JP2023532784A - グアニジノ酢酸の発酵産生方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を産生することができるようにＬ－アルギニン：グリシンアミドトランスフェラーゼおよびグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよび還元型リンゴ酸シンターゼで形質転換された微生物、ならびにそのような微生物を用いたＧＡＡの発酵産生方法に関するものである。本発明はまた、クレアチンの発酵産生方法に関するものである。
Description
本発明は、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を産生することができるように形質転換された微生物、およびそのような微生物を用いたＧＡＡの発酵産生方法に関するものである。本発明はまた、クレアチンの発酵産生方法に関するものである。
ＧＡＡは、動物用飼料添加物として使用されている有機化合物である（米国特許出願公開第２０１１２５７０７５号明細書）。ＧＡＡはクレアチンの天然前駆体である（例えば、Humm et al., Biochem. J. (1997) 322, 771-776）。したがって、ＧＡＡを添加することにより生体内にクレアチンの最適な供給が可能となる。
本発明は、工業用原料（例えば、アンモニア、アンモニウム塩およびグルコースまたは糖含有基質）を出発物質として用いた発酵プロセスによりＧＡＡを産生する方法に関するものである。生体系では、アルギニンおよびグリシンを出発物質として、Ｌ－アルギニン：グリシン－アミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ；ＥＣ２．１．４．１）の触媒作用によりＧＡＡおよびＬ－オルニチンが生成され、これがクレアチン生合成の第１段階となる：
Ｇｕｔｈｍｉｌｌｅｒら（J Biol Chem. 1994 Jul 1;269(26):17556-60）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で酵素をクローニングし異種発現させることにより、ラット腎臓ＡＧＡＴの特性を明らかにした。Ｍｕｅｎｃｈｈｏｆｆら（FEBS Journal 277 (2010) 3844-3860）は、同じく大腸菌で酵素をクローニングし異種発現させることにより、初めて原核生物由来のＡＧＡＴの特性を明らかにしたと報告している。Ｓｏｓｉｏら（Cell Chemical Biology 25, 540-549, May 17, 2018）は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）におけるシュードウリジマイシン（pseudouridimycin）の生合成経路を解明した。彼らは中間反応として、Ｌ－アルギニン：グリシン－アミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）であるＰｕｍＮが触媒するＬ－アルギニンとグリシンとの反応によるＧＡＡおよびＬ－オルニチンの生成を記載している。
ＧＡＡ合成の出発物質の１つであるＬ－アルギニンの産生を微生物、特に細菌で増やすためのアプローチも文献からいくつか知られている。Ｌ－アルギニン産生のためのコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の代謝工学に関する概要は、Ｐａｒｋら（NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618）により提供されている。彼らは、例えばＡＴＣＣ２１８３１（Nakayama and Yoshida 1974、米国特許第３８４９２５０号明細書）の既にＬ－アルギニンを産生するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株のランダム変異誘発およびＬ－アルギニン産生体のスクリーニング、ならびにシステム全体の代謝分析に基づく段階的で合理的な代謝工学を提案しており、菌株エンジニアリングステップを通してＬ－アルギニン産生量を徐々に増やしている。Ｙｉｍら（J Ind Microbiol Biotechnol (2011) 38:1911-1920）は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体上のａｒｇＲ遺伝子を破壊することにより、Ｌ－アルギニン生合成経路を制御する中央リプレッサータンパク質ＡｒｇＲをコードする遺伝子を不活性化すると、アルギニン産生株が向上することを示すことができていた。Ｇｉｎｅｓｙら（Microbial Cell Factories (2015) 14:29）は、アルギニン産生を強化するための大腸菌のエンジニアリングに成功したことを報告している。中でも、彼らはａｒｇＲリプレッサー遺伝子の欠失を提案していた。
アルギニン生合成オペロンａｒｇＲの発現を抑制する遺伝子を不活性化した遺伝子組換え株を用いる方法が、Ｓｕｇａらにより報告されている（米国特許出願公開第２００７００３１９４６号明細書）。特に、アルギニンオペロンを制御するａｒｇＲの欠失は、アルギニン産生に重要な因子と考えられてきた。
Ｆａｎ Ｗｅｎｃｈａｏは、非病原性微生物、例えばＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの発酵によるクレアチンの産生方法を開示している（中国特許出願公開第１０６０６５４１１号明細書）。この微生物は、以下の生体内変換機能を有している：グルコースのＬ－グルタミン酸への変換；Ｌ－グルタミン酸のＮ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸への変換；Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸のＮ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸セミアルデヒドへの変換；Ｎ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸セミアルデヒドのＮ－アセチル－Ｌ－オルニチンへの変換；Ｎ－アセチル－Ｌ－オルニチンのＬ－オルニチンへの変換；Ｌ－オルニチンのＬ－シトルリンへの変換；Ｌ－シトルリンのアルギニノコハク酸への変換；アルギニノコハク酸のＬ－アルギニンへの変換；Ｌ－アルギニンのグアニジノ酢酸への変換；そして最終的にグアニジノ酢酸のクレアチンへの変換。Ｆａｎ Ｗｅｎｃｈａｏは、この微生物が、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ、Ｎ－アセチルオルニチン－δ－アミノトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルオルニチナーゼ、オルニチン－カルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．４．１）、グアニジノ酢酸－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．１．２）からなる群より選択される１つまたは複数の酵素を過剰発現させることを提案している。この微生物は、好ましくは、グリシンアミジノトランスフェラーゼ（Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ）およびグアニジノ酢酸－Ｎ－メチルトランスフェラーゼを過剰発現させる。
ＧＡＡ生合成の第２の出発物質としては、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）の機能を有するタンパク質をコードする相同遺伝子を天然に備える微生物、またはＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）の機能を有するタンパク質をコードする異種遺伝子を備えた微生物におけるＧＡＡ生合成を向上させるためにグリシンの供給を増やすことが望ましいであろう。
大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの微生物に天然に存在する、いわゆるグリオキシル酸シャント経路は、三炭酸（ＴＣＡ）サイクル（クレプスサイクル）の副反応であり、イソクエン酸リアーゼによるイソクエン酸からのグリオキシル酸およびコハクの生成、リンゴ酸シンターゼによるグリオキシル酸およびアセチルＣｏＡからのリンゴ酸の生成を含む（Salusjarvi et al., Applied Microbiology and Biotechnology (2019) 103:2525-2535）。
グリオキシル酸は、アミノ酸などのアミノ供与体およびグリオキシル酸トランスアミナーゼの存在下でグリシンを生成するための出発物質として使用されてもよい。グリオキシル酸トランスアミナーゼは、アミノ酸からグリオキシル酸へのアミノ基の転移を触媒する。この転移の産物は、グリシンと対応するα－ケト酸とである。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのグリコール酸産生を向上させる試みにおいて、Ｚａｈｏｏｒら（Journal of Biotechnology 192 (2014) 366-375）は、リンゴ酸シンターゼ遺伝子ａｃｅＢの欠失により、とりわけグリオキシル酸前駆体の供給を増やすことを達成した。
グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼはいくつか知られており、アミノ供与体に対するそれらの基質特異性が異なる（例えば、Kameya et al. FEBS Journal 277 (2010) 1876-1885; Liepman and Olsen, Plant Physiol. Vol. 131, 2003, 215-227; Sakuraba et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 2004, p. 5513-5518; Takada and Noguchi, Biochem. J. (1985) 231, 157-163）。これらのグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの多くは、異なるアミノ酸をアミノ供与体として用いることができるため、しばしば異なるＥＣ番号で注釈が付けられている。しかしながら、これらのすべてのアミノトランスフェラーゼは、グリオキシル酸を受容体分子として用い、または逆反応の場合はグリシンを供与体分子として用いるという点で共通している。
グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質の例は、以下のものである：
グリシントランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．４）は、次の反応を触媒する：
Ｌ－グルタミン酸＋グリオキシル酸＜＝＞α－ケトグルタル酸＋グリシン。
グリシントランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．４）は、次の反応を触媒する：
Ｌ－グルタミン酸＋グリオキシル酸＜＝＞α－ケトグルタル酸＋グリシン。
グリシン：オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．３５）は、次の反応を触媒する：
Ｌ－アスパラギン酸＋グリオキシル酸＜＝＞オキサロ酢酸＋グリシン。
Ｌ－アスパラギン酸＋グリオキシル酸＜＝＞オキサロ酢酸＋グリシン。
アラニン：グリオキシル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．４４）は、次の反応を触媒する：
Ｌ－アラニン＋グリオキシル酸＜＝＞ピルビン酸＋グリシン。
Ｌ－アラニン＋グリオキシル酸＜＝＞ピルビン酸＋グリシン。
セリン：グリオキシル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．４５）は、次の反応を触媒する：
Ｌ－セリン＋グリオキシル酸＜＝＞３－ヒドロキシ－ピルビン酸＋グリシン。
Ｌ－セリン＋グリオキシル酸＜＝＞３－ヒドロキシ－ピルビン酸＋グリシン。
メチオニン：グリオキシル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．７３）は、次の反応を触媒する：
Ｌ－メチオニン＋グリオキシル酸＜＝＞４－（メチルスルファニル）－２－ケト－ブタン酸＋グリシン。
Ｌ－メチオニン＋グリオキシル酸＜＝＞４－（メチルスルファニル）－２－ケト－ブタン酸＋グリシン。
芳香族アミノ酸：グリオキシル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．６０）は、次の反応を触媒する：
芳香族アミノ酸＋グリオキシル酸＜＝＞芳香族ケト酸＋グリシン。
芳香族アミノ酸＋グリオキシル酸＜＝＞芳香族ケト酸＋グリシン。
キヌレニン：グリオキシル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．６３）は、次の反応を触媒する：
キヌレニン＋グリオキシル酸＜＝＞４－（２－アミノフェニル）－２，４－ジケト－ブタン酸＋グリシン。
キヌレニン＋グリオキシル酸＜＝＞４－（２－アミノフェニル）－２，４－ジケト－ブタン酸＋グリシン。
（Ｓ）－ウレイド－グリシン：グリオキシル酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．１１２）は、次の反応を触媒する：
（Ｓ）－ウレイド－グリシン＋グリオキシル酸＜＝＞Ｎ－カルバモイル－２－ケト－グリシン＋グリシン。
（Ｓ）－ウレイド－グリシン＋グリオキシル酸＜＝＞Ｎ－カルバモイル－２－ケト－グリシン＋グリシン。
しかしながら、これまで大腸菌およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの内因性グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼは報告されていない。さらに、ＧＡＡを野生型と比較して多く産生するのに適した微生物、およびそのような微生物を用いたＧＡＡのそれぞれの産生方法は報告されていない。
したがって、本発明の根底にある課題は、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）を産生できるように形質転換された微生物、特にＧＡＡ生合成の出発物質としてのグリシンの供給能力が向上した微生物、およびそのような微生物を用いたＧＡＡの発酵産生方法を提供することである。
この課題は、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、例えばＥＣ２．１．４．１）の機能を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、かつグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの機能を有する少なくとも１つのタンパク質を含む微生物によって解決される。
好ましくは、本発明による微生物において、グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの機能を有する少なくとも１つのタンパク質の酵素活性が、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している。
本発明による微生物は、グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも１つ含み得る。グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を有する少なくとも１つのタンパク質は、相同性または異種性であってもよい。好ましくは、グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が本発明の微生物中で過剰発現させられている。
好ましくは、本発明の微生物は、野生型微生物の能力と比較して、Ｌ－アルギニン産生能力が向上している。
本発明の文脈において、Ｌ－アルギニン産生能力が向上している微生物とは、自身の必要量を超えてＬ－アルギニンを産生している微生物を意味する。そのようなＬ－アルギニン産生微生物についての例は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ２１８３１であるか、またはＰａｒｋら（NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms5618）もしくはＧｉｎｅｓｙら（Microbial Cell Factories (2015) 14:29）により開示されるものである。
本発明の特定の実施形態において、本微生物は、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＥＣ６．３．４．１６）の機能を有する酵素の活性が、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している。
本発明による微生物において、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＥＣ．４．３．２．１）の機能を有する酵素の活性が、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加していてもよい。
さらに、本発明による微生物において、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．３．３）の機能を有する酵素の活性が、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している。
本発明による微生物において、アルギニノコハク酸シンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．３．４．５）の機能を有する酵素の活性も、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加していてもよい。
微生物における酵素活性の増加は、例えば、対応する内在性遺伝子を変異させることにより達成することができる。酵素活性を増加させるための更なる方策は、酵素をコードするｍＲＮＡを安定化させることであってもよい。また、上記酵素の活性の増加は、それぞれの酵素をコードする遺伝子を過剰発現させることによっても達成され得る。
本発明による微生物の更なる実施形態では、リンゴ酸シンターゼの機能を有するタンパク質の活性は、野生型微生物におけるそれぞれの活性と比較して低下している。
リンゴ酸シンターゼの機能を有するタンパク質の活性は、該タンパク質を野生型タンパク質よりも低い酵素活性を有するタンパク質に変異させることにより、リンゴ酸シンターゼの機能を有する酵素をコードする遺伝子の発現を野生型微生物におけるそれぞれの遺伝子の発現と比較して減弱させることにより、翻訳の効率を、例えば、ＡＴＧ開始コドンをＧＴＧに変更することにより、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に二次構造を導入することにより、もしくはコドン使用を減弱させることにより低下させることにより、またはリンゴ酸シンターゼの機能を有する酵素をコードする遺伝子を欠失させることにより減少させることができる。
また、本発明による微生物は、好ましくは、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．３．３）の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ａｒｇＦ／ａｒｇＦ２／ａｒｇＩ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（Ｅ．Ｃ．６．３．４．５）の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ａｒｇＧ）、およびアルギニノコハク酸リアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．３．２．１）の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、ａｒｇＨ）からなる群より選択される少なくとも１つまたは複数の過剰発現させられた遺伝子を含む。
さらに、本発明による微生物において、アルギニンオペロン（ａｒｇＣＪＢＤＦＲ）が過剰に発現していてもよい。
あるいは本発明による微生物において、アルギニン応答性リプレッサータンパク質ＡｒｇＲをコードするａｒｇＲ遺伝子は、減弱または欠失させられていてもよい。
本発明の更なる実施形態において、また必要に応じて、上記の改変に加えて、Ｌ－アルギニンの生合成経路の酵素をコードする遺伝子であって、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、アセチルグルタミン酸キナーゼ、アセチルグルタミルリン酸レダクターゼおよびアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをそれぞれコードするｇｄｈ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣおよび／またはａｒｇＤを含む遺伝子のうちの少なくとも１つまたは複数の遺伝子が、本発明による微生物において過剰発現させられている。
第１表は、異なる種、すなわち大腸菌、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）におけるアルギニン生合成に関与するかまたは寄与する酵素の異なる名称を示したものである。
遺伝子の過剰発現は、一般に、遺伝子のコピー数を増やすこと、および／または遺伝子を強力なプロモーターと機能的に結び付けること、および／またはリボソーム結合部位を強化すること、および／または開始コドンもしくは遺伝子全体のコドン使用の最適化、または上述の方法の選択もしくはすべてを含む組合せにより達成される。
本発明の更なる実施形態において、本発明による微生物においてＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、異種性である。
異種遺伝子とは、本来この遺伝子を有していない宿主生物にその遺伝子が挿入されていることを意味する。宿主への異種遺伝子の挿入は、組換えＤＮＡ技術によって行われる。組換えＤＮＡ技術を受けた微生物は、トランスジェニック、遺伝子改変またはリコンビナントと呼ばれる。
異種タンパク質とは、微生物中に天然に存在しないタンパク質を意味する。
相同遺伝子または内在性遺伝子とは、その機能自体を含む遺伝子または遺伝子のヌクレオチド配列が微生物において天然に存在するか、または微生物において「ネイティブ」であることを意味する。
相同タンパク質またはネイティブタンパク質とは、微生物において天然に存在するタンパク質を意味する。
Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）の機能を有するタンパク質は、アミジノトランスフェラーゼファミリーに属している。アミジノトランスフェラーゼファミリーは、グリシン（ＥＣ：２．１．４．１）およびイノサミン（ＥＣ：２．１．４．２）アミジノトランスフェラーゼを含み、それぞれクレアチンおよびストレプトマイシンの生合成に関与する酵素である。このファミリーには、アルギニンデイミナーゼ、ＥＣ：３．５．３．６も含まれる。これらの酵素は、反応：アルギニン＋Ｈ２Ｏ＜＝＞シトルリン＋ＮＨ３を触媒する。また、このファミリーには、ストレプトコッカス抗腫瘍糖タンパク質（Streptococcus anti tumour glycoprotein）も含まれる。また、Ｌ－アルギニン：グリシン－アミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ）活性を有する酵素またはタンパク質も、以下の刊行物：Pissowotzki K et al., Mol Gen Genet 1991;231:113-123 (PUBMED:1661369 EPMC:1661369); D’Hooghe I et al., J Bacteriol 1997;179:7403-7409 (PUBMED:9393705 EPMC:9393705); Kanaoka M et al., Jpn J Cancer Res 1987;78:1409-1414 (PUBMED:3123442 EPMC:3123442)に記載されているように、ＰＦＡＭファミリーに属する保存ドメイン：Ａｍｉｄｉｎｏｔｒａｎｓｆ（ＰＦ０２２７４）を持つと記載されている（: Marchler-Bauer A et al. (2017), “CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures.”, Nucleic Acids Res. 45(D1):D 200-D203.）。
本発明の微生物において、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子がさらに過剰発現させられていてもよい。遺伝子の過剰発現は、一般に、遺伝子のコピー数を増やすこと、および／または遺伝子を強力なプロモーターと機能的に結び付けること、および／またはリボソーム結合部位を強化すること、および／または開始コドンもしくは遺伝子全体のコドン使用の最適化、または上述の方法の選択もしくはすべてを含む組合せにより達成される。
本発明の微生物におけるＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１によるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同、好ましくは少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。本発明の更なる実施形態において、Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１によるアミノ酸配列と同じである。
本発明の特定の実施形態において、本発明による微生物においてグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２によるアミノ酸配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５によるアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８によるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含む。
本発明の微生物は、コリネバクテリウム属、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、または腸内細菌科属、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、またはシュードモナス属、好ましくはシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）に属するものであってもよい。
微生物、特に本発明の微生物において、野生型微生物におけるそれぞれの活性と比較して増加したタンパク質の酵素活性は、例えば、タンパク質の変異、特に、タンパク質に例えば酵素触媒反応の産物に対するフィードバック耐性を付与する変異によって、または酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が野生型微生物におけるそれぞれの遺伝子の発現と比較して増加していることによって達成することができる。
微生物、特に本発明の微生物における遺伝子の、野生型微生物におけるそれぞれの活性と比較した発現の増加または過剰発現は、遺伝子のコピー数を増やすこと、および／または制御因子を増強すること、例えば遺伝子を強力なプロモーターと機能的に結び付けること、および／またはリボソーム結合部位を強化すること、および／または開始コドンもしくは遺伝子全体のコドン使用の最適化により達成することができる。遺伝子発現にプラスの影響を与えるそのような制御因子の増強は、例えば、プロモーターの有効性を高めるために構造遺伝子の上流のプロモーター配列を改変すること、または前述のプロモーターをより有効なもしくはいわゆる強力なプロモーターに完全に置き換えることにより達成することができる。プロモーターは、遺伝子の上流に位置する。プロモーターとは、約４０～５０塩基対からなるＤＮＡ配列で、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の結合部位および転写開始点を構成し、それによって、制御されるポリヌクレオチドまたは遺伝子の発現の強さに影響を与えることができるものである。一般に、強力なプロモーターを選択することにより、例えば、元のプロモーターを、強力な、ネイティブな（元々他の遺伝子に割り当てられた）プロモーターと置き換えることにより、または例えばＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについてＭ．Ｐａｔｅｋら（Microbial Biotechnology 6 (2013), 103-117）が教示しているように、所与のネイティブプロモーターの特定の領域（例えば、そのいわゆる－１０および－３５領域）をコンセンサス配列に向かって改変することにより、細菌中の遺伝子の過剰発現または発現の増加を達成することが可能である。「強力な」プロモーターの例は、スーパーオキシドジムスターゼ（ｓｏｄ）プロモーター（“Psod”; Z. Wang et al., Eng. Life Sci. 2015, 15, 73-82）である。「機能的に結び付ける」とは、プロモーターが遺伝子と順次配置され、これにより遺伝子の転写をもたらすことを意味すると理解される。
遺伝暗号が縮退しているとは、あるアミノ酸が多くの異なるトリプレットでコードされている可能性があることを意味する。コドン使用という用語は、ある生物は、通常、あるアミノ酸に対応するすべての可能なコドンを同じ頻度で使用するわけではないという観察結果を意味する。その代わり、ある生物は、通常、特定のコドンに対してある種の優先傾向を示し、これらのコドンはある生物の転写遺伝子のコード配列の中でより頻繁に見出されることを意味する。将来の宿主にとって外来の、すなわち、異なる種からのある遺伝子が将来の宿主生物において発現させられるべきならば、前述の遺伝子のコード配列は、前述の将来の宿主生物のコドン使用に調整されるべきである（すなわち、コドン使用の最適化）。
上述の課題はさらに、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）の発酵産生方法であって、ａ）上記で定義した本発明による微生物を適切な培地で適切な条件下で培養するステップと、ｂ）培地中にＧＡＡを蓄積してＧＡＡ含有発酵ブロスを生成するステップとを含む、方法により解決される。
本発明による方法は、発酵ブロスからＧＡＡを単離するステップをさらに含んでもよい。
本発明による方法は、ＧＡＡを含む発酵ブロスを乾燥および／または造粒するステップをさらに含んでもよい。
本発明はさらに、グアニジノ酢酸－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．１．１．２）の活性を有する酵素をコードする遺伝子をさらに含む、上記に定義した微生物に関するものである。好ましくは、グアニジノ酢酸－Ｎ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子は過剰発現させられる。
本発明はまた、クレアチンの発酵産生方法であって、ａ）グアニジノ酢酸－Ｎ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子を含む本発明による微生物を適切な培地で適切な条件下で培養するステップと、ｂ）培地中にクレアチンを蓄積させてクレアチン含有発酵ブロスを生成するステップとを含む、方法に関るものである。
好ましくは、本方法はさらに、クレアチン含有発酵ブロスからクレアチンを単離するステップを含む。クレアチンは、等電点法および／またはイオン交換法によって発酵ブロスから抽出することができる。あるいはクレアチンは、水中で再結晶させる方法によってさらに精製することができる。
実施例
Ａ）材料および方法
化学物質
ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）由来のカナマイシン溶液は、Sigma Aldrich (St. Louis, USA, Cat. no. K0254)から購入した。ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）は、Carl-Roth (Karlsruhe, Germany, Cat. no. 2316.4.)から購入した。特に断りのない限り、他のすべての化学物質は、分析的に純粋なものをMerck (Darmstadt, Germany)、Sigma Aldrich (St. Louis, USA)またはCarl-Roth (Karlsruhe, Germany)から購入した。
Ａ）材料および方法
化学物質
ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）由来のカナマイシン溶液は、Sigma Aldrich (St. Louis, USA, Cat. no. K0254)から購入した。ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）は、Carl-Roth (Karlsruhe, Germany, Cat. no. 2316.4.)から購入した。特に断りのない限り、他のすべての化学物質は、分析的に純粋なものをMerck (Darmstadt, Germany)、Sigma Aldrich (St. Louis, USA)またはCarl-Roth (Karlsruhe, Germany)から購入した。
細胞増殖のための培養
特に断りのない限り、培養／インキュベーションの手順は以下のとおりである：
ａ．Merck (Darmstadt, Germany; Cat. no. 110285)のＬＢブロス（ＭＩＬＬＥＲ）を用いて、大腸菌株を液体培地中で培養した。液体培養液（３つのバッフル付き１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ当たり１０ｍｌの液体培地）を、Infors GmbH（Bottmingen, Switzerland）のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ標準インキュベーターシェーカーで３０℃および２００ｒｐｍにてインキュベートした。
特に断りのない限り、培養／インキュベーションの手順は以下のとおりである：
ａ．Merck (Darmstadt, Germany; Cat. no. 110285)のＬＢブロス（ＭＩＬＬＥＲ）を用いて、大腸菌株を液体培地中で培養した。液体培養液（３つのバッフル付き１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ当たり１０ｍｌの液体培地）を、Infors GmbH（Bottmingen, Switzerland）のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ標準インキュベーターシェーカーで３０℃および２００ｒｐｍにてインキュベートした。
ｂ．Merck (Darmstadt, Germany, Cat. no. 110283)のＬＢ寒天（ＭＩＬＬＥＲ）を用いて、寒天プレート上で大腸菌株を培養した。寒天プレートは、VWR (Radnor, USA)のＩＮＣＵ－Ｌｉｎｅ（登録商標）ミニインキュベーターで３０℃にてインキュベートした。
ｃ．Merck (Darmstadt, Germany, Cat. no. 110493)のブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ）を用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を液体培地中で培養した。液体培養液（３つのバッフル付き１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ当たり１０ｍｌの液体培地）を、Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland)のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ標準インキュベーターシェーカーで３０℃および２００ｒｐｍにてインキュベートした。
ｄ．Merck （Darmstadt, Germany, Cat. no. 113825）のブレインハート寒天（ＢＨＩ寒天）を用いて、寒天プレート上でＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を培養した。寒天プレートは、Heraeus InstrumentsのＫｅｌｖｉｔｒｏｎ（登録商標）温度コントローラー付きインキュベーター（Hanau, Germany）で３０℃にてインキュベートした。
ｅ．エレクトロポレーション後にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを培養するために、ＢＨＩ寒天（Merck, Darmstadt, Germany, Cat. no. 113825）に、１３４ｇ／ｌのソルビトール（Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany）、２．５ｇ／ｌの酵母エキス（Oxoid/ThermoFisher Scientific, Waltham, USA, Cat. no. LP0021）および２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを添加した。寒天プレートは、Heraeus InstrumentsのＫｅｌｖｉｔｒｏｎ（登録商標）温度コントローラー付きインキュベーター（Hanau, Germany）で３０℃にてインキュベートした。
細菌懸濁液の光学密度の測定
ａ．Eppendorf AG (Hamburg, Germany)のＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、振とうフラスコ培養における細菌懸濁液の光学密度を６００ｎｍ（ＯＤ６００）で測定した。
ａ．Eppendorf AG (Hamburg, Germany)のＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、振とうフラスコ培養における細菌懸濁液の光学密度を６００ｎｍ（ＯＤ６００）で測定した。
ｂ．Tecan Group AG (Maennedorf, Switzerland)のＧＥＮｉｏｓ(商標)プレートリーダーを用いて、Ｗｏｕｔｅｒ Ｄｕｅｔｚ（ＷＤＳ）マイクロ発酵システム（２４ウェルプレート）で産生した細菌懸濁液の光学密度を６６０ｎｍ（ＯＤ６６０）で測定した。
遠心分離
ａ．最大容量２ｍｌの細菌懸濁液を１．５ｍｌまたは２ｍｌの反応管（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｕｂｅｓ（登録商標）３８１０Ｘ）に入れて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１７Ｒベンチトップ遠心機を用いて遠心分離した（５分、１３．０００ｒｐｍ）。
ａ．最大容量２ｍｌの細菌懸濁液を１．５ｍｌまたは２ｍｌの反応管（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｕｂｅｓ（登録商標）３８１０Ｘ）に入れて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１７Ｒベンチトップ遠心機を用いて遠心分離した（５分、１３．０００ｒｐｍ）。
ｂ．最大容量５０ｍｌの細菌懸濁液を１５ｍｌまたは５０ｍｌの遠心管（例えば、Ｆａｌｃｏｎ（商標）５０ｍｌのコニカル遠心管）に入れて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒベンチトップ遠心機を用いて４．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
ＤＮＡの単離
Qiagen (Hilden, Germany, Cat. No. 27106)のＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて、大腸菌細胞からプラスミドＤＮＡを製造元の指示に従い単離した。
Qiagen (Hilden, Germany, Cat. No. 27106)のＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて、大腸菌細胞からプラスミドＤＮＡを製造元の指示に従い単離した。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
プルーフリーディング（高忠実度）ポリメラーゼによるＰＣＲを用いて、サンガーシーケンシングまたはＤＮＡアセンブリのためにＤＮＡの所望のセグメントを増幅した。非プルーフリーディングポリメラーゼキットを用いて、大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのコロニーから直接、所望のＤＮＡフラグメントの有無を決定した。
プルーフリーディング（高忠実度）ポリメラーゼによるＰＣＲを用いて、サンガーシーケンシングまたはＤＮＡアセンブリのためにＤＮＡの所望のセグメントを増幅した。非プルーフリーディングポリメラーゼキットを用いて、大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのコロニーから直接、所望のＤＮＡフラグメントの有無を決定した。
ａ．New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA, Cat. No. M0530)のＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（Ｐｈｕｓｉｏｎキット）を用いて、選択したＤＮＡ領域を製造元の指示に従いテンプレート補正増幅した（第２表を参照されたい）。
ｂ．Qiagen (Hilden, Germany, Cat. No.201203)のＴａｑ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｔａｑキット）を用いて、所望のＤＮＡセグメントを増幅し、その存在を確認した。キットは製造元の指示に従い用いた（第３表を参照されたい）。
ｃ．Takara Bio Inc (Takara Bio Europe S.A.S., Saint-Germain-en-Laye, France, Cat. No. RR350A/B)のＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ｍｉｘ）を代わりとして用いて、大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍコロニーから採取した細胞中の所望のＤＮＡセグメントの存在を製造元の指示に従い確認した（第４表を参照されたい）。
ｄ．すべてのオリゴヌクレオチドプライマーを、McBride and Caruthers (1983)により記載されたホスホロアミダイト法を用いてEurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)により合成した。
ｅ．ＰＣＲテンプレートとして、単離されたプラスミドＤＮＡ、液体培養から単離された全ＤＮＡ、または細菌コロニーに含まれる全ＤＮＡのいずれかの適切な希釈溶液を使用した（コロニーＰＣＲ）。前述のコロニーＰＣＲでは、寒天培地上のコロニーから爪楊枝で細胞物質を採取し、その細胞物質をＰＣＲ反応管に直接入れることによりテンプレートを調製した。この細胞物質をSEVERIN Elektrogeraete GmbH (Sundern, Germany)のＭｉｋｒｏｗａｖｅ ＆ Ｇｒｉｌｌタイプの電子レンジで８００Ｗで１０秒間加熱し、ＰＣＲ反応管内のテンプレートにＰＣＲ試薬を添加した。
ｆ．すべてのＰＣＲ反応を、Eppendorf AG (Hamburg, Germany)のＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒまたはＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｎｅｘｕｓ ｇｒａｄｉｅｎｔタイプのＰＣＲサイクラーで行った。
ＤＮＡの制限酵素消化
制限酵素消化のために、「ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限エンドヌクレアーゼ（ＦＤ）」(ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)または New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA)の制限エンドヌクレアーゼを用いた。反応は、製造元のマニュアルの指示に従い行った。
制限酵素消化のために、「ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限エンドヌクレアーゼ（ＦＤ）」(ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)または New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA)の制限エンドヌクレアーゼを用いた。反応は、製造元のマニュアルの指示に従い行った。
ＤＮＡフラグメントのサイズの測定
ａ．小さなＤＮＡフラグメント（＜１０００ｂｐｓ）のサイズは、通常、Qiagen (Hilden, Germany)のＱＩＡｘｃｅｌを用いた自動キャピラリー電気泳動によって測定した。
ａ．小さなＤＮＡフラグメント（＜１０００ｂｐｓ）のサイズは、通常、Qiagen (Hilden, Germany)のＱＩＡｘｃｅｌを用いた自動キャピラリー電気泳動によって測定した。
ｂ．ＤＮＡフラグメントを単離する必要がある場合、またはＤＮＡフラグメントが１０００ｂｐｓよりも大きい場合、ＤＮＡをＴＡＥアガロースゲル電気泳動で分離し、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）核酸ゲル染色（Biotium, Inc., Fremont, Canada）を用いて染色した。染色したＤＮＡを３０２ｎｍで可視化した。
ＰＣＲ増幅物および制限フラグメントの精製
Qiagen (Hilden, Germany; Cat. No. 28106)のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ＰＣＲ増幅物および制限フラグメントを製造元の指示に従いクリーンアップした。ＤＮＡを３０μｌの１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で溶出させた。
Qiagen (Hilden, Germany; Cat. No. 28106)のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ＰＣＲ増幅物および制限フラグメントを製造元の指示に従いクリーンアップした。ＤＮＡを３０μｌの１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で溶出させた。
ＤＮＡ濃度の測定
ＤＮＡ濃度を、PEQLAB Biotechnologie GmbH（２０１５年以降VWRブランド(Erlangen, Germany)）のＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計ＮＤ－１０００を用いて測定した。
ＤＮＡ濃度を、PEQLAB Biotechnologie GmbH（２０１５年以降VWRブランド(Erlangen, Germany)）のＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計ＮＤ－１０００を用いて測定した。
アセンブリクローニング
New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA, Cat. No. E5520)から購入した「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」を用いてプラスミドベクターをアセンブリした。線形ベクターと少なくとも１つのＤＮＡ挿入物とを含む反応混合物を５０℃で６０分間インキュベートした。０．５μｌのアセンブリ混合物を各形質転換実験に用いた。
New England BioLabs Inc. (Ipswich, USA, Cat. No. E5520)から購入した「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」を用いてプラスミドベクターをアセンブリした。線形ベクターと少なくとも１つのＤＮＡ挿入物とを含む反応混合物を５０℃で６０分間インキュベートした。０．５μｌのアセンブリ混合物を各形質転換実験に用いた。
大腸菌の化学形質転換
プラスミドクローニングのために、化学的にコンピテントな「ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」(New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. C3040)を製造元のプロトコルに従い形質転換させた。形質転換に成功した細胞を、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地上で選択した。
プラスミドクローニングのために、化学的にコンピテントな「ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」(New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. C3040)を製造元のプロトコルに従い形質転換させた。形質転換に成功した細胞を、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを添加したＬＢ寒天培地上で選択した。
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの形質転換
プラスミド－ＤＮＡによるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの形質転換を、Ｒｕａｎら(2015)により記載されているように、「Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ」(Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany)を用いたエレクトロポレーションにより実施した。エレクトロポレーションは、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット(Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany)において１．８ｋＶおよび５ｍｓに設定した固定時定数で実施した。形質転換した細胞は、１３４ｇ／ｌのソルビトール、２．５ｇ／ｌの酵母エキスおよび２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＢＨＩ寒天上で選択した。
プラスミド－ＤＮＡによるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの形質転換を、Ｒｕａｎら(2015)により記載されているように、「Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ」(Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany)を用いたエレクトロポレーションにより実施した。エレクトロポレーションは、１ｍｍエレクトロポレーションキュベット(Bio-Rad Laboratories GmbH, Feldkirchen, Germany)において１．８ｋＶおよび５ｍｓに設定した固定時定数で実施した。形質転換した細胞は、１３４ｇ／ｌのソルビトール、２．５ｇ／ｌの酵母エキスおよび２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＢＨＩ寒天上で選択した。
ヌクレオチド配列の決定
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終結法（Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463 - 5467, 1977）を用いたサイクルシーケンシングでEurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)により決定した。配列の可視化および評価には、Scientific & Educational Software (Denver, USA)のＣｌｏｎｅｍａｎａｇｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ９ソフトウェアを用いた。
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ鎖終結法（Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463 - 5467, 1977）を用いたサイクルシーケンシングでEurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)により決定した。配列の可視化および評価には、Scientific & Educational Software (Denver, USA)のＣｌｏｎｅｍａｎａｇｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ９ソフトウェアを用いた。
大腸菌およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株のグリセロールストック
大腸菌およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの長期保存のために、グリセロールストックを調製した。選択した大腸菌を、２ｇ／ｌのグルコースを添加した１０ｍｌのＬＢ培地で培養した。選択したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを、２ｇ／ｌのグルコースを添加した２倍濃縮ＢＨＩ培地１０ｍｌで培養した。プラスミド含有大腸菌およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を培養するための培地に、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを添加した。培地は、３つのバッフル付き１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れた。これに、コロニーから採取した細胞のループを接種した。次いで、この培養液を３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートした。前述のインキュベーション期間後、１．２ｍｌの８５％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロールを培養液に添加した。次いで、得られたグリセロール含有細胞懸濁液を２ｍｌずつ分注し、－８０℃で保存した。
大腸菌およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの長期保存のために、グリセロールストックを調製した。選択した大腸菌を、２ｇ／ｌのグルコースを添加した１０ｍｌのＬＢ培地で培養した。選択したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを、２ｇ／ｌのグルコースを添加した２倍濃縮ＢＨＩ培地１０ｍｌで培養した。プラスミド含有大腸菌およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を培養するための培地に、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを添加した。培地は、３つのバッフル付き１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れた。これに、コロニーから採取した細胞のループを接種した。次いで、この培養液を３０℃および２００ｒｐｍで１８時間インキュベートした。前述のインキュベーション期間後、１．２ｍｌの８５％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロールを培養液に添加した。次いで、得られたグリセロール含有細胞懸濁液を２ｍｌずつ分注し、－８０℃で保存した。
ミリリットルスケールの培養におけるＧＡＡ産生
Ｄｕｅｔｚ(2007)によるミリリットルスケール培養系を用い、菌株のＧＡＡ産生を評価した。このために、EnzyScreen BV (Heemstede, Netherlands, Cat. no. CR1424)の２４ディープウェルマイクロプレート（２４ウェルＷＤＳプレート）に１ウェル当たり２．５ｍｌの培地を充填したものを用いた。
Ｄｕｅｔｚ(2007)によるミリリットルスケール培養系を用い、菌株のＧＡＡ産生を評価した。このために、EnzyScreen BV (Heemstede, Netherlands, Cat. no. CR1424)の２４ディープウェルマイクロプレート（２４ウェルＷＤＳプレート）に１ウェル当たり２．５ｍｌの培地を充填したものを用いた。
菌株の前培養を１０ｍｌのシード培地（ＳＭ）で行った。培地は３つのバッフル付き１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れた。これに１００μｌのグリセロールストック培養液を接種し、３０℃および２００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。シード培地（ＳＭ）の組成を第５表に示す。
前述のインキュベーション期間後、前培養液の光学密度ＯＤ６００を測定した。ＯＤ６００が０．１になるように２．５ｍｌの産生培地（ＰＭ）を接種するのに必要な量を前培養からサンプリングし、遠心分離（８０００ｇで１分間）して上清を廃棄した。次いで、細胞を１００μｌの産生培地に再懸濁した。
２４ウェルＷＤＳプレートの２．４ｍｌ産生培地（ＰＭ）入りウェルに、前培養から再懸濁した細胞１００μｌずつを接種し、本培養を開始した。産生培地（ＰＭ）の組成を第６表に示す。
主培養液を、Infors GmbH (Bottmingen, Switzerland)のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ標準インキュベーターシェーカーで３０℃および３００ｒｐｍにて７２時間、グルコースが完全に消費されるまでインキュベートした。懸濁液中のグルコース濃度を、LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Germany)の血糖値測定器ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｖｉｔａ（登録商標）で分析した。
培養後、培養懸濁液をディープウェルマイクロプレートに移した。培養懸濁液の一部は、ＯＤ６６０を測定するために適切に希釈した。培養液の別の一部を遠心分離し、上清中のＧＡＡ濃度を以下に記載するように分析した。
酵母ペプトンＦＭ９０２中のＬ－アルギニンおよびグリシン含量の測定
酵母エキスＦＭ９０２（Angel Yeast Co.,LTD, Hubei, P.R.China）には様々なペプチドおよびアミノ酸が含まれているため、そのＬ－アルギニンおよびグリシンの含量を以下のとおり測定した。
酵母エキスＦＭ９０２（Angel Yeast Co.,LTD, Hubei, P.R.China）には様々なペプチドおよびアミノ酸が含まれているため、そのＬ－アルギニンおよびグリシンの含量を以下のとおり測定した。
遊離アミノ酸の測定のために、酵母エキス１ｇを水２０ｍｌに溶解して試料を調製した。この溶液に水を加えて全量を２５ｍｌとし、十分に混合した後、０．２μＭのナイロンシリンジフィルターを用いてろ過を行った。
総アミノ酸（遊離アミノ酸＋ペプチドに結合したアミノ酸）の測定のために、酵母エキス１ｇを６Ｍ ＨＣｌ１０ｍｌに溶解し、１１０℃で２４時間インキュベートして試料を調製した。次いで、水を加えて全量を２５ｍｌとした。この溶液を十分に混合し、０．２μＭのナイロンシリンジフィルターを用いてろ過した。
試料中のＬ－アルギニンおよびグリシンの濃度は、SYKAM Vertriebs GmbH (Fuerstenfeldbruck, Germany)のＳＹＫＡＭ Ｓ４３３アミノ酸分析装置を用いたイオン交換クロマトグラフィーによって測定した。固相として、ＳＹＫＡＭの球状ポリスチレンベース陽イオン交換体（Ｐｅｅｋ ＬＣＡ Ｎ０４／Ｎａ、寸法１５０×４．６ｍｍ）を備えたカラムを用いた。Ｌ－アミノ酸の種類に応じて、溶出には緩衝液ＡとＢとの混合物を用いたアイソクラティック溶出、または前述の緩衝液を用いたグラジエント溶出で分離を行う。緩衝液Ａとして、２０ｌ中にクエン酸三ナトリウム２６３ｇ、クエン酸１２０ｇ、メタノール１１００ｍｌ、３７％ＨＣｌ１００ｍｌおよびオクタン酸２ｍｌを含む水溶液（最終ｐＨ３．５）を用いた。緩衝液Ｂとして、２０ｌ中にクエン酸三ナトリウム３９２ｇ、ホウ酸１００ｇおよびオクタン酸２ｍｌを含む水溶液（最終ｐＨ１０．２）を用いた。遊離アミノ酸は、カラム後の誘導体化によりニンヒドリンで着色し、５７０ｎｍで光度計により検出した。
第７表は、酵母エキスＦＭ９０２（(Angel Yeast Co.,LTD, Hubei, P.R.China)）で測定した遊離および総Ｌ－アルギニンおよびグリシンの含有量と、産生培地（ＰＭ）中のその結果としての量を示す。
ＧＡＡの定量
試料を、ＨＰＬＣ「Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０」と質量分析計「Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６４２０」（Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA）とをセットにしたものからなるAgilentの分析システムで分析した。クロマトグラフィー分離は、Ａｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣシリカカラム、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（Waters Corporation, Milford, USA）で３５℃の温度で行った。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウムと０．２％ギ酸とを含む水であった。移動相Ｂは９０％アセトニトリルと１０％水との混合物であり、１０ｍＭギ酸アンモニウムをこの混合物に加えた。ＨＰＬＣシステムは１００％Ｂでスタートし、その後２２分間、０．６ｍＬ／ｍｉｎの一定流速で６６％Ｂまでリニアグラジェントした。質量分析計はＥＳＩポジティブイオン化モードで操作した。ＧＡＡを検出するために、ｍ／ｚ値はＭＲＭフラグメント［Ｍ＋Ｈ］＋１１８－７６を用いてモニターした。ＧＡＡの定量下限（ＬＯＱ）は７ｐｐｍに固定した。
試料を、ＨＰＬＣ「Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０」と質量分析計「Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６４２０」（Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA）とをセットにしたものからなるAgilentの分析システムで分析した。クロマトグラフィー分離は、Ａｔｌａｎｔｉｓ ＨＩＬＩＣシリカカラム、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（Waters Corporation, Milford, USA）で３５℃の温度で行った。移動相Ａは、１０ｍＭギ酸アンモニウムと０．２％ギ酸とを含む水であった。移動相Ｂは９０％アセトニトリルと１０％水との混合物であり、１０ｍＭギ酸アンモニウムをこの混合物に加えた。ＨＰＬＣシステムは１００％Ｂでスタートし、その後２２分間、０．６ｍＬ／ｍｉｎの一定流速で６６％Ｂまでリニアグラジェントした。質量分析計はＥＳＩポジティブイオン化モードで操作した。ＧＡＡを検出するために、ｍ／ｚ値はＭＲＭフラグメント［Ｍ＋Ｈ］＋１１８－７６を用いてモニターした。ＧＡＡの定量下限（ＬＯＱ）は７ｐｐｍに固定した。
Ｂ）実験結果
実施例１：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＧＧＴ１のクローニング
シロイヌナズナの遺伝子ＧＧＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１０２１８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、グルタミン酸：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿５６４１９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードする。このタンパク質は、グリオキシル酸＋Ｌ－アラニン＝グリシン＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．４４）、２－オキソグルタル酸＋Ｌ－アラニン＝Ｌ－グルタミン酸＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．２）、および２－オキソグルタル酸＋グリシン＝グリオキシル酸＋Ｌ－グルタミン酸の反応を触媒することが分かった（ＥＣ２．６．１．４；Liepman AH, Olsen LJ., Plant Physiol. 2003 Jan;131(1):215-27. doi: 10.1104/pp.011460）。
実施例１：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＧＧＴ１のクローニング
シロイヌナズナの遺伝子ＧＧＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１０２１８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、グルタミン酸：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿５６４１９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードする。このタンパク質は、グリオキシル酸＋Ｌ－アラニン＝グリシン＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．４４）、２－オキソグルタル酸＋Ｌ－アラニン＝Ｌ－グルタミン酸＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．２）、および２－オキソグルタル酸＋グリシン＝グリオキシル酸＋Ｌ－グルタミン酸の反応を触媒することが分かった（ＥＣ２．６．１．４；Liepman AH, Olsen LJ., Plant Physiol. 2003 Jan;131(1):215-27. doi: 10.1104/pp.011460）。
ソフトウェアツール「コドン最適化ツール」（Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA）を用いて、ＧＧＴ１タンパク質のアミノ酸配列を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのコドン使用に最適化したＤＮＡ配列に翻訳し直した。オープンリーディングフレームの直接上流にシャイン・ダルガノ配列を追加し（ＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＧ；Shi F, Luan M, Li Y, AMB Express. 2018 Apr 18;8(1):61. doi: 10.1186/s13568-018-0595-2）、得られた配列の末端をその後のサブクローニングのためのモチーフで拡張した。得られたＤＮＡ配列ＡｔＧＧＴ１＿ｏｐｔ＿ＲＢＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)から遺伝子合成用に注文し、それはアンピシリンに対する耐性を付与したクローニングプラスミド（ｐＥＸ－Ａ２５８－ＡｔＧＧＴ１＿ｏｐｔ＿ＲＢＳと表記）の一部として提供した。
実施例２：シロイヌナズナ由来のグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＧＧＴ２のクローニング
シロイヌナズナの遺伝子ＡＯＡＴ２（シノニム：ＧＧＴ２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３６１８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、アラニン－２－オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０３１２６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）をコードする。このタンパク質は、グリオキシル酸＋Ｌ－アラニン＝グリシン＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．４４）、２－オキソグルタル酸＋Ｌ－アラニン＝Ｌ－グルタミン酸＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．２）、および２－オキソグルタル酸＋グリシン＝グリオキシル酸＋Ｌ－グルタミン酸の反応を触媒することが分かった（ＥＣ２．６．１．４；Liepman AH, Olsen LJ. (2003), Plant Physiol. 2003 Jan;131(1):215-27. doi: 10.1104/pp.011460）。
シロイヌナズナの遺伝子ＡＯＡＴ２（シノニム：ＧＧＴ２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０３６１８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、アラニン－２－オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０３１２６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）をコードする。このタンパク質は、グリオキシル酸＋Ｌ－アラニン＝グリシン＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．４４）、２－オキソグルタル酸＋Ｌ－アラニン＝Ｌ－グルタミン酸＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．２）、および２－オキソグルタル酸＋グリシン＝グリオキシル酸＋Ｌ－グルタミン酸の反応を触媒することが分かった（ＥＣ２．６．１．４；Liepman AH, Olsen LJ. (2003), Plant Physiol. 2003 Jan;131(1):215-27. doi: 10.1104/pp.011460）。
ソフトウェアツール「コドン最適化ツール」（Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA）を用いて、ＧＧＴ２タンパク質のアミノ酸配列を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのコドン使用に最適化したＤＮＡ配列に翻訳し直した。オープンリーディングフレームの直接上流にシャイン・ダルガノ配列を追加し（ＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＧ；Shi, 2018）、得られた配列の末端をその後のサブクローニングのためのモチーフで拡張した。得られたＤＮＡ配列ＡｔＧＧＴ２＿ｏｐｔ＿ＲＢＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）は、Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)から遺伝子合成用に注文し、それはアンピシリンに対する耐性を付与するクローニングプラスミド（ｐＥＸ－Ａ２５８－ＡｔＧＧＴ２＿ｏｐｔ＿ＲＢＳと表記）の一部として提供した。
実施例３：超好熱性古細菌（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｇｔのクローニング
超好熱性古細菌の遺伝子ａｇｔ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３３９９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）は、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ４０３２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をコードする。このタンパク質は、グリオキシル酸＋Ｌ－アラニン＝グリシン＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．４４）およびグリオキシル酸＋Ｌ－セリン＝グリシン＋３－ヒドロキシピルビン酸の反応を触媒することが分かった（ＥＣ２．６．１．４５；Sakuraba, H. et al., J Bacteriol. 2004 Aug; 186(16): 5513-5518. doi: 10.1128/JB.186.16.5513-5518.2004）。
超好熱性古細菌の遺伝子ａｇｔ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３３９９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）は、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ４０３２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をコードする。このタンパク質は、グリオキシル酸＋Ｌ－アラニン＝グリシン＋ピルビン酸（ＥＣ２．６．１．４４）およびグリオキシル酸＋Ｌ－セリン＝グリシン＋３－ヒドロキシピルビン酸の反応を触媒することが分かった（ＥＣ２．６．１．４５；Sakuraba, H. et al., J Bacteriol. 2004 Aug; 186(16): 5513-5518. doi: 10.1128/JB.186.16.5513-5518.2004）。
ソフトウェアツール「コドン最適化ツール」（Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, USA）を用いて、Ａｇｔタンパク質のアミノ酸配列を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのコドン使用に最適化したＤＮＡ配列に翻訳し直した。オープンリーディングフレームの直接上流にシャイン・ダルガノ配列を追加し（ＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＧ；Shi F, Luan M, Li Y, AMB Express. 2018 Apr 18;8(1):61. doi: 10.1186/s13568-018-0595-2）、得られた配列の末端をその後のサブクローニングのためのモチーフで拡張した。得られたＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）は、Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Germany)から遺伝子合成用に注文し、それはアンピシリンに対する耐性を付与したクローニングプラスミド（ｐＥＸ－Ａ２５８－ＡＧＴ＿Ｔｌ＿ｏｐｔ＿ＲＢＳと表記）の一部として提供した。
実施例４：モオレア・プロドゥケンス（Ｍｏｏｒｅａ ｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）由来のＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、ＥＣ２．１．４．１）をコードする遺伝子ＡＧＡＴ＿Ｍｐのクローニング
モオレア・プロドゥケンスは糸状シアノバクテリアである。モオレア・プロドゥケンス株ＰＡＬ－８－１５－０８－１のゲノムは、Ｌｅａｏらによって公開された（Leao T, Castelao G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12):3198-3203. doi: 10.1073/pnas.1618556114；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０１７５９９．１）。それはＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、ＥＣ２．１．４．１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＢＪＰ３４＿００３００）を推定上コードするオープンリーディングフレームを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は、由来するアミノ酸配列を示す（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０７０３９０６０２）。
モオレア・プロドゥケンスは糸状シアノバクテリアである。モオレア・プロドゥケンス株ＰＡＬ－８－１５－０８－１のゲノムは、Ｌｅａｏらによって公開された（Leao T, Castelao G, Korobeynikov A, Monroe EA, Podell S, Glukhov E, Allen EE, Gerwick WH, Gerwick L, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Mar 21;114(12):3198-3203. doi: 10.1073/pnas.1618556114；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０１７５９９．１）。それはＬ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＧＡＴ、ＥＣ２．１．４．１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ ＢＪＰ３４＿００３００）を推定上コードするオープンリーディングフレームを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は、由来するアミノ酸配列を示す（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０７０３９０６０２）。
ソフトウェアツール「コドン最適化ツール」（Geneart/ThermoFisher Scientific, Waltham, USA）を用いて、このアミノ酸配列を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのコドン使用に最適化したＤＮＡ配列に翻訳し直した。その末端はアセンブリクローニング用の配列で拡張し、オープンリーディングフレームの５塩基対上流にシャイン・ダルガノ配列（ＡＧＧＡ）を付加した。得られたＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）は、Invitrogen/Geneart (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)から遺伝子合成用に注文し、それはクローニングプラスミド（ｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐと表記）の一部として提供した。
実施例５：ＡＧＡＴ＿Ｍｐの発現プラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅへのクローニング
大腸菌－Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトルプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２１９６８２）を、制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩを用いて消化した。「ＦａｓｔＡＰ温度感受性アルカリホスファターゼ（FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase）」（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）を用いて末端リン酸塩を除去した。次いで、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて精製した。
大腸菌－Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトルプラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２１９６８２）を、制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩを用いて消化した。「ＦａｓｔＡＰ温度感受性アルカリホスファターゼ（FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase）」（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）を用いて末端リン酸塩を除去した。次いで、ＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて精製した。
クローニングプラスミドｐＭＡ－Ｔ＿ＡＧＡＴ＿ＭｐをＭｌｕＩ＋ＡａｔＩＩで消化し、得られたフラグメントを「Ｆａｓｔ ＤＮＡ末端修復キット（Fast DNA End Repair Kit）」（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）を用いて鈍化させた。それらをアガロースゲル電気泳動（ＴＡＥ緩衝液中０．８％アガロース）で分離し、「ＡＧＡＴ＿Ｍｐ」に相当するバンド（１１７４ｂｐ）を切断した。そのＤＮＡは、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて精製した。
ＡＧＡＴ＿Ｍｐフラグメントと線状化したｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅとを「Ｒｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｏ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」（GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany）を用いてライゲーションさせた。ライゲーション産物を「ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」（New England Biolabs, Ipswich, USA）に形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地で細胞を増殖させた。制限酵素消化およびＤＮＡシーケンシングにより、適切なクローンを同定した。得られたプラスミドをｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐと命名した。
実施例６：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現プラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐへのクローニング
プラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを用いて消化し、「ＦａｓｔＡＰ温度感受性アルカリホスファターゼ（FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase）」（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）を用いて末端リン酸を除去した。次いで、消化したＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて精製した。
プラスミドｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを用いて消化し、「ＦａｓｔＡＰ温度感受性アルカリホスファターゼ（FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase）」（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）を用いて末端リン酸を除去した。次いで、消化したＤＮＡを「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて精製した。
クローニングプラスミドｐＥＸ－Ａ２５８－ＡｔＧＧＴ１＿ｏｐｔ＿ＲＢＳ、ｐＥＸ－Ａ２５８－ＡｔＧＧＴ２＿ｏｐｔ＿ＲＢＳおよびｐＥＸ－Ａ２５８－ＡＧＴ＿Ｔｌ＿ｏｐｔ＿ＲＢＳは、各々ＢａｍＨＩおよびＢｓａＩで消化された。切断したプラスミドは、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて精製した。
消化したｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐを、消化した各クローニングプラスミドと共に「Ｒｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｏ Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」（GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany）を用いてライゲーションさせた。ライゲーション産物を「ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」（New England Biolabs, Ipswich, USA）に形質転換し、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地で細胞を増殖させた。制限酵素消化およびＤＮＡシーケンシングにより、適切なクローンを同定した。得られたプラスミドを第８表に示す。これらは、強力なＩＰＴＧ誘導性ｔｒｃ－プロモーターの制御下にオペロン様構造でＡＧＡＴ＿Ｍｐ遺伝子とそれぞれのグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼとを提供する。
実施例７：ＡＴＣＣ１３０３２におけるｃａｒＡＢオペロン上流へのｓｏｄプロモーターの染色体挿入
Ｌ－アルギニンの産生を向上させるために、ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに、ｃａｒＡＢオペロンの上流で強力なｓｏｄプロモーターを挿入した。したがって、プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢを、以下のとおり構築した。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Schaefer, A. et al., Gene. 1994 Jul 22;145(1):69-73. doi: 10.1016/0378-1119(94)90324-7）をＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲルから線状化したベクターＤＮＡ（５６７０ｂｐｓ）を切断した。「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いてＤＮＡを抽出した。
Ｌ－アルギニンの産生を向上させるために、ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに、ｃａｒＡＢオペロンの上流で強力なｓｏｄプロモーターを挿入した。したがって、プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢを、以下のとおり構築した。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Schaefer, A. et al., Gene. 1994 Jul 22;145(1):69-73. doi: 10.1016/0378-1119(94)90324-7）をＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲルから線状化したベクターＤＮＡ（５６７０ｂｐｓ）を切断した。「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いてＤＮＡを抽出した。
挿入物の構築のために、以下のプライマー対を用いたＰＣＲにより３つのＤＮＡフラグメントを作製した（ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡをテンプレートとする）：
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
＝左ホモロジーアーム（１０２５ｂｐｓ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
＝ｓｏｄ－プロモーター（２５０ｂｐｓ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
＝右ホモロジーアーム（９４４ｂｐｓ）
「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて産物ＤＮＡを精製した。次いで、線状化したプラスミドとＰＣＲ産物とを、「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」（New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520）を用いてアセンブリした。制限消化およびＤＮＡシーケンシングにより、適切なプラスミドクローンを同定した。
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＬＡ－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
＝左ホモロジーアーム（１０２５ｂｐｓ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
＝ｓｏｄ－プロモーター（２５０ｂｐｓ）
ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｆ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）＋ＰｓｏｄｃａｒＡＢ－ＲＡ－Ｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
＝右ホモロジーアーム（９４４ｂｐｓ）
「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて産物ＤＮＡを精製した。次いで、線状化したプラスミドとＰＣＲ産物とを、「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」（New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520）を用いてアセンブリした。制限消化およびＤＮＡシーケンシングにより、適切なプラスミドクローンを同定した。
次いで、得られたプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢを、エレクトロポレーションによりＡＴＣＣ１３０３２に形質転換した。１３４ｇ／ｌのソルビトール、２．５ｇ／ｌの酵母エキスおよび２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを添加したＢＨＩ寒天上にプレーティングすることにより、（１回目の組換えイベントから生じた）染色体統合を選択した。寒天プレートは３３℃で４８時間インキュベートした。
個々のコロニーを新鮮な寒天プレート（２５ｍｇ／ｌのカナマイシン入り）に移し、３３℃で２４時間インキュベートした。これらのクローンの液体培養液を、３つのバッフル付き１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れた１０ｍｌのＢＨＩ培地で３３℃にて２４時間培養した。２回目の組換えイベントに遭遇したクローンを単離するために、各液体培養液からアリコートを取り、適切に希釈し、１０％サッカロースを添加したＢＨＩ寒天上にプレーティングした（通常１００～２００μｌ）。これらの寒天プレートを３３℃で４８時間インキュベートした。次いで、サッカロースを含む寒天培地プレート上で成長するコロニーを、カナマイシン感受性について調べた。そのために、爪楊枝を用いてコロニーから細胞物質を取り除き、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＢＨＩ寒天培地上と１０％サッカロースを含むＢＨＩ寒天培地上とに移した。寒天プレートを３３℃で６０時間インキュベートした。カナマイシンに感受性でサッカロースに耐性を示すクローンは、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングによって、ｓｏｄプロモーターが適切に組み込まれているかどうか調べた。得られた菌株をＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢと命名した。
実施例８：Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢにおける遺伝子ａｃｅＢ（ＮＣｇｌ２２４７）の染色体欠失
グリオキシル酸からＬ－リンゴ酸への代謝フラックスを減少させるために、リンゴ酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．９）をコードする遺伝子ａｃｅＢ（ＮＣｇｌ２２４７）をＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ株で欠失させた。
グリオキシル酸からＬ－リンゴ酸への代謝フラックスを減少させるために、リンゴ酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．９）をコードする遺伝子ａｃｅＢ（ＮＣｇｌ２２４７）をＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ株で欠失させた。
したがって、プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤａｃｅＢを、以下のとおり構築した。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Schaefer, 1994）をＸｂａＩで切断し、線状化したベクターＤＮＡ（５７２１ｂｐｓ）を「ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて精製した。
挿入物の構築のために、以下のプライマー対を用いたＰＣＲにより２つのＤＮＡフラグメントを作製した（ＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡをテンプレートとする）：
１ｆ－ａｃｅＢ－Ｄ２＿ｖｅｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）＋１ｒ－ａｃｅＢ－Ｄ２＿ａｃｅＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
＝左ホモロジーアーム（１０６５ｂｐｓ）
２ｆ－ａｃｅＢ－Ｄ２＿ａｃｅＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）＋２ｒ－ａｃｅＢ＿Ｄ２＿Ｖｅｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
＝左ホモロジーアーム（１０８０ｂｐｓ）
「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて産物ＤＮＡを精製した。次いで、線状化したプラスミドとＰＣＲ産物とを、「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」（New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520）を用いてアセンブリした。得られた欠失ベクターをｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤａｃｅＢと命名した。制限酵素消化およびＤＮＡシーケンシングにより確認した。
１ｆ－ａｃｅＢ－Ｄ２＿ｖｅｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）＋１ｒ－ａｃｅＢ－Ｄ２＿ａｃｅＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
＝左ホモロジーアーム（１０６５ｂｐｓ）
２ｆ－ａｃｅＢ－Ｄ２＿ａｃｅＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）＋２ｒ－ａｃｅＢ＿Ｄ２＿Ｖｅｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
＝左ホモロジーアーム（１０８０ｂｐｓ）
「ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）を用いて産物ＤＮＡを精製した。次いで、線状化したプラスミドとＰＣＲ産物とを、「ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」（New England BioLabs Inc., Ipswich, USA, Cat. No. E5520）を用いてアセンブリした。得られた欠失ベクターをｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤａｃｅＢと命名した。制限酵素消化およびＤＮＡシーケンシングにより確認した。
ａｃｅＢ遺伝子を欠失させるために、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ＿ＤａｃｅＢをＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢにエレクトロポレーションにより形質転換した。１３４ｇ／ｌのソルビトール、２．５ｇ／ｌの酵母エキスおよび２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを添加したＢＨＩ寒天培地にプレーティングすることにより、（１回目の組換えイベントから生じた）染色体統合を選択した。寒天プレートは３３℃で４８時間インキュベートした。
個々のコロニーを新鮮な寒天プレート（２５ｍｇ／ｌのカナマイシン入り）に移し、３３℃で２４時間インキュベートした。これらのクローンの液体培養液を、３つのバッフル付き１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れた１０ｍｌのＢＨＩ培地で３３℃にて２４時間培養した。２回目の組換えイベントに遭遇したクローンを単離するために、各液体培養液からアリコートを取り、適切に希釈し、１０％サッカロースを添加したＢＨＩ寒天上にプレーティングした（通常１００～２００μｌ）。これらの寒天プレートを３３℃で４８時間インキュベートした。次いで、サッカロースを含む寒天培地プレート上で成長したコロニーを、カナマイシン感受性について調べた。そのために、爪楊枝を用いてコロニーから細胞物質を取り除き、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＢＨＩ寒天培地上と１０％サッカロースを含むＢＨＩ寒天培地上とに移した。寒天プレートを３３℃で６０時間インキュベートした。カナマイシンに感受性でサッカロースに耐性を示すクローンは、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングによって、ｓｏｄプロモーターが適切に組み込まれているかどうかを調べた。得られた菌株をＡＴＣＣ１３０３２＿ＤａｃｅＢと命名した。
実施例９：各種発現プラスミドを用いたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株の形質転換
以下のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの菌株をエレクトロポレーションによりプラスミドで形質転換した（第１０表）。プラスミドを含む細胞は２５ｍｇ／ｌのカナマイシン入りで選択した。
以下のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの菌株をエレクトロポレーションによりプラスミドで形質転換した（第１０表）。プラスミドを含む細胞は２５ｍｇ／ｌのカナマイシン入りで選択した。
・ Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２：一般に用いられる野生型株（Kinoshita et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 1957; 3(3): 193-205）
・ Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ：ＡＴＣＣ１３０３２におけるｃａｒＡＢの上流での強力なｓｏｄプロモーターの染色体統合によるＬ－アルギニン産生能力の向上
・ Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ：ＡＴＣＣ１３０３２におけるａｃｅＢ遺伝子の染色体欠失によるリンゴ酸シンターゼの活性低下とｃａｒＡＢの上流での強力なｓｏｄプロモーターの染色体統合によるＬ－アルギニン産生能力の向上。
・ Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ：ＡＴＣＣ１３０３２におけるｃａｒＡＢの上流での強力なｓｏｄプロモーターの染色体統合によるＬ－アルギニン産生能力の向上
・ Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ：ＡＴＣＣ１３０３２におけるａｃｅＢ遺伝子の染色体欠失によるリンゴ酸シンターゼの活性低下とｃａｒＡＢの上流での強力なｓｏｄプロモーターの染色体統合によるＬ－アルギニン産生能力の向上。
実施例１０：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの活性増加がＧＡＡ産生に及ぼす影響
グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性の増加がＧＡＡ産生に及ぼす影響を評価するために、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ株、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ株、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、およびＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌ株をＷｏｕｔｅｒ Ｄｕｅｔｚシステムで培養し、得られるＧＡＡ力価を測定した。産生培地（ＰＭ）には４０ｇ／ｌのＤ－グルコースおよび１．９０ｇ／ＬのＬ－アルギニンが含まれていたが、グリシンは追加していない。
グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性の増加がＧＡＡ産生に及ぼす影響を評価するために、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ株、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ株、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、およびＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌ株をＷｏｕｔｅｒ Ｄｕｅｔｚシステムで培養し、得られるＧＡＡ力価を測定した。産生培地（ＰＭ）には４０ｇ／ｌのＤ－グルコースおよび１．９０ｇ／ＬのＬ－アルギニンが含まれていたが、グリシンは追加していない。
第１１表に示すように、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ株は、検出可能な量のＧＡＡを産生しなかった。
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ株は、モオレア・プロドゥケンス由来のＡＧＡＴをコードするポリヌクレオチドを有し、これはＡＧＡＴ酵素活性を提供する。該株は、１２２ｍｇ／ＬのＧＡＡを産生した。
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、およびＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌ株は、ＡＧＡＴ酵素活性およびグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの増加した酵素活性を有する。該株は、それぞれ２４６ｍｇ／ｌ、２５５ｍｇ／ｌ、および１９９ｍｇ／ｌのＧＡＡを産生した。
ＡＧＡＴ酵素活性の存在下で、グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を高めると、ＧＡＡ産生が向上すると結論付けた。
実施例１１：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの活性増加とＬ－アルギニン産生能力の向上との組み合わせがＧＡＡ産生に及ぼす影響
グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの活性増加とＬ－アルギニン産生能力の向上との組み合わせがＧＡＡ産生に及ぼす影響を評価するために、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌ、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２、およびＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿ＴｌをＷｏｕｔｅｒ Ｄｕｅｔｚシステムで培養し、得られるＧＡＡ力価を測定した。染色体遺伝子ｃａｒＡおよびｃａｒＢの上流に強力なｓｏｄプロモーターを挿入したことにより、後者の３株は、向上したＬ－アルギニン産生能力を有している。産生培地（ＰＭ）には、４０ｇ／ｌのＤ－グルコースおよび１．９０ｇ／ＬのＬ－アルギニンが含まれているが、グリシンは追加していない。
グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの活性増加とＬ－アルギニン産生能力の向上との組み合わせがＧＡＡ産生に及ぼす影響を評価するために、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌ、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２、およびＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿ＴｌをＷｏｕｔｅｒ Ｄｕｅｔｚシステムで培養し、得られるＧＡＡ力価を測定した。染色体遺伝子ｃａｒＡおよびｃａｒＢの上流に強力なｓｏｄプロモーターを挿入したことにより、後者の３株は、向上したＬ－アルギニン産生能力を有している。産生培地（ＰＭ）には、４０ｇ／ｌのＤ－グルコースおよび１．９０ｇ／ＬのＬ－アルギニンが含まれているが、グリシンは追加していない。
ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、およびＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌ株は、ＡＧＡＴ酵素活性およびグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの増加した酵素活性増加を有している。第１２表に示すように、それぞれ２４６ｍｇ／ｌ、２５５ｍｇ／ｌ、および１９９ｍｇ／ｌのＧＡＡを生産した。
また、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、およびＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌ株も、ＡＧＡＴ酵素活性およびグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの増加した酵素活性を有している。さらに、それらは向上したＬ－アルギニン産生能力を有している。これらの株は、それぞれ３２５ｍｇ／ｌ、３２２ｍｇ／ｌ、および３１６ｍｇ／ｌのＧＡＡを産生した。
ＡＧＡＴ酵素活性の存在下で、グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの活性増加とＬ－アルギニン産生能力の向上とがＧＡＡ産生を向上させると結論付けた。
実施例１２：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性の増加、リンゴ酸シンターゼ活性の低下、およびＬ－アルギニン産生能力の向上がＧＡＡ産生に及ぼす複合的な影響
グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性の増加、リンゴ酸シンターゼ活性の低下、およびＬ－アルギニン産生能力の向上がＧＡＡ産生に及ぼす複合的な影響を評価するために、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌ株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、およびＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿ＴｌをＷｏｕｔｅｒ Ｄｕｅｔｚシステムで培養し、得られるＧＡＡ力価を測定した。ａｃｅＢ遺伝子の欠失により、後者の３株は、低下したリンゴ酸シンターゼ活性を有している。産生培地（ＰＭ）には、４０ｇ／ｌのＤ－グルコースおよび１．９０ｇ／ＬのＬ－アルギニンが含まれているが、グリシンは追加していない。
グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性の増加、リンゴ酸シンターゼ活性の低下、およびＬ－アルギニン産生能力の向上がＧＡＡ産生に及ぼす複合的な影響を評価するために、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌ株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、およびＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿ＴｌをＷｏｕｔｅｒ Ｄｕｅｔｚシステムで培養し、得られるＧＡＡ力価を測定した。ａｃｅＢ遺伝子の欠失により、後者の３株は、低下したリンゴ酸シンターゼ活性を有している。産生培地（ＰＭ）には、４０ｇ／ｌのＤ－グルコースおよび１．９０ｇ／ＬのＬ－アルギニンが含まれているが、グリシンは追加していない。
ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、およびＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌは、ＡＧＡＴ酵素活性、グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの増加した酵素活性、およびＬ－アルギニン産生能力の向上を有している。第１３表に示すように、これらの株は、それぞれ３２５ｍｇ／ｌ、３２２ｍｇ／ｌ、および３１６ｍｇ／ｌのＧＡＡを産生した。
ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ１株、ＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡｔＧＧＴ２株、およびＡＴＣＣ１３０３２＿Ｐｓｏｄ－ｃａｒＡＢ＿ＤａｃｅＢ／ｐＥＣ－ＸＫ９９Ｅ＿ＡＧＡＴ＿Ｍｐ＿ＡＧＴ＿Ｔｌも、ＡＧＡＴ酵素活性、グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの増加した酵素活性、およびＬ－アルギニン産生能力の向上を有している。さらに、それらはリンゴ酸シンターゼの低下した酵素活性を有している。これらの株は、それぞれ３６２ｍｇ／ｌ、３５４ｍｇ／ｌ、および３３１ｍｇ／ｌのＧＡＡを産生した。
酵素的ＡＧＡＴ活性、グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ活性の増加、リンゴ酸シンターゼの活性低下、およびＬ－アルギニン産生能力の向上の組み合わせによりＧＡＡ産生が向上すると結論付けた。
Claims (28)
- Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、かつグリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの機能を有する少なくとも１つのタンパク質を含む、微生物。
- 前記グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの機能を有する少なくとも１つのタンパク質の酵素活性が、野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している、請求項１記載の微生物。
- 前記微生物が、前記野生型微生物の能力と比較して向上した、Ｌ－アルギニン産生能力を有している、請求項１または２記載の微生物。
- 前記微生物が、カルバモイルリン酸シンターゼの機能を有する酵素の活性を有し、前記野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して活性が増加している、請求項３記載の微生物。
- 前記微生物がさらに、アルギニノコハク酸リアーゼの機能を有する酵素を含み、その活性が野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している、請求項３または４記載の微生物。
- 前記微生物がさらに、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの機能を有する酵素を含み、その活性が野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している、請求項３から５までのいずれか１項記載の微生物。
- 前記微生物がさらに、アルギニノコハク酸シンテターゼの機能を有する酵素をさらに含み、その活性が野生型微生物におけるそれぞれの酵素活性と比較して増加している、請求項３から６までのいずれか１項記載の微生物。
- 前記酵素の活性の増加が、それぞれの酵素をコードする遺伝子を過剰発現させることにより達成されている、請求項３から７までのいずれか１項記載の微生物。
- リンゴ酸シンターゼの機能を有するタンパク質の活性が、前記野生型微生物におけるそれぞれの活性と比較して低下している、請求項３から８までのいずれか１項記載の微生物。
- 前記リンゴ酸シンターゼの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現が、前記野生型微生物におけるそれぞれの遺伝子の発現と比較して減弱させられているか、または前記リンゴ酸シンターゼの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が欠失させられている、請求項９記載の微生物。
- アルギニンオペロン（ａｒｇＣＪＢＤＦＲ）が過剰発現させられている、請求項３から１０までのいずれか１項記載の微生物。
- アルギニン応答性リプレッサータンパク質ＡｒｇＲをコードするａｒｇＲ遺伝子の発現が、野生型微生物におけるａｒｇＲ遺伝子の発現と比較して減弱させられているか、または前記ａｒｇＲ遺伝子が欠失させられている、請求項３から１０までのいずれか１項記載の微生物。
- Ｌ－アルギニンの生合成経路の酵素をコードする遺伝子であって、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ、アセチルグルタミン酸キナーゼ、アセチルグルタミルリン酸レダクターゼおよびアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼをそれぞれコードするｇｄｈ、ａｒｇＪ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣおよび／またはａｒｇＤを含む遺伝子のうちの少なくとも１つまたは複数の遺伝子が過剰発現させられている、請求項３から１０または１２のいずれか１項記載の微生物。
- 前記Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が異種性である、請求項１から１３までのいずれか１項記載の微生物。
- 前記Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が過剰発現させられている、請求項１から１４までのいずれか１項記載の微生物。
- 前記Ｌ－アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼの機能を有するタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１によるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含む、請求項１から１５までのいずれか１項記載の微生物。
- 前記グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８によるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含む、請求項１から１６までのいずれか１項記載の微生物。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム属、または腸内細菌科属、またはシュードモナス属に属している、請求項１から１７までのいずれか１項記載の微生物。
- 前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１８記載の微生物。
- 前記微生物が大腸菌である、請求項１８記載の微生物。
- 前記微生物がシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）である、請求項１８記載の微生物。
- グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）の発酵産生方法であって、ａ）請求項１から２１までのいずれか１項記載の微生物を適切な培地で適切な条件下に培養するステップと、ｂ）前記培地中にＧＡＡを蓄積してＧＡＡ含有発酵ブロスを生成するステップとを含む、方法。
- 前記ＧＡＡ含有発酵ブロスからＧＡＡを単離するステップをさらに含む、請求項２２記載の方法。
- 前記ＧＡＡ含有発酵ブロスを乾燥および／または造粒するステップをさらに含む、請求項２２または２３記載の方法。
- グアニジノ酢酸－Ｎ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１から２１までのいずれか１項記載の微生物。
- 前記グアニジノ酢酸－Ｎ－メチルトランスフェラーゼの活性を有する酵素をコードする遺伝子が過剰発現させられている、請求項２５記載の微生物。
- クレアチンの発酵産生方法であって、ａ）請求項２５または２６記載の微生物を適切な培地で適切な条件下に培養するステップと、ｂ）前記培地中にクレアチンを蓄積してクレアチン含有発酵ブロスを生成するステップとを含む、方法。
- 前記クレアチン含有発酵ブロスからクレアチンを単離するステップをさらに含む、請求項２７記載の方法。
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