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JP2023551741A - 二重標的化化合物及びその調製方法と応用 - Google Patents

二重標的化化合物及びその調製方法と応用 Download PDF

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Abstract

本発明は、核医学及び分子イメージングの分野に関し、具体的には、二重標的化化合物及びその調製方法と応用に関する。二重標的化化合物の構造は、以下の式（Ｉ）に示すとおりである。本発明はまた、放射性核種で標識できる二重標的化化合物を提供し、その構造は、以下の式（Ｉ－１）又は式（Ｉ－２）に示すとおりである。本発明の二重標的化化合物は、ＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的の両方に対して高い親和性を有し、腫瘍内のＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的を相乗的に標的とすることができ、腫瘍での高い取り込み及び長い保持時間を示す。本発明はまた、上記の二重標的化化合物に基づく放射性核種標識二重標的化化合物、その調製方法、及びＦＡＰ及び／又はインテグリンαｖβ３の過剰発現を特徴とする疾患を診断又は治療するための薬物の調製における応用を提供する。JPEG2023551741000009.jpg150170

Description

本発明は、核医学及び分子イメージングの分野に関し、具体的には、線維芽細胞活性化タンパク質ＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とする放射性核種標識二重標的化化合物及びその調製方法、並びにＦＡＰ及び／又はインテグリンαｖβ３の過剰発現を特徴とする疾患の診断又は治療における上記化合物の応用に関する。
線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＦＡＰ）は、腫瘍間質の活性化線維芽細胞の表面に発現する膜セリンペプチダーゼであり、腫瘍の発生と進行に重要な役割を果たす。以前の研究では、ＦＡＰは通常、正常なヒト組織では発現しないが、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、及び膵臓癌などを含む上皮性悪性腫瘍の９０％以上で間質線維芽細胞の表面に選択的に高度に発現することが示されている。インテグリンαｖβ３（ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖβ３）は、細胞表面に位置するヘテロ二量体受容体であり、正常な血管内皮及び上皮細胞ではほとんど発現しないが、肺癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、膠芽細胞腫及び浸潤性黒色腫などの種々の固形腫瘍の細胞表面で高度に発現しており、また、すべての腫瘍組織の新生血管の内皮細胞膜でも高発現しており、これは、インテグリンαｖβ３が腫瘍の増殖、浸潤及び転移において重要な役割を果たすことを示唆している。アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含むポリペプチドは、インテグリンαｖβ３に特異的に結合することができる。腫瘍におけるＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３の広範な発現及び重要な役割を考慮して、ＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３は腫瘍イメージング及び治療における重要な標的となっている。
腫瘍の診断及び治療効率を更に向上させるために、従来技術では、２つの標的に対して同時に親和性を有する二重標的化プローブが開発されている。例えば、Ａｎｎａ Ｏｒｌｏｖａらは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）とガストリン放出ペプチド受容体（ＧＲＰＲ）に対して同時に親和性を有する二重標的化プローブを報告している。ＰＳＭＡとＧＲＰＲは前立腺で同時に高度に発現するため、この二重標的化プローブの欠点は、前立腺癌の放射線診断と治療にのみ適用され、他の腫瘍には適用できないことである。
ＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３は、主に腫瘍間質細胞及び新生血管に分布するため、複数種類の腫瘍で同時に高度に発現し、「汎腫瘍」二重標的化プローブを開発するための理想的な標的である。腫瘍の不均一性を考慮すると、腫瘍の診断及び治療効率を更に向上させるためには、ＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３の両方の標的に対して標的化の役割を果たすことができる標的化化合物を開発する必要がある。この二重標的化化合物は、腫瘍内のＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的を相乗的に標的とすることを達成するために、２つの標的に対して同時に高い親和性を有する必要があり、また、腫瘍での取り込み及び保持時間を増加させるために、体内で優れた薬物動態特性を有する必要がある。この二重標的化化合物に基づく放射性核種標識二重標的化化合物は、ＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的を同時に利用して、腫瘍内の有効な受容体の数及び利用効率を向上させることができ、それによって陽性腫瘍の検出効率及び／又は治療効率を改善するという課題を達成する。
上記の問題を解決するために、本発明の主な目的は、腫瘍内のＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的を相乗的に標的とし、腫瘍内での薬物の取り込み及び保持時間を増加させることができる新規な化合物構造を開発することである。
本発明の別の目的は、上記の新規な化合物の調製方法を提供し、便利で入手しやすい合成経路を介して腫瘍内のＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的を相乗的に標的とすることができる化合物を合成することである。
本発明の更に別の目的は、ＦＡＰ及び／又はインテグリンαｖβ３の過剰発現を特徴とする疾患の診断又は治療における上記化合物の応用を提供することである。
本発明の上記目的は、以下の技術的解決策によって達成される。
第１の態様では、本発明は、ＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とすることができる二重標的化化合物を提供し、その構造は同時にＦＡＰとインテグリンαｖβ３の特異的結合リガンド構造を含み、上記化合物の構造は以下の式（Ｉ）に示すとおりである。
第２の態様では、本発明は、ＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とする放射性核種で標識できる二重標的化化合物を提供し、その構造は同時にＦＡＰとインテグリンαｖβ３の特異的結合リガンド及び核種キレート構造を含み、本発明では、この構造をＦＡＰＩ－ＲＧＤ構造として表記し、上記化合物の構造は以下の式（Ｉ－１）又は式（Ｉ－２）に示すとおりである。
第３の態様では、ＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とすることができる放射性核種標識二重標的化化合物を提供し、これは、本発明の第２の態様に記載の化合物を放射性核種で標識することによって得られる。
本発明の解決策では、上記放射性核種は、α線放出同位体、β線放出同位体、γ線放出同位体、オージェ電子放出同位体又はＸ線放出同位体などから選択することができ、例えば、１８Ｆ、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１３９Ｌａ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、８６Ｙ、９０Ｙ、１４９Ｐｍ、１６５Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１４２Ｐｒ、１５９Ｇｄ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９７Ｒｕ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０１ｍＲｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、１５１Ｅｕ、１５３Ｅｕ、１６９Ｅｕ、２０１Ｔｌ、２０３Ｐｂ、２１２Ｐｂ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１９８Ａｕ、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈ、８９Ｚｒ又は１９９Ａｇのいずれかであり、より好ましい放射性核種は、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、１８８Ｒｅ又は２２５Ａｃである。
第４の態様では、本発明は、第２の態様に記載の二重標的化化合物及びその放射性核種標識化合物（即ち、本発明の第３の態様に記載の二重標的化化合物）の調製方法を提供し、本発明が提供する調製方法は以下を含む。
（１）まず６－ヒドロキシキノリン－４－カルボン酸のカルボキシル基をグリシンｔｅｒｔ－ブチルエステルのアミノ基とアミド縮合反応させる。アミド縮合生成物のヒドロキシル基の位置でアルキル鎖を介してＢｏｃで保護されたピペラジニル基を連結する。酸性条件下でＢｏｃ保護基及びｔｅｒｔ－ブチル保護基を除去し、縮合生成物のピペラジン環にＢｏｃ保護基を導入する。（Ｓ）－ピロリジン－２－カルボニトリル塩酸塩とアミド縮合反応させる。Ｂｏｃ保護基を除去し、Ｎ－Ｂｏｃ－３－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］プロピオン酸と縮合反応させる。Ｂｏｃ保護基を除去し、Ｆｍｏｃ－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｌ－グルタミン酸と反応させる。ｔｅｒｔ－ブチルエステルを除去し、活性化エステルを調製し、アミノ－ジポリエチレングリコールを含むｃ（ＲＧＤｆＫ）と反応させて、二重標的化化合物を得る。Ｆｍｏｃ保護を除去し、核種キレート剤（核種キレート剤は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’－四酢酸又は１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸である）と反応させる。キレート基のｔｅｒｔ－ブチルエステル保護を除去して、放射性核種で標識できる二重標的化化合物、即ち、本発明の第２の態様に記載の二重標的化化合物を得る。
（２）従来の湿式標識法又は凍結乾燥標識法に従って、（１）で得られた放射性核種で標識できる二重標的化化合物を放射性核種を含む化合物と反応させて、本発明の第３の態様に記載のＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とすることができる放射性核種標識二重標的化化合物を得る。
第５の態様では、本発明は医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、本発明の第１の態様に記載のＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とすることができる二重標的化化合物、本発明の第２の態様に記載のＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とする放射性核種で標識できる二重標的化化合物、第３の態様に記載のＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とすることができる放射性核種標識二重標的化化合物、又はそれらの薬学的に許容される任意の互変異性体、ラセミ体、水和物、溶媒和物若しくは塩を含む。
第６の態様では、本発明はまた、動物又はヒト対象におけるＦＡＰ及び／又はインテグリンαｖβ３の過剰発現を特徴とする疾患を診断又は治療するための薬物の調製における、本発明の第１の態様に記載のＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とすることができる二重標的化化合物、第２の態様に記載のＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とする放射性核種で標識できる二重標的化化合物、第３の態様に記載のＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３を標的とすることができる放射性核種標識二重標的化化合物、又は第５の態様に記載の医薬組成物の応用を提供する。
本発明の応用において、ＦＡＰ及び／又はインテグリンαｖβ３の過剰発現を特徴とする疾患は、癌、慢性炎症、アテローム性動脈硬化症、線維症、組織リモデリング及び瘢痕疾患を含むが、これらに限定されず、好ましくは、上記癌は更に、乳癌、膵臓癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、肝細胞癌、食道癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、骨髄腫細胞、膀胱癌、胆管癌、淡明細胞型腎細胞癌、神経内分泌腫瘍、発癌性骨軟化症、肉腫、ＣＵＰ（原発不明癌）、胸腺癌、神経膠腫、神経膠腫、星状細胞腫、子宮頸癌、又は前立腺癌から選択される。
本発明が提供するＦＡＰＩ－ＲＧＤ化合物構造は、ＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的の両方に対して高い親和性を有し、腫瘍内のＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的を相乗的に標的とすることができ、腫瘍での高い取り込み及び長い保持時間を示し、ＦＡＰ及び／又はインテグリンαｖβ３の過剰発現を特徴とする疾患の診断又は治療への応用が期待される。
更に、本発明が提供するＦＡＰＩ－ＲＧＤ化合物の調製方法は、反応経路が単純で、操作が簡単であり、製造原料が安価で入手しやすく、生産コストが低く、工業生産に適している。
化合物７の水素核磁気共鳴スペクトルである。 化合物７の炭素核磁気共鳴スペクトルである。 化合物７のマススペクトルである。 化合物８のマススペクトルである。 化合物９のマススペクトルである。 化合物１２のマススペクトルである。 化合物１３のマススペクトルである。 化合物１４のマススペクトルである。 化合物１５のマススペクトルである。 本発明による６８Ｇａ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ（式Ｉ－１）複合体の生理食塩水中での安定性実験の結果を示す図である。 本発明による６８Ｇａ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ（式Ｉ－１）複合体の細胞取り込み及び細胞結合実験の結果を示す図である。 ＨＴ１０８０－ＦＡＰ担癌マウスにおける、本発明による６８Ｇａ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ（式Ｉ－１）複合体及びモノマー６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－０２と６８Ｇａ－Ｃ（ＲＧＤｆＫ）のＭｉｃｒｏＰＥＴイメージング結果を示す図である。 本発明による６８Ｇａ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ（式Ｉ－１）複合体及びＣ（ＲＧＤｆＫ）及び／又はＦＡＰＩ－０２を同時注射してから３０分後のＭｉｃｒｏＰＥＴイメージング結果及び腫瘍と重要臓器の取り込み結果の統計グラフである。 ＨＴ１０８０－ＦＡＰ担癌マウスにおける、本発明の実施例４で調製した１７７Ｌｕ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体のＳＰＥＣＴイメージング結果を示す図である。 ６８Ｇａで標識された対照化合物ＦＡＰＩ－ＲＧＤの複合体の分子構造、ＨＴ１０８０－ＦＡＰ担癌マウスに該対照化合物を注射してから３０分及び２時間後のＭｉｃｒｏＰＥＴイメージング結果、及び腫瘍と重要臓器の取り込み結果の統計グラフである。 膵臓癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌及び鼻咽頭癌の患者に本発明による６８Ｇａ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ（式Ｉ－１）複合体、１８Ｆ－ＦＤＧ及び６８Ｇａ－ＦＡＰＩ４６を注射してから３時間後のＰＥＴ／ＣＴイメージング結果を示す図である。
以下、添付の図面と併せて具体的な実施形態を通じて本発明の技術的解決策を更に例示及び説明する。
実施例１：化合物Ｉ－１の調製
化合物２の合成：
１００ｍＬフラスコ中のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３０ｍＬに、化合物１（６－ヒドロキシキノリン－４－カルボン酸、１．８９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、グリシンｔｅｒｔ－ブチルエステル（１．８９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３．８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）をそれぞれ順に加えた。反応混合物を一晩撹拌し、溶媒を減圧蒸留により除去して粗生成物を得た。シリカゲルカラム（ジクロロメタン／メタノール＝３０：１）で精製して、化合物２を白色固体として８７％の収率で得た。
化合物３の合成：
１００ｍＬフラスコ中のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５０ｍＬに、化合物２（１．５１ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、１－ブロモ－３－クロロプロパン（１．５５ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１．３８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）をそれぞれ順に加えた。系の温度を６０℃に上げ、６０℃に維持して一晩撹拌し、溶媒を減圧蒸留により除去して粗生成物を得た。シリカゲルカラム（ジクロロメタン／メタノール＝５０：１）で精製して、化合物３を白色固体として６３％の収率で得た。
化合物４の合成：
１００ｍＬフラスコ中のアセトニトリル３０ｍＬに、化合物３（０．７６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルピペラジン（０．５５ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（０．４９ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をそれぞれ順に加えた。系の温度を６０℃に上げ、６０℃に維持して一晩撹拌し、溶媒を減圧蒸留により除去して粗生成物を得た。シリカゲルカラム（ジクロロメタン／メタノール＝３０：１）で精製して、化合物４を白色固体として５８％の収率で得た。
化合物５の合成：
氷浴条件下で化合物４（０．５２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタンとトリフルオロ酢酸の混合溶液１０ｍＬ（体積比９：１）に溶解し、系の温度を室温に上げて２時間反応させ、反応終了後、溶媒を減圧蒸留により除去し、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１０ｍＬに溶解して化合物５を得て次の反応に備えた。
化合物６の合成：
化合物５のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液に、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（０．２２ｇ、１．０ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．３９ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をそれぞれ加え、室温で一晩撹拌し、溶媒を減圧蒸留により除去して粗生成物を得た。シリカゲルカラム（ジクロロメタン／メタノール＝１０：１）で精製して、化合物６を白色固体として７２％の収率で得た。
化合物７の合成：
１００ｍＬフラスコ中のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１０ｍＬに、化合物６（０．４７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、（Ｓ）－ピロリジン－２－カルボニトリル塩酸塩（０．１３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．３８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．２６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）をそれぞれ順に加えた。反応混合物を室温で反応終了まで撹拌し、溶媒を減圧蒸留により除去して粗生成物を得た。シリカゲルカラム（ジクロロメタン／メタノール＝５０：１）で精製して、化合物７を白色固体として８５％の収率で得た。図１は化合物７の水素核磁気共鳴スペクトルであり、図２は化合物７の炭素核磁気共鳴スペクトルであり、図３は化合物７のマススペクトルである。
化合物８の合成：
化合物７（２．５０ｇ、４．５ｍｍｏｌ）、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（２．５８ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）、及びアセトニトリル２５ｍＬを反応フラスコに加え、６５℃で１時間反応させ、ＴＬＣで化合物７の反応の完了をモニタリングし（メタノール：ジクロロメタン＝５：１）、減圧下、４０℃で蒸発乾固した。ＤＭＦ１４ｍＬ及びＤＩＰＥＡ（３．０５ｇ、２３．６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で撹拌した。この反応を番号（１）とする。即ち、化合物７のピペラジン脱保護により中間体を得た。別の反応フラスコにＮ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－ジエチレングリコール－カルボン酸（１．６２ｇ、４．８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２．６０ｇ、６．８ｍｍｏｌ）、及びＤＭＦ１０ｍＬを加え、２５℃で３０分間反応させた。この反応を番号（２）とする。反応（２）の反応溶液系を反応（１）系に滴下し、１時間反応させた。減圧下、４０℃で蒸発乾固し、精製水５０ｍＬを加え、ＤＣＭで２回、各回５０ｍＬで抽出し、ＤＣＭを合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発乾固して粗生成物を得て、粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物１．６８ｇを得た。理論分子量は７０９．３７９９、測定分子量は７０９．３８８０１であり、マススペクトル結果は目的物と一致した。図４は化合物８のマススペクトルである。
化合物９の合成：
化合物８、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（１．６１ｇ、８．５ｍｍｏｌ）、及びアセトニトリル２０ｍＬを反応フラスコに加え、６５℃で１時間反応させ、減圧下、４０℃で蒸発乾固した。ＤＭＦ２０ｍＬ及びＤＩＰＥＡ（１．８３ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で撹拌した。この反応を番号（１）とする。別の反応フラスコにＦｍｏｃ－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｌ－グルタミン酸（１．４３ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．２９ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、及びＤＭＦ２０ｍＬを加え、２５℃で３０分間反応させた。この反応を番号（２）とする。反応（２）の反応溶液系を反応（１）系に滴下し、１時間反応させた。減圧下、４０℃で蒸発乾固して粗生成物を得て、粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物１．１９ｇを得た。理論分子量は１０１６．５００８、測定分子量は１０１６．５１０９４であり、マススペクトル結果は目的物と一致した。図５は化合物９のマススペクトルである。
化合物１２の合成：
ｃ（ＲＧＤｆＫ）（１．００ｇ、１．７ｍｍｏｌ）、アミノｔｅｒｔ－ブチルエステル－ジポリエチレングリコール－スクシンイミドエステル（０．７４ｇ、１．９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．４４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、及びＤＭＦ２０ｍＬを反応フラスコに加え、３０℃で２０時間反応させた。減圧下、４０℃で蒸発乾固し、メタノール１０ｍＬを加え、ＭＴＢＥ６０ｍＬを滴加し、固体を沈殿させて中間体１１を得て、この中間体を吸引濾過し、４０℃で真空下で２時間乾燥した。固体の中間体１１を反応フラスコに加え、ＴＦＡ３０ｍＬ及び精製水１．５ｍＬを加え、３０℃で１時間反応させ、０～５℃に冷却し、ＭＴＢＥ２００ｍＬを滴下し、０～５℃で３０分間撹拌し、吸引濾過し、ＭＴＢＥですすぎ、４０℃で真空下で乾燥して生成物を得た。理論分子量は７６２．４０２４、測定分子量は７６２．４０７６８であり、マススペクトル結果は目的物と一致した。図６は化合物１２のマススペクトルである。
化合物１３の合成：
化合物９、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（０．３４ｇ、１．８ｍｍｏｌ）、及びアセトニトリル２０ｍＬを反応フラスコに加え、６５℃で４時間反応させ、減圧下、４０℃で蒸発乾固した。ＤＭＦ２０ｍＬ、ＤＩＰＥＡ（０．３６ｇ、２．８ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．１４ｇ、０．７ｍｍｏｌ）、及びＮＨＳ（０．０８ｇ、０．７ｍｍｏｌ）を加え、３５℃で１５～２０時間反応させて中間体１０を得た。次に、２５℃に冷却し、化合物１２を加え、１時間反応させ、減圧下、４０℃で蒸発乾固して粗生成物を得て、粗生成物を分取液体クロマトグラフィーで精製して目的物６６．５ｍｇを得た。理論分子量は１７０４．８３００、測定分子量は１７０４．８４５１８であり、マススペクトル結果は目的物と一致した。図７は化合物１３のマススペクトルである。
化合物１４の合成：
化合物１３、ピペリジン０．５ｍＬ、及びＤＭＦ２ｍＬを反応フラスコに加え、２５℃で１時間反応させ、酢酸エチル１０ｍＬを滴下して結晶化させ、３０分間撹拌し、吸引濾過した。固体を４０℃で真空下で２時間乾燥し、生成物５０．８ｍｇを得た。Ｆｍｏｃ保護が除去された化合物１３をＤＭＦ２ｍＬに溶解し、ＮＯＴＡ－２ ｔｅｒｔ－ブチルエステル－ＮＨＳ活性化エステル及びＤＩＰＥＡ（０．０１０ｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１時間反応させ、減圧下、４０℃で蒸発乾固し、酢酸エチル２ｍＬとＭＴＢＥ２ｍＬを加えて結晶化させ、２０分間撹拌し、吸引濾過した。固体を４０℃で真空下で乾燥し、生成物４３．２ｍｇを得た。理論分子量は１８８０．０１９６、測定分子量は１８８０．０３６９であり、マススペクトル結果は目的物と一致した。図８は化合物１４のマススペクトルである。
化合物１５の合成：
化合物１４及びトリフルオロ酢酸２ｍＬを反応フラスコに加え、２５℃で１時間反応させ、減圧下、４０℃で蒸発乾固して粗生成物を得て、粗生成物を分取液体クロマトグラフィーで精製し、凍結乾燥して、生成化合物１５を４２％の収率で得た。理論分子量は１７６７．８９４４、測定分子量は１７６７．９１０３６であり、マススペクトル結果は目的物と一致した。図９は化合物１５のマススペクトルである。
上記ステップの合成経路は以下のとおりである。
実施例２
実施例２の調製方法については、実施例１を参照し、上記の実施例におけるＮＯＴＡ－２ ｔｅｒｔ－ブチルエステル－ＮＨＳ活性化エステルをＤＯＴＡ－３ ｔｅｒｔ－ブチルエステル－ＮＨＳ活性化エステルに置き換えて、以下の構造を得た。
実施例３：放射性Ｇａ－６８標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ式（Ｉ－１）複合体（６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ）の調製
湿式法：実施例１で調製した式（Ｉ－１）の構造を有する化合物の酢酸－酢酸塩溶液（１．０ｇ／Ｌ）０．５ｍＬの入った遠心管に、約１８．５～１８５０メガベクレル（ＭＢｑ）の６８ＧａＣｌ３塩酸溶液（ゲルマニウムガリウム発生器から溶出）を加え、３７℃で２０分間反応させた。Ｃ１８分離カートリッジを取り出し、まず無水エタノール１０ｍＬでゆっくりとすすぎ、次に水１０ｍＬですすいだ。標識溶液を水１０ｍＬで希釈した後、分離カラムにロードし、まず水１０ｍＬで標識されていない６８Ｇａイオンを除去し、次に、１０ｍＭ ＨＣｌエタノール溶液０．３ｍＬですすいで６８Ｇａ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体を得た。溶出液を生理食塩水で希釈し、無菌濾過して６８Ｇａ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体の注射液を得た。
凍結乾燥法：式（Ｉ－１）の化合物を含む凍結乾燥キットに、約１８．５～１８５０メガベクレル（ＭＢｑ）の６８ＧａＣｌ３塩酸溶液（ゲルマニウムガリウム発生装置から溶出）を加え、均一に混合し、３７℃で２０分間反応させた。Ｃ１８分離カートリッジを取り、まず無水エタノール１０ｍＬでゆっくりとすすぎ、次に水１０ｍＬですすいだ。標識溶液を水１０ｍＬで希釈した後、分離カラムにロードし、まず水１０ｍＬで標識されていない６８Ｇａイオンを除去し、次に、１０ｍＭ ＨＣｌエタノール溶液０．３ｍＬですすいで複合体溶出液を得た。溶出液を生理食塩水で希釈し、無菌濾過して６８Ｇａ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体の注射液を得た。
実施例４：放射性Ｌｕ－１７７標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ式（Ｉ－２）複合体（１７７Ｌｕ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ）の調製
ｐＨ＝５．５の緩衝液の調製：酢酸５７．６ｍｇ、ゲンチシン酸１８９ｍｇ、及び酢酸ナトリウム三水和物５２５ｍｇを秤量し、純水４８ｍｌに溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ５．５に調整した。実施例２で調製した式（Ｉ－２）の構造を有する化合物２００μｇを緩衝液（ｐＨ＝５．５）２００μＬで完全に溶解し、次に緩衝液（ｐＨ＝５．５）５ｍＬ及び約１５０ｍＣｉの１７７ＬｕＣｌ３塩酸溶液を加えた。混合物を均一に振とうし、８０℃で加熱して２０分間反応させた。反応終了後、室温まで冷却した。反応液を生理食塩水で希釈し、無菌濾過して１０ｍＣｉ／ｍＬの１７７Ｌｕ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体の注射液を得た。
実施例：分析及び適用効果
１、６８Ｇａ標識式（Ｉ－１）ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体の安定性分析
実施例３で調製した６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ（３．７ＭＢｑ活量／２０μＬ）の溶液２０μＬを生理食塩水又はＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）１００μＬを含む遠心管にピペットで移し、３７℃で０．５時間、１時間、及び４時間共インキュベートして共インキュベーション溶液を得た。共インキュベーション溶液２０μＬを０．２２μｍニードルフィルタ膜で濾過し、ＨＰＬＣにより放射化学的純度を分析した。試験結果を図１０に示す。６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤを生理食塩水中でインキュベートした後、明らかな分解は見られず、放射化学的純度は９９％を超えた。これは、本発明によって調製された６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤが安定性に優れていることを示している。
２、６８Ｇａ標識式（Ｉ－１）ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体の細胞実験分析
ＨＴ１０８０－ＦＡＰ腫瘍細胞で６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤの細胞取り込み実験を行った。試験結果を図１１の部分Ａに示す。６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤは、急速に細胞に取り込まれ、３０分間のインキュベーションで取り込みは最大に達し、同様の取り込みレベルを最大２時間維持した。更に、遮断実験により、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤの細胞取り込みがＣ（ＲＧＤｆＫ）又はＦＡＰＩ－０２によって部分的に阻害される可能性があり、ＦＡＰＩ－ＲＧＤによって完全に遮断される可能性があることが確認された（図１１の部分Ａを参照）ＨＴ１０８０－ＦＡＰ及びＵ８７ＭＧ腫瘍細胞で細胞結合実験を行った。その試験結果を図１１のＢ及びＣにそれぞれ示す。ＨＴ１０８０－ＦＡＰ細胞実験では、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤと６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－０２のＩＣ５０はそれぞれ１１．１７ｎＭと４．１４ｎＭであった。ＨＴ１０８０－ＦＡＰ細胞実験では、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤと６８Ｇａ－Ｃ（ＲＧＤｆＫ）のＩＣ５０はそれぞれ１８．９３ｎＭと１１．４９ｎＭであった。実験結果は、ＦＡＰＩ－ＲＧＤが、対応するモノマーと比較して、その対応する受容体ＦＡＰ及びインテグリンαｖβ３に対して類似の親和性を有することを示している。
３、担癌マウスにおける６８Ｇａ標識式（Ｉ）ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体のＭｉｃｒｏＰＥＴイメージング
実施例３の方法に従って６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤを調製し、ＨＴ１０８０－ＦＡＰ担癌マウスにおいて、無作為にグループ化されたマウスに７．４ＭＢｑの６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－０２、及び６８Ｇａ－Ｃ（ＲＧＤｆＫ）をそれぞれ尾静脈から注射し、次に、イソフルラン麻酔下で、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ群では投与から０～２４０分後にＭｉｃｒｏＰＥＴイメージングを行い、他の群では投与から０～１２０分後にそれぞれＭｉｃｒｏＰＥＴイメージングを行った。結果を図１２に示す。図１２中のＡ、Ｃ及びＥはそれぞれ、上記の３群のマウスの静脈内注射後の異なる時間におけるＨＴ１０８０－ＦＡＰ担癌マウス（ｎ＝３）のＭｉｃｒｏＰＥＴ最大密度投影画像を示し、Ｂ、Ｄ及びＦはそれぞれ、上記の３群のマウスの注射後の異なる時点における各臓器又は組織（血液、肝臓、腎臓、腫瘍、及び筋肉）の取り込みを示し、各群の３つの取り込みは、左から右にそれぞれ注射後０．５時間、１時間、２時間に対応する。図１２は、画像が取得された時点で、腫瘍がはっきりと見え、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤがモノマー６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－０２及び６８Ｇａ－Ｃ（ＲＧＤｆＫ）よりも腫瘍での取り込みが高かったことを示す。６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤが体内でインテグリンαｖβ３及びＦＡＰに特異的に結合する能力は、遮断実験によって確認された。上記の６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤをＣ（ＲＧＤｆＫ）又はＦＡＰＩ－０２とともにＨＴ１０８０－ＦＡＰ担癌マウスに同時注射し、そのＭｉｃｒｏＰＥＴイメージング結果及び臓器取り込み結果を図１３に示す。図１３では、Ａの左から右への４つの画像はそれぞれ、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ単一注射、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤとＣ（ＲＧＤｆＫ）の同時注射、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤとＦＡＰＩ－０２の同時注射、及び６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤとＣ（ＲＧＤｆＫ）とＦＡＰＩ－０２の同時注射によって得られた画像であり、Ｂ及びＣはそれぞれ、上記の４つの異なる注射方法による注射後のマウスの各臓器又は組織（血液、肝臓、腎臓、腫瘍、及び筋肉）の６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ取り込み及び標的／非標的比を示し、Ｂ及びＣにおける各臓器又は組織の４つの棒グラフはそれぞれ、左から右にＡの４つの注射方法に対応する。図１３からわかるように、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤとＲＧＤ又はＦＡＰＩ－０２の同時注射はいずれも、腫瘍の６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ取り込みを減少させることができ、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤとＣ（ＲＧＤｆＫ）＋ＦＡＰＩ－０２の同時注射は、腫瘍の６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤ取り込みを更に減少させ、遮断実験により、６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤが体内でインテグリンαｖβ３及びＦＡＰに結合することによって腫瘍特異的標的化を達成できることが確認された。
４、担癌マウスにおける１７７Ｌｕ標識式（ＩＩ）ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体のＳＥＰＣＴイメージング
実施例４の方法に従って１７７Ｌｕ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤを調製し、ＨＴ１０８０－ＦＡＰ担癌マウスに、３７ＭＢｑの１７７Ｌｕ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤをそれぞれ尾静脈から注射し、次に、イソフルラン麻酔下で投与から４時間後にＳＰＥＣＴイメージングを行った。結果を図１４に示す。投与から４時間後に腫瘍がはっきりと見えたことがわかる。
５、担癌マウスにおける６８Ｇａ標識ＦＡＰＩ－ＲＧＤ（対照化合物）複合体のＭｉｃｒｏＰＥＴイメージング
対照として、マレイミド－チオールによって形成されたスルホスクシンイミド結合を連結構造として、図１５Ｂの化合物を調製し、そして実施例３の方法に従って６８Ｇａで標識し、ＨＴ１０８０－ＦＡＰ担癌マウスでＭｉｃｒｏＰＥＴイメージングを行った。その結果を図１５に示す。図１５Ａは、画像が取得された時点で、主な放射性シグナルが肝臓と腎臓に集中し、腫瘍での取り込みが少なかったことを示す。図１５Ｃも肝臓及び腎臓での高い取り込み及び腫瘍での低い取り込みを示す。したがって、連結構造としてのスルホスクシンイミド結合は、標的化基と標的化受容体との親和性を低下させる可能性があり、その結果、標的臓器での取り込みが減少し、一方、非標的組織での取り込みが高すぎて、標的／非標的比が低下し、副作用が起こりやすくなる。本発明における特定の連結構造は、受容体との高い親和性を確保するだけでなく、適切な薬物動態特性も提供することができ、それによって、腫瘍での高い絶対取り込み及び標的／非標的比を確保する。
６、腫瘍患者における６８Ｇａ標識式（Ｉ－１）ＦＡＰＩ－ＲＧＤ複合体のＰＥＴ／ＣＴイメージング
厦門大学附属第一病院の臨床研究倫理委員会の承認を得て６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤの臨床試験を実施した。膵臓癌患者１人、非小細胞肺癌患者１人、小細胞肺癌患者１人、及び鼻咽頭癌患者１人を含むすべての被験者は書面によるインフォームドコンセントに署名した。被験者の体重に応じて６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤの静脈内投与量（１．８～２．２ＭＢｑ［０．０５～０．０６ｍＣｉ］／ｋｇ）を算出した。静脈内注射から３時間後、ハイブリッドＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＭＩ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用してデータを取得し、イメージング結果を図１６に示す。アキシャル画像上に描かれた関心領域（ＲＯＩ）を用いて最大標準取り込み値（ＳＵＶｍａｘ）を自動的に計算した。異なる種類の腫瘍における二重標的化６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－ＲＧＤのＳＵＶｍａｘはいずれも、ＦＡＰタンパク質単一標的化６８Ｇａ－ＦＡＰＩ－４６よりも高く、ＳＵＶｍａｘは約３０～５０％増加し、これは、二重標的化設計が、腫瘍内の有効な受容体の数及び利用効率を向上させ、それによって腫瘍での取り込みを増加させることができることを証明した。
要約すると、本発明はＦＡＰＩ－ＲＧＤ構造を開発し、これは、ＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的の両方に対して高い親和性を有し、腫瘍内のＦＡＰ標的及びインテグリンαｖβ３標的を相乗的に標的とすることができ、優れた代謝動態、腫瘍での高い取り込み及び長い保持時間を示し、ＦＡＰ及び／又はインテグリンαｖβ３の過剰発現を特徴とする疾患の診断又は治療への応用が期待される。
以上、本発明を一般的な説明、具体的な実施形態及び試験により詳細に説明したが、本発明に基づいていくつかの変更又は改善を行うことができることは当業者には明らかである。したがって、本発明の精神から逸脱しない範囲で行われたこれらの変更又は改善は、すべて本発明の保護範囲に属する。

Claims (11)

  1. 二重標的化化合物であって、その構造が同時にＦＡＰとインテグリンαｖβ３の特異的結合リガンド構造を含み、前記化合物の構造が以下の式（Ｉ）に示すとおりである、ことを特徴とする二重標的化化合物。
  2. 放射性核種で標識できる二重標的化化合物であって、その構造が同時にＦＡＰとインテグリンαｖβ３の特異的結合リガンド及び核種キレート構造を含み、前記化合物の構造が以下の式（Ｉ－１）又は式（Ｉ－２）に示すとおりである、ことを特徴とする放射性核種で標識できる二重標的化化合物。
  3. 請求項２に記載の放射性核種で標識できる二重標的化化合物の調製方法であって、まず６－ヒドロキシキノリン－４－カルボン酸のカルボキシル基をグリシンｔｅｒｔ－ブチルエステルのアミノ基とアミド縮合反応させるステップと、アミド縮合生成物のヒドロキシル基の位置でアルキル鎖を介してＢｏｃで保護されたピペラジニル基を連結するステップと、酸性条件下でＢｏｃ保護基及びｔｅｒｔ－ブチル保護基を除去し、縮合生成物のピペラジン環にＢｏｃ保護基を導入するステップと、（Ｓ）－ピロリジン－２－カルボニトリル塩酸塩とアミド縮合反応させるステップと、Ｂｏｃ保護基を除去し、Ｎ－Ｂｏｃ－３－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］プロピオン酸と縮合反応させるステップと、Ｂｏｃ保護基を除去し、Ｆｍｏｃ－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｌ－グルタミン酸と反応させるステップと、ｔｅｒｔ－ブチルエステルを除去し、活性化エステルを調製し、アミノ－ジポリエチレングリコールを含むｃ（ＲＧＤｆＫ）と反応させて、二重標的化化合物を得るステップと、Ｆｍｏｃ保護を除去し、核種キレート剤（核種キレート剤は、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’－四酢酸又は１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸である）と反応させるステップと、キレート基のｔｅｒｔ－ブチルエステル保護を除去して、放射性核種で標識できる二重標的化化合物を得るステップとを含む、ことを特徴とする調製方法。
  4. 放射性核種標識二重標的化化合物であって、請求項２に記載の放射性核種で標識できる二重標的化化合物のいずれかを放射性核種で標識することによって得られるものであり、前記放射性核種は、α線放出同位体、β線放出同位体、γ線放出同位体、オージェ電子放出同位体又はＸ線放出同位体から選択される、ことを特徴とする放射性核種標識二重標的化化合物。
  5. 前記放射性核種は、１８Ｆ、５１Ｃｒ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１３９Ｌａ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、８６Ｙ、９０Ｙ、１４９Ｐｍ、１６５Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１４２Ｐｒ、１５９Ｇｄ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９７Ｒｕ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０１ｍＲｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、１５１Ｅｕ、１５３Ｅｕ、１６９Ｅｕ、２０１Ｔｌ、２０３Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１９８Ａｕ、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈ又は１９９Ａｇのいずれかから選択される、ことを特徴とする請求項４に記載の放射性核種標識二重標的化化合物。
  6. 前記放射性核種は、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、１８８Ｒｅ又は２２５Ａｃから選択される、ことを特徴とする請求項４に記載の放射性核種標識二重標的化化合物。
  7. 請求項４に記載の放射性核種標識二重標的化化合物の調製方法であって、湿式標識法又は凍結乾燥標識法に従って請求項２に記載の放射性核種で標識できる二重標的化化合物を放射性核種を含む化合物と反応させて、前記放射性核種標識二重標的化化合物を得るステップを含む、ことを特徴とする調製方法。
  8. 請求項１に記載の二重標的化化合物、請求項２に記載の放射性核種で標識できる二重標的化化合物、請求項４に記載の放射性核種標識二重標的化化合物、又はそれらの薬学的に許容される水和物、溶媒和物若しくは塩を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
  9. 動物又はヒト対象におけるＦＡＰ及び／又はインテグリンαｖβ３の過剰発現を特徴とする疾患を診断又は治療するための薬物の調製における、請求項１に記載の二重標的化化合物、請求項２に記載の放射性核種で標識できる二重標的化化合物、請求項４に記載の放射性核種標識二重標的化化合物、それらの薬学的に許容される水和物、溶媒和物若しくは塩、又は請求項８に記載の医薬組成物のいずれかの応用。
  10. 前記ＦＡＰ及び／又はインテグリンαｖβ３の過剰発現を特徴とする疾患は、癌、慢性炎症、アテローム性動脈硬化症又は瘢痕疾患を含む、ことを特徴とする請求項９に記載の応用。
  11. 前記前記癌は、乳癌、膵臓癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、肝細胞癌、食道癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、骨髄腫細胞、膀胱癌、胆管癌、淡明細胞型腎細胞癌、神経内分泌腫瘍、発癌性骨軟化症、肉腫、原発不明癌、胸腺癌、神経膠腫、神経膠腫、星状細胞腫、子宮頸癌、又は前立腺癌から選択される、ことを特徴とする請求項１０に記載の応用。
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