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JP2024503719A - ヒトｔ細胞の機能を強化するための遺伝子活性化標的 - Google Patents

ヒトｔ細胞の機能を強化するための遺伝子活性化標的 Download PDF

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JP2024503719A JP2023543206A JP2023543206A JP2024503719A JP 2024503719 A JP2024503719 A JP 2024503719A JP 2023543206 A JP2023543206 A JP 2023543206A JP 2023543206 A JP2023543206 A JP 2023543206A JP 2024503719 A JP2024503719 A JP 2024503719A
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Abstract

本明細書には、Ｔ細胞の制御因子、ならびにそのようなＴ細胞制御因子を調節する方法、およびＴ細胞制御因子を調節する新規薬剤を同定する方法が記載されている。リンパ系細胞および／または骨髄系細胞におけるこのようなＴ細胞制御因子を改変することにより、例えば、免疫障害、がんならびに他の疾患および状態に罹患している対象など、投与を必要とする対象に投与することができるリンパ系／骨髄系細胞を提供することができる。

Description

本発明は、ヒトＴ細胞の機能を強化するための遺伝子活性化標的に関する。
抗がん治療薬として有用であり得る細胞治療薬の例としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞が挙げられる。患者由来の免疫細胞の使用も、副作用がほとんどないか全くない効果的ながん処置法となる可能性がある。ＮＫ細胞は殺細胞効果を有するが、抗原特異性を有していないため、いくつかの副作用がある。樹状細胞は、細胞を直接殺滅する機能を有さず、患者体内のＴ細胞に抗原特異性を伝達し得るため、がん細胞特異性を高効率でＴ細胞に付与するという点で、ワクチンの概念に属する治療薬である。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞は生産的で抗原依存的な免疫応答を促進する役割を果たし、ＣＤ８＋Ｔ細胞は抗原特異性と殺細胞機能を有することが知られている。
しかしながら、現在まで使用され、または開発されてきた細胞治療薬のほとんどは、臨床的に大きな限界を有している。例えば、がん細胞はそれ自体、人体の免疫反応を抑制する物質を分泌し、またはそのようながん細胞に対する抗体の産生に必要な抗原を提示しなかったりするため、適切な免疫反応が起こらない。
本明細書には、Ｔ細胞機能の制御因子、ならびにそのような制御因子を使用する方法が記載されている。ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）およびＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）スクリーニングを初代ヒトＴ細胞で行い、治療に関連するＴ細胞表現型の遺伝子制御因子を同定した。これらのスクリーニングにより、それらの表現型に対して有意な反応を示す１０７４個の遺伝子が同定された。このスクリーニングにより、Ｔ細胞機能に関与する既知の遺伝子が同定され、実際にＴ細胞機能に影響を与える遺伝子が確実に同定されたことが示された。しかしながら、このスクリーニングにより、Ｔ細胞機能に関与する新規遺伝子も同定された。
本明細書には、少なくとも１種の改変リンパ系細胞、少なくとも１種の改変骨髄系細胞、または改変リンパ系細胞および改変骨髄系細胞の混合物を生成するために、少なくとも１種のリンパ系細胞もしくは骨髄系細胞、またはそれらの組合せ内で、表１～７または図１～４に記載された調節遺伝子のいずれかをエクスビボで改変することを含む方法が記載されている。例えば、改変は、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの１つまたは複数の内因性ゲノム部位への１つまたは複数の欠失、置換または挿入であり得る。改変は、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの発現または翻訳の減少であり得る。発現または翻訳の減少は、阻害性核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）によるものであり得る。改変は、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの発現の増加であり得る。例えば、発現の増加は、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの１つまたは複数のプロモーターの改変によるものであり得る。改変は、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ媒介改変または活性化であり得る。改変は、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかのコード領域を含む核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む１つまたは複数の発現カセットによる、少なくとも１種のリンパ系細胞もしくは骨髄系細胞、またはそれらの組合せの形質転換を含み得る。
本方法は、少なくとも１種の改変リンパ系細胞、少なくとも１種の改変骨髄系細胞、または改変リンパ系細胞および改変骨髄系細胞の混合物を対象に投与する工程も含むことができる。
場合によっては、本方法は、少なくとも１種の改変リンパ系細胞、少なくとも１種の改変骨髄系細胞、または改変リンパ系細胞および改変骨髄系細胞の混合物をインキュベートして、改変細胞の集団を形成する工程を含むことができる。このような改変細胞の集団を対象に投与することができる。場合によっては、対象は疾患または病態を有し得る。例えば、疾患や病態は免疫状態またはがんである。
また、少なくとも１種の試験薬を試験細胞と接触させて試験アッセイ混合物を供給する工程；および
試験細胞の細胞増殖、試験細胞によるサイトカイン放出、もしくはそれらの組合せ；
試験細胞の活性化；
細胞内での、表１～７もしくは図１～４に記載された制御因子のいずれかの発現もしくは活性；または
それらの組合せ
を測定する工程を含む方法も記載される。
本方法はまた、測定結果を対照の結果と比較する工程も含む。対照の結果は、試験薬をいずれも使用しないで測定した試験細胞の結果であり得る。
例えば、試験細胞はリンパ系細胞および／または骨髄系細胞を含むことができる。試験細胞の例としては、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、人工多能性幹細胞由来の免疫（例えば、リンパ系および／もしくは骨髄系）細胞、またはそれらの組合せを挙げることができる。
このようにして測定された結果は、Ｔ細胞および試験薬のいずれも使用しないで測定された試験細胞を含む対照細胞混合物の結果と比較することができる。
刺激された初代ヒトＴ細胞におけるサイトカイン産生に関するゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａスクリーニングを示す図。ＣＲＩＳＰＲａスクリーニングの概略図。 刺激された初代ヒトＴ細胞におけるサイトカイン産生に関するゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａスクリーニングを示す図。ＩＬ－２（左）およびＩＦＮ－γ（右）スクリーニングにおける対象遺伝子のｓｇＲＮＡ ｌｏｇ２倍率変化。バーは、２人のヒト血液ドナーの各ｓｇＲＮＡの平均ｌｏｇ２倍率変化を表す。上の密度プロットは全てのｓｇＲＮＡの分布を表す。 刺激された初代ヒトＴ細胞におけるサイトカイン産生に関するゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａスクリーニングを示す図。ＩＬ－２スクリーニングにおける、２人のドナーのスクリーニングを比較した、各遺伝子のｓｇＲＮＡのｌｏｇ２倍率変化の中央値（高／低ソーティングビン）の散布図。 刺激された初代ヒトＴ細胞におけるサイトカイン産生に関するゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａスクリーニングを示す図。ＩＦＮ－γスクリーニングにおける、２人のドナーのスクリーニングを比較した、各遺伝子のｓｇＲＮＡのｌｏｇ２倍率変化の中央値（高／低ソーティングビン）の散布図。 刺激された初代ヒトＴ細胞におけるサイトカイン産生に関するゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａスクリーニングを示す図。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γスクリーニングにおける遺伝子のｌｏｇ２倍率変化（ｓｇＲＮＡ中央値、２人のドナーの平均値）の比較。 統合ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにより、Ｔ細胞サイトカイン応答の基礎となる遺伝子回路が高解像度でマッピングされた図。ＩＬ－２スクリーニングについて、２人のドナーのＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングを比較した、各遺伝子のｓｇＲＮＡ ｌｏｇ２倍率変化（高／低ソーティングビン）の中央値。 統合ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにより、Ｔ細胞サイトカイン応答の基礎となる遺伝子回路が高解像度でマッピングされた図。ＩＦＮ－γスクリーニングについて、２人のドナーのＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングを比較した、各遺伝子のｓｇＲＮＡ ｌｏｇ２倍率変化（高／低ソーティングビン）の中央値。 統合ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにより、Ｔ細胞サイトカイン応答の基礎となる遺伝子回路が高解像度でマッピングされた図。静止ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉサイトカインスクリーニングヒットの遺伝子ｍＲＮＡ発現分布（本試験）。 統合ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにより、Ｔ細胞サイトカイン応答の基礎となる遺伝子回路が高解像度でマッピングされた図。Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路（ＫＥＧＧ経路）に属する遺伝子を灰色以外の色で示したＩＬ－２ ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａスクリーニングの比較。 統合ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにより、Ｔ細胞サイトカイン応答の基礎となる遺伝子回路が高解像度でマッピングされた図。手動で選択したＮＦ－κＢ経路制御因子を標識したＩＦＮ－γ ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａスクリーニングの比較。他の全ての遺伝子は灰色で示す。 統合ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにより、Ｔ細胞サイトカイン応答の基礎となる遺伝子回路が高解像度でマッピングされた図。図２Ｄで標識したＮＦ－κＢ経路制御因子のマップ。 統合ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにより、Ｔ細胞サイトカイン応答の基礎となる遺伝子回路が高解像度でマッピングされた図。Ｔ細胞刺激および同時刺激シグナル伝達経路において、定義された機能を有することが過去に証明されたスクリーニングヒットのマップ。示された遺伝子は、少なくとも１つのスクリーニングで有意にヒットしたものであり、文献および経路データベース（例えば、ＫＥＧＧおよびＲｅａｃｔｏｍｅ）の概説に基づいて選択された。タイルは示された遺伝子によってコードされるタンパク質を表し、スペースの制約上、細胞質で示された成分の多くは細胞膜で生じているため、細胞内局在は不正確であるとの警告がある。タイルは、サブパネルに示したように、ｌｏｇ２倍率変化Ｚ－スコアに従って色分けされており、種々のヒットの例が示されている。上部の大きな矢印は刺激／同時刺激源を表す。 統合ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにより、Ｔ細胞サイトカイン応答の基礎となる遺伝子回路が高解像度でマッピングされた図。図２Ｇと同じ形式で、Ｔ細胞におけるあまりよく説明されていない機能を有するスクリーニングヒットの選択。図２Ｈでは、各スクリーニングのｌｏｇ２倍率変化で上位２０位までの陽性および陰性遺伝子から有意なヒットのみを組み入れ候補とした。 アレイプロファイリングによるＣＲＩＳＰＲａスクリーニングヒットの特徴付けを示す図。アレイ実験の概略図。 アレイプロファイリングによるＣＲＩＳＰＲａスクリーニングヒットの特徴付けを示す図。ＩＬ－２（ＣＤ４＋Ｔ細胞における）およびＩＦＮ－γ（ＣＤ８＋Ｔ細胞における）ＣＲＩＳＰＲａスクリーニングのアレイ化ｓｇＲＮＡパネルによって標的とされた遺伝子との比較、ならびにそのスクリーニングヒット分類が示された。高ランクでもあるアレイ化されたパネル遺伝子のパラログも、さらに示した。 アレイプロファイリングによるＣＲＩＳＰＲａスクリーニングヒットの特徴付けを示す図。１０時間刺激後の対照（ＮＯ－ＴＡＲＧＥＴ＿１ ｓｇＲＮＡ）またはＶＡＶ１（ＶＡＶ１＿１ ｓｇＲＮＡ）ＣＲＩＳＰＲａ Ｔ細胞における指示サイトカインの代表的な細胞内サイトカイン染色フローサイトメトリー。 アレイプロファイリングによるＣＲＩＳＰＲａスクリーニングヒットの特徴付けを示す図。完全アレイ化ｓｇＲＮＡパネルの細胞内サイトカイン染色により、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞における、示されたサイトカインに対して陽性にゲーティングされた細胞の割合が示される。点は、刺激のありなしの両方における、４人のドナーの平均値を示す。破線の縦線は、刺激がある場合の非標的対照ｓｇＲＮＡの対照の平均値を示す。＊ｑ＜０．０５、＊＊ｑ＜０．０１、マン・ホイットニーＵ検定後におけるｑ値の多重比較補正。中用量の刺激はＩＬ－２およびＩＦＮ－γについて、低用量の刺激はＴＮＦ－αについて示す。 アレイプロファイリングによるＣＲＩＳＰＲａスクリーニングヒットの特徴付けを示す図。図３Ｄから同じデータを用いた、刺激ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞における、アレイ化パネルｓｇＲＮＡのサイトカイン陽性細胞の割合のｌｏｇ２倍率変化対非標的対照ｓｇＲＮＡの平均値の散布図の比較。 アレイプロファイリングによるＣＲＩＳＰＲａスクリーニングヒットの特徴付けを示す図。ＩＬ２およびＩＦＮＧ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを除去した、示された遺伝子カテゴリーで分類された分泌サイトカイン染色アレイ化パネル。点は単一の遺伝子およびドナーの測定値を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、マン－ホイットニーＵ検定。 アレイプロファイリングによるＣＲＩＳＰＲａスクリーニングヒットの特徴付けを示す図。示されたＣＲＩＳＰＲａ ｓｇＲＮＡから得られた分泌サイトカイン測定値の主成分分析。 アレイプロファイリングによるＣＲＩＳＰＲａスクリーニングヒットの特徴付けを示す図。示された生物学的カテゴリーにより分類された、選択された分泌サイトカイン測定のヒートマップ。値は４人のドナーの中央値を表し、各サイトカインについてＺ－スコアのスケーリングを行った。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ実験の概略図。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。ライブラリーが本発明者らのプライマリー・ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａサイトカインスクリーニングからのヒットで構成されているｓｇＲＮＡライブラリーが標的とする遺伝子のカテゴリー別の内訳を示す図。両スクリーニングでｌｏｇ２倍率変化の合計が０未満の遺伝子（対角線）は、負の制御因子として分類されている。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。血液ドナー別に色分けされた品質管理フィルター後の再刺激されたＴ細胞のＵＭＡＰ投影図。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。再刺激されたＴ細胞ＵＭＡＰ投影にわたるＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の分布を示す図。各ビンは、そのビン内の細胞の平均ｌｏｇ２（ＣＤ４／ＣＤ８）転写産物レベルで色分けされている。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。各ビン内の平均細胞活性化スコアで色分けした再刺激されたＴ細胞ＵＭＡＰを示す図。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。ｓｇＲＮＡ標的遺伝子によって分類した再刺激されたＴ細胞の活性化スコアの箱ひげ図。破線は非標的対照細胞の活性化スコアの中央値を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ ボンフェローニ補正したマン・ホイットニーＵ検定。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。クラスターごとに色分けした再刺激されたＴ細胞のＵＭＡＰを示す図。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。各クラスターで差次的に発現したマーカー遺伝子のヒートマップを示す図。各クラスターで統計的に有意（ＦＤＲ＜０．０５）に差次的に発現上昇した上位５０の遺伝子を示す。複数のクラスターで発現上昇した遺伝子は、その遺伝子のｌｏｇ２倍率変化が高いクラスターを優先する。各クラスターセクションにおけるｌｏｇ２倍率変化による上位のマーカー遺伝子を右側に示す。各クラスターでオッズ比により上位に大きな比率を占めるｓｇＲＮＡを次の右側に示す。各クラスターにおける差次的に発現上昇した上位のサイトカイン遺伝子を次の右側に示す。各クラスターにおける平均細胞ｌｏｇ２（ＣＤ４／ＣＤ８）細胞転写産物値を右端に示す。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。示された遺伝子の発現が示された再刺激されたＴ細胞のＵＭＡＰを示す図。 ＣＲＩＳＰＲａ ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑは、ゲノムワイドなサイトカインスクリーニングヒットによって駆動される多様なＴ細胞状態を捉える。ＵＭＡＰ空間における、示されたｓｇＲＮＡ標的に割り当てられた再刺激細胞の輪郭密度のプロットを示す図。標的のない対照の輪郭は下にグレースケールで示されている。「摂動（Ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）細胞」は、標的のない対照のｓｇＲＮＡ以外の単一のｓｇＲＮＡを割り当てられた全ての細胞を示す。 同定されたヒットをＴ細胞がん治療に用いたインビトロデータを示す図。
本明細書には、Ｔ細胞応答を調節するための方法および組成物が記載されている。Ｔ細胞はインビボまたはエクスビボで調節することができる。エクスビボで調節されたＴ細胞は、そのような投与から利益を得る可能性のある対象に投与することができる。試験薬を評価し、Ｔ細胞機能の調節に有用な薬剤を同定するための方法も本明細書に記載される。
刺激されたＴ細胞におけるサイトカイン産生の制御は、自己免疫、免疫不全、およびがんにおいて破壊される可能性がある。刺激依存性サイトカイン制御因子の系統的発見には、機能喪失および機能獲得の両方の研究が必要であり、ヒト初代細胞では困難であった。今回、本発明者らは、インターロイキン２およびインターフェロンガンマの産生を制御する遺伝子ネットワークを同定するための初代ヒトＴ細胞におけるゲノムワイドＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）および干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）スクリーニングを報告する。アレイ化されたＣＲＩＳＰＲａによって主要なヒットが確認され、多重化されたセクレトームの特徴付けが可能となり、サイトカイン応答が再構築されたことが明らかになった。ＣＲＩＳＰＲａスクリーニングを単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑとカップリングすることで、スクリーニングヒットの遺伝子の詳細な分子の特徴付けが可能となり、Ｔ細胞の活性化にどのような摂動が加わり、異なるサイトカイン発現プロファイルを特徴とする細胞状態が促進されるかが明らかになった。同時に、これらのスクリーニングにより免疫細胞の機能を再プログラムする遺伝子が明らかになった。
Ｔ細胞応答の調節
Ｔ細胞の負の制御因子および正の制御因子のリストを表１～７または図１～４に示す。このような制御因子は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮ－γ）産生、インターロイキン２（ＩＬ２）産生、Ｔ細胞の細胞増殖、またはそれらの組合せを調節することができる。Ｔ細胞の制御因子のいずれかは、本明細書に記載の方法および組成物に使用することができる。記載された制御因子を調節する薬剤もまた、本明細書に記載の方法および組成物に使用することができる。例えば、Ｔ細胞を正に制御するために、１種もしくは複数の正のＴ細胞制御因子をコードする１種もしくは複数の発現カセット、そのような正の制御因子の発現もしくは活性を増加させる１種もしくは複数の薬剤、またはＴ細胞の負の制御因子を阻害する薬剤を使用することができる。Ｔ細胞を負に制御するためには、例えば抗体、１種もしくは複数の負のＴ細胞制御因子をコードする１種もしくは複数の発現カセット、そのような負の制御因子の発現もしくは活性を増加させる１種もしくは複数の薬剤、またはＴ細胞の正の制御因子を阻害する薬剤を使用することができる。Ｔ細胞制御因子を調節し得る薬剤としては、発現ベクター、阻害性核酸、抗体、低分子、ガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼ（例えば、１種もしくは複数のｃａｓヌクレアーゼ）、ヌクレアーゼデッドｃａｓバリアント（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ）、またはそれらの組合せを挙げることができる。
例えば、表１～７または図１～４に記載されたＴ細胞制御因子のいずれかを増加または減少させるように、Ｔ細胞および他の種類の細胞をエクスビボで改変することができ、改変された細胞を、そのような投与から利益を得る可能性のある対象に投与することができる。別の例では、表１～７または図１～４に記載されたＴ細胞調節因子のいずれかの発現または活性は、表１～７または図１～４に記載された制御因子のいずれかを含むかまたは標的とする発現ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＣＲＩＳＰＲ関連リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体、およびそれらの組合せのインビボ投与によって調節することができる。制御因子核酸、制御因子タンパク質、制御因子ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、１種または複数の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）、ウイルス様粒子、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）、ナノ粒子、リポソーム、またはそれらの組合せなどによる１つまたは複数のビヒクルを介して導入することができる。ビヒクルは、特定の細胞タイプを標的とする（例えば、細胞表面マーカーを認識する抗体）、細胞浸透を促進する、分解を減少させる、またはそれらの組合せを可能にする成分または薬剤を含み得る。
さらに、新規薬剤は、例えば、１種または複数の試験薬およびＴ細胞の集団を含むアッセイ混合物を、試験薬が本明細書に記載の制御因子のいずれかの発現または活性を調節し得るかどうかを判定するのに十分な時間および条件下でインキュベートした後に評価することを含む、本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定することができる。場合によっては、アッセイ混合物は、Ｔ細胞および他の種類の細胞、例えば、Ｔ細胞と相互作用し得るもののような他の免疫細胞を含むことができる。このような方法によって同定された有用な試験薬は、例えば、表１～７または図１～４のいずれかに記載された制御因子のいずれかの発現または活性を増加または減少させることができる。
したがって、Ｔ細胞の制御因子のいずれか、ならびにそれらの制御因子を調節し得る薬剤（すなわち、調節因子）を、本明細書に記載の方法および組成物に使用することができる。
Ｔ細胞制御因子は、ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子改変を受けた２種の異なるドナーから単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激初代Ｔ細胞のＩＬ－２サイトカイン産生、ＩＦＮ－γ産生、および細胞増殖の変化を検出することによって同定された。Ｔ細胞の正の制御因子および負の制御因子のいずれもが同定された。
Ｔ細胞または本明細書に記載のＴ細胞制御因子を調節し得る薬剤は、制御因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）または調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）をコードする発現系、抗体、低分子、阻害性核酸、ペプチド、ポリペプチド、ガイドＲＮＡ、ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、ｃａｓ９ヌクレアーゼ）、ヌクレアーゼデッドｃａｓバリアント（例えば、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ）、およびそれらの組合せであり得る。このような薬剤の例を以下に記載する。
制御因子および／または制御因子を調節する薬剤は、様々なアッセイ法で評価することができる。このようなアッセイ法は、新しいＴ細胞制御因子を同定するためにも使用することができる。場合によっては、このアッセイ手順を使用して、Ｔ細胞活性またはＴ細胞数に対する制御因子または調節剤の活性の種類（正の効果もしくは負の効果）、量、または程度の有用性を評価することもできる。
例えば、出願人の制御因子／薬剤または新規制御因子／薬剤を評価するための方法は、１つまたは複数のＴ細胞（またはＴ細胞集団）を試験薬と接触させて試験アッセイ混合物を供給する工程、および試験アッセイ混合物を以下の少なくとも１つについて評価する工程を含み得る：
・サイトカイン（例えば、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２））産生の検出および／もしくは定量；
・試験アッセイ混合物内のＴ細胞の数の定量；
・細胞分裂によって希釈される色素の定量による増殖の検出；
・試験アッセイ混合物中のＴ細胞が、本明細書に記載の１種もしくは複数の正の制御因子もしくは負の制御因子を発現しているかどうかの検出；
・Ｔ細胞の集団によって発現される、１種もしくは複数の正の制御因子もしくは負の制御因子を発現する細胞の数の定量；または
・それらの組合せ。
試験薬／試験制御因子と接触するＴ細胞またはＴ細胞集団は、様々なリンパ系免疫細胞および／または骨髄系免疫細胞も含み得る。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、人工多能性幹細胞由来の免疫（例えば、リンパ系および／もしくは骨髄系）細胞、またはそれらの組合せを含むアッセイ混合物に試験薬を導入することができる。
Ｔ細胞を調節するための、または本明細書に記載された制御因子のいずれかの量もしくは活性を調節するためのインビトロ活性を示す試験薬は、動物疾患モデルで評価することができる。そのような動物疾患モデルとしては、がん疾患動物モデル、免疫系疾患モデル、またはそれらの組合せを挙げることができる。
正のＴ細胞制御因子
以下の遺伝子は、インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子である（表１参照）：ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＬ２、ＡＳＢ１２、ＢＡＣＥ２、ＢＣＬ９、ＢＩＣＤＬ２、Ｃ１５ｏｒｆ５２、Ｃ１ｏｒｆ９４、ＣＤ２、ＣＤ２４７、ＣＤ２８、ＣＮＧＢ１、ＣＴＳＫ、ＤＥＡＦ１、ＤＥＦ６、ＤＥＰＤＣ７、ＤＫＫ２、ＥＭＰ１、ＥＯＭＥＳ、ＥＰ３００、ＦＬＴ３、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＱ１、ＧＩＮＳ３、ＧＬＭＮ、ＧＮＡ１１、ＨＥＬＺ２、ＨＲＡＳＬＳ５、ＩＦＮＧ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ９Ｒ、ＫＬＨＤＣ３、ＫＬＲＣ４、ＬＡＴ、ＬＣＰ２、ＬＤＢ２、ＬＴＢＲ、ＭＶＢ１２Ａ、ＮＢＰＦ６、ＮＩＴ１、ＮＬＲＣ３、ＯＲＣ１、ＯＴＵＤ７Ａ、ＯＴＵＤ７Ｂ、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＰＬＣＧ２、ＰＲＤＭ１、ＰＲＫＤ２、ＰＲＯＣＡ１、ＲＥＬＡ、ＲＮＦ２１７、ＳＡＦＢ２、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ５Ａ１０、ＳＬＣ７Ａ３、ＳＰＰＬ２Ｂ、ＴＡＧＡＰ、ＴＢＸ２１、ＴＭＥＭ１５０Ｂ、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＯＲ１Ａ、ＴＰＧＳ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ３ＩＰ２、ＴＲＩＭ２１、ＶＡＶ１、ＷＴ１、ＺＮＦ６３０、およびＺＮＦ７１７。実施例２は、インターフェロン－γ産生によって検出された追加の正の制御性Ｔ細胞を提供する。
これらの遺伝子およびそのコードされるタンパク質に関する配列およびその他の情報は、例えばＮＣＢＩおよびＵｎｉＰＲＯＴデータベースから入手可能であり、これらは参照により組み込まれる。
インターフェロン－γ産生によってＴ細胞の正の制御因子として検出される遺伝子のいくつかによってコードされるタンパク質配列のいくつかの例を示す。例えば、インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＢＩＣＤＬ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ａ１Ａ５Ｄ９として入手可能であり、以下に配列番号１として示されている。
ＢＩＣＤＬ２タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＬ８３３７４９およびＡＣ１０８１３４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＣ１ｏｒｆ９４遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ６Ｐ１Ｗ５として入手可能であり、以下に配列番号２として示される。
Ｑ６Ｐ１Ｗ５タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＫ１２３３５５およびＡＣ１１５２８６としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＣＮＧＢ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ１４０２８として入手可能であり、以下に配列番号３として示される。
Ｑ１４０２８タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｕ１８９４５およびＬ１５２９６としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＤＥＰＤＣ７遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９６ＱＤ５として入手可能であり、以下に配列番号４として示される。
Ｑ９６ＱＤ５タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＪ２４５６００およびＡＣ１０７９３９としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＨＲＡＳＬＳ５遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９６ＫＮ８として入手可能であり、以下に配列番号５として示される。
ＨＲＡＳＬＳ５タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ２９８８０４およびＡＰ０００４８４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＫＬＨＤＣ３遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＢＱ９０として入手可能であり、以下に配列番号６として示されている。
ＫＬＨＤＣ３タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０５５９２５およびＡＬ１３６３０４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＮＢＰＦ６遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ５ＶＷＫ０として入手可能であり、以下に配列番号７として示される。
Ｑ５ＶＷＫ０タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＢＣ１２５１６１およびＡＬ３９００３８としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＯＴＵＤ７Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ５ＶＷＫ０として入手可能であり、以下に配列番号８として示される。
Ｑ５ＶＷＫ０タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＢＣ１２５１６１およびＡＬ３９００３８としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＴＰＧＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ６８ＣＬ５として入手可能であり、以下に配列番号９として示される。
ＴＰＧＳ２タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＫ２９５８１７およびＡＣ００９８５４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＺＮＦ６３０遺伝子によってコードされるＺＮＦ６３０タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ２Ｍ２１８として入手可能であり、以下に配列番号１０として示される。
Ｑ２Ｍ２１８タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＢＣ１１２１３９およびＺ９８３０４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＺＮＦ７１７遺伝子によってコードされるＺＮＦ７１７タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＢＹ３１として入手可能であり、以下に配列番号１１として示されている。
Ｑ９ＢＹ３１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＦ２２６９９４およびＡＣ１０８７２４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
以下の遺伝子は、インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子である（表２を参照のこと）：ＡＢＣＢ１０、ＡＣＳＳ２、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＬＫＢＨ７、ＡＬＸ４、ＡＮＸＡ２Ｒ、ＡＰ２Ａ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＬ２、ＡＲＮＴ、ＡＲＴ１、ＡＳＣＬ４、ＢＥＸ４、ＢＴＧ２、ＢＴＮＬ２、Ｃ１１ｏｒｆ２１、Ｃ１２ｏｒｆ８０（ＬＩＮＣ０２８７４とも称される）、ＣＢＸ４、ＣＢＹ１、ＣＣＤＣ１８３、ＣＣＤＣ７１Ｌ、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ６、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＨＥＲＰ、ＣＩＰＣ、ＣＬＩＰ３、ＣＮＧＢ１、ＣＮＲ２、ＣＲＥＢ５、ＣＵＬ３、ＤＣＴＮ５、ＤＥＦ６、ＤＥＰＤＣ７、ＤＹＮＬＬ２、ＥＡＰＰ、ＥＥＰＤ１、ＥＬＦＮ２、ＥＭＢ、ＥＭＰ１、ＥＭＰ３、ＥＰ３００、ＥＲＣＣ３、ＥＳＲＰ１、Ｆ２、ＦＢＸＬ１３、ＦＢＸＯ４１、ＦＮＢＰ１Ｌ、ＦＯＳＢ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＱ１、ＦＵＺ、ＧＡＢＲＧ１、ＧＧＴＬＣ２、ＧＮＰＤＡ１、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ８４、ＧＲＩＮ３Ａ、ＧＳＤＭＤ、ＧＳＴＭ１、ＨＣＳＴ、ＨＥＬＺ２、ＨＥＰＨＬ１、ＩＬ２、ＩＬ２ＲＢ、ＩＲＸ４、ＩＳＭ１、ＫＬＦ７、ＫＬＲＣ４、ＫＲＴ１８、ＬＡＴ、ＬＣＰ２、ＬＨＸ６、ＬＭＮＡ、ＭＡＧＥＡ９Ｂ、ＭＡＰ３Ｋ１２、ＭＥＲＴＫ、ＭＴＭＲ１１、ＮＤＲＧ３、ＮＩＴ１、ＮＬＲＣ３、ＮＬＲＰ２、ＮＰＬＯＣ４、ＯＲＣ１、ＯＳＢＰＬ７、ＯＴＯＰ３、ＯＴＵＤ７Ａ、ＯＴＵＤ７Ｂ、Ｐ２ＲＹ１４、ＰＡＦＡＨ１Ｂ２、ＰＣＰ４、ＰＤＥ３Ａ、ＰＨＦ８、ＰＩＫ３ＡＰ１、ＰＬＡ２Ｇ３、ＰＬＣＧ２、ＰＯＬＫ、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＰＩＬ２、ＰＲＡＣ１、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＤ２、ＲＡＢ６Ａ、ＲＡＣ１、ＲＡＣ２、ＲＩＰＫ３、ＲＲＡＳ２、ＲＹＲ１、ＳＡＦＢ２、ＳＣＮ３Ａ、ＳＤＣＣＡＧ８、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＧＴＡ、ＳＨＯＣ２、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＩＲＴ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＭＣ４、ＳＰＰＬ２Ｂ、ＳＳＵＨ２、ＳＷＡＰ７０、ＴＡＦ１５、ＴＨＥＭＩＳ、ＴＭ４ＳＦ４、ＴＭＥＭ７９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＰＧＳ２、ＴＲＡＦ３ＩＰ２、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＭＴ５、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＶ５、ＴＳＰＹＬ５、ＵＢＡ５２、ＵＢＬ５、ＶＡＶ１、ＷＡＲＳ２、ＺＡＰ７０、ＺＮＦ１４１、ＺＮＦ２９６、およびＺＮＦ７０１。実施例２は、インターロイキン－２産生によって検出された追加の正の制御因子Ｔ細胞を提供する。
これらの遺伝子およびそのコードされるタンパク質に関する配列およびその他の情報は、例えばＮＣＢＩおよびＵｎｉＰＲＯＴデータベースから入手可能であり、これらは参照により組み込まれる。
インターロイキン－２産生によってＴ細胞の正の制御因子として検出される遺伝子のいくつかによってコードされるタンパク質配列のいくつかの例を示す。例えば、インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＡＤＡＭＴＳ５遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＵＮＡ０として入手可能であり、以下に配列番号１２として示される。
このタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＦ１４２０９９およびＡＰ００１６９８としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＣ１２ｏｒｆ８０ ｃＤＮＡ（ＬＩＮＣ０２８７４とも称される）のヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩデータベースからアクセッション番号ＮＲ＿１６４１２７．１として入手可能であり、以下に配列番号１３として示される。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＣＣＤＣ１８３遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ５Ｔ５Ｓ１として入手可能であり、以下に配列番号１４として示される。
このタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０７５８６４およびＡＬ３５５９８７としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＣＩＰＣ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９Ｃ０Ｃ６として入手可能であり、以下に配列番号１５として示される。
ＣＩＰＣタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０５１５２４およびＡＣ００７６８６としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＣＵＬ３遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ１３６１８として入手可能であり、以下に配列番号１６として示される。
Ｑ１３６１８タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＦ０６４０８７およびＡＣ０７３０５２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＥＭＢ（エンビギン）遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ６ＰＣＢ８として入手可能であり、以下に配列番号１７として示される。
このタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＫ３００８６０およびＡＣ０３５１４５としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＥＳＲＰ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ６ＮＸＧ１として入手可能であり、以下に配列番号１８として示される。
Ｑ６ＮＸＧ１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＢＣ０６７０９８およびＡＰ００５６６０としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＦＢＸＬ１３遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ８ＮＥＥ６として入手可能であり、以下に配列番号１９として示される。
ＦＢＸＬ１３タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＹ３５９２３８およびＡＣ００５２５０としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＦＢＸＯ４１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ８ＴＦ６１として入手可能であり、以下に配列番号２０として示される。
ＦＢＸＯ４１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０７５８２０およびＡＣ０１０９１３としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＦＯＳＬ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ１５４０７として入手可能であり、以下に配列番号２１として示されている。
ＦＯＳＬ１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｘ１６７０７およびＡＰ００６２８７としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＦＯＸＯ４遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ９８１７７として入手可能であり、以下に配列番号２２として示される。
ＦＯＸＯ４タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｘ９３９９６およびＡＬ５９０７６４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＦＵＺ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＢＴ０４として入手可能であり、以下に配列番号２３として示される。
ＦＵＺタンパク質をコードするｃＤＮＡ及び染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＫ０２６３４１及びＡＣ００６９４２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
ヒトＩＲＸ４遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ７８４１３として入手可能であり、以下に配列番号２３として示される。
ＩＲＸ４タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＦ１２４７３３およびＡＢ６９０７７８としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＩＳＭ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｂ１ＡＫＩ９として入手可能であり、以下に配列番号２４として示される。
ＩＳＭ１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＢＣ０１７９９７およびＡＬ０５０３２０としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＭＴＭＲ１１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ａ４ＦＵ０１として入手可能であり、以下に配列番号２５として示される。
ＭＴＭＲ１１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｕ７８５５６およびＡＬ５９０４８７としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＮＤＲＧ３遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＵＧＶ２として入手可能であり、以下に配列番号２６として示される。
ＮＤＲＧ３タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０４４９４３およびＡＬ０３１６６２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＮＰＬＯＣ４遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ８ＴＡＴ６として入手可能であり、以下に配列番号２７として示される。
ＮＰＬＯＣ４タンパク質をコードするｃＤＮＡは、アクセッション番号ＡＢ０４０９３２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＯＴＯＰ３遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ７ＲＴＳ５として入手可能であり、以下に配列番号２８として示される。
ＯＴＯＰ３タンパク質をコードするｃＤＮＡ及び染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＢＫ０００５６８及びＡＣ０８７６５１としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＯＴＵＤ７Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ８ＴＥ４９として入手可能であり、以下に配列番号２９として示される。
ＯＴＵＤ７Ａタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、アクセッション番号ＡＪ４３０３８３としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＰＤＥ３Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ１４４３２として入手可能であり、以下に配列番号３０として示される。
ＰＤＥ３Ａタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、アクセッション番号Ｍ９１６６７としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＰＯＬＫ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースから入手可能であり、以下に配列番号３１として示される。
ＰＯＬＫタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０２７５６４およびＡＹ２７３７９７としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＰＲＡＣ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９６ＫＦ２として入手可能であり、以下に配列番号３２として示される。
ＰＲＡＣ１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＦ３３１１６５およびＣＨ４７１１０９としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＳＥＲＰＩＮＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースから入手可能であり、以下に配列番号３３として示される。
ＳＥＲＰＩＮＦ１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｍ７６９７９およびＵ２９９５３としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＳＳＵＨ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９Ｙ２Ｍ２として入手可能であり、以下に配列番号３４として示される。
ＳＳＵＨ２タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０２４７０５およびＡＣ０３４１８７としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＴＭ４ＳＦ４遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ４８２３０として入手可能であり、以下に配列番号３５として示される。
ＴＭ４ＳＦ４タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｕ３１４４９およびＣＨ４７１０５２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
以下の遺伝子は、Ｔ細胞増殖の増加によって検出されるようなＴ細胞の正の制御因子である（表３を参照のこと）：ＡＢＣＢ１、ＡＳＡＰ１、ＡＴＰ１０Ａ、ＤＥＡＦ１、ＦＯＸＫ１、ＩＴＧＡＸ、ＬＣＥ６Ａ、ＬＣＰ２、ＬＥＦＴＹ１、ＭＹＣ、ＮＡＴ８Ｂ、ＯＬＦＭ３、およびＰＬＤ６。表７は、Ｔ細胞増殖の増加によって検出されるＴ細胞のさらなる正の制御因子を提供する。
細胞増殖の増加によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＡＴＰ１０Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｏ６０３１２として入手可能であり、以下に配列番号３６として示される。
ＡＴＰ１０Ａタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０５１３５８およびＡＹ０２９５０４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
細胞増殖の増加によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＬＣＥ６Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ａ０Ａ１８３として入手可能であり、以下に配列番号３７として示される。
ＬＣＥ６Ａタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＤＱ９９１２５１およびＡＬ１６２５９６としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
細胞増殖の増加によって検出されるＴ細胞の正の制御因子であるヒトＮＡＴ８Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＵＨＦ３として入手可能であり、以下に配列番号３８として示される。
ＮＡＴ８Ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、アクセッション番号ＡＦ１８５５７１としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
Ｔ細胞の負の制御因子
以下の遺伝子は、インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子である（表４を参照のこと）：ＡＣＥＲ２、ＡＤＧＲＶ１、ＡＩＦ１Ｌ、ＡＬＰＬ、ＡＭＡＣＲ、ＡＭＺ１、ＡＲＨＧＡＰ３０、ＡＲＨＧＤＩＢ、ＡＲＨＧＥＦ１１、ＡＲＬ１１、ＡＴＰ２Ａ２、Ｂ３ＧＮＴ５、ＢＡＣＨ２、ＢＬＭ、ＢＳＧ、ＢＴＢＤ２、ＢＴＬＡ、ＢＴＲＣ、ＣＡ１１、ＣＡＳＴＯＲ２、ＣＢＬＢ、ＣＣＮＴ２、ＣＣＳＥＲ１、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤＫ６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＰ１６４、ＣＫＡＰ２Ｌ、ＣＬＣＮ２、ＣＬＤＮ２５、ＣＯＬＱ、ＣＳＴ５、ＣＴＮＮＡ１、ＣＹＰ２４Ａ１、ＤＤＩＴ４Ｌ、ＤＥＮＮＤ３、ＤＧＫＧ、ＤＧＫＫ、ＤＧＫＺ、ＤＳＣ１、ＥＢＦ２、ＥＣＥＬ１、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＰＢ４１、ＥＰＳ８Ｌ１、ＦＡＭ３５Ａ、ＦＡＭ５３Ｂ、ＦＡＭ８３Ａ、ＦＫＲＰ、ＦＯＸＡ３、ＦＯＸＦ１、ＦＯＸＦ２、ＦＯＸＩ３、ＦＯＸＪ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＬ２ＮＢ、ＧＡＢＲＱ、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＣＭ２、ＧＣＳＡＭ、ＧＣＳＡＭＬ、ＧＭＦＧ、ＧＮＬ３Ｌ、ＧＲＡＰ、ＧＲＢ２、ＧＲＩＡ１、ＧＴＳＦ１Ｌ、ＨＲＨ２、ＨＹＬＳ１、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＬ２ＲＢ、ＩＮＰＰＬ１、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＫＣＮＶ１、ＫＲＩＴ１、ＬＡＭＢ１、ＬＡＰＴＭ５、ＬＡＴ２、ＬＡＸ１、ＬＣＫ、ＬＥＮＥＰ、ＬＭＯ４、ＬＲＲＣ２５、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＬＹＮ、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＰ４Ｋ１、ＭＢＩＰ、ＭＢＯＡＴ１、ＭＥＴＴＬ２３、ＭＩＰＥＰ、ＭＩＰＯＬ１、ＭＭＰ２１、ＭＳＭＢ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２１、ＭＵＣ８、Ｎ４ＢＰ１、ＮＡＩＦ１、ＮＤＮＦ、ＮＦＡＴＣ１、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＫＸ２－１、ＮＫＸ２－３、ＮＭＢ、ＮＲ２Ｆ１、ＯＤＦ４、ＯＰＲＤ１、ＯＲＣ５、ＯＴＵＤ４、ＰＡＳＤ１、ＰＢＫ、ＰＣＢＰ２、ＰＤＬＩＭ１、ＰＤＰＮ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＩＰ５Ｋ１Ａ、ＰＩＰ５Ｋ１Ｂ、ＰＩＴＰＮＡ、ＰＯＧＺ、ＰＯＬＫ、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＳＴＰＩＰ１、ＰＴＰＮ１２、ＰＴＰＲＣ、ＰＶＲＩＧ、ＲＡＢ１４、ＲＢＰ７、ＲＥＴＲＥＧ１、ＲＦＣ２、ＲＨＣＥ、ＲＮＦ１９Ｂ、ＲＮＦ２、ＲＵＳＣ２、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＨ３ＫＢＰ１、ＳＩＧＬＥＣ６、ＳＩＰＡ１Ｌ１、ＳＬＡ、ＳＬＡ２、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ４４Ａ５、ＳＬＣ４５Ａ１、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＬＣ６Ａ９、ＳＭＡＤ９、ＳＭＡＧＰ、ＳＯＣＳ３、ＳＯＸ１３、ＳＰＡＴＡ３１Ａ１、ＳＰＮ、ＳＰＯＣＫ３、ＳＰＲＥＤ１、ＳＴＡＰ１、ＳＴＫ３５、ＳＵＬＴ６Ｂ１、ＳＹＴ１５、ＴＥＣ、ＴＩＡＭ１、ＴＭＥＭ１５１Ａ、ＴＭＥＭ８７Ｂ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、ＴＮＮＴ２、ＴＲＩＢ２、ＴＲＩＭ２８、ＴＳＰＡＮ１、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＵＢＱＬＮ４、ＵＢＸＮ７、ＵＮＣ１１９、ＵＰＰ１、ＶＰＳ２８、ＷＬＳ、ＺＫＳＣＡＮ４、ＺＮＦ４４５、およびＺＮＦ４７４。表７は、インターフェロン－γ産生によって検出されたＴ細胞の追加の負の制御因子を提供する。
これらの遺伝子およびそのコードされるタンパク質に関する配列およびその他の情報は、例えばＮＣＢＩおよびＵｎｉＰＲＯＴデータベースから入手可能であり、これらは参照により組み込まれる。
インターフェロン－γ産生によってＴ細胞の負の制御因子として検出される遺伝子のいくつかによってコードされるタンパク質配列のいくつかの例が提供される。例えば、インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＡＩＦ１Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＢＱＩ０として入手可能であり、以下に配列番号３９として示される。
ＡＩＦ１Ｌタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＬ１３６５６６およびＡＬ１５７９３８としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＡＲＨＧＤＩＢ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ５２５６６として入手可能であり、以下に配列番号４０として示される。
ＡＲＨＧＤＢタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｌ２０６８８およびＣＨ４７１０９４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＢＬＭ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ５４１３２として入手可能であり、以下に配列番号４１として示されている。
ＢＬＭタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｕ３９８１７およびＡＹ８８６９０２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＢＳＧ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ７ＫＴＪ７として入手可能であり、以下に配列番号４２として示される。
ＢＳＧタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＥ０１４１３４およびＡＡＮ１０６６１．２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＢＴＢＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＢＸ７０として入手可能であり、以下に配列番号４３として示される。
ＢＴＢＤ２タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＦ３５５７９７およびＡＣ００４６７８としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＣＡＳＴＯＲ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ａ６ＮＨＸ０として入手可能であり、以下に配列番号４４として示されている。
ＣＡＳＴＯＲ２タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＢＣ１４７０３０およびＡＣ２４５１５０としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＣＣＳＥＲ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９Ｃ０１３として入手可能であり、以下に配列番号４５として示される。
ＣＣＳＥＲ１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０５１４６７およびＡＣ０９３７２９としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＣＬＣＮ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ５１７８８として入手可能であり、以下に配列番号４６として示される。
ＣＬＣＮ２タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｓ７７７７０およびＡＣ０７８７９７としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＥＢＦ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＨＡＫ２として入手可能であり、以下に配列番号４７として示される。
ＥＢＦ２（ＣＯＥ２）タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＹ７００７７９およびＡＣ０２３５６６としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＦＡＭ８３Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ８６ＵＹ５として入手可能であり、以下に配列番号４８として示される。
ＦＡＭ８３Ａタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、アクセッション番号ＤＱ２８０３２２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＦＯＸＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースから入手可能であり、以下に配列番号４９として示される。
ＦＯＸＦ１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｕ１３２１９およびＡＦ０８５３４３としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＦＯＸＩ３遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ａ８ＭＴＪ６として入手可能であり、以下に配列番号５０として示される。
ＦＯＸＩ３タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＢＮ００１２２２およびＡＣ０１２６７１としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＦＯＸＬ２ＮＢ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ６ＺＵＵ３として入手可能であり、以下に配列番号５１として示される。
ＦＯＸＬ２ＮＢタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＫ１２５３１９およびＡＣ０９２９４７としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＨＹＬＳ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９６Ｍ１１として入手可能であり、以下に配列番号５２として示される。
ＨＹＬＳ１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＫ０５７４７７およびＡＰ０００８４２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＬＡＭＢ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ０７９４２として入手可能であり、以下に配列番号５３として示される。
ＬＡＭＢ１タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｍ６１９１６およびＭ６１９５０としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＬＥＮＥＰ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｌ５として入手可能であり、以下に配列番号５４として示される。
ＬＥＮＥＰタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＦ２６８４７８およびＡＦ１４４４１２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＬＲＲＣ４Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９ＮＴ９９として入手可能であり、以下に配列番号５５として示される。
ＬＲＲＣ４Ｂタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＢＣ０１９６８７およびＡＣ００８７４３としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒト遺伝子によってコードされるＭＡＢ２１Ｌ２タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９Ｙ５８６として入手可能であり、以下に配列番号５６として示される。
ＭＡＢ２１Ｌ２タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＦ２６２０３２およびＡＦ１５５２１９としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＲＥＴＲＥＧ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ９Ｈ６Ｌ５として入手可能であり、以下に配列番号５７として示される。
ＲＥＴＲＥＧ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、アクセッション番号ＡＫ０００１５９としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＳＭＡＤ９遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号０１５１９８として入手可能であり、以下に配列番号５８として示されている。
ＳＭＡＤ９タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号Ｄ８３７６０およびＡＬ１３８７０６としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＳＰＡＴＡ３１Ａ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ５ＴＺＪ５として入手可能であり、以下に配列番号５９として示される。
ＳＰＡＴＡ３１Ａ１タンパク質をコードする染色体配列は、アクセッション番号ＢＸ００５２１４としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターフェロン－γ産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＺＮＦ４４５遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ５９９２３として入手可能であり、以下に配列番号６０として示される。
ＺＮＦ４４５タンパク質をコードするｃＤＮＡは、アクセッション番号ＡＹ２６２２６０としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
以下の遺伝子は、インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子である（表５を参照のこと）：ＡＢＩ３ＢＰ、ＡＥＢＰ１、ＡＨＲ、ＡＮＴＸＲ２、ＡＲＨＧＡＰ１５、ＡＲＨＧＡＰ２７、ＡＲＨＧＤＩＢ、ＡＲＩＤ３Ａ、ＡＲＬ４Ｄ、Ｂ４ＧＡＬＮＴ３、ＢＩＣＤ１、Ｃ１０ｏｒｆ８２、Ｃ１７ｏｒｆ７５、Ｃ１９ｏｒｆ３５、Ｃ１ＲＬ、Ｃ２ｏｒｆ６９、Ｃ６ｏｒｆ１３２、Ｃ９ｏｒｆ８４、ＣＡＢＰ１、ＣＢＬＢ、ＣＣＳＥＲ１、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＳ３、ＣＧＢ３、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬＱ、ＣＰＥＢ３、ＣＲＥＬＤ２、ＣＳＴ９Ｌ、ＤＤＸ５５、ＤＬＧ４、ＤＯＫ１、ＥＢＦ３、ＥＩＦ３Ｋ、ＥＮ２、ＥＯＭＥＳ、ＥＰＢ４１、ＥＴＳ１、Ｆ５、ＦＡＭ９６Ａ、ＦＨＬ１、ＦＯＸＡ３、ＦＯＸＥ１、ＦＯＸＩ３、ＦＯＸＬ２ＮＢ、ＦＵＳ、ＦＵＴ４、ＧＣＳＡＭ、ＧＣＳＡＭＬ、ＧＤＡＰ１Ｌ１、ＧＤＰＤ２、ＧＭＩＰ、ＧＮＬ３Ｌ、ＧＯＬＰＨ３、ＧＲＡＰ、ＧＲＢ２、ＨＡＵＳ７、ＨＥＲＣ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ２、ＨＳＤ１７Ｂ１１、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＮＰＰＬ１、ＩＮＴＳ１０、ＩＴＩＨ２、ＩＴＰＫＡ、ＩＴＰＫＢ、ＩＴＰＫＣ、ＪＤＰ２、ＪＫＡＭＰ、ＪＭＪＤ１Ｃ、ＫＩＡＡ１０２４、ＫＩＦ１５、ＫＩＦ５Ａ、ＫＮＴＣ１、ＬＡＴ２、ＬＡＸ１、ＬＧＲ５、ＬＩＭＥ１、ＬＭＢＲＤ２、ＬＯＣ４０１０５２、ＬＯＮＰ２、ＬＲＣＨ３、ＬＲＲＣ２３、ＬＲＲＣ２５、ＬＲＲＣ５２、ＬＹＮ、ＬＹＰＤ１、ＭＡＡＴＳ１、ＭＡＢ２１Ｌ２、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＰ４Ｋ１、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＴＴＬ９、ＭＩＣＵ１、ＭＲＰＬ１７、ＭＵＣ１、ＮＡＩＦ１、ＮＣＦ２、ＮＤＮＦ、ＮＤＵＦＢ１、ＮＨＰ２、ＮＫＸ２－６、ＮＬＧＮ４Ｙ、ＮＮＴ、ＮＰＩＰＢ９、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＣＡＭ、ＮＲＰ１、ＮＲＳＮ２、ＮＳＵＮ７、ＯＬＦＭＬ１、ＯＭＰ、ＯＰＲＤ１、ＯＲ１Ｋ１、ＯＲ２Ｂ１１、ＯＳＢＰＬ１１、ＯＴＯＧ、ＯＴＵＤ４、ＰＡＴＬ２、ＰＡＸ５、ＰＦＫＬ、ＰＨＦ２、ＰＩＢＦ１、ＰＩＰ５Ｋ１Ａ、ＰＩＰ５Ｋ１Ｂ、ＰＩＴＰＮＣ１、ＰＬＣＬ１、ＰＬＥＫＨＭ２、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＩＣ、ＰＳＲＣ１、ＰＳＴＰＩＰ１、ＰＴＰＮ１２、ＰＴＰＮ２２、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＣ、ＰＶＲＩＧ、ＲＢＰ４、ＲＰＬ１３Ａ、Ｓ１００Ａ２、ＳＡＬＬ４、ＳＡＭＤ８、ＳＥＮＰ６、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＺ６Ｌ、ＳＦＴ２Ｄ１、ＳＨ３ＴＣ１、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＩＴ１、ＳＬＡ、ＳＬＡ２、ＳＬＣ２０Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ２、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＭＡＧＰ、ＳＮＲＮＰ４８、ＳＯＣＳ２、ＳＯＲＢＳ１、ＳＯＸ１３、ＳＰＮ、ＳＰＲＥＤ１、ＳＰＲＥＤ２、ＳＲＰＫ１、ＳＴＡＰ１、ＳＴＫ３８Ｌ、ＳＹＰＬ１、ＴＣＦ１２、ＴＥＸ３５、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＴＭＥＭ１４Ｃ、ＴＭＥＭ２２３、ＴＭＥＭ２６２、ＴＮＮＴ２、ＴＰＲＡ１、ＴＲＩＭ６－ＴＲＩＭ３４、ＴＳＰＡＮ１、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＵＢＥ２Ｗ、ＵＢＲ４、ＵＢＸＮ７、ＵＣＰ１、ＵＩＭＣ１、ＵＬＫ１、ＵＰＫ３Ｂ、ＶＰＳ２８、ＶＳＴＭ５、ＸＫＲ９、ＹＬＰＭ１、ＺＤＨＨＣ７、ＥＢ１、ＺＥＢ２、ＺＮＦ４４５、ＺＮＦ７０、およびＺＮＦ８３１。表７は、インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の追加の負の制御因子を提供する。
これらの遺伝子およびコードされるタンパク質に関する配列およびその他の情報は、例えばＮＣＢＩおよびＵｎｉＰＲＯＴデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によってＴ細胞の負の制御因子として検出される遺伝子のいくつかによってコードされるタンパク質配列のいくつかの例を提供する。例えば、インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＡＢＩ３ＢＰ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ７２７Ｇ０として入手可能であり、以下に配列番号６１として示される。
ＡＢＩ３ＢＰタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＢ０５６１０６およびＣＨ４７１０５２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＧＣＳＡＭＬ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号０４３７４１として入手可能であり、以下に配列番号６２として示される。
ＧＣＳＡＭＬタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、それぞれアクセッション番号ＡＪ２２４５３８およびＡＬ３５６３７８としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
以下の遺伝子は、細胞増殖の減少によって検出されるようなＴ細胞の負の制御因子である（表６を参照のこと）：ＡＢＣＢ１、ＡＳＡＰ１、ＡＴＰ１０Ａ、ＤＥＡＦ１、ＦＯＸＫ１、ＩＴＧＡＸ、ＬＣＥ６Ａ、ＬＣＰ２、ＬＥＦＴＹ１、ＭＹＣ、ＮＡＴ８Ｂ、ＯＬＦＭ３、ＰＬＤ６、ＰＲＥＰ、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＳＵＬＴ１Ａ４、ＡＨＮＡＫ、ＡＲＨＧＤＩＢ、Ｂ３ＧＮＴ５、ＣＡＳＺ１、ＣＤ２７、ＣＥＢＰＢ、ＣＲＨＢＰ、ＦＬＩ１、ＦＯＳＬ２、ＨＬＸ、ＭＡＰ４Ｋ１、ＭＵＣ２１、ＭＸＩ１、ＮＤＲＧ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ３、ＳＭＡＧＰ、ＳＯＸ１３、ＳＰ１４０、ＴＰＩ１およびＴＴＣ３９Ｃ。表７は、細胞増殖の減少によって検出されるＴ細胞の追加の負の制御因子を提供する。
細胞増殖の減少によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＳＵＬＴ１Ａ４遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｐ０ＤＭＮ０として入手可能であり、以下に配列番号６３として示される。
ＳＵＬＴ１Ａ４タンパク質をコードする染色体配列は、アクセッション番号ＡＣ１０６７８２としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
細胞増殖の減少によって検出されるＴ細胞の負の制御因子であるヒトＳＬＣ４３Ａ３遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲＯＴデータベースからアクセッション番号Ｑ８ＮＢＩ５として入手可能であり、以下に配列番号６４として示される。
ＳＬＣ４３Ａ３タンパク質をコードするｃＤＮＡおよび染色体配列は、アクセッション番号ＡＢ０２８９２７およびＡＰ０００７８１としてＮＣＢＩデータベースから入手可能である。
本明細書に記載されたこれらの遺伝子またはこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質のいずれもが、Ｔ細胞を制御することができる。
本明細書で提供される配列は例示的なものである。これらの配列のアイソフォームおよびバリアント、ならびに表１～７または図１～４に記載された制御因子のいずれかも、本明細書に記載される方法および組成物において使用することができる。
例えば、タンパク質および核酸のアイソフォームおよびバリアントは、それらが表１～７または図１～４に記載された遺伝子またはコードされたタンパク質と実質的に同一である場合に、本明細書に記載された方法および組成物において使用することができる。「実質的に同一」という用語は、ポリペプチドまたは核酸が、基準配列に対して５５～１００％の配列同一性を有する配列、例えば、指定された比較ウィンドウにわたって基準配列に対して少なくとも５５％の配列同一性、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列からなることを示す。最適なアラインメントは、ニードルマンおよびブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－５３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して確認または実施することができる。
２つのポリペプチド配列が実質的に同一であることを示す指標は、両ポリペプチドが同じ機能－Ｔ細胞またはＴ細胞活性の制御因子として作用する－を有することである。制御因子配列と実質的に同一であるポリペプチドは、制御因子と全く同じレベルの活性を有していない可能性がある。その代わりに、実質的に同一なポリペプチドは、表１～７もしくは図１～４に記載されたもの、または本明細書に記載された配列のいずれかよりも高いレベルまたは低いレベルの制御因子活性を示す場合がある。例えば、実質的に同一のポリペプチドまたは核酸は、同様のアッセイ手順で測定した場合に、本明細書に記載の制御因子の少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約１００％、または少なくとも約１０５％、または少なくとも約１１０％、または少なくとも約１２０％、または少なくとも約１３０％、または少なくとも約１４０％、または少なくとも約１５０％、または少なくとも約２００％の活性を有し得る。
あるいは、実質的な同一性は、第２のポリペプチドが第１のポリペプチド（例えば、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかによってコードされるポリペプチド）に対して上昇させた抗体と免疫学的に反応する場合に存在する。したがって、ポリペプチドは、例えば、２つのポリペプチドが保存的置換によってのみ異なっている場合、第１のポリペプチドと実質的に同一である。さらに、抗体が認識するエピトープが実質的に同一である場合に、非保存的な変化によって異なっている場合、ポリペプチドは第１のポリペプチドと実質的に同一であり得る。「実質的に類似している」ポリペプチドは、同一でないいくつかの残基の位置が保存的アミノ酸変化によって異なり得ることを除いては、上記のように配列を共有している。
発現系
１種もしくは複数の制御因子タンパク質をコードする核酸セグメント、または阻害性核酸もしくはそのような制御因子である核酸セグメントは、適切な発現系のいずれかに挿入され得るか、または適切な発現系のいずれかと共に使用することができる。制御因子タンパク質の発現または活性を調節し得る１種または複数の薬剤をコードする核酸セグメントは、適切な発現系のいずれかに挿入することができ、または適切な発現系のいずれかと共に使用することができる。治療有効量の１種または複数の制御因子タンパク質またはそのような制御因子タンパク質の調節因子を、そのような発現系から生成することができる。治療有効量の１種または複数の阻害性核酸も、そのような発現系から生成することができる。
核酸（または阻害性核酸）の組換え発現は、プラスミドなどのベクターを使用して有用に達成される。ベクターは、１種または複数の制御因子／調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ／ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）タンパク質をコードする核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。別の例では、ベクターは、制御因子／調節因子阻害性核酸をコードする核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。
ベクターは、転写および翻訳に必要な他の要素も含み得る。本明細書で使用される場合、ベクターとは、外来性ＤＮＡを含む担体を指す。したがって、ベクターは、外因性核酸を分解することなく細胞内に輸送し、外因性核酸が送達される細胞において核酸の発現をもたらすプロモーターを含む薬剤である。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。様々な原核生物および真核生物の発現ベクターが、制御因子／調節因子の担持、コードおよび／または発現に適している。制御因子／調節因子阻害性核酸を担持、コードおよび／または発現させるのに適した様々な原核生物および真核生物発現ベクターを使用することができる。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、および酵母ベクターが挙げられる。このようなベクターは、例えば、様々なインビボおよびインビトロの状況で使用することができる。
発現カセット、発現ベクター、およびカセットまたはベクター中の配列は異種であり得る。本明細書で使用される場合、発現カセット、発現ベクター、調節配列、プロモーター、または核酸に関して使用される場合、「異種」という用語は、何らかの方法で操作された発現カセット、発現ベクター、調節配列、または核酸を指す。例えば、異種プロモーターは、天然には目的の核酸に連結されていないプロモーター、または細胞形質転換手順によって細胞に導入されたプロモーターであり得る。異種核酸またはプロモーターはまた、生物に対してネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）であるが、何らかの方法で改変された（例えば、異なる染色体位置に配置され、変異され、多重コピーに付加され、ネイティブでないプロモーターまたはエンハンサー配列に連結されたなど）核酸またはプロモーターも含む。異種核酸は、ｃＤＮＡ形態を含む配列を含むことがあり；ｃＤＮＡ配列は、センス方向（ｍＲＮＡを産生する）またはアンチセンス方向（ｍＲＮＡ転写物に相補的なアンチセンスＲＮＡ転写物を産生する）のいずれかで発現され得る。異種コード領域は、例えば、異種コード領域が、コード領域に天然において付随することが見出されないプロモーターなどの調節エレメントを含むヌクレオチド配列と結合している場合、または異種コード領域が、天然においては見出されない染色体の一部（例えば、コード領域によってコードされるタンパク質が通常発現されない遺伝子座で発現される遺伝子）に付随している場合に、内因性コード領域と区別することができる。同様に、異種プロモーターは、天然においては連結されていないコード領域に連結されたプロモーターであり得る。
使用することができるウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経細胞栄養ウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｒｏｐｈｉｃ ｖｉｒｕｓ）、シンドビス、およびその他のウイルスに関するものが挙げられる。また、ベクターとして使用するのに適したこれらのウイルスの特性を共有するウイルスファミリーも有用である。使用することができるレトロウイルスベクターとしては、バルマ（Ｖｅｒｍａ），Ｉ．Ｍ．，遺伝子導入用レトロウイルスベクター（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ－１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９－２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）に記載されているものが挙げられる。例えば、このようなレトロウイルスベクターは、望ましい特性を発現するモロニーマウス白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、および他のレトロウイルスを含み得る。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびカプセル化に必要な逆末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含む。ベクターとして操作される場合、ウイルスは通常１種または複数の初期遺伝子を除去され、除去されたウイルス核酸の代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットがウイルスゲノムに挿入される。
発現カセットおよび／または発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始配列、転写終結配列、その他のエレメントなど、様々な調節エレメントを含めることができる。「プロモーター」は一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にある場合に機能する１つまたは複数のＤＮＡの配列である。例えば、プロモーターは制御因子タンパク質をコードする核酸セグメントの上流にあり得る。別の例では、プロモーターは、１種または複数の制御因子に対する調節剤の阻害性核酸セグメントの上流にあり得る。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。「エンハンサー」は一般に、転写開始部位からの距離に関係なく機能するＤＮＡの配列を指し、転写単位に対して５’または３’のいずれかに存在し得る。さらに、エンハンサーはイントロン内に、ならびにコード配列自体にも存在し得る。エンハンサーは通常、長さが１０～３００であり、シスで機能する。エンハンサーは近くのプロモーターからの転写を増大させるように機能する。エンハンサーも、プロモーターと同様に、転写の制御を仲介する応答エレメントを含むことが多い。エンハンサーはしばしば発現制御を決定する。
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を与え得る転写終結のための配列を含むこともできる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写される。また、３’非翻訳領域は転写終結部位を含む。転写ユニットはポリアデニル化領域をも含んでいることが好ましい。この領域の１つの利点は、転写されたユニットがｍＲＮＡのようにプロセシングされ輸送される可能性が向上することである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。導入遺伝子構築物には相同なポリアデニル化シグナルを用いることが好ましい。
発現カセットまたは発現ベクターからの制御因子／調節因子タンパク質またはその阻害性核酸分子の発現は、原核細胞または真核細胞で発現可能なプロモーターのいずれかによって制御することができる。使用することができる原核生物プロモーターの例としては、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ、またはマルトースプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる真核生物プロモーターの例としては、構成的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、およびＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびに制御可能プロモーター、例えばｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター、ＣＲＥによって制御される合成プロモーターなどの誘導性または抑制性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。細菌発現用のベクターとしてはｐＧＥＸ－５Ｘ－３が挙げられ、真核生物発現用のベクターとしてはｐＣＩｎｅｏ－ＣＭＶが挙げられる。
発現カセットまたはベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に導入され、導入された後に発現されているかどうかを決定するために使用される。マーカー遺伝子は、β－ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、マーカーは選択可能マーカーであり得る。このような選択可能マーカーが宿主細胞にうまく導入されると、形質転換された宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生存することができる。選択的レジームには、広く使用されている２つの異なるカテゴリーがある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝に基づいており、補給培地に依存せずに増殖する能力を欠く変異細胞株を使用する。第２のカテゴリーは優性選択であり、細胞型のいずれかに使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは、通常、宿主細胞の増殖を止めるために薬剤を使用する。新規遺伝子を有する細胞は薬剤耐性を示すタンパク質を発現し、選択から生存する。このような優性選択の例は、ネオマイシン（サウザン Ｐ．（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．）およびバーグ Ｐ．（Ｂｅｒｇ，Ｐ．），Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（ムリガン Ｒ．Ｃ．（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．）およびバーグ Ｐ．（Ｂｅｒｇ，Ｐ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン（サグデンＢ．（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０－４１３（１９８５））を使用する。
遺伝子導入は、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体などの遺伝物質を直接導入する方法、または細胞もしくはカチオン性リポソームなどの担体に遺伝物質を導入する方法を用いて得ることができるが、これらに限定されない。このような方法は当技術分野でよく知られており、本明細書に記載される方法での使用に容易に適応可能である。導入ベクターは、遺伝子を細胞に導入するために使用されるヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）のいずれか、または遺伝子を送達する一般的な戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部として使用することができる（ラム（Ｒａｍ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３－８８、（１９９３））。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、またはエレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散などの物理機械的方法を含むトランスフェクションのための適切な手段は、例えば、ウォルフ Ｊ．Ａ．（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５－１４６８，（１９９０）；およびウォルフ Ｊ．Ａ．（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．）Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５－８１８，（１９９１）によって開示されている。
例えば、制御因子／調節因子タンパク質、あるいはその阻害核酸分子をコードする核酸分子、発現カセットおよび／またはベクターは、カルシウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、粒子線照射などを含むがこれらに限定されないいずれかの方法によって細胞に導入することができる。細胞は培養で増殖させた後、対象、例えばヒトのような哺乳動物に投与することができる。投与される細胞の量または数は変動し、約１０６～約１０９細胞の範囲の量を用いることができる。一般に生理食塩水または緩衝生理食塩水などの生理的溶液中の細胞が送達される。細胞はまた、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）の集団のようなビヒクルで送達することもできる。
場合によっては、トランスジェニック細胞は、１種または複数の制御因子／調節因子をコードする核酸分子、発現カセットおよび／またはベクターを含むエクソソームまたはマイクロベシクルを産生することができる。場合によっては、トランスジェニック細胞は、制御因子／調節因子核酸、１種または複数の制御因子用核酸、またはそれらの組合せを標的とし得る阻害性核酸分子を含むエクソソームまたはマイクロベシクルを産生することができる。マイクロベシクルは、多種多様なタンパク質、脂質、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡの分泌を媒介し、隣接する細胞と相互作用し、それによってシグナル、タンパク質、脂質、核酸を細胞から細胞へと伝達することができる（例えば、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される、シェン（Ｓｈｅｎ）ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８６（１６）：１４３８３－１４３９５（２０１１）；フー（Ｈｕ）ら，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３（２０１２年４月）；ペグテル（Ｐｅｇｔｅｌ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ Ｓｃｉ １０７（１４）：６３２８－６３３３（２０１０）；ＷＯ／２０１３／０８４０００；を参照されたい）。このようなマイクロベシクルを産生する細胞は、１種または複数の制御因子／調節因子タンパク質、および／または１種または複数の制御因子／調節因子に対する阻害性核酸、またはそれらの組合せを発現するために使用することができる。
異種発現カセットまたは発現ベクターを有するトランスジェニックベクターまたは細胞は、１種または複数の制御因子を発現することができ、場合により１種または複数の制御因子阻害核酸も発現することができ、またはそれらの組合せも発現することができる。これらのベクターまたは細胞のいずれかを対象に投与することができる。トランスジェニック細胞によって産生されたエクソソームは、制御因子／調節因子タンパク質、制御因子／調節因子核酸、制御因子／調節因子阻害核酸、またはそれらの組合せを、対象、または対象中の腫瘍およびがん細胞に投与するために使用することができる。
阻害性核酸、抗体、またはそれらの任意の組合せのような制御因子の１つの阻害剤を含む方法および組成物。
ＣＲＩＳＰＲ改変
場合によっては、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）システムを用いて、ゲノム制御因子遺伝子に１つ以上の改変を加えることができる。このようなＣＲＩＳＰＲ修飾は、制御因子遺伝子産物の発現または機能を低下または活性化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、ＲＮＡプログラム可能なゲノム編集に有用である（例えば、全てが参照によりその全体が本明細書に援用される、マーラフィニ（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ）およびソンテイマー（Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ）．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：１８１－１９０（２０１０）；ソレク（Ｓｏｒｅｋ）ら．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００８ ６：１８１－６；カーギノフ（Ｋａｒｇｉｎｏｖ）およびハンノン（Ｈａｎｎｏｎ）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２０１０ １：７－１９；ヘール（Ｈａｌｅ）ら．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２０１０：４５：２９２－３０２；ジネク（Ｊｉｎｅｋ）ら．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ ３３７：８１５－８２０；ビカード（Ｂｉｋａｒｄ）およびマーラフィニ（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１２ ２４：１５－２０；ビカード（Ｂｉｋａｒｄ）ら．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２０１２ １２：１７７－１８６を参照されたい）。
ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、Ｃａｓ酵素をゲノムの所望の位置に標的化することができ、それにより、ゲノムＤＮＡを切断してゲノム改変体を生成することができる。この技術は、例えば、参照により全体が本明細書に援用される、マリ（Ｍａｌｉ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９：８２３－６に記載されている。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集の設計および使用のためのキットは市販されており、例えば、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カナダ、マウンテンビューからＰＲＥＣＩＳＩＯＮ Ｘ ＣＡＳ９ ＳＭＡＲＴ ＮＵＣＬＥＡＳＥ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号ＣＡＳ９００Ａ－１）が入手可能である。
場合によっては、転写活性化因子は、欠陥のあるＣａｓ９、または転写活性化因子を標的とする１種または複数のガイドＲＮＡに連結され得る。そのような転写活性化因子としては、表１～７または図１～４に記載された、１種または複数の制御因子遺伝子の転写を増加させるために、補因子およびＲＮＡポリメラーゼの動員を補助するタンパク質ドメインまたは全タンパク質が挙げられる。
場合によっては、アブレムスキ（Ａｂｒｅｍｓｋｉ）ら、１９８３．Ｃｅｌｌ ３２：１３０１（１９８３），スターンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）ら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＸＬＶ ２９７（１９８１）などに記載されているバクテリオファージＰ１のｃｒｅ－ｌｏｘ組換えシステムを用いて、組換えおよび制御因子ゲノム部位の改変を促進することができる。ｃｒｅ－ｌｏｘシステムは、バクテリオファージＰ１から単離されたｃｒｅリコンビナーゼを、このリコンビナーゼが認識するＤＮＡ配列（ｌｏｘ部位と呼ばれる）と共に利用する。この組換えシステムは、植物細胞（例えば、米国特許第５，６５８，７７２号を参照されたい）、動物細胞（米国特許第４，９５９，３１７号および米国特許第５，８０１，０３０号）、およびウイルスベクター（ハーディー（Ｈａｒｄｙ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：１８４２（１９９７））において組換えを達成するのに有効であった。
このように組み込まれたゲノム変異は、コードされた制御因子遺伝子産物中の１つまたは複数のアミノ酸を変化させることができる。例えば、コードされた制御因子タンパク質が分解されやすくなるように、安定性が低下してそのようなタンパク質の半減期が短くなるように、または制御因子の発現または機能が改善されるようにゲノム部位が改変される。別の例では、制御因子ポリペプチドの少なくとも一つのアミノ酸を欠失させるか、または変異させて、その活性を変えるようにゲノム部位を改変することができる。例えば、制御因子ポリペプチドの活性を改善または低下させるために、保存アミノ酸または保存ドメインを改変することができる。例えば、制御因子ポリペプチドの保存ドメイン中の保存アミノ酸またはいくつかのアミノ酸を、保存アミノ酸とは異なる物理的および／または化学的性質を有する１つまたは複数のアミノ酸で置換することができる。例えば、保存アミノ酸の物理的および／または化学的性質を変化させるために、保存アミノ酸を欠失させるか、または別のクラスのアミノ酸で置換させることができ、ここでクラスは以下の表で特定される。
ガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼは、１つまたは複数の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）、ウイルス様粒子、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）、ナノ粒子、リポソーム、またはそれらの組合せによるなど、１つまたは複数のビヒクルを介して導入することができる。ビヒクルは、特定の種類の細胞を標的とする（例えば、細胞表面マーカーを認識する抗体）、細胞浸透を促進する、分解を低減する、またはそれらの組合せを可能にする成分または薬剤を含み得る。
阻害性核酸
例えば、制御因子または調節因子をコードする核酸を特異的に認識する阻害性核酸を使用することにより、１種または複数の制御因子／調節因子の発現を阻害することができる。
阻害性核酸は、細胞内またはストリンジェントな条件下で制御因子核酸または調節因子とハイブリダイズする少なくとも１つのセグメントを有し得る。阻害性核酸は制御因子／調節因子核酸の発現を低下させることができる。核酸は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、またはそれらの組合せにハイブリダイズする可能性がある。阻害性核酸はプラスミドベクターまたはウイルスＤＮＡに組み込まれ得る。核酸は１本鎖であっても２本鎖であってもよく、環状であっても直鎖状であってもよい。
阻害性核酸は、１３ヌクレオチド以上の長さを有するリボースヌクレオチドまたはデオキシリボースヌクレオチドのポリマーである。阻害性核酸としては、天然に存在するヌクレオチド；ホスホロチオレートのような合成、修飾、または擬似ヌクレオチド；ならびにＰ３２、ビオチンまたはジゴキシゲニンのような検出可能な標識を有するヌクレオチドを挙げることができる。阻害性核酸は、制御因子／調節因子核酸の発現および／または活性を低下させることができる。このような阻害性核酸は、内因性の制御因子／調節因子核酸（例えば、ＲＮＡ）のセグメントと完全に相補的であってもよい。あるいは、制御因子／調節因子配列に対する阻害性核酸配列にはある程度の可変性が許容される。阻害性核酸は、細胞内条件下またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で制御因子／調節因子核酸とハイブリダイズすることができ、内因性の制御因子／調節因子核酸の発現を阻害するのに十分な相補性を有している。細胞内条件とは、細胞、例えば動物または哺乳動物細胞内に通常に見出される温度、ｐＨおよび塩濃度のような条件を指す。このような動物または哺乳動物細胞の一例は、骨髄系前駆細胞である。このような動物または哺乳動物細胞の別の例は、骨髄系前駆細胞から派生したより分化した細胞である。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件は、本明細書において別に定義されるストリンジェンシーの所望の程度に応じて、選択された配列の熱融点より約１℃～約２０℃低い範囲の温度を包含する。例えば、制御因子／調節因子コード配列に正確に相補的である隣接したヌクレオチドの２、３、４、または５またはそれ以上のストレッチを含み、各ストレッチが隣接するコード配列に相補的でない隣接したヌクレオチドのストレッチによって分離されている阻害性オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される制御因子または調節因子のいずれかについての１または複数の核酸の機能を阻害することができる。一般に、隣接するヌクレオチドの各ストレッチは、少なくとも４、５、６、７、または８ヌクレオチド以上の長さである。非相補的な介在配列は、１、２、３、または４ヌクレオチドの長さであってもよい。当業者は、センス核酸にハイブリダイズした阻害性核酸の計算融点を用いて、特定の標的核酸の発現を阻害するのに許容されるミスマッチの程度を容易に推定することができる。本発明の阻害性核酸としては、例えば、ショートヘアピンＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイムまたはアンチセンス核酸分子が挙げられる。
阻害性核酸分子は１本鎖であっても２本鎖であってもよく（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））、酵素依存的に機能してもよいし、立体障害によって機能してもよい。酵素依存的に機能する阻害性核酸分子としては、標的ｍＲＮＡを分解するＲＮａｓｅ Ｈ活性に依存する形態が挙げられる。これらとしては、１本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホスホロチオエート分子、ならびにセンス－アンチセンス鎖の対合による標的ｍＲＮＡの認識とそれに続くＲＮＡ誘導サイレンシング複合体による標的ｍＲＮＡの分解を伴う２本鎖ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ系が挙げられる。ＲＮａｓｅ－Ｈに依存しない立体障害阻害性核酸は、標的ｍＲＮＡに結合して他の方法を阻害することにより、遺伝子発現または他のｍＲＮＡ依存性細胞プロセスを阻害する。立体障害阻害性核酸としては、２’－Ｏアルキル（通常ＲＮａｓｅ－Ｈ依存性アンチセンスとのキメラ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルフォリノアンチセンスなどが挙げられる。
例えば、小干渉ＲＮＡは、コードされた制御因子／調節因子ポリペプチドの翻訳が減少するように、制御因子／調節因子の翻訳を特異的に減少させるために使用される場合がある。ＳｉＲＮＡは配列特異的に転写後遺伝子サイレンシングを行う。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｒｎａｉ．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照されたい。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に組み込まれると、ｓｉＲＮＡは複合体を相同ｍＲＮＡ転写体に誘導することにより、相同内在ｍＲＮＡ転写体の切断を媒介し、次いで複合体により切断される。ｓｉＲＮＡは、制御因子／調節因子の転写物および／または制御因子／調節因子の転写物の任意の領域と相同的および／または相補的であってもよい。相同性の領域は３０ヌクレオチド以下の長さ、好ましくは２５ヌクレオチド以下、より好ましくは約２１～２３ヌクレオチドの長さであってもよい。ＳｉＲＮＡは通常は２本鎖であり、２ヌクレオチドの３’オーバーハング、例えば３’オーバーハングのＵＵジヌクレオチドを有していてもよい。ｓｉＲＮＡを設計する方法は当業者に公知である。例えば、エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４－４９８（２００１）；ハーバース（Ｈａｒｂｏｒｔｈ）ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１３：８３－１０６（２００３）を参照されたい。
ヘアピンｓｉＲＮＡ発現用ｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＮｅｏベクターは、ＩＭＧＥＮＥＸ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されており、制御因子／調節因子の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡを製造するのに使用することができる。ｓｉＲＮＡ発現プラスミドの構築には、ｍＲＮＡの標的領域の選択が必要であり、これは試行錯誤の過程である。しかし、エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）らは、約８０％の確率で機能すると思われるガイドラインを提供している。エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ），Ｓ．Ｍ．ら、哺乳動物体細胞における低分子干渉ＲＮＡを用いた遺伝子機能解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００２．２６（２）：ｐ．１９９－２１３。したがって、合成ｓｉＲＮＡの合成には、好ましくは、開始コドンの５０～１００ヌクレオチド下流に標的領域を選択することができる。５’および３’非翻訳領域および開始コドンに近い領域は、制御タンパク質結合部位が豊富である可能性があるため回避すべきである。ｓｉＲＮＡはＡＡで始まり、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖ともに３’ＵＵオーバーハングを有しておりＧ／Ｃ含量は約５０％である。合成ｓｉＲＮＡの配列の例は、５’－ＡＡ（Ｎ１９）ＵＵであり、ＮはｍＲＮＡ配列中の任意のヌクレオチドであり、Ｇ－Ｃ含量は約５０％であるべきである。選択された配列は、ヒトゲノムデータベース内の他の配列と比較し、他の既知のコード配列との相同性を最小化することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを介したＢｌａｓｔ検索など）。
ＳｉＲＮＡは化学的に合成することができ、インビトロ転写によって作製することができ、またはｓｉＲＮＡ発現ベクターまたはＰＣＲ発現カセットから発現させることができる。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ－ａｎｄ－Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｒｎａｉ．ｈｔｍｌのウェブサイトを参照されたい。ｓｉＲＮＡが発現ベクターまたはＰＣＲ発現カセットから発現される場合、ｓｉＲＮＡをコードする挿入物は、ｓｉＲＮＡヘアピンに折り畳まれるＲＮＡ転写物として発現され得る。したがって、ＲＮＡ転写物は、３’末端のＵの文字列と同様に、ヘアピンのループを形成するスペーサー配列によって、その逆相補的アンチセンスｓｉＲＮＡ配列に連結されるセンスｓｉＲＮＡ配列を含む場合がある。ヘアピンのループは、あらゆる適切な長さ、例えば、３～３０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、３～２３ヌクレオチドの長さであってもよく、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号６１）を含む種々のヌクレオチド配列であってもよい。ＳｉＲＮＡはまた、直接、あるいは導入遺伝子やウイルスを介して導入された２本鎖ＲＮＡの切断によってインビボで産生される場合もある。いくつかの生物では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる増幅が起こる場合もある。
ショートヘアピンＲＮＡ ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの阻害性核酸は、阻害性核酸の配列を含む発現ベクターまたは発現カセットからの発現などの方法を用いて調製することができる。あるいは、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはそれらの組合せのいずれかを用いた化学合成によって調製してもよい。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、例えば、阻害性核酸の生物学的安定性を増大させるように、または阻害性核酸と標的制御因子／調節因子核酸との間に形成される二重鎖の細胞内安定性を増大させるように設計された修飾ヌクレオチドまたは非ホスホジエステル結合から作製される。
阻害性核酸は、例えば、本明細書に記載の制御因子／調節因子核酸の相補性配列をコードする発現ベクターからの発現によって、利用可能な方法を用いて調製することができる。あるいは、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、またはそれらの組合せの混合物のいずれかを用いた化学合成によって調製することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の制御因子／調節因子の核酸は、例えば、核酸の生物学的安定性を増大させるように、または阻害性核酸と他の（例えば、内因性）核酸との間に形成される二重鎖の細胞内安定性を増大させるように設計された修飾ヌクレオチドまたは非ホスホジエステル結合から作製される。
例えば、制御因子／調節因子核酸は、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合を有するペプチド核酸であり得る。
制御因子／調節因子核酸に使用することができる天然に存在するヌクレオチドとしては、リボースまたはデオキシリボースのヌクレオチドであるアデノシン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。制御因子／調節因子核酸に使用することができる修飾ヌクレオチドの例としては、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸、ウィブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。
したがって、本明細書に記載の制御因子／調節因子の阻害性核酸は、修飾ヌクレオチド、ならびにリボースおよびデオキシリボースヌクレオチドの組合せのような天然ヌクレオチドを含み得る。阻害性核酸は、本明細書に記載の野生型の制御因子／調節因子と同じ長さであってもよい。本明細書に記載の制御因子／調節因子の阻害性核酸はまた、より長く、他の有用な配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される制御因子／調節因子の阻害性核酸は、いくらか短い。例えば、本明細書に記載の制御因子／調節因子の阻害性核酸は、５’末端または３’末端から５ヌクレオチドまで欠損、または１０ヌクレオチドまで欠損、または２０ヌクレオチドまで欠損、または３０ヌクレオチドまで欠損、または５０ヌクレオチドまで欠損、または１００ヌクレオチドまで欠損し得る核酸配列を有するセグメントを含み得る。
抗体
抗体は、本明細書に記載の制御因子／調節因子のいずれかの阻害剤または活性化剤として使用することができる。例えば、場合によっては、抗体製剤は、本明細書に記載の１種または複数の制御因子または調節因子を標的にして、本明細書に記載の制御因子／調節因子による相互作用を遮断するか、または制御因子／調節因子の活性を低下させることができる。他の例では、例えば、抗体は細胞表面レセプターである本明細書に記載の１種または複数の制御因子または調節因子を活性化することができる。このような活性化の一例として、現在臨床試験中のバルリルマブ（ＣＤ２７活性化抗体）があり、抗腫瘍Ｔ細胞機能を増大させることが示されている（アンセル（Ａｎｓｅｌｌ）ら（２０２０）Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ．４（９）：１９１７－１９２６）。
抗体は、本明細書に記載の制御因子／調節因子の種々のエピトープに対して上昇し得る。本明細書に記載の制御因子／調節因子に対する抗体のいくつかは市販もされている。しかしながら、本明細書に記載の方法および組成物に従って処置するように意図される抗体は、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体であり、標的に対して高度に特異的である。
一態様において、本開示は、本明細書に記載の制御因子／調節因子に特異的に結合する単離された抗体の使用に関する。このような抗体はモノクローナル抗体であってもよい。このような抗体はまた、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、本明細書に記載の１種または複数の制御因子／調節因子に対する高親和性結合、または本明細書に記載の制御因子／調節因子のいずれかの機能を阻害する能力のような、１種または複数の望ましい機能的特性を示すことができる。
本明細書に記載の方法および組成物は、本明細書に記載の制御因子／調節因子のいずれかと結合する抗体、または各抗体型が本明細書に記載の制御因子／調節因子の１種と別々に結合できる抗体の組合せを含み得る。
本明細書で言及される「抗体」という用語としては、抗体全体、抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはその１本鎖が挙げられる。「抗体」とは、少なくとも２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ）がジスルフィド結合で連結された糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインから構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域、およびフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い領域にさらに細分化される。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んでいる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、本明細書に記載のいずれかの制御因子／調節因子のペプチドまたはドメイン）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片でも行い得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（ワード（Ｗａｒｄ）ら．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって１価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって結合され得る（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、バード（Ｂｉｒｄ）ら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６；およびハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。このような１本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技術を用いて得られ、無傷の抗体と同様の方法で有用性がスクリーニングされる。
本明細書で使用する場合、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、本明細書に記載の制御因子／調節因子のいずれかと特異的に結合する単離された抗体は、本明細書に記載の制御因子／調節因子のいずれかを除く抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、本明細書に記載の制御因子／調節因子と特異的に結合する単離された抗体は、他の種の制御因子／調節因子タンパク質のアイソフォームまたは関連形態のような他の抗原に対して交差反応性を有することがある。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性と親和性を示す。
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がいずれも、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでいてもよい。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図するものではない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域がいずれも、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
本明細書で使用される場合、「組換えヒト抗体」という用語には、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたはトランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）から単離された抗体、またはそこから調製されたハイブリドーマ（以下にさらに記載）、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う他の手段により調製、発現、作製または単離された抗体など、組換え手段により調製、発現、作製または単離された全てのヒト抗体が含まれる。このような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、このような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニック動物が使用される場合は、インビボ体細胞変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＬおよびＶＨ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＬおよびＶＨ配列に由来し、それに関連するものの、インビボではヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然には存在しない配列である場合がある。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の改変体、例えば抗体と他の薬剤や抗体とのコンジュゲートを指す。
「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖細胞系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を指す。ヒトフレームワーク配列内では、さらなるフレームワーク領域の改変を行ってもよい。
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がマウス抗体由来で定常領域配列がヒト抗体由来である抗体など、可変領域配列がある種の由来であり、定常領域配列が別の種の由来である抗体を指す。
本明細書で使用する場合、「本明細書に記載のヒト制御因子／調節因子タンパク質に特異的に結合する」抗体は、本明細書に記載のヒト制御因子／調節因子タンパク質に１ｘ１０－７Ｍ以下、より好ましくは５×１０－８Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０－９Ｍ以下、さらに好ましくは１×１０－８Ｍ以上１×１０－１０Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を指すことを意図している。
本明細書で使用される場合、「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を指すことを意図し、一方、本明細書で使用される場合、「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を指すことを意図する。本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、Ｋａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すことを意図している。抗体のＫＤ値は、当技術分野で確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いることであり、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いる。
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性によって特徴付けられる。例えば、抗体は本明細書に記載のヒト制御因子／調節因子に特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体は、高い親和性、例えば１×１０－７Ｍ以下のＫＤで、本明細書に記載の制御因子／調節因子に結合する。抗体は、以下の特徴の１つ以上を示し得る：
（ａ）１×１０－７Ｍ以下のＫＤで本明細書に記載のヒト制御因子／調節因子に結合する；
（ｂ）本明細書に記載のヒト制御因子／調節因子の機能または活性を阻害する；
（ｃ）がん（例えば、転移性がん）を抑制する；または
（ｄ）それらの組合せ。
本明細書に記載のヒト制御因子／調節因子に対する抗体の結合能を評価するためのアッセイとしては、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡなどを使用することができる。抗体の結合動態（例えば、結合親和性）もまた、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）分析のような当技術分野で公知の標準的なアッセイによって評価することができる。
各対象抗体が本明細書に記載のヒト制御因子／調節因子に結合し得ることを考慮すると、ＶＬおよびＶＨ配列を「混合およびマッチング」（ｍｉｘｅｄ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ）して、本明細書に記載のヒト制御因子／調節因子に結合する他の結合分子を製造することができる。このような「混合およびマッチド」抗体の結合特性は、上記の結合アッセイを用いて試験し、実施例に記載したアッセイで評価することができる。ＶＬ鎖とＶＨ鎖を混合およびマッチングさせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＨ配列を構造的に類似したＶＨ配列に置換することができる。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対からのＶＬ配列は、構造的に類似したＶＬ配列に置換される。
したがって、一態様において、本発明は、
（ａ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分であって、該抗体は、本明細書に記載のヒト制御因子／調節因子と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体を提供する。
場合によっては、ＣＤＲ３ドメインは、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインとは独立して、単独で、同族抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができ、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有する複数の抗体を予測可能に生成することができる。例えば、クリムカ（Ｋｌｉｍｋａ）ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０（２０００）（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ－４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いたヒト化抗ＣＤ３０抗体の産生について記載されている）；ベイボア（Ｂｅｉｂｏｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）（親マウスＭＯＣ－３１抗ＥＧＰ－２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いた組換え上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）抗体について記載されている）；レーダー（Ｒａｄｅｒら），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）（重鎖および軽鎖の可変ＣＤＲ３ドメインを用いたヒト化抗インテグリンαβ３抗体のパネルについて記載されている）を参照されたい。したがって、場合によっては、混合およびマッチド抗体（ｍｉｘｅｄ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、またはヒト化抗体は、本明細書に記載の制御因子／調節因子のいずれにも特異的なＣＤＲ３抗原結合ドメインを含む。
医薬開発のためのアッセイ
本明細書には、試験薬が本明細書に記載の制御因子／調節因子の発現または活性を調節できるかどうかを評価する方法も記載されている。Ｔ細胞、がん細胞、およびそれらの組合せは、候補化合物による処置に対する感受性について評価することができる。
具体的には、本方法は、Ｔ細胞もしくはがん細胞の増殖、機能もしくは生存率を選択的に調節し、または本明細書に記載の制御因子のレベルもしくは機能を増大もしくは低下させる候補試験薬を同定するためのアッセイ工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン産生、活性、または生存率が、本明細書に記載の１種または複数の制御因子の存在下で増大または低下するが、Ｔ細胞－制御因子アッセイ混合物中のＴ細胞の増殖、サイトカイン産生、活性、または増殖、活性、または生存率が、試験薬の存在下で変化する場合、その試験薬は、Ｔ細胞の制御因子を調節するための有用性を有している。このような試験薬は調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）と呼ばれる。
アッセイは、試験薬がＴ細胞数の減少もしくは増加を特異的に引き起こすかどうか、または化合物がＴ細胞の機能の低下または増大を特異的に引き起こすかどうかを決定することを含み得る。試験薬がＴ細胞数またはＴ細胞機能の変化を引き起こす場合、その試験薬は、がんまたは免疫状態もしくは疾患を処置するための治療薬としての適性など、さらなる研究のために選択／同定することができる。例えば、本発明で取り上げた選択方法によって同定された試験薬（調節因子）を、例えば動物モデルに投与することによって、腫瘍を標的とする能力、免疫細胞を標的とする能力、あるいはがんを処置する能力をさらに調べることができる。
評価される細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、転移細胞、良性細胞サンプル、細胞株（がん細胞株を含む）、またはそれらの組合せを含み得る。評価される細胞はまた、がん患者（転移がん患者を含む）からの細胞、または既知の癌型もしくは癌細胞株からの細胞、または本明細書に記載の制御因子のいずれかの過剰産生を示す細胞を含み得る。これらの細胞型のいずれかの産生または活性を調節することができる試験薬は、患者を含む動物に投与することができる。
例えば、１つの方法は、（ａ）患者から細胞のサンプルを得ること、（ｂ）サンプルから既知の数または重量の細胞中のＴ細胞／制御因子／調節因子の量または濃度を測定して基準値を生成すること、（ｃ）サンプルから既知の数または重量の細胞を試験薬と混合して試験アッセイを生成すること、（ｄ）試験アッセイ中のＴ細胞、制御因子または調節因子の量または数を測定して、試験アッセイＴ細胞／制御因子／調節因子値を生成すること、（ｅ）場合により、工程（ｃ）および（ｄ）を別々のサンプルで繰り返すこと、および（ｆ）基準値よりも低いまたは高い試験アッセイＴ細胞／制御因子／調節因子値を有する試験薬を選択することを含み得る。本方法は、例えば、試験薬の毒性および／または有効性をさらに評価するために、動物モデルに試験薬を投与することをさらに含むことができる。場合によっては、本方法は、細胞サンプルまたは組織サンプルを得た患者に試験薬を投与することをさらに含むことができる。
試験薬または調節因子（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかによって同定されたトップヒット（ｔｏｐ ｈｉｔｓ））は、試験薬または調節因子の有効性の読み出しとして、本明細書に記載のＴ細胞または制御因子のいずれかを発現する細胞を用いる細胞ベースのアッセイで使用することができる。
本明細書では、表１～７または図１～４に記載された制御因子のいずれかをＴ細胞に調節し得る薬剤の効力を同定し、評価するためのアッセイ法も記載する。
例えば、Ｔ細胞はインターフェロンγまたはインターロイキン－２などのサイトカインを放出することができる。Ｔ細胞または本明細書に記載の制御因子のいずれかを発現するＴ細胞を試験物質と接触させ、Ｔ細胞によるサイトカインの放出を測定することができる。このような試験薬に関連したサイトカインのレベルを、試験薬と接触させなかったＴ細胞で観察されたレベルと比較することができる。
有用な試験制御因子、調節因子、試験薬を、試験動物または患者に投与することができる。
「処置」または「処置すること」は、治療的処置および予防的処置の両方を指す。処置が必要なヒトには、すでに障害を有するヒト、障害を有しやすいヒト、障害を予防したいヒトが含まれる。
本明細書に記載の制御因子、調節因子、試験薬または組成物の投与の目的のための「対象」とは、ヒト、飼育動物、家畜、動物の園の動物、実験動物、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのペット動物を含む、哺乳動物または鳥類として分類されるあらゆる動物への投与を指す。実験動物としては、マウス、ラット、モルモット、ヤギ、イヌ、サル、またはそれらの組合せを挙げることができる。場合によっては、対象はヒトである。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、血液学的悪性腫瘍と同様に、固形動物腫瘍を含む。「腫瘍細胞」および「がん細胞」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
「動物の固形腫瘍」としては、頭頸部、肺、中皮腫、縦隔、肺、食道、胃、膵臓、肝胆道系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、精巣、婦人科臓器、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚中枢神経系のがん；軟部組織および骨の肉腫、皮膚および眼内由来のメラノーマが挙げられる。さらに、微小転移性腫瘍、巨大転移性腫瘍、再発性がんなど、どのような進行段階の転移性がんでも処置が可能である。
場合によっては、血液学的がんまたは血液学的悪性腫瘍を処置することができる。「血液学的悪性腫瘍」という用語には、成人または小児の白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ球性および皮膚由来のリンパ腫、急性および慢性白血病、形質細胞新生物、ＡＩＤＳに関連するがんが含まれる。
本発明の方法および組成物はまた、白血病、リンパ節、胸腺組織、扁桃腺、脾臓、乳房のがん、肺のがん、副腎皮質のがん、子宮頸部のがん、子宮内膜のがん、食道のがん、頭頸部のがん、肝臓のがん、膵臓のがん、前立腺のがん、胸腺がん、カルチノイド腫瘍、慢性リンパ性白血病、ユーイング肉腫、妊娠性絨毛腫瘍、肝芽腫、多発性骨髄腫、非小細胞肺がん、網膜芽細胞腫、または卵巣の腫瘍を処置するためにも使用することができる。原発性がん、転移性がん、再発性がんなど、どのような進行段階のがんでも処置または検出が可能である。場合によっては、転移性がんは処置されるが、原発性がんは治療されない。数多くの種類のがんに関する情報は、例えば米国がん協会（ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）、または例えばウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら（１９９１）Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１２版，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．に見出すことができる。
いくつかの実施形態において、処置されるがんおよび／または腫瘍は、血液学的悪性腫瘍、またはリンパ節、胸腺組織、扁桃腺、脾臓、およびそれらに関連する細胞のがんまたは腫瘍などのリンパ系由来のものである。いくつかの実施形態において、処置されるがんおよび／または腫瘍は、Ｔ細胞療法に抵抗性を示すものである。
転移性がんの治療または処置には、がん細胞の遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の減少または少なくとも１つの転移性腫瘍の確立の減少を含み得る。治療にはまた、咳、息切れ、喀血、リンパ節腫脹、肝臓肥大、吐き気、黄疸、骨痛、骨折、頭痛、発作、全身性疼痛およびそれらの組合せなどの転移性がんの１つ以上の症状の緩和または軽減も含まれる。処置により、がんを治癒することができ、例えば、転移性がんを予防することができ、転移性腫瘍の形成および増殖を実質的に排除することができ、および／または転移性がん細胞の遊走を停止もしくは阻害することができる。
抗がん活性は、当業者に利用可能な方法を用いて、種々のがん（例えば、乳がん、肺がん、膵臓がん、または前立腺がん）の進行を抑制することができる。抗がん活性は、例えば、がん細胞の遊走を阻止する本発明の薬剤の致死量（ＬＤ１００）または５０％有効量（ＥＤ５０）または５０％で増殖を阻害する量（ＧＩ５０）を特定することによって決定することができる。一態様において、抗がん活性とは、例えば、原発腫瘍部位から近位または遠位の部位におけるがん細胞マーカーの発現を検出することによって測定した場合、または転移を検出するための利用可能な方法を用いて評価した場合に、癌細胞の遊走を５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％減少させる薬剤の量である。
別の例において、制御因子／調節因子の発現または機能を増大または低下させる薬剤を投与することにより、腫瘍細胞を免疫療法に対して感作させることができる。したがって、制御因子／調節因子の発現または機能を増加または減少させる薬剤を投与することにより、腫瘍細胞は免疫系および種々の免疫療法に対して、より感受性が高まる。
組成物
本発明はまた、本明細書に記載の制御因子、本明細書に記載の調節因子、またはそれらの組合せのいずれかのような１種または複数の活性剤を含む組成物に関する。このような活性剤は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、発現カセットまたは発現ベクター内）、改変細胞、阻害性核酸、低分子、本明細書に記載の方法によって同定される化合物、またはそれらの組合せであり得る。組成物は医薬組成物であり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤、賦形剤、および／または塩が、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに対して有害でないことを意味する。
組成物は、あらゆる便利な形態で処方され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかによってコードされるタンパク質またはポリペプチドを含み得る。他の実施形態において、組成物は、表１～７または図１～４に記載されたポリペプチドをコードする少なくとも１種の核酸または発現カセットを含み得る。他の実施形態において、組成物は、表１～２に記載された遺伝子に相補的な核酸セグメント（例えば、阻害性核酸）を含む少なくとも１種の核酸または発現カセットを含み得る。他の実施形態において、組成物は、ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸セグメントと、本明細書に記載の制御因子または調節因子を標的とし得る少なくとも１つのガイドＲＮＡとを含む少なくとも１つの核酸または発現カセットを含み得る。他の実施形態において、組成物は、表１～７または図１～４に記載された少なくとも１種の遺伝子によってコードされる少なくとも１種のタンパク質に結合する少なくとも１種の抗体を含むことができる。他の実施形態において、組成物は、表１～７または図１～４に記載された少なくとも１つの遺伝子に結合し、活性化し、または阻害する少なくとも１つの低分子、あるいは表１～７または図１～４に記載された少なくとも１つの遺伝子によってコードされる少なくとも１つのタンパク質に結合する、活性化する、または阻害する少なくとも１つの低分子を含むことができる。他の実施形態において、組成物は、少なくとも１種の改変されたゲノム制御因子または調節因子遺伝子部位を有する細胞、本明細書に記載の１種または複数の制御因子を発現する細胞、少なくとも１種の制御因子または調節因子遺伝子を標的とし得るｃａｓヌクレアーゼおよび少なくとも１種のガイドＲＮＡを発現する細胞、１種または複数の阻害性核酸を発現する細胞、またはそれらの組合せを含むことができる。細胞は免疫細胞であってもよい。場合によっては、細胞は、リンパ系細胞、骨髄系細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、人工多能性幹細胞由来の免疫（例えば、リンパ系および／または骨髄系）細胞、またはそれらの組合せの１つまたは複数の種類であり得る。
投与される細胞の量または数は変化し得るが、約１０６～約１０９個の範囲の量を用いることができる。細胞は一般に生理食塩水または緩衝化生理食塩水のような生理的溶液中で投与される。細胞はまた、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクルの集団内などのビヒクル中で投与することもできる。
いくつかの実施形態において、本発明の活性剤（例えば、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、発現カセットまたは発現ベクター内）、抗体、阻害性核酸、低分子、本明細書に記載の方法によって特定される化合物、改変細胞、またはそれらの組合せ）は、「治療有効量」で投与される。このような治療有効量は、疾患の少なくとも１つの症状の軽減など、所望の生理学的効果を得るのに十分な量である。
疾患は、がん、または免疫疾患、または病態であり得る。例えば、活性薬剤は、疾患の症状を５％、または１０％、または１５％、または２０％、または２５％、または３０％、または３５％、または４０％、または４５％、または５０％、または５５％、または６０％、または６５％、または７０％、または８０％、または９０％、または９５％、または９７％、または９９％、または５％と１００％との間の任意の数値割合だけ軽減することができる。例えば、がんの症状としては、腫瘍性悪液質、腫瘍誘発性疼痛状態、腫瘍誘発性疲労、腫瘍増殖、および転移拡散も挙げることができる。したがって、活性薬剤はまた、腫瘍性悪液質、腫瘍誘発性疼痛状態、腫瘍誘発性疲労、腫瘍増殖、またはそれらの組合せを、５％、または１０％、または１５％、または２０％、または２５％、または３０％、または３５％、または４０％、または４５％、または５０％、または５５％、または６０％、または６５％、または７０％、または８０％、または９０％、９５％、または９７％、または９９％、または５％と１００％との間の任意の数値割合で軽減することができる。
所望の効果を得るために、活性薬剤は単回投与または分割投与としてもよい。例えば、活性薬剤は、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５００～７５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約３００～５００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１００～３００ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ～約５０～１００ｍｇ／ｋｇの体重の投与量で投与することができるが、他の投与量でも有益な結果が得られる場合がある。投与量は、投与用に選択された小分子、化合物、ペプチド、または核酸の種類、哺乳動物の疾患、体重、物理的状態、健康状態、および年齢を含むがこれらに限定されない種々の因子によって変化する。このような因子は、動物モデルまたは当技術分野で利用可能な他の試験系を用いて、臨床医が容易に決定することができる。
本発明に従う活性薬剤の投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、および当業者に公知の他の要因に依存して、単回投与であっても、複数回投与であってもよく、連続的であっても、断続的であってもよい。本発明の活性剤および組成物の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、または一連の間隔をあけた投与であってもよい。局所投与および全身投与の両方が企図される。
組成物を調製するために、小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、発現カセット、リボ核タンパク質複合体、および他の薬剤を合成するか、または他の方法で入手し、必要または所望に応じて精製する。これらの小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、発現カセット、リボ核タンパク質複合体、および他の薬剤は、薬学的に許容される担体中に懸濁させ、および／または凍結乾燥させるか、さもなければ安定化させることができる。小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、発現カセット、リボ核タンパク質複合体、その他の薬剤、およびそれらの組合せは、適切な濃度に調整することができ、場合によって他の薬剤と組み合わせることができる。単位用量に含まれる所与の小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、リボ核タンパク質複合体、および／または他の薬剤の絶対重量は、広く変動し得る。例えば、約０．０１～約２ｇ、または約０．１～約５００ｍｇの少なくとも１種の分子、化合物、ポリペプチド、核酸、リボ核タンパク質複合体、および／または他の薬剤、または複数の分子、化合物、ポリペプチド、核酸、リボ核タンパク質複合体、および／または他の薬剤を投与することができる。あるいは、単位投与量は、約０．０１ｇ～約５０ｇ、約０．０１ｇ～約３５ｇ、約０．１ｇ～約２５ｇ、約０．５ｇ～約１２ｇ、約０．５ｇ～約８ｇ、約０．５ｇ～約４ｇ、または約０．５ｇ～約２ｇの範囲で変化し得る。
本発明の活性剤の１日投与量も変化し得る。このような１日用量は、例えば、約０．１ｇ／日～約５０ｇ／日、約０．１ｇ／日～約２５ｇ／日、約０．１ｇ／日～約１２ｇ／日、約０．５ｇ／日～約８ｇ／日、約０．５ｇ／日～約４ｇ／日、および約０．５ｇ／日～約２ｇ／日の範囲であり得る。
処置に使用する活性剤の量は、選択される特定の担体だけでなく、投与経路、処置するがんの性質、患者の年齢および病態によっても変化するであろうことが理解されよう。最終的には、医療従事者が適切な投与量を決定することができる。さらに、医薬組成物は単回投与形態として製剤化することができる。
したがって、活性剤を含む１つまたは複数の適切な単位剤形は、非経口（皮下、静脈内、筋肉内および腹腔内を含む）、経口、直腸、皮膚、経皮、胸腔内、肺内および鼻腔内（呼吸器）経路を含む種々の経路で投与することができる。活性薬剤はまた、徐放性用に製剤化することもできる（例えば、マイクロカプセル化を用いる、国際公開第９４／０７５２９号および米国特許第４，９６２，０９１号を参照）。製剤は、適切な場合には、便利なように別個の単位剤形とすることができ、製薬技術によく知られた方法のいずれかによって調製することができる。このような方法には、活性剤を液体担体、固体マトリクス、半固体担体、細かく分割された固体担体またはそれらの組合せと混合する工程、次いで必要に応じて、所望の送達系に導入または成形することが含まれる。例えば、活性剤をナノ粒子、アルブミン、ポリアルキレングリコールなどの便利な担体に結合させたり、プロドラッグの形態で供給したりすることができる。活性剤およびその組合せは、担体と組合せ、および／またはリポソームなどの小胞に封入することができる。
本発明の組成物は、水溶液、懸濁液、錠剤、ハードまたはソフトゼラチンカプセル、リポソーム、および成形ポリマーゲルなどの他の徐放性製剤を含む多くの形態で調製することができる。阻害剤の投与は、水溶液または徐放性ビヒクルでの非経口投与または局所投与も含み得る。
したがって、活性薬剤および／または他の薬剤は、経口剤形で投与される場合もあり、その経口剤形は、小分子、化合物、ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、発現カセット、リボ核タンパク質複合体、およびそれらの組合せが治療的有用性を提供する前に、小分子、化合物、ポリペプチド、核酸、発現カセット、リボ核タンパク質複合体、およびそれらの組合せを分解または破壊から保護するように製剤化することができる。例えば、場合によっては、小分子、化合物、ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、発現カセット、リボ核タンパク質複合体、および／または他の薬剤が胃を通過した後に腸内に放出されるように製剤化することができる。このような製剤は、例えば、米国特許第６，３０６，４３４号およびそこに含まれる参考文献に記載されている。
液体医薬組成物は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップまたはエリキシル、使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥粉末の形態であってもよい。このような液体医薬組成物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含んでいてもよい）、または保存剤などの従来の添加剤を含んでもよい。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液などの形態をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの配合剤を含んでもよい。適切な担体としては、生理食塩水、カプセル化剤（例えば、リポソーム）、および他の材料が挙げられる。活性剤および／または他の薬剤は、担体の存在下または非存在下で、乾燥形態（例えば、凍結乾燥形態）で製剤化することができる。所望される場合、担体を医薬製剤に含めることができ、または乾燥形態、懸濁液、または便利な液体中の可溶性濃縮形態で包装された阻害剤に添加するために、別個の容器に別々に包装することができる。
活性薬剤および／または他の薬剤は、非経口投与（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入）用に製剤化することができ、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入容器、または保存剤を添加したマルチ用量容器に単位投与量で存在し得る。
組成物はまた、活性剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗微生物剤および／または防腐剤などの他の成分を含み得る。使用してもよい治療剤の例としては：アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、エチレンイミン、およびトリアゼン；代謝拮抗剤、例えば、葉酸拮抗剤、プリン類似体、およびピリミジン類似体；抗生物質、例えば、アントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ダクチノマイシン、およびプリカマイシン；酵素、例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ；ファルネシル－タンパク質転移酵素阻害剤；ホルモン剤、例えば、グルココルチコイド、エストロゲン／抗エストロゲン、アンドロゲン／抗アンドロゲン、プロゲスチン、および黄体形成ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト、酢酸オクトレオチド；微小管破壊剤、例えば、エクテイナシジンまたはその類似体および誘導体；微小管安定化剤、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、エポチロンＡ～Ｆまたはその類似体もしくは誘導体；植物由来製品、例えば、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、タキサン；トポイソメラーゼ阻害剤、プレニル－タンパク質転移酵素阻害剤；種々の薬剤、例えば、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、マイトタン、ヘキサメチルメラミン；白金配位錯体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ならびに抗がん剤および細胞毒性剤として使用される他の薬剤、例えば、生物学的応答調節剤、成長因子、免疫調節剤、モノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本組成物は放射線療法と併用することもできる。
本明細書は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されるべきではない。全ての引用文献（本出願を通じて引用された文献、発行済み特許、公開特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。
実施例１：遺伝子制御因子を同定するためのＣＲＩＳＰＲａによる初代ヒトＴ細胞のスクリーニング
本実施例では、治療上関連するＴ細胞表現型の遺伝子制御因子を同定するための、初代ヒトＴ細胞のスクリーニングにおけるＣＲＩＳＰＲａの使用について説明する。
Ｔ細胞は２人の別々のドナーから単離した。２つのＴ細胞集団にｄＣａｓ９－ＶＰ６４発現レンチウイルス（ＣＲＩＳＰＲａ）またはＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９発現レンチウイルス（ＣＲＩＳＰＲｉ）で形質導入し、ｄＣａｓ９を安定に発現するＴ細胞をｍＣｈｅｒｒｙで選択した。次に、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４またはＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９発現Ｔ細胞集団に、それぞれ２つのゲノムワイドｓｇＲＮＡライブラリーをトランスフェクトし、Ｔ細胞のゲノムのＣＲＩＳＰＲ活性化または干渉を開始した。ＣＲＩＳＰＲ活性化には、ＣａｌａｂｒｅｓｅセットＡおよびＢを使用した（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｏｏｌｅｄ－ｌｉｂｒａｒｙ／ｂｒｏａｄｇｐｐ－ｈｕｍａｎ－ｃｒｉｓｐｒａ－ｃａｌａｂｒｅｓｅ－ｐ６５ｈｓｆ／のウェブサイトを参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ干渉にはＤｏｌｃｅｔｔｏセットＡおよびＢを使用した（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｏｏｌｅｄ－ｌｉｂｒａｒｙ／ｂｒｏａｄｇｐｐ－ｈｕｍａｎ－ｃｒｉｓｐｒｉ－ｄｏｌｃｅｔｔｏ／のサイトを参照されたい）。
Ｔ細胞集団を、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ（商標）ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞活性化剤（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ、バンクーバー）で刺激し、２人のドナーからの刺激されたＣＲＩＳＰＲａ／ｉ編集Ｔ細胞を、以下のマーカーについて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて選別した：ＩＬ－２サイトカイン産生、ＩＦＮ－γ産生、およびＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔによる細胞増殖。選別された細胞をゲノムＤＮＡ抽出に供し、ｓｇＲＮＡをＰＣＲ増幅した後、次世代シークエンシングを行い、各集団におけるｓｇＲＮＡ頻度を決定した。データは、ＭａＧｅｃｋバージョン０．５．９．２、リー（Ｌｉ）ら．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １５：５４４（２０１４）を用いて解析した。
これらのスクリーニングにより、Ｔ細胞機能における既知の遺伝子および新規の遺伝子のいずれをも含む、これらの表現型に有意に反応する１０７４個のユニークな遺伝子が同定された（ＦＤＲ＜０．０１）。
以下の表１は、ＩＦＮ－γ産生によって検出されるＴ細胞機能の正の制御因子を示す。
以下の表２は、インターロイキン－２産生によって検出されるＴ細胞機能の正の制御因子を示す。
以下の表３は、Ｔ細胞増殖によって検出されるＴ細胞機能の正の制御因子を示す。
以下の表４は、ＩＦＮ－γ産生の減少によって検出されるＴ細胞機能の負の制御因子を示す。
以下の表５は、インターロイキン－２産生の減少によって検出されるＴ細胞機能の負の制御因子を示す。
以下の表６は、細胞増殖の減少によって検出されるＴ細胞機能の負の制御因子を示す。
これらの調節因子およびこれらの調節因子を調節する薬剤は、癌または自己免疫疾患のためのＴ細胞関連免疫療法として使用され得る。
実施例２：Ｔ細胞を制御する遺伝子のＣＲＩＳＰＲｉによる同定
本実施例では、治療上関連するＴ細胞表現型の遺伝子制御因子を同定するための、初代ヒトＴ細胞のスクリーニングにおけるＣＲＩＳＰＲｉの使用について説明する。
２つのＴ細胞集団にＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９発現レンチウイルス（ＣＲＩＳＰＲｉ）で形質導入し、ｄＣａｓ９を安定に発現するＴ細胞をｍＣｈｅｒｒｙで選択した。次に、ＫＲＡＢ－ｄＣａｓ９発現Ｔ細胞集団に、それぞれ２つのゲノムワイドｓｇＲＮＡライブラリーをトランスフェクトし、Ｔ細胞のゲノムにＣＲＩＳＰＲ干渉を開始した。ＣＲＩＳＰＲ干渉には、ＤｏｌｃｅｔｔｏセットＡおよびＢを使用した（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｏｏｌｅｄ－ｌｉｂｒａｒｙ／ｂｒｏａｄｇｐｐ－ｈｕｍａｎ－ｃｒｉｓｐｒｉ－ｄｏｌｃｅｔｔｏ／を参照されたい）。
Ｔ細胞集団を、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ（商標）ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化剤（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カナダ、バンクーバー）で刺激し、２人のドナーからの刺激されたＣＲＩＳＰＲｉ編集Ｔ細胞を、以下のマーカーについて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて選別した：ＩＬ－２サイトカイン産生、ＩＦＮ－γ産生、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔによる細胞増殖。選別された細胞をゲノムＤＮＡ抽出に供し、ｓｇＲＮＡをＰＣＲ増幅した後、次世代シークエンシングを行い、各集団におけるｓｇＲＮＡ頻度を決定した。データはＭａＧｅｃｋバージョン０．５．９．２ リー（Ｌｉ）ら．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １５：５４４（２０１４）を用いて解析した。表７は、Ｔ細胞の機能を調節する遺伝子を示す。
このスクリーニングにおいては、実施例１に記載したスクリーニングで同定された遺伝子と同じ遺伝子がかなり多数同定された。以下の遺伝子は、このＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングによって同定された新規遺伝子であった：ＨＮＲＮＰＬ、ＨＯＸＤ１３、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＢＫＧ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＮＰＰ１、ＩＴＫ、ＪＡＫ１、ＪＵＮ、ＫＡＴ７、ＫＣＮＩＰ３、ＫＩＡＡ１１０９、ＫＩＤＩＮＳ２２０、ＬＩＭＳ２、ＬＯＣ１０１９２７３２２、ＬＲＩＧ１、ＭＡＬＴ１、ＭＡＰ３Ｋ７、ＭＢＤ２、ＭＥＡＦ６、ＭＥＮ１、ＭＭＰ２４、ＭＯＢ４、ＭＹＬＩＰ、ＮＤＦＩＰ２、ＮＳＤ２、ＮＳＦＬ１Ｃ、ＮＹＮＲＩＮ、ＯＳＢＰ、ＰＣＹＴ２、ＰＧＢＤ５、ＰＩ４ＫＢ、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＲＣ２Ｂ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＢＣＫ１、ＲＤＸ、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＧ、ＲＯＰＮ１Ｂ、ＲＴＰ２、ＳＡＥ１、ＳＣＲＩＢ、ＳＥＣ６１Ａ１、ＳＥＣ６２、ＳＥＨ１Ｌ、ＳＥＬ１Ｌ、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＣ３８Ａ６、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＰＣＳ２、ＳＰＴＬＣ２、ＳＰＴＳＳＡ、ＳＲＤ５Ａ２、ＳＲＰ１９、ＳＲＰ６８、ＳＲＰ７２、ＳＲＰＲＢ、ＳＳＢ、ＳＴＡＴ３、ＳＵＧＴ１、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＳＵＰＴ５Ｈ、ＴＡＤＡ１、ＴＡＤＡ２Ｂ、ＴＡＦ１１、ＴＡＦ１３、ＴＡＦ２、ＴＡＦ６Ｌ、ＴＡＲＳ、ＴＬＮ１、ＴＭＸ１、ＴＲＡＦ６、ＴＸＫ、ＵＢＡ２、ＶＰＳ２９、ＶＰＳ３５、ＶＰＳ３７Ｃ、ＶＰＳ４１、ＷＡＳ、ＸＰＯ６、ＢＲＤ９、ＢＲＩＰ１、ＣＡＤ、ＣＢＬＬ１、ＣＤＫ１２、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＳＴＦ３、ＣＴＤＳＰＬ２、Ｅ２Ｆ１、ＥＩＦ３Ｂ、ＥＩＦ３Ｄ、ＥＩＦ４Ｅ２、ＧＣＮ１、ＧＩＧＹＦ２、ＧＮＡＩ２、ＨＩＦ１ＡＮ、ＩＫＢＫＥ、ＬＡＲＧＥ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴＡＰ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＴＦ１、ＭＹＢ、ＮＭＴ１、ＮＲＦ１、ＮＵＤＣ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＴＰＮＢ、ＰＮＩＳＲ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＰＲＭＴ１、ＰＳＭＤ１３、ＰＳＭＤ４、ＰＴＭＡ、ＲＡＢ４Ａ、ＲＢＰＪ、ＲＩＯＫ２、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ４０、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ６、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ８、ＳＣＲＮ３、ＳＦ３Ａ１、ＳＬＡＭＦ６、ＳＭＣ３、ＳＰ１、ＳＹＭＰＫ、ＴＨＯＣ３、ＴＯＮＳＬ、ＴＳＣ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＵＮＣＸ、ＵＳＰ５、ＺＣ３Ｈ１８、ＢＣＬ１０、ＣＡＳＤ１、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＨＤ７、ＤＮＴＴＩＰ１、ＥＬＯＦ１、ＧＲＡＰ２、ＩＦＮＧＲ２、ＩＴＫ、ＫＩＤＩＮＳ２２０、ＮＤＦＩＰ２、ＮＹＮＲＩＮ、ＰＧＢＤ５、ＰＬＣＧ１、ＲＨＯＧ、ＲＰＮ２、ＳＣＲＩＢ、ＳＩＮ３Ｂ、ＳＰＲＹＤ３、ＳＲＰ１９、ＳＲＰ６８、ＳＲＰ７２、ＳＵＬＴ２Ｂ１、ＴＡＦ１１、ＴＡＦ１３、ＴＡＦ２、ＴＡＦ８、ＴＬＮ１、ＶＰＳ２９、ＶＰＳ３５、ＷＡＳ、ＡＣＴＬ６Ａ、ＡＤＳＳ、ＡＮＬＮ、ＡＲＩＤ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＵＮＩＰ、ＢＥＣＮ１、ＢＭＳ１、ＢＯＰ１、Ｃ２１ｏｒｆ６２、ＣＡＤ、ＣＢＦＢ、ＣＤＣ２３、ＣＤＫ１２、ＣＥＮＰＥ、ＣＥＮＰＩ、ＣＥＰ１９２、ＣＨＡＦ１Ｂ、ＣＨＭＰ３、ＣＨＭＰ５、ＣＨＭＰ６、ＣＮＯＴ１、ＣＰＳＦ４、ＣＰＳＦ６、ＣＴＤＳＰＬ２、ＣＴＰＳ１、ＤＤＸ４７、ＤＨＯＤＨ、ＤＬＳＴ、ＤＮＴＴＩＰ２、ＤＰＹ１９Ｌ３、Ｅ２Ｆ１、ＥＤＣ４、ＥＦＴＵＤ２、ＥＩＦ３Ｂ、ＥＩＦ３Ｄ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ５Ａ、ＥＰ４００、ＥＳＦ１、ＦＡＤＤ、ＦＡＭ４９Ｂ、ＦＡＭ６０Ａ、ＦＡＵ、ＧＣＮ１、ＧＩＧＹＦ２、ＨＧＳ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬＦ２、ＩＮＴＳ３、ＪＰＨ１、ＫＡＮＳＬ３、ＫＡＴ５、ＫＬＦ２、ＬＡＭＴＯＲ２、ＭＡＤ２Ｌ１ＢＰ、ＭＡＫ１６、ＭＡＵ２、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３ＡＰ、ＭＥＭＯ１、ＭＥＴＡＰ２、ＭＭＰ１６、ＭＲＰＬ２２、ＭＳＴ１Ｌ、ＭＹＣＢＰ２、ＮＡＲＦＬ、ＮＥＰＲＯ、ＮＭＴ１、ＮＲＦ１、ＮＵＤＣ、ＯＴＵＢ１、ＰＣＢＰ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＦＡＳ、ＰＩＴＰＮＢ、ＰＮＩＳＲ、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＲ１Ｂ、ＰＰＡＮ、ＰＰＩＨ、ＰＰＰ１Ｒ８、ＰＲＭＴ１、ＰＲＰＦ４Ｂ、ＰＲＲ１２、ＰＳＭＤ２、ＰＴＰＮ２３、ＰＵＭ１、ＲＡＢ４Ａ、ＲＡＳＡ２、ＲＢＭ１４、ＲＢＭ２５、ＲＢＭ４２、ＲＢＳＮ、ＲＣＬ１、ＲＭＮＤ５Ａ、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ４０、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１３、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４Ｘ、ＲＰＳ５、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＵＶＢＬ２、ＳＡＲＴ１、ＳＥＴＤ１Ａ、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＢＰ、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＣ１Ａ、ＳＭＣ３、ＳＮＲＮＰ２７、ＳＮＲＮＰ７０、ＳＮＲＰＣ、ＳＮＲＰＦ、ＳＰ１、ＳＲＦＢＰ１、ＳＲＳＦ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＵＲＦ６、ＳＹＭＰＫ、ＴＢＬ１Ｘ、ＴＨＯＣ３、ＴＮＰＯ３、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＩＰ、ＴＳＣ１、ＴＳＧ１０１、ＴＵＢＧＣＰ５、ＴＹＭＳ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＵＰＦ１、ＵＴＰ１４Ａ、ＵＴＰ１５、ＷＤＲ４５、ＷＤＲ５、ＹＥＡＴＳ４、ＺＭＡＴ２、ＡＡＭＰ、ＡＡＲＳ、ＡＡＴＦ、ＡＫ２、ＡＬＤＨ１８Ａ１、ＡＰ２Ｍ１、ＡＴＩＣ、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ５Ｏ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ｆ、ＡＴＸＮ１０、ＢＭＳ１、ＢＯＰ１、ＢＵＤ２３、Ｃ１２ｏｒｆ６０、ＣＡＤ、ＣＡＲＳ、ＣＣＤＣ８６、ＣＣＴ６Ａ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３ＥＡＰ、ＣＤ３Ｇ、ＣＩＮＰ、ＣＬＮＳ１Ａ、ＣＰＳＦ４、ＣＲＣＰ、ＣＴＰＳ１、ＤＡＤ１、ＤＤＸ２７、ＤＤＸ５２、ＤＧＣＲ８、ＤＨＯＤＨ、ＤＨＸ２９、ＤＨＸ３７、ＤＩＣＥＲ１、ＤＮＡＪＡ３、ＤＮＭ２、ＤＮＴＴＩＰ２、ＤＰＨ６、ＤＲＯＳＨＡ、ＥＩＦ２Ｂ２、ＥＩＦ２Ｂ３、ＥＩＦ２Ｂ４、ＥＩＦ５Ａ、ＥＬＰ４、ＥＳＦ１、ＥＸＯＳＣ４、ＥＸＯＳＣ５、ＥＸＯＳＣ７、ＥＸＯＳＣ９、ＦＡＭ１４９Ｂ１、ＦＡＲＳＢ、ＦＢＬ、ＦＣＦ１、ＦＨ、ＦＬＶＣＲ１、ＦＴＳＪ３、ＧＦＥＲ、ＧＭＰＳ、ＧＮＬ２、ＧＮＰＡＴ、ＧＴＦ３Ｃ１、ＨＡＲＳ、ＨＡＵＳ４、ＨＣＣＳ、ＨＥＡＴＲ３、ＨＳＤ１７Ｂ１０、ＨＳＤ１７Ｂ１２、ＨＳＰＡ９、ＩＬ２ＲＧ、ＩＭＰＤＨ２、ＩＳＧ２０Ｌ２、ＫＡＲＳ、ＬＡＧＥ３、ＬＥＴＭ１、ＬＯＮＰ１、ＭＡＲＳ２、ＭＤＮ１、ＭＥＴＴＬ１６、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＲＰＬ１６、ＭＲＰＬ２２、ＭＲＰＬ３５、ＭＲＰＬ３６、ＭＲＰＬ３７、ＭＲＰＬ４１、ＭＲＰＬ４２、ＭＲＰＬ４５、ＭＲＰＬ５４、ＭＲＰＳ１１、ＭＲＰＳ１４、ＭＲＰＳ１７、ＭＲＰＳ１８Ａ、ＭＲＰＳ２、ＭＲＰＳ２３、ＭＲＰＳ３３、ＭＲＰＳ５、ＭＲＰＳ９、ＭＴＨＦＤ１Ｌ、ＭＴＯＲ、ＭＹＢＢＰ１Ａ、ＮＡＴ１０、ＮＣＬ、ＮＥＰＲＯ、ＮＩＦＫ、ＮＯＣ２Ｌ、ＮＯＬ１０、ＮＯＬ６、ＮＯＬ８、ＮＯＰ１４、ＮＯＰ２、ＮＯＰ５６、ＮＯＰ５８、ＮＵＢＰ１、ＮＵＦＩＰ１、ＯＲＡＯＶ１、ＰＡＭ１６、ＰＣＹＴ２、ＰＤＣＤ１１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＳＳ２、ＰＥＬＰ１、ＰＧＤ、ＰＧＭ３、ＰＨＢ、ＰＨＢ２、ＰＩＳＤ、ＰＩＴＲＭ１、ＰＭＰＣＡ、ＰＮＯ１、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＧ２、ＰＯＬＲ１Ａ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ２Ｅ、ＰＯＬＲ３Ｂ、ＰＯＬＲＭＴ、ＰＯＰ１、ＰＯＰ４、ＰＯＰ５、ＰＯＴ１、ＰＰＡＮ、ＰＰＡＴ、ＰＳＭＧ１、ＱＡＲＳ、ＲＢＭ１９、ＲＣＬ１、ＲＩＯＫ１、ＲＩＯＫ２、ＲＯＭＯ１、ＲＰＦ１、ＲＰＦ２、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３９、ＲＰＬＰ２、ＲＰＮ２、ＲＰＰ２１、ＲＰＰ３０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１９ＢＰ１、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ４Ｘ、ＲＰＳ６、ＲＰＳＡ、ＲＲＰ１２、ＲＲＰ３６、ＲＲＰ７Ａ、ＲＲＰ９、ＲＳＬ２４Ｄ１、ＳＡＭＭ５０、ＳＡＲＳ、ＳＤＨＣ、ＳＥＨ１Ｌ、ＳＬＣ３５Ｂ１、ＳＬＣ３８Ａ６、ＳＬＣ７Ａ１１、ＳＰＯＵＴ１、ＳＲＦＢＰ１、ＳＳＢ、ＳＵＲＦ６、ＴＡＦ１Ａ、ＴＡＦ１Ｃ、ＴＡＦ１Ｄ、ＴＡＦ８、ＴＡＭＭ４１、ＴＡＲＳ、ＴＥＸ１０、ＴＩＭＭ４４、ＴＮＫＳ１ＢＰ１、ＴＯＭＭ２０、ＴＯＭＭ４０、ＴＰ５３Ｉ１３、ＴＲＭＴ１１２、ＴＲＮＴ１、ＴＳＥＮ２、ＴＳＥＮ５４、ＴＳＲ１、ＴＴＩ１、ＴＷＩＳＴＮＢ、ＴＷＮＫ、ＵＭＰＳ、ＵＱＣＲ１０、ＵＱＣＲＢ、ＵＱＣＲＣ１、ＵＴＰ１１、ＵＴＰ１４Ａ、ＵＴＰ３、ＵＴＰ６、ＶＰＳ２９、ＶＰＳ７２、ＷＡＳ、ＷＤＲ１２、ＷＤＲ３、ＷＤＲ３６、ＷＤＲ５５、ＸＲＣＣ５、ＸＲＣＣ６、ＹＡＥ１Ｄ１、ＺＣＣＨＣ９、ＺＮＨＩＴ３、ＺＮＨＩＴ６、およびＺＮＲＤ１。
これらの制御因子、および制御因子を調節する薬剤は、がん、または自己免疫疾患に対するＴ細胞関連免疫療法として使用することができる。
実施例３：遺伝子制御因子を同定する初代ヒトＴ細胞のＣＲＩＳＰＲａによるスクリーニング
序論
刺激に応答するＴ細胞のサイトカイン産生を制御することは、バランスのとれた免疫応答において役割を果たしている。サイトカインの調節不全は、自己免疫、免疫不全、癌における免疫回避を誘導する可能性がある（１－４）。主にＣＤ４＋Ｔ細胞から分泌されるインターロイキン２（ＩＬ－２）は、Ｔ細胞の増殖を促進し（５）、自己免疫およびがんに種々の用量で治療的に応用されている（６）。インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方から分泌されるサイトカインであり、ウイルスを含む細胞内病原体に対するＩ型免疫反応を促進し（４）、がん免疫療法の陽性反応と相関している（７－９）。ヒトにおいてサイトカイン産生を誘導する経路に関する現在の理解の多くは、形質転換Ｔ細胞株を用いた研究から得られたものであり、ヒトの初代細胞生物学を代表するものではないことが多い（１０－１２）。初代ヒトＴ細胞におけるサイトカイン産生を制御する経路を包括的に理解することは、次世代免疫療法の開発を促進するであろう。
不偏的な順遺伝学的方法は、制御ネットワークの構成要素を系統的に明らかにすることができるが、効率的なＣａｓ９導入の課題により、初代細胞での応用は限られている。Ｃａｓ９を発現させたトランスジェニックマウスからの初代マウス免疫細胞を用いたゲノムワイドＣＲＩＳＰＲノックアウトスクリーニングが完了しており（１３－１５）、樹状細胞における自然免疫サイトカイン産生の制御因子のスクリーニングが含まれている（１３）。ヒト初代細胞におけるゲノムスケールのＣＲＩＳＰＲ研究は、遺伝子ノックアウトを導入するための一過性のＣａｓ９エレクトロポレーションを用いて最近達成された（１６，１７）。しかしながら、制御因子の包括的な発見には、機能獲得研究および機能喪失研究がいずれも必要である。例えば、ＣＲＩＳＰＲａ機能獲得スクリーニングは、テストされた条件下では通常は活性化されないが、目的の表現型を促進する遺伝子を発見することができる（１８，１９）。ＣＲＩＳＰＲノックアウトとは対照的に、ＣＲＩＳＰＲａまたはＣＲＩＳＰＲｉは、活性化因子と結合したエンドヌクレアーゼ－デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の持続的発現を必要とし、レンチウイルスの送達が不十分なため、初代細胞での小規模な実験に限られていた（２０，２１）。本明細書では、初代ヒトＴ細胞におけるＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニング・プラットフォームを開発し、刺激依存性サイトカイン応答を調整するために改変可能な遺伝子および経路の系統的発見を可能にした。
材料および方法
ヒトＴ細胞の単離および培養
ヒトＴ細胞は、ＩＲＢが承認したインフォームドコンセント（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に基づき、健康なドナーのＰＢＭＣ濃縮白血球製剤（ロイコパックス（Ｌｅｕｋｏｐａｋｓ）、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社カタログ番号７０５００．２）から供給された（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。バルクＴ細胞は、製造業者の推奨プロトコル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社カタログ番号１７９５１）に従い、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）磁気選別を用いてロイコパックスから単離した。特に断りのない限り、バルクＴ細胞はＢａｍｂａｎｋｅｒ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｕｌｌｄｏｇ Ｂｉｏ社カタログ番号ＢＢ０１）で５×１０７個細胞／ｍｌで凍結し、分離直後に、短期保存の場合は－８０℃で、長期保存の場合は液体窒素で保存した。特に断りのない限り、解凍したＴ細胞は、５％ＦＣＳ、５５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、４ｍＭ Ｎ－アセチルＬ－システイン、および５００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（Ａｍｅｒｉｓｏｕｒｃｅ Ｂｅｒｇｅｎ社カタログ番号１０１０１６４１）を添加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社カタログ番号０４－４１８Ｑ）中で培養した。初代Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳ ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号４０２０３Ｄ）を用いて、細胞対ビーズ比１：１で１０６細胞／ｍｌで活性化した。
細胞株の維持
Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏカタログ番号６３２１８０）を、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号１５１４０１２２）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号１１３６００７０）、１×ＭＥＭの非必須アミノ酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号１１１４００５０）および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号０８８７－１００ＭＬ）を補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（商標）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ１０５６６０２４）を含むＤＭＥＭ高グルコース中で維持した。解離のために、細胞を、Ｔｒｙｐｌｅ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号１２６０４０１３）を用いて２日ごとに継代し、コンフルエントを６０％未満に維持した。ＮＡＬＭ６細胞は、ＵＣＳＦのＥｙｑｕｅｍ研究室によって１Ｇ４ ＴＣＲで認識可能なＨＬＡ－Ａ０２０１バックグラウンドでＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドを発現するように操作され、ＴＣＲ刺激共培養実験用に提供された。簡単に説明すると、これらの細胞をＮＡＬＭ６と呼ぶ。ＮＡＬＭ６細胞を、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌの ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号１５１４０１２２）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号１１３６００７０）、および１Ｘ ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号１１１４００５０）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号Ｈ０８８７－１００ＭＬ）、および２ｍＭの Ｌ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社カタログ番号１７－６０５Ｅ）を添加したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社カタログ番号２１８７００９２）中で培養した。
プラスミド
ｄＣａｓ９－ＶＰ６４はｌｅｎｔｉＳＡＭｖ２（ａｄｄｇｅｎｅ社７５１１２）に由来し、Ｇｉｂｓｏｎ ＡｓｓｅｍｂｌｙでｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２－ｄＣａｓ９バックボーン（ａｄｄｇｅｎｅ社１１２２３３）にクローニングした。プロモーターをＳＦＦＶに切り替え、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４の上流にｍＣｈｅｒｒｙを導入し、Ｐ２Ａ配列で分離してｐＺＲ１１２プラスミドを得た。ＬＴＲ－ＬＴＲの範囲を最小にし、レンチウイルスの力価を高めた。ＣＲＩＳＰＲｉの場合、ｐＨＲ－ＳＦＦＶ－ｄＣａｓ９－ＢＦＰ－ＫＲＡＢ（ａｄｄｇｅｎｅ社４６９１１）のＢＦＰをＧｉｂｓｏｎ ＡｓｓｅｍｂｌｙでｍＣｈｅｒｒｙに切り替え、ｐＺＲ０７１を得た。
アレイ実験用の単一ｓｇＲＮＡは、以前に記述したように（２２）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ｃｌｏｎｉｎｇによって導入した（２２）。簡単に説明すると、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅオーバーハングを有するＤＮＡオリゴ－マーをアニーリングした後、ＮＥＢ（登録商標）Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（ＢｓｍＢＩ－ｖ２，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社カタログ番号Ｅ１６０２Ｌ）を用いて、非消化標的プラスミドにクローニングした。ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲａの場合はｐＸＰＲ＿５０２（ａｄｄｇｅｎｅ社９６９２３）に、ＣＲＩＳＰＲｉの場合はＣＲＯＰｓｅｑ－Ｇｕｉｄｅ－Ｐｕｒｏ（４３）（ａｄｄｇｅｎｅ社８６７０８）にクローニングした。本研究で使用した全ての１本鎖ｓｇＲＮＡを表８に示す。
ゲノムワイドｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲａ（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ Ａ，カタログ番号９２３７９およびＣａｌａｂｒｅｓｅ Ｂ，カタログ番号９２３８０）およびＣＲＩＳＰＲｉライブラリー（Ｄｏｌｃｅｔｔｏ Ａ，カタログ番号９２３８５およびＤｏｌｃｅｔｔｏ Ｂ、カタログ番号９２３８６）（２２）はａｄｄｇｅｎｅ社から入手した。４０ナノグラムの各ライブラリーを、製造者の指示に従ってＥｎｄｕｒａ（商標）ＥｌｅｃｔｒｏＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社カタログ番号６０２４２－２）に形質転換した。形質転換後、Ｅｎｄｕｒａ（商標）細胞をアンピシリン存在下、３０℃で１６時間振盪培養した。ライブラリープラスミドはＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ ＭａｘｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社１２９６３）を用いて単離し、「ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニング」に記載されているように、ｓｇＲＮＡの発現について配列決定した。
ｃＤＮＡを介した標的の過剰発現のために、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２（ａｄｄｇｅｎｅ社７５１１２）バックボーンをＳＦＦＶプロモーター、ならびにＢｓｍＢＩ制限部位およびＰ２Ａ－Ｐｕｒｏを有するレンチウイルスｃＤＮＡクローニングプラスミドに再構築した。トランスジーンｃＤＮＡはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社から購入し、各遺伝子について基準の（最長の）アイソフォームを選択し、ＰＣＲによりＢｓｍＢＩ制限部位を導入した。最終的なレンチウイルス導入プラスミドは、ＮＥＢ（登録商標）Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（ＢｓｍＢＩ－ｖ２，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社カタログ番号Ｅ１６０２Ｌ）を用いて構築した。
Ｐｅｒｔｕｒｂ配列用の直接捕捉適合ＣＲＩＳＰＲａ－ＳＡＭプラスミドをクローニングするために、種々のｓｇＲＮＡデザインをＧ－Ｂｌｏｃｋ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）として合成し、Ｇｉｂｓｏｎ ＡｓｓｅｍｂｌｙによってｐＸＰＲ＿５０２（ａｄｄｇｅｎｅ社９６９２３）にクローニングし、そのｓｇＲＮＡカセットに置き換えた。
レンチウイルスの産生
特に断らない限り、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％ ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）および１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加したＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント（Ｇｉｂｃｏ社カタログ番号３１９８５０８８）を補充したＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（ＯＰＴＩ－ＭＥＭ）に、Ｔ２２５フラスコ当たり３．６×１０７細胞で、４５ｍｌの培地中に一晩播種し（ｃＯＰＴＩ－ＭＥＭ）、トランスフェクションの時点でコンフルエントが８５％から９５％になるようにした。翌朝、ＨＥＫ２９３Ｔｓ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００トランスフェクション試薬（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号Ｌ３００００７５）を用いて、第２世代のレンチウイルスパッケージングプラスミドとトランスフェクションプラスミドをトランスフェクトした。簡単に説明すると、１６５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００試薬を５ｍｌの室温のＯＰＴＩ－ＭＥＭに、サプリメントなしで添加した。４２マイクログラムのＣａｓ９導入プラスミド、３０μｇのｐｓＰＡＸ２（ａｄｄｇｅｎｅ社１２２６０）、１３μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ａｄｄｇｅｎｅ社１２２５９）、および１４５μｌのｐ３０００試薬を、５ｍｌの室温のＯＰＴＩ－ＭＥＭにサプリメントなしで室温で添加し、穏やかに反転させて混合した。プラスミドおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００ミックスを合わせ、穏やかに反転させて混合し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、２０ｍｌの培地をＴ２２５フラスコから除去し、１０ｍｌのトランスフェクション混合液をＨＥＫ２９３Ｔ細胞が剥離しないように注意深く添加した。６時間後、トランスフェクション培地を、１×ＶｉｒａｌＢｏｏｓｔ（Ａｌｓｔｅｍ Ｂｉｏ社番号ＶＢ１００）を添加した４５ｍｌのｃＯＰＴＩ－ＭＥＭに交換した。トランスフェクションの２４時間後にレンチウイルス上清を回収し（１回目の回収）、４５ｍｌの新鮮なｃＯＰＴＩ－ＭＥＭと交換した。トランスフェクションの４８時間後に２回目の回収を行った。回収後すぐに、培地を５００ｇ、５分、４℃で遠心し、細胞残屑を除去した。特に断りのない限り、回収した上清にＬｅｎｔｉ－Ｘ－Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社６３１２３２）を添加し、製造業者の指示に従ってレンチウイルスを濃縮し、サプリメントを添加せずに元の培養量の１％でＯＰＴＩ－ＭＥＭに再懸濁した。その後、レンチウイルス粒子を分注し、－８０℃で凍結した。
フローサイトメトリー
ソーティングにはＵＣＳＦ Ｐａｒｎａｓｓｕｓ Ｆｌｏｗ ＣｏｒｅおよびＧｌａｄｓｔｏｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｌｏｗ ＣｏｒｅのＡｒｉａ ２、Ａｒｉａ ３およびＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用した。フローサイトメトリーにはＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）およびＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用した。フローサイトメトリー解析およびソーティングに使用した抗体を表９に要約した。
細胞内サイトカイン染色
特に指示がない限り、Ｔ細胞はＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社カタログ番号１０９９０）を使用して、培地１ｍｌあたり６．２５μｌ、２×１０６細胞／ｍｌで刺激した。再刺激の１時間後、Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（商標）タンパク質輸送阻害剤（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社カタログ番号５５５０２９）を１／１０００希釈に添加した。Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（商標）添加の９時間後、Ｔ細胞を固定する前に表面抗原を染色し、その後ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社カタログ番号５５４７１４）の説明書に従って細胞内サイトカイン染色を行った。
ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニング
活性化の１日後、２人のヒト血液ドナーのＴ細胞を２％（ｖ／ｖ）濃縮ｄＣａｓ９－ＶＰ６４レンチウイルスに感染させた。活性化の２日後、Ｔ細胞を２つの集団に分け、１％（ｖ／ｖ）（約０．５のＭＯＩ）のＣａｌａｂｒｅｓｅ ＳｅｔＡ（ａｄｄｇｅｎｅ ９２３７９）または０．８％（ｖ／ｖ）（約０．５のＭＯＩ）のＣａｌａｂｒｅｓｅ ＳｅｔＢ（ａｄｄｇｅｎｅ社９２３８０）レンチウイルスに感染させた。これら２つのセットを別々に培養し、解析まで並行して処理した。活性化の３日後、ＩＬ－２（最終濃度５００ＩＵ／ｍｌ）およびピューロマイシン（最終濃度２μｇ／ｍｌ）を添加した新鮮培地を添加し、細胞を３×１０５細胞／ｍｌにした。２日後に細胞を分割し、ＩＬ－２を添加した新鮮な培地を、３×１０５細胞／ｍｌになるように添加した。最初の活性化の８日後、細胞を回収し、５００ｇで５分間遠心分離し、２×１０６細胞／ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５にサプリメントなしで再懸濁した。翌日、細胞を再刺激し、「細胞内サイトカイン染色」で説明したようにＦＡＣＳ染色した。その後２日間にわたり、Ｐａｒｎａｓｓｕｓ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＰＦＣＣ）で、細胞をＩＬ－２ｌｏおよびＩＬ－２ｈｉ ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＩＦＮ－γｌｏおよびＩＦＮ－γｈｉ ＣＤ４－Ｔ細胞集団に選別した。選別した細胞は、ゲノムＤＮＡ単離までＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｂｕｆｆｅｒ（２％ ＦＣＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを添加したＰＢＳ）に一晩保存した。
ＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングでは、同じドナー由来のＴ細胞を用いた同じ実験手順に従った。Ｔ細胞を、２％（ｖ／ｖ）のｄＣａｓ９－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＫＲＡＢ、ならびにそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）または２５％（ｖ／ｖ）の非濃縮ウイルス（約０．５のＭＯＩ）のＤｏｌｃｅｔｔｏ Ａ（ａｄｄｇｅｎｅ社９２３８５）およびＢ（ａｄｄｇｅｎｅ社９２３８６）ｓｇＲＮＡライブラリーに感染させた。
ゲノムＤＮＡは、固定した細胞から前述の方法（４４）で抽出した。統合ｓｇＲＮＡ配列を前述（２２）のように増幅し、その後シーケンスライブラリーをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｍｉｎｉキット（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ社カタログ番号７４０６０９．５０）を用いてアガロースゲルで精製した。ライブラリーはＮｅｘｔＳｅｑ（商標）５００装置で１００倍カバレッジの標的深度まで配列決定した。
ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａスクリーニングの補足ＣＤ４＋Ｔ細胞セットの場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞を磁気ネガティブ選択（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社カタログ番号１７９５２）を用いてＬｅｕｋｏｐａｋｓから単離し、その後「ヒトＴ細胞の単離および培養」に記載したように刺激した。その後、Ｔ細胞を培養し、上記のプライマリーＣＲＩＳＰＲａスクリーニングに記載したようにレンチウイルスに感染させた。ライブラリーレンチウイルス産生の場合、トランスフェクション前にＣａｌａｂｒｅｓｅセットＡプラスミドおよびセットＢプラスミドを等モル比で混合し、両セットからプールしたレンチウイルス粒子を形質導入に使用した。Ｔ細胞活性化後７日目にＣＤ４フローサイトメトリー染色を行い、純度が９８％超であることを確認した。Ｔ細胞をさらに処理し、上記のように再刺激した。Ｔ細胞は、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、またはＴＮＦ－αについて別々にＦＡＣＳ染色した。本発明者らの最初の解析の後、ＩＦＮ－γスクリーニングは、他のスクリーニングに比べてヒット分解能が低いため、サンプル不足の可能性があった。これに対処するため、同じ実験から得られた追加の固定細胞を、追加のテクニカルレプリケートとして染色およびソートし、計算的にマージした（以下に記述）。
ＣＲＩＳＰＲスクリーニング解析
リードは、－トリム－５ ２２，２３，２４，２５，２６，２８，２９，３０の独立変数を使用して、スタガード型の５’アダプターを除去し、ＭＡＧｅＣＫバージョン０．５．９．２（４５）を使用して適切な参照ライブラリーにアライメントした。次に、両ライブラリーセットにわたる生のリードカウントを各サンプルの総リードカウントに標準化し、２セットにわたって一致する各サンプルをマージして、単一の正規化リードカウント表を作成した。高ビン対低ビンの正規化リードカウントを、－－ｎｏｒｍ－ｍｅｔｈｏｄ ｎｏｎｅ、－－ｐａｉｒｅｄ、および－－ｃｏｎｔｒｏｌ－ｓｇｒｎａオプションでｍａｇｅｃｋ検定を使用し、それぞれサンプルをドナーでペアリングし、非標的ｓｇＲＮＡを対照として使用して比較した。遺伝子ヒットは、絶対的ｌｏｇ２倍率変化の中央値が０．５を超え、ＦＤＲが０．０５未満であるものとして分類した。補足的なＣＤ４＋スクリーニングの場合、リードは単一の参照ファイルで完全なＣａｌａｂｒｅｓｅ ＡおよびＢライブラリーにアライメントされた。補足的なＣＤ４＋ＩＦＮ－γスクリーニングは、２つのテクニカルレプリケートとして選別および配列決定され、標準化カウントは、ｍａｇｅｃｋ検定で解析する前に、テクニカルレプリケート間で平均した。
遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）
遺伝子セット濃縮解析（Ｇｅｎｅ ｓｅｔ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、ｆｇｓｅａ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｒパッケージを用い、デフォルト設定（４６）を使用して行った。ＫＥＧＧ経路 ｖ７．４はＧＳＥＡ ｍＳｉｇＤＢ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ－ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｊｓｐから取得した。ＫＥＧＧ ＮＦ－κＢシグナル伝達経路（エントリーｈｓａ０４０６４）はこのデータセットから欠落しており、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｅｎｔｒｙ／ｐａｔｈｗａｙ＋ｈｓａ０４０６４から手動で追加した。
ｓ－ＬＤＳＣ分析
ＧＷＡＳの要約統計は、Ｐｒｉｃｅ研究室のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ａｌｋｅｓｇｒｏｕｐ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｕｍｓｔａｔｓ＿ｆｏｒｍａｔｔｅｄ／およびｈｔｔｐｓ：／／ａｌｋｅｓｇｒｏｕｐ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ＵＫＢＢ／）からダウンロードした。ＬＤスコアは、１０００Ｇフェーズ３母集団リファレンスを用いて、各スクリーニング（各スクリーニングで有意なヒットとして同定された遺伝子の１００ｋｂ以内のＳＮＰのセット、または対応するマッチドバックグラウンドセットに対応）について作成した。各アノテーションの所与の形質に対する遺伝率の濃縮は、ベースラインＬＤモデルにアノテーションを追加し、層別ＬＤスコア回帰パッケージ（４７）を用いてＨａｐＭａｐ３ ＳＮＰｓを用いて形質のカイ二乗統計量に対して回帰することにより算出した。その後、逆分散重み付けを用いて、免疫形質または非免疫形質にわたって遺伝率の濃縮をメタ解析した。バックグラウンド遺伝子のセットは、対照ｓｇＲＮＡ、刺激されたバルクＲＮＡ－Ｓｅｑデータで発現した全遺伝子のセットからサンプリングした。各スクリーニングについて、バックグラウンド遺伝子は、数が有意なスクリーニングヒットと一致するように、また遺伝子発現の十分位数に基づいてサンプリングした。解析に用いた免疫形質は、「好酸球数」、「リンパ球数」、「単球数」、「白血球数」、「自己免疫疾患Ａｌｌ」、「診断されたアレルギー湿疹」、「診断された喘息」、「セリアック病（Ｃｅｌｉａｃ）」、「クローン病」、「炎症性腸疾患」、「ループス」、「多発性硬化症」、「原発性胆汁性肝硬変」、「関節リウマチ」、「１型糖尿病」、「潰瘍性大腸炎」であった。非免疫特性は、「ヒールＴスコア」、「ハゲ（Ｂａｌｄｉｎｇ）１」、「ハゲ４」、「ＢＭＩ」、「身長」、「２型糖尿病」、「神経質」、「拒食症」、「自閉症」、「双極性障害」、「抑うつ症状」、「空腹時グルコース」、「Ｈｄｌ」、「Ｌｄｌ」、「トリグリセリド」、「空腹時グルコース」であった。
アレイ化されたＣＲＩＳＰＲａ実験
フォローアップ実験で標的とするために選択された各遺伝子について、スクリーニングで使用されたＣａｌａｂｒｅｓｅライブラリーから１つのｓｇＲＮＡが選択された。最初のｓｇＲＮＡ（「＿１」）は、両ドナーで観察されたｌｏｇ２倍率変化が一致したものを手動で選択した。第２のｓｇＲＮＡ（「＿２」）は、ｈＣＲＩＳＰＲａ－ｖ２ゲノムワイドライブラリー（４８）から、各遺伝子についてＣａｌａｂｒｅｓｅライブラリーには存在しないトップランクのｓｇＲＮＡを選択した。ｓｇＲＮＡはプラスミドのセクションに記載したようにｐＸＰＲ＿５０２ベクターにクローニングした。
初代ヒトＴ細胞に、活性化の１日後に２％（ｖ／ｖ）ｍＣｈｅｒｒｙ－２Ａ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４レンチウイルス（ｐＺＲ１１２）で形質導入した。翌日（２日目）、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４形質導入細胞を９６ウェル平底プレートに端のウェルを避けて分割し、各ウェルに種々のｓｇＲＮＡレンチウイルスで形質導入した（５％ｖ／ｖ）。ｓｇＲＮＡを形質導入した１日後、新鮮な培地にＩＬ－２（５００ＩＵ／ｍｌ）および２μｇ／ｍｌ（最終培養濃度）のピューロマイシンを添加した。細胞を２日後に継代し、５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む新鮮な培地を添加し、３×１０５～１×１０６細胞／ｍｌの濃度を維持し、この濃度を維持するために必要に応じて９６ウェルプレートを複製した。８日目に、複製したプレートの細胞をプールし、サンプルをカウントした。細胞をペレット化し、添加剤を含まない新鮮なＸ－ＶＩＶＯ（商標）－１５に２×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。９日目に、細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒで再刺激するか（「細胞内サイトカイン染色」に記載）、静置した。
ＲＴ－ｑＰＣＲ
Ｔ細胞は、アレイ化されたＣＲＩＳＰＲａ実験に記載したように調製した。ｓｇＲＮＡを形質導入した７日後、ウェルあたり１００，０００個のＴ細胞を５００ｇ、５分、４℃でペレット化した。細胞を溶解し、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ ９６キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用し、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した、ウェル内のＤＮａｓｅ処理のオプションは省略した。ＤＮａｓｅ処理およびｃＤＮＡ合成は、ｄｓＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＲＴ－ｑＰＣＲのためのＭａｘｉｍａ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用して行った。ｑＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＰｒｉｍｅＴｉｍｅ（登録商標）ｑＰＣＲプローブアッセイ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、表１０に、使用したプローブのリスト）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ（登録商標）５リアルタイムＰＣＲシステムで行った。データはｄｅｌｔａＤｅｌｔａＣｔ法で解析した。２つのハウスキーピング遺伝子、ＰＰＩＡおよびＧＵＳＢの平均Ｃｔ値からｄｅｌｔａＣｔを算出し、非標的対照の平均ｄｅｌｔａＣｔからｄｅｌｔａＤｅｌｔａＣｔを算出した。
ｃＤＮＡ実験
活性化の１日後、Ｔ細胞に、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を認識する１Ｇ４ ＴＣＲレンチウイルスで形質導入するか、ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ（商標）アッセイのために、形質導入しなかった。１日後、細胞にｃＤＮＡ形式の導入遺伝子を形質導入した。最初の活性化から３日後、５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含む新鮮なＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地と共に、最終濃度が２μｇ／ｍｌになるようにピューロマイシンを添加し、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲスクリーニングと同様にさらに培養・増殖させた。最初の活性化から９日後、Ｔ細胞を遠心分離し、Ｘ－Ｖｉｖｏ（商標）１５に２×１０６細胞／ｍｌになるようにサプリメントなしで再懸濁した。同日、１Ｇ４ＴＣＲの発現をフローサイトメトリーで評価し、デキストラマー染色（Ｉｍｍｕｄｅｘ社カタログ番号ＷＢ３２４７－ＰＥ）を使用し、種々のｃＤＮＡ構築物間で均一に発現していることが確認された。翌日、１Ｇ４ ＴＣＲ導入細胞に対して、エフェクター－標的比１：２で、１ｍｌあたり６．２５μｌのＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔ（商標）またはＮＡＬＭ６細胞でＴ細胞を再刺激した。細胞を、さらに、「細胞内サイトカイン染色」の項で述べたように処理した。ＣＤ２２をＮＡＬＭ６細胞のマーカーとして用い、共培養中のＴ細胞と区別した。ＯＴＵＤ７Ｂ ｃＤＮＡを１Ｇ４ ＴＣＲと共に過剰発現させることにより（単独では発現せず）、毒性が生じたため、解析から除外した。２人のドナーは、ＴＣＲ導入が不十分であったため、１Ｇ４ ＴＣＲアッセイから除外した。
サイトカインＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ
Ｔ細胞は、「アレイ化されたＣＲＩＳＰＲａ実験」で説明したように調製した。活性化後９日目に、２×１０６細胞／ｍｌ濃度のＴ細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社カタログ番号１０９７０）で６．２５μｌ／ｍｌで再刺激した。再刺激の２４時間後、上清を回収し、－２０℃で凍結した。連続的なパイロット滴定の後、サイトカイン分析は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）２００システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰテクノロジーを使用して、Ｅｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより１／２００希釈で行った。下流の解析のために発現が非常に低いサイトカインを除去するため、４人のドナーのうち３人がサイトカインを検出できなかったグループは、サイトカインを除去した。さらに、ＩＬ－１αのｓｇＩＬ１Ｒ１－１ドナー４の測定値は、極めて高い異常値であったため、手動で除去した。
バルクＲＮＡ－ｓｅｑサンプルの調製
４人のドナー由来のＦＯＸＱ１および非標的ｓｇＲＮＡ対照初代ヒトＴ細胞に、「アレイ化されたＣＲＩＳＰＲａ実験」のセクションに記載したように形質導入し、増殖させた。８日目に、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＣＤ４＋集団を選別し、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）－１５に２×１０６細胞／ｍｌで添加物なしで再懸濁した。９日目に、細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）で１ｍｌあたり６．２５μｌで再刺激するか、静止（非刺激）状態でそのまま放置した。２４時間後、細胞を溶解してＲＮＡを得た。
ＲＮＡはＱｕｉｃｋ－ＲＮＡ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用して精製し、オプションのウェル内ＤＮａｓｅ処理工程は行わなかった。精製したＲＮＡをＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で処理し、可能性のある汚染ＤＮＡを除去した。その後、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－５キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用してＲＮＡを精製した。ＲＮＡの品質管理はＲＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅアッセイ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を使用して行い、全サンプルのＲＮＡインテグリティナンバーは７超であった。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーは、１００ｎｇのインプットＲＮＡを用い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｐｒｅｐキットを用いて調製した。ライブラリーは、ＮｅｘｔＳｅｑ５００（商標）装置でペアエンド７２－ｂｐリードを使用し、サンプルあたり平均３．２×１０７クラスター深度で配列決定した。
バルクＲＮＡ－ｓｅｑデータ解析
ｃｕｔａｄａｐｔバージョン２．１０（４９）を使用し、デフォルト設定で最小リード長２０ｂｐを維持しながら、ｆａｓｔｑファイルからアダプターを切り出した。ＳＴＡＲバージョン２．７．５ｂ（５０）を使用し、「－－ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ １」の設定で、一意にマッピングされたリードのみを残し、リードをヒトゲノムＧＲＣｈ３８にマッピングした。遺伝子とオーバーラップするリードは、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓバージョン２．０．１（５１）を使用し、「－ｓ ２」の設定で、Ｇｅｎｃｏｄｅバージョン３５基本的トランスクリプトームアノテーション（ｂａｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を使用してカウントした。カウントマトリクスはＲにインポートされた。少なくとも４つのサンプルにわたって少なくとも１カウント／１，０００，０００（ＣＰＭ）の遺伝子のみが保持された。ヒートマップにはＴＭＭで正規化したカウントを用いた。次に、ＦＯＸＱ１過剰発現サンプルおよび対照サンプル間の差次的発現遺伝子を、ドナー間の差異を制御しながら、ｌｉｍｍａバージョン３．４４．３（５２）を用いて同定した。有意な差次的発現遺伝子は、０．０５未満のＦＤＲ調整Ｐ値を有するものとして定義された。
Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑライブラリーの設計およびクローニング
一次ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ ＣＲＩＳＰＲａスクリーニングの結果からＣＲＩＳＰＲａ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ標的遺伝子を選択した。まず、有意なフィットネス欠陥（ｆｉｔｎｅｓｓ ｄｅｆｅｃｔ）があった遺伝子を遺伝子リストから削除した。次に、遺伝子をｓｇＲＮＡのｌｏｇ２倍率変化の中央値でランク付けし、上位にランク付けされ、以前に選択されていない遺伝子を、陽性のヒット数が陰性のヒット数を４：１の比率で上回るように、以下の順序で選択した：（１）ＩＬ－２陽性ヒット、（２）ＩＦＮ－γ陽性ヒット、（３）ＩＬ－２陽性ヒット、（４）ＩＦＮ－γ陽性ヒット、および（５）ＩＬ－２陽性またはＩＦＮ－γ陽性ヒット（各ラウンドで交互に）。各ラウンドで有意なヒット（ＦＤＲ＜０．０５）のみが選択された。例外はＴＣＦ７であり、Ｔ細胞機能への影響が知られているため、解析する価値があると考え、手動で追加した。ｓｇＲＮＡを選択するために、遺伝子が選択されたスクリーニングにおいて、ｌｏｇ２倍率変化で濃縮された上位２つのｓｇＲＮＡを使用した。ライブラリーを、プールされた１本鎖オリゴとしてオーダーし、ＰＣＲ増幅し、ＣＲＩＳＰＲａ－ＳＡＭ直接捕獲（ｄｉｒｅｃｔ－ｃａｐｔｕｒｅ）設計Ｉクローニングベクター（ｐＺＲ１５８）にクローニングした。
Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑサンプルの調製および配列決定
２人のドナーから得たバルクＣＤ３＋初代ヒトＴ細胞に、「ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニング」のセクションに記載したように形質導入し、培養したが、ライブラリーの形質導入は０．３という低いＭＯＩで完了した。１ｍｌあたり６．２５μｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ（商標）で、刺激状態の細胞を刺激した。２４時間後、刺激状態および非刺激状態の両方からの細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ＋（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４を示す）について選別した。選別された細胞は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＩＨＧ）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅにより、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングのためのＦｅａｔｕｒｅ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ技術を用いたＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３．１を使用し、製造業者のプロトコルに従って単一細胞のＲＮＡ－ｓｅｑおよびｓｇＲＮＡシーケンスライブラリーに処理した。クロムチップにロードする前に、２人の血液ドナーからソートした細胞を１０００細胞／μｌに標準化し、各状態について１：１の比率で混合した。２０マイクロリットルの細胞懸濁液を、条件ごとに４つの複製ウェルにロードし、状態ごとに合計８０，０００個の細胞をロードした。最終的なｓｇＲＮＡシーケンシングライブラリーは、４％アガロースＥ－Ｇｅｌ ＥＸ Ｇｅｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で正しいサイズの断片をさらに精製し、ゲル抽出した。ライブラリーは、遺伝子発現ライブラリーとｓｇＲＮＡライブラリーのモル比が２：１になるように、２つのＮｏｖａＳｅｑ Ｓ４レーン（１レーンあたり刺激ウェル２つ、非刺激ウェル２つ）で配列決定した。
Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ解析
遺伝子発現およびｓｇＲＮＡリードのアラインメントとカウント集計はＣｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１．１で行った。遺伝子発現およびｓｇＲＮＡリードは、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｃｏｕｎｔを使用し、デフォルト設定でアライメントした。遺伝子発現リードは、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓからダウンロードした「ｒｅｆｄａｔａ－ｇｅｘ－ＧＲＣｈ３８－２０２０－Ａ」ヒトトランスクリプトームリファレンスにアライメントした。ｓｇＲＮＡリードは、パターン（ＢＣ）ＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧを使用してＰｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑライブラリーにアライメントした。カウントはｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ａｇｇｒでデフォルト引数で集計した。ｓｇＲＮＡを細胞に割り当てるために、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒのカウント出力ファイル「ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ＿ｃａｌｌｓ＿ｐｅｒ＿ｃｅｌｌ．ｃｓｖ」を使用し、１を超えるｓｇＲＮＡがコールされた液滴をフィルタリングし、ｓｇＲＮＡシングルで１３３ ｓｇＲＮＡ ＵＭＩの中央値を返した。ストリンジェンシーを高めるため、５以上のｓｇＲＮＡ ＵＭＩの液滴のみを更なる解析に使用した。細胞ドナーはＳｏｕｐｏｒｃｅｌｌ（５３）（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｗｈｅａｔｏｎ５／ｓｏｕｐｏｒｃｅｌｌ）を使用して遺伝的多重化を解除した。それぞれのランの入力は、ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｃｏｕｎｔ出力からのｂａｍファイル、ｂａｒｃｏｄｅｓ．ｔｓｖファイル、および参照ｆａｓｔａであった。Ｓｏｕｐｏｒｃｅｌｌから出力されたｖｃｆファイルを使用し、公開されているｐｙｔｈｏｎスクリプト（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｈｙｕｎｍｉｎｋａｎｇ／ａｐｉｇｅｎｏｍｅ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｖｃｆ－ｍａｔｃｈ ｓａｍｐｌｅ－ｉｄｓ）を使用して、ウェル間のドナーコールを整合させた。
遺伝子発現データをインポートし、Ｓｅｕｒａｔ ｖｅｒｓｉｏｎ４．０．３ Ｒｅａｄ１０Ｘ関数（５４）を用いてＲで解析した。細胞は、ミトコンドリアリードの割合が２５％未満、検出されたＲＮＡフィーチャーの数が４００以上、６０００未満という条件で最初にクオリティフィルターを行い、４％の細胞を除去した。フィルタリング後、条件ごとにｓｇＲＮＡターゲット遺伝子あたり中央値４０１細胞（シングレットあたり中央値１２７ ｓｇＲＮＡユニーク分子インデックス（ＵＭＩ））、および条件ごとに標的なし対照ガイドで約２０００個の細胞を回収した。４つのｓｇＲＮＡ標的（ＨＥＬＺ２、ＴＣＦ７、ＰＲＤＭ１、およびＩＲＸ４）は、細胞数が少ない（１００個未満）ため、ダウンストリーム解析から除外された。
遺伝子発現カウントを標準化し、Ｓｅｕｒａｔ ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ関数（５５）を使用して変換し、以下の変数：ミトコンドリアリードの割合、Ｓ期スコア、Ｇ２／Ｍ期スコアを回帰した。これらは、Ｓａｔｉｊａ研究室のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｓａｔｉｊａｌａｂ．ｏｒｇ／ｓｅｕｒａｔ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｃｅｌｌ＿ｃｙｃｌｅ＿ｖｉｇｎｅｔｔｅ．ｈｔｍｌ）に記載されているように回帰を行った。標準化および変換されたカウントを、全ての下流解析に使用した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を呼び出すために、以下の式を用いた各細胞のＣＤ４／ＣＤ８スコアを使用した：ｌｏｇ２（ＣＤ４／平均（ｍｅａｎ）（ＣＤ８Ａ，ＣＤ８Ｂ））。－０．９未満のスコアはＣＤ８＋細胞と呼ばれ、１．４を超えるスコアはＣＤ４＋細胞と呼ばれる。
再刺激状態および安静状態の両方で、次元１～２０、それ以外はＲｕｎＵＭＡＰ Ｓｅｕｒａｔ関数のデフォルト設定でＵＭＡＰ削減を実行した。クラスタリングでは、アルゴリズム３を使用してＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓを実行し、分解能は再刺激状態では０．４、安静状態では０．５とした。再刺激状態における２つのクラスターを手動で統合し、「Ｃｌｕｓｔｅｒ ２：Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ」とした。混合したクラスターは非常に類似した遺伝子発現パターンを示し、１つのクラスターは負の制御因子ｓｇＲＮＡを含む細胞の大部分を含み、他のクラスターは負の制御因子であるＭＵＣ１を標的とするｓｇＲＮＡを含んでいた。表示されたクラスターツリーは、デフォルト引数でＳｅｕｒａｔ ＢｕｉｌｄＣｌｕｓｔｅｒＴｒｅｅ関数を使用して生成された。擬似バルク微分発現解析には、デフォルト法のウィルコクソンの順位和検定でＳｅｕｒａｔ ＦｉｎｄＭａｒｋｅｒｓ関数を使用した。
Ｔ細胞活性化スコアを作成するために、まず擬似バルク微分発現解析を再刺激対安静時無標的対照ｓｇＲＮＡで行い、ｌｏｇ２－倍率変化の出力を遺伝子重みとして使用した。ｌｏｇ２－倍率変化量の絶対値が０．２５を超え、再刺激細胞または安静細胞の１０％で検出された遺伝子のみを遺伝子ウェイトに使用した。与えられた細胞について、活性化スコアはｓｕｍ（ＧＥ×ＧＷ／ＧＭ）として計算される。式中、ＧＥは遺伝子の標準化／変換された発現数であり、ＧＷは遺伝子の重みであり、ＧＭは（ベースライン発現のレベルの差を補正するために）標的としなかった対照細胞における遺伝子の平均発現である。
統計解析
全ての統計解析は、特に断りのない限り、Ｒバージョン４．０．２で行った。ノンパラメトリック検定で同値を扱うため、マン・ホイットニーのＵ検定はＣｏｉｎ Ｒパッケージ（バージョン１．４－１）のｗｉｌｃｏｘ＿ｔｅｓｔ関数をデフォルト引数で使用して行った。ｑ値に基づく多重比較補正には、Ｒ ｑｖａｌｕｅパッケージ（バージョン２．２０．０）をデフォルト引数で使用した。
結果
ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａスクリーニングにより、Ｔ細胞におけるＩＬ－２およびＩＦＮ－γ産生の制御因子が同定される
初代ヒトＴ細胞で拡張可能なＣＲＩＳＰＲａを可能にするため、最小限のｄＣａｓ９－ＶＰ６４ベクター（ｐＺＲ１１２）を使用する最適化された高力価レンチウイルス生産プロトコルを開発し、最大８０％の導入効率を可能にした。第２世代のＣＲＩＳＰＲａ相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）システム（２２，２３）により、確立された表面マーカーの標的発現が強固に増大した。次に、本発明者らは、本発明者らのプラットフォームをスケールアップして、１８，８００を超えるタンパク質コード遺伝子を標的とするプールされたゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａスクリーニングを、１１２，０００を超えるｓｇＲＮＡを用いて行った（２２）。本発明者らは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、ＩＬ－２産生ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を高ビンおよび低ビンに分けた（図１Ａ）。その後のｓｇＲＮＡ定量化により、ＩＬ－２（ＩＬ２）およびＩＦＮ－γ（ＩＦＮＧ）を標的とするｓｇＲＮＡが、それぞれのサイトカイン高値集団に強く濃縮され、非標的対照ｓｇＲＮＡはいずれのビンにも濃縮されなかったことが確認された（図１Ｂ）。両方のＣＲＩＳＰＲａスクリーニングは、２つの異なるヒト血液ドナーにおいて高い再現性を示した（図１、ＣおよびＤ）。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ ＣＲＩＳＰＲａスクリーニングの遺伝子レベルの統計解析から、１７１個の共有ヒットを含む、それぞれ４４４および４７１のヒットが明らかになった（図１Ｅ）。したがって、ＣＲＩＳＰＲａスクリーニングにより、初代細胞における刺激依存性応答の機能獲得制御因子（ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）を発見するための強固なプラットフォームが提供される。
ＣＲＩＳＰＲａのヒットは、ＴＣＲシグナル伝達経路の構成要素およびＴ細胞転写因子を含んでいた。メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞のいずれもの分化を促進するＴＢＸ２１（Ｔ－ｂｅｔをコードする）を活性化することにより（２４－２６）、特徴的なＩ型サイトカインであるＩＦＮ－γが選択的に増強された（図１Ｅ）。一方、Ｔ－ｂｅｔに拮抗してＩＩ型分化を促進するＧＡＴＡ３を活性化するｓｇＲＮＡ（２５，２７）は、逆の効果を示した（図１Ｅ）。ＶＡＶ１、ＣＤ２８、ＬＣＰ２（ＳＬＰ７６をコードする）およびＬＡＴ（２８，２９）のような近位ＴＣＲシグナル伝達複合体のメンバーの過剰発現により、Ｔ細胞の活性化が強化され、サイトカイン高値の両ビンに濃縮された。逆に、負のＴＣＲシグナル制御因子であるＭＡＰ４Ｋ１およびＳＬＡ２は、これらのビンでは枯渇していた（図１、ＢおよびＥ）（３０，３１）。このように、ＣＲＩＳＰＲａはサイトカイン産生を誘導するシグナルにおける重要な「ボトルネック」を同定する。
ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉの相補的スクリーニングにより、Ｔ細胞におけるサイトカイン産生回路が包括的に明らかになった
ＣＲＩＳＰＲａスクリーニングは、サイトカイン産生の制限因子を同定するのに有効であったが、機能喪失試験によってのみ同定される必要な構成要素を見逃す可能性があった。したがって、本発明者らは、最適化したレンチウイルスプロトコルを使用して、ゲノムワイドなＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングを行った（図２、ＡおよびＢ）。標準的必須遺伝子（３２）のドロップアウトおよび２人のヒトドナー間での再現性により、スクリーニングの質が確認された。ＣＲＩＳＰＲｉ ＩＬ－２およびＩＦＮ－γスクリーニングは、それぞれ２２６個および２０３個の遺伝子ヒットを同定し、その中には９２個の共有ヒットが含まれていた（図２、ＡおよびＢ）。予想されたように、ＣＲＩＳＰＲｉによるヒットは、ＣＤ３複合体のメンバーを含むｍＲＮＡ発現量の多い遺伝子に偏っていたが、ＣＲＩＳＰＲａでは、スクリーニングされた条件下でＴ細胞において低レベルか全く発現していない調節因子も同定された（図２、ＣおよびＤ）。例えば、ＰＩＫ３ＡＰ１およびＩＬ１Ｒ１はスクリーニングされた条件下では低レベルで発現していた（図Ｓ７Ａ）。これらの遺伝子はＴ細胞の文脈によっては潜在的に誘導可能であるが、ＣＲＩＳＰＲａではヒットとして検出されたが、ＣＲＩＳＰＲｉでは検出されなかった。
活性化および干渉スクリーニングをカップリングすることの力（ｐｏｗｅｒ）は、２つのＩＦＮ－γ制御回路の同定によってさらに実証された。ＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにより、ＩＦＮ－γ産生に必要なＮＦ－κＢ経路の構成要素が同定された（ＩＬ－２産生もより少ない程度に）。ＣＲＩＳＰＲｉは、ＭＡＬＴ１、ＢＣＬ１０、ＴＲＡＦ６、およびＴＡＫ１（ＭＡＰ３Ｋ７によってコードされる）を介して、ＩＦＮ－γ産生を促進するＮＦ－κＢ複合体（ＣＨＵＫ、ＩＫＢＫＢ、およびＩＫＢＫＧによってコードされるＩκＢ複合体）の阻害剤にシグナル伝達するＴ細胞刺激回路を検出した（図２、ＥおよびＦ）。一方、ＣＲＩＳＰＲａにより、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーおよびＩＬ１Ｒ１を含む一連の正のＩＦＮ－γ制御因子が明らかになった。これらの制御因子もまた、ＮＦ－κＢを介してシグナルを伝達するが、個々に必要なものではないため、ＣＲＩＳＰＲｉにおいては検出されなかった（図２、ＥおよびＦ）。したがって、ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉは、機能的サイトカイン制御因子を包括的に発見するために、互いに補完している。ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａのスクリーニングを通して濃縮された機能的経路に関する洞察を得るために、ＫＥＧＧ経路の遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）を行い、複数の免疫関連経路がスクリーニング間で濃縮されていることを確認した。さらに、本発明者らは、多数のゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）のデータを解析し、層別連鎖不平衡スコア（ｓ－ＬＤＳＣ）回帰により、スクリーニングでヒットした遺伝子を有するゲノム領域で、複雑な免疫形質の遺伝率が濃縮されているかどうかを調べた。ＩＦＮ－γのＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａ制御因子、ならびにＩＬ－２のＣＲＩＳＰＲａ制御因子の両方が、非免疫形質または発現をマッチさせた背景セットと比較して、免疫形質の遺伝率が濃縮された領域にあった。したがって、これらの順遺伝学的スクリーニングは、複雑な免疫疾患と関連するゲノム領域における機能遺伝子候補の優先順位付けに役立つリソースとなる可能性がある。
次いで、本発明者らは、両サイトカインに関するＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングにわたってヒットした遺伝子の統合的解析を行った。本発明者らは、Ｔ細胞における刺激応答性サイトカイン産生の核となる制御因子を代表する一握りの遺伝子（例えば、正の制御因子としてのＺＡＰ７０および負の制御因子としてのＣＢＬＢ）が、全てのスクリーニングにわたって同定されたことを発見した。しかしながら、ヒットの大部分はサイトカイン（ＣＤ４＋Ｔ細胞ではＩＬ－２、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではＩＦＮ－γ）または摂動（活性化または干渉）特異的であった。ＰＴＰＲＣ（ＣＤ４５）を含むいくつかの標的遺伝子では、ＣＲＩＳＲＰａとＣＲＩＳＰＲｉの両方が同じ方向にサイトカイン産生に影響を及ぼし、いくつかの遺伝子では活性化および干渉のいずれもが最適なレベルを損なっていることが示唆された。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－２およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの間の制御因子における顕著な重複から、本発明者らは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αについて、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａスクリーニングを追加的に実施し、ＣＤ４＋Ｔ細胞における１型サイトカイン調節因子の直接的な比較を可能にした。最も強力な陽性ヒット（例えば、ＶＡＶ１、ＣＤ２８およびＬＣＰ２）および陰性ヒット（例えば、ＭＡＰ４Ｋ１、ＬＡＴ２およびＧＲＡＰ）の多くは、全てのＣＲＩＳＰＲａスクリーニングで重複しており、刺激／共刺激に応答する１型サイトカイン産生の核となる制御因子である可能性が高い。さらに、これらのスクリーニングにより、個々のサイトカインを選択的に増減させる可能性のあるヒットが同定された。したがって、ＣＲＩＳＰＲｉおよびＣＲＩＳＰＲａのヒットにより、サイトカイン産生の核となる制御因子および文脈特異的制御因子がいずれも明らかになった。
本発明者らは、統合されたデータセットを文献レビューと組み合わせて使用し、サイトカイン産生を誘導するシグナル伝達経路の調整可能な制御因子の高解像度マップを構築した（図２Ｇ）。これには、カルシウム経路シグナル伝達遺伝子（例えば、ＰＬＣＧ１、ＰＬＣＧ２、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＫＤ２、およびＮＦＡＴＣ２）およびサイトカインシグナル伝達遺伝子（例えば、ＳＴＡＴ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、およびＳＯＣＳ３）が含まれ、後者はサイトカインシグナル間のフィードバック回路を示唆している。特に、ＣＲＩＳＰＲａは、以前の文献にはなかった制御因子（ＡＰＯＢＥＣ３Ａ／Ｄ／Ｃ、ＦＯＸＱ１、ＥＭＰ１など）を同定し（図２Ｈ）、包括的発見のためには機能獲得型スクリーニングが必要であることが強調された。したがって、ＣＲＩＳＰＲａおよびＣＲＩＳＰＲｉスクリーニングは、Ｔ細胞刺激応答性サイトカイン産生を制御する調節可能な遺伝子回路をマッピングするために、互いに補完し合う。
選択されたＣＲＩＳＰＲａスクリーニングヒットのアレイ化された特徴付け
次いで、本発明者らは、アレイ化ＣＲＩＳＰＲａ実験を行い、スクリーンヒットの表現型をより深く特徴付けた（図３Ａ）。本発明者らは、確立された制御因子ＶＡＶ１、ＭＡＰ４Ｋ１、ならびに陽性対照のＩＬ２およびＩＦＮＧを含む１４のスクリーニングヒット（異なるスクリーニングカテゴリーから）を選択した（図３Ｂ）。特に、本発明者らの実験条件下ではＴ細胞での発現が比較的低い遺伝子、ＦＯＸＱ１、ＩＬ１Ｒ１、ＬＨＸ６、およびＰＩＫ３ＡＰ１も含んでいた。まず、本発明者らは、選択したｓｇＲＮＡが標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を増加させることを検証した。次いで、本発明者らはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の細胞内染色により、ＩＬ－２、ＩＦＮγおよびＴＮＦ－αを評価した。１４個の標的遺伝子のうち１３個が、少なくとも１個のｓｇＲＮＡで、関連サイトカイン陽性細胞の割合を有意に変化させた（図３、ＣおよびＤ）。さらに、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γの二重陽性集団および単陽性集団のいずれも効果が観察された。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（およびＩＬ２またはＩＦＮＧ）を除き、正の制御因子は刺激なしでは自発的なサイトカイン産生を起こさなかった（図３Ｄ）。ＩＬ－２はＣＤ４＋Ｔ細胞でスクリーニングされ、ＩＦＮ－γはＣＤ８＋Ｔ細胞でスクリーニングされたが、ＣＲＩＳＰＲａ ｓｇＲＮＡの効果は、両系統にわたって高度に相関していた（図３Ｅ）。また、本発明者らは、Ｔ細胞の分化を評価し、ＦＯＸＱ１およびＴＮＦＲＳＦ１ＡがＣＤ６２Ｌ＋細胞の割合を有意に減少させることを観察し、潜在的なメカニズムとしてエフェクターＴ細胞状態へのシフトを示した。したがって、これらの研究により、プールされたＣＲＩＳＰＲａスクリーニングが検証され、主要な標的遺伝子の活性化によって促進されるサイトカイン産生と細胞分化状態の特徴が明らかになり始めた。
次いで、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲａの継続的発現は、Ｃａｓ９の免疫原性のために細胞治療において課題があるため（３３）、ＣＲＩＳＰＲａによって同定された遺伝子をｃＤＮＡ導入遺伝子として過剰発現させた場合にもサイトカインを制御できるかどうかを検証した。ＣＲＩＳＰＲａのｃＤＮＡ導入遺伝子過剰発現は、抗体または抗原陽性がん細胞で刺激されたＴ細胞におけるサイトカイン産生に影響を与えた。したがって、この戦略は、人工Ｔ細胞療法にＣＲＩＳＰＲａの発見を導入するために使用し得る可能性がある。
次いで、本発明者らは、４８種類（そのうち３２種類は対照サンプルで検出された）の分泌型サイトカインおよびケモカインの広範なパネルを測定することにより、個々のＣＲＩＳＰＲａの摂動がサイトカイン産生をどのように再プログラムするかを評価した。ＩＬ－２、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの測定に対する影響が細胞内染色と一致することが確認された後（図３Ｆ）、本発明者らは、全てのサイトカインについて主成分分析（ＰＣＡ）および階層的クラスタリングを行った。その結果、本発明者らは、両サイトカインの制御因子として同定された遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡが、サイトカイン濃度の広範な増加または減少を引き起こすという、スクリーニングで観察されたものと一致するｓｇＲＮＡのカテゴリー分類を観察した（図３Ｇ）。特に、種々の制御因子によって増加するサイトカインのクラスには、明確なパターンがあった（図３Ｈ）。ＶＡＶ１およびＦＯＸＱ１（Ｔ細胞では十分に特徴付けられていない転写因子）は、１型シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）サイトカインを優先的に増加させ、２型サイトカインを減少させた。意外なことに、近位ＴＣＲシグナル伝達の正の制御因子であるＯＴＵＤ７Ｂ（３４）は種々の効果を示し、２型サイトカインを増加させた。次いで、本発明者らは、セクレトームにおける調節が、対応する遺伝子の転写制御と相関しているかどうかを調べた。ＦＯＸＱ１を例にとって、ＦＯＸＱ１および対照のｓｇＲＮＡ ＣＤ４＋Ｔ細胞についてバルクＲＮＡ－ｓｅｑを行い、セクレトームの効果と高い相関があることがわかった。このように、同定された制御因子は、ＴＣＲ刺激およびシグナル伝達を調節するだけでなく、Ｔ細胞のセクレトームを特定のシグネチャーに向けて調整する可能性がある。
ＣＲＩＳＰＲａ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑはサイトカイン制御因子の分子表現型を特徴付ける
本発明者らは、プールされたＣＲＩＳＰＲａ摂動をバーコード化されたシングルセルＲＮＡシーケンス（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）リードアウト（ＣＲＩＳＰＲａ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ）とカップリングするためにプラットフォームを開発し、各ＣＲＩＳＰＲａ遺伝子の誘導から生じるグローバルな分子シグネチャーを評価した（図４Ａ）。同様のＣＲＩＳＰＲａ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑアプローチが細胞株および動物モデルで強力であったため（３５－３７）、本発明者らは、液滴ベースのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ手法との互換性を可能にするため、ＣＲＩＳＰＲａ－ＳＡＭ改変ｓｇＲＮＡスキャフォールドに直接捕捉配列を組み込んだ。
本発明者らは、ゲノムワイドＣＲＩＳＰＲａサイトカインスクリーニングからヒットした７０個および対照を標的に、約５６，０００個の初代ヒトＴ細胞における刺激応答の制御因子のＣＲＩＳＰＲａ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ特性の解析を行った（図４、ＡおよびＢ）。まず、本発明者らは、ｓｇＲＮＡが標的遺伝子の発現を有意に増加させることを確認した。次いで、ユニフォームマニフォールド近似および投影（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ：ＵＭＡＰ）次元削減により、安静時細胞および再刺激細胞の分離が明らかになり、２つのドナーの細胞が比較的均等に分布していることが示された（図４Ｃ、遺伝子シグネチャーにより、ほとんどのＴ細胞をＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかとして分離することができた（図４Ｄ））。したがって、本発明者らは、高品質のＣＲＩＳＰＲａ Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑデータセットを作成した。
サイトカインの産生は、強化されたＴＣＲシグナル伝達によって調整することができる。本発明者らは、非標的対照ｓｇＲＮＡグループ内の安静時細胞および再刺激細胞を比較して導き出した遺伝子シグネチャーに基づいて、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ「活性化」スコアを計算し、刺激応答性遺伝子の一般的な強さを調整するＣＲＩＳＰＲａ遺伝子摂動を同定した。活性化スコアを刺激細胞ＵＭＡＰに投影すると、再刺激細胞間で活性化スコアが高い領域と低い領域とが別々に存在することが明らかになった（図４Ｅ）。次いで、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲａの摂動全体における活性化スコアを調べた（図４Ｆ）。特に、ＩＫＺＦ３（転写因子Ａｉｏｌｏｓをコードする）を除く負の制御因子は活性化スコアを低下させ、刺激強度を広く減衰させるように作用していることが示唆された。一方、ＩＫＺＦ３は全体的な活性化スコアを低下させることなくＩＦＮＧ発現を低下させた（図４Ｆ）ため、サイトカイン遺伝子制御のメカニズムが異なっている可能性が示唆される。正の制御因子の多くが活性化スコアを有意に増加させ、ＶＡＶ１が最も強い活性化増強を引き起こした（図４Ｆ）。したがって、全てではないが多くのヒット因子が、程度の差こそあれ、Ｔ細胞全体の活性化を調整することによって作用している。
次いで、本発明者らは、種々の摂動が刺激細胞におけるサイトカインおよび他のエフェクター遺伝子の発現にどのような影響を与えるかを調べた。本発明者らは、各ｓｇＲＮＡ 標的細胞群について、標的を設定しない対照細胞と比較し、再刺激条件下での仮性バルク差次的遺伝子発現を解析した。ＩＦＮＧは２９種類のｓｇＲＮＡ標的で差次的発現が認められ、負の制御因子を標的とするｓｇＲＮＡのみが発現低下を引き起こした。しかしながら、ＩＬ２はｓｃＲＮＡ－ｓｅｑでほとんど検出されなかった。ＩＬ２およびＶＡＶ１のｓｇＲＮＡのみが発現を増加させたが、これはＶＡＶ１の活性化がＩＬ２の放出を最も多く引き起こしたという観察結果と一致している（図３Ｈ）。負の制御因子の多くは、サイトカイン遺伝子発現の差の定型的なパターンを引き起こしたが、正の制御因子は、概して負の制御因子よりも多様なサイトカイン発現パターンを引き起こした。特に、ＴＢＸ２１（Ｔ－ｂｅｔ）が検出可能なほとんどのサイトカイン遺伝子の発現を調節した。さらに、ほとんどの摂動とは異なり、刺激とは無関係にサイトカイン発現が変化した。
次いで、本発明者らは、クラスタリング解析を使用して、再刺激Ｔ細胞および静止Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲａ駆動細胞状態の特徴を明らかにした（図４Ｇ）。各クラスターについて、本発明者らは、発現が増加した上位の遺伝子マーカーおよびサイトカイン遺伝子、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の寄与、および過剰発現したｓｇＲＮＡを同定し、ＣＲＩＳＰＲａによって促進されるＴ細胞の多様な状態を明らかにした（図４、Ｈ～Ｊ）。負のサイトカイン制御因子（例えばＭＡＰ４Ｋ１）は、ＬＴＢ発現および低い活性化スコアによって特徴づけられるクラスター２に高度に濃縮されていた。特に、ＧＡＴＡ３のみがＴｈ２表現型（クラスター３）を促進したことにより、Ｔヘルパーの分化の変化が、負のＩＦＮＧ制御因子の共通のメカニズムではないことが示唆された。したがって、Ｐｅｒｔｕｒｂ ｓｅｑにより、種々の主要な制御因子の過剰発現によって促進される細胞の状態が明らかになった。
転写物の捕捉が不十分であったにもかかわらず、本発明者らは、ＩＬ２を発現する２つのクラスターを同定し、そのクラスターは、いずれも主にＣＤ４＋Ｔ細胞から構成されていた。２つのうちのクラスター１３はＩＬ２発現が高く、ＶＡＶ１およびＯＴＵＤ７Ｂ ｓｇＲＮＡによって促進された。ＶＡＶ１ ｓｇＲＮＡは、ＩＦＮＧおよびＩＬ２発現クラスターの両方において強く濃縮されており、ＶＡＶ１を介したＴ細胞刺激の増強が、複数の異なるサイトカイン産生集団への分化を促進する可能性があることが示唆されている。
また、本発明者らは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をいずれも含む、ＩＦＮＧを発現する細胞の２つの異なるクラスター（クラスター１および１２）を同定した。クラスター１は、ＣＣＬ３およびＣＣＬ４の高発現によって特徴付けられ、ＶＡＶ１、ＣＤ２８、ＦＯＸＱ１などの、強い活性化スコアを増強するｓｇＲＮＡに富んでいた。一方、クラスター１２はＩＬ１Ｒ１、ＴＲＡＦ３ＩＰ２、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１ＢなどのＮＦ κＢ経路を活性化することが知られているｓｇＲＮＡに富んでいた。これらの観察から、増強された刺激／共刺激は、ＮＦ－κＢ経路を介したより特異的なシグナル伝達とは異なる、活性化されたＩＦＮＧ発現状態へとＴ細胞を駆動する可能性が示唆される。ＴＮＦＲＳＦレセプター遺伝子のサブセット（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＬＴＢＲ、ＣＤ２７）の活性化もまた、細胞周期遺伝子の高発現によって特徴づけられる細胞状態（クラスター５および６）を促進した。ＬＴＢＲおよびＣＤ２７のｓｇＲＮＡは、このクラスターの細胞でのみ見られたが、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＢのｓｇＲＮＡは、細胞を増殖状態およびＩＦＮＧ発現状態の両方に押しやるように思われた。このように、ＣＲＩＳＰＲａ Ｐｅｒｔｕｒｂ ｓｅｑにより、サイトカイン産生の制御因子がＴ細胞の活性化をどのように調整し、細胞を異なる刺激応答状態にどのようにプログラムするかが明らかになる。
考察
初代ヒトＴ細胞における刺激応答性サイトカイン産生を制御する遺伝子プログラムを解読するために、ＣＲＩＳＰＲａとＣＲＩＳＰＲｉを対にしたスクリーニングは互いに補完し合う。ＣＲＩＳＰＲｉにより必要なサイトカイン制御因子が同定されたが、ＣＲＩＳＰＲａは経路機能における主要なシグナル伝達のボトルネックならびにｅｘ ｖｉｖｏ－培養Ｔ細胞では必ずしも活性化されない制御因子を明らかにした。他の種々の実験条件において実施される将来のスクリーニングにより、Ｔ細胞の状態および機能の制御因子をさらに同定できる可能性がある。
本研究で開発された技術により、ヒトゲノムの機能的非コード領域のスクリーニング（１８、３８、３９）など、初代ヒトＴ細胞や他の初代細胞タイプにおけるスクリーニングアプローチが可能になる。さらに、このスクリーニングフレームワークは、ＣＲＩＳＰＲツールキットの他の非遺伝子編集アプリケーションにも適応可能であり（４０）、特にＣＲＩＳＰＲ摂動がシングルセル解析とカップリングされる場合、初代細胞における複雑な生物学的疑問の探究の機会を拡大し続ける。
参考文献
実施例３
Ｔ細胞がん治療のための同定されたヒットを使用したインビトロデータ。このアッセイのために、２人のヒト血液ドナー由来のＴ細胞を、１Ｇ４抗がんＴ細胞受容体ならびにＣＲＩＳＰＲａスクリーニングの各遺伝子でウイルス導入し（または対照として「空（ｅｍｐｔｙ）」ウイルス）、ＮＹＥＳＯ発現Ａ３７５メラノーマ細胞と共培養した。ライブイメージングシステムにより、４時間ごとにがん細胞数を記録した。標的遺伝子ＶＡＶ１、ＰＩＫ３ＡＰ１、およびＣＤ２７で形質導入されたＴ細胞は、がん殺傷の増強を示した（図５）。
本明細書において参照され、または言及される全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野における当業者の技術レベルを示すものであり、このように参照された特許または刊行物はそれぞれ、その全体が個別に参照により援用されるか、またはその全体が本明細書に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に具体的に援用される。出願人は、そのような引用特許または刊行物からのあらゆる資料および情報を本明細書に物理的に援用する権利を留保する。
以下のステートメントは、本明細書における上述の説明に従って本発明の種々の実施形態を説明し要約することを意図している。
ステートメント：
１．１種または複数の試験薬を１種または複数のＴ細胞と接触させてアッセイ混合物を形成する工程、およびアッセイ混合物または１種もしくは複数のＴ細胞中のインターフェロン－γ産生、インターロイキン－２産生、細胞増殖、またはそれらの組合せを検出または定量し、インターフェロン－γ産生、インターロイキン－２産生、細胞増殖、またはそれらの組合せの検出または定量レベルを生成する工程を含む方法。
２．検出もしくは定量されたインターフェロン－γ産生レベル、検出もしくは定量されたインターロイキン－２産生レベル、検出もしくは定量された細胞増殖レベル、またはそれらの組合せを、対照と比較する工程をさらに含む、ステートメント１に記載の方法。
３．アッセイ混合物中または１種もしくは複数のＴ細胞において、表１～７または図１～４に記載された１種または複数の制御因子の量を測定する工程をさらに含む、ステートメント１または２に記載の方法。
４．試験薬と最初に接触した１種または複数のＴ細胞が、表１～７または図１～４に記載された制御因子のいずれかを天然に発現している、ステートメント１、２または３に記載の方法。
５．試験薬と最初に接触した１種または複数のＴ細胞が、表１～７または図１～４のいずれかに記載された１種または複数の制御因子を発現しない、ステートメント１～３または４に記載の方法。
６．試験薬と最初に接触した１種または複数のＴ細胞が、１種または複数の制御因子を発現する可能性を有するが、試験薬と最初に混合すると、細胞は検出可能な量の１種または複数の制御因子を発現しない、ステートメント１～４または５に記載の方法。
７．少なくとも１種のＴ細胞が、表１～７または図１～４のいずれかに記載された１種または複数の制御因子の発現または活性を低下させるノックダウンまたはノックアウト変異を含む変異Ｔ細胞である、ステートメント１～５または６に記載の方法。
８．表１～７または図１～４に記載された１種または複数の制御因子を発現または過剰発現するように、１種または複数の変異Ｔ細胞を改変する工程；および第２のアッセイ混合物または１種もしくは複数の変異Ｔ細胞内で、インターフェロン－γ産生、インターロイキン－２産生、細胞増殖、またはそれらの組合せを検出または定量する工程をさらに含む、ステートメント７に記載の方法。
９．１種または複数のＴ細胞がＴ細胞の集団中に存在する、ステートメント１～７または８に記載の方法。
１０．１種または複数のＴ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、人工多能性幹細胞由来の免疫（例えば、リンパ球系および／もしくは骨髄系）細胞、またはそれらの組合せの１種または複数を含む、ステートメント１～８または９に記載の方法。
１１．インターフェロン－γ産生、インターロイキン－２産生、細胞増殖、またはそれらの組合せを検出または定量する工程の前に、少なくとも１種の第２の細胞型をアッセイ混合物に添加する工程をさらに含む、ステートメント１～９または１０に記載の方法。
１２．第２の細胞型が、１種もしくは複数のがん細胞、１種もしくは複数の免疫細胞、またはそれらの組合せである、ステートメント１１に記載の方法。
１３．１種または複数のがん細胞が、白血病細胞、リンパ腫細胞、ホジキン病細胞、軟部組織および骨の肉腫、肺がん細胞、中皮腫、食道がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、肝胆道がん細胞、小腸がん細胞、結腸がん細胞、結腸直腸がん細胞、直腸がん細胞、腎臓がん細胞、尿道がん細胞、膀胱がん細胞、前立腺がん細胞、精巣がん細胞、子宮頸がん細胞、卵巣がん細胞、乳がん細胞、内分泌系がん細胞、皮膚がん細胞、中枢神経系がん細胞、皮膚および／もしくは眼内由来のメラノーマ細胞、ＡＩＤＳ関連がん細胞、またはそれらの組合せを含む、ステートメント１２に記載の方法。
１４．１種または複数のがん細胞が転移性がん細胞を含む、ステートメント１２または１３に記載の方法。
１５．１種または複数のがん細胞が、微小転移腫瘍細胞、巨大転移腫瘍細胞、再発がん細胞、またはそれらの組合せを含む、ステートメント１２、１３または１４に記載の方法。
１６．１種または複数の免疫細胞が、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、キメラ抗原受容体細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、人工多能性幹細胞由来の免疫（例えば、リンパ球系および／もしくは骨髄系）細胞、またはそれらの組合せを含む、ステートメント１２～１４または１５に記載の方法。
１７．少なくとも１種の第２の細胞型の細胞増殖を測定する工程をさらに含む、ステートメント１２～１５または１６に記載の方法。
１８．１種または複数のＴ細胞のインターフェロン－γ産生レベル、インターロイキン－２産生レベル、細胞増殖レベル、またはそれらの組合せを調節する１種または複数の試験薬を同定し、それによって１種または複数の有用な試験薬を同定する工程をさらに含む、ステートメント１～１６または１７に記載の方法。
１９．表１～７または図１～４のいずれかに記載された１種または複数の制御因子の発現または活性を調節する試験薬の１種または複数を同定し、それによって１種または複数の有用な試験薬を同定する工程をさらに含む、ステートメント１～１７または１８に記載の方法。
２０．表１～７または図１～４のいずれかに記載された１種または複数の制御因子によってコードされるタンパク質、またはそれを含む核酸に対する１種または複数の有用な試験薬の結合を測定する工程をさらに含む、ステートメント１９に記載の方法。
２１．１種または複数の有用な試験薬を、１または複数の実験動物に投与する工程をさらに含む、ステートメント１９または２０に記載の方法。
２２．１または複数の実験動物が、疾患、感染症、または病状を有する、ステートメント２１に記載の方法。
２３．疾患または病態が、がん、免疫障害、または免疫状態である、ステートメント２２に記載の方法。
２４．免疫障害または免疫状態が、自己免疫障害、グレーヴス病、関節炎、乾癬、セリアック病、白斑、関節リウマチ、ループス、クローン病、多発性硬化症、１型糖尿病、脱毛症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、またはそれらの組合せである、ステートメント２３に記載の方法。
２５．疾患の症状もしくは病態について、有用な試験薬の毒性副作用について、またはそれらの組合せについて、１または複数の実験動物をモニタリングする工程をさらに含む、ステートメント２１～２３または２４に記載の方法。
２６．１または複数の実験動物の免疫細胞数および／または種類をモニタリングする工程をさらに含む、ステートメント２１～２４または２５に記載の方法。
２７．疾患または病態の処置に有用な治療薬として１種または複数の有用な試験薬を同定する工程をさらに含む、ステートメント２２～２５または２６に記載の方法。
２８．請求項１～２７のいずれかに記載の方法により同定された有用な試験薬または治療薬を含む組成物。
２９．少なくとも１種の改変リンパ系細胞、少なくとも１種の改変骨髄系細胞、または改変リンパ系細胞および改変骨髄系細胞の混合物を生成するために、少なくとも１種のリンパ系細胞もしくは骨髄系細胞、またはそれらの組合せ内で、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかをエクスビボで改変することを含む方法。
３０．改変が、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの１種または複数のゲノム部位への１つまたは複数の欠失、置換または挿入である、ステートメント２９に記載の方法。
３１．改変が、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの１種または複数のＣＲＩＳＰＲ媒介改変または活性化である、ステートメント２９または３０に記載の方法。
３２．少なくとも１種の改変リンパ系細胞、少なくとも１種の改変骨髄系細胞、または改変リンパ系細胞および改変骨髄系細胞の混合物を対象に投与する工程をさらに含む、ステートメント２９、３０または３１に記載の方法。
３３．少なくとも１種の改変リンパ系細胞、少なくとも１種の改変骨髄系細胞、または改変リンパ系細胞および改変骨髄系細胞の混合物をインキュベートして、改変細胞の集団を形成する工程をさらに含む、ステートメント２９、３０または３１に記載の方法。
３４．改変された細胞の集団を対象に投与する工程をさらに含む、ステートメント３３に記載の方法。
３５．対象が疾患または病態を有する、ステートメント３２または３４に記載の方法。
３６．疾患または病態が免疫状態またはがんである、ステートメント３５に記載の方法。
本明細書に記載の具体的な方法および組成物は、好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的なものであって、本発明の範囲を限定するものとして意図していない。他の目的、態様、および実施形態は、本明細書を検討する際に当業者に想起され、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含される。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示された発明に様々な置換および改変を加えることができることは、当業者には容易に明らかであろう。
本明細書で例示的に記載された本発明は、好適には、本明細書において必須であるとして具体的に開示されていない１つもしくは複数の要素、または１つもしくは複数の限定がない場合に実施され得る。本明細書に例示的に記載された方法および工程は、好適には、工程の順序が異なって実施されてもよく、方法および工程は、本明細書または特許請求の範囲に示された工程の順序に必ずしも限定されない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「核酸」または「タンパク質」または「細胞」への言及は、複数のそのような核酸、タンパク質、または細胞（例えば、核酸もしくは発現カセットの溶液もしくは乾燥調製物、タンパク質の溶液、または細胞の集団）などを含む。本明細書において、「または」という用語は、特に断りのない限り、「ＡまたはＢ」が「ＡであるがＢではない」、「ＢであるがＡではない」、「ＡおよびＢ」を含むように、非排他的な「または（ｏｒ）」を意味するために使用される。
いかなる場合においても、本特許は、本明細書に具体的に開示された具体例または実施形態または方法に限定して解釈されない。いかなる場合においても、審査官または特許商標庁のその他の職員もしくは従業者が行った記述によって特許が限定されると解釈されることはない。ただし、そのような記述が、出願人による応答文書において具体的かつ無条件で明示的に採用された場合はこの限りでない。
使用された用語および表現は、説明の用語として使用されたものであり、限定を意味するものではなく、このような用語および表現の使用には、記載され、説明された特徴またはその一部と同等のものを排除する意図はないが、特許請求された本発明の範囲内で様々な変更が可能であると認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されているが、ここに開示された概念の修正および変形は、当業者によって頼ることができ、そのような修正および変形は、添付の特許請求の範囲および本発明の記載によって定義される本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるであろう。
本発明は、本明細書において広く一般的に記載されている。一般的な開示に含まれる狭義の各種および亜属の各群も本発明の一部を構成する。これには、本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から主題を除去するただし書きまたは否定的限定を伴う本発明の一般的記載が含まれる。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、本発明がそれによってマーカッシュ群の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも記載されていることを認識するであろう。

Claims (18)

  1. 少なくとも１種の改変リンパ系細胞、少なくとも１種の改変骨髄系細胞、または改変リンパ系細胞および改変骨髄系細胞の混合物を生成するために、少なくとも１種のリンパ系細胞もしくは骨髄系細胞、またはそれらの組合せ内で、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかをエクスビボで改変することを含む方法。
  2. 前記改変が、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの１つまたは複数の内因性ゲノム部位への１つまたは複数の欠失、置換または挿入である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記改変が、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの発現または翻訳の減少である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記発現または翻訳の減少が阻害性核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）によるものである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記改変が、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの発現の増加である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記発現の増加が、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの１つまたは複数のプロモーターの改変によるものである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記改変が、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかの１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ媒介改変または活性化である、請求項１に記載の方法。
  8. 改変が、表１～７または図１～４に記載された遺伝子のいずれかのコード領域を含む核酸セグメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む１つまたは複数の発現カセットによる、少なくとも１種のリンパ系細胞もしくは骨髄系細胞、またはそれらの組合せの形質転換である、請求項１に記載の方法。
  9. 少なくとも１種の改変リンパ系細胞、少なくとも１種の改変骨髄系細胞、または改変リンパ系細胞および改変骨髄系細胞の混合物を対象に投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記少なくとも１種の改変リンパ系細胞、少なくとも１種の改変骨髄系細胞、または改変リンパ系細胞および改変骨髄系細胞の混合物をインキュベートして、改変細胞の集団を形成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記改変細胞の集団を対象に投与することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記対象が疾患または病態を有する、請求項９または１１に記載の方法。
  13. 前記疾患または病態が免疫状態またはがんである、請求項１２に記載の方法。
  14. 少なくとも１種の試験薬を試験細胞と接触させて試験アッセイ混合物を供給する工程；および
    ａ．該試験細胞の細胞増殖、該試験細胞によるサイトカイン放出、もしくはそれらの組合せ；
    ｂ．該試験細胞の活性化；
    ｃ．該細胞内での、表１～７もしくは図１～４に記載された制御因子のいずれかの発現もしくは活性；または
    ｄ．それらの組合せ
    を測定する工程を含む方法。
  15. 測定結果を対照の結果と比較する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 対照の結果が、前記試験薬をいずれも使用しないで測定した前記試験細胞の結果である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記試験細胞がリンパ系細胞および／または骨髄系細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記試験細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、人工多能性幹細胞由来の免疫（例えば、リンパ系および／または骨髄系）細胞、またはそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の方法。
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