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CN118345080B - 一种抗耗竭t细胞及其制备方法、应用 - Google Patents

一种抗耗竭t细胞及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗耗竭T细胞及其制备方法、应用，属于细胞技术领域。本发明提供的抗耗竭T细胞，是通过CRISPR/Cas9系统将FERMT3基因或TLN1基因进行敲除的T细胞，使其相比未敲除FERMT3基因或TLN1基因的T细胞，具有耗竭拮抗能力。本发明提供的抗耗竭T细胞，在耗竭诱导实验中存活率更高，表现出了显著的耗竭拮抗特征；进一步利用PMA对其进行刺激的实验表明，抗耗竭T细胞在细胞因子分泌能力和细胞杀伤能力相比野生型T细胞显著增强。本发明提供的技术方案可用于制备T细胞治疗产品，增强其活性和持久性，能够达到更优的治疗效果，在肿瘤治疗和抗感染治疗中具有广阔应用前景。

Description

一种抗耗竭T细胞及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种抗耗竭T细胞及其制备方法、应用。
背景技术
T细胞耗竭（T Cell Exhaustion）是指慢性感染和癌症患者体内T细胞功能丧失。由于长期暴露于持续性抗原或慢性炎症，疲惫的T细胞逐渐失去效应功能，记忆T细胞特征也开始缺失。通过阻止PD-1、TIM-3之类的免疫检查点抑制性通路，可以扭转这种T细胞功能丧失。在制备T细胞用于科研和治疗用途时，如何获得有耗竭拮抗功能的，有大量增殖能力的T细胞是现有CAR-T、TCR-T、TIL等T细胞药物的研发热点。
Fermitin 家族同源物 3 (FERMT3)也称为kindlin-3 (KIND3)，是人类中由FERMT3基因编码的蛋白质。FERMT3蛋白在止血和血栓形成的调节中具有关键作用。这种蛋白质还可能有助于维持细胞的膜骨架，可与Talin 蛋白（由TLN1基因编码）一起，发挥稳定细胞骨架的作用，并调节其在细胞和细胞器运动中的动力学。
FERMT3基因功能在免疫中的作用尚不明确，一些实验证据互相矛盾。有动物实验表明FERMT3基因缺失和肿瘤进展相关，在2种肿瘤细胞模型（乳腺癌和黑色素瘤）中，敲除Kindlin-3显著增加转移形成，符合肿瘤细胞恶性特性的体外增加（Kindlin-3敲低促进SKMEL28黑色素瘤模型中肺病灶的转移形成、Kindlin-3敲低促进MDA-MB-231乳腺癌模型中肝病灶的转移形成）。有报道称FERMT3的天然突变可能和白血病相关（Djaafri I, KhayatiF, Menashi S, et al. A novel tumor suppressor function of Kindlin-3 in solidcancer[J]. Oncotarget, 2014, 5(19): 8970.）。也有动物实验利用siRNA去除慢性髓细胞性白血病-白血病干细胞上的Kindlin-3蛋白，以延长慢性粒细胞白血病小鼠的生存期，诱导疾病缓解（Krenn P W, Koschmieder S, Fässler R. Kindlin-3 loss curbschronic myeloid leukemia in mice by mobilizing leukemic stem cells fromprotective bone marrow niches[J]. Proceedings of the National Academy ofSciences, 2020, 117(39): 24326-24335.）。
目前，尚未有靶向编辑FERMT3和TLN1以增强T细胞耗竭拮抗功能的报道。
发明内容
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供了一种抗耗竭T细胞，具有增强的耗竭拮抗功能，在持续接触抗原情形下（感染或肿瘤）仍具备持续扩增、维持活率，并大量分泌细胞因子的耗竭拮抗能力。本发明还提供了前述抗耗竭T细胞的制备方法，是通过对细胞内FERMT3或TLN1编辑达到的。最后本发明还提供了抗耗竭T细胞的具体应用。
为了解决现有技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种抗耗竭T细胞的制备方法：以CRISPR/Cas9 系统对T细胞的FERMT3基因或TLN1基因进行敲除，所述CRISPR/Cas9 系统包括sgRNA，所述sgRNA为靶向FERMT3或靶向TLN1的sgRNA，所述靶向FERMT3的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示；所述靶向TLN1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步地，所述的制备抗耗竭T细胞的方法中，所述CRISPR/Cas9系统具体为Cas9蛋白和sgRNA组成的RNP复合物。
进一步地，所述的T细胞是CAR-T、TCR-T、TIL中的一种或几种。
任一所述的抗耗竭T细胞的制备方法制备得到的T细胞。一种sgRNA，具体地，为靶向FERMT3或靶向TLN1的sgRNA，所述靶向FERMT3的sgRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示序列中的一种；所述靶向TLN1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
一种试剂盒，包括所述的sgRNA和Cas9蛋白。
所述的sgRNA或所述的试剂盒在制备抗耗竭T细胞中的应用。
所述的抗耗竭T细胞在制备细胞治疗药物中的应用。
所述的应用中，所述的药物是用于肿瘤治疗的药物或用于抗感染治疗的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过基因编辑技术，制备得到一种抗耗竭T细胞，具体是通过将T细胞中的FERMT3基因或TLN1基因的表达和/或功能被降低或清除，使其相比未敲除FERMT3基因或TLN1基因的T细胞（野生型T细胞），具有持续接触抗原情形下（感染或肿瘤）仍可持续扩增、维持活率，并大量分泌细胞因子的耗竭拮抗能力。并且，本发明设计了多种靶向FERMT3基因或TLN1基因的sgRNA，与Cas9蛋白构建得到RNP复合物，用于制备得到敲除FERMT3基因或TLN1基因的T细胞。诱导耗竭实验表明，利用本发明设计的sgRNA制备得到的抗耗竭T细胞，活性和稳定性相比野生型更强，具有显著地耗竭拮抗特征；进一步利用PMA进行刺激的实验表明，其细胞因子分泌能力和细胞杀伤能力相比野生型T细胞显著增强。本发明的技术方案可用于制备T细胞治疗产品，增强其活性和持久性，能够达到更优的治疗效果，在肿瘤治疗和抗感染治疗中具有广阔应用前景。
附图说明
图1为TIM-3基因靶向gRNA测试结果图；
图2为FERMT3基因靶向gRNA测试结果图；
图3为TLN1基因靶向gRNA测试结果图；
图4为耗竭诱导试验流程图；
图5为sg012介导的FERMT3基因编辑T细胞群在耗竭诱导前后野生型T细胞比例变化图；
图6为sg014介导的FERMT3基因编辑T细胞群在耗竭诱导前后野生型T细胞比例变化图；
图7为Sg020介导的TLN1基因编辑T细胞群在耗竭诱导前后野生型T细胞比例变化图；
图8为T细胞经过sg012、sg014介导的FERMT3编辑，或者sg020介导的TLN1基因编辑后持续培养过程中增值倍数和活率比较图；
图9为T细胞经过sg012、sg014介导的FERMT3编辑，或者sg020介导的TLN1基因编辑后耗竭诱导的拮抗效果对比图；
图10为经过FERMT3编辑或者TLN1编辑的T细胞其细胞因子分泌能力和细胞杀伤能力测试结果图；
图11为经过FERMT3编辑或者TLN1编辑的T细胞其细胞因子分泌能力和细胞杀伤能力测试结果的柱状统计图。
具体实施方式
为使本发明解决的技术问题、采用的技术方案和达到的技术效果更加清楚，下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。实施例中使用到的试剂和仪器设备，如无详细说明，均可从市场上购买得到。以下表1和2中是以下实施例中使用的部分仪器设备和试剂说明：
表1 仪器设备
表2 试剂
sgRNA设计
FERMT3和TLN1的基因序列获取自NCBI数据库，在外显子区域上设计sgRNA序列。在众多的设计序列中，选择靶向位点较靠近翻译起始位点、且GC含量较为均衡的各5条靶向序列（以下表3）进行合成。带有sgRNA靶向序列的sgRNA由南京金斯瑞生物合成。
表3 靶基因sgRNA序列
细胞基因编辑流程
冻存的CD3+T细胞在含有300IU/mL人白介素-2的无血清培养基中复苏，当天用30ng/mL的OKT3进行激活，4天后采集5E6的CD3+T细胞重悬于100uL的PBS中，加入100pmol的gRNA和10ug的Cas9，转移到电转杯中，以1700us（微秒）的持续电脉冲进行电转染。转染后的细胞重悬在5mL含有300IU/mL人白介素-2的T细胞无血清培养基中持续培养。电转至少4天后可进行基因编辑效果的检测。
基因编辑效果检测
采集1E6的细胞提取DNA，在gRNA编辑位点上下游各~150bp处设计PCR引物（见表4）。PCR扩增子进行Sanger测序，获得测序结果（.ab1文件），通过比对测序结果在gRNA编辑位点附近是否有重叠信号峰以及信号峰高低判断是否基因编辑成功。利用在线工具“TIDE”（shinyapps.datacurators.nl/tide），上传Sanger测序的.ab1文件，可基于Sanger测序峰值水平，定量分析得到不同编辑类型在总扩增子中的占比，并模拟得到定量敲除效率（插入和删除类型在总扩增子中的占比）。
表4 引物序列表
实施例1：靶向FERMT3和TLN1的gRNA序列筛选
冻存的CD3+T细胞复苏4天后，利用电转染将靶向gRNA和Cas9蛋白复合物（RNP）转入T细胞内，在电转后第3天和结束耗竭诱导后采样检测T细胞各测试各gRNA的编辑效率。TIM-3是有较多报道的有耗竭拮抗功能的免疫检查点编码基因，靶向TIM-3的gRNA（sg010）和Cas9蛋白复合物（RNP）电转入T细胞内用做基因编辑对照。不靶向人基因任何区域的gRNA（sg001）和Cas9蛋白复合物（RNP）电转入T细胞内用于制备未编辑的T细胞电转后对照。
TIM-3基因靶向gRNA测试。结果显示在敲除位点附近有多峰信号，显示样本中发生了基因成功敲除（图1）。
FERMT3基因靶向gRNA测试。结果显示sg-12、sg-14在敲除位点附近有多峰信号，显示样本中发生了基因成功敲除（图2）。
TLN1基因靶向gRNA测试。结果显示sg-20在敲除位点附近有多峰信号，显示样本中发生了基因成功敲除（图3）。
实施例2：经过FERMT3或TLN1编辑后的T细胞，在耗竭诱导的体系下，编辑过的T细胞在细胞群体中的比例持续增加。
耗竭诱导试验流程（图4）：冻存的CD3+T细胞复苏4天后，利用电转染将靶向gRNA和Cas9蛋白复合物RNP转入T细胞内，电转之后第5天（Day9）开始利用CD3抗体（OKT3）对T细胞进行持续刺激，每2天添加一次OKT3，模拟T细胞接触抗原的过程，诱发T细胞进入耗竭状态。在电转后第3天和结束耗竭诱导后采样检测T细胞各测试靶点的编辑效率。
未经FERMT3编辑的野生型T细胞比例在耗竭诱导中大量减少。如图5所示，sg012介导的FERMT3基因编辑，在电转后3天（Day7）的T细胞池中检测发现野生型有45.9%（细胞池总体编辑效率Indel%=51.4%），而在持续用OKT3诱导耗竭6天(Day15)后，野生型比例已经降到5%以下（细胞池总体编辑效率Indel%=87.5%）。
未经FERMT3编辑的野生型T细胞比例在耗竭诱导中大量减少。如图6所示，sg014介导的FERMT3基因编辑，在电转后3天（Day7）的T细胞池中检测发现野生型有45.5%（细胞池总体编辑效率Indel%=42%），而在持续用OKT3诱导耗竭6天(Day15)后，野生型比例已经降到11.3%（细胞池总体编辑效率Indel%=59.2%）。
未经TLN1编辑的野生型T细胞比例在耗竭诱导中大量减少。如图7所示，Sg020介导的TLN1基因编辑，在电转后3天（Day7）的T细胞池中检测发现野生型有72.1%（细胞池总体编辑效率Indel%=26.8%），而在持续用OKT3诱导耗竭6天(Day15)后，野生型比例已经降到29.7%（细胞池总体编辑效率Indel%=60.4%）。
实施例3: FERMT3或TLN1编辑不影响细胞增殖，在耗竭诱导刺激条件下呈现增殖优势
耗竭诱导试验流程（图4）：冻存的CD3+T细胞复苏4天后，利用电转染将靶向gRNA和Cas9蛋白复合物RNP转入T细胞内，电转之后第5天（Day9）开始利用CD3抗体（OKT3）对T细胞进行持续刺激，每2天添加一次OKT3，模拟T细胞接触抗原的过程，诱发T细胞进入耗竭状态。在此过程中在不同时间点取样以AO/PI染色法检测细胞增殖和活率。 AO/PI试剂由可以发出绿色荧光的DNA结合染料吖啶橙（AcridineOrange，简称AO）和可以发出红色荧光的DNA结合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，简称PI）组成。其中AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光；PI只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。通过统计AO和PI阳性的数目，得到监测点的总细胞数和总活细胞数。
T细胞经过sg012、sg014介导的FERMT3编辑，或者sg020介导的TLN1基因编辑后，在电转后十天（Day5-Day15）的持续培养过程中未发现增值倍数和活率与未编辑组（sg001）有明显差异（图8）。
T细胞经过sg012、sg014介导的FERMT3编辑，或者sg020介导的TLN1基因编辑后，电转后4天（Day9）开始用OKT3进行持续刺激6天至Day15，在此耗竭诱导的过程中，未编辑组（sg001）的呈现凋亡，活率大量下降，而靶向FERMT3与TLN1编辑的T细胞组（sg012、sg014、sg020）呈现出了更强的耗竭拮抗（图9）。
实施例4: FERMT3或TLN1编辑后可增加T细胞的因子分泌能力
T细胞经过sg012、sg014介导的FERMT3编辑，或者sg020介导的TLN1基因编辑后，利用T细胞刺激剂，佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯 （phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA，100nM)对T细胞进行刺激以检测T细胞的细胞因子分泌能力（CD107a）和杀伤型细胞因子分泌能力(IFN-g)。具体方法为接受PMA刺激后，利用带BV421荧光标记的CD107a抗体和带APC荧光标记的IFN-g抗体进行胞内染色标记，检测细胞群内两种细胞因子的分泌能力（图10），结果显示经过FERMT3编辑或者TLN1编辑的T细胞CD107a和IFN-g都不分泌的细胞群体（Q3圈门）减少。进一步统计各细胞群CD107a和IFN-g这两种细胞因子表达量的平均值（图11），结果显示经过FERMT3编辑或者TLN1编辑的T细胞其细胞因子分泌能力相对于对照组（sg001）以及TIM-3编辑组（sg010）都要显著升高。

Claims (9)

1. 一种抗耗竭T细胞的制备方法，其特征在于，包括：以CRISPR/Cas9 系统对T细胞的FERMT3基因或TLN1基因进行敲除，所述CRISPR/Cas9 系统包括sgRNA，所述sgRNA为靶向FERMT3或靶向TLN1的sgRNA，所述靶向FERMT3的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQID NO.5所示；所述靶向TLN1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的抗耗竭T细胞的制备方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统具体为Cas9蛋白和sgRNA组成的RNP复合物。
3.根据权利要求1所述的抗耗竭T细胞的制备方法，其特征在于，所述的T细胞是CAR-T、TCR-T、TIL中的一种或几种。
4.权利要求1-3任一项所述的抗耗竭T细胞的制备方法制备得到的抗耗竭T细胞。
5. 一种sgRNA，其特征在于，为靶向FERMT3或靶向TLN1的sgRNA，所述靶向FERMT3的sgRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示序列中的一种；所述靶向TLN1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11 所示。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求5所述的sgRNA以及Cas9蛋白。
7.权利要求5所述的sgRNA或权利要求6所述的试剂盒在制备抗耗竭T细胞中的应用。
8.权利要求4所述的抗耗竭T细胞在制备细胞治疗药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的细胞治疗药物是用于肿瘤治疗的药物或用于抗感染治疗的药物。
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