性大腸炎の患者では非常に高い比率（80％）でこの比
較的低い感度の検定においてさえも、高水準の循環LIMA
を示した。従つて、このLIMA検定は、炎症性大腸疾病の
検出において価値を有するであろう。

B.サンドイツチ免疫検定上記モノクロナール抗体はまた、サンドイツチ免疫検
定において使用できる。

この型の検定は、検定の感度の改善において多数の利
点を有し、加えてそれは上記の競合阻害検定に比しより
少ない工程を含む。更に、サンドイツチ免疫検定におけ
る“信号”（たとえば、ウエル中の放射活性または酵素
標識抗体発色を使用する）は、ムチン抗原濃度に直接比
例し、それは競合阻害検定と比較するとき、結果の計算
および処理を非常に簡略化する。

検定はムチン分子を不動化するためにモノクロナール
抗体で被覆された固体表面を包含し、そして同じモノク
ロナール抗体は、被覆された抗体に結合したムチンの存
在を検出するために標識化（¹²⁵Iまたは酵素で）した
（図６参照）。

a.SIMAまたはLIMA放射免疫検定の詳細（図６） 1.ミリタイターHAプレート〔ミリポア・コーポレーシヨ
ン（Millipore Corporation）、米国〕のウエルを、被
覆バツフアー（炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムバツ
フアーpH9.6、１ウエル当り50μｌ）中で希釈した蛋白
質Ａ−精製モノクロナール抗体IgG（約10μg/ml）で被
覆する。プレートを、37℃で３〜５時間インキユベート
する。

2.血清検体または標準100μｌに、0.2M酢酸ナトリウム
（pH5.0）200μｌを加え、70±１℃で15分間加熱し、つ
いで9,000×ｇで10分間遠心分離する。標準は、健康な
志願者から得た貯蔵血清中に作り上げたSIMAまたはLIMA
0、1.5、5.0、15、50、150および500μ/mlを含有する。

3.1％BSAを含有するPBS中で希釈した¹²⁵I−標識モノク
ロナール抗体を、ついでアセテート抽出上澄液（約0.1
μCi＋上澄液100μｌ）に加え、そして37℃で１時間イ
ンキユベートする。

4.ミリタイタープレートの被覆したウエルを、ついでPB
S/ツウイーンで４回洗滌し、そしてプレートをPBS中の
１％BSAで、37℃において30分間遮断する。

5.遮断の後、プレートをPBS/ツウイーンで３回洗滌す
る。¹²⁵I−標識抗体と前インキユベートした検体〔二重
（duplicate）ウエル中、１ウエル当り50μｌ〕を、つ
いでウエルに加え、そして４℃で１夜インキユベートす
る。

6.1夜のインキユベーシヨンの後、ウエルをPBS/ツウイ
ーンで５回洗滌し、吸取り乾燥し、そして各ウエルの基
部における濾紙をパンチし、そしてガンマ−カウンター
で計数する。

SIMAおよびLIMA水準は、独自の単位/mlで表わし、SIM
AおよびLIMAの参照標準の蛋白質含量に関係して決定す
る。

サンドイツチ検定の信頼性および再現性を評価するた
めに、多数の実験を行つた。表４は、対照血清の三重決
定間で得られた変動を示す。SIMAの検定について、変動
性は1.5μ/mlの水準において最も高く（cr＝10％）、検
定は信頼性があるとは考えられない（従つて、すべての
値＜５μ/mlSIMAは、特異値を与えない）。５から500U/
mlSIMAまでの血清水準につき、内部検定変動性は5.6％
もしくはそれ以下である。

b.LIMA酵素免疫検定（EIA）の詳細（図７） 1.ポリスチレンマイクロタイタープレート〔ヌンク・イ
ミユノプレーツ（Nunc Immunoplates）〕を、重炭酸塩
バツフアー中、抗−LIMAモノクロナール抗体IgG（たと
えば、ハイブリドーマセルライン2C3から）37℃におい
て３時間被覆する。プレートを洗滌バツフアー（PBS/ツ
ウイーン／ナトリウムアチド、pH7.2〜7.6）で２回洗滌
し、ついで排水する。

2.遮断溶液（ナトリウムアチド、pH7.4を含有するPBSに
溶かした牛血清アルブミン）50μｌをプレートの各ウエ
ルに加え、そして37℃で１時間インキユベートする。

3.標準LIMA溶液（ナトリウムアチドを含有する正常人血
清に標準LIMAを溶かして、０、1.5、５、15、50、150お
よび500単位/mlを得る）または血清検体100μｌに、ア
セテート抽出バツフアー（ナトリウムアチドを含有する
0.2M酢酸ナトリウム、pH5.0）200μｌを加え、そして70
±１℃で15分間加熱する。室温に冷却し、そしてスイン
グアウトロータ中において10,000×ｇで10分間遠心分離
する。

4.マイクロタイタープレートを洗滌バツフアーで３回洗
滌し、そして排水する。

5.アセテート／熱処理標準または血清検体50μｌで各ウ
エルに加える（１検体当り２ウエル）。プレートを37℃
で１時間インキユベートする。

6.マイクロタイタープレートを洗滌バツフアーで４回洗
滌し、ついで排水する。

7.1％牛血清アルブミンを含有するホスフエート緩衝化
塩水中に1:300に希釈したアルカリホスフアターゼ−結
合抗−LIMAモノクロナール抗体１ウエル当り50μｌを加
える。37℃で1.5時間インキユベートする。洗滌バツフ
アーで４回、蒸留水で３回洗滌し、ついで排水する。基
質希釈バツフアー（0.1M塩化マグネシウムを含有する0.
2M炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウムバツフアー）中に
1ml当り2mgの濃度で溶かした基質（ｐ−ニトロフエニル
ホスフエート）１ウエル当り100μｌを加える。37℃で2
0分間インキユベートする。

8.酵素反応停止溶液（0.5M水酸化ナトリウム）１ウエル
当り100μｌを加える。

9.適当なマイクロタイタープレートリーダーで405nmに
おける光学密度を読み取る。

試験結果の評価（ｉ）各LIMA標準につき得た平均光学密度（Ｙ軸上）に
対する対応のLIMA濃度（Ｘ軸上）をプロツトすることに
より標準曲線を作成する。

（ii）各血清検体の平均光学密度を使用して、標準曲線
から、ml当りの単位における対応のLIMA濃度を決定す
る。

標準曲線上で読み取ることのできる値を与えるため
に、もしも標品が追加希釈を必要とするならば（即ち、
LIMA濃度＞150U/ml）、標準曲線から得た値は、血清中
のLIMA濃度を得るために、適当な希釈因数で掛け算しな
ければならない。

１例を表５に示し、そして図８は表５中のデータから
作成した。

上記LIMA・EIAの再現性の１例を表６に示し、それは
各種量のLIMAを含有する血清検体の検定における三重決
定の間で得られた変動を示す。変動性は、1.5U/ml以下
の値（変動の係数10％）または150U/mlの値（変動の係
数12％）について最高である。従つて、それら限界外の
血清水準（即ち、＜２または＞150U/ml）は、信頼性が
ないと考えられる。従つて、＞150U/mlを含有する検体
は、希釈しそして再検定しなければならない。

c.臨床結果下記表７は、各種疾病の患者および健康な対照からの
検体についての結果の要約であり、SIMAのみ、LIMAの
み、CEAのみ、あるいはそれら３つの指標の任意の組合
せにつき陽性であつた検体の数を比較する目的でのSIMA
およびLIMA・RIA（上記a.参照）ならびにCEA血清検定の
結果を示す。

この表に係わり、LIMA水準 10U/mlは陽性と考え、CAE値 10は陽性と考えた。SIMA血清水準 25U/mlは、患者について陽性と考えた。健康人対照の検
体については、１回もしくはそれ以上の繰返し検定が 20U/mlであつたとき陽性と考えた。

C.他の免疫検定方法上記“２部位”免疫検定の変法は、固体層を被覆する
ために、ポリクロナール抗−ムチン抗血清（たとえば、
家兎または羊において上昇された）を使用しうる。これ
は、検定において“第２の”抗体として未標識モノクロ
ナール抗体の使用を可能とし、引続いて標識した家兎ま
たは羊の抗−マウス抗体によりマウスモノクロナールを
検出する。この方式（またはその逆：固体層−被覆のた
めのモノクロナール抗体および検出のためのポリクロナ
ール抗血清）は、１モノクロナール抗体を直接標識する
ときに比し陽性信号のよりよい増巾を提供しうる。

本発明は、サンドイツチ免疫検定における螢光源酵素
基質たとえば４−メチルウンベリフエリル（4MU）−ホ
スフエート（アルカリホスフアターゼのため）または4M
U−β−Ｄ−ガラクトシド（β−ガラクトシダーゼのた
めに）の使用を包含することがまた認められなければな
らない。同じ酵素結合モノクロナール抗体が、上記の比
色分析法における如く使用される。感度における期待さ
れた増加は約10倍である。他の知られた検出方式、たと
えば蛋白質Ａ、アビジン−ビオチン等がまた、使用しう
る。標識した蛋白質Ａをそれらサンドイツチ免疫検定に
おいて検出方式として使用するならば、固体層被覆抗体
（モノクロナールまたはポリクロナール）はＦ（ab）断
片、および検出抗体、Fc断片を含有する損われていない
分子である。多数の異つた固体層、たとえば種々の型の
ビーズが、それらの方式で、マイクロタイターウエルに
加えて使用しうる。加えて、膜が抗原を結合するための
吸着表面として使用しうる。

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of monoclonal antibodies）、プロシーデイングズ・
ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・オブ・ユーエス
・エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、76:1438、1979。

15.コプロウスキー（Koprowski,B.）、ハーリン（Herly
n,H.）、ステプレウスキー（Steplewski,Z.）およびシ
アーズ（Sears,H.F.）、スペシフイツク・アンチゲン・
イン・シーラム・オブ・ペーシエンツ・ウイズ・コロン
・カルシノーマ（Specific antigen in serum of patie
nts with colon carcinoma）、サイエンス（Scienc
e）、212:53、1981。

16.マグナーニ（Magnani,J.）、ブロツクラウス（Brock
laus,M.）、スミス（Smith,D.）、ギンスバーグ（Ginsb
urg,V.）、ブラスチユツク（Blaszcyk,M.）、ミツチエ
ル（Mitchell,D.）、ステプレウスキー（Steplewsky,
Z.）およびコプロウスキー（Koprowski,H.）、ア・モノ
クロナール・アンチボデイ・デフアインド・アンチゲン
・オブ・コロン・カルシノーマ（A monoclonal antibod
y defined antigen of colon carcinoma）、サイエンス
（Science）、212:55、1981。

17.デビラノ（Devillano,B.）等、ラジオイミユノメト
リツク・アツセイ・フオア・ア・モノクロナール・アン
チボデイ・デフアインド・チユモア・マーカーズ・CA19
-9（商標）（Radioimmunometric Assay for a Monoclon
al Antibody defined Tumors Markers CA19-9^TM）、ク
リニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）、29:549〜55
2、1983。

18.シアーズ（Sears,H.）、ハーリン（Herlyn,J.）、デ
ルビラノ（Delvillano,B.）、ステプレウスキー（Stepl
ewski,Z.）およびコプロウスキー（Koprowski,H.）、ア
・クリニカル・エバリユエシヨン・オブ・ペーシエンツ
・ウイズ・コロレクタル・キヤンサー（A clinical eva
luation of patients with colorectal cancer）、クリ
ニカル・イミユノロジー（Clinical immunology）、2:1
41、1982。

19.マグナーニ（Magnani,J.）、ステプレウスキー（Ste
plewski,Z.）、コプロウスキー（Koprowski.H.）および
ギンスバーグ（Ginsburg,V.）、アイデンチフイケーシ
ヨン・オブ・ザ・ガストロインテスチナル・アンド・パ
ンクレアチツク・キヤンサー−アソシエイテツド・アン
チゲン・デキクテツド・バイ・モノクロナール・アンチ
ボデイ19-9・イン・ザ・セラ・オブ・ペーシエンツ・ア
ズ・ア・ムチン（Identification of the gastrointest
inal and pancreatic cancer-associated antigen dete
cted by monoclonal antibody 19-9 in the sera of pa
tients as a mucin）、キヤンサー・リサーチ（Cancer
Research）、:43、5489〜5492、1983。

20.フリゲート（Friguet,B.）、ジヤバデイ−オハニア
ンス（Djavadi-Ohaniance,L.）、ページズ（Pages,
J.）、ブツサロ（Bussaro,A.）およびゴールドベング
（Goldberg,M.）、ア・コンビニエント・エンザイム−
リンクト・イミユノソルベント・アツセイ・フオア・テ
ステイング・ホエザー・モノクロナール・アンチボデイ
ズ・レコグナイズ・ザ・セーム・アンチゲニツク・サイ
ト。アプリケーシヨン・ツー・ハイブリドーマズ・スペ
シフイツク・フオア・ザ・β_２−サブユニツト・オブ・
イー・コリ・トリプトフアン・シンターゼ（A convenie
nt enzyme-linked immunosorbent assay for testing w
hether monoclonal antibodies recognise the same an
tigenic site.Application to hybridomas specific fo
r the β_２−subunit ofE.coli tryptophan synthas
e）、ジヤーナル・オブ・イミユノロジカル・メソオズ
（J.Immunol.Methods）、:351〜358、1983。

21.トレレリアン（Trerelyan,W.E.）およびハリソン（H
arrison,J.S.）、スタデイズ・イン・イースト・メタボ
リスム・Ｉ・フラクシヨネーシヨン・アンド・マイクロ
デターミネーシヨン・オブ・セル・カーボハイドレーツ
（Studies in yeast metabolism.I.Fractionation and
microdetermination of cell carohydrates.）、バイオ
ケミカル・ジヤーナル（Biochem.J.）、50:298〜303、1
952。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】被験者において、癌細胞またはムチン抗原
を産生する他の細胞の存在を検出するための診断組成物
であって、被験者から採取した、血液、血清および血漿
からなる群から選択される生理的液体のサンプルに含ま
れるSIMAもしくはLIMA、またはSIMAおよびLIMAの両方と
免疫反応することができる抗体、またはその断片からな
ることを特徴とする組成物。
【請求項２】抗体またはその断片を検出しうる信号を提
供しうる標識で標識化した、請求の範囲第１項に記載の
組成物。
【請求項３】抗体がモノクロナル抗体である、請求の範
囲第１項に記載の組成物。
【請求項４】抗体またはその断片を酵素または放射性同
位元素で標識化する、請求の範囲第１項に記載の組成
物。
【請求項５】抗体またはその断片を固体支持体に結合さ
せた、請求の範囲第１項に記載の組成物。
【請求項６】抗体を検出しうる信号を提供しうる標識で
標識化し、そして、固体支持体に結合させた、請求の範
囲第１項に記載の組成物。
【請求項７】被験者から採取した、血液、血清および血
漿からなる群から選択される生理的液体のサンプル中に
おいてSIMAもしくはLIMA、またはSIMAおよびLIMAの両方
の存在を検出することにより、被験者において、癌細胞
またはムチン抗原を産生する他の細胞の存在を検出する
ためのインビトロ診断用キットであって、上記サンプル
中のSIMAもしくはLIMA、またはSIMAおよびLIMAの両方と
免疫反応を行うことができる少なくとも一つのモノクロ
ナル抗体またはその断片を結合した固体支持体、および
上記抗体またはその断片と上記サンプル中の相当する抗
原との間の免疫反応の存在を示す指示手段からなり、上
記支持体が被験生理的液体の適用を許容するキット。
【請求項８】指示手段が検出しうる信号を提供しうる標
識を包含し、この標識を抗体またはその断片に結合させ
る、請求の範囲第７項に記載のキット。
【請求項９】指示手段が検出しうる信号を提供しうる標
識を包含し、この標識を該第１の抗体に対し高められる
第２の抗体に結合させ、そして第１の抗体の結合により
免疫反応の存在を指示するものである、請求の範囲第７
項に記載のキット。
【請求項１０】該標識が酵素または放射性同位元素であ
る、請求の範囲第８項または第９項のいずれか一項に記
載のキット。