[go: up one dir, main page]

JP2026500282A - インフルエンザウイルス様粒子をコードするｍＲＮＡ - Google Patents

インフルエンザウイルス様粒子をコードするｍＲＮＡ

Info

Publication number
JP2026500282A
JP2026500282A JP2025534604A JP2025534604A JP2026500282A JP 2026500282 A JP2026500282 A JP 2026500282A JP 2025534604 A JP2025534604 A JP 2025534604A JP 2025534604 A JP2025534604 A JP 2025534604A JP 2026500282 A JP2026500282 A JP 2026500282A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
composition
influenza
proteins
mrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2025534604A
Other languages
English (en)
Inventor
ソフィー・ビュファン
イザベル・ルゲストロワ
Original Assignee
サノフィ パスツール インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by サノフィ パスツール インコーポレイテッド filed Critical サノフィ パスツール インコーポレイテッド
Publication of JP2026500282A publication Critical patent/JP2026500282A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、哺乳動物細胞を誘導してインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生することができるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ベースの免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、インフルエンザウイルスマトリックス１（Ｍ１）タンパク質と、１つ以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質及び／又は１つ以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質とをコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む。

Description

本発明は、哺乳動物細胞を誘導してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生させることができるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ベースのインフルエンザワクチンに関する。ＶＬＰは、その表面上に様々なエピトープのクラスターを発現することができるが、ウイルス遺伝物質を欠くため、ワクチンは、複数のインフルエンザ亜型／系統に対して有効であり、長期にわたって持続する免疫応答を誘発し、代替的なワクチン接種戦略よりも高い安全性プロファイルを確保することが期待される。
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のエンベロープを有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザウイルスには、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型の４つの型があり、これらのうち、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型のみがヒトに感染することが知られている。Ａ型及びＢ型は、最も一般的に循環する型である。インフルエンザＡ型の亜型は、２つの表面糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の存在に基づいて分類される。Ｂ型インフルエンザウイルスは、インフルエンザＢ型／山形系統及びインフルエンザＢ型／ビクトリア系統の２つの異なる系統によって分類される。Ａ型インフルエンザウイルスは、１８個のＨＡ及び１１個のＮＡの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）に更に細分される。多数の潜在的な亜型が、インフルエンザウイルスで観察される高い抗原変異の主な原因となる。
ＨＡ及びＮＡは、産生的感染及び宿主免疫応答の確立のための重要な決定因子と考えられる。ＨＡは、ウイルス侵入を促進するために、宿主細胞受容体上のウイルスとシアル酸との間の初期相互作用に関与する。シアル酸残基へのＨＡ媒介性結合後、ＮＡは生物学的シザーとして作用し、シアル酸を切断してウイルス放出を促進する（Ｂｕｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１９：３７（４６）：６８５７－６８６７；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１３ １０：３２１）。マトリックス１（Ｍ１）タンパク質は、ウイルスリボヌクレオタンパク質と相互作用して、ウイルス膜の内面と密接に関連している（Ｐｅｕｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０２０；５８７：４９５－４９８）。マトリックス２（Ｍ２）タンパク質は、ウイルスエンベロープ内にプロトンチャネルを形成する構造的膜貫通タンパク質である（Ｐｉｅｌａｋ ＆ Ｃｈｏｕ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１；１８０８（２）：５２２－５２９。
インフルエンザウイルス感染に関連する最も一般的に報告されている症状としては、発熱、倦怠感、及び筋肉痛とともに気管気管支炎及び咽頭炎の上気道徴候が挙げられる。高リスク患者集団は、肺炎及び急性呼吸窮迫症候群などの重度の疾病表現型を呈する可能性が高く、これは入院及び死亡の可能性につながり得る（Ｆｌｅｒｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０２１；１９（７）：４２５－４４１）。毎年３００万人～５００万人を超えるインフルエンザの重症症例が発生すると推定されており、これらの症例のうち何十万人も死に至る（Ａｌｉ ＆ Ｃｏｗｌｉｎｇ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ．２０２１；４２：４３－５７）。
ワクチン接種は、インフルエンザを予防し、疾病負荷を軽減するための最も成功した方法であり続けている。現在、不活化ワクチン、生弱毒化ワクチン、及びサブユニットワクチンを含む、いくつかのワクチンアプローチが免疫化プログラムに採用されている。現在入手可能なインフルエンザワクチンは、どれも特に有効ではない。これは、少なくとも部分的には、不適切なワクチン株の選択及び株の選択とワクチンの提供との間の遅延時間によって説明され得る。例えば、現在のインフルエンザワクチンの多くは、孵化前の鶏卵中でインフルエンザウイルスを増殖させることによって作製されており、その長い製造時間により、新たに出現した株に効率的に対応することが困難になる。
したがって、季節的に循環する株に対してより迅速に展開することができ、感染の予防又は低減に有効であるインフルエンザワクチンの開発が依然として必要とされている。
ｍＲＮＡベースのワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされた最近のＣＯＶＩＤ－１９パンデミック中に実証されたように、迅速に展開することができる。実際に、ウイルスは、ヒト集団に広がるにつれて急速に変化していたが、ｍＲＮＡベースのワクチンは、感染の重症度を低下させるのに有効なままであった。加えて、ｍＲＮＡ技術は、更新されたワクチンを短期間で提供することを可能にした。更新されたワクチンは、主に循環しているウイルスによって獲得された変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含む。
ｍＲＮＡベースのワクチン戦略は、インフルエンザ感染を予防するか又はこれらの感染の重症度を低下させるのに非常に魅力的である。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、免疫応答を誘発させるのに有効であるため、何十年もの間ワクチン研究者の注目を集めてきた。しかしながら、ＶＬＰベースのワクチンの製造は、一部には商業規模でＶＬＰを産生することが困難であるため、ほとんどのウイルス、特にエンベロープウイルスに対しては依然として困難なままである。
本開示は、ｍＲＮＡベースのワクチン技術を使用して、哺乳動物細胞におけるインフルエンザＶＬＰの発現を誘導することができることを実証する。具体的には、（ｉ）インフルエンザウイルスマトリックス１（Ｍ１）タンパク質と、（ｉｉ）１つ以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質及び／又は１つ以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質と、をコードする１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）で哺乳動物細胞をトランスフェクトすることにより、本発明者らは、野生型インフルエンザウイルスと形態及びサイズが非常に類似したこれらの細胞におけるＶＬＰの産生を誘導することができた。このｍＲＮＡベースのアプローチを使用して、本発明者らは、哺乳動物細胞を誘導して、異なるインフルエンザウイルス由来のＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質を含むＶＬＰを産生することができた。
注目すべきことに、ＨＡタンパク質のうちの少なくとも１つ及び／又はＮＡタンパク質のうちの少なくとも１つは、Ｍ１タンパク質が由来するインフルエンザウイルスとは異なるインフルエンザウイルスからのものであった。これは、単一のＭ１タンパク質コード配列が、それらの表面上に異なるインフルエンザウイルス由来の複数のＨＡ及びＮＡタンパク質を有するＶＬＡの形成を誘導するのに十分であり得ることを示した。
本明細書に記載の組成物は、複数のインフルエンザ亜型／系統に対して有効な免疫応答を誘発するように設計することができる。ＶＬＰは、その表面上にエピトープのクラスターを発現することができるが、完全なウイルス遺伝物質を欠くため、本明細書に記載の組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、高い免疫原性である一方で、良好な安全性プロファイルを維持することが期待される。
特に、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルスマトリックス１（Ｍ１）タンパク質と、（ｉｉ）１つ以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質及び／又は１つ以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質と、をコードする１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）であって、Ｍ１タンパク質と１つ以上のＨＡタンパク質及び／又は１つ以上のＮＡタンパク質は、哺乳動物細胞を誘導して、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生することができる、組成物に関する。
いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、約５０ｎｍ～約２００ｎｍのサイズである。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、約１００ｎｍのサイズである。
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは、２つ以上のＨＡタンパク質及び／又は２つ以上のＮＡタンパク質をコードし、２つ以上のＨＡタンパク質の各々及び２つ以上のＮＡタンパク質の各々は、異なるインフルエンザウイルスからのものである。
いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＡタンパク質のうちの少なくとも１つ及び／又は２つ以上のＮＡタンパク質のうちの少なくとも１つは、Ｍ１タンパク質が由来するインフルエンザウイルスとは異なるインフルエンザウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＡタンパク質及び／又は２つ以上のＮＡタンパク質は、異なるインフルエンザＡ型の亜型からのものである。いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＡタンパク質のうちの少なくとも１つ及び／又は２つ以上のＮＡタンパク質のうちの少なくとも１つは、Ｂ型インフルエンザウイルスからのものである。
いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、パンデミックインフルエンザウイルス（例えば、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９）からのものである。いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、Ｈ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、３０位にセリン、１４２位にアラニン、２０７位にアスパラギン、及び２０９位にスレオニンを有する。いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、別個のｍＲＮＡによってコードされる。
いくつかの実施形態では、２つ以上のＮＡタンパク質のうちの少なくとも１つは、ノイラミニダーゼ活性アッセイによって決定されるように、２０００マイクロモル／時間（μＭ／時）以上の活性を有する。いくつかの実施形態では、２つ以上のＮＡタンパク質は、異なるインフルエンザＡ型の亜型からの２つのＮＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、異なるインフルエンザＡ型の亜型は、Ｎ１及びＮ２である。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、哺乳動物細胞におけるＶＬＰの発現を誘導することができ、ＶＬＰは、異なるインフルエンザＡ型の亜型からの２つのＮＡタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、２つ以上のＨＡタンパク質は、異なるインフルエンザＡ型の亜型からの２つのＨＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、異なるインフルエンザＡ型の亜型は、Ｈ１及びＨ３である。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、哺乳動物細胞におけるＶＬＰの発現を誘導することができ、ＶＬＰは、異なるインフルエンザＡ型の亜型からの２つのＨＡタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは、１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入される。
いくつかの実施形態では、各ＨＡタンパク質及び各ＮＡタンパク質は、別個のｍＲＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、３、４、５、６、７、８、又は９個の、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子、及び（ｉ）２、３、４、５、６、７、若しくは８個のＨＡタンパク質、（ｉｉ）２、３、４、５、６、７、若しくは８個のＮＡタンパク質、又は（ｉｉｉ）１、２、３、若しくは４個のＨＡタンパク質及び１、２、３、若しくは４個のＮＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、３、４、５、６、７、８、又は９個のｍＲＮＡは、同じＬＮＰに封入される。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡと、１つのＨＡタンパク質及び１つのＮＡタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、同じＬＮＰに封入される。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、第１のＨＡタンパク質及び第１のＮＡタンパク質をコードする第１のｍＲＮＡと、第２のＨＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする第３のｍＲＮＡとを含み、第１のＨＡタンパク質及び第１のＮＡタンパク質は第１のインフルエンザウイルスからのものであり、第２のＨＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質は第２のインフルエンザウイルスからのものである。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のインフルエンザウイルスは、異なる亜型のＡ型インフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、異なる亜型は、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２である。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、第３のＨＡタンパク質及び第３のＮＡタンパク質をコードする第４のｍＲＮＡを更に含み、第３のＨＡタンパク質及び第３のＮＡタンパク質は第３のインフルエンザウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、第３のインフルエンザウイルスは、Ｂ型インフルエンザウイルスである。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、第４のＨＡタンパク質及び第４のＮＡタンパク質をコードする第５のｍＲＮＡを更に含み、第４のＨＡタンパク質及び第４のＮＡタンパク質は第４のインフルエンザウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、第３及び第４のインフルエンザウイルスは、それぞれインフルエンザＢ型／山形系統及びインフルエンザＢ型／ビクトリア系統のものである。
いくつかの実施形態では、適用可能な場合、１つの第１、第２、第４及び第５のｍＲＮＡは、５’から３’の順序で、（ｉ）ＨＡタンパク質のコード配列、（ｉｉ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）ＮＡタンパク質のコード配列を含む。
いくつかの実施形態では、適用可能な場合、第１、第２、第３、第４及び第５のｍＲＮＡは、同じＬＮＰに封入される。
いくつかの実施形態では、第１、第２及び第３のｍＲＮＡは第１のＬＮＰに封入され、第４及び第５のｍＲＮＡは第２のＬＮＰに封入される。いくつかの実施形態では、第２のＬＮＰは、Ｍ１タンパク質をコードする第６のｍＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、第６のｍＲＮＡによってコードされるＭ１タンパク質は、Ｂ型インフルエンザウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、第１のＬＮＰ及び第２のＬＮＰは、同じ脂質成分を含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、インフルエンザウイルスマトリックス２（Ｍ２）タンパク質を更にコードするｍＲＮＡを更に含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡは、配列最適化されている。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約１００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチドを含むポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、約２００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、約５００ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰの脂質成分は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及び任意選択的にステロール系脂質を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＩＣＥ、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０８Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ、ＯＦ－０２、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＰ－Ｅ１８－２、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＥ－Ｅ１８－２、ＳＹ－３－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＨＥＰ－Ｅ３－Ｅ１０、ＨＥＰ－Ｅ４－Ｅ１０、ＲＬ３－ＤＭＡ－０７Ｄ、ＲＬ２－ＤＭＰ－０７Ｄ、ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１０、ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１２、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＳＩ－４－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＴＬ－１－１２Ｄ－ＤＭＡ、ＳＹ－０１０、ＳＹ－０１１、及び４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート（ＡＬＣ－０３１５）から選択される。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＥＰＥ １，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、及びＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））から選択される。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ及び２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）から選択される。
いくつかの実施形態では、ステロール系脂質は、コレステロールである。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＯＦ－０２、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、及びＡＬＣ－０３１５から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ又はＡＬＣ－０１５９から選択される。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥ又はＤＳＰＣから選択される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約７０ｎｍ～約１５０ｎｍのサイズである。
本発明はまた、本明細書に開示される組成物（例えば、免疫原性組成物）及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤は、塩、糖、緩衝試薬及びそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム又はその両方の組み合わせである。いくつかの実施形態では、糖は、二糖である。いくつかの実施形態では、二糖は、スクロース又はトレハロースである。いくつかの実施形態では、緩衝試薬は、リン酸、トリス、イミダゾール及びヒスチジンから選択される。いくつかの実施形態では、緩衝試薬は、リン酸又はトリスである。
本発明はまた、対象における１つ以上のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発させる方法であって、本方法は、本明細書に開示される組成物（例えば、免疫原性組成物、ワクチン、又は医薬組成物）を対象に投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、対象における１つ以上のインフルエンザウイルスによる感染の１つ以上の症状の重症度を低下させるのに有効である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、対象における１つ以上のインフルエンザウイルスによる感染を予防するのに有効である。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、妊娠している。いくつかの実施形態では、対象は、６５歳以上である。いくつかの実施形態では、対象は、７０歳以上である。
以下の図面を参照しながら、本発明の実施形態を例として説明する。
棒グラフに示されるように、亜型Ｎ１又はＮ２のＮＡタンパク質をコードする単一のｍＲＮＡでトランスフェクトされた、又はＨＡ、ＮＡ及びＭ１タンパク質をコードする複数のｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清におけるＮＡ活性を示す。ＮＡの酵素活性は、μＭ／時として報告され、平均値（Ｎ＝３）はバーの上に示される。模擬トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｍＲＮＡなし）の上清では、ＮＡ活性は検出されなかった。ＰＢＳは、陰性対照として機能した。 示されるように、Ｈ３亜型ＨＡタンパク質（Ｈ３）をコードするｍＲＮＡ及びＨ１亜型ＨＡタンパク質（Ｈ１）、Ｍ１タンパク質（Ｍ１）、又は１つ以上のＮＡタンパク質（Ｎ１、Ｎ２）をコードする１つ以上の追加のｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物におけるＨ３亜型ＨＡタンパク質のタンパク質発現を示す。溶解物をゲル上で分離させた。ポリクローナル抗Ｈ３抗体を用いてウェスタンブロットを行った。模擬トランスフェクトされた細胞（ｍＲＮＡなし）は、陰性対照（ＮＣ）として機能した。Ｈ１、Ｎ１、Ｈ３、Ｎ２、及びＭ１タンパク質をコードする発現プラスミドで一次的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られた精製ＶＬＰは、陽性対照（ＰＣ）として機能した。ゲルのレーンを、以下のように左から右に装填した：分子量マーカー（Ｍ）；Ｈ３；Ｈ３／Ｍ１；Ｈ３／Ｎ２／Ｍ１、Ｈ１Ｎ１／Ｈ３Ｎ２／Ｍ１；Ｈ１／Ｈ３／Ｍ１；陰性対照（ＮＣ）；陽性対照（ＰＣ）；分子量マーカー（Ｍ）。 模擬トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びｍＲＮＡがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清からのＶＬＰの代表的な低温透過型電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）画像を示す。トランスフェクトされた細胞の上清を、１００ｋＤａの孔径を有するＡｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心分離フィルターに濃縮して、細胞破片及び小さなタンパク質を除去した。濃縮ＶＬＰを、更なる検査のために－８０℃で維持した。パネルＡは、模擬トランスフェクトされた細胞（ｍＲＮＡなし）を示す。この条件では、ＶＬＰは視認できなかった。対照的に、パネルＢは、インフルエンザウイルスＨＡ、ＮＡ及びＭ１タンパク質（Ｈ３／Ｎ２／Ｍ１）をコードする別個のｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の表面上の球状小胞の存在を示す。同様に、パネルＣは、２つの異なるインフルエンザウイルス（それぞれＨ１、Ｈ３、Ｎ１及びＮ２）のＨＡ及びＮＡタンパク質をコードする別個のｍＲＮＡ、並びにＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の表面上に球状小胞が存在することを示す。ＶＬＰは、インフルエンザウイルスのサイズと同様の約１００ｎｍのサイズを有する。注目すべきことに、異なるインフルエンザウイルスからのＨＡ及びＮＡタンパク質の発現は、ＶＬＰ形成を妨害しなかった。 ＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及びＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清におけるＮＡ活性を示す。ＮＡ及びＨＡタンパク質は、それぞれダーウィン（Ａ型）、ウィスコンシン（Ａ型）、プーケット（Ｂ型）及びオーストリア（Ｂ型）インフルエンザ株に適合させ、それらに由来した。Ｍ１タンパク質は、ＨＡ及びＮＡタンパク質配列が由来したものとは異なる株からのものであった（更なる詳細については、実施例６を参照されたい）。ＮＡの酵素活性は、μＭ／時として報告される。模擬トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（リポフェクタントのみ、陰性対照）の上清では、ＮＡ活性は検出されなかった。精製された組換えＶＬＰは、陽性対照として機能した。 ＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及びＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の溶解物及び上清（ＳＮ；濃縮及び非濃縮）におけるインフルエンザＡ型（パネルＡ）及びＢ型（パネルＢ）ＨＡタンパク質の発現を示す。ＮＡ及びＨＡタンパク質は、それぞれダーウィン（Ａ型）、ウィスコンシン（Ａ型）、プーケット（Ｂ型）及びオーストリア（Ｂ型）株に適合させ、それらに由来した。Ｍ１タンパク質は、ＨＡ及びＮＡタンパク質配列が由来したものとは異なる株からのものであった（更なる詳細については、実施例６を参照されたい）。ゲル上での分離後、Ａ型（パネルＡ）又はＢ型（パネルＢ）に対するモノクローナル抗ＨＡ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。模擬トランスフェクトされた細胞（リポフェクタントのみ）は、陰性対照として機能した。組換えインフルエンザＢ型ＨＡ（ｒＨＡ＿Ｂ）は、陽性対照として機能した。分子量マーカー（ＭＷ）も別のレーンに含まれた。完全長ＨＡ及びＨＡ２サブユニットに対応するバンドは、破線で囲まれている。 ＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及びＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の溶解物及び濃縮上清（パネルＡ）並びに非濃縮上清（パネルＢ）におけるＭ１タンパク質の発現を示す。ＮＡ及びＨＡタンパク質は、それぞれダーウィン（Ａ型）、ウィスコンシン（Ａ型）、プーケット（Ｂ型）及びオーストリア（Ｂ型）株に適合させ、それらに由来した。Ｍ１タンパク質は、ＨＡ及びＮＡタンパク質配列が由来したものとは異なる株からのものであった（更なる詳細については、実施例６を参照されたい）。ゲル上での分離後、ポリクローナル抗Ｍ１抗体を用いてウェスタンブロットを行った。模擬トランスフェクトされた細胞（リポフェクタントのみ）は、陰性対照として機能した。精製されたＶＬＰは、陽性対照として機能した。分子量マーカー（ＭＷ）も別のレーンに含まれた。Ｍ１は、トランスフェクトされた細胞の細胞溶解物及び濃縮上清中で検出されたが（パネルＡ）、非濃縮上清試料（パネルＢ）では検出されなかった。 模擬トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞及びｍＲＮＡでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の濃縮上清からの代表的な低温透過型電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）画像を示す。パネルＡは、模擬トランスフェクトされた細胞（リポフェクタントのみ）を示す。この条件では、ＶＬＰは視認できなかった。パネルＢ～Ｅは、ＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及びＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の上清の代表的な画像を示す。ＮＡ及びＨＡタンパク質は、上記各パネルに示すように、それぞれインフルエンザ株のダーウィン（Ａ型；パネルＢ）、ウィスコンシン（Ａ型；パネルＣ）、プーケット（Ｂ型；パネルＤ）及びオーストリア（Ｂ型；パネルＥ）に適合させ、それらに由来した。Ｍ１タンパク質は、ＨＡ及びＮＡタンパク質配列が由来したものとは異なる株からのものであった（更なる詳細については、実施例６を参照されたい）。模擬トランスフェクトされた細胞の上清では、不均一な平滑小胞（白色の矢印）（トランスフェクションプロセスからのアーチファクトと考えられる）、及びタンパク質破片（黒色の輪郭の矢印）のみが観察された（パネルＡの例示的な画像を参照されたい）。ｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の上清の各々において、ＶＬＰが検出された（パネルＢ～Ｅ；塗りつぶした黒色矢印を参照されたい）。ＶＬＰは、タンパク質破片（黒色の輪郭の矢印；パネルＢ～Ｄを参照されたい）及び平滑な小胞（白色の矢印；パネルＥを参照されたい）と明確に区別することができる。ＶＬＰは、約５０～１５０ｎｍのサイズを有していた。 図７－１の続き。
定義
本発明の理解が容易になるように、初めに以下に特定の用語を定義する。以下の用語及び他の用語についての更なる定義は、本明細書全体を通して示される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、別途文脈が明らかに指示しない限り、複数の指示物を含む。
具体的に記載されるか又は文脈から明らかである場合を除き、本明細書で使用される場合、用語「又は」は包含的であると理解され、「又は」及び「及び」の両方が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「およそ」又は「約」は、注目する１つ以上の値に使用される場合、記述される参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、この用語は、別段記述されない限り又は文脈から別段明らかではない限り、記述される参照値のいずれかの方向（より大きいか又はより小さい）の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満内に入る値の範囲を指す。
例示的な方法及び材料を以下に記載するが、本発明の実施又は試験には、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な方法及び材料も用いられ得る。概して、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品及び製薬化学並びにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法及びその技法は、当該技術分野で周知の一般的に使用されるものである。酵素反応及び精製技法は、製造者の仕様書に従い、当該技術分野において一般的に達成されるとおり又は本明細書に記載されるとおり実施される。
本明細書で使用される場合、用語「ｍＲＮＡ」は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾ＲＮＡ及び非修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域及び非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、天然源から精製され、組換え発現系を使用して産生され、任意選択的に精製され、インビトロで転写され、又は化学的に合成され得る。適切な場合には、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学的に修飾された塩基又は糖、骨格修飾などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段の指示がない限り、５’～３’方向に提示される。典型的なｍＲＮＡは、５’キャップ、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、タンパク質－コード領域、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）及び３’テールを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、ポリ（Ｃ）テールである。より典型的には、テール構造は、ポリ（Ａ）テールである。
本明細書で使用される場合、用語「配列最適化されている」は、ヌクレオチド配列が天然に存在する又は野生型の核酸と比べて修飾されていることを表して使用される。かかる修飾には、例えば、コドン最適化並びに通常その天然に存在する又は野生型の核酸と結び付かない５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの使用が含まれ得る。本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」及び「コドン最適化されている」は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする天然に存在する又は野生型の核酸のコドン組成についてのそのアミノ酸配列を変化させない修飾であって、それにより前記核酸のタンパク質発現が向上するような修飾を指す。本発明に関連して、「コドン最適化」は、ヌクレオチド配列のリストから、グアニン－シトシン含量、コドン適応指標、不安定化要因となる核酸配列若しくはモチーフの存在並びに／又は休止部位及び／若しくは終結シグナルの存在によるフィルタリングなど、最適に満たないヌクレオチド配列をフィルターで取り除くことにより、１つ以上の最適化されたヌクレオチド配列に至らしめる過程も指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「鋳型ＤＮＡ」（又は「ＤＮＡ鋳型」）は、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって合成しようとするｍＲＮＡ転写物をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子に関する。鋳型ＤＮＡは、鋳型ＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡ転写物を産生するためのＩＶＴの鋳型として使用される。鋳型ＤＮＡは、ＩＶＴに必要な全ての要素、特に例えばＴ３、Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼなど、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合のための、所望のｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されているプロモーターエレメントを含む。更に、鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列のアイデンティティを、例えばＰＣＲ又はＤＮＡシーケンシングによって決定することができるように、ｍＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ配列の５’側及び／又は３’側にプライマー結合部位を含み得る。「鋳型ＤＮＡ」は、本発明に関連して、線状又は環状ＤＮＡ分子であり得る。本明細書で使用される場合、用語「鋳型ＤＮＡ」は、プラスミドＤＮＡなど、所望のｍＲＮＡ転写物をコードする核酸配列を含むＤＮＡベクターを指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト又は他の動物などの哺乳動物を指す。典型的には、対象は、ヒトである。対象は、男性又は女性であり得、乳児、若年者、青年、成人、及び高齢者対象を含む任意の好適な年齢であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「ワクチン組成物」又は「ワクチン」は、対象において防御免疫応答を生じさせることができる組成物を指す。本明細書で使用される場合、「防御免疫応答」は、感染から対象を保護する（感染を予防するか、又は感染に関連する疾患の発症を予防する）か、又は感染（例えば、インフルエンザウイルスによる感染）の症状を軽減する免疫応答を指す。ワクチンは、予防（防止）反応及び治療反応の両方を誘発し得る。
本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本願が属する当業者が一般に理解するのと同じであり、且つ本願が属する当該技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本発明の背景を記載し、その実施に関して追加的な詳細を提供するため本明細書において言及される刊行物及び他の参考資料は、本明細書によって参照により援用される。
本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルスマトリックス１（Ｍ１）タンパク質と、（ｉｉ）１つ以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質及び／又は１つ以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質とをコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）であって、Ｍ１タンパク質と、１つ以上のＨＡタンパク質及び／又は１つ以上のＮＡタンパク質は、哺乳動物細胞を誘導してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生させることができる、組成物を提供する。
ウイルス様粒子
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスタンパク質の発現時に集合する構造であり、天然のビリオン構造を模倣することができる。それらは、天然ウイルスと同様の構造及び形状を有するが、ウイルスゲノムを欠く。エンベロープウイルスのＶＬＰは、典型的には、それらが発現された細胞に由来する脂質膜を含む。１つ以上のウイルス糖タンパク質は、典型的には、脂質膜に組み込まれ、免疫細胞によって認識されて中和抗体を産生することができる標的抗原として機能する。
細胞からのインフルエンザＶＬＰの出芽は、ＨＡ及びＮＡの発現、特にＨＡ及びＮＡの細胞質テールに依存する。細胞表面からのＶＬＰの効率的な放出は、ＨＡ及びＮＡによって提供されるシアリダーゼ活性の存在を必要とする。加えて、哺乳動物細胞、特にヒト細胞におけるＶＬＰの有効な産生は、Ｍ１タンパク質の存在に依存する。Ｍ１タンパク質の存在下で産生されるＶＬＰは、完全ＶＬＰと非常に類似している。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルスマトリックス１（Ｍ１）タンパク質と、（ｉｉ）１つ以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質と、（ｉｉｉ）１つ以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質とをコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）を提供する。そのような組成物は、哺乳動物、特にヒト細胞を誘導してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生させるのに特に有効である。ＶＬＰ産生は、本明細書、例えば実施例４及び５に記載されるように、電子顕微鏡（ＥＭ）法を使用して可視化することができる。例えば、Ｍ１タンパク質、１つ以上のＨＡタンパク質、及び１つ以上のＮＡタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３細胞又は他の哺乳動物細胞をトランスフェクトすることができ、ＶＬＰ産生は、本明細書に記載されるような低温ＥＭ法を使用して観察することができる。
いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、約５０ｎｍ～約２００ｎｍのサイズである。具体的な実施形態では、ＶＬＰは、約１００ｎｍのサイズである。
Ｍ１タンパク質
マトリックス１（Ｍ１）タンパク質は、ウイルス粒子の脂質二重層の下にコートを形成する２５２残基の構造タンパク質である。結果として、それは、表面タンパク質のヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）と同じ進化圧を経験しない。実際、Ｍ１タンパク質は、インフルエンザウイルスゲノムによってコードされる最も遅い進化タンパク質の１つである。これは、インフルエンザウイルスゲノムのＭ遺伝子によってコードされる。Ｍ遺伝子は、ＨＡ遺伝子よりも５～１０倍遅い進化をすることが分かった。
Ｍ１タンパク質は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ Ｔ細胞エピトープの両方を含む。特に一般的なＭＨＣクラスＩＩ Ｔ細胞エピトープは、核輸送配列と重複する。
そのアミノ酸配列の高い保存性とＴ細胞エピトープの存在は、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを含めることがインフルエンザウイルスの複数の株に対する免疫応答を誘発させるのに有効であり得ることを示唆している。
いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、パンデミックインフルエンザウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、Ｈ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルス（例えば、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９又はＡ／プエルトリコ／８／１９３４）からのものである。いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、３０位のアミノ酸セリン（Ｓ）、１４２位のアミノ酸アラニン（Ａ）、２０７位のアミノ酸アスパラギン（Ｎ）及び２０９位のアミノ酸スレオニン（Ｔ）を含むＭ１タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、任意のインフルエンザＡ型株からのＮＡ及びＨＡタンパク質を含むＶＬＰを形成することができる。いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、任意のインフルエンザＢ型株からのＮＡ及びＨＡタンパク質を含むＶＬＰを形成することができる。
哺乳動物細胞を、ＨＡタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡ、ＮＡタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡ及びＨ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／カリフォルニア／０７／２００９）に由来するＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトする場合、本発明者らは、ＨＡ及びＮＡタンパク質がＡ／カリフォルニア／０７／２００９以外のインフルエンザウイルスに由来した場合でも、形質膜においてＶＬＰの効率的な出芽を観察した。
ヘマグルチニン
ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質は、ウイルスのエンベロープに関連する内在膜タンパク質である。ＨＡは、インフルエンザウイルスの主要な抗原であり、ビリオン表面ではＮＡを５～１０倍上回る。グループ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８）並びにグループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５）に細分される１８個の既知のＨＡ亜型が存在する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、又はＨ１８の少なくとも１つのＨＡタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。一般的な季節性インフルエンザＡ型の亜型としては、Ｈ１及びＨ３が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡは、亜型Ｈ１又はＨ３の少なくとも１つのＨＡタンパク質をコードする。パンデミックの可能性を有するインフルエンザＡ型株は、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９又はＨ１０亜型を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡは、亜型Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９又はＨ１０の少なくとも１つのＨＡタンパク質をコードする。
より典型的には、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、ＨＡタンパク質をコードする複数の（例えば、２つ以上の）ｍＲＮＡを含み、各ＨＡタンパク質は、異なる亜型から選択される。ＨＡタンパク質は、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、及びＨ１８のいずれかから選択され得る。より一般的には、複数のｍＲＮＡは、グループ１及び２の各々の少なくとも１つのＨＡタンパク質をコードする。例えば、複数のｍＲＮＡは、亜型Ｈ１のＨＡタンパク質及び亜型Ｈ３のＨＡタンパク質をコードし得る。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、Ｂ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのＨＡタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ型インフルエンザウイルスは、山形系統のものである。いくつかの実施形態では、Ｂ型インフルエンザウイルスは、ビクトリア系統のものである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、インフルエンザＢ／山形系統のＨＡタンパク質及びインフルエンザＢ／ビクトリア系統のＨＡタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む。
ノイラミニダーゼ
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、ウイルスのエンベロープに関連する別の内在膜タンパク質である。ＮＡは、細胞質テール、膜貫通領域、ストーク（ｓｔａｌｋ）、及び触媒頭部を含む別個の構造ドメインに折り畳まれた４つの同一ポリペプチドの四量体として集合する。細胞質テールのＮ末端領域の高い配列保存性が観察されている。ＮＡには１１個の既知の亜型がある（Ｎ１～Ｎ１１）。ＮＡは、細胞受容体からのシアル酸の除去、並びに新生ビリオン上で新たに合成されたＨＡ及びＮＡの除去に関与している。この酵素活性は、ウイルス凝集を防止し、瀕死の宿主細胞へのウイルス結合を回避し、新しい細胞標的のウイルス放出及び感染を促進する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、亜型Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、又はＮ１１の少なくとも１つのＮＡタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。例えば、一般的な季節性インフルエンザＡ型の亜型は、Ｎ１及びＮ２を含む。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡは、亜型Ｎ１又はＮ３の少なくとも１つのＮＡタンパク質をコードする。パンデミック可能性を有するインフルエンザＡ型株は、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ９又はＮ７を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍＲＮＡは、亜型Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ９又はＮ７の少なくとも１つのＮＡタンパク質をコードする。
より典型的には、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、ＮＡタンパク質をコードする複数の（例えば、２つ以上の）ｍＲＮＡを含み、各ＮＡタンパク質は、異なる亜型から選択される。ＮＡタンパク質は、亜型Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、及びＮ１１のいずれかから選択され得る。より一般的には、複数のｍＲＮＡは、Ｎ１亜型の少なくとも１つのＮＡタンパク質及びＮ２亜型の少なくとも１つのＮＡタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、Ｂ型インフルエンザウイルスの少なくとも１つのＮＡタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ型インフルエンザウイルスは、山形系統のものである。いくつかの実施形態では、Ｂ型インフルエンザウイルスは、ビクトリア系統のものである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、インフルエンザＢ／山形系統のＮＡタンパク質及びインフルエンザＢ／ビクトリア系統のＮＡタンパク質をコードする１つ以上のｍＲＮＡを含む。
本発明者らは、インフルエンザＡ型の亜型Ｎ２株のＮＡタンパク質が、インフルエンザＡ型の亜型Ｎ１のＮＡタンパク質よりも２．５～３倍活性であり得ることを観察した。したがって、２０００μＭ／時間以上の高活性のＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡを、ｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞からのＶＬＰの効率的な出芽を確実にするために、より低い活性（例えば、１０００μＭ／時間未満）のＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡと組み合わせて含むことが望ましい場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、高活性のＮＡタンパク質（例えば、Ｎ２亜型のＮＡタンパク質）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、低活性のＮＡタンパク質（例えば、Ｎ１亜型のＮＡタンパク質）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡとを含む。ＮＡタンパク質の酵素活性は、本明細書に記載されるように、例えば、実施例２に記載されるように決定することができる。具体的には、４－メチルウンベリフェロン－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＭＵＮＡＮＡ）を基質として用いる蛍光ベースのアッセイを使用して、ＮＡタンパク質の活性を決定することができる。
Ｍ２タンパク質
インフルエンザウイルスマトリックス２（Ｍ２）タンパク質とのＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質の共発現は、宿主細胞からのこれらのタンパク質の放出を更に増強し得る。
ＶＬＰ形成組成物
本発明のＶＬＰ形成組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、典型的には、Ｍ１タンパク質、１つ以上のＨＡタンパク質及び１つ以上のＮＡタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡを含む。１つ以上のＨＡタンパク質及び１つ以上のＮＡタンパク質は、同じｍＲＮＡによって、又は別個のｍＲＮＡによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、各ＨＡタンパク質及び各ＮＡタンパク質は、別個のｍＲＮＡによってコードされる。
典型的には、Ｍ１タンパク質は、別個のｍＲＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）中の１つ以上の他のｍＲＮＡによってコードされる少なくとも１つのＨＡタンパク質及び／又は少なくとも１つのＮＡタンパク質が由来するインフルエンザウイルスとは異なるインフルエンザウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、Ｍ１タンパク質は、Ｈ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルス（例えば、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９）からのものであり、及び／又は３０位でアミノ酸セリン（Ｓ）、１４２位でアミノ酸アラニン（Ａ）、２０７位でアミノ酸アスパラギン（Ｎ）及び２０９位でアミノ酸スレオニン（Ｔ）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、Ｍ１タンパク質と、（ｉ）１つ以上のＨＡタンパク質、（ｉｉ）１つ以上のＮＡタンパク質、又は（ｉｉｉ）１つ以上のＨＡタンパク質とＮＡタンパク質との組み合わせと、をコードする２、３、４、５、６、７、８、９個、又はそれ以上のｍＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、Ｍ１タンパク質と、（ｉ）２つ以上のＨＡタンパク質、（ｉｉ）２つ以上のＮＡタンパク質、又は（ｉｉｉ）少なくとも１つのＨＡタンパク質及び少なくとも１つのＮＡタンパク質と、をコードする３、４、５、６、７、８、９個、又はそれ以上のｍＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＡ及びＮＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザウイルスからのものである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、Ｈ１亜型を含み、１つ以上のＮＡタンパク質は、Ｎ１亜型を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、Ｈ２亜型を含み、１つ以上のＮＡタンパク質は、Ｎ２亜型を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、Ｈ５亜型を含み、１つ以上のＮＡタンパク質は、Ｎ１亜型を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、Ｈ３亜型を含み、１つ以上のＮＡタンパク質は、Ｎ２亜型を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、Ｈ７亜型を含み、１つ以上のＮＡタンパク質は、Ｎ３、Ｎ７又はＮ９亜型を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、Ｈ９亜型を含み、１つ以上のＮＡタンパク質は、Ｎ２亜型を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、Ｈ１０亜型を含み、１つ以上のＮＡタンパク質は、Ｎ７亜型を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、亜型Ｈ１及びＨ３を含み、１つ以上のＮＡタンパク質は、亜型Ｎ１及びＮ２を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、インフルエンザＢ／山形系統又はインフルエンザＢ／ビクトリア系統のＨＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＡタンパク質は、インフルエンザＢ／山形系統又はインフルエンザＢ／ビクトリア系統のＮＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質は、亜型Ｈ１及びＨ３のＨＡタンパク質、並びにインフルエンザＢ／山形系統若しくはインフルエンザＢ／ビクトリア系統の１つ又は両方のＨＡタンパク質を含み、１つ以上のＮＡタンパク質は、亜型Ｎ１及びＮ２のＨＡタンパク質並びにインフルエンザＢ／山形系統若しくはインフルエンザＢ／ビクトリア系統の１つ又は両方のＮＡタンパク質を含む。
一実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、Ｈ１ ＨＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ分子、インフルエンザＢ／山形系統のＨＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、インフルエンザＢ／ビクトリア系統のＨＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、及びＭ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡを含む。
一実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、Ｈ３ ＨＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、Ｎ２ ＮＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、Ｈ１ ＨＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、Ｎ１ ＮＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、インフルエンザＢ／山形系統からのＨＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、インフルエンザＢ／山形系統からのＮＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、インフルエンザＢ／ビクトリア系統からのＨＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、インフルエンザＢ／ビクトリア系統からのＮＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、及びＭ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、第１のＨＡタンパク質及び第１のＮＡタンパク質をコードする第１のｍＲＮＡと、第２のＨＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする第３のｍＲＮＡとを含む。典型的には、第１のＨＡタンパク質及び第１のＮＡタンパク質は、第１のインフルエンザウイルスからのものであり（例えば、インフルエンザＡ型からのＨ１及びＮ１）、第２のＨＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質は、第２のインフルエンザウイルスからのものである（例えば、インフルエンザＡ型からのＨ３及びＮ２）。
いくつかの実施形態では、第１のインフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルスであり、第２のインフルエンザウイルスは、Ｈ３Ｎ２ Ａ型インフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、第１のインフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１又はＨ３Ｎ２）であり、第２のインフルエンザウイルスは、Ｂ型インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＢ／山形又はインフルエンザＢ／ビクトリア）である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、第３のインフルエンザウイルスからの第３のＨＡタンパク質及び第３のＮＡタンパク質をコードする第４のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のインフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルスであり、第２のインフルエンザウイルスは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスであり、第３のインフルエンザウイルスは、Ｂ型インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＢ／山形又はインフルエンザＢ／ビクトリア）である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、第３のインフルエンザウイルスからの第３のＨＡタンパク質及び第３のＮＡタンパク質をコードする第４のｍＲＮＡと、第４のインフルエンザウイルスからの第４のＨＡタンパク質及び第４のＮＡタンパク質をコードする第５のｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、第１のインフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルスであり、第２のインフルエンザウイルスは、Ｈ３Ｎ２ Ａ型インフルエンザウイルスであり、第３のインフルエンザウイルスは、山形系統のＢ型インフルエンザウイルスであり、第４のインフルエンザウイルスは、ビクトリア系統のものである。
いくつかの実施形態では、バイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）な第１、第２、第４及び第５のｍＲＮＡは、ＨＡ及びＮＡタンパク質をコードする２つのコード配列間の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ＩＲＥＳは、第２のリボソーム動員部位として機能し、ｍＲＮＡの内部領域で翻訳開始が追加的に起こることを可能にする。
いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、ウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスは、リボウイルス（ｒｉｂｏｖｉｒｕｓ）である。いくつかの実施形態では、リボウイルスは、ピコルナウイルス、ヘパシウイルス、ペスチウイルス、肝炎ウイルス、フラビウイルス、又はレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、リボウイルスは、ピコルナウイルスである。いくつかの実施形態では、ピコルナウイルスは、ジシストロウイルス又は脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）である。
いくつかの実施形態では、バイシストロニックな第１、第２、第４及び第５のｍＲＮＡは、ＨＡ及びＮＡタンパク質をコードする２つのコード配列間の自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである。２Ａペプチドは、典型的には、およそ１８～２５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、ウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａである。
上流コード配列の翻訳中に、２Ａペプチドは、リボソームが２ＡペプチドのＣ末端でのグリシン及びプロリンペプチド結合の合成をスキップさせ、２Ａペプチドと下流コード配列によってコードされるタンパク質との間の分離を引き起こす。結果として、上流タンパク質は、そのＣ末端に２Ａペプチドに由来する残基を含む。下流コード配列によってコードされるタンパク質は、そのＮ末端にも２Ａペプチドに由来するプロリンを含む。
バイシストロニックなｍＲＮＡ中のＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質のコード配列は、いずれかの順序で配置され得る（ＨＡの後にＮＡが続くか、又はＮＡの後にＨＡが続く）。ＨＡタンパク質は、典型的には、天然ウイルス粒子の表面上でＮＡを５～１０倍上回るので、ＨＡタンパク質がＮＡタンパク質よりも高いレベルで発現されるように、ＨＡを最初に配置する（すなわち、ポリシストロニックなｍＲＮＡの５’位置に）ことが有利であり得る。
例えば、ＩＲＥＳの下流のコード配列は、典型的には、バイシストロンにおける上流コード配列と比較して、はるかに低いレベル（典型的には、１０～２０％）で発現される。したがって、ＨＡタンパク質のコード配列、ＩＲＥＳ及びＮＡタンパク質のコード配列を５’～３’の順序で含むバイシストロニックなｍＲＮＡは、天然ウイルス粒子のものと同様の比で、ＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質を含むＶＬＰの形成をもたらし得る。
同様に、自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流のコード配列は、典型的には、バイシストロンにおける上流コード配列と比較してより低いレベルで発現される。例えば、２Ａペプチドの翻訳産物のＮ末端は、２ＡペプチドのＣ末端のものを超える２～５倍のモル過剰に通常的に蓄積する。したがって、５’～３’の順序でＨＡタンパク質のコード配列、自己切断ペプチド（例えば、２Ａペプチド）をコードするヌクレオチド配列、及びＮＡタンパク質のコード配列を含むバイシストロニックなｍＲＮＡは、同様に、天然ウイルス粒子のものと同様の比で、ＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質を含むＶＬＰの形成をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、少なくとも第１のＨＡタンパク質及び第２のＨＡタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、少なくとも第１のＮＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする第３のｍＲＮＡとを含む。典型的には、第１のＨＡタンパク質及び第２のＨＡタンパク質（並びに任意の更なるＨＡタンパク質）は、異なる亜型（例えば、インフルエンザＡ型からのＨ１及びＨ３）及び／又は異なる系統（例えば、ビクトリア及び山形）からのものであり、第１のＮＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質（並びに任意の更なるＮＡタンパク質）は、異なる亜型（例えば、インフルエンザＡ型からのＮ１及びＮ２）及び／又は異なる系統からのものである。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のＨＡタンパク質（並びに任意の更なるＨＡタンパク質）のコード配列及び／又は第１及び第２のＮＡタンパク質（並びに任意の更なるＮＡタンパク質）のコード配列は、自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列によって分離されている。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである。２Ａペプチドは、典型的には、約１８～２５アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、ウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ又はＦ２Ａである。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のＨＡタンパク質（並びに任意の更なるＨＡタンパク質）をコードする第１のｍＲＮＡと第１及び第２のＮＡタンパク質（並びに任意の更なるＮＡタンパク質）をコードする第２のｍＲＮＡとは、同じ５’ＵＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＨＡタンパク質をコードする第１のｍＲＮＡと第１及び第２のＮＡタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡとは、異なる５’ＵＴＲ配列を含む。例えば、異なる５’ＵＴＲ配列を使用することは、天然ウイルス粒子に見られるものと同様のＨＡ対ＮＡ比を達成するのに有利であり得る。
１つ以上のＨＡタンパク質及び１つ以上のＮＡタンパク質とＭ２タンパク質との共発現は、細胞からのＶＬＰの放出を更に増強し得る。したがって、本発明による組成物（例えば、本発明による免疫原性組成物又はワクチン）は、マトリックス２（Ｍ２）タンパク質をコードするｍＲＮＡを更に含み得る。インフルエンザウイルスゲノムでは、Ｍ１タンパク質及びＭ２タンパク質は、異なるが部分的に重複するリーディングフレームにコードされる。したがって、いくつかの実施形態では、Ｍ２タンパク質は、Ｍ１タンパク質と同じｍＲＮＡによってコードされ、例えば、野生型インフルエンザウイルスゲノム中のＭ１及びＭ２タンパク質のコード配列の配置を複製する。或いは、Ｍ２タンパク質は、別個のｍＲＮＡによってコードされ得る。
株選択
インフルエンザウイルスは絶えず進化しており、したがって、季節性インフルエンザワクチンに含まれるウイルス株の頻繁な更新が必要である。世界保健機関（ＷＨＯ）は、インフルエンザなどの循環性呼吸器ウイルスを監視し、監視データを分析して、インフルエンザワクチン組成物の年間推奨を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＡ及びＮＡタンパク質は、インフルエンザワクチン組成物のためのそれらの年間推奨においてＷＨＯによって推奨されるインフルエンザウイルス株からのものである。
ある特定の実施形態では、１つ以上のインフルエンザウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つは、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有するインフルエンザウイルスＨＡタンパク質及び／又はインフルエンザウイルスＮＡタンパク質を含み、ある特定の実施形態では、１つ以上のリボ核酸分子のうちの少なくとも１つは、機械学習モデルから同定されるか又は設計される分子配列を有する１つ以上のインフルエンザウイルスタンパク質をコードする。
ある実施形態では、組成物は、機械学習モデルから同定又は設計された分子配列を有する機械学習インフルエンザウイルスＨＡをコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子を更に含み、１つ以上の機械学習インフルエンザウイルスＨＡは、Ｈ１ＨＡ、Ｈ３ＨＡ、インフルエンザＢ／ビクトリア系統からのＨＡ、インフルエンザＢ／山形系統からのＨＡ、又はそれらの組み合わせから選択され得る。
１つ以上の機械学習インフルエンザウイルスＨＡを選択する場合には、任意の機械学習アルゴリズムを使用し得る。例えば、本明細書で想定されているのは、ＰＣＴ出願の国際公開第２０２１／０８０９９０Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、及び国際公開第２０２１／０８０９９９Ａ１号パンフレット（発明の名称：Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）（これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている機械学習アルゴリズム及び方法のうちのいずれかである。
ｍＲＮＡ
ｍＲＮＡの構造要素
本発明による典型的なｍＲＮＡは、５’キャップ、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、タンパク質－コード領域、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及び３’テールを含む。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見出されるヌクレアーゼへの抵抗性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。いくつかの実施形態では、５’キャップ及び／又は３’テールは、ｍＲＮＡ合成後に付加され得る。他の実施形態では、５’キャップ及び／又は３’テール配列は、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応で使用されるＤＮＡ鋳型配列に含まれる。
５’キャップ
具体的な実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、以下の構造を有する５’キャップを含む：
。
５’キャップは、以下のように付加され得る：まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、５’ヌクレオチドから末端ホスフェート基の１つを除去し、２つの末端ホスフェートを残し；続いて、グアノシントリホスフェート（ＧＴＰ）が、グアニリルトランスフェラーゼによって末端ホスフェートに付加され、５’５’５トリホスフェート結合を生成し；続いて、グアニンの７－窒素がメチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。追加のキャップ構造は、参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願公開第２０１６／００３２３５６号明細書及び公開された米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号明細書に記載されている。
３’テール
典型的な実施形態では、ｍＲＮＡのテール構造は、ポリ（Ａ）テールを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのテール構造は、ポリ（Ｃ）テールを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０個のアデノシン又はシトシンヌクレオチドを含む。典型的な実施形態では、テール構造は、およそ１００～５００ヌクレオチド長である。例えば、１００～２５０ヌクレオチド長のテール構造（例えば、ポリ（Ａ）テール）は、ｍＲＮＡの治療的使用に特に有用であり得る。
ｍＲＮＡの３’末端上のポリ（Ａ）又はポリ（Ｃ）テールは、典型的には、それぞれ少なくとも５０個のアデノシン又はシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシン又はシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシン又はシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシン又はシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシン又はシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシン又はシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシン又はシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシン又はシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシン又はシトシンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、本明細書に記載の様々な長さのポリ（Ａ）及びポリ（Ｃ）テールの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチドを含むポリＡ配列を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約２００ヌクレオチドのポリＡ配列を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、約５００ヌクレオチドのポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ転写産物によってコードされる遺伝子と区別される遺伝子に由来する５’又は３’ＵＴＲを含み得る（すなわち、ＵＴＲは異種ＵＴＲである）。
ある特定の実施形態では、５’及び／又は３’ＵＴＲ配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるために安定である（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン又はクエン酸サイクル酵素）ｍＲＮＡからのものであり得る。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善し、且つ／又はｍＲＮＡの半減期を改善するために、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列又はその断片を含み得る。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列又はその断片をｍＲＮＡの３’末端又は非翻訳領域に含めることも企図される。一般に、これらの修飾は、修飾されていない対応物と比較してｍＲＮＡの安定性及び／又は薬物動態特性（例えば、半減期）を改善し、例えば、インビボヌクレアーゼ消化に対するそのようなｍＲＮＡ耐性を改善するために行われる修飾を含む。
例示的な５’ＵＴＲには、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子（米国特許出願公開第２０１４／０２０６７５３号明細書及び同第２０１５／０１５７５６５号明細書（それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる））からの配列、又は米国特許出願公開第２０１６／０１５１４０９号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）において開示される配列番号４の配列が含まれる。
様々な実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲからのものであり得る。ＴＯＰ遺伝子は、典型的には、５’末端オリゴピリミジン（ＴＯＰ）トラクトの存在によって特徴付けられる。更に、ほとんどのＴＯＰ遺伝子は、成長関連翻訳調節によって特徴付けられる。しかしながら、組織特異的翻訳調節を有するＴＯＰ遺伝子も公知である。ある特定の実施形態では、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲからの５’ＵＴＲは、５’ＴＯＰモチーフ（オリゴピリミジントラクト）を欠く（例えば、米国特許出願公開第２０１７／００２９８４７号明細書、同第２０１６／０３０４８８３号明細書、同第２０１６／０２３５８６４号明細書、及び同第２０１６／０１６６７１０号明細書（それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる））。
ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、リボソームタンパク質ラージ３２（Ｌ３２）遺伝子からのものである（上記の米国特許出願公開第２０１７／００２９８４７号明細書）。
ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、ヒドロキシステロイド（１７－ｂ）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲからのものである（上記の米国特許出願公開第２０１６／０１６６７１０号明細書）。
ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＡＴＰ５Ａ１遺伝子の５’ＵＴＲからのものである（上記の米国特許出願公開第２０１６／０１６６７１０号明細書）。
いくつかの実施形態では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、５’ＵＴＲの代わりに使用される。
本発明で使用するために好適な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／０７５０４０号パンフレットに記載されている。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、国際公開第２０１２／０７５０４０号パンフレットの配列番号１に記載される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、国際公開第２０１２／０７５０４０号パンフレットの配列番号３に記載される核酸配列を含む。
典型的には、５’から３’まで、ｍＲＮＡ構築物は、段落［１１１］エラー！参照先が見つかりません、に記載される５’キャップ、段落［０１２４］に記載される５’ＵＴＲ、本発明による１つ以上のコード配列、段落［０１２４］に記載される３’ＵＴＲ、及び１００～５００ヌクレオチドのポリ（Ａ）テールを含む。
ヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然に存在するヌクレオシド（又は非修飾ヌクレオチド；すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジン、及びウリジン）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヌクレオチド類似体（例えば、アデノシン類似体、グアノシン類似体、シチジン類似体、又はウリジン類似体）などの１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。１つ以上のヌクレオシド類似体の存在は、ｍＲＮＡを、同じ配列を有するが天然に存在するヌクレオシドのみを含有する対照ｍＲＮＡより安定にし、且つ／又は免疫原性をより少なくし得る。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオシドの両方を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド類似体である。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾ヌクレオシドは、修飾糖、及び修飾ヌクレオ塩基から選択される少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾糖、及び対応する天然に存在するリボヌクレオチドに対する修飾ヌクレオ塩基から選択される少なくとも１つの修飾を含む。
修飾ヌクレオシドは、修飾ウリジン、シチジン、アデニン、又はグアニンであり得る。ｍＲＮＡ分子ちゅうのヌクレオシドのいくつかの例示的な化学修飾としては、例えば、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオシュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザシュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオアデニン、２－メトキシアデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ウイオシン、ウイブトシン、７－デアザグアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオグアノシン、６－チオ－７－デアザグアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチルグアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシグアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子中の修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン、４－チオ－ウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば、５－ヨードウリジン又は５－ブロモウリジン）、３－メチルウリジン、５－メトキシ－ウリジン、ウリジン－５－オキシ酢酸、ウリジン－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン、５－アミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－カルバモイルメチル－ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン、１－タウリノメチルシュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン、５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ、例えば、ヌクレオ塩基デオキシチミジンを有するもの）、１－メチル－シュードウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン）、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン、アルファ－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、及び５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンから選択される修飾ウリジンである。
いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジン、シュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５－アザ－シチジン、６－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミル－シチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－メチルシチジン、５－ハロシチジン（例えば、５－ヨードシチジン）、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチルシチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシシチジン、２－メトキシ－５－メチルシチジン、４－メトキシシュードイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジン、リシジン、アルファ－チオ－シチジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、１－チオ－シチジン、２’－Ｆ－アラ－シチジン、２’－Ｆシチジン、及び２’－ＯＨ－アラ－シチジンから選択される修飾シトシンである。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾ピリミジンヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオシドは、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシチジン、５－メトキシウリジン、及びこれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、シトシン及びウラシルの両方が、修飾ヌクレオシド（例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジン及び５－メチルシチジン）で置き換えられる。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノ－６－ハロプリン（例えば、２－アミノ－６－クロロプリン）、６－ハロプリン（例えば、６－クロロプリン）、２－アミノ－６－メチルプリン、８－アジドアデノシン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、２－メチルアデニン、Ｎ６－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－アセチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシアデニン、アルファ－チオ－アデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート）、２－アミノ－Ｎ６－メチルプリン、１－チオ－アデノシン、８－アジド－アデノシン、２’－Ｆ－アラ－アデノシン、２’－Ｆアデノシン、２’－ＯＨ－アラ－アデノシン、及びＮ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）アデノシンから選択される修飾アデニンである。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、イノシン、１－メチルイノシン、ウイオシン、メチルウイオシン、４－デメチルウイオシン、イソウイオシン、ウイブトシン、ペルオキシウイブトシン、ヒドロキシウイブトシン、中間体（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシウイブトシン、７－デアザ－グアノシン、キューオシン、エポキシキューオシン、ガラクトシルキューオシン、マンノシルキューオシン、７－シアノ－７－デアザ－グアノシン、７－アミノメチル－７－デアザ－グアノシン、アルカエオシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチルグアノシン、６－チオ－７－メチルグアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシグアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチル－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシン、アルファ－チオ－グアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、Ｎ２－メチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン、１－メチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン、Ｎ２，７－ジメチル－２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート）、１－チオ－グアノシン、Ｏ６－メチルグアノシン、２’－Ｆ－アラグアノシン、及び２’－Ｆグアノシンから選択される修飾グアニンである。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２－アミノアデノシン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、シュードウリジン（例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジン）、２－チオウリジン、及び２－チオシチジンから選択されるヌクレオシド類似体である。例えば、５－メチルシチジン、シュードウリジン、及び２－チオ－ウリジン並びにそれらのｍＲＮＡへの組み込みの議論については、米国特許第８，２７８，０３６号明細書又は国際公開第２０１１／０１２３１６号パンフレットを参照されたい。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンから選択される。
本発明で使用するためのｍＲＮＡにおいて、修飾ヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するヌクレオチドに取って代わる。したがって、本発明の１つ以上のｍＲＮＡは、非修飾ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドの両方を含み得る。そのようなｍＲＮＡは、典型的には、天然に存在するヌクレオチドの代わりにＩＶＴ反応混合物中に修飾ヌクレオチドを含めることによって調製することができる（例えば、ウリジンの代わりにＮ１－メチルシュードウリジン）。これにより、天然に存在するヌクレオチドの１００％が対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられる（例えば、ウリジンの１００％がＮ１－メチルシュードウリジンに置き換えられる）ｍＲＮＡがもたらされる。いくつかの実施形態では、天然に存在するヌクレオシドの一部のみ（例えば、天然に存在するヌクレオシドの少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％又は２５％）が、修飾ヌクレオシドで置き換えられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の天然に存在するヌクレオシドが、修飾リボヌクレオシドで置き換えられる。例えば、２つ以上のリボヌクレオシドは、修飾リボヌクレオシドであり得る（例えば、ウリジンは２－チオ－ウリジンで置き換えられてもよく、シチジンは５－メチルシチジンで置き換えられてもよい）。例えば、ウリジンの２５％が２－チオ－ウリジンで置き換えられてもよく、及び／又はシチジン残基の２５％が５－メチルシチジンで置き換えられてもよい。
最適化されたヌクレオチド配列の生成
いくつかの実施形態では、本発明で使用するための１つ以上のｍＲＮＡは、配列最適化されている。例えば、１つ以上のｍＲＮＡのコード配列は、（ａ）インビトロ合成中の完全長ｍＲＮＡの収率を改善するために、及び（ｂ）インビボでのｍＲＮＡの標的細胞への送達後のコードされたタンパク質の発現を最大化するために、それらの天然に存在する対応物に対して修飾され得る。標的細胞におけるｍＲＮＡの迅速な分解を促進する配列モチーフも除去されている。
最適化されたヌクレオチド配列を生成するプロセスは、最初にコドン最適化配列のリストを生成し、次いで３つのフィルターをリストに適用することを含み得る。具体的には、それは、モチーフ選別フィルター、グアニン－シトシン（ＧＣ）含量分析フィルター、及びコドン適応指数（ＣＡＩ）分析フィルターにかけられて、最適化されたヌクレオチド配列のリストの更新をもたらす。更新されたリストはもはや、効率的な転写及び／又はコードされたポリペプチドの翻訳に支障をきたすことが期待される特徴を含有するヌクレオチド配列を含む。
コドン最適化
遺伝子コードは、６４の可能なコドンを有する。各コドンは、３つのヌクレオチドの配列を含む。ゲノムのタンパク質コード領域における各コドンの使用頻度は、ゲノムのタンパク質コード領域内に特定のコドンが現れる事例の数を決定し、その後、得られた値をゲノムのタンパク質コード領域内で同じアミノ酸をコードするコドンの総数で除算することによって計算することができる。
コドン使用頻度表は、表が生成された特定の生物学的供給源について、各コドンがある特定のアミノ酸をコードするために使用される頻度に関する実験的に導出されたデータを含む。この情報は、コドンがそのアミノ酸をコードする総回数と比較して、そのコドンがある特定のアミノ酸をコードするために使用される頻度のパーセンテージ（０～１００％）又は分数（０～１）として、各コドンについて表される。
コドン使用頻度表は、コドン使用頻度データベース（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（１），２９２；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／にてオンラインで利用可能）、及びＨｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ－Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｔａｂｌｅｓ（ＨＩＶＥ－ＣＵＴｓ）データベース（Ａｔｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１７），ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １８（１），３９１；ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖｅ．ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｇｗｕ．ｅｄｕ／ｒｅｖｉｅｗ／ｃｏｄｏｎにてオンラインで利用可能）などの公的に利用可能なデータベースに格納されている。
コドン最適化の第１の工程中に、コドンが閾値使用頻度（例えば、１０％）未満のコドン使用頻度に関連付けられる場合、所与の生物（例えば、哺乳動物又はヒト）における各コドンの頻度を反映する第１のコドン使用頻度表からコドンが除去される。第１の工程で除去されなかったコドンのコドン使用頻度を正規化して、正規化されたコドン使用頻度表を生成する。目的のアミノ酸配列をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、正規化されたコドン使用頻度表における所与のアミノ酸に関連付けられた１つ以上のコドンの使用頻度に基づいて、アミノ酸配列中の各アミノ酸についてコドンを選択することによって生成される。所与のアミノ酸についてある特定のコドンを選択する確率は、正規化されたコドン使用頻度表におけるこのアミノ酸に関連付けられたコドンに関連する使用頻度に等しい。
本発明のコドン最適化配列は、最適化されたヌクレオチド配列を生成するためのコンピュータ実装方法によって生成される。本方法は、（ｉ）アミノ酸配列がペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードする、アミノ酸配列を受信することと、（ｉｉ）第１のコドン使用頻度表を受信することであって、第１のコドン使用頻度表がアミノ酸のリストを含み、表中の各アミノ酸が少なくとも１つのコドンに関連付けられ、各コドンが使用頻度に関連付けられる、第１のコドン使用頻度表を受信することと、（ｉｉｉ）コドン使用頻度表から閾値使用頻度未満である使用頻度に関連付けられた任意のコドンを除去することと、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で除去されなかったコドンの使用頻度を正規化することによって、正規化されたコドン使用頻度表を生成することと、（ｖ）正規化されたコドン使用頻度表中のアミノ酸に関連付けられた１つ以上のコドンの使用頻度に基づいて、アミノ酸配列中の各アミノ酸についてコドンを選択することによって、アミノ酸配列をコードする最適化されたヌクレオチド配列を生成することと、を含む。閾値使用頻度は、５％～３０％の範囲であり得、特に５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又３０％であり得る。本発明に関連して、閾値使用頻度は、典型的には１０％である。
正規化されたコドン使用頻度表を生成する工程は、（ａ）第１のアミノ酸に関連付けられ、且つ工程（ｉｉｉ）で除去された各コドンの使用頻度を、第１のアミノ酸に関連付けられた残りのコドンに分配することと、（ｂ）各アミノ酸について工程（ａ）を繰り返して、正規化されたコドン使用頻度表を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、除去されたコドンの使用頻度は、残りのコドン間で均等に分配される。いくつかの実施形態では、除去されたコドンの使用頻度は、残りの各コドンの使用頻度に基づいて、比例して残りのコドン間で分配される。この文脈における「分配される」は、ある特定のアミノ酸に関連付けられた除去されたコドンの使用頻度の合計のサイズを取り、この組み合わされた頻度の一部を、ある特定のアミノ酸をコードする残りのコドンのそれぞれに割り当てることとして定義され得る。
各アミノ酸についてコドンを選択する工程は、（ａ）正規化されたコドン使用頻度表において、アミノ酸配列の第１のアミノ酸に関連付けられた１つ以上のコドンを識別することと、（ｂ）第１のアミノ酸に関連付けられたコドンを選択することであって、ある特定のコドンを選択する確率が、正規化されたコドン使用頻度表中の第１のアミノ酸に関連付けられたコドンに関連する使用頻度に等しい、選択することと、（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を、アミノ酸配列中の各アミノ酸についてコドンが選択されるまで繰り返すことと、を含む。
アミノ酸配列中の各アミノ酸についてコドンを選択することによって最適化されたヌクレオチド配列を生成する工程（上記方法における工程（ｖ））をｎ回実行して、最適化されたヌクレオチド配列のリストを生成する。
モチーフスクリーニング
モチーフスクリーニングフィルターは、最適化されたヌクレオチド配列のリストに適用される。任意の既知のマイナスシス調節エレメント及びマイナス反復エレメントをコードする最適化されたヌクレオチド配列をリストから除去して、更新されたリストを生成する。
リスト中の各最適化されたヌクレオチド配列について、それが終止シグナルを含有するかどうかも決定される。１つ以上の終止シグナルを含有する任意のヌクレオチド配列は、更新されたリストを生成するリストから除去される。いくつかの実施形態では、終止シグナルは、以下のヌクレオチド配列を有する：５’－Ｘ１ＡＴＣＴＸ２ＴＸ３－３’（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧから独立して選択される）。いくつかの実施形態では、終止シグナルは、以下のヌクレオチド配列のうちの１つを有する：ＴＡＴＣＴＧＴＴ；及び／又はＴＴＴＴＴＴ；及び／又はＡＡＧＣＴＴ；及び／又はＧＡＡＧＡＧＣ；及び／又はＴＣＴＡＧＡ。典型的な実施形態では、終止シグナルは、以下のヌクレオチド配列を有する：５’－Ｘ１ＡＵＣＵＸ２ＵＸ３－３’（式中、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、Ａ、Ｃ、Ｕ又はＧから独立して選択される）。具体的な実施形態では、終止シグナルは、以下のヌクレオチド配列のうちの１つを有する：ＵＡＵＣＵＧＵＵ；及び／又はＵＵＵＵＵＵ；及び／又はＡＡＧＣＵＵ；及び／又はＧＡＡＧＡＧＣ；及び／又はＵＣＵＡＧＡ。
グアニン－シトシン（ＧＣ）含量
本方法は、最適化されたヌクレオチド配列の更新されたリスト中の最適化されたヌクレオチド配列の各々のグアニン－シトシン（ＧＣ）含量を決定することを更に含む。配列のＧＣ含量は、ヌクレオチド配列中のグアニン又はシトシンである塩基のパーセンテージである。最適化されたヌクレオチド配列のリストは、そのＧＣ含量が所定のＧＣ含量範囲外である場合、リストから任意のヌクレオチド配列を除去することによって更に更新される。
最適化されたヌクレオチド配列の各々のＧＣ含量を決定することは、各ヌクレオチド配列について、ヌクレオチド配列の１つ以上の追加部分のＧＣ含量を決定することを含み、追加部分が互いに第１の部分と重複しておらず、最適化された配列のリストを更新することが、任意の部分のＧＣ含量が所定のＧＣ含量範囲外にある場合、ヌクレオチド配列を除去することを含み、任意選択的に、任意の部分のＧＣ含量が所定のＧＣ含量の範囲外であると決定されると、ヌクレオチド配列のＧＣ含量の決定は停止される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の第１の部分及び／又は１つ以上の追加部分は、所定の数のヌクレオチドを含み、任意選択的に、所定の数のヌクレオチドは、５～３００ヌクレオチド、又は１０～２００ヌクレオチド、又は１５～１００ヌクレオチド、又は２０～５０ヌクレオチドの範囲である。本発明に関連して、所定の数のヌクレオチドは、典型的には３０ヌクレオチドである。所定のＧＣ含量範囲は、１５％～７５％、又は４０％～６０％、又は３０％～７０％であり得る。本発明に関連して、所定のＧＣ含量範囲は、典型的には３０％～７０％である。
本発明に関連する公的なＧＣ含量フィルターは、最初に、最適化されたヌクレオチド配列の最初の３０ヌクレオチド、すなわち、最適化されたヌクレオチド配列のヌクレオチド１～３０個を分析し得る。分析は、Ｇ又はＣのいずれかである部分中のヌクレオチドの数を決定することを含み得、部分のＧＣ含量を決定することは、部分のＧ又はＣヌクレオチドの数を部分のヌクレオチドの総数で除算することを含み得る。この分析結果は、Ｇ又はＣである部分におけるヌクレオチドの割合を表す値を提供し、パーセンテージ、例えば５０％、又は少数、例えば０．５であり得る。第１の部分のＧＣ含量が所定のＧＣ含量範囲外である場合、最適化されたヌクレオチド配列は、最適化されたヌクレオチド配列のリストから除去され得る。
第１の部分のＧＣ含量が所定のＧＣ含量範囲内にある場合、ＧＣ含量フィルターは、次いで、最適化されたヌクレオチド配列の第２の部分を分析し得る。この例では、これは、最適化されたヌクレオチド配列の第２の３０ヌクレオチド、すなわち３１～６０個のヌクレオチドであり得る。部分分析は、以下のいずれかまで、各部分について繰り返され得る：所定のＧＣ含量範囲外にあるＧＣ含量を有する部分が見出される場合には、最適化されたヌクレオチド配列がリストから除外され得るか、又は最適化されたヌクレオチド配列全体が分析されており、そのような部分が見出されない場合には、ＧＣ含量フィルターが、最適化されたヌクレオチド配列をリストにそのまま残し、リスト中の次の最適化されたヌクレオチド配列まで移動し得る。
コドン適応指数（ＣＡＩ）
本方法は、最適化されたヌクレオチド配列の最新の更新されたリスト中の最適化されたヌクレオチド配列の各々のコドン適応指数（ＣＡＩ）を決定することを更に含む。配列のＣＡＩは、コドン使用頻度バイアスの尺度であり、０～１の値であり得る。最適化されたヌクレオチド配列の最新の更新されたリストは、そのＣＡＩが所定のコドン適応指数閾値以下である場合、任意のヌクレオチド配列を除去することによって更に更新される。ＣＡＩ閾値は、０．７、又は０．７５、又は０．８、又は０．８５、又は０．９であり得る。本発明者らは、０．８以上のＣＡＩを有する最適化されたヌクレオチド配列が、非常に高いタンパク質収率をもたらすことを見出した。したがって、本発明に関連して、ＣＡＩ閾値は、典型的には０．８である。
コドン適応指数（ＣＡＩ）は、最適化されたヌクレオチド配列ごとに、例えば“Ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ－－ａ ｍｅａｓｕｒｅ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｂｉａｓ，ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ｓｈａｒｐ ａｎｄ Ｌｉ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５（３），ｐ．１２８１－１２９５）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３４０５２４／にてオンラインで利用可能）に記載されているように、当業者に明らかであろう任意の方法で計算され得る。
コドン適応指数（ＣＡＩ）計算の実行は、以下によるか、又はそれに類似する方法を含み得る。配列中の各アミノ酸について、配列中の各コドンの重量は、相対的適応性（ｗｉ）と呼ばれるパラメータによって表され得る。相対的適応性は、コドンｆｉの観察された頻度とそのアミノ酸についての最も頻繁な同義コドンｆｊの頻度との間の比として、参照配列セットから計算され得る。次いで、配列のＣＡＩは、配列の長さにわたる各コドンに関連付けられた重量の幾何平均として計算され得る（コドンで測定される）。ＣＡＩを算出するために使用される参照配列セットは、本発明の方法で使用されるコドン使用頻度表が導出されるのと同じ参照配列セットであり得る。
インビトロ転写
本発明のｍＲＮＡは、種々の公知の方法のいずれかに従って合成され得る。様々な方法が、公開されている米国特許出願公開第２０１８／０２５８４２３号明細書及び国際公開第２０１８／１５７１５３号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、本発明を実施するために使用することができる。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって合成され得る。手短に言えば、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、リボヌクレオチドトリホスフェートのプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含み得る緩衝液システム、並びに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ及び／又はＲＮａｓｅ阻害剤を含有する直鎖の若しくは環状ＤＮＡ鋳型又はＤＮＡベクターで行われる。正確な条件は、具体的な適用に応じて変わるであろう。
ＩＶＴによるｍＲＮＡの調製については、ＤＮＡ鋳型又はＤＮＡベクターがインビトロで転写され得る。公的なＤＮＡ鋳型又はＤＮＡベクターは、通常、インビトロ転写（ＩＶＴ）のためのプロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターに続いて、所望のｍＲＮＡ及び末端シグナル（ターミネーター）のための所望のヌクレオチド配列を有する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の最適化されたヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡをコードするＤＮＡベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターは、プロモーター及び／又はターミネーターを更に含む。一実施形態では、プロモーターは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。
合成後精製
合成後にｍＲＮＡを精製するために、様々な方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を使用して精製される。好適な精製方法としては、全てが参照により本明細書に組み込まれ、本発明を実践するために使用され得る米国特許出願公開第２０１６／００４０１５４号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０３７６２２０号明細書、米国特許出願公開第２０１８／０２５１７５５号明細書、米国特許出願公開第２０１８／０２５１７５４号明細書、２０１８年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７５７，６１２号明細書、及び２０１９年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８９１，７８１号明細書に記載されるものが挙げられる。ｍＲＮＡ製品の純度要件は、治療用途にはより厳格であるため、本発明のいくつかの実施形態で医薬組成物に含まれ得る本発明のｍＲＮＡを精製することが有利である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ付加及びテール付加の前に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ付加及びテール付加の後に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ付加及びテール付加の前及び後の両方で精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、遠心分離によって、キャップ付加及びテール付加の前若しくは後のいずれか又は前及び後の両方で精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、濾過によって、キャップ付加及びテール付加の前若しくは後のいずれか又は前及び後の両方で精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＴＦＦによって、キャップ付加及びテール付加の前若しくは後のいずれか又は前及び後の両方で精製される。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
本発明はまた、本発明で使用するための１つ以上のｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供する。典型的には、本発明で使用するために好適な脂質ナノ粒子は、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ並びに／又はコレステロール）、及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）を含む。
本発明で使用するための典型的な脂質ナノ粒子は、４つの脂質成分：カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫＥ１０、ＯＦ－０２又はＡＬＣ－０３１５）、非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ又はＤＳＰＣ）、コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ又は２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９））から構成される。カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロールとＰＥＧ修飾脂質のモル比は、典型的には、それぞれ約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５である。本発明による例示的なＬＮＰは、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＯＦ－０２及びＡＬＣ－０３１５から選択されるカチオン性脂質；ＤＯＰＥ及びＤＳＰＣから選択される非カチオン性脂質；コレステロールなどのコレステロール系脂質；並びにＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ及びＡＬＣ－０１５９などのＰＥＧ修飾脂質から構成され得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３つ以下の別個の脂質成分を含む。例示的な脂質ナノ粒子は、３つの脂質成分：カチオン性脂質（例えば、ステロール系カチオン性脂質）、非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ又はＤＥＰＥ）及びＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から構成される。具体的な実施形態では、３つの別個の脂質成分は、ＨＧＴ４００２、ＤＯＰＥ及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋである。例示的な実施形態では、ＨＧＴ４００２、ＤＯＰＥ及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋは、それぞれおよそ６０：３５：５のモル比で存在する。そのようなＬＮＰは、本発明のｍＲＮＡのエアロゾル送達に特に好適であり得る。
本発明において使用するための脂質ナノ粒子は、当該技術分野において現在知られている様々な技術によって調製され得る。そのような方法は、例えば、全てが参照により本明細書に組み込まれる、公開されている米国特許出願公開第２０１１／０２４４０２６号明細書、公開されている米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号明細書、公開されている米国特許出願公開第２０１８／０１５３８２２号明細書、公開されている米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号明細書及び２０１９年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７，５９７号明細書に記載されている。
カチオン性脂質
カチオン性脂質は、低ｐＨで正に帯電した環境を与えて、負に帯電したｍＲＮＡ原薬の効率的なカプセル封入を促進する。ＬＮＰにおける使用に好適な様々なカチオン性脂質が当該技術分野において公知である。これらには、例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２－ジオレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭ、及びＣ１２－２００が挙げられる。本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法において使用するために好適な例示的なカチオン性脂質が本明細書に記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１０／１４４７４０号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法において使用するための他の好適なカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１３／１４９１４０号パンフレットに記載されるとおりのイオン化できるカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式：
又はその薬学的に許容される塩（式中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素、任意選択により置換された、不定の飽和若しくは不飽和Ｃ１～Ｃ２０アルキル及び任意選択により置換された、不定の飽和若しくは不飽和Ｃ６～Ｃ２０アシルからなる群から選択され；Ｌ１及びＬ２は、各々独立して、水素、任意選択により置換されたＣ１～Ｃ３０アルキル、任意選択により置換された、不定の不飽和Ｃ１～Ｃ３０アルケニル、及び任意選択により置換されたＣ１～Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され；ｍ及びｏは、各々独立して、ゼロ及び任意の正の整数（例えば、ｍは３である）からなる群から選択され；且つｎはゼロ又は任意の正の整数（例えば、ｎは１である）である）のうちの１つのカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－ｌ－アミン（「ＨＧＴ５００１」）：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質及び（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００２」）：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法において使用するための他の好適なカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットにおいてアミノアルコールリピドイドとして記載されているカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法において使用するための他の好適なカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／１１８７２５号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法において使用するための他の好適なカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／１１８７２４号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法において使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、及びその薬学的に許容される塩が挙げられる。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質には、各々が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１３／０６３４６８号パンフレット及び国際特許公開第２０１６／２０５６９１号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式のカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩（式中、ＲＬのそれぞれの例は、独立して、任意選択により置換されたＣ６～Ｃ４０アルケニルである）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１５／１８４２５６号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式のカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩（式中、各Ｘは、独立して、Ｏ又はＳであり；各Ｙは、独立して、Ｏ又はＳであり；各ｍは、独立して、０～２０であり；各ｎは、独立して、１～６であり；各ＲＡは、独立して、水素、任意選択により置換されたＣ１～５０アルキル、任意選択により置換されたＣ２～５０アルケニル、任意選択により置換されたＣ２～５０アルキニル、任意選択により置換されたＣ３～１０カルボシクリル、任意選択により置換された３～１４員ヘテロシクリル、任意選択により置換されたＣ６～１４アリール、任意選択により置換された５～１４員ヘテロアリール又はハロゲンであり；且つ各ＲＢは、独立して、水素、任意選択により置換されたＣ１～５０アルキル、任意選択により置換されたＣ２～５０アルケニル、任意選択により置換されたＣ２～５０アルキニル、任意選択により置換されたＣ３～１０カルボシクリル、任意選択により置換された３～１４員ヘテロシクリル、任意選択により置換されたＣ６～１４アリール、任意選択により置換された５～１４員ヘテロアリール又はハロゲンである）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、「標的２３」：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１６／００４２０２号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０２０／０９７３８４号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式のカチオン性脂質：
、又はその薬学的に許容される塩（式中、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ又はＣ１～Ｃ６脂肪族であり；各ｍは、独立して、１～４の値を有する整数であり；各Ａは、独立して、共有結合又はアリーレンであり；各Ｌ１は、独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、又は無水物基であり；各Ｌ２は、独立して、Ｃ２～Ｃ１０脂肪族であり；各Ｘ１は、独立して、Ｈ又はＯＨであり；且つ各Ｒ３は、独立して、Ｃ６～Ｃ２０脂肪族である）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式のカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式のカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式のカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれるＪ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ，Ｃｅｌｌ ２０１０，１４１，２１０－２１７及びＷｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載されるとおりのカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１５／１９９９５２号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩より選択されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩より選択されてもよい。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１７／００４１４３号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１７／０７５５３１号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式のカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩（式中、Ｌ１又はＬ２のうちの１つは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、又は－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり；Ｌ１又はＬ２のうちの他のものは、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－若しくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、又は直接結合であり；Ｇ１及びＧ２は、各々独立して非置換Ｃ１～Ｃ１２アルキレン又はＣ１～Ｃ１２アルケニレンであり；Ｇ３は、Ｃ１～Ｃ２４アルキレン、Ｃ１～Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルケニレンであり；Ｒａは、Ｈ又はＣ１～Ｃ１２アルキルであり；Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、Ｃ６～Ｃ２４アルキル又はＣ６～Ｃ２４アルケニルであり；Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４又は－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；Ｒ４は、Ｃ１～Ｃ１２アルキルであり；Ｒ５は、Ｈ又はＣ１～Ｃ６アルキルであり；且つｘは、０、１又は２である）を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１７／１１７５２８号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１７／０４９２４５号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式のうちの１つの化合物：
、及びその薬学的に許容される塩を含む。これらの４つの式のいずれか１つに関して、Ｒ４は、独立して、－（ＣＨ２）ｎＱ及び－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択され；Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及び複素環からなる群から選択され；且つｎは、１、２、又は３である。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、各々が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１７／１７３０５４号パンフレット及び国際特許公開第２０１５／０９５３４０号パンフレットに記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／０８２，０９０号明細書に記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月１日に出願された米国仮特許出願第６３／００３，６９８号明細書に記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／０８２，１０１号明細書に記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／８６４，８１８号明細書に記載されるとおりのカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式に従う化合物構造を有するカチオン性脂質：
又はその薬学的に許容される塩（式中、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の各々は、独立してＣ６～Ｃ３０アルキル、Ｃ６～Ｃ３０アルケニル、又はＣ６～Ｃ３０アルキニルであり；Ｌ１は、Ｃ１～Ｃ３０アルキレン、Ｃ２～Ｃ３０アルケニレン、又はＣ２～Ｃ３０アルキニレンであり；且つＢ１は、イオン化可能な窒素含有基である）を含む。実施形態では、Ｌ１はＣ１～Ｃ１０アルキレンである。実施形態では、Ｌ１は、非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキレンである。実施形態では、Ｌ１は、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、又は（ＣＨ２）５である。実施形態では、Ｌ１は、（ＣＨ２）、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、又は（ＣＨ２）１０である。実施形態では、Ｂ１は、独立して、ＮＨ２、グアニジン、アミジン、モノ若しくはジアルキルアミン、５～６員窒素含有ヘテロシクロアルキル、又は５～６員窒素含有ヘテロアリールである。実施形態では、Ｂ１は
である。実施形態では、Ｂ１は
である。実施形態では、Ｂ１は
である。実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の各々は、独立して、非置換直鎖Ｃ６～Ｃ２２アルキル、非置換直鎖Ｃ６～Ｃ２２アルケニル、非置換直鎖Ｃ６～Ｃ２２アルキニル、非置換分岐Ｃ６～Ｃ２２アルキル、非置換分岐Ｃ６～Ｃ２２アルケニル、又は非置換分岐Ｃ６～Ｃ２２アルキニルである。実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の各々は、非置換Ｃ６～Ｃ２２アルキルである。実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の各々は、－Ｃ６Ｈ１３、－Ｃ７Ｈ１５、－Ｃ８Ｈ１７、－Ｃ９Ｈ１９、－Ｃ１０Ｈ２１、－Ｃ１１Ｈ２３、－Ｃ１２Ｈ２５、－Ｃ１３Ｈ２７、－Ｃ１４Ｈ２９、－Ｃ１５Ｈ３１、－Ｃ１６Ｈ３３、－Ｃ１７Ｈ３５、－Ｃ１８Ｈ３７、－Ｃ１９Ｈ３９、－Ｃ２０Ｈ４１、－Ｃ２１Ｈ４３、－Ｃ２２Ｈ４５、－Ｃ２３Ｈ４７、－Ｃ２４Ｈ４９、又は－Ｃ２５Ｈ５１である。実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の各々は、独立して、－Ｏ（ＣＯ）Ｒ５又は－Ｃ（Ｏ）ＯＲ５で置換されたＣ６～Ｃ１２アルキルである（式中、Ｒ５は、非置換Ｃ６～Ｃ１４アルキルである）。実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の各々は、非置換Ｃ６～Ｃ２２アルケニルである。実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の各々は、－（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）５ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）６ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）９ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１０ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１１ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１２ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１３ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１４ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１５ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１６ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１７ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１８ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３、－（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）８ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３、－（ＣＨ２）６ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３、－（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、－（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３、－（ＣＨ２）１１ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３、又は－（ＣＨ２）２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３である。実施形態では、前記Ｃ６～Ｃ２２アルケニルは、モノアルケニル、ジエニル、又はトリエニルである。実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の各々は、
である。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第２０１２／１７０８８９号パンフレットに記載されるとおりの切断可能なカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の式のカチオン性脂質：
を含み、式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジウム、アミノ、イミン、エナミン、任意選択により置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）及びピリジルからなる群から選択され；Ｒ２は、以下の２つの式：
のうちの１つからなる群から選択され、式中、Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、任意選択により置換された不定の飽和又は不飽和Ｃ６～Ｃ２０アルキル及び任意選択的に置換された、不定の飽和又は不飽和Ｃ６～Ｃ２０アシルからなる群から選択され；且つｎは、０又は任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）である。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、「ＨＧＴ４００１」：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、「ＨＧＴ４００２」：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、「ＨＧＴ４００３」：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、「ＨＧＴ４００４」：
及びその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、「ＨＧＴ４００５」：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法における使用のための他の好適なカチオン性脂質には、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１９／２２２４２４号パンフレットに記載されるとおりの切断可能なカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、一般式のいずれか又は国際特許公開第２０１９／２２２４２４号パンフレットに記載される構造（１ａ）～（２１ａ）及び（１ｂ）～（２１ｂ）及び（２２）～（２３７）のいずれかであるカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、式（Ｉ’）による構造を有するカチオン性脂質を含み、
式中、
ＲＸは、独立して、－Ｈ、－Ｌ１－Ｒ１、又は－Ｌ５Ａ－Ｌ５Ｂ－Ｂ’であり；
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３の各々は、独立して、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり；
各Ｌ４Ａ及びＬ５Ａは、独立して、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり；
各Ｌ４Ｂ及びＬ５Ｂは、独立して、Ｃ１～Ｃ２０アルキレン、Ｃ２～Ｃ２０アルケニレン、又はＣ２～Ｃ２０アルキニレンであり；
各Ｂ及びＢ’は、ＮＲ４Ｒ５又は５員～１０員窒素含有ヘテロアリールであり；
各Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ６～Ｃ３０アルキル、Ｃ６～Ｃ３０アルケニル、又はＣ６～Ｃ３０アルキニルであり；
各Ｒ４及びＲ５は、独立して、水素、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、又はＣ２～Ｃ１０アルキニルであり；且つ
各ＲＬは、独立して、水素、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ２～Ｃ２０アルケニル、又はＣ２～Ｃ２０アルキニルである。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有する、国際特許公開第２０１９／２２２４２４号パンフレットの化合物（１３９）であるカチオン性脂質を含む：
。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するＲＬ３－ＤＭＡ－０７Ｄであるカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するＲＬ２－ＤＭＰ－０７Ｄであるカチオン性脂質：
及びその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１０－ＤＳ－３－Ｅ１８－１（２－（４－（２－（（３－（ビス（（Ｚ）－２－ヒドロキシオクタデカ－９－エン－１－イル）アミノ）プロピル）ジスルファネイル（ｄｉｓｕｌｆａｎｅｙｌ））エチル）ピペラジン－１－イル）エチル４－（ビス（２－ヒドロキシデシル）アミノ）ブタノエート）を含む：
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０（２－（４－（２－（（３－（ビス（２－ヒドロキシデシル）アミノ）ブチル）ジスルファネイル）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブタノエート）を含む：
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－３－Ｅ１４（２－（４－（２－（（３－（ビス（２－ヒドロキシテトラデシル）アミノ）プロピル）ジスルファネイル）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブタノエート）を含む：
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号明細書）。本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法に好適な他のカチオン性脂質には、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（「ＤＯＧＳ」）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号明細書；米国特許第５，３３４，７６１号明細書）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、以下の構造を有するカチオン性脂質ＩＭ－００１を含む：
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号明細書）。本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法に好適な他のカチオン性脂質には、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（「ＤＯＧＳ」）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号明細書；米国特許第５，３３４，７６１号明細書）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）が挙げられる。
Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）（参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号明細書）。本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法に好適な他のカチオン性脂質には、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（「ＤＯＧＳ」）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号明細書；米国特許第５，３３４，７６１号明細書）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）が挙げられる。
本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法に好適な追加の例示的なカチオン性脂質にはまた、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）；１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）；１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）；Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－ｌ－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）；２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－ｌ－（シス，シス－９’，ｌ－２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）；２，３－ジリノレオイルオキシ－Ν，Ν－ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）；１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」）；２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）；（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，ｆｓｌ－ｄｉｍｅｔｈｙｈ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」）；及び２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ２－ジエン－１－イル）－ｌ，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）が挙げられる（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０／０４２８７７号パンフレット；Ｓｅｍｐｌｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０）を参照されたい）。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）；国際特許公開第２００５／１２１３４８号パンフレット）。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質の１つ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、又はグアニジウム部分の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物及び方法に好適な１つ以上のカチオン性脂質には、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＸＴＣ」）；（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（「ＡＬＮＹ－１００」）及び／又は４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド（「ＮＣ９８－５」）が挙げられる。
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＩＣＥ、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０８Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ、ＯＦ－０２、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＰ－Ｅ１８－２、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＥ－Ｅ１８－２、ＳＹ－３－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＨＥＰ－Ｅ３－Ｅ１０、ＨＥＰ－Ｅ４－Ｅ１０、ＲＬ３－ＤＭＡ－０７Ｄ、ＲＬ２－ＤＭＰ－０７Ｄ、ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１０、ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１２、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＳＩ－４－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＴＬ－１－１２Ｄ－ＤＭＡ、ＳＹ－０１０、ＳＹ－０１１、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、及び４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート（ＡＬＣ－０３１５）から選択される。
具体的な実施形態では、カチオン性脂質は、ｃＫＫＥ１０、ＯＦ－０２、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、及びＡＬＣ－０３１５から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物は、ＬＮＰ、組成物、医薬組成物中の総脂質内容物、例えば、脂質ナノ粒子の重量によって測定される少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、又は７０％を占める１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物は、ＬＮＰ、組成物、医薬組成物中の総脂質内容物、例えば、脂質ナノ粒子のｍｏｌ％として測定される少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、又は７０％を占める１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物は、ＬＮＰ、組成物、医薬組成物中の総脂質内容物、例えば、脂質ナノ粒子の重量によって測定される約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、又は約３５～４０％）を占める１つ以上のカチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰ、組成物、医薬組成物は、ＬＮＰ、組成物、医薬組成物中の総脂質内容物、例えば、脂質ナノ粒子のｍｏｌ％として測定される約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、又は約３５～４０％）を占める１つ以上のカチオン性脂質を含む。
非カチオン性脂質
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上の非カチオン性脂質を含有する。本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性、双性イオン又はアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、語句「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性は、ＬＮＰの構造的安定性を増強し、ｍＲＮＡペイロードの取り込み及び放出を改善し得る。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ｍＲＮＡペイロードの取り込み及び放出を増強させるための融合特性を有する双性イオン脂質である。非カチオン性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＯＣ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明で使用するのに好適な脂質ナノ粒子は、ＤＯＰＥを非カチオン性脂質成分として含む。他の実施形態では、本発明で使用するのに好適な脂質ナノ粒子は、ＤＥＰＥを非カチオン性脂質成分として含む。
特定の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＥＰＥ １，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、及びＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））から選択される。具体的な実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥ及び／又はＤＳＰＣから選択される。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、ＬＮＰ、組成物、医薬組成物が製剤化され、及び／又は投与される条件において正味の電荷を有さない脂質である。
コレステロール系脂質
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上のコレステロール系脂質を含む。コレステロール系脂質は、ナノ粒子内の脂質二重層構造に安定性を提供し得る。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質には、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、ｌ，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号明細書）、又は以下の構造を有する国際特許公開第２０１１／０６８８１０号パンフレットに開示されているとおりのイミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）が挙げられる：
。
実施形態では、コレステロール系脂質は、コレステロールである。
ＰＥＧ修飾脂質
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。ＰＥＧ化脂質は、ＬＮＰの粒径及び安定性に対する制御を提供し得る。そのような成分を添加することにより、複雑な凝集が防止され、循環寿命を延ばし、標的組織への脂質－核酸医薬組成物の送達を増大させるための手段を提供し得る（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６８ （１）：２３５－７）。これらの成分は、インビボで医薬組成物から迅速に交換されるように選択され得る（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号明細書を参照されたい）。
例えば、単独で又は好ましくは移送媒体（例えば、脂質ナノ粒子）を含む他の脂質医薬組成物とともに組み合わされた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質及びＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含む誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化された脂質の使用もまた本発明によって企図される。
企図されるＰＥＧ修飾脂質には、Ｃ６～Ｃ２０（例えば、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、又はＣ１８）の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合した長さが最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質又はＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロール又はＰＥＧ－２Ｋである。そのような成分の添加は、複雑な凝集を妨げる可能性があり、循環寿命を増大させ且つ脂質－核酸医薬組成物の標的組織への送達を増加させるための手段も提供し得るか（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５－２３７）、又はそれらは、インビボで医薬組成物から迅速に交換されるように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号明細書を参照されたい）。特に有用な交換し得る脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４又はＣ１８）を有するＰＥＧ－セラミドである。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）；１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＬＰＥ－ＰＥＧ）；又は１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－ポリエチレングリコール（ＤＳＧ－ＰＥＧ）である。
ＰＥＧは、典型的には高分子量、例えば、２０００～２４００ｇ／ｍｏｌを有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧ２０００（又はＰＥＧ－２Ｋ）である。特定の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＬＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＳＧ－ＰＥＧ２０００、又はＣ８ ＰＥＧ２０００である。
本発明で使用するために好適なＬＮＰには、典型的には、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）又は２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）などのＰＥＧ修飾脂質が挙げられる。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、モル比で総脂質の約４％を占める。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、モル比で総脂質の約５％を占める。いくつかの実施形態では、１種以上のＰＥＧ修飾脂質は、モル比によって総脂質の約６％を占める。肺送達などの特定の用途では、ＰＥＧ修飾脂質成分がモル比で総脂質の約５％を占める脂質ナノ粒子が特に好適であることが分かった。
例示的な脂質製剤
本発明で使用するための典型的なＬＮＰは、次の組み合わせ：カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質及び任意選択によるコレステロール：ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ｃＫＫ－Ｅ１０、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＯＦ－０２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００１、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＴＬ１－０８Ｄ－ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＩＣＥ、ＤＯＰＥ及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００１、ＤＯＰＥ及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００２、ＤＯＰＥ及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＳＹ－３－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＲＬ３－ＤＭＡ－０７Ｄ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＲＬ２－ＤＭＰ－０７Ｄ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１０、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；又はｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋのうちの１つから構成され得る。具体的な実施形態では、ＬＮＰは、ＳＹ－３－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから選択され得る。他の具体的な実施形態では、ＬＮＰは、ＲＬ３－ＤＭＡ－０７Ｄ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから構成され得る。更に他の具体的な実施形態では、ＬＮＰは、ＲＬ２－ＤＭＰ－０７Ｄ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから構成され得る。更に他の具体的な実施形態では、ＬＮＰは、ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１０、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから構成され得る。更に他の具体的な実施形態では、ＬＮＰは、ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから構成され得る。更に他の具体的な実施形態では、ＬＮＰは、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから構成され得る。
カチオン性脂質、ＰＥＧ化脂質、コレステロール系脂質、及び非カチオン性脂質のモル比は、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ（ここで、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＝１００％）である。いくつかの実施形態では、総脂質に対するＬＮＰ中のカチオン性脂質のモル比（すなわち、Ａ）は、３５～４５％（例えば、３８～４２％、例えば、４０％）である。いくつかの実施形態では、総脂質に対するＰＥＧ化脂質成分のモル比（すなわち、Ｂ）は、０．２５～２．７５％（例えば、１～２％、例えば、１．５％）である。いくつかの実施形態では、総脂質に対するコレステロール系脂質のモル比（すなわち、Ｃ）は、２０～３５％（例えば、２７～３０％、例えば、２８．５％）である。いくつかの実施形態では、総脂質に対する非カチオン性脂質のモル比（すなわち、Ｄ）は、２５～３５％（例えば、２８～３２％、例えば、３０％）である。いくつかの実施形態では、（ＰＥＧ化脂質＋コレステロール）成分は、ヘルパー脂質と同じモル量を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１超である、カチオン性脂質とヘルパー脂質とのモル比を含有する。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ、ＯＦ－０２、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、ＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０８Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＩＣＥ、ＨＧＴ４００１、及び／又はＨＧＴ４００２）は、モル比で脂質ナノ粒子の約３０～６０％（例えば、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、又は約３５～４０％）を占める。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ、ＯＦ－０２、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、ＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０８Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＩＣＥ、ＨＧＴ４００１、及び／又はＨＧＴ４００２）のパーセンテージは、モル比で脂質ナノ粒子の約３０％超、約３５％超、約４０％超、約４５％、約５０％超、約５５％超、又は約６０％超である。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質との比は、モル比で約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質との比は、モル比でおよそ４０：３０：２０：１０である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質との比は、モル比でおよそ４０：３０：２５：５である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質との比は、モル比でおよそ４０：３２：２５：３である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質との比は、モル比でおよそ５０：２５：２０：５である。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰは、３５％～５５％のモル比のカチオン性脂質（例えば、ＯＦ－０２、ｃＫＫ－Ｅ１０、又はＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０）；５％～４０％のモル比の非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ）；２０％～４５％のモル比のコレステロール系脂質（例えば、コレステロール）；及び１％～２％のモル比のＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）を含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比は、４０：３０：２８．５：１．５である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比は、４６．３：９．４：４２．７：１．６である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比は、５０：１０：３８．５：１．５である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４０％のモル比のＯＦ－０２、ｃ－ＫＫ－Ｅ１０、又はＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０；３０％のモル比のＤＯＰＥ；２８．５％のモル比のコレステロール；及び１．５％のモル比のＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４６．３％のモル比のＡＬＣ－０３１５；９．４％のモル比のＤＳＰＣ；４２．７％のモル比のコレステロール；及び１．６％のモル比のＡＬＣ－０１５９を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０％のモル比のＳＭ－１０２；１０％のモル比のＤＳＰＣ；３８．５％のモル比のコレステロール；及び１．５％のモル比のＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。そのような脂質ナノ粒子は、筋肉内投与によるｍＲＮＡの送達に特に好適である。
本発明での使用に好適な典型的な三成分脂質ナノ粒子において、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とＰＥＧ修飾脂質とのモル比は、それぞれ約５５～６５：３０～４０：１～１５であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ステロール系脂質）と非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ又はＤＥＰＥ）とＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）の６０：３５：５のモル比が、例えば、噴霧による脂質ナノ粒子の肺送達に特に好適である。
１つ以上のＬＮＰ
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、複数のタンパク質、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のタンパク質をコードするｍＲＮＡを担持し得る。例えば、ＬＮＰは、複数のインフルエンザウイルスタンパク質に翻訳され得るポリシストロニックなｍＲＮＡ（例えば、バイシストロニックなｍＲＮＡ）を担持し得る（例えば、各タンパク質コード配列は、ＩＲＥＳをコードするヌクレオチド配列又は２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドによって分離される）。典型的には、ポリシストロニックなｍＲＮＡは、３つ以下又は４つ以下のタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、１つのｍＲＮＡは、ＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質をコードする。例えば、１つ以上のＨＡタンパク質及び１つ以上のＮＡタンパク質が、同じｍＲＮＡによってコードされてもよい。具体的な実施形態では、ＨＡ及びＮＡタンパク質の両方をコードするｍＲＮＡは、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡとは別個である。
いくつかの実施形態では、１つのｍＲＮＡは、Ａ型インフルエンザ株からの１つ以上のＨＡタンパク質及び１つ以上のＮＡタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ａ型インフルエンザのコードされたＨＡ及びＮＡタンパク質は、同じｍＲＮＡによってコードされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｂ型インフルエンザ株からの１つ以上のＨＡタンパク質及び１つ以上のＮＡタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ｂ型インフルエンザのコードされたＨＡ及びＮＡタンパク質は、同じｍＲＮＡによってコードされる。一実施形態では、１つ以上のＨＡタンパク質及び１つ以上のＮＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ株とＢ型インフルエンザ株との組み合わせからのものであり、同じｍＲＮＡからコードされる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、第１のＨＡタンパク質及び第１のＮＡタンパク質をコードする第１のｍＲＮＡと、第２のＨＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする第３のｍＲＮＡとを含む。典型的には、第１のＨＡタンパク質及び第１のＮＡタンパク質は、第１のインフルエンザウイルスからのものであり（例えば、インフルエンザＡ型からのＨ１及びＮ１）、第２のＨＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質は、第２のインフルエンザウイルスからのものである（例えば、インフルエンザＡ型からのＨ３及びＮ２）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のインフルエンザウイルスは、異なる亜型のＡ型インフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のウイルスは、異なる系統のＢ型インフルエンザウイルスである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、第３のインフルエンザウイルスからの第３のＨＡタンパク質及び第３のＮＡタンパク質をコードする第４のｍＲＮＡと、第４のインフルエンザウイルスからの第４のＨＡタンパク質及び第４のＮＡタンパク質をコードする第５のｍＲＮＡとを更に含む。第３のインフルエンザウイルスは、典型的には、山形系統のウイルスのＢ型インフルエンザウイルスであり、第４のインフルエンザウイルスはビクトリア系統からのものである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも第１のＨＡタンパク質及び第２のＨＡタンパク質をコードする第１のｍＲＮＡと、少なくとも第１のＮＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする第３のｍＲＮＡとを含む。典型的には、第１のＨＡタンパク質及び第２のＨＡタンパク質（並びに任意の更なるＨＡタンパク質）は、異なる亜型（例えば、Ａ型インフルエンザからのＨ１及びＨ３）並びに／又は系統からのものであり、第１のＮＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質（並びに任意の更なるＮＡタンパク質）は、異なる亜型（例えば、Ａ型インフルエンザからのＮ１及びＮ２）並びに／又は系統からのものである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、第３のインフルエンザウイルスからの第３のＨＡタンパク質及び第３のＮＡタンパク質をコードする第４のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のインフルエンザウイルスはＨ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルスであり、第２のインフルエンザウイルスはＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスであり、第３のインフルエンザウイルスはＢ型インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＢ／山形又はインフルエンザＢ／ビクトリア）である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、第４のインフルエンザウイルスからの第４のＨＡタンパク質及び第４のＮＡタンパク質をコードする第５のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第４のインフルエンザウイルスは、第３のインフルエンザウイルスのものとは異なる系統からのＢ型インフルエンザウイルスである。
いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のｍＲＮＡは第１のＬＮＰ中に封入され、第４及び第５のｍＲＮＡは第２のＬＮＰ中に封入される。第２のＬＮＰは、第６のｍＲＮＡを追加的に含み得る。いくつかの実施形態では、第６のｍＲＮＡは、Ｍ１タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、第６のｍＲＮＡによってコードされるＭ１タンパク質は、Ｂ型インフルエンザウイルスからのものである。
いくつかの実施形態では、Ｍ１、ＨＡ、及びＮＡタンパク質は、各々別個のｍＲＮＡによってコードされ、全てのｍＲＮＡが単一のＬＮＰ中に封入される。例えば、ＬＮＰは、（ｉ）２つ以上のＨＡタンパク質、及び／又は（ｉｉ）２つ以上のＮＡタンパク質、又は（ｉｉｉ）少なくとも１つのＨＡタンパク質及び少なくとも１つのＮＡタンパク質をコードする３、４、５、６、７、８、９個、又はそれ以上のｍＲＮＡ分子を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＨＡタンパク質（例えば、Ｈ１及びＨ３）をコードする２つのｍＲＮＡと、ＮＡタンパク質（例えば、Ｎ１及びＮ２）をコードする２つのｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＨＡタンパク質（例えば、Ｈ１、Ｈ３、及びＢ型インフルエンザのＨＡ）をコードする３つのｍＲＮＡと、ＮＡタンパク質（例えば、（Ｎ１、Ｎ２、及びＢ型インフルエンザのＨＡ）をコードする３つのｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＨＡタンパク質（例えば、２つのＡ型インフルエンザのＨＡ及び２つのＢ型インフルエンザのＨＡ）をコードする４つのｍＲＮＡと、ＮＡタンパク質（例えば、２つのＡ型インフルエンザのＨＡ及び２つのＢ型インフルエンザのＨＡ）をコードする４つのｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡとを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、Ａ型インフルエンザのＨＡタンパク質（例えば、Ｈ１又はＨ３）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、Ａ型インフルエンザのＮＡタンパク質（例えば、Ｎ１又はＮ２）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＡとを含み、ＨＡ ｍＲＮＡ、ＮＡ ｍＲＮＡ及びＭ１ ｍＲＮＡは、４０～５０：１０～５０：３０～５０（例えば、４０：１０：５０、４０：４０：５０、又は５０：１０：３０）のモル比で存在する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、Ｂ型インフルエンザのＨＡタンパク質（例えば、山形又はビクトリア）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、Ｂ型インフルエンザのＮＡタンパク質（例えば、山形又はビクトリア）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡとを含み、Ａ ｍＲＮＡ、ＮＡ ｍＲＮＡ及びＭ１ ｍＲＮＡは、４０～５０：１０～５０：３０～５０（例えば、４０：１０：５０。４０：４０：５０、又は５０：１０：３０）のモル比で存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、Ａ型インフルエンザのＨＡタンパク質（例えば、Ｈ１又はＨ３）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、Ａ型インフルエンザのＮＡタンパク質（例えば、Ｎ１又はＮ２）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡとを含む第１のＬＮＰであって、ＨＡ ｍＲＮＡ、ＮＡ ｍＲＮＡ及びＭ１ ｍＲＮＡが、４０～５０：１０～５０：３０～５０（例えば、４０：１０：５０。４０：４０：５０、又は５０：１０：３０）のモル比で存在する、第１のＬＮＰと、Ｂ型インフルエンザのＨＡタンパク質（例えば、山形又はビクトリア）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、Ｂ型インフルエンザのＮＡタンパク質（例えば、山形又はビクトリア）をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡとを含む第２のＬＮＰであって、ＨＡ ｍＲＮＡ、ＮＡ ｍＲＮＡ及びＭ１ ｍＲＮＡが、４０～５０：１０～５０：３０～５０（例えば、４０：１０：５０、４０：４０：５０、又は５０：１０：３０）のモル比で存在する、第２のＬＮＰとを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、Ａ型インフルエンザのＨＡタンパク質（例えば、Ｈ１及びＨ３）をコードする２つのｍＲＮＡと、Ａ型インフルエンザのＮＡタンパク質（例えば、（Ｎ１及びＮ２）をコードする２つのｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡとを含み、ＨＡ ｍＲＮＡ及びＮＡ ｍＲＮＡが、４０：１０若しくは５０：１０のモル比で、又は等しいモル比で存在する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、Ｂ型インフルエンザのＨＡタンパク質（例えば、Ｈ１及びＨ３）をコードする２つのｍＲＮＡと、Ｂ型インフルエンザのＮＡタンパク質（例えば、（Ｎ１及びＮ２）をコードする２つのｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡとを含み、ＨＡ ｍＲＮＡ及びＮＡ ｍＲＮＡが、４０：１０若しくは５０：１０のモル比で、又は等しいモル比で存在する。
いくつかの実施形態では、Ｍ１、ＨＡ、及びＮＡタンパク質は、各々別個のｍＲＮＡによってコードされ、各ｍＲＮＡはＬＮＰ中に別個に封入される。
いくつかの実施形態では、同じインフルエンザウイルスに由来するｍＲＮＡのセットは、単一のＬＮＰ中で製剤化され得る。例えば、第１のＡ型インフルエンザウイルスからのＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡの第１のセットは、第１のＬＮＰ中に封入され得る。第２のＡ型インフルエンザウイルスからのＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡの第２のセットは、第２のＬＮＰ中に封入され得る。Ｂ型インフルエンザウイルスからのＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡの第３のセットは、第３のＬＮＰ中に封入される。ｍＲＮＡの各セットは、ＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡと、ＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡと、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡとを含み得る。Ｍ１タンパク質は、各セットについて同じであってもよい。いくつかの実施形態では、ＨＡ及びＮＡタンパク質は、同じｍＲＮＡによってコードされ得る。第１、第２及び第３のＬＮＰは、各々同じ脂質組成を有し得る。いくつかの実施形態では、第１、第２及び第３のＬＮＰは、異なる脂質組成を有する。
いくつかの実施形態では、第３のセットにおけるｍＲＮＡによってコードされるＨＡ及びＮＡタンパク質のものとは異なる系統のＢ型インフルエンザからのＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡの第４のセットは、第４のＬＮＰ中に封入される。第１、第２、第３及び第４のＬＮＰは、各々同じ脂質組成を有し得る。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３及び第４のＬＮＰは、異なる脂質組成を有する。
いくつかの状況では、第１及び第２のＡ型インフルエンザからのＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡを第１のＬＮＰ中に封入し、且つ１つ以上のＢ型インフルエンザからのＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡを第２のＬＮＰ中に封入することが便利であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの第１及び第２のセットが第１のＬＮＰ中に封入され、ｍＲＮＡの第３のセット及び任意選択的に第４のセットが第２のＬＮＰ中に封入される。第１及び第２のＬＮＰは、同じ脂質組成を有し得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＬＮＰは、異なる脂質組成を有する。
ポリマー
いくつかの実施形態では、好適なＬＮＰ送達ビヒクルは、単独で又は本明細書に記載の様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて、担体としてポリマーを使用して製剤化される。したがって、いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、本明細書で使用される場合、ポリマーを含むナノ粒子も包含する。好適なポリマーとしては、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられ得る。ＰＥＩが存在するとき、それは、１０～４０ｋＤａの範囲の分子量の分岐ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａ分岐ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ ＃４０８７２７）であり得る。
組成物
いくつかの実施形態では、本発明による組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも０．７ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも０．８ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも０．９ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬの濃度である。典型的な実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．６ｍｇ／ｍＬ～約０．８ｍｇ／ｍＬの濃度である。
典型的には、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）中のｍＲＮＡは、ＬＮＰ中に封入される。ｍＲＮＡ又はそれを封入するＬＮＰを安定化させるため、又はｍＲＮＡのインビボ発現を増強させるために、本発明の組成物は、１つ以上の担体、安定化試薬又は他の賦形剤とともに製剤化され得る。そのような組成物は、医薬組成物であり得、したがって、それらは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。１つ以上の薬学的に許容される賦形剤は、緩衝液、糖、塩、界面活性剤又はそれらの組み合わせから選択され得る。
薬学的に許容される賦形剤
いくつかの実施形態では、医薬組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、希釈剤とともに製剤化され得る。いくつかの実施形態では、希釈剤は、エチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール、スクロース、トレハロース、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、希釈剤は、二糖（例えば、トレハロース又はスクロース）である。いくつかの実施形態では、製剤は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％の希釈剤を含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、二糖を含む水溶液中に懸濁される。本明細書で使用するために好適な二糖には、トレハロース及びスクロースが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、トレハロース、例えば、水中１０％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む水溶液中に懸濁される。他の実施形態では、ＬＮＰは、スクロース、例えば、水中１０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む水溶液中に懸濁される。
いくつかの実施形態では、水溶液は、緩衝液、塩、界面活性剤、又はそれらの組み合わせを更に含む。
いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、及びＣａＣｌ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩は、ＫＣｌである。いくつかの実施形態では、塩は、ＣａＣｌ２である。いくつかの実施形態では、塩は、ＫＣｌとＮａＣｌとの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、ヒスチジン緩衝液、及びグッド緩衝液からなる群から選択される。したがって、いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、クエン酸緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、イミダゾール緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジン緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、グッド緩衝液である。いくつかの実施形態では、グッド緩衝液は、トリス緩衝液又はＨＥＰＥＳ緩衝液である。
特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液（例えば、クエン酸－リン酸緩衝液）、トリス緩衝液（例えば、ＴｒｉｓＨＣｌ）、又はイミダゾール緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸緩衝液であるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、緩衝液及び塩（典型的には、二糖又は任意選択的にプロピレングリコールなどの好適な希釈剤に加えて）を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液及び塩の総濃度は、約４０ｍＭのトリス緩衝液及び７５～１２５ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭのトリス緩衝液及び５０ｍＭ～１００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭのトリス緩衝液及び約１００ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭのイミダゾール及び約１００ｍＭ～１２５ｍＭのＮａＣｌ、並びに約５０ｍＭのイミダゾール及び約７５ｍＭ～１００ｍＭのＮａＣｌから選択される。
いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、緩衝液（例えば、リン酸又はトリス）、塩（例えば、ＫＣｌ若しくはＮａＣｌ、又はその両方）、及び糖（例えば、スクロース又はトレハロースなどの二糖）を含む。特定の実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、緩衝液、塩及び糖を含む水溶液（例えば、注射用水を含む）である。追加の賦形剤には、（例えば、組成物のｐＨを調製するための）ＮａＯＨ又はＨＣｌが含まれ得る。
脂質ナノ粒子製剤
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）中のＬＮＰの大部分、すなわちＬＮＰの約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超は、約１５０ｎｍ（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、又は約８０ｎｍ）のサイズを有する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物中のＬＮＰは、約１５０ｎｍ以下（例えば、約１４５ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１３５ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１２５ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１１５ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、約１０５ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約９５ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約８５ｎｍ以下、又は約８０ｎｍ以下）のサイズを有する。具体的な実施形態では、ＬＮＰは、７０ｎｍ～約１５０ｎｍのサイズである。
いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）中のＬＮＰの約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超は、約４０～９０ｎｍ（例えば、約４５～８５ｎｍ、約５０～８０ｎｍ、約５５～７５ｎｍ、約６０～７０ｎｍ）の範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４０～９０ｎｍ（例えば、約４５～８５ｎｍ、約５０～８０ｎｍ、約５５～７５ｎｍ、約６０～７０ｎｍ）の範囲のサイズを有する。約５０～７０ｎｍ（例えば、５５～６５ｎｍ）の平均サイズを有するＬＮＰを有する組成物は、噴霧又は吸入による送達に特に好適であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明によって提供される医薬組成物中の脂質ナノ粒子の分散度、又は分子のサイズの不均一性の尺度（多分散指数；ＰＤＩ）は、約０．５未満である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．５未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．４未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．３未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．２８未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．２５未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．２３未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．２０未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．１８未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．１６未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．１４未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．１２未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．１０未満のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．０８未満のＰＤＩを有する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約８０％を超えるｍＲＮＡカプセル封入効率を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約８５％を超えるｍＲＮＡカプセル封入効率を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約９０％を超えるｍＲＮＡカプセル封入効率を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約９２％を超えるｍＲＮＡカプセル封入効率を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約９５％を超えるｍＲＮＡカプセル封入効率を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約９８％を超えるｍＲＮＡカプセル封入効率を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約９９％を超えるｍＲＮＡカプセル封入効率を有する。典型的には、本発明で使用するためのＬＮＰは、少なくとも９０％～９５％のｍＲＮＡカプセル封入効率を有する。
治療有効量
本発明によるｍＲＮＡは、本明細書に提供される医薬組成物、免疫原性組成物又はワクチンにおいて治療有効量で提供される。本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は主として、本発明の医薬組成物中に含有される治療剤の総量に基づいて決定される。一般に、治療有効量は、対象に意味のある利益を達成するのに十分なものである。
いくつかの実施形態では、単一バイアル用量は、１～５０μｇのｍＲＮＡ（例えば、一価又は多価）を含有する。例えば、単回用量バイアル又はシリンジは、典型的には、筋肉内注射により、又は粘膜送達により投与される、約２．５μｇ、約５μｇ、約７．５μｇ、約１０μｇ、約１２．５μｇ、又は約１５μｇのｍＲＮＡを含有し得る。
パッケージング
本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、非経口（例えば、筋肉内、皮内若しくは皮下）投与又は粘膜（例えば、鼻咽頭、肺若しくは鼻腔内）投与のために包装され得る。ワクチン組成物は、即時製剤の形態、例えば、使用直前に生理学的緩衝液（例えば、ＰＢＳ）で再構成する必要がある凍結乾燥形態であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、水溶液又は冷凍水溶液の形態で提供することができ、再構成なしで対象に直接投与することができる（予め冷凍されている場合には解凍後）。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、別個のｍＲＮＡ、例えば、ＨＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、ＮＡタンパク質をコードする１つのｍＲＮＡ、及びＭ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＨＡ ｍＲＮＡ、ＮＡ ｍＲＮＡ及びＭ１ ｍＲＮＡは、１：１：２の重量比で提供される。いくつかの実施形態では、ＨＡ ｍＲＮＡ、ＮＡ ｍＲＮＡ及びＭ１ ｍＲＮＡは、同じ脂質ナノ粒子中に封入される。
いくつかの実施形態では、組成物は多価であり、例えば、各々が異なるインフルエンザウイルスからのＨＡ ｍＲＮＡ、ＮＡ ｍＲＮＡ、及びＭ１ ｍＲＮＡを含む複数のセットを含む。例えば、四価組成物は、ｍＲＮＡの４つのセット、例えばＡ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）からのｍＲＮＡの第１のセット、Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）からのｍＲＮＡの第２のセット、Ｂ型インフルエンザウイルス（Ｂ／山形）からのｍＲＮＡの第３のセット、及びＢ型インフルエンザウイルス（Ｂ／ビクトリア）からの第４のセットを含み得る。ｍＲＮＡの各セットは、同じ脂質ナノ粒子中に封入され得る。いくつかの実施形態では、各セット中のＨＡ ｍＲＮＡ、ＮＡ ｍＲＮＡ及びＭ１ ｍＲＮＡは、１：１：２の重量比で提供される。
したがって、本開示は、単一容器中で本発明の組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）を提供するか、又はある容器中で組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）を提供し、別の容器中で再構成用の生理学的緩衝液を提供する製造品、例えばキットを提供する。容器は、単回使用投与量又は複数回使用投与量を含有し得る。容器は、前処理されたガラスバイアル又はアンプルであり得る。製造品は、使用説明書も含み得る。
特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、筋肉内注射での使用のために提供される。組成物は対象に、例えば、対象の上腕の三角筋で注射することができる。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、充填済みシリンジ又は注射器（例えば、シングルチャンバー型又はマルチチャンバー型）中で提供される。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、粘膜投与による（例えば、鼻腔内スプレーとして、又は舌下で）使用のために提供される。いくつかの実施形態では、組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、吸入による（例えば、肺送達のための）使用のために提供され、充填済みポンプ、エアロゾル発生器、又は吸入器で提供される。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）は、皮膚注射、例えば、皮膚の表皮、真皮、又は皮下における使用のために提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、針（例えば、表皮針、真皮針又は皮下針）、無針デバイス、マイクロニードルデバイス、又はマイクロプロジェクションアレイデバイスなどの皮膚注射に好適なデバイス内に提供される。皮膚注射に適したマイクロニードル又はマイクロプロジェクションアレイデバイスの例は、米国特許出願公開第２０２３０２７０８４２Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０２２０３３９４１６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０２１００８５５９８Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０２００２４６４５０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０２２０１４３３７６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２６４２４４Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２６３６４１Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１１０２４５７７６Ａ１号明細書に記載されている。
治療的使用
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において免疫応答を誘発させる方法であって、有効量の本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象において免疫応答を誘発させるための本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、医薬品を製造する方法における本発明の組成物の使用であって、組成物が、対象において免疫応答を誘発させるための（例えば、誘発させるために製剤化される）ものである。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、対象における１つ以上のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発させる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発させる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発させる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発させる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、異なる亜型及び／又は系統のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発させる。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、予防的に投与される。いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるインフルエンザ感染の重症度を低下させる方法であって、有効量の本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるインフルエンザ感染の１つ以上の症状の重症度を低下させるのに使用するための、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、医薬品を製造する方法における本発明の組成物の使用であって、組成物が、対象におけるインフルエンザ感染の１つ以上の症状の重症度を低下させるための（例えば、そのために製剤化される）ものである、使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルスによる感染の１つ以上の症状の重症度を低下させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、異なる亜型及び／又は系統のインフルエンザウイルスによる感染の１つ以上の症状の重症度を低下させる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるインフルエンザ感染を予防する方法であって、有効量の本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるインフルエンザ感染の予防に使用するための本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、医薬品を製造する方法における本発明の組成物の使用であって、組成物が、対象におけるインフルエンザ感染を予防するための（例えば、そのために製剤化される）ものである、使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス及び／又はＢ型インフルエンザウイルスによる感染を予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、異なる亜型及び／又は系統のインフルエンザウイルスによる感染を予防する方法を提供する。
様々な実施形態では、本明細書に提供される免疫化の方法は、１つ以上のインフルエンザウイルスに対する広範な中和免疫応答を誘発させる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、抗体応答を含む。したがって、様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物は、様々な型のインフルエンザウイルスに対して広範な交差防御を提供し得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、鳥、ブタ、季節性及び／又はパンデミックインフルエンザウイルスに対する交差防御を提供する。
いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上のＡ型インフルエンザ若しくはＢ型インフルエンザ及び／又はＡ型インフルエンザの１つ以上の亜型若しくはＢ型インフルエンザの系統、特に季節性株に対する交差防御を提供する。いくつかの実施形態では、本組成物は、季節性インフルエンザウイルスの複数の株に対する交差防御を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本組成物は、季節性Ａ型インフルエンザＨ１亜型ウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１）、季節性Ａ型インフルエンザＨ３亜型ウイルス（例えば、Ｈ３Ｎ２）、及び１つ又は両方の循環Ｂ型インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＢ／山形及び／又はインフルエンザＢ／ビクトリア）に対する交差防御を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１つ以上のパンデミックインフルエンザ株に対して改善された免疫応答を誘発させることができる。パンデミック亜型としては、特に、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ９及びＨ１０Ｎ７亜型が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１つ以上のブタインフルエンザ株に対する改善された免疫応答を誘発させることができる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の鳥インフルエンザ株に対する改善された免疫応答を誘発させることができる。例示的な鳥株としては、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、及びＨ９Ｎ２が挙げられるが、これらに限定されない。追加のインフルエンザパンデミック、季節性、鳥及び／又はブタ株が、当該技術分野において公知である。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、免疫原性組成物又はワクチン）の投与は、Ａ型株及び／又はＢ型株によって引き起こされるインフルエンザ感染に対する免疫を提供する。いくつかの実施形態では、投与は、同じ型のインフルエンザ（例えば、Ａ型又はＢ型）の複数の亜型（例えば、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）又は系統（ビクトリア及び山形）によって引き起こされる感染に対する免疫を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上のＡ型インフルエンザの亜型に対する免疫が提供される。いくつかの実施形態では、１つ以上の（例えば、２つの）Ａ型インフルエンザの亜型（例えば、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）並びにＢ型インフルエンザの１つ以上の系統（例えば、ビクトリア及び／又は山形）に対して免疫が提供される。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、季節性及び／若しくはパンデミックインフルエンザワクチンとして、又は長期的な（複数季節）防御を付与することを意図したインフルエンザワクチン接種レジメンの一部として使用される。
本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、それを必要とする対象に、治療有効量、すなわち、十分な時間（例えば、１年、２年、５年、１０年、又は生涯）にわたって標的病原体に対する十分な免疫防御を提供する量で投与され得る。十分な免疫防御は、例えば、病原体による感染に伴う症状の予防又は緩和であり得る。いくつかの実施形態では、所望の治療効果を達成するためにワクチンの複数回用量（例えば、２回用量）が、それを必要とする対象に注射される。用量（例えば、初回用量及び追加用量）は、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、又は１０年の間隔で分けられ得る。
代替的な実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、インフルエンザ症状及び／又は対象がインフルエンザ感染を有することが確認された後に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、インフルエンザ感染に罹患しているか、又は罹患しやすい。いくつかの実施形態では、対象が、インフルエンザ感染に一般的に関連する１つ以上の症状を示している場合に、対象はインフルエンザ感染に罹患していると見なされる。
いくつかの実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスに曝露されていると分かっているか、又は曝露されていると考えられている。いくつかの実施形態では、対象が、インフルエンザウイルスに曝露されていると分かっているか又は曝露されていると考えられている場合、対象は、インフルエンザ感染に罹患しやすいと見なされる。いくつかの実施形態では、対象が、インフルエンザウイルスに感染していると分かっているか又は疑われる他の個体と接触している場合、及び／又は対象がインフルエンザ感染が流行していることが知られているか又はそのように考えられる地域に対象が存在するか若しくは存在したことがある場合、対象はインフルエンザウイルスに曝露されていることが分かっているか又は曝露されていると考えられる。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物（例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン）は、単回用量として、例えば、筋肉内投与又は粘膜送達によって投与される。いくつかの実施形態では、追加用量は、初回投与後約１年以上後に投与される。いくつかの実施形態では、追加用量は、５年後に投与される。
対象
いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、健康である。ある特定の実施形態では、対象は、成人、青年又は乳児である。
いくつかの実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスによる感染から重篤な合併症を発症するリスクが高い年齢を有する。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、生後６ヶ月未満である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、２歳未満である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、５歳未満である。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、５５歳以上、例えば６０歳以上、６５歳以上、又は７０歳以上である。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも６５歳である。
いくつかの実施形態では、対象は、インフルエンザウイルスによる感染から重篤な合併症を発症するリスクがより高い状態を有する。いくつかの実施形態では、対象は、妊婦である。いくつかの実施形態では、対象は、肺の病態（例えば、慢性肺疾患）に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、喘息に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、ＣＯＰＤに罹患している。
いくつかの実施形態では、対象は、老人ホーム又は長期介護施設に住んでいる。
いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、家畜又はペット（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、及び／又はブタ）である。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、対象は、鳥類（例えば、ニワトリ）である。
以下の実施例は、あくまでも例示目的で含めるものであり、本発明の範囲を限定することは意図されない。
実施例１：ｍＲＮＡのインビトロ転写
この実施例は、インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１及びＡ／Ｈ３Ｎ２ウイルスからのヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）及びマトリックス１（Ｍ１）タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成を示す。
Ａ／カリフォルニア／０７／２００９からのＭ１タンパク質、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）からのＨＡ－Ｈ１タンパク質、Ａ／ミシガン／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）からのＮＡ－Ｎ１タンパク質、Ａ／ミネソタ／０７／２００８（Ｈ３Ｎ２）からのＨＡ－Ｈ３タンパク質、及びＡ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／０７／２００８（Ｈ３Ｎ２）からのＮＡ－Ｎ２をコードする配列最適化ヌクレオチド配列を調製した。コドン最適化配列を、好適な５’及び３’ＵＴＲ配列並びにＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプラスミドに別々に挿入した。インビトロ転写（ＩＶＴ）の前に、プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで線状化した。
ＤＴＴ、ピロリン酸及びＲＮａｓｅ阻害剤を補充した好適なＩＶＴ反応緩衝液中で、線状化ＤＮＡ鋳型プラスミド、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）及びＲＮＡポリメラーゼを使用してＩＶＴ反応を実施した。ＩＶＴ反応を、３７℃で９０分にわたり行った。反応をＤＮａｓｅ Ｉによる処理によって終結させ、鋳型プラスミドを除去した。得られたＩＶＴ ｍＲＮＡを、グアニジンチオシアネートによる沈殿によって精製した。
精製されたＩＶＴ ｍＲＮＡを、好適なキャッピング反応緩衝液中、Ｓ－アデノシルメチオニン、ＲＮａｓｅ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ及びグアニリルトランスフェラーゼとともに３７℃で９０分間インキュベートすることによってキャッピングした。キャッピング後に、テーリング反応を、好適なテーリング反応緩衝液中でＡＴＰ及びポリＡポリメラーゼを用いて３７℃で３０分間実施した。反応をＥＤＴＡの添加によって停止させ、続いて３７℃で５分間のインキュベーション及び上述のｍＲＮＡ精製を行った。
実施例２：ノイラミニダーゼ（ＮＡ）活性の評価
この実施例は、インフルエンザウイルスのＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡによる哺乳動物細胞のトランスフェクション後に、ＮＡ活性が上清で観察されることを示す。この活性は、細胞が、ＮＡタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡでトランスフェクトされる場合、又はＭ１タンパク質及び１つ以上のＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされる場合にも観察される。
ＨＡ、ＮＡ及びＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを、実施例１に記載されるように調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、インフルエンザウイルスのタンパク質Ｎ１若しくはＮ２をコードする単一のｍＲＮＡ、インフルエンザウイルスのタンパク質Ｈ１、Ｎ１及びＭ１若しくはＨ３、Ｎ２及びＭ１をコードする３つのｍＲＮＡ、又はインフルエンザウイルスのタンパク質Ｈ１、Ｎ１、Ｈ３、Ｎ２、及びＭ１をそれぞれコードする５つのｍＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡトランスフェクションキットを使用して実施した。トランスフェクトされていない細胞及びｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として含めた。トランスフェクションの４８時間後に細胞をカウントし、細胞生存率を評価した。
ＮＡ活性を、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔから採取した上清を使用して決定した。酵素活性を、ＮＡ－Ｆｌｕｏｒ（商標）インフルエンザノイラミニダーゼアッセイキットを使用して測定した。４－メチルインベリフェロン（ｍｅｔｈｙｌｉｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）ナトリウム塩を使用して標準曲線を生成し、３７℃で１時間インキュベートした後、Ｖａｒｉｏｓｋａｎリーダーを使用して蛍光を検出した。ＮＡ活性の力価をμＭ／時で測定した。各試料につき３回の独立した測定を実施した。
結果を図１にまとめる。ＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた全ての細胞の上清中にＮＡ活性を検出した。細胞を、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＮＡタンパク質（Ｎ１及び／又はＮ２）をコードする１つ又は２つのｍＲＮＡ並びにＨＡタンパク質（Ｈ１及び／又はＨ３）をコードする１つ又は２つのｍＲＮＡで追加的にトランスフェクトした場合にもＮＡ活性が観察された。興味深いことに、ＮＡ活性は、Ｎ１をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞と比較して、Ｎ２をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞では約２．５～３倍高かった。Ｎ１及びＮ２の両方を有するトランスフェクト細胞は、測定されたＮＡ活性を更に増加させなかった。
この実施例のデータは、Ｍ１、ＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡを同じ細胞内で一緒に発現させて、活性ＮＡタンパク質を有するＶＬＰを産生させることができることを示している。
実施例３：ヘマグルチニン（ＨＡ）活性の評価
この実施例は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡが、哺乳動物細胞を誘導して機能的なヘマグルチニン（ＨＡ）活性を発現させることができることを示す。
ＨＡ、ＮＡ及びＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを、実施例１に記載されるように調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｈ１若しくはＨ３のいずれかをコードする単一のｍＲＮＡ、Ｈ１若しくはＨ３のタンパク質のいずれか及びＭ１タンパク質をコードする２つのｍＲＮＡ、Ｈ１、Ｎ１及びＭ１タンパク質、Ｈ３、Ｎ２及びＭ１タンパク質若しくはＨ１、Ｈ３及びＭ１タンパク質のいずれかをコードする３つのｍＲＮＡ、又はインフルエンザタンパク質のＨ１、Ｎ１、Ｈ３、Ｎ２及びＭ１をそれぞれコードする５つのｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションは、実施例２に記載されているものと同じ方法で実施した。
ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清を使用してヘマグルチニン単位（ＨＡＵ）力価を計算することによって、ＨＡの機能性を決定した。前記上清の連続希釈物を、５０μＬの０．５％（ｖ／ｖ）七面鳥赤血球とともに、４℃で４５～６０分間インキュベートした。懸濁液のＨＡＵ力価は、完全な赤血球凝集を示す最も高い希釈の逆数であると定義される。非濃縮及び濃縮（５倍）上清の両方についての赤血球凝集値を表１に示す。それぞれインフルエンザウイルスＡ／ミシガン／４５／２０１５のＨ１及びＮ１タンパク質、並びにＡ／香港／４８０１／２０１４のＨ３及びＮ２タンパク質を用いて調製された以前に精製及び濃縮したＶＬＰを陽性対照として機能させた。ｍＲＮＡなしでトランスフェクトされた細胞からの上清を陰性対照として使用した。
赤血球凝集は、Ｈ１亜型ＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞から得られた全ての濃縮上清について観察され、細胞がタンパク質をその活性形態で発現したことを示している。この観察は、細胞が、別のＨＡタンパク質（Ｈ３）、１つ以上のＮＡタンパク質（Ｎ１、若しくはＮ１及びＮ２）をコードする１つ以上のｍＲＮＡ、及び／又はＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡで追加的にトランスフェクトされた細胞では無関係であった。
Ｈ１亜型ＨＡタンパク質が存在しない場合、Ｈ３亜型ＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞について赤血球凝集は観察されなかった。赤血球凝集は、Ｈ３亜型ＨＡタンパク質では検出が困難であり得るため、これはそれほど驚くべきことではない。Ｈ３亜型ＨＡタンパク質が発現されたことを確認するために、ポリクローナル抗Ｈ３抗体（ウサギ、ＳＩＧＭＡ）を用いて、ウェスタンブロットを実施した。簡単に述べると、細胞溶解物をＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離させた。分離したタンパク質をニトロセルロース膜（ＢｉｏＲＡＤ）にブロッティングし、抗Ｈ３抗体でプローブした。抗ウサギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＤｙＬｉｇｈｔ）を、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（ＬＩＣＯＲ）を使用する検出のために用いた。
図２から分かるように、Ｈ３タンパク質は、（ｉ）Ｈ３及びＭ１タンパク質、（ｉｉ）Ｈ３、Ｎ２及びＭ１タンパク質、（ｉｉｉ）Ｈ１、Ｎ１、Ｈ３、Ｎ２及びＭ１タンパク質、並びに）（ｉｖ）Ｈ１及びＨ３タンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞において容易に検出された。理由は不明であるが、細胞をＨ３タンパク質をコードする単一のｍＲＮＡでトランスフェクトした場合に、非常に弱いＨ３バンドのみが検出された。
この実施例のデータは、Ｍ１、ＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡを同じ細胞内で一緒に発現させて、機能的ＨＡタンパク質を有するＶＬＰを産生させることができることを示している。
実施例４：陰性染色透過型電子顕微鏡法（ＮＳ－ＴＥＭ）によるインフルエンザＶＬＰの可視化
この実施例は、Ｍ１、ＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた哺乳動物細胞がＶＬＰを産生することができることを示す。この実施例はまた、哺乳動物細胞がＭ１及びＨＡタンパク質をコードするｍＲＮＡのみでトランスフェクトされる場合、ＶＬＰの出芽が大幅に低減することを示している。
Ｍ１、ＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた哺乳動物細胞におけるＶＬＰの生成を可視化するために、陰性染色透過型電子顕微鏡法（ＮＳ－ＴＥＭ）を実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｍＲＮＡの３つの異なる組み合わせでトランスフェクトした。ＨＡ、ＮＡ及びＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを、実施例１に記載されるように調製した。いくつかの細胞を、Ｍ１タンパク質及び２つのＨＡタンパク質（Ｈ１及びＨ３）のいずれか、又は１つのＨＡタンパク質（それぞれＨ１又はＨ３）及び１つのＮＡタンパク質（それぞれＮ１又はＮ２）をコードする３つのｍＲＮＡの組み合わせでトランスフェクトした。他の細胞を、Ｍ１タンパク質、２つのＨＡタンパク質（Ｈ１及びＨ３）並びに２つのＮＡタンパク質（Ｎ１及びＮ２）をコードする５つのｍＲＮＡでトランスフェクトした。
トランスフェクト細胞の細胞上清を、プラズマクリーナー中の以前にイオン化された連続炭素フィルムＴＥＭグリッド上でインキュベートした。濾紙を使用して過剰な物質を吸収し、吸着した粒子を２％酢酸ウラニルで陰性染色し、画像化した。
（ｉ）Ｈ１、Ｎ１、Ｈ３、Ｎ２及びＭ１、（ｉｉ）Ｈ１、Ｎ１及びＭ１、（ｉｉｉ）Ｈ３、Ｎ２、及びＭ１、並びに（ｉｖ）Ｈ１、Ｈ３、及びＭ１をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清は、小胞を含有し、トランスフェクト細胞によるＶＬＰの産生及び放出を示した。模擬トランスフェクト細胞の上清では、小胞は観察されなかった。重要なことに、Ｈ１、Ｈ３、及びＭ１をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の上清では、非常に少量のみの小胞が観察された。
この実施例は、Ｍ１、ＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた哺乳動物細胞がＶＬＰを産生することができることを示している。この実施例はまた、哺乳動物細胞が、Ｍ１及びＨＡタンパク質のみをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた場合にも、ＶＬＰ形成が依然として起こり得ることを示している。しかしながら、ＶＬＰ形成は非常に減少し、細胞表面からのＶＬＰの効率的な出芽がＮＡタンパク質の発現に結び付いていることを示している。
実施例５：低温透過型電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）によるインフルエンザＶＬＰの可視化
この実施例は、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ、並びに複数のＨＡタンパク質及び複数のＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた哺乳動物細胞が、コード配列が異なるインフルエンザウイルスに由来する場合であっても、ＶＬＰを産生することができることを示す。
ｍＲＮＡトランスフェクト哺乳動物細胞によって産生されるＶＬＰのサイズを決定するために、細胞膜からのＶＬＰの出芽を観察するために低温透過型電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ）を実施した。ＨＡ、ＮＡ及びＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを、実施１に記載されるように調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｍ１タンパク質、１つのＨＡタンパク質（Ｈ３）及び１つのＮＡタンパク質（Ｎ２）をコードする３つのｍＲＮＡ、又はＭ１タンパク質、２つのＨＡタンパク質（Ｈ１及びＨ３）並びに２つのＮＡタンパク質（Ｎ１及びＮ２）をコードする５つのｍＲＮＡのいずれかでトランスフェクトした。模擬トランスフェクト細胞（ｍＲＮＡなし）を対照として含めた。ＥＬＭＯイオン化装置でのグロー放電後、試料をＱｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ２／２銅２００メッシュグリッドに堆積させた。グリッドをブロッティングし、凍結させ、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭによる可視化のために移した。
例示的な画像を図３に示す。パネルＡは、模擬トランスフェクト細胞を示す。ＶＬＰは視認できなかった。パネルＢ及びＣは、３つのｍＲＮＡ（Ｈ３／Ｎ２／Ｍ１；パネルＢ）又は５つのｍＲＮＡ（Ｈ１／Ｎ１／Ｈ３／Ｎ２／Ｍ１；パネルＣ）のいずれかでトランスフェクトされた細胞からのＶＬＰの代表的な画像を示す。ＶＬＰは、インフルエンザウイルスの糖タンパク質に類似した糖タンパク質の不均一なスパイクで観察することができた。観察されたＶＬＰは、およそ１００ｎｍのサイズであり、したがってインフルエンザウイルスのサイズと同様であった。注目すべきことに、これは、細胞を異なるインフルエンザウイルスからのＨＡタンパク質及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした場合（それぞれ、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９［Ｈ１］、及びＡ／ミシガン／４５／２０１５［Ｎ１］並びにＡ／ミネソタ／０７／２００８［Ｈ３及びＮ２］）、又はＭ１タンパク質並びにＨＡ及びＮＡタンパク質が、異なるインフルエンザウイルス（それぞれ、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９［Ｈ１Ｎ１］及びＡ／ミネソタ／０７／２００８［Ｈ３Ｎ２］）からのものであった場合でもそうであった。
この実施例は、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ並びに異なるインフルエンザウイルスからの２つのＨＡタンパク質及び２つのＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた哺乳動物細胞が、ＶＬＰを産生することができることを実証している。同様に、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡのコード配列は、ＨＡ及びＮＡタンパク質をコードするｍＲＮＡのコード配列とは異なるウイルスに由来し得る。
実施例６：Ａ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザのタンパク質によるトランスフェクションにより、ＶＬＰ形成が可能になる
この実施例は、Ａ型又はＢ型のいずれかに由来するＭ１及びインフルエンザ糖タンパク質の両方をコードするｍＲＮＡが、ＶＬＰを産生することができることを示す。
Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルスの両方からＶＬＰが産生され得るかどうかを決定するために、４つの異なる株を調査した。Ａ／ダーウィン／６／２０２１からのＨＡ及びＮＡタンパク質（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／５８８／２０１９からのＨＡ及びＮＡタンパク質（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／プーケット／３０７３／２０１３（Ｂ／山形系統）からのＨＡ及びＮＡタンパク質、並びにＢ／オーストリア／１３５９４１７／２０２１（Ｂ／ビクトリア系統）からのＨＡ及びＮＡタンパク質をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列を調製した。前の実施例と同様に、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９からのＭ１タンパク質をコードする同じ配列最適化ヌクレオチド配列を使用した。コドン最適化配列を、好適な５’及び３’ＵＴＲ配列並びにＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプラスミドに別々に挿入した。ＩＶＴの前に、プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで線状化した。ＩＶＴ反応を、実施例１に記載されるように実施した。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、実施例２に記載される方法を使用して、インフルエンザウイルスのタンパク質をコードする３つのｍＲＮＡでトランスフェクトした。表２に示すように、４つの組み合わせ（ダーウィン、ウィスコンシン、プーケット及びオーストリア）を試験した。各トランスフェクションについて、ＨＡ、ＮＡ、及びＭ１をコードするｍＲＮＡを、それぞれ４０：１０：５０のモル比でトランスフェクトした。
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から採取された上清を使用する酵素的ＮＡ活性アッセイを、実施例２に記載されている方法によって実施した。結果を図４にまとめる。ＮＡ活性は、オーストリア株を除いて、トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から採取された全ての上清で検出可能であった。精製されたＶＬＰ（陽性対照）と比べて、ＮＡ活性は、この実験では低かった。ウェスタンブロットにより、弱いＮＡタンパク質発現が確認された（データは示されていない）。
トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からの細胞溶解物及び上清抽出物におけるＭ１及びＨＡ発現を、ウェスタンブロットによって評価した。検出に使用される試薬を表３に示す。
濃縮（２５倍）及び非濃縮上清抽出物の両方を分析した。ＨＡ発現を、モノクローナルＡ型インフルエンザ株又はＢ型インフルエンザ株の抗ＨＡ抗体を使用して決定した。結果を、それぞれ図５Ａ（Ａ型インフルエンザ）及び図５Ｂ（Ｂ型インフルエンザ）に示す。ＨＡ発現は、全ての実験条件の細胞溶解物、濃縮上清抽出物及び非濃縮上清抽出物で検出された。模擬トランスフェクト細胞（陰性対照）の溶解物及び上清では、シグナルは検出されなかった。ＨＡは、各プロトマーが、単一のジスルフィド架橋を介して接続されたＨＡ１鎖及びＨＡ２鎖からなるホモトリマーである。ＨＡ２サブユニットは、細胞溶解物の各々で検出され得るが、細胞上清では検出されない。
Ｍ１発現を、ポリクローナル抗Ｍ１抗体を使用して決定した。図６に示すように、Ｍ１は、トランスフェクト細胞の細胞溶解物及び濃縮上清中で検出されたが（パネルＡ）、非濃縮上清試料では検出されなかった（パネルＢ）。濃縮上清中では、微量のみを検出することができた。バンド強度は、細胞溶解物試料で最大であった。陰性対照試料を含む細胞溶解物及び濃縮上清を含む試料において、非特異的結合が観察された。しかしながら、Ｍ１特異的バンドは、明らかに区別可能であった。模擬トランスフェクト細胞（リポフェクタントのみ、陰性対照）の細胞溶解物及び上清では、Ｍ１は観察されなかった。
実施例５に記載されるように、ｍＲＮＡトランスフェクト哺乳動物細胞によって産生されたＶＬＰを、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭを使用して可視化した。例示的な画像を図７に示す。パネルＡは、模擬トランスフェクト細胞の代表的な画像を示す。この状態では、ＶＬＰは見出されなかった。不均一な平滑な小胞（白色の矢印）（トランスフェクションプロセスからのアーチファクトの可能性が高い）及びタンパク質の破片（黒色の輪郭の矢印）のみが観察された。
Ａ型インフルエンザ株のダーウィン及びウィスコンシンからのＭ１プラスＨＡ及びＮＡでトランスフェクトされた細胞からのＶＬＰの代表的な画像を、それぞれパネルＢ及びＣに示す。パネルＤ及びＥは、それぞれ、Ｂ型インフルエンザ株のプーケット及びオーストリアからのＭ１プラスＨＡ及びＮＡでトランスフェクトされた細胞からのＶＬＰの代表的な画像を示す。糖タンパク質が密に施されたＶＬＰ（黒く塗りつぶされた矢印）は、４つの条件全てで観察された。ＶＬＰのサイズは約５０～３００ｎｍの範囲であり、大部分は１００ｎｍを超えるサイズであった。
この実施例は、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ及びＡ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザのいずれかからのＨＡ及びＮＡをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされた哺乳動物細胞が、ＶＬＰを産生することができることを実証している。データは、ＨＡ及びＮＡタンパク質が由来するインフルエンザの型及び株に関係なく、Ｍ１タンパク質の同じコード配列の使用を更に裏付けている。
実施例７：マウス免疫化
この実施例は、実施例６に記載されるＨＡ、ＮＡ及びＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む組成物の免疫原性を試験するためのマウス研究を概説する。
インフルエンザ株Ｂ／プーケット／３０７３／２０１３（山形）のＨＡ及びＮＡタンパク質並びにＡ／カリフォルニア／０７／２００９のＭ１タンパク質をコードする３つの配列最適化ｍＲＮＡを含む一価ｍＲＮＡ組成物を調製する。ｍＲＮＡを、４０：３０：２８．５：１．５のモル比で、カチオン性脂質ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、非カチオン性脂質ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ修飾脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入する。最終的なｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤を、水性懸濁液で提供する。ＨＡ、ＮＡ、及びＭ１をコードするｍＲＮＡを、免疫化に使用される最終組成物中でそれぞれ１：１：２の重量比で提供する。
並行して、ｍＲＮＡの４つのセットを含む四価ｍＲＮＡ組成物を調製する。セット１は、インフルエンザ株Ｂ／プーケット／３０７３／２０１３（山形）のＨＡ及びＮＡタンパク質並びにＡ／カリフォルニア／０７／２００９のＭ１タンパク質をコードする３つの配列最適化ｍＲＮＡを含む。セット２は、インフルエンザ株Ａ／ダーウィン／６／２０２１及びＡ／タスマニア／５０３／２０２０（Ｈ３Ｎ２）のそれぞれのＨＡ及びＮＡタンパク質、並びにＡ／カリフォルニア／０７／２００９のＭ１タンパク質をコードする３つの配列最適化ｍＲＮＡを含む。セット３は、インフルエンザ株Ａ／ウィスコンシン／５８８／２０１９（Ｈ１Ｎ１）のＨＡ及びＮＡタンパク質並びにＡ／カリフォルニア／０７／２００９のＭ１タンパク質をコードする３つの配列最適化ｍＲＮＡを含む。セット４は、インフルエンザ株Ｂ／オーストリア／１３５９４１７／２０２１及びＢ／ワシントン／０２／２０１９（ビクトリア）のそれぞれのＨＡ及びＮＡタンパク質、並びにＡ／カリフォルニア／０７／２００９のＭ１タンパク質をコードする３つの配列最適化ｍＲＮＡを含む。ｍＲＮＡのセットの各々は、一価組成物と同じＬＮＰ中に別々に封入される。各セットについて、ＨＡ、ＮＡ、及びＭ１をコードするｍＲＮＡは、免疫化に使用される最終組成物中でそれぞれ１：１：２の重量比で提供される。
対照として、Ｍ１タンパク質をコードするｍＲＮＡが、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）からのＴエピトープをコードするｍＲＮＡで置き換えられている一価及び四価組成物に対応するｍＲＮＡ組成物が提供される。四価組換えインフルエンザワクチンＦｌｕｂｌｏｋ及び四価不活化スプリットビリオンワクチンＶａｘｉｇｒｉｐ Ｔｅｔｒａは、免疫化対照として提供される。Ｆｌｕｂｌｏｋ及びＶａｘｉｇｒｉｐ Ｔｅｔｒａ中のＨＡ及びＮＡタンパク質は、四価ｍＲＮＡ組成物中のそれぞれのＨＡ及びＮＡ ｍＲＮＡによってコードされるものと一致する。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、陰性対照として機能する。
組成物の各々を、０日目及び２１日目に筋肉内（ＩＭ）注射によってマウスに投与する。ＢＡＬＢ／ｃマウスの９群を免疫化する（ｎ＝８）。群１は、一価ｍＲＮＡ組成物の注射ごとに合計２μｇのｍＲＮＡを受ける。群２は、一価ｍＲＮＡ組成物の注射ごとに合計８μｇのｍＲＮＡを受ける。群３及び４は、それぞれ、注射ごとに合計２μｇ及び８μｇの一価の対照ｍＲＮＡ組成物を受ける。群５は、四価ｍＲＮＡ組成物の注射ごとに合計８μｇのｍＲＮＡを受ける。群６は、対照四価ｍＲＮＡ組成物の注射ごとに合計８μｇのｍＲＮＡを受ける。群７は、注射ごとにヒトの用量の１／１０のＦｌｕｂｌｏｋを受ける。群８は、注射ごとにヒトの用量の１／１０のＶａｘｉｇｒｉｐ Ｔｅｔｒａを受ける。群９は、ＰＢＳを受ける。
４２日目に、マウスを殺処分する。血液を採取して、ＥＬＩＳＡ、赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイ、及びノイラミニダーゼ活性阻害（ＮＡＩ）アッセイをそれぞれ使用して、ＩｇＧ産生（総ＩｇＧ）及び抗ＨＡ／抗ＮＡ機能抗体を評価する。

Claims (63)

  1. （ｉ）インフルエンザウイルスマトリックス１（Ｍ１）タンパク質と、（ｉｉ）１つ以上のインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質及び／又は１つ以上のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質とをコードする１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物であって、前記Ｍ１タンパク質と前記１つ以上のＨＡタンパク質及び／又は前記１つ以上のＮＡタンパク質とが、哺乳動物を誘導して、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生することができる、組成物。
  2. 前記１つ以上のｍＲＮＡが、２つ以上のＨＡタンパク質及び／又は２つ以上のＮＡタンパク質をコードし、前記２つ以上のＨＡタンパク質の各々及び前記２つ以上のＮＡタンパク質の各々が、異なるインフルエンザウイルスからのものである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記２つ以上のＨＡタンパク質の少なくとも１つ及び／又は前記２つ以上のＮＡタンパク質の少なくとも１つが、前記Ｍ１タンパク質が由来する前記インフルエンザウイルスとは異なるインフルエンザウイルスからのものである、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記２つ以上のＨＡタンパク質及び／又は前記２つ以上のＮＡタンパク質が、異なるＡ型インフルエンザ亜型からのものである、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記２つ以上のＨＡタンパク質の少なくとも１つ及び／又は前記２つ以上のＮＡタンパク質の少なくとも１つが、Ｂ型インフルエンザウイルスからのものである、請求項３又は４に記載の組成物。
  6. 前記Ｍ１タンパク質が、パンデミックインフルエンザウイルスからのものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記Ｍ１タンパク質が、Ｈ１Ｎ１ Ａ型インフルエンザウイルスからのものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記Ｍ１タンパク質が、３０位にセリン、１４２位にアラニン、２０７位にアスパラギン、及び２０９位にスレオニンを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記Ｍ１タンパク質が、別個のｍＲＮＡによってコードされる、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記２つ以上のＮＡタンパク質の少なくとも１つが、ノイラミニダーゼ活性アッセイによって決定されるように、２０００μＭ／時以上の活性を有する、請求項２～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記２つ以上のＮＡタンパク質が、異なるＡ型インフルエンザ亜型からの２つのＮＡタンパク質を含む、請求項４～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記異なるＡ型インフルエンザ亜型が、Ｎ１及びＮ２である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記組成物が、前記哺乳動物細胞におけるＶＬＰの発現を誘導することができ、前記ＶＬＰが、異なるＡ型インフルエンザ亜型からの前記２つのＮＡタンパク質を含む、請求項１１又は１２に記載の組成物。
  14. 前記２つ以上のＨＡタンパク質が、異なるＡ型インフルエンザ亜型からの２つのＨＡタンパク質を含む、請求項４～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記異なるＡ型インフルエンザ亜型が、Ｈ１及びＨ３である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記組成物が、前記哺乳動物細胞におけるＶＬＰの発現を誘導することができ、前記ＶＬＰが、異なるＡ型インフルエンザ亜型からの前記２つのＨＡタンパク質を含む、請求項１４又は１５に記載の組成物。
  17. 前記１つ以上のｍＲＮＡが、１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に封入される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 各ＨＡタンパク質及び各ＮＡタンパク質が、別個のｍＲＮＡによってコードされる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記組成物が、Ｍ１タンパク質と、（ｉ）２、３、４、５、６、７、若しくは８個のＨＡタンパク質、（ｉｉ）２、３、４、５、６、７、若しくは８個のＮＡタンパク質、又は（ｉｉｉ）１、２、３、若しくは４個のＨＡタンパク質及び１、２、３、若しくは４個のＮＡタンパク質と、をコードする３、４、５、６、７、８、若しくは９個のｍＲＮＡ分子を含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記３、４、５、６、７、８、若しくは９個のｍＲＮＡが、同じＬＮＰ中に封入される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記組成物が、前記Ｍ１タンパク質をコードする１つのｍＲＮＡと、１つのＨＡタンパク質及び１つのＮＡタンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡと、を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記組成物が、第１のＨＡタンパク質及び第１のＮＡタンパク質をコードする第１のｍＲＮＡと、第２のＨＡタンパク質及び第２のＮＡタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、前記Ｍ１タンパク質をコードする第３のｍＲＮＡと、を含み、前記第１のＨＡタンパク質及び前記第１のＮＡタンパク質が、第１のインフルエンザウイルスからのものであり、前記第２のＨＡタンパク質及び前記第２のＮＡタンパク質が、第２のインフルエンザウイルスからのものである、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記第１及び第２のインフルエンザウイルスが、異なる亜型のＡ型インフルエンザウイルスである、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記異なる亜型が、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２である、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記組成物が、第３のＨＡタンパク質及び第３のＮＡタンパク質をコードする第４のｍＲＮＡを更に含み、前記第３のＨＡタンパク質及び前記第３のＮＡタンパク質が、第３のインフルエンザウイルスからのものである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 前記第３のインフルエンザウイルスが、Ｂ型インフルエンザウイルスである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記組成物が、第４のＨＡタンパク質及び第４のＮＡタンパク質をコードする第５のｍＲＮＡを更に含み、前記第４のＨＡタンパク質及び前記第４のＮＡタンパク質が、第４のインフルエンザウイルスからのものである、請求項２５又は２６に記載の組成物。
  28. 前記第３及び第４のインフルエンザウイルスが、それぞれ山形系統及びビクトリア系統からのものである、請求項２７に記載の組成物。
  29. 前記第１、第２、第４及び第５のｍＲＮＡが、適用可能な場合、５’から３’の順序で、（ｉ）前記ＨＡタンパク質のコード配列、（ｉｉ）内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又は２Ａペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）前記ＮＡタンパク質のコード配列を含む、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記ｍＲＮＡが、同じＬＮＰ中に封入される、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 前記第１、第２及び第３のｍＲＮＡが、第１のＬＮＰ中に封入され、前記第４及び第５のｍＲＮＡが、第２のＬＮＰ中に封入される、請求項２７又は２８に記載の組成物。
  32. 前記第２のＬＮＰが、Ｍ１タンパク質をコードする第６のｍＲＮＡを更に含む、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記第６のｍＲＮＡによってコードされる前記Ｍ１タンパク質が、Ｂ型インフルエンザウイルスからのものである、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記第１のＬＮＰ及び前記第２のＬＮＰが、同じ脂質成分を含む、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記組成物が、インフルエンザウイルスマトリックス２（Ｍ２）タンパク質を更にコードするｍＲＮＡを更に含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記ＶＬＰが、約５０ｎｍ～約２００ｎｍのサイズである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 前記ＶＬＰが、約１００ｎｍのサイズである、請求項３６に記載の組成物。
  38. 前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 前記１つ以上のｍＲＮＡが、配列最適化されている、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記ｍＲＮＡが、約１００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチドを含むポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 前記ポリＡ配列が、約２００ヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記ポリＡ配列が、約５００ヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の組成物。
  43. 前記ＬＮＰの前記脂質成分が、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及び任意選択的にステロール系脂質を含むか、又はそれからなる、請求項１７～４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. （ａ）前記カチオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１２、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＩＣＥ、ＨＧＴ４００１、ＨＧＴ４００２、ＨＧＴ４００３、ＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－０８Ｄ－ＤＭＡ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ、ＯＦ－０２、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＰ－Ｅ１８－２、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＥ－Ｅ１８－２、ＳＹ－３－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＨＥＰ－Ｅ３－Ｅ１０、ＨＥＰ－Ｅ４－Ｅ１０、ＲＬ３－ＤＭＡ－０７Ｄ、ＲＬ２－ＤＭＰ－０７Ｄ、ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１０、ｃＨｓｅ－Ｅ－３－Ｅ１２、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＳＩ－４－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＴＬ－１－１２Ｄ－ＤＭＡ、ＳＹ－０１０、ＳＹ－０１１、ＩＭ－００１、及び４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート（ＡＬＣ－０３１５）から選択され；
    （ｂ）前記非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＥＰＥ １，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、及びＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））から選択され；
    （ｃ）前記ＰＥＧ修飾脂質が、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ及び２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）から選択され；並びに／又は
    （ｄ）前記ステロール系が、コレステロールである、
    請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記カチオン性脂質が、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＯＦ－０２、ＧＬ－ＨＥＰＥＳ－Ｅ３－Ｅ１２－ＤＳ－４－Ｅ１０、ＩＭ－００１及びＡＬＣ－０３１５から選択される、請求項４３又は４４に記載の組成物。
  46. 前記ＰＥＧ修飾脂質が、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ又はＡＬＣ－０１５９から選択される、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の組成物。
  47. 前記非カチオン性脂質が、ＤＯＰＥ又はＤＳＰＣから選択される、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の組成物。
  48. 前記ＬＮＰが、約７０ｎｍ～約１５０ｎｍのサイズである、請求項１７～４７のいずれか一項に記載の組成物。
  49. その組成物が、ワクチン組成物である、請求項１～４８のいずれか一項に記載の組成物。
  50. 請求項１～４９のいずれか一項に記載の組成物と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  51. 前記１つ以上の薬学的に許容される賦形剤が、塩、糖、緩衝試薬及びそれらの組み合わせから選択される、請求項５０に記載の医薬組成物。
  52. 前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム又はその両方の組み合わせである、請求項５１に記載の医薬組成物。
  53. 前記糖が、二糖である、請求項５１又は５２に記載の医薬組成物。
  54. 前記二糖が、スクロース又はトレハロースである、請求項５３に記載の医薬組成物。
  55. 前記緩衝試薬が、リン酸、トリス、イミダゾール及びヒスチジンから選択される、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  56. 前記緩衝試薬が、リン酸又はトリスである、請求項５５に記載の医薬組成物。
  57. 対象における１つ以上のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発させる方法における使用のための、請求項１～４８のいずれか一項に記載の組成物、請求項４９に記載のワクチン組成物又は請求項５０～５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  58. 前記免疫応答が、前記対象における前記１つ以上のインフルエンザウイルスによる感染に関連する１つ以上の症状の重症度を低下させるのに有効である、請求項５７に記載の使用のためのワクチン又は医薬組成物。
  59. 前記免疫応答が、前記対象における前記１つ以上のインフルエンザウイルスによる感染の予防に有効である、請求項５７に記載の使用のためのワクチン又は医薬組成物。
  60. 前記対象が、ヒトである、請求項５７～５９のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン又は医薬組成物。
  61. 前記対象が、妊娠している、請求項６０に記載の使用のためのワクチン又は医薬組成物。
  62. 前記対象が、６５歳以上である、請求項６０に記載の使用のためのワクチン又は医薬組成物。
  63. 前記対象が、７０歳以上である、請求項６２に記載の使用のためのワクチン又は医薬組成物。
JP2025534604A 2022-12-15 2023-12-15 インフルエンザウイルス様粒子をコードするｍＲＮＡ Pending JP2026500282A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22315327.1 2022-12-15
EP22315327 2022-12-15
PCT/EP2023/086109 WO2024126809A1 (en) 2022-12-15 2023-12-15 Mrna encoding influenza virus-like particle

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2026500282A true JP2026500282A (ja) 2026-01-06

Family

ID=85251942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2025534604A Pending JP2026500282A (ja) 2022-12-15 2023-12-15 インフルエンザウイルス様粒子をコードするｍＲＮＡ

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20260007735A1 (ja)
EP (1) EP4633673A1 (ja)
JP (1) JP2026500282A (ja)
CN (1) CN120344258A (ja)
AU (1) AU2023394992A1 (ja)
CO (1) CO2025009386A2 (ja)
IL (1) IL321458A (ja)
MX (1) MX2025006877A (ja)
WO (1) WO2024126809A1 (ja)

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5744335A (en) 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
GB0402131D0 (en) 2004-01-30 2004-03-03 Isis Innovation Delivery method
EP1766035B1 (en) 2004-06-07 2011-12-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
EP4174179B1 (en) 2005-08-23 2025-05-07 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
EP3040082A1 (en) * 2007-05-31 2016-07-06 Statens Serum Institut Influenza vaccines
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
MX353900B (es) 2008-11-07 2018-02-01 Massachusetts Inst Technology Lipidoides de aminoalcohol y usos de los mismos.
CA2764609C (en) 2009-06-10 2018-10-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved cationic lipid of formula i
DK2459231T3 (en) 2009-07-31 2016-09-05 Ethris Gmbh RNA with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
ES2666559T3 (es) 2009-12-01 2018-05-07 Translate Bio, Inc. Entrega del mrna para la aumentación de proteínas y enzimas en enfermedades genéticas humanas
WO2012075040A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
BR112013031553A2 (pt) 2011-06-08 2020-11-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. composições, mrna que codifica para uma hgla e seu uso, uso de pelo menos uma molécula de mrna e um veículo de transferência e uso de um mrna que codifica para proteína exógena
ES2663360T3 (es) 2011-06-08 2018-04-12 Translate Bio, Inc. Lípidos escindibles
NZ747501A (en) 2011-10-27 2020-05-29 Massachusetts Inst Technology Amino acid derivatives functionalized on the n-terminal capable of forming drug encapsulating microspheres
BR112014024131A2 (pt) 2012-03-29 2017-07-25 Shire Human Genetic Therapies lipídios catiônicos ionizáveis
CA2876155C (en) 2012-06-08 2022-12-13 Ethris Gmbh Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
CA2903487A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Quantitative assessment for cap efficiency of messenger rna
EP4446413A3 (en) 2013-03-14 2024-12-18 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
ES2795249T3 (es) 2013-03-15 2020-11-23 Translate Bio Inc Mejora sinérgica de la administración de ácidos nucleicos a través de formulaciones mezcladas
CN105451779A (zh) 2013-08-21 2016-03-30 库瑞瓦格股份公司 增加rna编码蛋白表达的方法
WO2015062738A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Curevac Gmbh Modified rna with decreased immunostimulatory properties
PL3083556T3 (pl) 2013-12-19 2020-06-29 Novartis Ag Lipidy i kompozycje lipidowe dla dostarczania środków czynnych
KR102399799B1 (ko) 2013-12-30 2022-05-18 큐어백 아게 인공 핵산 분자
CA2927254C (en) 2013-12-30 2023-10-24 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
CN106164248B (zh) 2014-04-25 2019-10-15 川斯勒佰尔公司 信使rna的纯化方法
CN106659731A (zh) 2014-05-30 2017-05-10 夏尔人类遗传性治疗公司 用于递送核酸的可生物降解脂质
EP3160938B1 (en) 2014-06-25 2020-09-16 Acuitas Therapeutics Inc. Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
US9840479B2 (en) 2014-07-02 2017-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
US9668980B2 (en) 2014-07-02 2017-06-06 Rana Therapeutics, Inc. Encapsulation of messenger RNA
EP3247363A4 (en) 2015-01-21 2018-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2016118725A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
HRP20230494T1 (hr) 2015-06-19 2023-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Alkenil supstituirani 2,5-piperazindioni i njihova upotreba u pripravcima za isporuku sredstva subjektu ili stanici
AU2016285852B2 (en) 2015-06-29 2020-12-17 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
ES2969082T3 (es) 2015-09-17 2024-05-16 Modernatx Inc Compuestos y composiciones para la administración intracelular de agentes terapéuticos
US11103259B2 (en) 2015-09-18 2021-08-31 Vaxxas Pty Limited Microprojection arrays with microprojections having large surface area profiles
US20180264244A1 (en) 2015-09-28 2018-09-20 Vaxxas Pty Limited Microprojection arrays with enhanced skin penetrating properties and methods thereof
WO2017070620A2 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
FI3368507T3 (fi) 2015-10-28 2023-03-21 Acuitas Therapeutics Inc Uusia lipidejä ja lipidinanopartikkeliformulaatioita nukleiinihappojen annostelemiseksi
WO2017117528A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
CA3018978A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Intellia Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components
MX2019005470A (es) 2016-11-10 2019-11-21 Translate Bio Inc Formulación de nanopartículas lipídicas basadas en ice mejorada para el suministro de arnm.
AU2017357758B2 (en) 2016-11-10 2023-11-16 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mRNA-loaded lipid nanoparticles
EP3585886B1 (en) 2017-02-27 2023-11-22 Translate Bio, Inc. Large scale synthesis of messenger rna
EP3971291A1 (en) 2017-02-27 2022-03-23 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
HUE059594T2 (hu) 2017-02-27 2022-11-28 Translate Bio Inc Hírvivõ RNS tisztítására szolgáló eljárások
CA3072369A1 (en) 2017-08-10 2019-02-14 Vaxxas Pty Limited Differential coating of microprojections and microneedles on arrays
US20210085598A1 (en) 2018-04-03 2021-03-25 Vaxess Technologies, Inc. Microneedle comprising silk fibroin applied to a dissolvable base
EP3794008A1 (en) 2018-05-16 2021-03-24 Translate Bio, Inc. Ribose cationic lipids
CN113272282B (zh) 2018-11-09 2024-11-08 川斯勒佰尔公司 具有插入的酯、硫酯、二硫化物和酸酐部分的2,5-二氧代哌嗪脂质
WO2020198785A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Vaxxas Pty Ltd Vaccination using high-density microprojection array patch
CA3156676A1 (en) 2019-10-09 2021-04-15 Vaxess Technologies, Inc. SILK FIBROIN MICRO NEEDLES AND THEIR USES
CN114846560A (zh) 2019-10-21 2022-08-02 赛诺菲巴斯德股份有限公司 用于预测生物应答的系统和方法
JP7801214B2 (ja) 2019-10-21 2026-01-16 サノフィ パスツール インコーポレイテッド ワクチンを設計するためのシステムおよび方法
CA3183930A1 (en) 2020-05-21 2021-11-25 Vaxess Technologies, Inc. Compositions and devices for vaccine release and uses thereof
IL308194A (en) * 2021-05-03 2024-01-01 Pfizer Immunogenic composition against influenza

Also Published As

Publication number Publication date
AU2023394992A1 (en) 2025-07-31
MX2025006877A (es) 2025-07-01
EP4633673A1 (en) 2025-10-22
US20260007735A1 (en) 2026-01-08
IL321458A (en) 2025-08-01
CN120344258A (zh) 2025-07-18
WO2024126809A1 (en) 2024-06-20
CO2025009386A2 (es) 2025-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11771652B2 (en) Lipid nanoparticles for delivering mRNA vaccines
US20220211841A1 (en) Nucleic acid based combination vaccines
US20230043128A1 (en) Multivalent influenza vaccines
CN112292395A (zh) 用于疫苗接种的新型rsv rna分子和组合物
US20230310571A1 (en) Human metapneumovirus vaccines
WO2023079507A1 (en) Respiratory syncytial virus rna vaccine
CA3194325A1 (en) Lipid nanoparticles for delivering mrna vaccines
US20240181037A1 (en) Immunogenic compositions
EP4593875A1 (en) Influenza virus vaccines
US20260007735A1 (en) Mrna encoding influenza virus-like particle
US20250009865A1 (en) Combination respiratory mrna vaccines
CN120359299A (zh) 一种广谱流感mRNA疫苗
US20250333452A1 (en) Vaccines and related methods
WO2025132839A1 (en) Influenza virus vaccines
WO2024223724A1 (en) Influenza virus vaccines
KR20250099770A (ko) 코로나바이러스에 대한 백신