[go: up one dir, main page]

JP2023551874A - 筋強直性ジストロフィー１型を処置するためのｒｎａ標的化組成物および方法 - Google Patents

筋強直性ジストロフィー１型を処置するためのｒｎａ標的化組成物および方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023551874A
JP2023551874A JP2023533279A JP2023533279A JP2023551874A JP 2023551874 A JP2023551874 A JP 2023551874A JP 2023533279 A JP2023533279 A JP 2023533279A JP 2023533279 A JP2023533279 A JP 2023533279A JP 2023551874 A JP2023551874 A JP 2023551874A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
sequence
rna
protein
cug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023533279A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2022119979A5 (ja
Inventor
デイビッド エー． ネルズ，
ランジャン バトラ，
ダニエラ ロス，
ディミトリオス ジソーリス，
アンジェリーン タ，
Original Assignee
ロックアネイビオ， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ロックアネイビオ， インコーポレイテッド filed Critical ロックアネイビオ， インコーポレイテッド
Publication of JP2023551874A publication Critical patent/JP2023551874A/ja
Publication of JPWO2022119979A5 publication Critical patent/JPWO2022119979A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Figure 2023551874000001
毒性標的ＣＵＧリピートＲＮＡを破壊または遮断するための、ならびにＤＭ１を処置するための、ＲＮＡ標的化遺伝子治療用組成物およびＲＮＡ標的化遺伝子治療方法が、開示される。本開示は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を処置するための組成物および方法を提供する。本明細書に開示される組成物および方法は、分解または遮断のどちらかによるＣＵＧｅｘｐ（ＣＵＧリピート伸長）ＲＮＡの用量依存的低減、ＤＭＰＫの低減、ならびに選択的スプライシングおよび筋強直のその後の修正をもたらす。

Description

開示の分野
本開示は、分子生物学、遺伝子治療、ならびにＲＮＡ分子の発現および活性を改変するための組成物および方法を対象とする。
関連出願
本出願は、２０２０年１２月１日に出願した米国特許出願第６３／１１９，９７７号、２０２０年１２月２３日に出願した米国特許出願第６３／１３０，０９２号および２０２１年１１月１２日に出願した米国特許出願第６３／２７８，７４６号に基づく利益および優先権を主張するものである。各々の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組込み
２０２１年１２月１日に作成された１．８１ＭＢサイズの「ＬＯＣＮ＿００７＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルの内容は、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
背景
有効な遺伝子治療を提供する有効なＲＮＡ標的化系を提供することについて長年にわたるが満たされていない必要性が当技術分野において存在する。特に、本開示は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）として公知のマイクロサテライトリピート伸長（ＭＲＥ）病の際に反復トラクトから発現される毒性ＲＮＡを特異的に標的とし、分解するための、組成物および方法を提供する。ＤＭ１は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧ ＭＲＥによって引き起こされる多臓器型の常染色体優性遺伝性障害である。全てのＭＲＥ病について言えば、利用可能な処置は、ＤＭ１の症状に対処するが、その基礎にある病因を標的としない。ゲノム編集でＤＮＡにおけるＭＲＥを消失させることにより、ＤＭ１を引き起こす病原性ＭＲＥを消失させることができるだろうが、リピート付近でのＤＮＡの破壊（ｂｒｅａｋ）の発生は、その活性が伸長部の成長に関連している修復機構を活性化し、リピートのさらなる変異を引き起こすことがあり、および／または病原性のリピートを、転写を調節する役割を有する正常なリピートと区別することができないことがある。他の可能性のあるＤＭ１治療、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡおよび小分子が、評価されているが、これらは、頻繁な再投与、罹患組織の浸透不良、リピートとの直接エンゲージメントの欠如、毒性およびオフターゲット効果に関する問題に悩まされる。これらの問題を克服しようとする努力の中で、Ｃａｓ９に基づくＲＮＡ標的化系（ＲＣａｓ９）は、マウスにおいて毒性ＣＵＧリピートＲＮＡを特異的に標的とすることができ、成人発症性筋強直性ジストロフィーのＤＭ１に関連する疾患表現型の長期修復をもたらすことができることが示された。しかし、他の非Ｃａｓ９ ＲＮＡ結合性の系の詳細を明らかにする必要があり、これらの系を、ＤＭ１の処置のための有効な、持続的な、かつスケーラブルな遺伝子治療を提供するために開発する必要がある。ＣＵＧ ＭＲＥを標的とするそのような非Ｃａｓ９ ＲＮＡ結合性の系は、系の成分がユニタリーベクターに頼れるほど小さいサイズであることから製造規模にとって重要である。これらの非ＲＣａｓ９系は、免疫原性Ｃａｓ９成分によって誘発される一切の有害な免疫応答を回避するためにも重要である。したがって、毒性ＣＵＧリピートを消失させることができる、新たな、改善された、ＲＮＡ標的化非ＲＣａｓ９遺伝子治療用組成物および系、ならびにＤＭ１を処置するためにそれを使用する方法が、本明細書において提供される。
要旨
本開示は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を処置するための組成物および方法を提供する。本明細書に開示される組成物および方法は、分解または遮断のどちらかによるＣＵＧｅｘｐ（ＣＵＧリピート伸長）ＲＮＡの用量依存的低減、ＤＭＰＫの低減、ならびに選択的スプライシングおよび筋強直のその後の修正をもたらす。
毒性標的ＣＵＧリピートＲＮＡ配列に結合することができるＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質を含むガイドされないＲＮＡ結合性タンパク質をコードする核酸を含む組成物であって、ＲＮＡ結合性タンパク質が、毒性標的ＣＵＧリピートＲＮＡ配列を切断することができない、組成物が、本明細書に開示される。
ガイドされないＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物であって、前記融合タンパク質が、ａ）毒性標的ＣＵＧリピートＲＮＡ配列に結合することができるＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質、およびｂ）毒性標的ＲＮＡ配列を切断することができるエンドヌクレアーゼを含み、エンドヌクレアーゼが、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである、組成物が、本明細書に開示される。
本開示は、毒性標的ＣＵＧリピートＲＮＡ配列に結合することができるガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはガイドされるＲＮＡ結合性ポリペプチドを含むＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物を提供する。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性ポリペプチドは、融合タンパク質である。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、毒性ＣＵＧリピートＲＮＡ配列を切断することができるエンドヌクレアーゼと融合したＲＮＡ結合性ポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、ガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質である。
一部の実施形態では、ガイドされるＲＮＡ結合性ポリペプチドは。一部の実施形態では、ｃａｓ１３ｄタンパク質は、触媒的に失活している。一部の実施形態では、ｃａｓ１３ｄタンパク質は、配列番号５８３または５８６～５８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである。
一部の実施形態では、ＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号４４４～４５１、４６１、５７０、または６３８～６４９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号４４４で示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列は、配列番号４５３～４５６で示される核酸配列のいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列は、配列番号４５４で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質は、配列番号４５２で示される核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質は、ヒトＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質である。
一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質は、リンカー配列によってＺＣ３Ｈ１２Ａエンドヌクレアーゼに連結されている。
一部の実施形態では、リンカーは、配列番号４１１で示されるアミノ酸配列を含む。
融合タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）、および核外輸送配列（ＮＥＳ）からなる群から選択される１つまたは複数のシグナル配列を含む。
一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号３５８または配列番号３５９で示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５５９～５６７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４６０、配列番号５１６または配列番号５１７を含む核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ｔＣＡＧプロモーター、ＥＦＳ／ＵＢＢプロモーター、デスミンプロモーター、ＣＫ８ｅプロモーター、またはＥＦＳプロモーターである。
本開示は、本開示のいずれかの実施形態の組成物を含むベクターを提供する。
一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される。本開示は、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列と、第１のプロモーター配列と、少なくとも１つのＣＵＧリピートＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列とを含む本開示のいずれかの実施形態のＡＡＶベクターを提供する。
一部の実施形態では、ＣＵＧリピートＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ配列をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号４５２で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＵＧリピートＲＮＡ結合性ポリペプチドは、Ｃａｓ１３ｄタンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄ配列をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号６０１、６１２または６１５～６１８で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、第１のプロモーター配列は、配列番号５６８、５６９、６０８、６０９、６３４～６３７で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号５９９または６００で示される核酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号５９９または６００で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、第２のプロモーター配列をさらに含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現を制御し、ｇＲＮＡは、（ｉ）ＤＲ配列および（ｉｉ）スペーサー配列を含む。一部の実施形態では、第２のプロモーターは、配列番号５１９で示される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ポリＡ配列をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのリンカー配列を含む。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの核局在化配列を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、配列番号５７４～５８２、５８４～５８５、５９０～５９７のいずれかで示される核酸でコードされる。
本開示は、ａ）本開示のいずれかの実施形態のＡＡＶウイルスベクターと、ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加剤とを含む、医薬組成物を提供する。
本開示は、ａ）本開示のいずれかの実施形態のＡＡＶベクターと、ｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質とを含む、ＡＡＶウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である。
本開示の実施形態のいずれか１つのベクターを含む、細胞。
本開示は、哺乳動物における筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を処置する方法であって、本開示のいずれかの実施形態の組成物またはＡＡＶベクターを、哺乳動物の組織における毒性標的ＣＵＧマイクロサテライトリピート伸長（ＭＲＥ）ＲＮＡ配列に投与するステップを含み、それによって毒性標的ＲＮＡの発現レベルが低下される、方法を提供する。
一部の実施形態では、組成物またはＡＡＶベクターは、対象に、静脈内、くも膜下腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは目周囲、経口、直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、大槽内、神経内、胸膜内、局部、リンパ内、大槽内投与されるか、または神経内にある。
一部の実施形態では、組成物またはＡＡＶベクターは、対象に静脈内投与される。
一部の実施形態では、毒性標的ＲＮＡの発現レベルの低下によって、哺乳動物におけるＤＭ１の症状が好転する。一部の実施形態では、毒性標的ＲＮＡの発現レベルは、未処置毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡの発現レベルの低下と比較して低下される。一部の実施形態では、低下のレベルは、１倍～２０倍の間である。
一部の実施形態では、ＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号４４４～４５１、４６１、５７０、または６３８～６４９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号４４４に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列は、配列番号４５３～４５６のいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列は、配列番号４５４を含む。
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質は、配列番号４５２に示される核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質は、ヒトＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質である。
一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質は、リンカー配列によってＺＣ３Ｈ１２Ａに連結されている。
一部の実施形態では、リンカーは、配列番号４１１で示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）および核外輸送配列（ＮＥＳ）からなる群から選択される１つまたは複数のシグナル配列を含む。
一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号３５８または配列番号３５９で示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５５９～５６７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４６０、配列番号５１６、または配列番号５１７を含む核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸分子は、プロモーターを含む。
一部の実施形態では、プロモーターは、ｔＣＡＧプロモーターである。
本開示は、前述の組成物のいずれかを含むベクターを提供する。
一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４である。
本開示は、本開示のベクターを含む細胞を提供する。
哺乳動物における筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を処置する方法であって、哺乳動物の組織における毒性標的ＣＵＧマイクロサテライトリピート伸長（ＭＲＥ）ＲＮＡ配列に組成物を投与するステップを含み、組成物が、ａ）毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列に結合することができるＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質と、ｂ）毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列を切断することができるエンドヌクレアーゼとを含むガイドされないＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、それによって毒性標的ＲＮＡの発現レベルが低下される方法が、本明細書に開示される。
一部の実施形態では、ＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号４４４～４５１、４６１、５７０、または６３８～６４９のいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、ＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号４４４を含む。
一部の実施形態では、毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列は、配列番号４５３～４５６のいずれか１つを含む。
一部の実施形態では、毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列は、配列番号４５３を含む。
一部の実施形態では、組成物は、静脈内投与によって哺乳動物の組織に投与される。
一部の実施形態では、毒性標的ＲＮＡの発現レベルの低下によって、哺乳動物におけるＤＭ１の症状が好転する。
一部の実施形態では、毒性標的ＲＮＡの発現レベルは、未処置毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡの発現レベルの低下と比較して低下される。
一部の実施形態では、低下のレベルは、１倍～２０倍の間である。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのドメインである。
一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーヌクレアーゼは、配列番号３５８または配列番号３５９で示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列は、プロモーターを含む。
一部の実施形態では、プロモーターは、ｔＣＡＧプロモーターである。
一部の実施形態では、プロモーターは、筋肉特異的プロモーターである。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、デスミンプロモーター（全長または短縮型された）である。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５５９～５６７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４６０、配列番号５１６または配列番号５１７を含む核酸配列によってコードされる。
天然に存在しないまたは操作された、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）系をコードする核酸配列を含む組成物であって、前記核酸配列が、（ａ）少なくとも１つの、ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質と、ｂ）少なくとも１つのＣａｓタンパク質の１つと複合体を形成することができる少なくとも１つの同族ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含み、ｇＲＮＡが、（ｉ）ＤＲ配列および（ｉｉ）スペーサー配列を含み、スペーサー配列が、標的ＣＵＧ ＭＲＥ分子とハイブリダイズし、スペーサー配列が、ａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇ（配列番号４５７）、ｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃ（配列番号４５８）、およびｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａ（配列番号４５９）からなる群から選択されるスペーサー配列またはその一部を含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が、触媒として不活性である、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓが、標的ＣＵＧ ＭＲＥに結合し、それを切断することができる、組成物。
天然に存在しないまたは操作された、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）系をコードする核酸配列を含む組成物であって、前記核酸配列が、（ａ）少なくとも１つの、ＲＮＡによりガイドされるＲＮｓｅ Ｃａｓタンパク質と、ｂ）少なくとも１つのＣａｓタンパク質の１つと複合体を形成することができる少なくとも１つの同族ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含み、ｇＲＮＡが、（ｉ）ＤＲ配列および（ｉｉ）スペーサー配列を含み、スペーサー配列が、標的ＣＵＧ ＭＲＥ分子とハイブリダイズし、スペーサー配列が、ａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇ（配列番号４５７）、ｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃ（配列番号４５８）、およびｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａ（配列番号４５９）からなる群から選択されるスペーサー配列またはその一部を含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が、標的ＣＵＧ ＭＲＥに結合することおよびそれを切断することができ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が、触媒として不活性である、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓが、標的ＣＵＧ ＭＲＥに結合することができるがそれを切断することができない、組成物。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、またはＣａｓ１３ｄである。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ｄである。
一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質またはガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドは、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドと融合している第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドである。一実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＲＮＡと会合する様式でＲＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＲＮＡを切断する様式でＲＮＡと会合することができる。一実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである。
一部の実施形態では、ＣａｓまたはｄＣａｓ系をコードする核酸は、プロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ＥＦＳプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、筋肉特異的プロモーターである。一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、デスミンプロモーター（全長または短縮型された）である。
前述の組成物のいずれかを含むベクターが、本明細書に開示される。
別の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される。
別の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。
別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ７４である。
ベクターを含む細胞が、本明細書に開示される。
本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供される。
図１は、本明細書に開示されるＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物およびＰＵＦ組成物の例示的な実施形態がＤＭ１毒性ＣＵＧリピートを破壊することを実証する、ＣＵＧ９６０ｑＰＣＲアッセイの結果を示す。Ｃａｓ１３ｄに基づく系（Ｃａｓ１３ｄ－Ｌ１と表示されているもの）における毒性リピートの低減が、３つの異なるガイドＣＵＧ－ｇ１、ＣＵＧ－ｇ２、およびＣＵＧ－ｇ３を使用して示されている。ＰＵＦに基づく系における毒性リピートの低減が、ＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７融合タンパク質（ＣＵＧ－ｆ１と表示されている）およびＥ１７－ＰＵＦ（ＣＵＧ）融合タンパク質（ＣＵＧ－ｆ２と表示されている）をコードする例示的な核酸分子を使用して示されている。Ｅ１７は、ＺＣ３Ｈ１２Ａエンドヌクレアーゼのドメインである。結果は、非標的化対照に対して正規化され、生物学的反復実験（ｎ＝２）の平均＋／－ｓ．ｄ．として示されている。
図２は、非標的化対照と比較して本明細書に開示される例示的なＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄおよびＰＵＦ組成物でのＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイの結果を示す。
図３は、ＲＣａｓ９系と比較して、本明細書に開示されるＣａｓ１３ｄ組成物およびＰＵＦ組成物を使用するＤＭ１毒性ＣＵＧリピートＲＮＡの分解を実証する、ＣＵＧ９６０ｑＰＣＲアッセイの結果を示す。結果は、非標的化対照に対して正規化されたものであり、生物学的反復実験（ｎ＝２）の平均＋／－ｓ．ｄ．として示されている。
図４Ａ～Ｃは、本明細書に開示されるＤＭ１遺伝子治療用組成物の例示的なベクター構成を示す。図４Ａは、短縮型ＣＡＧプロモーター（ｔＣＡＧ）に作動可能に連結されているＣＵＧ標的化ＰＵＦ－Ｅ１７を含む、ＤＭ１遺伝子治療用構築物の構成を例示する。図４Ｂは、Ｅ１７と融合している、ＣＵＧを標的とする触媒的に不活なＣａｓ１３ｄと、ＥＦＳプロモーターに作動可能に連結されている対応するガイドとを含む、ＤＭ１遺伝子治療用構築物の構成を例示する。図４Ｃは、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄと、ＥＦＳプロモーターに作動可能に連結されている対応するガイドとを含む、ＤＭ１遺伝子治療用構築物の構成を例示する。
図５は、ＣＵＧ標的化ＰＵＦとヒトＰＵＭ１のアラインメントを、ミスマッチを強調して描示する。
図６Ａ～Ｂは、ＣＵＧ９６０アッセイの結果を示す。図６Ａは、ＤＭＰＫ－ＣＵＧ９６０レポーターｍＲＮＡのノックダウンを示す。具体的には、Ｃａｓ１３ｄ－ＣＵＧ（Ａ０１２１５）は、ＣｏｓＭ６細胞におけるＣＵＧ９６０リピートｍＲＮＡ発現を減少させる。ＣＵＧ９６０リピートｍＲＮＡのレベル（ヒトＤＭＰＫエクソン１１～１５との関連で）は、参照遺伝子ＧＡＰＤＨおよびトランスフェクション対照ＧＦＰ（ＣＵＧ９６０と同じプラスミドから発現された）に対して正規化されている。データは、Ｃａｓ１３ｄ非標的化（ＮＴ）陰性対照（異なる実験ｎ＝３）でトランスフェクトされた細胞と比べての、Ｃａｓ１３ｄ－ＣＵＧでトランスフェクトされた細胞の変化倍率として表されている。図６Ｂは、内因性ＤＭＰＫ ｍＲＮＡが保存されることを示す。具体的には、Ｃａｓ１３ｄ－ＣＵＧは、ＨＥＫ２９３細胞において正常ＤＭＰＫ ｍＲＮＡレベルを低下させなかったが、リピートフランキング領域を標的とするＣａｓ１３ｄ－ＤＭＰＫ陽性対照は、全ＤＭＰＫ ｍＲＮＡを５８％ノックダウンした。
図７は、ＤＭ１遺伝子治療の２つの作用機序：１）リピート分解、および２）リピート遮断を描示する。
図８は、ＡＡＶ９ベクターにパッケージングされた本明細書に開示されるＤＭ１ ＡＡＶに基づく遺伝子治療用組成物の３つの異なる実施形態を示す。具体的には、図８は、１）同族ＣＵＧ標的化ｇＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄ系に基づく反復ＣＵＧの分解のための治療用構築物Ａ０１２１５、２）反復ＣＵＧ ＲＮＡを標的とするようにおよび切断するように操作されたヒトエンドヌクレアーゼドメイン（Ｅ１７）と融合したＰＵＦ（ヒトＰＵＭ１由来）タンパク質に基づく反復ＣＵＧの分解のための治療用構築物Ａ０１３４４、および３）反復ＣＵＧ ＲＮＡを標的とするようにおよび結合する（しかし切断しない）ように操作されたＰＵＦ（ヒトＰＵＭ１由来）タンパク質に基づく治療用構築物Ａ０１６８６を描示する。
図９Ａ～Ｂは、患者筋肉細胞における核内ＣＵＧｅｘｐ凝集体（ｆｏｃｉ）の低減を示す。図９Ａは、ＧＦＰ（Ａ０１４７５－対照）、Ｃａｓ１３ｄ－ＣＵＧ（Ａ０１２１５）、またはＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７（Ａ０１３４４）をコードする改変されたＡＡＶｒｈ７４（ｅＡＡＶ）で処置されたＤＭ１患者筋細胞（２６００のＣＵＧリピート）における核内ＣＵＧｅｘｐＲＮＡ凝集体を評価するためのＲＮＡ－ＦＩＳＨを示す。図９Ｂは、Ａ０１２１５（Ｃａｓ１３ｄ－ＣＵＧ）およびＡ０１３４４（ＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７）での毒性ＣＵＧ ＲＮＡ凝集体の用量依存的低減を実証する、ｅＡＡＶ－ＧＦＰ（Ａ０１４７５－対照）に対して正規化された核内ＣＵＧｅｘｐＲＮＡ凝集体の数についてのＲＮＡ ＦＩＳＨ定量化を示す。
図１０Ａ～Ｇは、ＨＳＡＬＲ ＤＭ１マウスにおけるＣＵＧｅｘｐＲＮＡの分解ならびにＤＭ１関連ミススプライシングおよび筋強直の修正を示す。図１０Ａは、ＡＡＶに基づくＡ０１２１５（Ｃａｓ１３ｄ－ＣＵＧ）およびＡ０１３４４（ＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７）により媒介されるＣＵＧｅｘｐ分解ならびに選択的スプライシングおよび筋強直のその後の修正についての作用機序を描示する。図１０Ｂは、対側前脛骨筋（ＴＡ）におけるビヒクルおよび処置薬の注射を示す注射スキームを描示する。図１０Ｃは、ＲＮＡ－ＦＩＳＨを使用しＣＡＧ１０プローブを用いて、処置されたＴＡ筋における核内ＣＵＧｅｘｐＲＮＡ凝集体の低減を示す。図１０Ｄは、ＲＴ－ｄｄＰＣＲを使用して、ＡＡＶ９に基づくＡ０１３４４（ＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７）でのＨＳＡ－ＣＵＧｅｘｐＲＮＡの用量依存性減少を示す。図１０Ｅ～Ｆは、半定量的ＲＴ－ＰＣＲ、続いてキャピラリー電気泳動を使用して、ＤＭ１関連Ａｔｐ２ａ１エクソン２２およびＣｌＣｎ１エクソン７ａの選択的スプライシングの修正をそれぞれ示す。図１０Ｇは、針筋電図検査（ＥＭＧ）を使用して筋強直性運動を生じさせる結果となる針挿入の％として表された筋強直の低減を示す。 同上。 同上。
図１１Ａ～Ｇは、ＨＳＡＬＲ ＤＭ１マウスにおけるＣＵＧｅｘｐＲＮＡの遮断ならびにＤＭ１関連ミススプライシングおよび筋強直の修正を示す。図１１Ａは、ＡＡＶに基づくＡ０１６８６（ＰＵＦ（ＣＵＧ））により媒介されるＣＵＧｅｘｐ遮断ならびに選択的スプライシングおよび筋強直のその後の修正についての作用機序を描示する。図１１Ｂは、対側前脛骨筋（ＴＡ）におけるビヒクルおよび処置薬の注射を示す注射スキームを描示する。図１１Ｃは、ＲＮＡ－ＦＩＳＨを使用しＣＡＧ１０プローブを用いて、処置されたＴＡ筋における核内ＣＵＧｅｘｐＲＮＡ凝集体の低減を示す。図１１Ｄは、ＲＴ－ｄｄＰＣＲを使用して、ＡＡＶ９に基づくＡ０１６８６（ＰＵＦ（ＣＵＧ））でのＨＳＡ－ＣＵＧｅｘｐＲＮＡの用量依存性減少を示す。図１１Ｅ～Ｆは、半定量的ＲＴ－ＰＣＲ、続いてキャピラリー電気泳動を使用して、ＤＭ１関連Ａｔｐ２ａ１エクソン２２およびＣｌＣｎ１エクソン７ａの選択的スプライシングの修正をそれぞれ示す。図１１Ｇは、針筋電図検査（ＥＭＧ）を使用して筋強直性運動を生じさせる結果となる針挿入の％として表された筋強直の低減を示す。 同上。 同上。
図１２Ａ～Ｂは、本明細書に開示されるＤＭ１遮断（切断を伴わない）遺伝子治療用組成物の例示的なベクター構成を描示する。図１２Ａは、いくつかのＰＵＦ（ＣＵＧ）実施形態を示し、図１２Ｂは、いくつかのｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）実施形態を示す。
詳細な説明
本開示は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を処置するためのＲＮＡ標的化遺伝子治療用組成物およびＲＮＡ標的化遺伝子治療方法を提供する。
ＤＭ１は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧマイクロサテライトリピート伸長（ＭＲＥ）によって引き起こされる多臓器型の常染色体優性遺伝性障害である。ＣＵＧリピート伸長を含有するＲＮＡ転写物は、胎児から成人アイソフォームへの選択的スプライシングスイッチの調節因子である筋盲様（ＭＢＮＬ）タンパク質を隔離する。成人ＤＭ１患者は、衰弱性筋強直および骨格筋の進行性脱力を経験するが、生まれつきＤＭ１（先天性ＤＭまたはＣＤＭ）の乳児は、低緊張であり、呼吸不全を示す。ＤＭＰＫ遺伝子は、筋肉、心臓および脳細胞に関与すると考えられている、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼと呼ばれるタンパク質をコードする。このタンパク質は、細胞内の通信に関与し得る。このタンパク質はまた、他のタンパク質と相互作用することによって筋肉細胞内の重要な構造の産生および機能を調節するようである。例えば、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼは、ミオシンホスファターゼと呼ばれる筋肉タンパク質の一部を阻害することが示されている。ミオシンホスファターゼは、筋肉の緊張（収縮）および弛緩に関与する酵素である。ＤＭＰＫ遺伝子の１つの領域は、何度も反復される３つのＤＮＡ基本単位（ヌクレオチド）からなるセグメントを含有する。この配列は、ＣＴＧと記載され、トリプレットまたはトリヌクレオチドリピートと呼ばれる。大部分の非罹患者では、この遺伝子におけるＣＴＧリピートの数は、５～３４の範囲である。ＤＭ１患者には、ＤＭＰＫ遺伝子におけるＣＴＧリピートのサイズを増加させるＣＴＧリピート伸長がある。ＤＭ１は、成人発症型または先天型のどちらかとして分類され、これらは、伸長されたＣＴＧトラクトのサイズにより区別される。このようなＣＴＧリピート伸長におけるリピートは、大部分の細胞では約５０～約１，０００ ＣＴＧリピートの範囲であり得、筋肉細胞などのある特定細胞型では、典型的にリピート数が、より多い。実際に、トリヌクレオチドリピート伸長のサイズは、ＤＭ１の徴候および症状の重症度に関連している。筋力低下および筋消耗などの古典的特徴は成人期まり、そして１細胞当たり約１００～約１，０００のＣＴＧリピートと相関する。より重症度の高い先天型のＤＭ１は、１細胞当たり１，０００を超えるＣＴＧリピートと相関する傾向がある。軽症型のＤＭ１は、典型的に、１細胞当たり約５０～約１５０ ＣＴＧリピートの範囲である。ＤＭ１は、成人発症型または先天型のどちらかとして分類され、これらは、伸長されたＣＴＧトラクトのサイズにより区別される。ＤＭＰＫ遺伝子座によって産生される反復ＲＮＡは、核内ＲＮＡ凝集体を形成し、この核内ＲＮＡ凝集体は、ＭＢＮＬ１（筋盲様スプライシング調節因子１）などのＲＮＡ結合性タンパク質を隔離し、それらを、それらの恒常性ＲＮＡプロセシング活性からそらす。ＭＢＮＬ１機能の喪失は、多かれ少なかれ患者死亡率に寄与する、何百もの選択的スプライシング異常および呼吸不全と関連している。ＣＵＧリピートの標的化および消失（または遮断）は、ＤＭ１の治療戦略である。
本明細書に開示される遺伝子治療用組成物は、ＤＭ１を処置する方法において毒性ＣＵＧリピートの効果的な切断または遮断を提供する。ＲＣａｓ９系を使用する過去の研究を基に、ＲＣａｓ９系成分に頼らない複数のＲＮＡ結合性の系が本明細書に開示される。Ｃａｓ９に基づくＲＮＡ標的化系（ＲＣａｓ９）は、マウスにおいて、毒性ＣＵＧリピートＲＮＡを特異的に標的とすることおよび成人発症性筋強直性ジストロフィーのＤＭ１に関連する疾患表現型の長期修復を提供することができるが、本明細書に開示される非Ｃａｓ９ ＲＮＡ結合性の系は、毒性ＣＵＧリピートＲＮＡの効率的切断または遮断を提供する。ＣＵＧ ＭＲＥを標的とするこのような非Ｃａｓ９ ＲＮＡ結合性の系は、治療用の系の製造規模の調整に重要である。特に、非Ｃａｓ９系成分は、ユニタリー（単一）ベクターに頼れるほど小さいサイズである。本明細書に開示される非ＲＣａｓ９系は、ＲＣａｓ９系と比較して毒性ＣＵＧリピートの有効なノックダウンまたは遮断を達成することができ、非ＲＣａｓ９系は、免疫原性の扱いにくいＣａｓ９成分によって誘発される一切の有害な免疫応答を回避するためにも重要である。
ＤＭ１を処置するための、毒性ＣＵＧリピートＲＮＡに結合することができる非Ｃａｓ９ＲＮＡ結合性の系をコードする核酸分子を含む組成物、およびそれを含むベクターが、本明細書に開示される。そのような組成物は、毒性ＣＵＧリピートをノックダウン／分解または遮断のどちらかの標的とすることができ、そのどちらかのために毒性ＣＵＧリピートに結合することができ、両方の機序（分解および遮断）によって、ＭＢＮＬ隔離、選択的スプライシングおよび筋強直の修正が起こる。実際に、一実施形態では、ＰＵＦ（ＣＵＧ）を含む遺伝子治療用遮断性組成物は、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡに直接結合し、ＭＢＮＬ隔離を阻止して、ほぼ正常な遊離ＭＢＮＬレベルおよび機能を保存することになり、これによって、ＤＭ１疾患表現型、例えば、スプライシング機能障害、筋強直などが回復することになる。一部の態様では、ＣＡＧリピートＲＮＡの遮断に好適な組成物は、ＣＵＧリピート含有ＲＮＡに結合し、ＣＵＧリピートＲＮＡの翻訳を防止する。一部の態様では、この翻訳防止は、ＣＵＧリピート含有ＲＮＡ配列からのタンパク質発現の低下を誘導する結果となる。本明細書に開示されるこれらの系は、ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ ＣａｓまたはガイドされないＰＵＦ、ＰＵＭＢＹもしくはＰＰＲタンパク質配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を含む。
一部の実施形態では、ガイドされるまたはガイドされないＣＵＧリピート標的化系は、ＣＵＧリピートがＣＵＧ５０であるかまたはそれより多い、伸長されたＣＵＧリピート（ＣＵＧｅｘｐ）を標的とする。一部の実施形態では、ＣＵＧリピートは、ＣＵＧ１００であるかまたはそれより多い。一部の態様では、ＣＵＧリピートは、ＣＵＧ５００であるかまたはそれより多い。一部の態様では、ＣＵＧリピートは、ＣＵＧ９６０である。一部の態様では、ＣＵＧ１０００リピートは、１０００ ＣＵＧリピートであるかまたはそれより多い。明確にするために、ＣＵＧ５０またはＣＵＧ１００またはＣＵＧ９６０またはＣＵＧ１０００は、ＣＵＧリピート含有遺伝子における５０のＣＵＧリピートまたは１００のＣＵＧリピートまたは９６０のＣＵＧリピートまたは１０００のＣＵＧリピートをそれぞれ指す。５０、５５、６０、６５、７０、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１５０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、９６０、１０００ ＣＵＧリピート、またはその間の任意の他の数のＣＵＧリピートを含む、任意の他の数または範囲のＣＵＧリピートが可能である。
ＤＭ１を処置するための前述のまたは以降のＲＮＡ標的化組成物のいずれにおいても、特定のＲＮＡ標的化組成物の文脈で記載されるいずれかの特定の構築物エレメント（例えば、リンカー、プロモーター、シグナル配列など）を、同じエレメントタイプ（例えば、リンカー、プロモーター、シグナル配列など）の別のものの代わりに用いることができる。一部の実施形態では、いずれかの特定の構築物エレメント（例えば、タグ配列）を、削除または除去することができる。言い換えると、本明細書に記載されるいずれの特定の遺伝子治療用組成物におけるエレメントの例示的な組合せも、限定することを意図したものではない。
ＲＮＡによりガイドされるＣＵＧリピートＲＮＡ結合性の系
一部の実施形態では、非Ｃａｓ９結合性の系は、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性ポリペプチドで構成される。一部の実施形態では、核酸配列は、ＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質（または不活性化ＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質）である、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、核酸配列は、毒性標的ＣＵＧリピートＲＮＡに結合するスペーサー配列と、ＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質に結合するダイレクトリピート（ＤＲ）配列とを含む、ｇＲＮＡ配列をさらに含む。一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）系は、触媒として活性であり、この場合、Ｃａｓ１３ｄ核タンパク質複合体は、毒性ＲＮＡ ＣＵＧリピートを切断し、破壊する。別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）系は、触媒として不活性であり、この場合、Ｃａｓ１３ｄ核タンパク質複合体は、ＲＮＡ ＣＵＧリピートに結合し、それを遮断する（切断しない）。さらに別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）は、毒性ＲＮＡ ＣＵＧリピートを切断することができるエンドヌクレアーゼと融合した、触媒として不活性なＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）を含む。そのような実施形態では、エンドヌクレアーゼは、活性ＲＮａｓｅである。ＲＮａｓｅ活性を有する例示的なエンドヌクレアーゼは、本明細書中で見つけることができ、これらは、例えば、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガー（本明細書ではＥ１７とも呼ばれる）またはＰＩＮエンドヌクレアーゼからのドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＵＧリピート標的化組成物をコードする核酸配列は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質またはＣａｓ１３ｄ融合タンパク質の発現を制御する第１のプロモーター配列、および少なくとも１つのガイドＲＮＡ配列の発現を制御する第２のプロモーター配列を含む。
Figure 2023551874000002
一実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質である。別の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質である。別の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、不活性化ＲＮａｓｅ Ｃａｓ１３ｄタンパク質（ｄＣａｓ１３ｄ）である。別の実施形態では、ｄＣａｓ１３ｄタンパク質は、１）ｄＣａｓ１３ｄと、２）ヌクレアーゼ活性を有するタンパク質またはその断片をコードするポリペプチドとを含む、融合タンパク質である。別の実施形態では、ｄＣａｓ１３ｄタンパク質は、１）ｄＣａｓ１３ｄと、２）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼまたはその短縮型（本明細書ではＥ１７または配列番号３５８とも呼ばれる）とを含む、融合タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓ構成は、シグナル配列、例えば、ＮＬＳおよび／またはＮＥＳを含む。一部の実施形態では、ｄＣａｓ１３ｄは、リンカー配列を介してＥ１７エンドヌクレアーゼに連結されている。一実施形態では、リンカー配列は、ＶＤＴＡＮＧＳ（配列番号４１１）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄ融合タンパク質は、プロモーター配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、プロモーター配列は、エンハンサーおよび／またはイントロンを含む。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ＥＦＳプロモーター配列である（図４Ｂおよび４Ｃ）。
一部の実施形態では、本開示のＣＵＧリピート標的化ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｃａｓ１３ｄ（Ｓｅｑ２１２）、リンカー、およびＳＶ－４０ ＮＬＳを含む。一部の態様では、本開示のＣＵＧリピート標的化ｄＣａｓ１３ｄタンパク質は、ＣＵＧリピートＲＮＡ配列伸長を遮断する方法に使用される。
短縮型デスミンプロモーターを有する活性Ｃａｓ１３ｄ（Ｓｅｑ２１２）（Ａ０２２０７）
Figure 2023551874000003
Figure 2023551874000004
 ガイドされないＣＵＧリピートＲＮＡ結合性の系
一部の実施形態では、非Ｃａｓ９ ＲＮＡ結合性の系は、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性ポリペプチドを含まない。代わりに、非Ｃａｓ９ ＲＮＡ結合性の系は、ＲＮＡによりガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチド、例えばＰＵＦタンパク質もしくはＰＵＭＢＹタンパク質、またはそのＲＮＡ結合性部分で構成されている。一実施形態では、本明細書に開示されるガイドされないＲＮＡ結合性融合タンパク質は、ａ）ＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５３）を含む毒性標的ＣＵＧリピート配列に結合することができるＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合性配列と、ｂ）毒性標的ＣＵＧリピート配列を切断することができるエンドヌクレアーゼとを含む。
一実施形態では、標的ＲＮＡ配列は、ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５４）、ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４５５）、およびＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４５６）からなる群から選択される。
一実施形態では、標的ＲＮＡ配列は、ＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７２）、ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７３）、ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４７４）、およびＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４７５）からなる群から選択される。
一実施形態では、標的ＲＮＡ配列は、ＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４７６）、ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４７７）、ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７８）、およびＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４７９）からなる群から選択される。
一実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、ａ）ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ ＣＵＧ標的化タンパク質と、ｂ）ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼまたはその切断型（本明細書ではＥ１７または配列番号３５８とも呼ばれる）とを含む。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、以下のとおりに構成される：
ＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７
Ｅ１７－ＰＵＦ（ＣＵＧ）
ＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）－Ｅ１７または
Ｅ１７－ＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）。
一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合構成は、ＰＵＦ（ＣＵＧ）またはＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）とＥ１７の間にリンカーを含む。一実施形態では、リンカー配列は、ＶＤＴＡＮＧＳ（配列番号４１１）である。
一部の実施形態では、リンカーを含む、ＣＵＧ標的化ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、以下のとおりに構成される：
ＰＵＦ（ＣＵＧ）－リンカー－Ｅ１７
Ｅ１７－リンカー－ＰＵＦ（ＣＵＧ）
ＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）－リンカー－Ｅ１７または
Ｅ１７－リンカー－ＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）。
ＰＵＦ（ＣＵＧ）－リンカー－Ｅ１７のＮからＣ末端への配向の例示的な実施形態は、ＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７としてＮからＣ末端へ配向されている図１の第１の配向ＣＵＧフレーム（ＣＵＧ－ｆ１）である。Ｅ１７－リンカー－ＰＵＦ（ＣＵＧ）のＮからＣ末端への配向の例示的な実施形態は、Ｅ１７－リンカー－ＰＵＦ（ＣＵＧ）としてＮからＣ末端へ配向されている図１の第２の配向ＣＵＧフレーム（ＣＵＧ－ｆ２）である。
一実施形態では、ＣＵＧ標的化ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質構成は、Ｎ末端からＣ末端へ、ＰＵＦ（ＣＵＧ）－ＶＤＴＡＮＧＳ－Ｅ１７またはＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）－ＶＤＴＡＮＧＳ－Ｅ１７である。別の実施形態では、ＣＵＧ標的化ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質構成は、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｅ１７－ＶＤＴＡＮＧＳ－ＰＵＦ（ＣＵＧ）またはＥ１７－ＶＤＴＡＮＧＳ－ＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）である。
一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ構成は、１つまたは複数のタグまたはシグナル配列および／またはタグ、例えば、ＦＬＡＧ、ＮＬＳ、ＮＥＳまたはこれらの組合せを含む。一実施形態では、ＦＬＡＧタグ配列は、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号４３６）である。一実施形態では、ＮＬＳシグナル配列は、ヒトＮＬＳである。一実施形態では、ＮＥＳは、ヒトＮＥＳである。一実施形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳである。別の実施形態では、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４３７）である。
一実施形態では、構成は、２つの異なるタグおよび／またはシグナル配列を含む。別の実施形態では、構成は、２つまたはそれより多くのシグナル配列を含む。一部の実施形態では、タグおよび／またはシグナルは、Ｎ末端に位置する。一部の実施形態では、タグおよび／またはシグナルは、Ｃ末端に位置する。一部の実施形態では、あるタグおよび／またはシグナルは、Ｎ末端に位置し、あるタグおよび／またはシグナルは、Ｃ末端に位置する。一実施形態では、１つまたは複数のタグおよび／またはシグナルを含む、ＣＵＧ標的化ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、以下のとおりに構成される：
ＦＬＡＧ－ＮＬＳ－ＰＵＦ（ＣＵＧ）－リンカー－Ｅ１７；または
ＦＬＡＧ－ＮＬＳ－ＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）－リンカー－Ｅ１７；
ＮＬＳ－ＰＵＦ（ＣＵＧ）－リンカー－Ｅ１７；または
ＮＬＳ－ＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）－リンカー－Ｅ１７。
一実施形態では、１つまたは複数のタグおよび／またはシグナルを含む、ＣＵＧ標的化ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、以下のとおりに構成される：
ＦＬＡＧ－ＮＬＳ－ＰＵＦ（ＣＵＧ）－ＶＤＴＡＮＧＳ－Ｅ１７；または
ＦＬＡＧ－ＮＬＳ－ＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）－ＶＤＴＡＮＧＳ－Ｅ１７；
ＮＬＳ－ＰＵＦ（ＣＵＧ）－ＶＤＴＡＮＧＳ－Ｅ１７；または
ＮＬＳ－ＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）－ＶＤＴＡＮＧＳ－Ｅ１７。
表２Ａ～２Ｂ：ＣＵＧ ＭＲＥを標的とするための例示的なＰＵＦ構成：
ＣＵＧ（ＤＭ１）を分解の標的とする、エンドヌクレアーゼを伴うＰＵＦ：
Figure 2023551874000005
ＣＵＧ（ＤＭ１）を遮断の標的とする、エンドヌクレアーゼを伴わないＰＵＦ：
Figure 2023551874000006
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質を含む本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ａに示されるように構成されている。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５７３または５７４で示される核酸配列を含む。
表Ａ： デスミン（ＦＬ）プロモーターを有するＰＵＦ－ＣＵＧ－Ｅ１７ （Ａ０２２０５）
Figure 2023551874000007
一実施形態では、ＰＵＦ（ＣＵＧ）またはＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）融合構築物またはエンドヌクレアーゼなしのＰＵＦ（ＣＵＧ）またはＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）をコードする核酸は、細胞における発現のためにプロモーター配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、プロモーター配列は、短縮型ＣＡＧ（ｔＣＡＧ）プロモーターである（図４Ａ）。一部の実施形態では、プロモーター配列は、エンハンサー配列および／またはイントロン配列を含む。一実施形態では、プロモーターは、ＥＦＳ／ＵＢＢプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列は、筋肉特異的プロモーターである。
一実施形態では、ＰＵＦ（ＣＵＧ）（エンドヌクレアーゼありまたはなし）、Ｃａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）またはｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）（エンドヌクレアーゼを有するまたは有さないｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ））をコードする核酸は、細胞における発現のためにプロモーター配列に作動可能に連結されている（図４Ｂ～４Ｃおよび図１２Ｂ）。一実施形態では、プロモーター配列は、ＥＦＳプロモーターである（図４Ｂ～４Ｃ）。一実施形態では、プロモーターは、ＥＦＳ／ＵＢＢプロモーターである（図１２Ｂ）。一部の実施形態では、プロモーター配列は、エンハンサー配列および／またはイントロン配列を含む。一部の実施形態では、プロモーター配列は、筋肉特異的プロモーターである（図１２Ｂ）。
一部の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、以下のようなデスミンプロモーターである：
筋肉特異的デスミンプロモーターの配列：
Figure 2023551874000008
別の実施形態では、ＰＵＦ（ＣＵＧ）またはＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）またはＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）またはｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）構成は、ＡＡＶベクター内にパッケージングされる。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターである。別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ７４ベクターである。
別の実施形態では、ＰＵＦ（ＣＵＧ）またはＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）またはＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）またはｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）構成は、ＡＡＶベクター内にパッケージングされる。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターである。別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ７４ベクターである。
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化活性Ｃａｓ１３ｄタンパク質を含む本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｂに示されるように構成されている。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５７３または５７４で示される核酸配列を含む。
表Ｂ： 例示的なＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ ＡＡＶベクター
Figure 2023551874000009
Figure 2023551874000010
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼと融合したＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質を含む、Ａ０２２０５と呼ばれる、本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｃに示されるようなエレメントを含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５７４または５７５で示される核酸配列を含む。
表Ｃ： 例示的なＣＵＧ標的化ＰＵＦ－エンドヌクレアーゼＡＡＶベクター Ａ０２２０５
Figure 2023551874000011
Figure 2023551874000012
Figure 2023551874000013
 デスミン（ＦＬ）プロモーターを有する、エンドヌクレアーゼなしのＰＵＦ－ＣＵＧ（Ａ０２２３９）
一部の実施形態では、本開示は、表Ｄに示されるようなＲＢ ＮＬＳと融合したＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質を提供する。
表Ｄ： 例示的なＣＵＧ標的化８ＰＵＦ
Figure 2023551874000014
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質を含む、Ａ０２２３９と呼ばれる、本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｅに示されるようなエレメントを含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５７６または５７７で示される核酸配列を含む。
表Ｅ： 例示的なＣＵＧ標的化ＰＵＦ ＡＡＶベクター Ａ０２２３９
Figure 2023551874000015
Figure 2023551874000016
 ＲＮＡを遮断の標的とする例示的な組成物
ＤＭＰＫの非コード３’非翻訳領域におけるＣＴＧマイクロサテライト伸長は、ＤＭ１を引き起こす。ＤＭＰＫ ｍＲＮＡにおける伸長されたＣＵＧ（ＣＵＧｅｘｐ）リピートは、ＭＢＮＬタンパク質を直接隔離し、それに起因してそれらの機能が喪失される。ＭＢＮＬ機能喪失は、ＤＭ１の際に認められる選択的スプライシング異常および臨床症状の直接的な原因となる。ＰＵＦ（ＣＵＧ）またはｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）は、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡに直接結合し、ＭＢＮＬ隔離を阻止して、ほぼ正常な遊離ＭＢＮＬレベルおよび機能を保存することになり、これによって、ＤＭ１疾患表現型、例えば、スプライシング機能障害、筋強直などが回復することになる。以下のＰＵＦ（ＣＵＧ）およびｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）ＲＮＡ標的化構築物は、遮断のための例示的な実施形態である。
一部の実施形態では、本開示は、表Ｆに示されるようなＲＢ ＮＬＳと融合したＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質を提供する。
表Ｆ： ＣＵＧ ＲＮＡを遮断するための例示的なＣＵＧ標的化８ＰＵＦ
Figure 2023551874000017
一部の実施形態では、遮断に好適なＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質を含む本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｇに示されるようなエレメントを含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５７８または５７９で示される核酸配列を含む。
表Ｇ： ＣＵＧを遮断の標的とする例示的なＰＵＦ
Ｎ末端からＣ末端への順序でのプラスミドエレメントのヌクレオチド配列
Figure 2023551874000018
Figure 2023551874000019
 エンドヌクレアーゼがない、ｍｙｃタグを有する、ＣＵＧ（ＤＭ１）を標的とするＰＵＦ
一部の実施形態では、本開示は、表Ｈに示されるようなＲＢ ＮＬＳと融合したＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質を提供する。
表Ｈ： ＣＵＧ ＲＮＡを遮断するための例示的なＣＵＧ標的化８ＰＵＦ
Figure 2023551874000020
Figure 2023551874000021
一部の実施形態では、遮断に好適なＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質を含む本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｉに示されるようなエレメントを含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５８１または５８２で示される核酸配列を含む。
表Ｉ： ＣＵＧを遮断の標的とするＰＵＦを含む例示的なＡＡＶベクター
Figure 2023551874000022
Figure 2023551874000023
 Ａ０１５６０：エンドヌクレアーゼのない、ＣＵＧを標的とするｄＣａｓ１３ｄ ｄＳｅｑ２１２（触媒ドメインに４つの点変異）
一部の実施形態では、本開示は、表Ｊに示されるような、４つの点変異を有する、ＣＵＧを標的とする触媒として不活性なＣａｓ（ｄＣａｓ１３ｄ）を提供する。
表Ｊ： ＣＵＧ ＲＮＡを遮断するための例示的なＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄ
Figure 2023551874000024
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄタンパク質を含む、Ａ０１５６０と呼ばれる、本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｋに示されるようなエレメントを含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５８４または５８５で示される核酸配列を含む。
表Ｋ： ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄを含む例示的なＡＡＶベクターＡ０１５６０
Figure 2023551874000025
Figure 2023551874000026
Figure 2023551874000027
 Ｃａｓ１３ｄ：エンドヌクレアーゼのない、ＣＵＧを標的とするｄＳｅｑ２１２（ＨＥＰＮ２に１つの点変異Ｈ９１９Ａを有する）
一部の実施形態では、本開示は、表Ｌに示されるようなＨＥＰＮ２にＨ９１９Ａ変異を有する、ＣＵＧを標的とする触媒として不活性なＣａｓ（ｄＣａｓ１３ｄ）を提供する。
表Ｌ： ＣＵＧ ＲＮＡを遮断するための例示的なＣＵＧ標的化ｄｃａｓ１３ｄ
Figure 2023551874000028
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄタンパク質を含む本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｍに示されるようなエレメントを含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５９０または５９１で示される核酸配列を含む。
表Ｍ： ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄを含む例示的なＡＡＶベクター
Figure 2023551874000029
Figure 2023551874000030
 Ｃａｓ１３ｄ：エンドヌクレアーゼのない、ＣＵＧを標的とするｄＳｅｑ２１２（ＨＥＰＮ２に１つの点変異Ｒ９１４Ａを有する）
一部の実施形態では、本開示は、表Ｎに示されるような、Ｈ９１４Ａ変異を有する、ＣＵＧを標的とする触媒として不活性なＣａｓ（ｄＣａｓ１３ｄ）を提供する。
表Ｎ： ＣＵＧ ＲＮＡを遮断するための例示的なＣＵＧ標的化ｄｃａｓ１３ｄ
Figure 2023551874000031
Figure 2023551874000032
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄタンパク質を含む本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｏに示されるようなエレメントを含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５９２または５９３で示される核酸配列を含む。
表Ｏ： ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄを含む例示的なＡＡＶベクター
Figure 2023551874000033
Figure 2023551874000034
 Ｃａｓ１３ｄ：エンドヌクレアーゼのない、ＣＵＧを標的とするｄＳｅｑ２１２（ＨＥＰＮ１に１つの点変異Ｒ２９３Ａを有する）
一部の実施形態では、本開示は、表Ｐに示されるような、ＨＥＰＮ１にＲ２９３Ａ変異を有する、ＣＵＧを標的とする触媒として不活性なＣａｓ（ｄＣａｓ１３ｄ）を提供する。
表Ｐ： ＣＵＧ ＲＮＡを遮断するための例示的なＣＵＧ標的化ｄｃａｓ１３ｄ
Figure 2023551874000035
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄタンパク質を含む本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｑに示されるようなエレメントを含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５９４または５９５で示される核酸配列を含む。
表Ｑ： ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄを含む例示的なＡＡＶベクター
Figure 2023551874000036
Figure 2023551874000037
 Ｃａｓ１３ｄ：エンドヌクレアーゼのない、ＣＵＧを標的とするｄＳｅｑ２１２（ＨＥＰＮ１に１つの点変異Ｈ２９８Ａを有する）
一部の実施形態では、本開示は、表Ｒに示されるような、ＨＥＰＮ１にＨ２９８Ａ変異を有する、ＣＵＧを標的とする触媒として不活性なＣａｓ（ｄＣａｓ１３ｄ）を提供する。
表Ｒ： ＣＵＧ ＲＮＡを遮断するための例示的なＣＵＧ標的化ｄｃａｓ１３ｄ
Figure 2023551874000038
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄタンパク質を含む本開示のＡＡＶベクターは、５’から３’へ、表Ｓに示されるようなエレメントを含む。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、配列番号５９６または５９７で示される核酸配列を含む。
表Ｓ： ＣＵＧ標的化ｄＣａｓ１３ｄを含む例示的なＡＡＶベクター
Figure 2023551874000039
Figure 2023551874000040
Figure 2023551874000041
 ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質のためのガイドＲＮＡ
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）という用語と単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）という用語は、本開示全体を通して互換的に使用される。
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、スペーサー配列および「ダイレクトリピート」（ＤＲ）配列で構成され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、連続したスペーサー配列およびＤＲ配列を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、スペーサー配列とＤＲ配列は連続していない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＤＲ配列を含む。ＤＲ配列は、スペーサー配列が散在する、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（細菌ゲノムまたはプラスミドに天然に存在する）内の反復配列を指す。関連するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の配列が分かっている場合には、対応する（または同族の）Ｃａｓタンパク質のＤＲ配列を推測することができることは周知である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列およびスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡをコードする配列は、リンカー配列によって分離されているスペーサー配列とＤＲ配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはその間の任意の数のヌクレオチド（ｎｔ）を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはその間の任意の数のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ＤＲ配列は、Ｃａｓ１３ｄ ＤＲ配列である。
一実施形態では、Ｃａｓ１３ｄ媒介様式で１つまたは複数の標的ＲＮＡ分子とハイブリダイズするｇＲＮＡは、１つまたは複数のダイレクトリピート（ＤＲ）配列、１つまたは複数のスペーサー配列、例えば、ＤＲ－スペーサー－ＤＲ－スペーサーのアレイを含む１つまたは複数の配列などを含む。一実施形態では、各ｇＲＮＡが異なり得る、例えば、異なるＲＮＡ、または単一のＲＮＡからの複数の標的領域、またはこれらの組合せを標的とし得る、複数のｇＲＮＡが、単一のアレイから生成される。一部の実施形態では、単離されたｇＲＮＡは、１つまたは複数のダイレクトリピート配列、例えば、プロセシングされていない（例えば、約３６ｎｔ）またはプロセシングされたＤＲ（例えば、約３０ｎｔ）を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して特異的な１つまたは複数のスペーサー配列をさらに含み得る（例えば、標的ＲＮＡと相補的である）。ある特定のそのような実施形態では、複数のｐｏｌＩＩＩプロモーターを使用して、複数のｇＲＮＡ、スペーサーおよび／またはＤＲを駆動することができる。一実施形態では、ガイドアレイは、ＤＲ（約３６ｎｔ）－スペーサー（約３０ｎｔ）－ＤＲ（約３６ｎｔ）－スペーサー（約３０ｎｔ）を含む。
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡをコードする配列は、改変または合成されたＲＮＡヌクレオチドを含むまたはそれからなる。例示的な改変されたＲＮＡヌクレオチドとしては、これだけに限定されないが、プソイドウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、および７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、ヒポキサンチン、キサンチン、キサントシン、７－メチルグアニン、５、６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシトシン（ｈｙｄｒｏｐｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、イソグアニン、およびイソシトシンが挙げられる。
本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的配列内の改変されたＲＮＡに結合し得る。本開示のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的配列内の改変されたまたは変異型（例えば、病原性）ＲＮＡに結合し得る。例示的なエピジェネティック的にまたは転写後に改変されたＲＮＡとしては、これだけに限定されないが、２’－Ｏ－メチル化（２’－ＯＭｅ）（２’－Ｏ－メチル化がリボース部分の遊離の２’－ＯＨの酸素に存在する）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、および５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）が挙げられる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡは、非コードＣ／Ｄボックス核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）配列をコードする少なくとも１つの配列を含む。一部の実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列を含み、ここで、ＲＮＡ分子の標的配列は、少なくとも１つの２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、ｓｎｏＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列を含み、ここで、標的ＲＮＡと相補的である少なくとも１つの配列は、ボックスＣモチーフ（ＲＵＧＡＵＧＡ）（配列番号５２３）およびボックスＤモチーフ（ＣＵＧＡ）（配列番号５２４）を含む。
本開示のスペーサー配列は、ＲＮＡ分子の標的配列に結合する。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、病原性標的ＲＮＡに結合する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合するスペーサー配列をさらに含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８７％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージ相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％の相補性を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２１個のヌクレオチド、２２個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２４個のヌクレオチド、２５個のヌクレオチド、２６個のヌクレオチド、２７個のヌクレオチド、２８個のヌクレオチド、または２９個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２６個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、スペーサー配列は、プロセシングされておらず、３０個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、プロセシングされていないスペーサー配列は、３０～３６個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。
本開示のＤＲ配列は、本開示のＣａｓポリペプチドに結合する。ｇＲＮＡのスペーサー配列が標的ＲＮＡ配列に結合すると、ｇＲＮＡのＤＲ配列に結合しているＣａｓタンパク質は、標的ＲＮＡ配列に配置される。その同族Ｃａｓタンパク質またはその核酸に対して十分な相補性を有するＤＲ配列は、Ｃａｓタンパク質の標的核酸配列に選択的に結合し、その配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージ同一性を有する。一部の実施形態では、十分な相補性を有する配列は、１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、本開示のＤＲ配列は、二次構造または三次構造を含む。例示的な二次構造としては、これだけに限定されないが、へリックス、ステムループ、バルジ、テトラループおよびシュードノットが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、Ａ形態のへリックス、Ｂ形態のへリックス、およびＺ形態のへリックスが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったステムループが挙げられる。例示的な三次構造としては、これだけに限定されないが、ねじれたまたはらせん状になったシュードノットが挙げられる。一部の実施形態では、本開示のＤＲ配列は、少なくとも１つの二次構造または少なくとも１つの三次構造を含む。一部の実施形態では、本開示のＤＲ配列は、１つもしくは複数の二次構造または１つもしくは複数の三次構造を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、本開示のＲＮＡ分子内のテトラループモチーフに選択的に結合する。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、テトラループモチーフを含む。一部の実施形態では、テトラループモチーフは、ＧＡＡＡ、ＧＵＧＡ、ＧＣＡＡまたはＧＡＧＡである配列の１つまたは複数を含むまたはそれからなる「ＧＲＮＡ」モチーフである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、ＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に共有結合により結合する。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合するガイドＲＮＡまたはその一部は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質または第２のＲＮＡ結合性タンパク質に非共有結合により結合する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、終点を含めて、１０個から１００個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、終点を含めて、１０個から３０個の間のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２０個のヌクレオチドを含むまたはそれらからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２１個のヌクレオチドを含むまたはそれらからなる。一部の実施形態では、本開示のスペーサー配列は、２６個のヌクレオチドを含むまたはそれらからなる。
ガイド分子は、一般に、種々のプロセシング状態で存在する。一例では、プロセシングされていないガイドＲＮＡは、３６ｎｔのＤＲであり、これに３０～３２ｎｔのスペーサーが続く。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｄ自体または他のＲＮａｓｅによって、より短い「成熟」形態へとプロセシング（短縮化／改変）される。一部の実施形態では、プロセシングされていないガイド配列は、長さ約または少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、またはそれを超えるヌクレオチド（ｎｔ）である。一部の実施形態では、プロセシングされたガイド配列は、約４４～６０ｎｔ（例えば、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０ｎｔ）である。一部の実施形態では、プロセシングされていないスペーサーは、約２８～３２ｎｔ長（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ）であるが、成熟（プロセシングされた）スペーサーは、約１０～３０ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１４～２５ｎｔ、２０～２２ｎｔ、または１４～３０ｎｔ（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ）であり得る。一部の実施形態では、プロセシングされていないＤＲは、約３６ｎｔ（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、または４１ｎｔ）であるが、プロセシングされたＤＲは、約３０ｎｔ（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ）である。一部の実施形態では、ＤＲ配列は、例えば５’末端で、１～１０ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、～１０ヌクレオチド）短縮化されて、成熟した予めプロセシングされたガイドＲＮＡとして発現される。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含まない。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、プロトスペーサーフランキング配列（ＰＦＳ）と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含め、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部がＰＦＳと相補的な配列を含むものを含め、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分をコードする配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはその一部は、ＰＦＳと相補的な配列を含まない。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、本開示のガイドＲＮＡ配列を含むベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列は、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列（ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｓ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、組織特異的かつ／または細胞型特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ハイブリッドまたは組換えプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡを哺乳動物細胞において発現させることができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡをヒト細胞において発現させることができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ガイドＲＮＡを発現させ、ガイドＲＮＡを細胞の核に制限することができるプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはヒトＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＵ６プロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、Ｕ６プロモーターは、ヒトＵ６プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトｔＲＮＡプロモーターまたはヒトｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトバリンｔＲＮＡプロモーターまたはヒトバリンｔＲＮＡプロモーターをコードする配列から単離されたもしくはそれに由来する配列である。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーターは、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列を含むベクターは、調節エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、調節エレメントは、ガイドＲＮＡの発現を増強するものである。例示的な調節エレメントとしては、これだけに限定されないが、エンハンサーエレメント、イントロン、エクソン、またはこれらの組合せが挙げられる。本開示の組成物の一部の実施形態では、本開示のベクターは、ガイドＲＮＡをコードする配列、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためのプロモーター配列および調節エレメントをコードする配列のうちの１つまたは複数を含む。本開示の組成物の一部の実施形態では、ベクターは、本開示の融合タンパク質をコードする配列をさらに含む。
ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ＲＮＡ分子、およびＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質に対応する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性融合タンパク質に対応し、この融合タンパク質は、第１および第２のＲＮＡ結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質中の第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、不活性化ＲＮＡ結合性タンパク質、例えば、不活性化Ｃａｓまたは触媒的に失活しているＣａｓタンパク質である。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して５’側に位置する。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードする配列に沿って、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列に対して３’側に位置する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に選択的に結合することができ、ＤＮＡ分子には結合しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合しない、またはいかなるＤＮＡ分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊（ｂｒｅａｋ）を誘導することができるタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊を誘導することができ、ＤＮＡ分子には結合しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合しない、またはいかなるＤＮＡ分子にも結合しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮＡ分子に結合し、ＲＮＡ分子の破壊を誘導することができ、ＤＮＡ分子には結合せず、その破壊も誘導しない、哺乳動物ＤＮＡ分子には結合せず、その破壊も誘導しない、または、いかなるＤＮＡ分子にも結合せず、その破壊も誘導しないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有さないタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質ではない。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質ではない。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質またはその一部を含む。一部の実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質またはその一部を含む。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、細菌または古細菌を含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、これだけに限定されないが、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ ｓｅｒｏｖａｒ １／２ｂ（ｓｔｒａｉｎ ＡＴＣＣ ３５９６７／ＤＳＭ ２０７５１／ＣＩＰ １００１００／ＳＬＣＣ ３９５４）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １０７１０、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ＤＳＭ ４８４７、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ ＷＢ４、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９－０３１７、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ ＦＳＬ Ｒ９－０３１７、ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＦＳＬ Ｍ６－０６３５（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ Ｆ０２７９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＳＢ １００３、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｒ１２１、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＤＥ４４２およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓを含めた、任意の種から単離し得るまたはそれに由来し得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質は、ＤＮＡヌクレアーゼが不活化されたものであり得る。本開示の例示的なＣａｓ１３タンパク質としては、これだけに限定されないが、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄおよびそれらのオルソログが挙げられる。本開示の例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、これだけに限定されないが、本明細書ではそれぞれＣｓｘ２７およびＣｓｘ２８と称される亜型１および２が挙げられる。
例示的なＣａｓ１３ａタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：
Figure 2023551874000042
Figure 2023551874000043
本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ａタンパク質は、配列番号４０８のアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。
例示的なＣａｓ１３ｂタンパク質としては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：
Figure 2023551874000044
Figure 2023551874000045
本開示の例示的な野生型Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ ＡＴＣＣ ４３７６７ Ｃａｓ１３ｂ（ＢｚＣａｓ１３ｂ）タンパク質は、配列番号４０９のアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得る。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。Ｃａｓ１３ｄは、ＶＩ－Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のエフェクターである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲＮＡを切る（ｃｕｔ）またはそれに結合することができる、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。一部の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、１つまたは複数の高等真核生物および原核生物ヌクレオチド結合性（ＨＥＰＮ）ドメインを含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、野生型ＨＥＰＮドメインまたは変異型ＨＥＰＮドメインのいずれかを含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、ＲＮＡを切ることはできないが、ガイドＲＮＡをプロセシングすることができる変異型ＨＥＰＮドメインを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、プロトスペーサーフランキング配列を必要としない。Ｃａｓ１３ｄタンパク質のさらなる例および配列について、限定することなく、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ公開第ＷＯ２０１９／０４０６６４号およびＵＳ２０１９／００６２７２４も参照されたい。
一部の実施形態では、本開示のＣａｓ１３ｄ配列は、限定することなく、ＷＯ２０１９／０４０６６４の配列番号１～２９６を含み、本明細書においてもそのように番号が付けられ、これをもって含まれる。
配列番号１は、ＨＥＰＮ部位を含有する、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍからの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２は、変異型ＨＥＰＮ部位を含有する、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍからの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３は、ＨＥＰＮ部位を含有する、未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４は、変異型ＨＥＰＮ部位を含有する、未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２７９１０００５４９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８５５０００３１７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３３８９００００２７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８０６１０００１７０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ５０９０００２９９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９５４９０００５９１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７１０００５００からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１２は、ヒト胃メタゲノムからの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３９１５０００３５７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４７１９０００１７３からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６９２９０００４６８からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７３６７０００４８６からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７９３００００４０３からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９９３０００５２７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６５５２０００６３９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌｌ９３２０００２４６からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ２９６３０００２８６からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２２は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２９５２０００４７０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４５１０００３９４からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２４は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ｓｉｒａｅｕｍ＿ＤＳＭ＿ｌ５７０２からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２５は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１９Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０，＿ｃ３６９０００００３からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７５９３０００３６２からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ２６１９００００５５からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ４０５０００１５１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号２９は、Ｃｈｉｃｋｅｎ＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃ２９８４７４からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ５１６０００２２７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ８３８０００３１９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３２は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１３１２３０００２６８からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５２９４０００４３４からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６４１５０００１９２からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６１４４０００３００からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９１１８００００４１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３７は、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ＿ｓｌｕｄｇｅ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ＿１２４４８６からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１３２２０００４３７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号３９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４５８２０００５３１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９１９００００２８３からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ７０９０００５１０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４２は、ＨＥＰＮドメインを有するＭ２４＿（ＬＳＱＸ０１２１２４８３＿Ａｎａｅｒｏｂｉｃ＿ｄｉｇｅｓｔｅｒ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３８３３０００４９４からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４４は、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ＿ｓｌｕｄｇｅ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ＿１１７３５５からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌｌ０６１０００３３０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４６は、ヒツジ胃メタゲノムからのＧｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３３８０００３２２からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４７は、ヒト胃メタゲノムからの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９５３０００００９７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号４９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ７５００００２５８からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５３７７０００２７４からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５１は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１９Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ２４８００００８９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５２は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌｌ４００００００３１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７９４００００１９１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６０４９０００２５１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ１３７０００５００からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９３６８０００１０５からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５４６０００２７５からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２１６０００５７３からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号５９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４８０６０００４０９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ０７６２０００４８０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４１１４０００３７４からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６２は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ＿ＦＤ１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７０９３０００１７０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ１１１３０００３８４からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６４０３０００２５９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６１９３０００１２４からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２１０００６１９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ６６６０００２７０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号６９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２００２０００４１１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７０は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ａｌｂｕｓからの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ１３５５２０００３１１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７２は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ００３７０００５２７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７３は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２３８０００３２９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ２６４３０００４９２からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８７４００００５７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４７８１０００４８９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ２１４４０００３５２からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５５９００００４４８からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号７９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ９２６９００００３１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ８５３７０００５２０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ８４５０００１３０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８２は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１３Ｅ０ｋ２ｌ２０１４０９２０＿ｃ３００００７２からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８３は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１ Ｅ０ｋ２ｌ２０１４０９２０ ＿ｃ Ｉ００００７８からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ２９９０００００９９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８５は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５２５０００３４９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８６は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７２２９０００３０２からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８７は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ３２２７０００３４３からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８８は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ７０３００００４６９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号８９は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ５１４９００００６８からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９０は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ４００２０００４５からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９１は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇｌ０４２００００４４６からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９２は、ｎｅｗ＿ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ＿ｓｔｒａｉｎ＿ＸＰＤ３００２ （ＣａｓＲｘ）からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９３は、Ｍ２６＿Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６９８０００３０７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９４は、Ｍ３６＿Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ＿ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿ｓｐ＿ＴＳ２８＿ｃ４０９５６からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９５は、Ｍ１２＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２５Ｃ０ｋ２ｌ２０１４０９２０ ＿ｃ１３４００００６６からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９６は、ヒト胃メタゲノムからの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９７は、ＭｌＯ＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ ＿Ｐ２５Ｃ９０ｋ２１２０ ｌ ４０９２０＿ｃ２８００００４１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９８は、３０ Ｍｌ Ｉ＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２５Ｃ７ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ４０７８０００１０５からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号９９は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２５Ｃ０ｋ２１２０ｌ４０９２０＿ｃ３２００００４５からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１００は、Ｍ１３＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ ＿Ｐ２３Ｃ７ｋ２ｌ２０１４０９２０ ＿ｃ３００００６７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１０１は、Ｍ５＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐｌ８Ｅ９０ｋ２１２０１４０９２０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１０２は、Ｍ２ｌ＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐｌ８Ｅ０ｋ２１２０１４０９２０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１０３は、Ｍ７＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ ＿Ｐ３８Ｃ７ｋ２１２０ ｌ ４０９２０＿ｃ４８４ ｌ ０００００３からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１０４は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｂｉｃｉｒｃｕｌａｎｓからの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１０５は、例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１０６は、例示的なＣａｓ１３ｄコンセンサス配列である。
配列番号１０７は、Ｍ１８＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ ＿Ｐ２２ＥＯｋ２ｌ２０１４０９２０＿ｃ３３９５００００７８からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１０８は、Ｍ１７＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ２２Ｅ９０ｋ２１２０１４０９２０＿ｃ１１４からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１０９は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ＿ｓｐ＿ＣＡＧ５７からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１１０は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐｌ １Ｅ９０ｋ２１２０ ｌ ４０９２０＿ｃ４３０００１２３からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１１１は、Ｍ６＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐ１３Ｅ９０ｋ２１２０ ｌ ４０９２０＿ｃ７０００００９からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１１２は、Ｍｌ９＿ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐｌ ７Ｅ９０ｋ２１２０１４０９２０からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１１３は、ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿Ｐｌ７Ｅ０ｋ２１２０ｌ４０９２０，＿ｃ８７００００４３からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１１４は、例示的なヒトコドン最適化Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１１５は、変異体ＨＥＰＮドメインを有する例示的なヒトコドン最適化Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１１６は、Ｎ末端ＮＬＳを有する例示的なヒトコドン最適化Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１１７は、ＮおよびＣ末端ＮＬＳタグを有する例示的なヒトコドン最適化Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１１８は、例示的なヒトコドン最適化非培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｃａｓ１３ｄ ３０核酸配列である。
配列番号１１９は、変異体ＨＥＰＮドメインを有する例示的なヒトコドン最適化非培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１２０は、Ｎ末端ＮＬＳを有する例示的なヒトコドン最適化非培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１２１は、ＮおよびＣ末端ＮＬＳタグを有する例示的なヒトコドン最適化非培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１２２は、例示的なヒトコドン最適化非培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤｌ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１２３は、変異型ＨＥＰＮドメインを有する例示的なヒトコドン最適化非培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤｌ Ｃａｓｌ３ｄ核酸配列である。
配列番号１２４は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｃｉｒｃｕｌａｎｓからの例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１２５は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍからの例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１２６は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ１からの例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１２７は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓからの例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１２８は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤからの例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１２９は、Ｅ． ｓｉｒａｅｕｍ Ｃａｓ１３ｄについての例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である。
配列番号１３０は、Ｒｕｍ． Ｓｐ． Ｃａｓ１３ｄについての例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である。
配列番号１３１は、Ｒｕｍ． Ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＸＰＤ３００２ Ｃａｓ１３ｄ（ＣａｓＲｘ）についての例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である。
配列番号１３２～１３７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である。
配列番号１３８は、７つの全長Ｃａｓ１３ｄオルソログの例示的な５０％コンセンサス配列である。
配列番号１３９は、腸内メタゲノムＰｌＥＯからの例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１４０は、Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｄｉｇｅｓｔｅｒからの例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１４１は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＡＧ：５７からの例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１４２は、例示的なヒトコドン最適化未培養腸内メタゲノムＰｌＥＯ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１４３は、例示的なヒトコドン最適化Ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｅｒ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１４４は、例示的なヒトコドン最適化Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１４５は、例示的なヒトコドン最適化Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ Ｃａｓ１３ｄ核酸配列である。
配列番号１４６は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＡＧ：５７ ＣＲＩＳＰＲアレイの例示的プロセシングである。
配列番号１４７は、コンティグｅｍｂ｜ＯＢＶＨ０１００３０３７．１、ヒト腸内メタゲノム配列（ＷＧＳコンティグｅｍｂ｜ＯＢＸＺ０１００００９４．１｜およびｅｍｂ｜ＯＢＪＦＯ１００００３３．１にも見いだされる）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１４８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１４７と組みになる）。
配列番号１４９は、コンティグｔｐｇ｜ＤＢＹＩ０１００００９１．１｜（ウシ腸内メタゲノムからアセンブルした未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＵＢＡ１１９０）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１５０～１５２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１４９と組みになる）。
配列番号１５３は、コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜（ヒツジ腸内メタゲノムからの未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１５４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１５３と組みになる）。
配列番号１５５は、コンティグＯＧＺＣ０１０００６３９．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１５６～１７７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１５５と組みになる）。
配列番号１５８は、コンティグｅｍｂ｜ＯＨＢＭ０１０００７６４．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１５９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１５８と組みになる）。
配列番号１６０は、コンティグｅｍｂ｜０ＨＣＰ０１００００４４．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１６１は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１６０と組みになる）。
配列番号１６２は、コンティグｅｍｂｌ０ＧＤＦ０１００８５１４．１｜（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１６３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１６２と組みになる）。
配列番号１６４は、コンティグｅｍｂ｜０ＧＰＮ０１００２６１０．１（ヒト腸内メタゲノムアセンブリ）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１６５は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１６４と組みになる）。
配列番号１６６は、コンティグＮＦＩＲ０１０００００８．１（ニワトリ腸内メタゲノムからの、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ａｎ３）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１６７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１６６と組みになる）。
配列番号１６８は、コンティグＮＦＬＶ０１０００００９．１（ニワトリ腸内メタゲノムからの、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ａｎ１１）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１６９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１６８と組みになる）。
配列番号１７１～１７４は、例示的なＣａｓ１３ｄモチーフ配列である。
配列番号１７５は、コンティグＯＪＭＭ０１００２９００ヒト腸内メタゲノム配列からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１７６は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１７５と組みになる）。
配列番号１７７は、コンティグＯＤＡＩ０１１６１１２７４．１腸内メタゲノム配列からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１７８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１７７と組みになる）。
配列番号１７９は、コンティグＯＩＺＸ０１０００４２７．１からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１８０は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１７９と組みになる）。
配列番号１８１は、コンティグｅｍｂ｜ＯＣＶＶ０１２８８９１４４．１｜からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１８２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１８１と組みになる）。
配列番号１８３は、コンティグＯＣＴＷ０１１５８７２６６．１からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である
配列番号１８４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１８３と組みになる）。
配列番号１８５は、コンティグｅｍｂ｜ＯＧＮＦＯ １００９１４１．１からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１８６は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１８５と組みになる）。
配列番号１８７は、コンティグｅｍｂ｜ＯＩＥＮ０１００２ｌ９６．１からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１８８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１８７と組みになる）。
配列番号１８９は、コンティグｅ－ｋ８７＿１１０９２７３６からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１９０～１９３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１８９と組みになる）。
配列番号１９４は、Ｇｕｔ＿ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ＿ｃｏｎｔｉｇ６８９３０００２９１からの例示的なＣａｓ１３ｄ配列である。
配列番号１９５～１９７は、例示的なＣａｓ１３ｄモチーフ配列である。
配列番号１９８は、Ｇａ０２２４４１５＿１０００７２７４からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号１９９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号１９８と組みになる）。
配列番号２００は、ＥＭＧ＿ｌ０００３６４１からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２０２は、Ｇａ０１２９３０６＿１０００７３５からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２０１は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２００と組みになる）。
配列番号２０２は、Ｇａ０１２９３０６＿１０００７３５からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２０３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２０３と組みになる
配列番号２０４は、ＧａＯ１２９３１７＿１００８０６７からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２０５は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２０４と組みになる）。
配列番号２０６は、Ｇａ０２２４４１５＿１００４８７９２からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２０７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２０６と組みになる）。
配列番号２０８は、１６０５８２９５８＿ｇｅｎｅ４９８３４からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２０９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２０８と組みになる）。
配列番号２１０は、２５０ｔｗｉｎｓ＿３５８３８＿ＧＬ０１１０３００からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２１１は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２１０と組みになる）。
配列番号２１２は、２５０ｔｗｉｎｓ＿３６０５０＿ＧＬＯＩ５８９８５からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２１３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２１２と組みになる）。
配列番号２１４は、３１００９＿ＧＬ００３４１５３からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２１５は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２１４と組みになる）。
配列番号２１６は、５３０３７３＿ＧＬ００２３５８９からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２１７は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２１６と組みになる）。
配列番号２１８は、ＢＭＺ－ｌ １Ｂ＿ＧＬ００３７７７１からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２１９は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２１８と組みになる）。
配列番号２２０は、ＢＭＺ－ｌ １Ｂ＿ＧＬ００３７９１５からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２２１は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２２０と組みになる）。
配列番号２２２は、ＢＭＺ－ｌ １Ｂ＿ＧＬ００６９６１ ７からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２２３は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２２２と組みになる）。
配列番号２２４は、ＤＬＦ０１４＿ＧＬ００１１９１４からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２２５は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２２４と組みになる）。
配列番号２２６は、ＥＹＺ－３６２Ｂ＿ＧＬ００８８９１５からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２２７～２２８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２２６と組みになる）。
配列番号２２９は、Ｇａ００９９３６４ １００２４１９２からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２３０は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２２９と組みになる）。
配列番号２３１は、Ｇａ０１８７９１０＿１０００６９３１からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２３２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２３１と組みになる）。
配列番号２３３は、Ｇａ０１８７９１０＿１００１５３３６からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２３４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２３３と組みになる）。
配列番号２３５は、Ｇａ０１８７９１０＿１００４０５３１からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２３６は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２３と組みになる）。
配列番号２３７は、Ｇａ０１８７９１１＿１００６９２６０からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２３８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２３７と組みになる）。
配列番号２３９は、ＭＨ０２８８＿ＧＬ００８２２１９からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２４０は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２３９と組みになる）。
配列番号２４１は、Ｏ２．ＵＣ２９－０＿ＧＬ００９６３１７からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２４２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２４１と組みになる）。
配列番号２４３は、ＰＩＧ－０１４＿ＧＬ０２２６３６４からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２４４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２４３と組みになる）。
配列番号２４５は、ＰＩＧ－０１８＿ＧＬ００２３３９７からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２４６は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２４５と組みになる）。
配列番号２４７は、ＰＩＧ－０２５＿ＧＬ００９９７３４からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２４８は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２４７と組みになる）。
配列番号２４９は、ＰＩＧ－０２８＿ＧＬ０１８５４７９からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２５０は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２４９と組みになる）。
配列番号２５１は、－Ｇａ０２２４４２２＿１０６４５７５９からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２５２は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２５１と組みになる）。
配列番号２５３は、ＯＤＡＩキメラからの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２５４は、例示的なコンセンサスＤＲ核酸配列である（配列番号２５３と組みになる）。
配列番号２５５は、ＨＥＰＮモチーフである。
配列番号２５６および２５７は、それぞれ、例示的なＣａｓ１３ｄ核局在化シグナルアミノ酸および核酸配列である。
配列番号２５８および２６０は、それぞれ、例示的なＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルアミノ酸および核酸配列である。
配列番号２５９は、ｄＣａｓ９標的配列である。
配列番号２６１は、ｃｃｄＢを標的とする人工Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ ｎＣａｓｌアレイである。
配列番号２６２は、完全３６ｎｔダイレクトリピートである。
配列番号２６３～２６６は、スペーサー配列である。
配列番号２６７は、ｃｃｄＢを標的とする人工未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｃｕｓ ｓｐ．ｎＣａｓｌアレイである。
配列番号２６８は、完全３６ｎｔダイレクトリピートである。
配列番号２６９～２７２は、スペーサー配列である。
配列番号２７３は、ｃｃｄＢ標的ＲＮＡ配列である。
配列番号２７４～２７７は、スペーサー配列である。
配列番号２７８は、変異型Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－Ｇａ＿０５３ｌ（ｔｒｕｎｃ）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、非保存Ｎ末端の欠失を有する。
配列番号２７９は、変異型Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＥＳ－Ｇａ＿０５３ｌ（ｔｒｕｎｃ）－ＮＥＳ－ＨＡである。この変異体は、非保存Ｎ末端の欠失を有する。
配列番号２８０は、全長Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ－ＮＬＳ－ＨＡである。
配列番号２８１は、変異型Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌ５）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸５５８～５８７の欠失を有する。
配列番号２８２は、変異型Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌ５．１２）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸５５８～５８７および９５３～９６６の欠失を有する。
配列番号２８３は、変異型Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌ５．１３）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸３７６～３９２および５５８～５８７の欠失を有する。
配列番号２８４は、変異型Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌ５．１２＋５．１３）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸３７６～３９２、５５８～５８７、および９５３～９６６の欠失を有する。
配列番号２８５は、変異型Ｃａｓ１３ｄ配列、ＮＬＳ－ＲｆｘＣａｓ１３ｄ（ｄｅｌｌ３）－ＮＬＳ－ＨＡである。この変異体は、アミノ酸３７６～３９２の欠失を有する。
配列番号２８６は、ＡＤＡＲ２の発現を編集するために使用されるエフェクター配列である。アミノ酸１～９６９は、ｄＲｆｘＣａｓ１３であり、ａａ ９７０～９９１は、ＮＬＳ配列であり、アミノ酸９９２～１３７８は、ＡＤＡＲ２ＤＤである。
配列番号２８７は、例示的なＨＩＶ ＮＥＳタンパク質配列である。
配列番号２８８～２９１は、例示的なＣａｓ１３ｄモチーフ配列である。
配列番号２９２は、Ｃａｓ１３ｄオルソログ配列ＭＨ＿４８６６である。
配列番号２９３は、０３７＿－＿ｅｍｂｌＯＩＺＡ０１０００３１５．ｌｌからの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２９４は、ＰＩＧ－０２２ ＧＬ００２６３５１からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２９５は、ＰＩＧ－０４６＿ＧＬ００７７８１３からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２９６は、ｐｉｇ＿ｃｈｉｍｅｒａからの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２９７は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ３００２（ＣａｓＲｘ）からの例示的なヌクレアーゼ不活性または失活Ｃａｓ１３ｄ（ｄＣａｓ１３ｄ）タンパク質配列である。
配列番号２９８は、例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号２９９は、（コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；ヒツジ腸内メタゲノムからの未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３）からの例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質配列である。
配列番号３００は、Ｃａｓ１３ｄ（コンティグｔｐｇ｜ＤＪＸＤ０１０００００２．１｜；ヒツジ腸内メタゲノムからの未培養Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓアセンブリ、ＵＢＡ７０１３）からの例示的なＣａｓ１３ｄダイレクトリピートヌクレオチド配列である（配列番号２９９と組みになる）。
配列番号３０１は、例示的なＣａｓ１３ｄタンパク質コンティグｅｍｂ｜ＯＢＬＩ０１０２０２４４である。
Ｙａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１８） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ７０（２）：３２７－３３９（ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１８．０２．２０１８）およびＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （２０１８） Ｃｅｌｌ １７３（３）：６６５－６７６（ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ／２０１８．０２．０３３）には、Ｃａｓ１３ｄタンパク質が記載されており、これらの両方は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＷＯ公開番号ＷＯ２０１８／１８３４０３（Ｃａｓ１３ｄであるＣａｓＭ）およびＷＯ２０１９／００６４７１（Ｃａｓ１３ｄ）も参照されたく、これらは、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号５８６は、不活性化Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄと呼ばれる、触媒活性のない例示的なｃａｓ１３ｄである。
配列番号５８７は、不活性化Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄと呼ばれる、触媒活性のない例示的なｃａｓ１３ｄである。
配列番号５８８は、不活性化Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄと呼ばれる、触媒活性のない例示的なｃａｓ１３ｄである。
配列番号５８９は、不活性化Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄと呼ばれる、触媒活性のない例示的なｃａｓ１３ｄである。
配列番号３０３は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍからの例示的なＣａｓＭタンパク質である。
配列番号３０４は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、２７８９ＳＴＤＹ５８３４９７１分離株からの、例示的なＣａｓＭタンパク質である。
配列番号３０５は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｃｉｒｃｕｌａｎｓからの例示的なＣａｓＭタンパク質である。
配列番号３０６は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、２７８９ＳＴＤＹ５６０８８９２分離株からの、例示的なＣａｓＭタンパク質である。
配列番号３０７は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、ＣＡＧ：５７からの、例示的なＣａｓＭタンパク質である。
配列番号３０８は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ－１からの例示的なＣａｓＭタンパク質である。
配列番号３０９は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ ＫＨ２Ｔ６株からの、例示的なＣａｓＭタンパク質である。
配列番号３１０は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ３００２株からの例示的なＣａｓＭタンパク質である。
配列番号３１１は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、２７８９ＳＴＤＹ５８３４８９４分離株からの、例示的なＣａｓＭタンパク質である。
配列番号３１２は、例示的なＲｔｃＢホモログである。
配列番号３１３は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍからの例示的なＷＹＬ＋Ｃ末端ＮＬＳである。
配列番号３１４は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ２７８９ＳＴＤＹ５８３４９７１分離株からの例示的なＷＹＬ＋Ｃ末端ＮＬＳである。
配列番号３１５は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｉｃｉｒｃｕｌａｎｓからの例示的なＷＹＬ＋Ｃ末端ＮＬＳである。
配列番号３１６は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ２７８９ＳＴＤＹ５６０８８９２分離株からの例示的なＷＹＬ＋Ｃ末端ＮＬＳである。
配列番号３１７は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＣＡＧ：５７からの例示的なＷＹＬ＋Ｃ末端ＮＬＳである。
配列番号３１８は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＤ－１からの例示的なＷＹＬ＋Ｃ末端ＮＬＳである。
配列番号３１９は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ ＫＨ２Ｔ６株からの例示的なＷＹＬ＋Ｃ末端ＮＬＳである。
配列番号３２０は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ３００２株からの例示的なＷＹＬ＋Ｃ末端ＮＬＳである。
配列番号３２１は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍからの例示的なＲｔｃＢ＋Ｃ末端ＮＬＳである。
配列番号３２２は、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ３００２ Ｃａｓ１３ｄ （ＣａｓＲｘ）の例示的なダイレクトリピート配列である。
配列番号５３０は、例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列、ｓｅｑ１９８である。
配列番号５３５は、例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列、ｓｅｑ１７９である。
配列番号５３８は、例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列、ｓｅｑ４２である。
配列番号５４０は、例示的なＣａｓ１３ｄ核酸配列、ｓｅｑ２１２である。
配列番号５３７は、配列番号５３８に対応する例示的なＤＲ核酸配列をコードする例示的な核酸配列である。
本開示の例示的な野生型Ｃａｓ１３ｄタンパク質は、アミノ酸配列の配列番号９２または配列番号２９８（ＣａｓＲｘとしても公知のＣａｓ１３ｄタンパク質）を含み得るまたはそれからなり得る。
Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ＸＰＤ３００２ Ｃａｓ１３ｄ（ＣａｓＲｘ）の例示的なダイレクトリピート配列は、核酸配列：ＡＡＣＣＣＣＴＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＣ（配列番号３０２）を含む。
ｇＲＮＡ標的配列
本開示の組成物は、病原性リピート配列を含むＲＮＡ分子の標的配列に結合し、それを破壊する。一実施形態では、標的ＲＮＡは、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質に対応するガイドＲＮＡのスペーサー配列に対応する配列モチーフを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的配列を標的とするために１つまたは複数のスペーサー配列が使用される。一部の実施形態では、複数の標的ＲＮＡを標的とするために複数のスペーサーが使用される。そのような標的ＲＮＡは、同じＲＮＡ分子内の異なる標的部位であることもあり、または異なるＲＮＡ分子内の異なる標的部位であることもある。スペーサー配列は、非コードＲＮＡを標的することもできる。一部の実施形態では、複数のプロモーター、例えば、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを使用して、複数の標的ＲＮＡを標的とするためにｇＲＮＡ内の複数のスペーサーを駆動することができる。一実施形態では、標的ＲＮＡまたは標的配列モチーフの分解は、病原性ＣＵＧリピートＲＮＡの発現を低下させ、それによって、ＤＭ１が処置される、および／またはＤＭ１に関連する１つもしくは複数の症状が好転する。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、標的ＲＮＡの配列モチーフは、疾患または障害のシグネチャーである。
本開示の標的配列モチーフは、ゲノム配列内に見いだされる外来または外因性配列の配列から単離し得るまたはそれに由来し得、したがって、本開示のｍＲＮＡ分子または本開示のＲＮＡ配列内に見いだされる外来または外因性配列の配列に翻訳される。
本開示の標的配列モチーフは、疾患または障害を引き起こす、内因性配列内の変異を含み得るまたはそれからなり得る。変異は、配列の置換、逆位、欠失、挿入、転位、またはこれらの任意の組合せを含み得る、それからなり得る、それの近くに位置し得る、またはそれと関連し得る。
本開示の標的配列モチーフは、リピート配列を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リピート配列は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）に関連し得る。１つまたは複数の遺伝子座におけるＭＳＩは、本開示の細胞のＤＮＡミスマッチ修復機構が損なわれたことに起因する。ＤＮＡの超可変配列は、超可変配列を含むまたはそれからなる標的配列を含む本開示のｍＲＮＡに転写され得る。
本開示の標的配列モチーフは、バイオマーカーを含み得るまたはそれからなり得る。バイオマーカーは、疾患または障害が発生するリスクを示すものであり得る。バイオマーカーは、健康な遺伝子（疾患または障害が発生することの確定可能なリスクが低いまたはリスクがない）を示すものであり得る。バイオマーカーは、編集された遺伝子を示すものであり得る。例示的なバイオマーカーとしては、これだけに限定されないが、一塩基多型（ＳＮＰ）、配列バリエーションまたは変異、エピジェネティックマーク、スプライスアクセプター部位、外因性配列、異種配列、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。
本開示の配列モチーフは、二次構造、三次構造または四次構造を含み得るまたはそれからなり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、内因性または天然に存在するものであり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、誘導されたまたは天然に存在しないものであり得る。二次構造、三次構造または四次構造は、内因性配列、外因性配列、または異種配列にコードされるものであり得る。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、終点を含めて、２個から１００個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、終点を含めて、２個から５０個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、終点を含めて、２個から２０個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、終点を含めて、２０個から３０個の間のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、終点を含めて、約２６個のヌクレオチドまたは核酸塩基を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は連続している。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は連続していない。例えば、ＲＮＡ分子の標的配列は、標的配列のヌクレオチド間に１つまたは複数の断続的なヌクレオチドが位置することに起因して連続していない１つまたは複数のヌクレオチドまたは核酸塩基を含み得るまたはそれからなり得る。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、天然に存在するものである。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、天然に存在しないものである。例示的な天然に存在しない標的配列は、配列バリエーションもしくは変異、キメラ配列、外因性配列、異種配列、キメラ配列、組換え配列、改変もしくは合成されたヌクレオチドを含む配列またはこれらの任意の組合せを含み得るまたはそれからなり得る。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示のガイドＲＮＡに結合する。本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の１つまたは複数の標的配列は、本開示の１つまたは複数のガイドＲＮＡスペーサー配列に結合する。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示の第１のＲＮＡ結合性タンパク質に結合する。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡ分子の標的配列は、本開示の第２のＲＮＡ結合性タンパク質に結合する。
本開示の組成物は、標的毒性ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列に特異的に結合するスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列に結合するスペーサーは、約２０個から３０個のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つまたは複数のスペーサー配列を含む。
ＲＮＡ分子の標的ＣＵＧ配列に特異的に結合する、本開示の例示的なｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号４５７～４５９に示される。
エンドヌクレアーゼ
一部の実施形態では、本開示の組成物は、ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる、第２のＲＮＡ結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エフェクタータンパク質である。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡと会合する様式でＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡを切断する（ｃｌｅａｖｅ）様式でＲＮＡと会合する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＰＵＦ、ＰＵＭＢＹまたはＰＰＲに基づくタンパク質である、第１のＲＮＡ結合性タンパク質と融合している。一実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、不活性化されているＣａｓに基づく（ｄＣａｓに基づく）タンパク質である、第１のＲＮＡ結合性タンパク質と融合している。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅを含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡｓｅ１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮＡｓｅ１タンパク質は、配列番号３２５を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅ４を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ４タンパク質は、配列番号配列番号３２６を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅ６を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ６タンパク質は、配列番号配列番号３２７を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅ７を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ７タンパク質は、配列番号配列番号３２８を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅ８を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ８タンパク質は、配列番号配列番号３２９を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅ２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ２タンパク質は、配列番号配列番号３３０を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅ６ＰＬを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ６ＰＬタンパク質は、配列番号配列番号３３１を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅＬを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅＬタンパク質は、配列番号配列番号３３２を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅＴ２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅＴ２タンパク質は、配列番号配列番号３３３を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅ１１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ１１タンパク質は、配列番号配列番号３３４を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮａｓｅＴ２様を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅＴ２様タンパク質は、配列番号配列番号３３５を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮａｓｅである。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）ポリペプチドは、配列番号３３６を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、配列番号３３７を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、配列番号３３８を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮａｓｅ１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、配列番号３３９を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドは、配列番号３４０を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドは、配列番号３４１を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、変異型ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ））ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ））ポリペプチドは、配列番号３４２を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号３４３を含むまたはそれからなる変異型ＲＮａｓｅ１（ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ））ポリペプチドである。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＯＢ１ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＮＯＢ１ポリペプチドは、配列番号３４４を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＶ（ＥＮＤＯＶ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＶタンパク質は、配列番号３４５を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＧタンパク質は、配列番号３４６を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＤ１（ＥＮＤＯＤ１）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＮＤＯＤ１タンパク質は、配列番号配列番号３４７を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヒトフラップエンドヌクレアーゼ－１（ｈＦＥＮ１）を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＦＥＮ１ポリペプチドは、配列番号３４８を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼＸＰＦ（ＥＲＣＣ４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＣＣ４ポリペプチドは、配列番号３４９を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、エンドヌクレアーゼＩＩＩ様タンパク質１（ＮＴＨＬ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＮＴＨＬポリペプチドは、配列番号３４０を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヒトＳｃｈｌａｆｅｎ１４（ｈＳＬＦＮ１４）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＳＬＦＮ１４ポリペプチドは、配列番号３５１を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヒトベータ－ラクタマーゼ様タンパク質２（ｈＬＡＣＴＢ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＬＡＣＴＢ２ポリペプチドは、配列番号３５２を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドデオキシリボヌクレアーゼ（ＡＰＥＸ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＰＥＸ２ポリペプチドは、配列番号３５３を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、ＡＰＥＸ２ポリペプチドは、配列番号３５４を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、脱プリンまたは脱ピリミジン部位リアーゼ（ＡＰＥＸ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＰＥＸ１ポリペプチドは、配列番号３５５を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＡＮＧポリペプチドは、配列番号３５６を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、熱応答タンパク質１２（ＨＲＳＰ１２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＨＲＳＰ１２ポリペプチドは、配列番号３５７を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型、１２Ａ含有（ＺＣ３Ｈ１２Ａ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、Ｚ３Ｈ１２Ａポリペプチドは、ポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメインであり、これは、配列番号３５８を含むまたはそれからなり、本明細書でＥ１７とも称される。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドは、配列番号３５９を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、反応性中間体イミンデアミナーゼＡ（ＲＩＤＡ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＩＤＡポリペプチドは、配列番号３６０を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ホスホリパーゼＤファミリーメンバー６（ＰＤＬ６）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＤＬ６ポリペプチドは、配列番号３６１を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ミトコンドリアリボヌクレアーゼＰ触媒サブユニット（ＫＩＡＡ０３９１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＫＩＡＡ０３９１ポリペプチドは、配列番号３６２を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、アルゴノート２（ＡＧＯ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＡＧＯ２ポリペプチドは、配列番号３６３を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ミトコンドリアヌクレアーゼＥＸＯＧ（ＥＸＯＧ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＸＯＧポリペプチドは、配列番号３６４を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型、１２Ｄ含有（ＺＣ３Ｈ１２Ｄ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＣ３Ｈ１２Ｄポリペプチドは、配列番号３６５を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、小胞体－核シグナル伝達２（ＥＲＮ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＮ２ポリペプチドは、配列番号３６６を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ペロタｍＲＮＡ生存およびリボソーム救援因子（ＰＥＬＯ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＥＬＯポリペプチドは、配列番号３６７を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＹＢＥＹメタロペプチダーゼ（ＹＢＥＹ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＹＢＥＹポリペプチドは、配列番号３６８を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、切断およびポリアデニル化特異的因子４様（ＣＰＳＦ４Ｌ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＣＰＳＦ４Ｌポリペプチドは、配列番号３６９を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドは、配列番号３７０を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、ｈＣＧ＿２００２７３１ポリペプチドは、配列番号３７１を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、除去修復相互相補化グループ１（ＥＲＣＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＥＲＣＣ１ポリペプチドは、配列番号３７２を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１アイソフォーム（ＲＡＣ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＣ１ポリペプチドは、配列番号３７３を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、リボヌクレアーゼＡＡ１（ＲＡＡ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＡ１ポリペプチドは、配列番号３７４を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｒａｓ関連タンパク質（ＲＡＢ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＡＢ１ポリペプチドは、配列番号３７５を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＤＮＡ複製ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ２（ＤＮＡ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＤＮＡ２ポリペプチドは、配列番号３７６を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＦＬＪ３５２２０ポリペプチドは、配列番号３７７を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＦＬＪ１３１７３ポリペプチドは、配列番号３７８を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｔｅｎｅｕｒｉｎ膜貫通タンパク質（ＴＥＮＭ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｔｅｎｅｕｒｉｎ膜貫通タンパク質１（ＴＥＮＭ１）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＥＮＭ１ポリペプチドは、配列番号３７９を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｔｅｎｅｕｒｉｎ膜貫通タンパク質２（ＴＥＮＭ２）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＥＮＭ２ポリペプチドは、配列番号３８０を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、リボヌクレアーゼカパ（ＲＮａｓｅＫ）ポリペプチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅＫポリペプチドは、配列番号３８１を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、転写活性位因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮポリペプチドは、配列番号３８２を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮポリペプチドは、配列番号３８３を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＺＮＦ６３８ポリペプチドまたはそのヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＺＮＦ６３８ポリペプチドは、配列番号３８４を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、一般にテロメラーゼ結合性タンパク質ＥＳＴ１Ａアイソフォーム３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１２４３７５６．１としても公知のヒトＳＭＧ６タンパク質に由来するＰＩＮドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、例えば、これだけに限定することなく、ｈＳＭＧ６由来のＰＩＮは、本明細書では、Ｃａｓ融合タンパク質の形態で、内部対照として使用される。一部の実施形態では、ＰＩＮポリペプチドは、配列番号５９８を含むまたはそれからなる。
本開示の組成物の一部の実施形態では、組成物は、（ａ）ＲＮＡ分子の内部に特異的に結合するｇＲＮＡを含む配列および（ｂ）ヌクレアーゼをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮまたはそのヌクレアーゼドメインから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。
ＡＡＶベクター
「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の核酸分子および１つまたは複数のＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む、それらから本質的になるまたはそれからなるベクターを指す。一部の態様では、核酸分子は、本開示のＣＡＧリピート標的化タンパク質および／または組成物をコードする。そのようなＡＡＶベクターは、例えば宿主細胞へのトランスフェクションにより、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物の機能を提供する宿主細胞に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、プロモーターを含有し、少なくとも１つのタンパク質もしくはＲＮＡをコードし得る少なくとも１つの核酸を含有し、ならびに／または感染性ＡＡＶ粒子にパッケージングされるエンハンサーおよび／もしくはターミネーターをフランキングＩＴＲ内に含有する。カプシド封入核酸部分は、ＡＡＶベクターゲノムと呼ばれ得る。ＡＡＶベクターを含有するプラスミドは、製造のためのエレメント、例えば、抗生物質耐性遺伝子、複製起点配列なども含有し得るが、これらは、カプシドに封入されず、したがって、ＡＡＶ粒子の一部を形成しない。
一部の態様では、ＡＡＶベクターは、本開示のＣＵＧリピート標的化組成物をコードする少なくとも１つの核酸分子を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つの調節配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ末端逆位（ＩＴＲ）配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのエンハンサー配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのポリＡ配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのリンカー配列を含み得る。一部の態様では、本開示のＡＡＶベクターは、少なくとも１つの核局在化シグナルを含み得る。一部の態様では、本開示のＡＡＶベクターは、ＣＵＧリピート標的化ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質、ペプチド、またはその断片を含み得る。一部の態様では、本開示のＡＡＶベクターは、Ｃａｓタンパク質、ペプチド、またはその断片を含み得る。一部の態様では、本開示のＡＡＶベクターは、エンドヌクレアーゼタンパク質、ペプチド、またはその断片を含み得る。一部の態様では、本開示のＡＡＶベクターは、ガイドＲＮＡ、一部の場合にはＣＵＧリピート標的化ガイドＲＮＡを含み得る。一部の態様では、本開示のＡＡＶベクターは、これだけに限定されないが、ＣＵＧリピート標的化タンパク質（例えば、Ｃａｓ、ＰＵＦ、またはＰＵＭＢＹ）およびエンドヌクレアーゼを含む、本開示の１つまたは複数のエレメントを含む、融合タンパク質を含み得る。必要に応じて、ＡＡＶベクターの融合タンパク質は、本開示の１つまたは複数のエレメント間にリンカーアミノ酸配列をさらに含み得る。
一部の態様では、ＡＡＶベクターは、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、ＣＵＧリピート標的化組成物核酸分子、調節配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、５’から３’方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、導入遺伝子核酸分子、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。
ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄベクター
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物は、ＡＡＶユニタリーベクターとしてパッケージングされる。一部の実施形態では、ＡＡＶユニタリーベクターとしてパッケージングされるＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物は、配列番号５１８、５２８、５３４、５３６、および５３９で示される。
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物は、５’から３’へ：ヒトＵ６プロモーター、ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡ（この場合のｇＲＮＡは、ダイレクトリピート配列およびＣＵＧ標的化スペーサー配列を含む）、ＥＦＳプロモーター、コザック配列、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列、リンカー配列、Ｃａｓ１３ｄをコードする配列、リンカー配列、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列、リンカー配列、ＨＡタグ配列、およびＢＧＨ配列を含む。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物をコードする核酸は、配列番号５１８で示される。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物は、表３に描示されるように配列される。
Figure 2023551874000046
Figure 2023551874000047
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物を含むＡＡＶベクターは、５’から３’へ：ヒトＵ６プロモーター、ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡ（この場合のｇＲＮＡは、ダイレクトリピート配列およびＣＵＧ標的化スペーサー配列を含む）、ＥＦＳプロモーター、コザック配列、Ｃａｓ１３ｄをコードする配列、リンカー配列、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列、およびＳＶ４０ポリａ配列を含む。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物をコードする核酸は、配列番号５２８で示される。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物は、表４に描示されるように配列される。
Figure 2023551874000048
Figure 2023551874000049
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物を含むＡＡＶベクターは、５’から３’へ：ヒトＵ６プロモーター、ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡ（この場合のｇＲＮＡは、ダイレクトリピート配列およびＣＵＧ標的化スペーサー配列を含む）、ＥＦＳプロモーター、コザック配列、Ｃａｓ１３ｄをコードする配列、リンカー配列、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列、およびＳＶ４０ポリａ配列を含む。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物をコードする核酸は、配列番号５３４で示される。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物は、表５に描示されるように配列される。
Figure 2023551874000050
Figure 2023551874000051
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物を含むＡＡＶベクターは、５’から３’へ：ヒトＵ６プロモーター、ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡ（この場合のｇＲＮＡは、ダイレクトリピート配列およびＣＵＧ標的化スペーサー配列を含む）、ＥＦＳプロモーター、コザック配列、Ｃａｓ１３ｄをコードする配列、リンカー配列、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列、およびＳＶ４０ポリａ配列を含む。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物をコードする核酸は、配列番号５３６で示される。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物は、表６に描示されるように配列される。
Figure 2023551874000052
Figure 2023551874000053
一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物を含むＡＡＶベクターは、５’から３’へ：ヒトＵ６プロモーター、ｃａｓ１３ｄ ｇＲＮＡ（この場合のｇＲＮＡは、ダイレクトリピート配列およびＣＵＧ標的化スペーサー配列を含む）、ＥＦＳプロモーター、コザック配列、Ｃａｓ１３ｄをコードする配列、リンカー配列、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列、およびＳＶ４０ポリａ配列を含む。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物をコードする核酸は、配列番号５３９で示される。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ組成物は、表７に描示されるように配列される。
Figure 2023551874000054
Figure 2023551874000055
一部の実施形態では、本開示のＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化された核酸配列である。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、翻訳の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増加を示す。
一部の態様では、配列番号５１８、５２８、５３４、５３６および５３９で提示されるものなどの、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、安定性の増大を示す。一部の態様では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、耐加水分解性の増大によって安定性の増大を示す。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、安定性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大を示す。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、耐加水分解性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大を示す。
一部の態様では、配列番号５１８、５２８、５３４、５３６および５３９で提示されるものなどの、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ドナースプライス部位を含み得ない。一部の態様では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つ、または約６つ、または約７つ、または約８つ、または約９つ、または約１０以下のドナースプライス部位を含み得る。一部の態様では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０少ない、ドナースプライス部位を含む。
理論により拘束されることを望まないが、コドン最適化された核酸配列におけるドナースプライス部位の除去は、隠れたスプライシングが防止されるので、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質の発現を予想外におよび予測不能に増加させることができる。さらに、隠れたスプライシングは、対象によって異なることがあり、これは、ドナースプライス部位を含むＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質の発現レベルが、予測不能に対象によって異なることがあることを意味する。ヒトの治療に関して、このような予測不能性は受入れ難い。それに応じて、ドナースプライス部位を欠いている配列番号５１８、５２８、５３４、５３６および５３９で提示されるコドン最適化された核酸配列は、予想外におよび驚くべきことに、ヒト対象におけるＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質の発現増加を可能にし、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質の発現をヒト対象の違いを超えて規則化する。
一部の態様では、配列番号５１８、５２８、５３４、５３６および５３９で提示されるものなどの、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列のＧＣ含量とは異なるＧＣ含量を有し得る。一部の態様では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列のＧＣ含量は、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、核酸配列全体にわたってより均一に分布している。
理論により拘束されることを望まないが、核酸配列全体にわたってより均一にＧＣ含量を分布させることによって、コドン最適化された核酸配列は、転写物長にわたってより均一な融解温度（「Ｔｍ」）を示す。融解温度の均一性は、ポリメラーゼおよび／またはリボソームがあまり失速せずに核酸配列の転写および／または翻訳が起こるので、ヒト対象におけるコドン最適化された核酸の発現増加を予想外にもたらす。
一部の態様では、配列番号５１８、５２８、５３４、５３６および５３９で提示されるものなどの、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、より少ない抑制的マイクロＲＮＡ標的結合性部位を有し得る。一部の態様では、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、コドン最適化されていない核酸配列、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質と比較して、少なくとも１つ、もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、もしくは少なくとも５つ、もしくは少なくとも６つ、もしくは少なくとも７つ、もしくは少なくとも８つ、もしくは少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０の、または少なくとも１０少ない、抑制的マイクロＲＮＡ標的結合性部位を有し得る。
理論により拘束されることを望まないが、より少ない抑制的マイクロＲＮＡ標的結合性部位を有することによって、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ヒト対象において発現の増加を予想外に示す。
融合タンパク質
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、組成物は、（ａ）第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列またはその一部と、必要に応じて（ｂ）第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする配列とを含む標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする配列を含み、ここで、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、標的ＲＮＡに結合し、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。
一部の実施形態では、標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質である。ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、ＲＮＡ結合性ポリペプチドを標的ＲＮＡへガイドするｇＲＮＡに対応する少なくとも１つのＲＮＡ結合性ポリペプチドを含む。ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質としては、これだけに限定することなく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに基づくＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはその一部であるＲＮＡ結合性ポリペプチドが挙げられる。
シグナル配列
一部の実施形態では、本開示の標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、シグナル配列を含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、１つまたは複数のシグナル配列を含む。一部の実施形態では、シグナル配列は、核局在化配列（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）またはこれらの組合せである。一部の実施形態では、シグナル配列は、１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のＮＬＳ配列は、表８に収載される配列を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳシグナル配列は、ＳＶ４０ ＮＬＳシグナル配列である。一部の実施形態では、ＳＶ４０ ＮＬＳシグナル配列は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４３７）である。
Figure 2023551874000056
一部の実施形態では、シグナル配列は、１つまたは複数のＮＥＳ配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のＮＥＳ配列は、表９に収載される配列を含む。
Figure 2023551874000057
一部の実施形態では、本開示の標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、タグ配列を含む。一部の実施形態では、タグ配列は、ＦＬＡＧタグである。一部の実施形態では、ＦＬＡＧタグ配列は、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号４３６）である。
リンカー配列
一部の実施形態では、標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、リンカー配列を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個またはその間の任意の数のアミノ酸を含み得るまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、表１０に収載されるリンカー配列を含む。
Figure 2023551874000058
Figure 2023551874000059
 プロモーター配列
態様では、本開示のＣＵＧ標的化組成物は、プロモーター配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるいずれかのプロモーターを、本明細書に開示されるＲＮＡ標的化構築物に関して述べられる他のプロモーターのいずれかの代わりに用いることができる。一部の態様では、ＣＵＧ標的化組成物は、短縮化ＣＡＧ（ｔＣＡＧ）プロモーター（配列番号３８５）を含む。一部の態様では、ＣＵＧ標的化組成物は、配列番号５２０に示される短いＥＦ１－アルファ（ＥＦＳ）プロモーターを含む。一部の態様では、ＣＵＧ標的化組成物は、配列番号５１９で示されるようなヒトＵ６プロモーターを含む。一部の態様では、ＣＵＧ標的化組成物は、配列番号６０９で示されるＥＦＳ－ＵＢＢプロモーターを含む。一部の態様では、ＣＵＧ標的化組成物は、筋肉特異的プロモーターを含む。一部の態様では、ＣＵＧ標的化組成物は、配列番号５６８（全長）、配列番号６０８（全長）または配列番号５６９（短縮型）で示されるデスミンプロモーターである筋肉特異的プロモーターを含む。一部の態様では、ＣＡＧ標的化組成物は、配列番号６１９で示されるシナプシンプロモーターを含む。一部の実施形態では、本開示のプロモーター配列は、ヒトＥＦ１－アルファコアプロモーター（配列番号６４２）を含む。一部の実施形態では、本開示のプロモーター配列は、改変されたＵＢＢイントロン（配列番号６４３）を含む。一部の実施形態では、本開示のプロモーター配列は、改変されたＣＭＶエンハンサー配列（配列番号６４４）を含む。一部の実施形態では、本開示のプロモーター配列は、ｅＣＭＶ－ＥＦＳ－ＵＢＢプロモーター配列（配列番号６４５）を含む。
一部の実施形態では、プロモーターによる発現制御は、構成的または遍在性である。非限定的な例示的なプロモーターとしては、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばＵ６およびＨ１プロモーターなど、ならびに／またはＰｏｌ ＩＩプロモーター、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ（必要に応じて、ＣＭＶエンハンサーを含む）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを含む）、ＣＢＡ（ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン）、ＣＡＧ（ニワトリβ－アクチンと融合したハイブリッドＣＭＶエンハンサー）、短縮化ＣＡＧ、Ｃｂｈ（ハイブリッドＣＢＡ）、ＥＦ－１ａ（ヒト伸長因子アルファ－１）またはＥＦＳ（短い、イントロン不含の、ＥＦ－１アルファ）、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）、ＵＢＣ（ユビキチンＣ）、ＧＵＳＢ（リソソーム酵素ベータ－グルクロニダーゼ）、ＵＣＯＥ（遍在性クロマチンオープニングエレメント）、ｈＡＡＴ（アルファ－１アンチトリプシン）、ＴＢＧ（チロキシン結合性グロブリン）、デスミン（全長または短縮化）、ＭＣＫ（筋クレアチンキナーゼ）、Ｃ５－１２（合成筋プロモーター）、ＣＫ８ｅ（クリアチン（ｃｒｅａｔｉｎ）キナーゼ８）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、シナプシン、シナプシン－１（ＳＹＮ－１）、オプシン、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＰＤＧＦ－Ａ、ＭｅｃＰ２（メチルＣｐＧ結合性タンパク質２）、ＣａＭＫＩＩ（カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ）、ｍＧｌｕＲ２（代謝型グルタミン酸受容体２）、ＮＦＬ（ニューロフィラメント軽鎖）、ＮＦＨ（ニューロフィラメント重鎖）、ｎβ２、ＰＰＥ（ラットプレプロエンケファリン）、ＥＮＫ（プレプロエンケファリン）、プレプロエンケファリン－ニューロフィラメントキメラプロモーター、ＥＡＡＴ２（グルタミン酸輸送体）、ＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性タンパク質）、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）、ヒトロドプシンキナーゼプロモーター（ｈＧＲＫ１）、β－アクチンプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ＭＨＣＫ７（筋クレアチンキナーゼおよびアルファミオシン重鎖遺伝子のエンハンサー／プロモーター領域のハイブリッドプロモーター）、ならびにこれらの組合せが挙げられる。「エンハンサー」は、活性化タンパク質が結合して転写の尤度または頻度を増加させることができる、ＤＮＡの領域である。非限定的な例示的なエンハンサーおよび転写後調節エレメントとしては、ＣＭＶエンハンサー、ＭＣＫエンハンサー、ＨＴＬＶ－１のＬＴＲ内のＲ－Ｕ５’セグメント、ＳＶ４０エンハンサー、ウサギβ－グロビンのエクソン２と３の間のイントロン配列、およびＷＰＲＥが挙げられる。一部の実施形態では、イントロン、例えば、ＵＢＢイントロンは、プロモーター活性を増強するために使用される。一部の実施形態では、ＵＢＢイントロンは、ＥＦＳプロモーターとともに使用される。一部の実施形態では、エンハンサー配列を５’または３’ＵＴＲ内に付加させることができる。一部の実施形態では、５’エンハンサーは、配列番号６５２：
Figure 2023551874000060
 で示される、Ｈｓｐ７０であり得る。
ガイドされないＲＮＡ結合性融合タンパク質
一部の実施形態では、標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、ＲＮＡによりガイドされる標的ＲＮＡ結合性融合タンパク質ではなく、したがって、対応するｇＲＮＡ配列を有さない標的ＲＮＡに結合することができる少なくとも１つのＲＮＡ結合性ポリペプチドを含む。そのようなガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドとしては、限定することなく、ＰＵＦ（ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦホモロジーファミリー）タンパク質である少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分が挙げられる。この型のＲＮＡ結合性ポリペプチドを、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓなどのｇＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性タンパク質の代わりに使用することができる。ｍＲＮＡの安定性および翻訳の媒介に関与するＰＵＦタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＰｕｍｉｌｉｏおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｆｅｍ－３結合因子に由来する）の独特のＲＮＡ認識方式は当技術分野で周知である。同じく当技術分野で公知のヒトＰｕｍｉｌｉｏ１のＰＵＦドメインは同族ＲＮＡ配列に密接に結合し、また、その特異性は改変することができる。ヒトＰｕｍｉｌｉｏ１のＰＵＦドメインは、８つの連続したＲＮＡ塩基を認識する８つのＰＵＦモジュールを含有し、各モジュールが一塩基を認識する。各モジュール内の２つのアミノ酸側鎖は、対応する塩基のワトソン・クリック端を認識し、そのモジュールの特異性が決定されるので、ＰＵＦモジュールは、最大の８～１６ｎｔのＲＮＡに特異的に結合するように設計することができる。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００９； ６ （１１）： ８２５－８３０。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０６８６２７も参照されたい。
ＰＵＦ－ＲＮＡ相互作用のモジュール的性質は、ＰＵＦドメインの結合特異性を合理的に操作するために使用されている（Ｃｈｅｏｎｇ， Ｃ． Ｇ． ＆ Ｈａｌｌ， Ｔ． Ｍ． （２００６） ＰＮＡＳ １０３： １３６３５－１３６３９；Ｗａｎｇ， Ｘ． ｅｔ ａｌ （２００２） Ｃｅｌｌ １１０： ５０１－５１２）。しかし、アデニン、グアニンまたはウラシルを認識するモジュールを有するＰＵＦドメインの設計の成功しか、上掲のＷＯ２０１２／０６８２７の教示より前に報告されていない。野生型ＰｕｍＨＤは、シトシン（Ｃ）に結合しないが、分子操作によって、Ｐｕｍユニットの一部が良好な収率および特異性でＣに結合するように変異され得ることが示されている。例えば、Ｄｏｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｕｍｉｌｉｏ／ＦＢＦ （ＰＵＦ） ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８６， ２６７３２－２６７４２ （２０１１）を参照されたい。したがって、ＰｕｍＨＤは、ＲＮＡの任意の８塩基配列へのプログラム可能な結合を示す、ＷＴ Ｐｕｍｉｌｉｏタンパク質の改変バージョンである。ＰｕｍＨＤの８ユニットの各々は、４つ全てのＲＮＡ塩基に結合することができ、標的配列に隣接しているＲＮＡ塩基は、結合に影響を与えない。ＰＵＦ設計の当技術分野において認知されているＲＮＡ結合規則については以下の参考文献も参照されたい：Ｆｉｌｉｐｏｖｓｋａ Ａ， Ｒａｚｉｆ ＭＦ， Ｎｙｇａｒｄ ＫＫ， ＆ Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ． Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＰＵＦ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ， ７（７）， ４２５－４２７ （２０１１）；Ｆｉｌｉｐｏｖｓｋａ Ａ， ＆ Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ． Ｍｏｄｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ＰＵＦ， ＴＡＬＥ ａｎｄ ＰＰＲ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ， ８（３）， ６９９－７０８ （２０１２）；Ａｂｉｌ Ｚ， Ｄｅｎａｒｄ ＣＡ， ＆ Ｚｈａｏ Ｈ． Ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ＰＵＦ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＲＮＡ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ８（１）， ７ （２０１４）；Ｚｈａｏ Ｙ， Ｍａｏ Ｍ， Ｚｈａｎｇ Ｗ， Ｗａｎｇ Ｊ， Ｌｉ Ｈ， Ｙａｎｇ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｚ， ＆ Ｗｕ Ｊ． Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＰＵＦ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４６（９）， ４７７１－４７８２ （２０１８）；Ｓｈｉｎｏｄａ Ｋ， Ｔｓｕｊｉ Ｓ， Ｆｕｔａｋｉ Ｓ， ＆ Ｉｍａｎｉｓｈｉ Ｍ． Ｎｅｓｔｅｄ ＰＵＦ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ， １９（２）， １７１－１７６ （２０１８）；Ｋｏｈ ＹＹ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｑｉｕ Ｃ， Ｏｐｐｅｒｍａｎ Ｌ， Ｇｒｏｓｓ Ｌ， Ｔａｎａｋａ Ｈａｌｌ ＴＭ， ＆ Ｗｉｃｋｅｎｓ Ｍ． Ｓｔａｃｋｉｎｇ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＰＵＦ－ＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． ＲＮＡ， １７（４）， ７１８－７２７ （２０１１）。
しかるが故に、ヒトＰＵＭ１（１１８６個のアミノ酸）が、このタンパク質のＣ末端にＲＮＡ結合性ドメイン（ＲＢＤ）（Ｐｕｍｉｌｉｏ相同ドメインＰＵＭ－ＨＤアミノ酸８２８～アミノ酸１１７５としても公知）を含有すること、およびＰＵＦがヒトＰＵＭ１のＲＢＤに基づくことは、当技術分野において周知である。ＲＮＡ結合のための３６個のアミノ酸の８つのリピートモジュール（４３個のアミノ酸を有するモジュール７を除く）、ならびにタンパク質の構造および安定性に重要なフランキングＮまたはＣ末端領域がある。各モジュール内の、アミノ酸１２、１３および１６は、ＲＮＡ結合にとって重要であり、１２および１６がＲＮＡ塩基認識に関与する。アミノ酸１３は、ＲＮＡ塩基とスタックし、特異性および親和性を調整するために改変され得る。あるいは、ＰＵＦ設計は、ヒトＰＵＭ１のネイティブな残基としてアミノ酸１３を維持し得る。本明細書に開示されるＰＵＦ（ＣＵＧ）またはＰＵＭＢＹ（ＣＵＧ）組成物の一部の実施形態では、アミノ酸１３は（スタッキングのために）、Ｈで操作されることになり、他の実施形態では、Ｙで操作されることになる。一部の実施形態では、スタッキング残基は、結合および特異性を改善するために改変され得る。認識は、Ｎ末端からＣ末端へＰＵＦが３’から５’へＲＮＡを認識するのとは逆の配向で行われる。したがって、当技術分野において公知の８モジュール（８ＰＵＦ）のＰＵＦ操作は、ヒトタンパク質を模倣する。例示的な８－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（８ＰＵＦ）は、次のように設計されることになる：Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’。一実施形態では、８ＰＵＦは、ＲＢＤとして使用される。別の実施形態では、８ＰＵＦ設計のバリエーションが、１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＦ）ＲＢＤ、１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）ＲＢＤ、または１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）ＲＢＤを作出するために使用される。別の実施形態では、ＰＵＦは、４－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１１－ｍｅｒ、１２－ｍｅｒ、１３－ｍｅｒ、１４－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒ、１６－ｍｅｒ、２４－ｍｅｒ、３０－ｍｅｒ、３６－ｍｅｒ、またはその間の任意の数のモジュールを含むように操作され得る。Ｓｈｉｎｏｄａ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｃｒｉｓｃｕｏｌｏ ｅｔ ａｌ．， ２０２０。野生型ヒトＰＵＭ１のリピート１～８が、これをもって配列番号４６２～４６９でそれぞれ提供される。ヒトＰＵＭ１からのＰＵＦドメインをコードする核酸配列は、配列番号４７０であり、ヒトＰＵＭ１アミノ酸８２８～１１７６からのＰＵＦドメインのアミノ酸配列は、配列番号４７１である。その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許９，５８０，７１４も参照されたい。
本開示のガイドされないＲＮＡ結合性融合タンパク質の一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＵＭＢＹ（Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ）タンパク質である少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分を含む。ＲＮＡを標的とするためネイティブな形態および改変された形態で広く使用されているＲＮＡ結合性タンパク質ＰｕｍＨＤは、それぞれが１つのＲＮＡ塩基を標的とする４つの標準的なタンパク質モジュールのセットをもたらすように設計したタンパク質構造に操作されている。これらのモジュール（すなわち、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリに関してはＰｕｍｂｙ）を、所望の標的ＲＮＡに結合するように様々な組成および長さの鎖に連結される。本質的に、ＰＵＭＢＹは、ＰｕｍＨＤの単一のタンパク質ユニットが連結されて任意のサイズおよび結合性配列特異性のアレイになる、より単純なモジュール形態のＰｕｍＨＤである。そのようなＰｕｍｂｙ－ＲＮＡ相互作用の特異性は高く、Ｐｕｍｂｙ鎖の、標的配列から３つまたはそれよりも多くのミスマッチを有するＲＮＡ配列への結合は検出不可能である。Ｋａｔａｒｚｙｎａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ２０１６； １１３ （１９）： Ｅ２５７９－Ｅ２５８８。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０２３８５９３も参照されたい。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＰｕｍｉｌｉｏおよびＦＢＦ（ＰＵＦ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｐｕｍｉｌｉｏに基づくアセンブリ（ＰＵＭＢＹ）タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｅ１７などのヌクレアーゼドメインと融合している（配列番号３５８）。別の実施形態では、単一のベクターは、Ｅ１７（配列番号３５９）などのＺＣ３Ｈ１２Ａからのヌクレアーゼドメインと融合した、ｄＣａｓ１３ｄ ＲＮＡ結合性の系を含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質またはそのＲＮＡ結合性部分の少なくとも１つは、ＰＰＲタンパク質である。ＰＰＲタンパク質（植物に由来するペンタトリコペプチドリピート（ＰＰＲ）モチーフを有するタンパク質）は、核にコードされ、ＲＮＡレベルで、細胞小器官（葉緑体およびミトコンドリア）、切り取り（ｃｕｔｔｉｎｇ）、翻訳、スプライシング、ＲＮＡの編集、ＲＮＡ安定性に特異的に作用する遺伝子を排他的に制御する。ＰＰＲタンパク質は、一般には、３５アミノ酸のモチーフであり、ＰＰＲモチーフが約１０個の連続したアミノ酸である構造を有する。ＰＰＲモチーフの組合せをＲＮＡへの配列選択的結合に使用することができる。ＰＰＲタンパク質は、多くの場合、約１０リピートドメインのＰＰＲモチーフで構成される。ＰＰＲドメインまたはＲＮＡ結合性ドメインは、触媒として不活性になるように構成することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０５８４０４。
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、少なくとも２つのＲＮＡ結合性ポリペプチド間のリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、ＶＤＴＡＮＧＳ（配列番号４１１）である。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、トリペプチドＧＧＳの１つまたは複数のリピートを含む。他の実施形態では、リンカーは、非ペプチドリンカーである。一部の実施形態では、非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ｃｏ－ポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ結合活性のために多量体形成を必要としない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。一部の実施形態では、多量体タンパク質複合体は、ＲＮＡ結合性タンパク質を含まない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対して高い親和性を含まずそれに選択的に結合しない。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、終点を含めて、２アミノ酸から１３００アミノ酸の間を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質の少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、ＲＮＡ結合性タンパク質のＮ末端に位置する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＬＳをＣ末端に含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、第１のＮＬＳをコードする第１の配列および第２のＮＬＳをコードする第２の配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳは、ＲＮＡ結合性タンパク質のＮ末端に位置する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳをＣ末端に含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質は、ＮＥＳ（核外輸送シグナル）または他のペプチドタグまたは分泌シグナルをさらに含む。一部の実施形態では、タグは、ＦＬＡＧタグである。
一部の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質として少なくとも１つのＲＮＡ結合性タンパク質を含み、それと共に、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる第２のＲＮＡ結合性タンパク質を含む。
一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドのＣ末端において第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドのＮ末端において第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドに対して作動可能に構成されている。一実施形態では、例示的な融合タンパク質は、ＺＣ３Ｈ１２Ａとして公知のジンクフィンガーエンドヌクレアーゼであるまたはその短縮化が配列番号３５８で示される第２のＲＮＡ結合性タンパク質（Ｅ１７とも呼ばれる）と融合している、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹに基づく第１のＲＮＡ結合性タンパク質である。
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５４）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＭＢＹ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000061
 を含む。
一部の態様では、配列番号５４７は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５４７は、表１１で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000062
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５４）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＭＢＹ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000063
 を含む。一部の態様では、配列番号５４７は、Ｒ１’－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５４７は、表１２で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000064
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７３）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＭＢＹ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000065
 を含む。一部の態様では、配列番号５４８は、Ｒ１’－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５４８は、表１３で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000066
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７７）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＭＢＹ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000067
 を含む。一部の態様では、配列番号５５８は、Ｒ１’－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５５８は、表１４で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000068
ＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５３）を標的とする例示的な８－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（８ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000069
 を含む。一部の態様では、配列番号４４４は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４４４は、表１５で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000070
一部の実施形態では、本開示のＰＵＦタンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化された核酸配列である。一部の実施形態では、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、発現の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増加を示す。一部の実施形態では、本開示の８ＰＵＦタンパク質は、配列番号４５２を含む核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化８ＰＵＦとＥ１７ヌクレアーゼとを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４６０を含む。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、５’から３’へ、ｆｌａｇタグ、ＳＶ－４０核局在化配列、８ＰＵＦ、およびＥ１７ヌクレアーゼを含み、配列番号５１５で示される。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、５’から３’へ、ＳＶ－４０核局在化配列、８ＰＵＦおよびＥ１７ヌクレアーゼを含み、配列番号５１７で示される。一部の実施形態では、ＣＵＧ標的化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、５’から３’へ、８ＰＵＦ、およびＥ１７ヌクレアーゼを含み、配列番号５１６で示される。
一部の実施形態では、本開示のＰＵＦタンパク質をコードする核酸配列は、コドン最適化された核酸配列である。一部の実施形態では、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、翻訳の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増加を示す。
一部の態様では、配列番号４５２および５１５～５１７で提示されるものなどの、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、安定性の増大を示す。一部の態様では、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、耐加水分解性の増大によって安定性の増大を示す。一部の実施形態では、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、安定性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大を示す。一部の実施形態では、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された配列は、ヒト対象において、野生型のまたはコドン最適化されていない核酸配列と比べて、耐加水分解性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大を示す。
一部の態様では、配列番号４５２および５１５～５１７で提示されるものなどの、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ドナースプライス部位を含み得ない。一部の態様では、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、約１つ、または約２つ、または約３つ、または約４つ、または約５つ、または約６つ、または約７つ、または約８つ、または約９つ、または約１０以下のドナースプライス部位を含み得る。一部の態様では、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０少ない、ドナースプライス部位を含む。
理論により拘束されることを望まないが、コドン最適化された核酸配列におけるドナースプライス部位の除去は、隠れたスプライシングが防止されるので、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＵＦタンパク質の発現を予想外におよび予測不能に増加させることができる。さらに、隠れたスプライシングは、対象によって異なることがあり、これは、ドナースプライス部位を含むＰＵＦタンパク質の発現レベルが、予測不能に対象によって異なることがあることを意味する。ヒトの治療に関して、このような予測不能性は受入れ難い。それに応じて、ドナースプライス部位を欠いている配列番号４５２および５１５～５１７で提示されるコドン最適化された核酸配列は、予想外におよび驚くべきことに、ヒト対象におけるＰＵＦタンパク質の発現増加を可能にし、ＰＵＦタンパク質の発現をヒト対象の違いを超えて規則化する。
一部の態様では、配列番号４５２および５１５～５１７で提示されるものなどの、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列のＧＣ含量とは異なるＧＣ含量を有し得る。一部の態様では、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列のＧＣ含量は、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、核酸配列全体にわたってより均一に分布している。
理論により拘束されることを望まないが、核酸配列全体にわたってより均一にＧＣ含量を分布させることによって、コドン最適化された核酸配列は、転写物長にわたってより均一な融解温度（「Ｔｍ」）を示す。融解温度の均一性は、ポリメラーゼおよび／またはリボソームがあまり失速せずに核酸配列の転写および／または翻訳が起こるので、ヒト対象におけるコドン最適化された核酸の発現増加を予想外にもたらす。
一部の態様では、配列番号４５２および５１５～５１７で提示されるものなどの、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化されていない核酸配列と比較して、より少ない抑制的マイクロＲＮＡ標的結合性部位を有し得る。一部の態様では、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、コドン最適化されていない核酸配列、ＰＵＦタンパク質と比較して、少なくとも１つ、もしくは少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、もしくは少なくとも５つ、もしくは少なくとも６つ、もしくは少なくとも７つ、もしくは少なくとも８つ、もしくは少なくとも９つ、もしくは少なくとも１０の、または少なくとも１０少ない、抑制的マイクロＲＮＡ標的結合性部位を有し得る。
理論により拘束されることを望まないが、より少ない抑制的マイクロＲＮＡ標的結合性部位を有することによって、ＰＵＦタンパク質をコードするコドン最適化された核酸配列は、ヒト対象において発現の増加を予想外に示す。
一部の実施形態では、８ＰＵＦタンパク質は、
Figure 2023551874000071
 を含む核酸配列によってコードされ得る。
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５４）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000072
 を含む。一部の態様では、配列番号４４５は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４４５は、表１６で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000073
Figure 2023551874000074
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５４）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000075
 を含む。一部の態様では、配列番号４４６は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４４６は、表１７で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000076
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４５５）を標的とする例示的な１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000077
 を含む。一部の態様では、配列番号４４７は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４４７は、表１８で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000078
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４５５）を標的とする例示的な１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000079
 を含む。一部の態様では、配列番号４４８は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４４８は、表１９で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000080
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４５５）を標的とする例示的な１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000081
 を含む。一部の態様では、配列番号４６１は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４６１は、表２０で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000082
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４５６）を標的とする例示的な１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000083
 を含む。一部の態様では、配列番号４４９は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４４９は、表２１で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000084
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４５６）を標的とする例示的な１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000085
 を含む。一部の態様では、配列番号４５０は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４５０は、表２２で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000086
Figure 2023551874000087
ＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４５６）を標的とする例示的な１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000088
 を含む。一部の態様では、配列番号４５１は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４５１は、表２３で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000089
Figure 2023551874000090
ＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７２）を標的とする例示的な８－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（８ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000091
 を含む。一部の態様では、配列番号４８０は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４８０は、表２４で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000092
Figure 2023551874000093
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７３）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000094
 を含む。一部の態様では、配列番号４８１は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４８１は、表２５で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000095
Figure 2023551874000096
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７３）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000097
 を含む。一部の態様では、配列番号４８２は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４８２は、表２６で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000098
Figure 2023551874000099
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４７４）を標的とする例示的な１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000100
 を含む。一部の態様では、配列番号４８３は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４８３は、表２７で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000101
Figure 2023551874000102
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４７４）を標的とする例示的な１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000103
 を含む。一部の態様では、配列番号４８４は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４８４は、表２８で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000104
Figure 2023551874000105
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４７４）を標的とする例示的な１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000106
 を含む。一部の態様では、配列番号４８５は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４８５は、表２９で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000107
Figure 2023551874000108
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４７５）を標的とする例示的な１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000109
 を含む。一部の態様では、配列番号４８６は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４８６は、表３０で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000110
Figure 2023551874000111
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４７５）を標的とする例示的な１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000112
 を含む。一部の態様では、配列番号４８７は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４８７は、表３１で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000113
Figure 2023551874000114
ＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４７５）を標的とする例示的な１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000115
 を含む。一部の態様では、配列番号４８８は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号４８８は、表３２で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000116
Figure 2023551874000117
ＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４７６）を標的とする例示的な８－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（８ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000118
 を含む。一部の態様では、配列番号５４９は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５４９は、表３３で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000119
Figure 2023551874000120
ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４７７）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000121
 を含む。一部の態様では、配列番号５５０は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５５０は、表３４で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000122
Figure 2023551874000123
ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣ（配列番号４７７）を標的とする例示的な１４－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１４ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000124
 を含む。一部の態様では、配列番号５５１は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５５１は、表３５で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000125
Figure 2023551874000126
ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７８）を標的とする例示的な１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000127
 を含む。一部の態様では、配列番号５５２は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５５２は、表３６で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000128
Figure 2023551874000129
ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７８）を標的とする例示的な１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000130
 を含む。一部の態様では、配列番号５５３は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ７－－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５５３は、表３７で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000131
Figure 2023551874000132
ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵ（配列番号４７８）を標的とする例示的な１５－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１５ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000133
 を含む。一部の態様では、配列番号５５４は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５５４は、表３８で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000134
Figure 2023551874000135
ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４７９）を標的とする例示的な１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000136
 を含む。一部の態様では、配列番号５５５は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５５５は、表３９で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000137
ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４７９）を標的とする例示的な１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000138
 を含む。一部の態様では、配列番号５５６は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５５６は、表４０で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000139
ＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４７９）を標的とする例示的な１６－ｍｅｒ ＲＮＡ認識（１６ＰＵＦ）は、アミノ酸配列：
Figure 2023551874000140
 を含む。一部の態様では、配列番号５５７は、Ｒ１’－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｒ５－Ｒ６－Ｒ７－Ｒ８－Ｒ８’に従ってＮ末端からＣ末端に進むアーキテクチャを含む。一部の態様では、配列番号５５７は、表４１で詳細が明らかにされる配列で構成されている。
Figure 2023551874000141
一部の態様では、本開示の融合タンパク質は、配列番号４４４～４５１、４６１、４８０～４８８、５４７～５５８、５７０、または６３８～６４９によるＰＵＦを含む。一部の態様では、本開示の融合タンパク質は、配列番号４４４によるＰＵＦを含む。一部の態様では、本開示の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ：ヒトＮＬＳ配列、配列番号４４４によるＰＵＦ、リンカー配列、およびエンドヌクレアーゼを含む。一部の態様では、本開示の例示的な８ＰＵＦ標的化ＣＵＧ融合タンパク質は、表４２～５０のいずれか１つに収載されているエレメントに従ってＮ末端からＣ末端へ配列されている。一部の実施形態では、本開示の８ＰＵＦタンパク質を含むＣＵＧ標的化融合タンパク質は、配列番号５５９を含む。一部の実施形態では、本開示の１４ＰＵＦタンパク質を含むＣＵＧ標的化融合タンパク質は、配列番号５６０を含む。一部の実施形態では、本開示の１４ＰＵＦタンパク質を含むＣＵＧ標的化融合タンパク質は、配列番号５６１を含む。一部の実施形態では、本開示の１５ＰＵＦタンパク質を含むＣＵＧ標的化融合タンパク質は、配列番号５６２を含む。一部の実施形態では、本開示の１５ＰＵＦタンパク質を含むＣＵＧ標的化融合タンパク質は、配列番号５６３を含む。一部の実施形態では、本開示の１５ＰＵＦタンパク質を含むＣＵＧ標的化融合タンパク質は、配列番号５６７を含む。一部の実施形態では、本開示の１６ＰＵＦタンパク質を含むＣＵＧ標的化融合タンパク質は、配列番号５６５を含む。一部の実施形態では、本開示の１６ＰＵＦタンパク質を含むＣＵＧ標的化融合タンパク質は、配列番号５６６を含む。一部の実施形態では、本開示の１６ＰＵＦタンパク質を含むＣＵＧ標的化融合タンパク質は、配列番号５６７を含む。
Figure 2023551874000142
Figure 2023551874000143
Figure 2023551874000144
Figure 2023551874000145
Figure 2023551874000146
Figure 2023551874000147
Figure 2023551874000148
Figure 2023551874000149
Figure 2023551874000150
Figure 2023551874000151
Figure 2023551874000152
追加のＰＵＦ（ＣＵＧ）ＲＮＡ標的化組成物は、以下のとおりである：
エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする１６ＰＵＦＮ５
Figure 2023551874000153
 表Ｔ： 例示的な１６ＰＵＦ標的化ＣＵＧ融合タンパク質 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000154
 エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする１６ＰＵＦＮ６
Figure 2023551874000155
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000156
 エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする１６ＰＵＦＮ０
Figure 2023551874000157
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000158
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000159
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000160
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000161
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000162
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000163
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000164
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000165
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000166
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000167
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000168
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000169
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000170
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000171
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000172
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000173
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000174
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000175
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000176
 Ｃへの変異のスタッキングを伴う、エンドヌクレアーゼを伴うまたは伴わない、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000177
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000178
 エンドヌクレアーゼとともにまたはなしで使用するための、変異のスタッキングを伴う、ＣＵＧｆ３（ＤＭ１）を標的とする８ＰＵＦ
Figure 2023551874000179
 Ｎ末端からＣ末端への順序での導入遺伝子エレメントのアミノ酸配列 （遮断または＊切断）
Figure 2023551874000180
 ベクター
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを少なくとも１つ含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを１つまたは複数含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドＲＮＡを２つまたはそれよりも多く含む。一実施形態では、ベクターは、３つのガイドＲＮＡを含む。一実施形態では、ベクターは、４つのガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のガイドされるまたはガイドされないＲＮＡ結合性タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、本開示のＲＮＡ結合性融合タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質および第２のＲＮＡ結合性タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質とｇＲＮＡとを含む、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性の系は、単一のベクター内に存在する。特定の実施形態では、単一のベクターは、Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性の系、または触媒的に不活性化されているＣａｓ１３ｄ（ｄＣａｓ１３ｄ） ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性の系である、ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性の系を含む。一実施形態では、単一のベクターは、ＣａｓＲｘまたはｄＣａｓＲｘ ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性の系である、Ｃａｓ１３ｄ ＲＮＡによりガイドされるＲＮＡ結合性の系を含む。別の実施形態では、単一のベクターは、Ｅ１７（配列番号３５８）などのＺＣ３Ｈ１２Ａからのヌクレアーゼドメインと融合した、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹに基づくタンパク質を含む、ガイドされないＲＮＡ結合性の系を含む。別の実施形態では、単一のベクターは、Ｅ１７（配列番号３５８）などのＺＣ３Ｈ１２Ａからのヌクレアーゼドメインと融合した、ｄＣａｓ１３ｄ ＲＮＡ結合性の系を含む。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、第１のベクターが本開示のガイドＲＮＡを含み、第２のベクターが本開示のＲＮＡ結合性タンパク質またはＲＮＡ結合性融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを少なくとも１つ含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを１つまたは複数含む。一部の実施形態では、第１のベクターは、本開示のガイドＲＮＡを２つまたはそれよりも多く含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、第１のＲＮＡ結合性タンパク質と第２のＲＮＡ結合性タンパク質とを含む。一部の実施形態では、第１のベクターと第２のベクターは同一のベクターまたはベクター血清型である。一部の実施形態では、第１のベクターと第２のベクターは同一ではないベクターまたはベクター血清型である。本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、毒性ＣＵＧ ＲＮＡリピートを標的とすることができるＲＮＡ結合性の系は、単一のベクター内に存在する。
１つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、プラスミドは、追加のＤＮＡセグメントが、例えば標準的な分子クローニング技法により、挿入され得る、環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損型アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためのベクター内に存在する、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルス（例えば、組込み欠損型レンチウイルスベクター）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ベクター、例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターなどは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができ、エピソーム哺乳動物ベクター、および他のベクター、例えば非エピソーム哺乳動物ベクターなどは、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。
一部の実施形態では、ベクター、例えば、発現ベクターなどは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。一般的な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、本明細書において提供される核酸、例えば、ＤＮＡ配列から発現され得るガイドＲＮＡ、およびＣａｓ １３ｄタンパク質をコードする核酸などを、宿主細胞におけるタンパク質の発現に好適な形態で含む。組換え発現ベクターは、発現に使用されることになる宿主細胞に基づいて選択され得る１つまたは複数の調節エレメントであって、発現されることになる核酸配列に作動可能に連結されている調節エレメントを含む。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結されている」は、目的のヌクレオチド配列が、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入されたときに宿主細胞において、などにおいて、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、調節エレメントに連結されていることを意味するように意図されている。ベクターのある特定の実施形態は、形質転換されることになる宿主細胞の選択、および所望される発現レベルなどの、因子に依存する。ベクターを宿主細胞に導入して、それによって、例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物、タンパク質、酵素、その変異体形態、その融合タンパク質などのような、本明細書に記載の核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む、転写物、タンパク質、またはペプチドを産生することができる。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製能力がない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、単離されたものまたは組み換えられたものである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的である。
用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、本明細書で使用される場合、この名前に関連するウイルスの綱のメンバーであって、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属に属するメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能がヘルパーウイルスの同時感染により提供される細胞において成長する一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶの一般的な情報および総説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ， １９８９， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ， Ｖｏｌ． １， ｐｐ． １６９－ ２２８、およびＢｅｒｎｓ， １９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ｐｐ． １７４３－１７６４， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において見つけることができる。これらの総説に記載されている同じ原理が、これらの総説の発表日後に特徴付けられた追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることは、十分に予想される。なぜなら、多様な血清型が、構造的にも機能的にも、さらには遺伝子レベルで、非常に密接に関連していることは周知であるからである。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ， １９８８， ｐｐ． １６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｊ． Ｒ． Ｐａｔｔｉｓｏｎ， ｅｄ．；およびＲｏｓｅ， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３： １－６１ （１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子により媒介される非常に類似した複製特性を示すようであり、全てが、３つの関連カプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２に発現されるものを有する。この類似度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の過度の交差ハイブリダイゼーションを明示するヘテロ二本鎖解析；および「末端逆位反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在によってさらに示唆される。類似した感染力パターンも、各血清型における複製機能が、類似した調節制御下にあることを示唆する。このウイルスの複数の血清型は、遺伝子送達に好適であることが公知であり、あらゆる公知血清型が、種々の組織型からの細胞に感染し得る。
ＡＡＶは、そのＡＡＶを、例えば遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するベクターとして魅力的なものにする、独特の特徴を有する。培養下の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染は、無症状および無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的とする可能性が認められる。さらに、ＡＡＶは、分裂および非分裂細胞に緩徐に形質導入し、本質的にこれらの細胞の寿命にわたって転写活性核エピソーム（染色体外エレメント）として存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド内にクローン化ＤＮＡとして挿入され、そのため組換えゲノムの構築が実現可能になる。さらに、ＡＡＶの複製およびゲノムカプシド封入を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されているため、ＡＡＶベクターを生成するために内部のおおよそ４．３ｋｂのゲノム（複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐ、をコードする）の一部または全てを外来ＤＮＡに置き換えることができる。ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をｉｎ ｔｒａｎｓで提供することができる。ＡＡＶのもう１つの有意な特徴は、極めて安定している丈夫なウイルスであることである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃、数時間）にたやすく耐え、そのためＡＡＶの低温保存があまり重要でなくなる。ＡＡＶを凍結乾燥させることさえできる。最終的に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に対して耐性がない。
本発明のＡＡＶ（ｒＡＡＶまたはＡＡＶベクター）ゲノムは、ＣＵＧリピート標的化組成物（例えば、ＰＵＦ、ＰＵＭＢＹ、またはＲＮＡによりガイドされるタンパク質）をコードする核酸分子、およびその核酸分子に隣接している１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。偽型ＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ２００１０８３６９２において開示されている。他のタイプのＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも、企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２２（１１）： １９００－１９０９ （２０１４）を参照されたい。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当技術分野において公知である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２のＡＡＶから単離されるまたはそれに由来する、末端逆位反復配列またはカプシド配列を含む。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、改変されたカプシドを含む。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２－Ｔｙｒ変異体ベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、非チロシンアミノ酸が、野生型ＡＡＶ２の位置Ｔｙｒ２５２、Ｔｙｒ２７２、Ｔｙｒ２７５、Ｔｙｒ２８１、Ｔｙｒ５０８、Ｔｙｒ６１２、Ｔｙｒ７０４、Ｔｙｒ７２０、Ｔｙｒ７３０またはＴｙｒ６７３の表面露出チロシン残基に対応する位置にある、カプシドを含む。その全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／１２４７２４も参照されたい。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、操作されたカプシドを含む。操作されたカプシドを含むＡＡＶベクターとしては、限定することなく、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ９．７ｍ８、ＡＡＶ２ ２ｔＹＦ、およびＡＡＶ８ Ｙ７３３Ｆ）が挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製能力がない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、単離されたものまたは組み換えられたもの（ｒＡＡＶ）である。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示のベクターは、非ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ナノ粒子、ミセル、リポソームまたはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックスまたはデンドリマーを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組換え発現系である。本明細書で使用される場合、「組換え発現系」という用語は、組換えによって形成されたある特定の遺伝子材料を発現させるための遺伝子構築物を指す。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に提示される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、これだけに限定することなく、発現制御エレメントを含む。「発現制御エレメント」は、本明細書で使用される場合、遺伝子などのコード配列の発現を調節する任意の配列を指す。例示的な発現制御エレメントとしては、これだけに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、マイクロＲＮＡ、転写後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル配列、およびイントロンが挙げられる。発現制御エレメントは、例えば、構成的、誘導性、抑制性、または組織特異的であり得る。「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節性タンパク質および分子が結合することができる遺伝子エレメントを含有し得る。一部の実施形態では、プロモーターによる発現制御は、組織特異的である。一部の実施形態では、プロモーターによる発現制御は、構成的または遍在性である。非限定的な例示的なプロモーターとしては、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばＵ６およびＨ１プロモーターなど、ならびに／またはＰｏｌ ＩＩプロモーター、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ（必要に応じて、ＣＭＶエンハンサーを含む）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを含む）、ＣＢＡ（ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン）、ＣＡＧ（ニワトリβ－アクチンと融合したハイブリッドＣＭＶエンハンサー）、短縮化ＣＡＧ、Ｃｂｈ（ハイブリッドＣＢＡ）、ＥＦ－１ａ（ヒト伸長因子アルファ－１）またはＥＦＳ（短い、イントロン不含の、ＥＦ－１アルファ）、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）、ＵＢＣ（ユビキチンＣ）、ＧＵＳＢ（リソソーム酵素ベータ－グルクロニダーゼ）、ＵＣＯＥ（遍在性クロマチンオープニングエレメント）、ｈＡＡＴ（アルファ－１アンチトリプシン）、ＴＢＧ（チロキシン結合性グロブリン）、デスミン（全長または短縮化）、ＭＣＫ（筋クレアチンキナーゼ）、Ｃ５－１２（合成筋プロモーター）、ＣＫ８ｅ（クリアチンキナーゼ８）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、シナプシン、シナプシン－１（ＳＹＮ－１）、オプシン、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＰＤＧＦ－Ａ、ＭｅｃＰ２（メチルＣｐＧ結合性タンパク質２）、ＣａＭＫＩＩ（カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ）、ｍＧｌｕＲ２（代謝型グルタミン酸受容体２）、ＮＦＬ（ニューロフィラメント軽鎖）、ＮＦＨ（ニューロフィラメント重鎖）、ｎβ２、ＰＰＥ（ラットプレプロエンケファリン）、ＥＮＫ（プレプロエンケファリン）、プレプロエンケファリン－ニューロフィラメントキメラプロモーター、ＥＡＡＴ２（グルタミン酸輸送体）、ＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性タンパク質）、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）、ヒトロドプシンキナーゼプロモーター（ｈＧＲＫ１）、β－アクチンプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ＭＨＣＫ７（筋クレアチンキナーゼおよびアルファミオシン重鎖遺伝子のエンハンサー／プロモーター領域のハイブリッドプロモーター）、ならびにこれらの組合せが挙げられる。「エンハンサー」は、活性化タンパク質が結合して転写の尤度または頻度を増加させることができる、ＤＮＡの領域である。非限定的な例示的なエンハンサーおよび転写後調節エレメントとしては、ＣＭＶエンハンサー、ＭＣＫエンハンサー、ＨＴＬＶ－１のＬＴＲ内のＲ－Ｕ５’セグメント、ＳＶ４０エンハンサー、ウサギβ－グロビンのエクソン２と３の間のイントロン配列、ならびにウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が挙げられる。一部の実施形態では、イントロン、例えば、ＵＢＢイントロンは、プロモーター活性を増強するために使用される。一部の実施形態では、ＵＢＢイントロンは、ＥＦＳプロモーターとともに使用される。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本明細書に提示される発現ベクター、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、これだけに限定することなく、「マルチシストロン性」または「ポリシストロン性」または「バイシストロン性」または「トリシストロン性」構築物の配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）のためのＩＲＥＳまたは２Ａペプチド部位を含む、すなわち、二重もしくは三重もしくは多重のコード領域またはエクソンなどのベクターエレメントを有し、したがって、単一の構築物から、ｍＲＮＡから２つまたはそれよりも多くのタンパク質を発現させる能力を有する。マルチシストロン性ベクターは、同じｍＲＮＡから２つまたはそれよりも多くの別々のタンパク質を同時に発現させる。マルチシストロン性配置を構築するために最も広く使用されている２つの戦略は、ＩＲＥＳまたは２Ａ自己切断部位を使用することである。「ＩＲＥＳ」は、ポリシストロニックベクター構築物に使用される、ウイルス、原核生物、または真核生物を起源とする配列内リボソーム進入部位またはその一部を指す。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、キャップ依存的に翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。「自己切断ペプチド」または「自己切断ペプチドをコードする配列」または「２Ａ自己切断部位」という用語は、リボソームスキッピングを促進するため、したがって、単一のプロモーターから２つのポリペプチドを生成するための部位を組み入れるためにベクター構築物内に使用される連結配列を指す。そのような自己切断ペプチドとしては、これだけに限定することなく、Ｔ２Ａペプチド、およびＰ２Ａペプチドまたは自己切断ペプチドをコードする配列が挙げられる。
一実施形態では、例示的なベクター構成は、図４Ａ～４Ｃに示される。例示的なベクター構成は、ＣＵＧ標的化ＰＵＦ－エンドヌクレアーゼ融合体をコードする核酸の発現を駆動する、プロモーターまたは調節配列（プロモーター／エンハンサーの組合せ）を含む。別の実施形態では、ベクター構成は、ＲＮＡによりガイドされるＣａｓ ＲＮａｓｅ ＲＮＡ結合性タンパク質の発現を駆動するプロモーター、または同族ｇＲＮＡの発現を駆動する第２のプロモーターと作動可能に連結しているｄＣａｓタンパク質融合体を含む。別の実施形態では、ベクター構成は、リンカーおよび１つまたは複数のタグを含む。
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、またはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルス／レトロウイルスキメラベクター、単純ヘルペスウイルスＩもしくはＩＩベクター、パルボウイルスベクター、細網内皮症ウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、乳頭腫ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または２つまたはそれよりも多くのウイルスベクターの好都合な側面が組み入れられた任意のハイブリッドもしくはキメラベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結した１つまたは複数の発現制御エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の選択マーカーをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは低毒性を有する。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは宿主ゲノム内に組み入れられず、それにより、挿入変異誘発が引き起こされる確率が低くなる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、４．５ｋｂから４．７５ｋｂまでの範囲の総ポリヌクレオチドをコードし得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、系、方法、およびキットのいずれかに使用することができる例示的なＡＡＶベクターとしては、ＡＡＶ１ベクター、改変ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、改変ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ２－Ｔｙｒ変異体ベクター、ＡＡＶ３ベクター、改変ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、改変ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、改変ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、改変ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、改変ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ１０ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ３２／３３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、改変ＡＡＶ．ｒｈ４３ベクター、ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクター、ＡＡＶ－Ｔｙｒ変異体ベクター、および改変ＡＡＶ．ｒｈ６４Ｒ１ベクターおよび任意の組合せまたはその等価物を挙げることができる。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼコンピテントレンチウイルスベクター（ＩＣＬＶ）である。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、導入遺伝子プラスミドベクターならびに関連するプラスミド（例えば、パッケージングプラスミド、ｒｅｖ発現プラスミド、エンベローププラスミド）と併せた導入遺伝子プラスミドベクターならびにウイルスまたはウイルス様侵入機構によって外因性核酸を細胞に導入することができるレンチウイルスに基づく粒子を指し得る。レンチウイルスベクターは、当技術分野で周知である（例えば、Ｔｒｏｎｏ Ｄ． （２００２） Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｓｐｒｉｎｇ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇおよびＤｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｖｉｒｕｓｅｓ ３ （２）： １３２－１５９ ｄｏｉ： １０．３３９０／ｖ３０２０１３２を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、系、方法、およびキットのいずれかに使用することができる例示的なレンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１ベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、改変ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２ベクター、スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＳＭ）ベクター、改変スーティーマンガベイサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＳＭ）ベクター、アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＡＧＭ）ベクター、改変アフリカミドリザルサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶＡＧＭ）ベクター、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、改変ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、改変ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、改変ビスナ／マエディウイルス（ＶＮＶ／ＶＭＶ）ベクター、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、改変ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベクター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、または改変ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を挙げることができる。
核酸
本明細書に記載の遺伝子移入および発現技法における使用のための、本明細書に開示されるＲＮＡ結合性ＣＵＧリピート標的化系をコードする核酸配列が本明細書に提示される。必ずしも明記されていないが、本明細書に提示される配列を使用して、同じ生物学的性質を有するタンパク質を生じさせる発現産物ならびに実質的に同一の配列をもたらすことができることが理解されるべきである。これらの「生物学的に等価の」または「生物活性ある」または「等価の」ポリペプチドは、本明細書に記載の等価のポリヌクレオチドによってコードされる。これらは、デフォルトの条件下で実行される配列同一性方法を使用して比較した場合に、参照ポリペプチドに対して少なくとも６０％、あるいは少なくとも６５％、あるいは少なくとも７０％、あるいは少なくとも７５％、あるいは少なくとも８０％、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも９０％、あるいは少なくとも９５％あるいは少なくとも９８％同一の一次アミノ酸配列を有することができる。特定の実施形態の例として特定のポリペプチド配列が提示されている。同様の電荷を有する代替のアミノ酸を用いたアミノ酸への配列の改変。さらに、等価のポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドもしくはその相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドである、またはポリペプチドに関しては、参照コードポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。あるいは、等価のポリペプチドまたはタンパク質は、等価のポリヌクレオチドから発現されるものである。
本明細書に開示される核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）は、当技術分野で周知の技法であるコドン最適化がなされたものであり得る。本明細書に開示される一部の実施形態では、例えば配列番号９２（ＣａｓＲｘとして公知のＣａｓ１３ｄ）をコードする核酸配列または配列番号２９８（ＣａｓＲｘとして公知のＣａｓ１３ｄ）をコードする核酸配列などの例示的なＣａｓ配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。コドン最適化は、異なる細胞では特定のコドンの使用が異なるという事実を指す。このコドンの偏りは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的な存在量の偏りに対応する。配列内のコドンを対応するｔＲＮＡの相対的な存在量と釣り合うように変更することにより、発現を増加させることが可能である。対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが分かっているコドンを故意に選択することによって発現を低減させることも可能である。哺乳動物細胞に関して、ならびに種々の他の生物体に関してコドン使用表が当技術分野で公知である。遺伝暗号に基づいて、例えばＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を生成することができる。一部の実施形態では、そのような配列を、例えば、Ｃａｓタンパク質を発現する宿主細胞または開示されている方法が実施される細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞など）を使用するなど、宿主または標的細胞における発現に関して最適化する。特定の種についてのコドンの選好およびコドン使用表を使用して、その特定の種のコドン使用選好性（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を活用する、Ｃａｓタンパク質をコードする単離された核酸分子（例えば、その対応する野生型タンパク質に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列同一性を有するタンパク質をコードするものなど）を操作することができる。例えば、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質を、目的の特定の生物体によって優先的に使用されるコドンを有するように設計することができる。一実施例では、Ｃａｓ核酸配列は、例えば、その対応する野生型または起源核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有するものなど、ヒト細胞における発現に関して最適化されたものである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＣａｓタンパク質（ベクターの一部であり得る）をコードする単離された核酸分子は、真核細胞における発現に関してコドン最適化された少なくとも１つのＣａｓタンパク質コード配列、またはヒト細胞における発現に関してコドン最適化された少なくとも１つのＣａｓタンパク質コード配列を含む。一実施形態では、そのようなコドン最適化されたＣａｓコード配列は、その対応する野生型または起源配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列同一性を有する。別の実施形態では、真核細胞のコドン最適化された核酸配列は、その対応する野生型または起源タンパク質に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列同一性を有するＣａｓタンパク質をコードする。別の実施形態では、配列は異なるが同じＣａｓタンパク質配列をコードする核酸などの、機能的に等価の核酸を含有する種々のクローンを常套的に生成することができる。コード配列内のサイレント変異は、１つよりも多くのコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る遺伝暗号の縮退（すなわち、重複性）に起因する。したがって、例えば、ロイシンはＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによってコードされ得る；セリンはＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣによってコードされ得る；アスパラギンはＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされ得る；アスパラギン酸はＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされ得る；システインはＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされ得る；アラニンはＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、またはＧＣＧによってコードされ得る；グルタミンはＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされ得る；チロシンはＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされ得る；およびイソロイシンはＡＴＴ、ＡＴＣ、またはＡＴＡによってコードされ得る。標準の遺伝暗号を示す表は、種々の供給源に見いだすことができる（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ， １９８８， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３．ｓｕｐ．ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗ．Ｈ． ５ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， ＮＹを参照されたい）。
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン結合、または任意の他の配列特異的様式で存在する。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多重鎖複合体を形成する３つまたはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などのより広範囲にわたるプロセスのステップを構成し得る。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約２５℃～約３７℃；ハイブリダイゼーション緩衝液濃度、約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約０％～約２５％；および洗浄溶液、約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣが挙げられる。中程度のハイブリダイゼーション条件の例としては、インキュベーション温度、約４０℃～約５０℃；緩衝液濃度、約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約３０％～約５０％；および洗浄溶液、約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣが挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、インキュベーション温度、約５５℃～約６８℃；緩衝液濃度、約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度、約５５％～約７５％；および洗浄溶液、約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は５分間から２４時間までであり、１回、２回、またはそれよりも多くの洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１分間、２分間、または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用したＳＳＣの等価物を使用することができることが理解される。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のためにアラインメントすることができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列内の位置を同じ塩基またはアミノ酸が占めている場合、その分子は、その位置において相同である。配列間の相同性程度は、それらの配列が共有するマッチするまたは相同な位置の数に応じる。「関連しない」または「非相同的」配列は、本発明の配列の１つと４０％未満の同一性あるいは２５％未満の同一性を共有する。
細胞
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、原核細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ウシ類、ネズミ類、ネコ類、ウマ類、ブタ類、イヌ類、サル類、またはヒトの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非ヒト霊長類細胞などの非ヒト哺乳動物細胞である。
一部の実施形態では、本開示の細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、生殖細胞系列細胞である。一部の実施形態では、本開示の生殖細胞系列細胞は、ヒト細胞ではない。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、胚性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の胚性幹細胞は、ヒト細胞ではない。一部の実施形態では、本開示の細胞は、複能性幹細胞または多能性幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、成体幹細胞である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、本開示の細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、筋肉細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、筋芽細胞または筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞または平滑筋細胞である。一部の実施形態では、本開示の筋肉細胞は、線条細胞である。一実施形態では、本明細書に開示される組成物で処置される患者の細胞（単数または複数）としては、限定することなく、骨格筋（発達中のおよび成熟した筋肉線維およびサテライト細胞）、神経筋接合部、心筋細胞、平滑筋細胞、末梢神経系（ニューロン）、末梢運動ニューロン、および／または感覚ニューロンが挙げられる。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、上皮細胞である。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、線維芽細胞、扁平上皮細胞、立方上皮細胞、円柱上皮細胞、重層上皮細胞、多列円柱上皮細胞または移行上皮細胞を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、松果体、胸腺、下垂体、甲状腺、副腎、アポクリン腺、ホロクリン腺、部分分泌腺、漿液腺、粘液腺および脂腺を含めた腺を形成する。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、これだけに限定されないが、肺、脾臓、胃、膵臓、膀胱、腸、腎臓、胆嚢、肝臓、喉頭または咽頭を含めた器官の外表面と接触している。一部の実施形態では、本開示の上皮細胞は、血管または静脈の外表面と接触している。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、初代細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、培養細胞である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の体細胞は、自家細胞または同種異系細胞である。
使用方法
本開示は、本開示のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示の組成物とＲＮＡ分子をガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合性タンパク質またはＲＮＡ結合性融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数がＲＮＡ分子に結合するのに適した条件下で接触させることを含む方法を提供する。
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示の組成物とＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子へのガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数の結合に好適な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、本開示のＲＮＡ分子の発現またはそのＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示の組成物とＲＮＡ分子を含む細胞とを、ＲＮＡ分子へのガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数の結合に好適な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、本開示の組成物は、本開示のガイドＲＮＡと本開示のＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質とを含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示の組成物とＲＮＡ分子を含む細胞とを、ＲＮＡ分子へのガイドＲＮＡまたはＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質（またはその一部）の１つまたは複数の結合に好適な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、本開示のＲＮＡ分子の発現またはそのＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示の組成物とＲＮＡ分子を、ＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質がＲＮＡ分子の破壊（ｂｒｅａｋ）を誘導するＲＮＡヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、本開示の組成物とＲＮＡ分子を、ＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質がＲＮＡ分子の破壊を誘導するＲＮＡヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。
本開示は、本開示のＲＮＡ分子の発現またはそのＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の発現のレベルを改変する方法であって、本開示の組成物とＲＮＡ分子を含む細胞とを、ＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質がＲＮＡ分子の破壊を誘導するＲＮＡヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡと本開示のＲＮＡ結合性融合タンパク質とを含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。
本開示は、ＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質の活性を改変する方法であって、組成物とＲＮＡ分子を含む細胞とを、ＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質がＲＮＡ分子の破壊を誘導するＲＮＡヌクレアーゼ活性に好適な条件下で、接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕにある。一部の実施形態では、組成物は、本開示のガイドＲＮＡまたは単一ガイドＲＮＡおよび本開示のＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物を含むベクターを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶである。
本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を治療有効量で投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＤＭ１を処置する方法を提供する。
本開示は、ＤＭ１の処置を、そのような処置を必要とする患者において行う方法であって、本開示の組成物の治療有効量を患者に投与するステップを含み、組成物が、本開示のガイドＲＮＡを含むベクターと、本開示のＲＮＡ結合性タンパク質またはＲＮＡ結合性タンパク質融合タンパク質をコードする核酸配列とを含み、組成物が、毒性ＣＵＧリピートＲＮＡの発現のレベルを（非標的化（ＮＴ）対照で処置された毒性ＣＵＧリピートＲＮＡの発現のレベルと比較して、または無処置と比較して）改変する、低下させる、破壊する、下げるまたはより小さくする、方法を提供する。一実施形態では、標的毒性ＣＵＧリピートＲＮＡのまたは標的ＲＮＡによりコードされる毒性リピートの低減のレベルが、ＲＣａｓ９系で処置されたときの標的ＲＮＡのまたは標的ＲＮＡによりコードされる毒性リピートの低減のレベルと比較される。別の実施形態では、低減のレベルは、１倍である、またはそれより大きい。別の実施形態では、低減のレベルは、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍である。別の実施形態では、低減のレベルは、１０倍である、またはそれより大きい。別の実施形態では、低減のレベルは、１０倍～２０倍の間である。別の実施形態では、低減のレベルは、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍である。別の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子治療用組成物は、ＤＭ１患者に投与されたとき、毒性ＣＵＧリピートＲＮＡの２０％～１００％分解（または消失）をもたらす。一実施形態では、毒性ＣＵＧリピートＲＮＡの％消失は、２０～９９％、２５％～９９％、５０％～９９％、８０％～９９％、９０％～９９％、９５％～９９％のいずれかである。一実施形態では、％消失は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。別の実施形態では、％消失は、毒性ＣＵＧリピートＲＮＡの完全消失または１００％消失である。
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、処置されることになる患者の疾患または障害としては、限定することなく、ＣＴＧマイクロサテライトリピート伸長の発現に関連する疾患または障害が挙げられる。一部の実施形態では、疾患または障害は、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧマイクロサテライトリピート伸長に関連する。本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、本開示の疾患または障害は、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、ＤＭ１の診断を受けている。一部の実施形態では、本開示の対象は、ＤＭ１についての少なくとも１つの徴候または症状を示している。少なくとも１つのＤＭ１徴候またはＤＭ１症状は、限定することなく、筋強直、筋萎縮、集中した筋核、筋力回復、ＧＩ苦痛、心伝導障害、嚥下障害、呼吸容量を含む。一実施形態では、ＤＭ１についての少なくとも１つの徴候または症状は、本明細書に開示される組成物での処置により好転する。一部の実施形態では、対象は、ＤＭ１が発生するリスクが予測されるバイオマーカーを有する。一部の実施形態では、バイオマーカーは、遺伝子変異である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、女性である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、男性である。一部の実施形態では、本開示の対象は、２つの染色体ＸＸまたはＸＹを有する。一部の実施形態では、本開示の対象は、２つの染色体ＸＸまたはＸＹおよび第３の染色体、ＸまたはＹのいずれかを有する。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、新生児、乳児、小児、成人、年配成人、または高齢成人である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１日齢、２日齢、３日齢、４日齢、５日齢、６日齢、７日齢、８日齢、９日齢、１０日齢、１１日齢、１２日齢、１３日齢、１４日齢、１５日齢、１６日齢、１７日齢、１８日齢、１９日齢、２０日齢、２１日齢、２２日齢、２３日齢、２４日齢、２５日齢、２６日齢、２７日齢、２８日齢、２９日齢、３０日齢または３１日齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１カ月齢、２カ月齢、３カ月齢、４カ月齢、５カ月齢、６カ月齢、７カ月齢、８カ月齢、９カ月齢、１０カ月齢、１１カ月齢または１２カ月齢である。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、少なくとも１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳、９０歳、９５歳、１００歳またはその間の任意の年齢または部分年齢である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、本開示の対象は、非ヒト哺乳動物である。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の対象は、ヒトである。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、単回用量の本開示の組成物を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、少なくとも１用量の本開示の組成物を含む。一部の実施形態では、治療有効量は、１用量または複数用量の本開示の組成物を含む。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状を排除するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害を排除するものである。
本開示の方法の一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を防止するものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の発症を遅延させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患または障害の徴候または症状の重症度を低下させるものである。一部の実施形態では、治療有効量は、対象の予後を改善するものである。
本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に筋肉内投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に筋肉内経路によって投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に注射または注入によって投与される。一部の実施形態では、組成物は、全身に投与される。本開示の方法の一部の実施形態では、本開示の組成物は、対象に局所的に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物を医薬組成物として製剤化する。簡単に述べると、本明細書に開示される使用のための医薬組成物は、必要に応じて免疫直交性でもある、タンパク質（複数可）または必要に応じてＡＡＶ内に含められたタンパク質（複数可）をコードするポリヌクレオチドを、１つまたは複数の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本開示の組成物を、例えば、経口、経腸、局部、経皮、鼻腔内および／または吸入投与経路などの、投与経路用に、ならびに例えば、静脈内、筋肉内、軟膜下、くも膜下、線条体内、皮下、皮内、腹腔内、腫瘍内、静脈内、眼内および／または非経口投与などの、注射または注入による投与経路用に、製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
実施形態例：
実施形態１．哺乳動物における筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を処置する方法であって、哺乳動物の組織における毒性標的ＣＵＧマイクロサテライトリピート伸長（ＭＲＥ）分子に組成物を投与するステップを含み、組成物が、天然に存在しないまたは操作された、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）系をコードする核酸配列を含み、核酸配列が、（ａ）少なくとも１つの、ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質（またはｄＣａｓタンパク質）と、（ｂ）少なくとも１つのＣａｓタンパク質の１つと複合体を形成することができる少なくとも１つの同族ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含み、ｇＲＮＡが、（ｉ）ＤＲ配列および（ｉｉ）スペーサー配列を含み、スペーサー配列が、標的ＣＵＧ ＭＲＥ分子とハイブリダイズし、それによって、組成物により形成された複合体が、標的ＣＵＧ ＭＲＥ分子を直接標的とし、それを分解または遮断し、その結果、哺乳動物におけるＤＭ１が処置される方法。
実施形態２：スペーサー配列が、ａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇ（配列番号４５７）、ｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃ（配列番号４５８）、およびｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａ（配列番号４５９）からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、いずれかの前記実施形態に記載の方法。
実施形態３：組成物が、静脈内投与によって哺乳動物の組織に投与される、いずれかの前記実施形態に記載の方法。
実施形態４：ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、およびそのＲＮＡ結合性部分からなる群から選択される、いずれかの前記実施形態に記載の方法。
実施形態５：ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１３ｄまたはそのＲＮＡ結合性部分である、いずれかの前記実施形態に記載の方法。
実施形態６：ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質が、不活性化されている（ｄＣａｓ）、いずれかの前記実施形態に記載の方法。
実施形態７：Ｃａｓ１３ｄが、配列番号５２２、５３０、５３５、５３８、または５４０のいずれか１つで示される核酸配列によってコードされる、いずれかの前記実施形態に記載の方法。
実施形態８：ｄＣａｓタンパク質が、エンドヌクレアーゼに連結されている、いずれかの前記実施形態に記載の方法。
実施形態９：エンドヌクレアーゼが、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである、いずれかの前記実施形態に記載の方法。
実施形態１０：ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーヌクレアーゼが、配列番号３５８または配列番号３５９で示されるアミノ酸配列を含む、いずれかの前記実施形態に記載の方法。
実施形態１１：天然に存在しないまたは操作された、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）系をコードする核酸配列を含む組成物であって、前記核酸配列が、（ａ）少なくとも１つの、ＲＮＡによりガイドされるＲＮｓｅ Ｃａｓタンパク質と、ｂ）少なくとも１つのＣａｓタンパク質の１つと複合体を形成することができる少なくとも１つの同族ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを含み、ｇＲＮＡが、（ｉ）ＤＲ配列および（ｉｉ）スペーサー配列を含み、スペーサー配列が、標的ＣＵＧ ＭＲＥ分子とハイブリダイズし、スペーサー配列が、ａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇ（配列番号４５７）、ｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃ（配列番号４５８）、およびｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａｇｃａ（配列番号４５９）からなる群から選択されるスペーサー配列またはその一部を含む、組成物。
実施形態１２：いずれかの前記実施形態に記載の組成物を含む、ＡＡＶベクター。
実施形態１３：ＡＡＶ９ベクターである、いずれかの前記実施形態に記載のＡＡＶベクター。
実施形態１４：哺乳動物における筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を処置する方法であって、哺乳動物の組織における毒性標的ＣＵＧマイクロサテライトリピート伸長（ＭＲＥ）分子に組成物を投与するステップを含み、組成物が、ａ）毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列に結合することができるＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合性配列であって、毒性標的ＣＵＧリピート配列がＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５３）を含む、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合性配列と、ｂ）毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列を切断することができるエンドヌクレアーゼとを含むガイドされないＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、それによって毒性標的ＲＮＡの発現レベルが低下される、方法。
実施形態１５：組成物の投与が、静脈内投与による、いずれかの前記実施形態に記載の実施形態。
実施形態１６：ＤＭ１を有する哺乳動物の組織における毒性ＣＵＧマイクロサテライトリピート伸長（ＭＲＥ）ＲＮＡを消失させる方法であって、ＣＵＧ ＭＲＥ ＲＮＡ配列を、組成物と、ＣＵＧ ＭＲＥ ＲＮＡへの組成物の結合に好適な条件下で接触させるステップを含み、組成物が、ａ）ＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５３）を含む毒性標的配列に結合することができるＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ ＲＮＡ結合性配列と、ｂ）毒性標的ＲＮＡ配列を切断することができるエンドヌクレアーゼとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含み、それによって毒性標的ＲＮＡが消失される方法。一実施形態では、毒性標的ＲＮＡの切断によって、毒性標的ＲＮＡの発現レベルが低下される。別の実施形態では、毒性標的ＲＮＡの発現レベルの低下によって、毒性標的ＲＮＡが消失される。
実施形態１７：ａ）ＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５３）を含む毒性標的配列に結合することができるＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質と、ｂ）毒性標的ＲＮＡ配列を切断することができるエンドヌクレアーゼとを含むガイドされないＲＮＡ結合性融合タンパク質をコードする核酸配列を含む組成物。
実施形態１８：ＡＡＶベクターは、いずれかの前記実施形態に記載の組成物を含む。
実施形態１９：ＡＡＶ９である、いずれかの前記実施形態に記載のＡＡＶベクター。
実施形態２０：エンドヌクレアーゼが、ＲＮａｓｅ１、ＲＮａｓｅ４、ＲＮａｓｅ６、ＲＮａｓｅ７、ＲＮａｓｅ８、ＲＮａｓｅ２、ＲＮａｓｅ６ＰＬ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＴ２、ＲＮａｓｅ１１、ＲＮａｓｅＴ２様、ＮＯＢ１、ＥＮＤＯＶ、ＥＮＤＯＧ、ＥＮＤＯＤ１、ｈＦＥＮ１、ｈＳＬＦＮ１４、ｈＬＡＣＴＢ２、ＡＰＥＸ２、ＡＮＧ、ＨＲＳＰ１２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＩＤＡ、ＰＤＬ６、ＮＴＨＬ、ＫＩＡＡ０３９１、ＡＰＥＸ１、ＡＧＯ２、ＥＸＯＧ、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＥＲＮ２、ＰＥＬＯ、ＹＢＥＹ、ＣＰＳＦ４Ｌ、ｈＣＧ＿２００２７３１、ＥＲＣＣ１、ＲＡＣ１、ＲＡＡ１、ＲＡＢ１、ＤＮＡ２、ＦＬＪ３５２２０、ＦＬＪ１３１７３、ＥＲＣＣ４、ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）、ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ）、ＲＮａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ）、ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ）、ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ）、ＴＥＮＭ１、ＴＥＮＭ２、ＲＮａｓｅＫ、ＴＡＬＥＮ、ＺＮＦ６３８、およびｈＳＭＧ６（ＰＩＮ）からなる群から選択される、いずれかの前記実施形態に記載の方法または組成物。実施形態ＸＸ：エンドヌクレアーゼが、＿＿である、いずれかの前記実施形態に記載の方法または組成物。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、またはＣａｓ１３ｄである。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３ｄである。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドである。一部の実施形態では、ガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＰＵＦタンパク質、またはＰＵＭＢＹタンパク質である。一部の実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質は、ヒトＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質である。一部の実施形態では、ガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ融合タンパク質である。一実施形態では、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹに基づく第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質と融合されている。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、配列番号３５８のＺＣ３Ｈ１２Ａとして公知のジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメイン（本明細書ではＥ１７とも呼ばれる）である。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、核酸配列は、少なくとも１つのプロモーターを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧまたは短縮型ＣＡＧ（ｔＣＡＧ）プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、ＥＦＳプロモーターである。一実施形態では、組織特異的プロモーターは、筋肉特異的プロモーターである。別の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、ＭＨＣＫ７プロモーターである。別の実施形態では、筋肉特異的プロモーターは、デスミンプロモーターである。一実施形態では、デスミンプロモーターは、全長デスミンプロモーターである。別の実施形態では、デスミンプロモーターは、短縮型デスミンプロモーターである。
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質またはガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドは、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドと融合している第１のＲＮＡ結合性ポリペプチドである。一実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＲＮＡと会合する様式でＲＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＲＮＡを切断する様式でＲＮＡと会合することができる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＲＮａｓｅ１、ＲＮａｓｅ４、ＲＮａｓｅ６、ＲＮａｓｅ７、ＲＮａｓｅ８、ＲＮａｓｅ２、ＲＮａｓｅ６ＰＬ、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅＴ２、ＲＮａｓｅ１１、ＲＮａｓｅＴ２様、ＮＯＢ１、ＥＮＤＯＶ、ＥＮＤＯＧ、ＥＮＤＯＤ１、ｈＦＥＮ１、ｈＳＬＦＮ１４、ｈＬＡＣＴＢ２、ＡＰＥＸ２、ＡＮＧ、ＨＲＳＰ１２、ＺＣ３Ｈ１２Ａ、ＲＩＤＡ、ＰＤＬ６、ＮＴＨＬ、ＫＩＡＡ０３９１、ＡＰＥＸ１、ＡＧＯ２、ＥＸＯＧ、ＺＣ３Ｈ１２Ｄ、ＥＲＮ２、ＰＥＬＯ、ＹＢＥＹ、ＣＰＳＦ４Ｌ、ｈＣＧ＿２００２７３１、ＥＲＣＣ１、ＲＡＣ１、ＲＡＡ１、ＲＡＢ１、ＤＮＡ２、ＦＬＪ３５２２０、ＦＬＪ１３１７３、ＥＲＣＣ４、ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ）、ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、ＲＮａｓｅ１（Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ、Ｈ１１９Ｎ）、ＲＮａｓｅ１（Ｈ１１９Ｎ）、ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ）、ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ、Ｈ１１９Ｎ、Ｋ４１Ｒ、Ｄ１２１Ｅ）、ＲＮａｓｅ１（Ｒ３９Ｄ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ８８Ａ、Ｇ８９Ｄ、Ｒ９１Ｄ）、ＴＥＮＭ１、ＴＥＮＭ２、ＲＮａｓｅＫ、ＴＡＬＥＮ、ＺＮＦ６３８、およびｈＳＭＧ６（ＰＩＮ）からなる群から選択される。一実施形態では、第２のＲＮＡ結合性ポリペプチドは、ＺＣ３Ｈ１２Ａからのヌクレアーゼドメイン（Ｅ１７）である。一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、不活性化されている、ＲＮＡによりガイドされるＲＮａｓｅ Ｃａｓタンパク質である。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＵＧ標的化ＤＭ１組成物を含むベクターが、本明細書に開示される。一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、本明細書に開示されるＣＵＧ標的化ＤＭ１組成物を含む。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９である。別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ．７４である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるベクター（単数または複数）を含む細胞が、本明細書に開示される。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む配列は、真核細胞においてｇＲＮＡを発現させることができるプロモーターをコードする配列をさらに含む。
本開示の組成物の一部の実施形態では、真核細胞は、動物細胞である。一部の実施形態では、動物細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、動物細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、ヒト細胞は、筋肉細胞である。
本開示の組成物の一部の実施形態では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼの発現を駆動することができるプロモーターから単離されるまたはそれに由来する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ヒトＵ６プロモーターから単離されるまたはそれに由来する。一部の実施形態では、プロモーターは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することができるプロモーターから単離されるまたはそれに由来する配列である。一部の実施形態では、プロモーターは、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リシンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、トレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、もしくはバリンｔＲＮＡプロモーターから単離される、またはそれに由来する。一部の実施形態では、プロモーターは、バリンｔＲＮＡプロモーターから単離されるまたはそれに由来する。
本開示の組成物の一部の実施形態では、ｇＲＮＡのＤＲ配列は、Ｃａｓ１３ｄ ＤＲ配列である。
本開示の組成物の一部の実施形態では、第１のＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質ではない、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低下しているまたは阻害されている。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加しているまたは誘導されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質および／または同族ｇＲＮＡは、変異を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインは、変異を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡのＤＲ配列は、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、またはｇＲＮＡをコードする核酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードするアミノ酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。一部の実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。一部の実施形態では、変異は、ｇＲＮＡのＤＲ配列における点変異である。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３ポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、Ｃａｓ１３ｄポリペプチドまたはそのＲＮＡ結合性部分を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、低下しているまたは阻害されている。一部の実施形態では、ネイティブなＲＮＡヌクレアーゼ活性は、増加しているまたは誘導されている。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質および／またはその同族ｇＲＮＡは、変異を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインは、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質をコードする核酸にまたはｇＲＮＡをコードする核酸に存在する。一部の実施形態では、変異は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列に存在する。一部の実施形態では、変異は、置換、挿入、欠失、フレームシフト、逆位、または転位を含む。一部の実施形態では、変異は、ヌクレアーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン内の結合性部位、ヌクレアーゼドメイン内の活性部位、またはヌクレアーゼドメイン内の少なくとも１つの必須アミノ酸残基の欠失を含む。一部の実施形態では、変異は、ｇＲＮＡのＤＲ配列における点変異である。一実施形態では、変異型ＤＲ配列は、点変異を含むＣａｓ１３ｄ ＤＲ配列である。
本開示の方法および／または組成物の一部の実施形態では、ガイドされないＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ結合活性のために多量体形成を必要としない。一部の実施形態では、ガイドされないＲＮＡ結合性タンパク質は、多量体複合体の単量体ではない。一部の実施形態では、多量体タンパク質複合体は、ＲＮＡ結合性タンパク質を含まない。
本開示の方法および／または組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の標的配列に選択的に結合する。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対する親和性を含まない。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡ分子内の第２の配列に対して高い親和性を含まずそれに選択的に結合しない。
本開示の方法および／または組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡゲノムまたはＲＮＡトランスクリプトームは、ＲＮＡ分子を含む。
本開示の方法および／または組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、終点を含めて、２アミノ酸から１３００アミノ酸の間を含む。
本開示の方法および／または組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性融合タンパク質は、終点を含めて、２アミノ酸から２０００アミノ酸の間を含む。
本開示の方法および／または組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）またはタグをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列のＮ末端に位置する。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、タンパク質のＣ末端にＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質または系をコードする配列は、２つのＮＬＳまたは２つのＮＥＳを含む。
本開示の方法および／または組成物の一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、第１のＮＬＳをコードする第１の配列、および第２のＮＬＳをコードする第２の配列をさらに含む。一部の実施形態では、第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳをコードする配列は、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列のＮ末端に位置する。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性タンパク質は、タンパク質のＣ末端に第１のＮＬＳまたは第２のＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合性組成物は、少なくとも１つのリンカーを含む。
本開示の方法および／または組成物の一部の実施形態では、組成物は、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡと会合する様式でＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡを切断する様式でＲＮＡと会合する。本開示の組成物の一部の実施形態では、第２のＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列は、ＲＮａｓｅを含むまたはそれからなる。
本明細書に開示される組成物のおよび／または組成物を含むベクターの製造方法も、本明細書に開示される。
核酸配列が、少なくとも１つのプロモーターを含み、少なくとも１つのプロモーターが、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターであり、少なくとも１つのプロモーターが、ＥＦＳプロモーターまたはｔＣＡＧプロモーターであり、組織特異的プロモーターが、筋肉特異的プロモーターであり、筋肉特異的プロモーターが、ＭＨＣＫ７プロモーターであり、および／または前記プロモーターのいずれかが、エンハンサーおよび／またはイントロンを含む、前記実施形態のいずれか。
毒性標的ＲＮＡの発現レベルが、未処置毒性標的ＲＮＡの発現レベルの低下と比較して低下され、毒性標的ＲＮＡの発現レベルが、ＲＣａｓ９に基づく系で処置された毒性標的ＲＮＡの低下レベルと比較して低下され、低下のレベルが、１倍であるかまたはそれより大きく、低下のレベルが、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍であり、低下のレベルが、１０倍であるかまたはそれより大きく、低下のレベルが、１０倍～２０倍の間である、前記実施形態のいずれか。
核酸配列が、ヒト細胞においてｇＲＮＡを発現させることができるプロモーターを含み、プロモーターが、ヒトＵ６プロモーターであり、プロモーターが、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発現を駆動することができるプロモーターから単離されたまたはそれに由来する配列であり、プロモーターが、アラニンｔＲＮＡプロモーター、アルギニンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギンｔＲＮＡプロモーター、アスパラギン酸ｔＲＮＡプロモーター、システインｔＲＮＡプロモーター、グルタミンｔＲＮＡプロモーター、グルタミン酸ｔＲＮＡプロモーター、グリシンｔＲＮＡプロモーター、ヒスチジンｔＲＮＡプロモーター、イソロイシンｔＲＮＡプロモーター、ロイシンｔＲＮＡプロモーター、リシンｔＲＮＡプロモーター、メチオニンｔＲＮＡプロモーター、フェニルアラニンｔＲＮＡプロモーター、プロリンｔＲＮＡプロモーター、セリンｔＲＮＡプロモーター、トレオニンｔＲＮＡプロモーター、トリプトファンｔＲＮＡプロモーター、チロシンｔＲＮＡプロモーター、およびバリンｔＲＮＡプロモーターからなる群から選択され、ｇＲＮＡのＤＲ配列が、Ｃａｓ１３ｄ ＤＲ配列であり、核酸配列が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）またはタグをコードする配列をさらに含み、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列のＮ末端に位置し、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）が、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする配列のＣ末端に位置し、核酸配列が、２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）または２つの核外輸送シグナル（ＮＥＳ）をコードする配列をさらに含み、ＲＮＡ結合性タンパク質または融合タンパク質が、少なくとも１つのリンカーを含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法および組成物。
（実施例１）
Ｃａｓ１３ｄ系はＤＭ１毒性ＣＵＧリピートを分解する
材料
プラスミド：ＣＴＧ９６０（９６０のＣＴＧリピート）、Ｔｅｔトランス活性化因子、ヒトＵ６プロモーターのもとでＣａｓおよびｓｇＲＮＡを発現するｐｃＤＮＡ３．１
トランスフェクション試薬：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ
ＲＮＡ抽出キット：ＲＮＥＡＳＹ ＰＬＵＳ（Ｑｉａｇｅｎ）
ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ｑｕａｎｔａｂｉｏ
方法
トランスフェクション、ＲＮＡ抽出、ＲＮＡ－ＦＩＳＨ、およびｑＲＴ－ＰＣＲ解析
ＣＵＧリピート含有ＲＮＡのノックダウンを評価するために、５×１０４個のＣＯＳＭ６細胞を２４ウェルプレートに播種し、５０ｎｇのＤＭＰＫ－ＣＴＧ９６０プラスミド（ＣＵＧ－９６０発現がテトラサイクリン調節可能プロモーターエレメント（ＴＲＥ）の制御下で駆動される場合）、２５ｎｇのＴｅｔトランス活性化因子（ｔＴＡ）プラスミド、および１μｇのＲＢＰ（Ｃａｓ＋ｓｇＲＮＡ）を用いてトランスフェクトした。Ｃａｓ１３ｄ系でのＣＵＧ標的化のためのｓｇＲＮＡにおいて使用したスペーサー配列は、表Ｔに収載されている。Ｃａｓタンパク質および対応するｓｇＲＮＡを同じプラスミドから発現させた。細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（５％ＦＢＳを含有する）中の１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンとともに一晩インキュベートした。これは、ＣＵＧ－９６０ ＲＮＡの発現を駆動するために必要である。細胞をＰＢＳで洗浄し、１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンを補充した完全ＤＭＥＭ培地中でさらに２４時間インキュベートした。細胞を回収し、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ＣＵＧ発現ΔΔＣＴを計算し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化し、非標的化（ＮＴ）ｓｇＲＮＡと比べてＣＵＧ－９６０ノックダウンを定量化した。
Figure 2023551874000181
図１は、配列番号４５７～４５９であるスペーサー配列を用いるＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ系が対照と比較してＣＵＧ標的の＞９０％を消失させることを実証する。
図２は、ＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ－ＦＩＳＨ）によって解析して、ＣＵＧ標的化Ｃａｓ１３ｄ系が対照と比較してＣＵＧリピートＲＮＡの＞９０％を消失させることを実証する。
図３は、ＲＣａｓ９系と比較したＣａｓ１３ｄ系を示す。Ｃａｓ１３ｄ系は、対照ＮＴ ｓｇＲＮＡと比較してＣＵＧ標的の＞９０％を消失させる効率的切断をもたらす。ＲＣａｓ９で処置した細胞は、標的ＣＵＧリピートの約８０％ノックダウンを示した。
（実施例２）
ＰＵＦ系はＤＭ１毒性ＣＵＧリピートを分解する
材料
プラスミド：ＣＴＧ９６０（９６０のＣＴＧリピート）、Ｔｅｔトランス活性化因子、ＲＢＰを発現するｐｃＤＮＡ３．１
トランスフェクション試薬：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、ＰＢＳ、ＤＭＥＭ
ＲＮＡ抽出キット：ＲＮＥＡＳＹ ＰＬＵＳ（Ｑｉａｇｅｎ）
ｑＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ｑｕａｎｔａｂｉｏ
方法
トランスフェクション、ＲＮＡ抽出、ＦＩＳＨ、およびｑＲＴ－ＰＣＲ解析
ＣＵＧリピート含有ＲＮＡのノックダウンを評価するために、５×１０４個のＣＯＳＭ６細胞を２４ウェルプレートに播種し、５０ｎｇのＤＭＰＫ－ＣＴＧ９６０プラスミド（ＣＵＧ－９６０発現がテトラサイクリン調節可能プロモーターエレメント（ＴＲＥ）の制御下で駆動される場合）、２５ｎｇのＴｅｔトランス活性化因子（ｔＴＡ）プラスミド、および１μｇのＲＢＰ（ＰＵＦ）を用いてトランスフェクトした。細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（５％ＦＢＳを含有する）中の１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンとともに一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンを補充した完全ＤＭＥＭ培地中でさらに２４時間インキュベートした。細胞を回収し、ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。ＣＵＧ発現ΔΔＣＴを計算し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化し、非標的化（ＮＴ）対照と比べてＣＵＧ９６０ ＲＮＡノックダウンを定量化した。
ＰＵＦ構築物（図１にＣＵＧ－ｆ１およびＣＵＧ－ｆ２と表示されている）は、毒性配列ＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号４５３）を標的とした。
図１は、ＣＵＧ標的化ＰＵＦ－Ｅ１７融合系が対照と比較してＣＵＧ標的の＞９０％を消失させることを実証する。
図２は、ＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ－ＦＩＳＨ）によって解析して、ＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７融合系が対照と比較してＣＵＧリピートＲＮＡの＞９０％を消失させることを実証する。
図３は、ＲＣａｓ９系と比較したＰＵＦ（ＣＵＧ）系を示す。ＰＵＦ（ＣＵＧ）系は、対照ＮＴと比較してＣＵＧ標的の＞９０％を消失させる効率的切断をもたらす。ＲＣａｓ９で処置した細胞は、標的ＣＵＧリピートの約８０％ノックダウンを示した。
（実施例３）
筋強直性ジストロフィー１型の処置のためのＲＮＡレベルでの伸長したＣＵＧリピートの標的化（分解および遮断機序）
本明細書に開示されるＲＮＡ標的化組成物Ａ０１２１５（分解のためのＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ））、Ａ０１３４４（分解のためのＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７）、およびＡ０１６８６（遮断のための）を、ＡＡＶに基づくアプローチによって、全身性経路または筋肉内経路のどちらかによって送達した。例えば、筋強直性ジストロフィーの下記の当技術分野において認知されている動物モデルにおけるＡＡＶ９に基づく送達のためのＰＵＦ標的化ＣＵＧ構築物を表５３に示す。
Figure 2023551874000182
筋強直性ジストロフィーに関連する伸長されたＣＵＧリピートを標的とするために、ＣＵＧ標的化組成物をコードするＤＮＡを有するベクターを、ＡＡＶベクターによって送達した。ＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７、Ｃａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）またはＰＵＦ（ＣＵＧ）単独の発現がプロモーターによって駆動された（図４Ａ～Ｃおよび図１２Ａ～Ｂ）。一部の態様では、短縮型ＣＡＧ（ｔＣＡＧ）プロモーター（配列番号３８５）を使用した。一部の態様では、短いＥＦ１－アルファ（ＥＦＳ）プロモーター（配列番号５２０）を使用した。一部の態様では、ＵＢＢイントロンを有するＥＦＳプロモーター（配列番号６０９）を使用した。
ＡＡＶ－９調製物を標準的な技法（トリプルトランスフェクション法）に従って生成し、ＩＤＸ密度勾配超遠心法によって精製した。ｑＰＣＲおよびカプシドＥＬＩＳＡによって、ＡＡＶの力価を決定した。次に、上記のＡＡＶ９バージョンを、ＨＳＡ－ＬＲ筋強直性ジストロフィー１型マウスに静脈内注射（１５０μＬの総体積、１×１０＾１２ｖｇ）し、または前記マウスの前脛骨筋に注射（５０μＬの総体積、２×１０＾１０ｖｇ、１×１０＾１１ｖｇ）し、その後、毎日臨床観察を行った。マウスを注射後４ｗおよび１２ｗの時点で屠殺した。ＲＮＡ／タンパク質評価および遺伝子発現の変化のために、動物ごとに、前脛骨筋（ＩＭ注射の注射部位）、四頭筋、横隔膜、腓腹筋、心臓、脾臓、肝臓（代表部分、すなわち、葉の一部分）、腸および腎臓の近位半分を収集し、個別に（対の臓器を除いて）クライオバイアルに入れ、液体窒素で瞬間凍結させた。全ての組織の残りの半分は、ＯＣＴに包埋し、凍結させた。筋肉切片を横断方式で切り取った。組織の残りの半分を使用して全ＲＮＡを調製した。
４および１２週の時点でマウスを屠殺する前に筋電図検査を行って、筋強直性ジストロフィー１型の生理学的表現型を回復させる点でのＲＮＡ標的化組成物の有効性の尺度として疾患関連筋強直（筋弛緩の異常）の回復を評価した。
凍結組織からのＲＮＡ単離は、ＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコールに従って行った。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用してＲＮＡの質および濃度を推定した。ｃＤＮＡ調製は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用しランダムプライマーを用いて製造者のプロトコールに従って行った。ｑＰＣＲおよびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を行って、２つのマウス群（ＲＮＡ標的化組成物、ビヒクル）の中で組織におけるＲＮＡ標的化組成物のレベルを評価し、導入遺伝子発現の永続性を評価した。
ＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行って、伸長されたＣＵＧリピートを消失させるまたは遮断する点でのＲＮＡ標的化組成物の有効性の尺度として筋肉切片におけるＲＮＡ凝集体の消滅を測定した。
塩化物チャネルＣｌｃｎ１およびＭｂｎｌ１に対する抗体を用いる免疫蛍光検査を、筋強直性ジストロフィー１型分子病態の処置についてのＲＮＡ標的化組成物の有効性の尺度として行った。Ｃｌｃｎ１の再構成および核内Ｍｂｎｌ１の再分布は、筋強直性ジストロフィー１型分子病態回復を意味する。
筋肉組織から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。選択的にスプライシングされたＡｔｐ２ａ１のエクソン２２、Ｃｌｃｎ１のエクソン７、ＢＩＮ１のエクソン１１に隣接するプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行って、筋強直性ジストロフィー１型関連選択的スプライシングの回復を明らかにする。
（実施例４）
ｄＣａｓ１３ｄおよびＣＵＧ標的化ガイドＲＮＡによる筋強直性ジストロフィー１型の処置のためのＲＮＡレベルでの伸長したＣＵＧリピートの標的化
ヒトＵ６プロモーター下のＣＵＧ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、エンドヌクレアーゼＥ１７（ヒトＺＣ３Ｈ１１２Ａ遺伝子に由来する）に連結されたヌクレアーゼ失活ｄＣａｓ１３ｄ、またはヌクレアーゼ失活ｄＣａｓ１３ｄ（単独の）とをコードする単一の導入遺伝子を、ウイルスまたは非ウイルス手段によって、全身性経路または筋肉内経路のどちらかによって送達する。筋強直性ジストロフィーに関連する伸長されたＣＵＧリピートを標的とするために、ＣＵＧ標的化ｇＲＮＡおよびｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）をコードするＤＮＡを有するベクターを、ＡＡＶベクターによって送達する。Ｃａｓ１３ｄ（またはｄＣａｓ１３ｄ）発現は、プロモーターによって駆動される（図４Ｂ、図４Ｃおよび図１２Ｂ）。一部の態様では、短縮型ＣＡＧ（ｔＣＡＧ）プロモーター（配列番号３８５）を使用した。一部の態様では、短いＥＦ１－アルファ（ＥＦＳ）プロモーター（配列番号５２０）を使用した。一部の態様では、ＵＢＢイントロンを有するＥＦＳプロモーター（配列番号６０９）を使用した。
ＡＡＶ９調製物を標準的な技法（トリプルトランスフェクション法）に従って生成し、ＩＤＸ密度勾配超遠心法によって精製した。ｑＰＣＲおよびカプシドＥＬＩＳＡによって、ＡＡＶの力価を決定した。次に、上記のＡＡＶ９バージョンを、ＨＳＡ－ＬＲ筋強直性ジストロフィー１型マウスに静脈内注射（１５０μＬの総体積、１×１０＾１２ｖｇ）し、または前記マウスの前脛骨筋に注射（５０μＬの総体積、２×１０＾１０ｖｇ、１×１０＾１１ｖｇ）し、その後、毎日臨床観察を行う。マウスを注射後４ｗおよび１２ｗの時点で屠殺する。ＲＮＡ／タンパク質評価および遺伝子発現の変化のために、動物ごとに、前脛骨筋（ＩＭ注射の注射部位）、四頭筋、横隔膜、腓腹筋、心臓、脾臓、肝臓（代表部分、すなわち、葉の一部分）、腸および腎臓の近位半分を収集し、個別に（対の臓器を除いて）クライオバイアルに入れ、液体窒素で瞬間凍結させる。全ての組織の残りの半分は、ＯＣＴに包埋し、凍結させる。筋肉切片を横断方式で切り取る。組織の残りの半分を使用して全ＲＮＡを調製する。
４および１２週の時点でマウスを屠殺する前に筋電図検査を行って、筋強直性ジストロフィー１型の生理学的表現型を回復させる点での分解によるｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）－Ｅ１７の有効性または遮断によるｄＣａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）の有効性の尺度として疾患関連筋強直（筋弛緩の異常）の回復を評価する。凍結組織からのＲＮＡ単離は、ＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者のプロトコールに従って行う。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用してＲＮＡの質および濃度を推定する。ｃＤＮＡ調製は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用しランダムプライマーを用いて製造者のプロトコールに従って行う。ｑＰＣＲおよびデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を行って、２つのマウス群（Ｃａｓ１３ｄまたはｄＣａｓ１３ｄとともにＣＵＧ標的化ＲＮＡ、ビヒクル）の中で組織におけるＣａｓ１３ｄ（またはｄＣａｓ１３ｄ）およびｇＲＮＡのレベルを評価して、導入遺伝子発現の永続性を評価する。ＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行って、伸長されたＣＵＧリピートを消失させる点でのＣＵＧ標的化ｇＲＮＡ＋Ｃａｓ１３ｄ（またはｄＣａｓ１３ｄ）の有効性の尺度として筋肉切片におけるＲＮＡ凝集体の消滅を測定する。塩化物チャネルＣｌｃｎ１およびＭｂｎｌ１に対する抗体を用いる免疫蛍光検査を、筋強直性ジストロフィー１型分子病態の処置についてのｇＲＮＡ＋Ｃａｓ１３ｄ（またはｄＣａｓ１３ｄ）の有効性の尺度として行う。Ｃｌｃｎ１の再構成および核内Ｍｂｎｌ１の再分布は、筋強直性ジストロフィー１型分子病態回復を意味する。筋肉組織から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。選択的にスプライシングされたＡｔｐ２ａ１のエクソン２２、Ｃｌｃｎ１のエクソン７、ＢＩＮ１のエクソン１１に隣接するプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行って、筋強直性ジストロフィー１型関連選択的スプライシングの回復を明らかにする。
（実施例５）
患者筋細胞およびＨＳＡ ＤＭ１マウス（上記）における分解または遮断によるＣＵＧｅｘｐＲＮＡの用量依存的低減
筋強直性ジストロフィーＩ型（ＤＭ１）は、ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＵＧマイクロサテライトリピート伸長（ＭＲＥ）によって引き起こされる多臓器型の常染色体優性遺伝性障害である。以前に、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくＲＮＡ標的化遺伝子治療には、初代患者細胞およびＤＭ１マウスモデルにおいてＤＭ１における反復トラクトから発現される毒性ＲＮＡを消失させる可能性があることを示した。あまり扱いやすくない、オフターゲット効果を低下または消失させるのにより適している、治療的ＭＲＥ標的化戦略をさらに探究するために、本発明者らは、ＲＮＡ標的化系：１）新規ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄ（Ａ０１２１５）、２）ヒトＺＣ３Ｈ１１２Ａに由来するＲＮＡエンドヌクレアーゼと連結された天然に存在するヒトＰＵＭ１タンパク質（ＰＵＦ－Ｅ１７）から得られたＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質系（Ａ０１３４４）、および３）エンドヌクレアーゼを伴わないＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質系（Ａ０１６８６）を、伸長されたＤＭ１関連ＣＵＧリピートを切断（１および２）または遮断どちらかの標的とするように操作した。改変された、ＡＡｖｒｈ７４にパッケージングされた、Ｃａｓ１３ｄおよびＰＵＦ－Ｅ１７は、ＤＭ１患者の筋細胞における核内ＣＵＧ ＲＮＡ凝集体を用量依存方式で低減させた。さらに、ユニタリーＡＡＶ９にパッケージングされたＣａｓ１３ｄ、ＰＵＦ－Ｅ１７およびＰＵＦ（遮断）を別々に筋肉内（ＩＭ）および静脈内（ＩＶ）注射によって成体（８～１２週齢）ＨＳＡＬＲ ＤＭ１マウスに送達した。本発明者らは、全てのＲＮＡ標的化系のＩＭ注射後４週間の時点での筋電図検査から、用量依存的導入遺伝子発現、ＤＭ１関連選択的スプライシングの修正、および筋強直の軽減を報告する。予想通り、Ｃａｓ１３ｄおよびＰＵＦ－Ｅ１７によるＲＮＡ凝集体の低減およびスプライシングの改善は、ＣＵＧ ＲＮＡレベルの低下（＞５０％）を伴った。要するに、本発明者らは、ＤＭＰＫにおけるＭＲＥを有効に標的化することができ、ＤＭ１の分子的および臨床的特徴を改善することができる、異なる機序のアプローチ（分解および遮断）を示す。図６～１２。
（実施例６）
ＮＨＰ研究における忍容性および導入遺伝子発現
標的組織における忍容性および導入遺伝子発現レベル（生体内分布）を評価するために筋肉（骨格筋、平滑筋および心筋）特異的プロモーターの制御下の上記のＲＮＡ標的化組成物（Ａ０１２１５、Ａ０１３４４、およびＡ０１６８６）をコードするＡＡＶ９を用いて非ヒト霊長類（ＮＨＰ）研究を行っている。ＲＮＡ標的化組成物。ＣＵＧ標的化組成物をコードするＤＮＡを有するベクターをＡＡＶ９ベクターによって送達した。ＰＵＦ（ＣＵＧ）－Ｅ１７、Ｃａｓ１３ｄ（ＣＵＧ）またはＰＵＦ（ＣＵＧ）単独の発現がプロモーターによって駆動される（図４Ａ～Ｃおよび図１２Ａ～Ｂ）。一部の態様では、デスミンプロモーター（全長デスミン配列番号５６８または短縮型デスミン配列番号５６９）を使用する。
参照による組込み
あらゆる相互参照されるまたは関連する特許または出願を含めた、本明細書において引用されているあらゆる文書は、明白に排除されるまたは他のやり方で限定される場合を除き、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いずれの文書の引用も、それが本明細書に開示されるもしくは具体化されるあらゆる発明に対して先行技術であること、または、単独で、もしくは任意の他の参考文献（複数可）との任意の組合せで、あらゆるそのような発明を教示、示唆もしくは開示するものであることを認めるものではない。さらに、本文書における用語のいずれかの意味または定義が参照により組み込まれる文書における同じ用語のいずれかの意味または定義と矛盾する範囲では、本文書におけるその用語に割り当てられた意味または定義が支配するものとする。
他の実施形態
本開示の特定の実施形態を例示し、記載したが、種々の他の変化および改変を本開示の主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内に入るそのような変化および改変の全てを包含する。

Claims (51)

  1. 毒性標的ＣＵＧリピートＲＮＡ配列に結合することができるガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドまたはガイドされるＲＮＡ結合性ポリペプチドを含むＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物。
  2. 前記ＲＮＡ結合性ポリペプチドが、融合タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記融合タンパク質が、前記毒性ＣＵＧリピートＲＮＡ配列を切断することができるエンドヌクレアーゼと融合した前記ＲＮＡ結合性ポリペプチドを含む、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ガイドされないＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記ガイドされるＲＮＡ結合性ポリペプチドが、Ｃａｓ１３ｄタンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記ｃａｓ１３ｄタンパク質が、触媒的に失活している、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記ｃａｓ１３ｄタンパク質が、配列番号５８３または５８６～５８９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記エンドヌクレアーゼが、ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  9. ＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質が、配列番号４４４～４５１、４６１、５７０、または６３８～６４９のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ＰＵＦ ＲＮＡ結合性タンパク質が、配列番号４４４で示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列が、配列番号４５３～４５６で示される核酸配列のいずれか１つを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡリピート配列が、配列番号４５４で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  13. ＣＵＧ標的化ＰＵＦタンパク質が、配列番号４５２で示される核酸配列によってコードされる、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質が、ヒトＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質が、リンカー配列によって前記ＺＣ３Ｈ１２Ａエンドヌクレアーゼに連結されている、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記リンカーが、配列番号４１１で示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記融合タンパク質が、核局在化配列（ＮＬＳ）、および核外輸送配列（ＮＥＳ）からなる群から選択される１つまたは複数のシグナル配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記ＺＣ３Ｈ１２Ａジンクフィンガーヌクレアーゼが、配列番号３５８または配列番号３５９で示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記融合タンパク質が、配列番号５５９～５６７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記融合タンパク質が、配列番号４６０、配列番号５１６または配列番号５１７を含む核酸配列によってコードされる、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記融合タンパク質をコードする核酸分子が、プロモーターを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記プロモーターが、ｔＣＡＧプロモーター、ＥＦＳ／ＵＢＢプロモーター、デスミンプロモーター、ＣＫ８ｅプロモーター、またはＥＦＳプロモーターである、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を含む、ベクター。
  24. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、およびデンドリマーからなる群から選択される、請求項２３に記載のベクター。
  25. ＡＡＶベクターである、請求項２３に記載のベクター。
  26. 第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列と、
    第１のプロモーター配列と、
    少なくとも１つのＣＵＧリピートＲＮＡ結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、
    第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列と
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  27. 前記ＣＵＧリピートＲＮＡ結合性ポリペプチドが、ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹタンパク質を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  28. ＰＵＦまたはＰＵＭＢＹ配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４５２で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  29. 前記ＣＵＧリピートＲＮＡ結合性ポリペプチドが、Ｃａｓ１３ｄタンパク質を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  30. Ｃａｓ１３ｄ配列をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号６０１、６１２または６１５～６１８で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  31. 前記第１のプロモーター配列が、配列番号５６８、５６９、６０８、６０９、６３４～６３７で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  32. 前記第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号５９９または６００で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  33. 前記第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号５９９または６００で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  34. 第２のプロモーター配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  35. 前記第２のプロモーターが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現を制御し、前記ｇＲＮＡが、（ｉ）ＤＲ配列および（ｉｉ）スペーサー配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  36. 前記第２のプロモーターが、配列番号５１９で示される核酸配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  37. ポリＡ配列をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  38. 少なくとも１つのリンカー配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  39. 少なくとも１つの核局在化配列を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  40. 前記ベクターが、配列番号５７４～５８２、５８４～５８５、５９０～５９７のいずれかで示される核酸でコードされる、前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  41. ａ）請求項２６から４０のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスベクターと、
    ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加剤と
    を含む、医薬組成物。
  42. ａ）前記請求項のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターと、
    ｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質と
    を含む、ＡＡＶウイルスベクター。
  43. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、請求項４２に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  44. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項２１に記載のＡＡＶウイルスベクター。
  45. 前記請求項のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  46. 哺乳動物における筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）を処置する方法であって、請求項１から４５のいずれか一項に記載の組成物またはＡＡＶベクターを、前記哺乳動物の組織における毒性標的ＣＵＧマイクロサテライトリピート伸長（ＭＲＥ）ＲＮＡ配列に投与するステップを含み、それによって毒性標的ＲＮＡの発現レベルが低下される、方法。
  47. 前記組成物またはＡＡＶベクターが、対象に、静脈内、くも膜下腔内、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内もしくは目周囲、経口、直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、大槽内、神経内、胸膜内、局部、リンパ内、大槽内投与されるか、または神経内にある、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記組成物またはＡＡＶベクターが、対象に静脈内投与される、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記毒性標的ＲＮＡの発現レベルの低下によって、前記哺乳動物におけるＤＭ１の症状が好転する、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記毒性標的ＲＮＡの前記発現レベルが、未処置毒性標的ＣＵＧ ＲＮＡの発現レベルの低下と比較して低下される、請求項４６に記載の方法。
  51. 低下のレベルが、１倍～２０倍の間である、請求項４６に記載の方法。
JP2023533279A 2020-12-01 2021-12-01 筋強直性ジストロフィー１型を処置するためのｒｎａ標的化組成物および方法 Pending JP2023551874A (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063119977P 2020-12-01 2020-12-01
US63/119,977 2020-12-01
US202063130092P 2020-12-23 2020-12-23
US63/130,092 2020-12-23
US202163278746P 2021-11-12 2021-11-12
US63/278,746 2021-11-12
PCT/US2021/061490 WO2022119979A1 (en) 2020-12-01 2021-12-01 Rna-targeting compositions and methods for treating myotonic dystrophy type 1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023551874A true JP2023551874A (ja) 2023-12-13
JPWO2022119979A5 JPWO2022119979A5 (ja) 2024-12-09

Family

ID=79731176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023533279A Pending JP2023551874A (ja) 2020-12-01 2021-12-01 筋強直性ジストロフィー１型を処置するためのｒｎａ標的化組成物および方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240108751A1 (ja)
EP (1) EP4255471A1 (ja)
JP (1) JP2023551874A (ja)
KR (1) KR20230129162A9 (ja)
AU (1) AU2021391645A1 (ja)
CA (1) CA3200588A1 (ja)
WO (1) WO2022119979A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020253435A1 (en) 2019-04-01 2021-11-18 Tenaya Therapeutics, Inc. Adeno-associated virus with engineered capsid
WO2022221278A1 (en) * 2021-04-12 2022-10-20 Locanabio, Inc. Compositions and methods comprising hybrid promoters
GB202207026D0 (en) * 2022-05-13 2022-06-29 Univ Oxford Innovation Ltd Method

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2406743A1 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
EP3492596A1 (en) 2007-04-09 2019-06-05 University of Florida Research Foundation, Inc. Raav vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use
CN101895633A (zh) 2010-07-14 2010-11-24 中兴通讯股份有限公司 一种移动终端及其解锁方法
US9580714B2 (en) 2010-11-24 2017-02-28 The University Of Western Australia Peptides for the specific binding of RNA targets
AU2012326971C1 (en) 2011-10-21 2018-02-08 Kyushu University, National University Corporation Method for designing RNA binding protein utilizing PPR motif, and use thereof
US10330674B2 (en) 2015-01-13 2019-06-25 Massachusetts Institute Of Technology Pumilio domain-based modular protein architecture for RNA binding
US10476825B2 (en) 2017-08-22 2019-11-12 Salk Institue for Biological Studies RNA targeting methods and compositions
WO2019236982A1 (en) * 2018-06-08 2019-12-12 Locana, Inc. Rna-targeting fusion protein compositions and methods for use

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021391645A1 (en) 2023-06-29
CA3200588A1 (en) 2022-06-09
EP4255471A1 (en) 2023-10-11
US20240108751A1 (en) 2024-04-04
KR20230129162A (ko) 2023-09-06
KR20230129162A9 (ko) 2024-12-23
WO2022119979A1 (en) 2022-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023551874A (ja) 筋強直性ジストロフィー１型を処置するためのｒｎａ標的化組成物および方法
CA3201392A1 (en) Aav vectors for gene editing
US12037588B2 (en) Compositions and methods comprising engineered short nuclear RNA (snRNA)
JP2021526858A (ja) Ｒｎａ標的化融合タンパク質組成物および使用方法
JP2023551873A (ja) Ｃａｇリピート病を処置するためのｒｎａ標的化組成物および方法
WO2023154807A2 (en) Compositions and methods for modulating pre-mrna splicing
JP2025069281A (ja) 調節可能な発現系
JP2021533803A (ja) Ｆａｓｌ免疫モジュレート遺伝子治療組成物および使用方法
KR20250092211A (ko) Rna 편집을 위한 프로그래밍 가능한 snrna를 포함하는 조성물 및 방법
WO2022221278A1 (en) Compositions and methods comprising hybrid promoters
WO2023205637A1 (en) Rna-targeting compositions and methods for treating c9/orf72 diseases
WO2023184107A1 (en) Crispr-cas13 system for treating mecp2-associated diseases
CN116801901A (zh) 用于治疗1型强直性肌营养不良的靶向rna的组合物和方法
CN117320741A (zh) 用于治疗cag重复疾病的靶向rna的组合物和方法
WO2023184108A1 (en) Crispr-cas13 system for treating ube3a-associated diseases
WO2025155722A1 (en) Muscle selective hybrid regulatory combinations and methods of use thereof for the treatment of myotonic dystrophy type 1
WO2025072530A2 (en) Compositions and methods comprising small nuclear rna (snrna) for treating dmd
WO2024078345A1 (zh) snRNA核酸分子及其应用
WO2022234051A1 (en) Split prime editing enzyme
EP4532720A2 (en) Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20241129

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20241129