JP2023522037A - 銅損の軽減 - Google Patents

Abstract

ここでは、溶液中の銅損を防止する方法が提供される。溶液は、銅（ＩＩ）及びシステインを含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物である。この方法は、溶液の濾過の前後に、実質的に同量の可溶性の銅を有することを含む。可溶性の銅の損失を伴わずに、銅（ＩＩ）、システイン、及び他の成分を含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を調製する方法も提供される。また、細胞を培養する方法又は生物学的生成物を作製する方法であって、銅損を防止する前記方法又は前記培地を調製する前記方法によって調製された培地を使用することを含む、方法も提供される。前記方法によって調製された培地、及びそのような培地の使用が、さらに提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
［０００１］本出願は、２０２０年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０１０５３２号の優先権の利益を主張し、その内容は、全体が参照により本明細書に援用される。

［０００２］本開示は、一つには、溶液中の銅損を防止する方法に関する。可溶性の銅の損失を伴わずに、銅（ＩＩ）、システイン、及び他の成分を含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を調製する方法も提供される。細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物は、これらの方法によって得ることができるか又は得られる場合がある。細胞は、このような方法によって調製された培地中で培養される場合があり、生物学的生成物は、前記細胞によって作製される場合がある。

［０００３］細胞培養は、組換えタンパク質などの製品を作成するために使用される場合があり、実際には培養細胞自体が製品になる可能性がある。細胞培養は、哺乳動物細胞などの真核細胞、又は細菌細胞などの原核細胞のいずれかを使用する場合がある。

［０００４］細胞培養は、制御された条件下で細胞を支持及び増殖するための培地の使用に依存している。培地及び関連する供給物、補充物、添加物は、細胞培養を成功させるための多くの異なる成分の存在を必要とする。組換えタンパク質の商業生産をサポートし得る動物細胞培養のための化学的に定義された培地（ＣＤＭ）の開発は、バイオテクノロジー産業にとって重要なマイルストーンとなった。ＣＤＭは、血清／溶解物を含む培地に特有のばらつきをなくし（Ｐｒｉｃｅ ＰＪ， Ｇｒｅｇｏｒｙ ＥＡ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｐｌａｎｔ， １９８２；１８（６）。全体が参照により本明細書に援用される）、不定型の薬剤のリスクを激減させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａｌｋ Ｊ， Ｍｅｌｌｏｒ Ｄ， Ｂｒａｎｄｓ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｈｕｍａｎｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ． ２００４；１８（１）：１－１２。全体が参照により本明細書に援用される）。ＣＤＭ以前は、細胞の増殖に必要な様々な栄養素及び成分を送達するために、血清又は溶解物に頼っていた。

［０００５］ＣＤＭは、定義されていない培地（例えば、血清又は加水分解物を含む）と比較して、培地成分の相互作用を研究する機会を提供する。しかし、血清／溶解物を含む培地の利点の一つは、化合物が通常すでに生物学的に利用可能な形態であることである。例えば、鉄は、多くの細胞機能にとって必須の補助因子である一方、細胞に対して毒性であり得る。定義されていない培地では、鉄を毒性なく送達するには、トランスフェリンなどの生物学的キレート剤が頼りになる（Ｂｊａｒｅ Ｕ． Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． １９９２；５３（３）：３５５－３７４、全体が参照により本明細書に援用される）。ＣＤＭでは、鉄の毒性を防ぐために、シトレートのような非タンパク質キレート剤を研究し、実装する必要がある。ＣＤＭは通常、多くの成分を含んでおり、これらの成分は必ずしも容易に理解できない様々な方法で相互作用し得る。ＣＤＭの実装を成功させるためには、成分がどのように化学的に相互作用し、どのように生物学的に利用可能な形態に保つかを理解することが必要である。したがって、成分がどのように相互作用するかを理解することも、最適な培地及び定義されていない培地を含む補充物を得ることにおいて重要である。

［０００６］したがって、成分間の相互作用による潜在的な問題を減少させるために、細胞培地、供給物、及び補充物を調製する改善された方法が必要である。

［０００７］我々は、システインを含む、細胞培地、供給物、又は添加物において、銅及び鉄を中心とした微量金属触媒の存在下で、システインのシスチンへの酸化が容易に生じることを確認した。銅は、システインの酸化を触媒すると、不溶性の銅（Ｉ）の形態に変換される。酸化されるシステインがなくなると、銅は通常、可溶性の形態に戻る。しかし、システインの酸化が生じている間に溶液を滅菌濾過する場合、通常、銅の少なくとも一部は不溶性の形態となり、培地から除去され、培地中の銅のレベルが減少する。これは好ましくないが、それは、銅は多くの細胞培養物に必要な微量金属であり、溶液からの銅損が、結果として生じる培地が意図したものより少ない銅しか培養細胞に提供されないことを意味するためである。通常、これにより、生産性が低下することになる。したがって、本開示の目的は、濾過中に溶液（細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物）からの銅損を最小限に抑える及び／又は回避することである。

［０００８］本開示の第１の態様は、溶液中の銅損を防ぐ方法を提供する。溶液は、銅（ＩＩ）及びシステインを含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物である。この方法は、溶液の濾過の前後に、実質的に同量の可溶性の銅を有することを含む。

［０００９］ある実施態様では、濾過は、少なくとも所定のレベルの溶存酸素（ｄＯ_２）を含む溶液を用いて実施される。酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することにより、銅（Ｉ）を可溶性の銅（ＩＩ）に迅速に変換し、多量の不溶性の銅（Ｉ）の蓄積を防止し得る。所定のレベルは、少なくとも約６％のｄＯ_２のレベルであり得る。所定のレベルは、少なくとも約８％のｄＯ_２のレベル、例えば、少なくとも約１０％のｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約１２％のｄＯ_２のレベルであり得る。濾過は、少なくとも約６％の溶存酸素（ｄＯ_２）のｄＯ_２レベルを含む溶液を用いて実施され得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約８％ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約１０％のｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約１２％のｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約６％ ｄＯ_２に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約８％ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約１０％のｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約１２％のｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約６％ ｄＯ_２に維持することを含み得る。

［００１０］所定のレベルは、少なくとも約０．４ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、例えば、少なくとも約０．６ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約０．８ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベルであり得る。濾過は、少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌの溶存酸素（ｄＯ_２）のｄＯ_２レベルを含む溶液を用いて実施され得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約０．６ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約０．８ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約０．６ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約０．８ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２に維持することを含み得る。

［００１１］ある実施態様では、ｄＯ_２レベルは、溶液を酸素化すること及び／又は濾過を最適化することによって、少なくとも必要レベルで維持される。必要レベルは、約６％ ｄＯ_２、約８％ ｄＯ_２、約１０％ ｄＯ_２、又は約１２％ ｄＯ_２であり得る。必要レベルは約８％ ｄＯ_２であり得る。必要レベルは、約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．６ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、又は約０．８ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。必要レベルは約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。

［００１２］酸素化は、酸素を含むガスで溶液をスパージすることを含み得る。酸素化は、溶液を撹拌及び／又は混合して、酸素を含むガスと溶液の接触を増加させることを含み得る。酸素化は、酸素を含むガスで溶液をスパージすることと、溶液を撹拌又は混合して、酸素を含むガスと溶液の接触を増加させることとを含み得る。酸素を含むガスは、大気であり得る。

［００１３］濾過を最適化することは、ｄＯ_２レベルが濾過中に所定のレベルより下にならないように、濾過速度、及び／又はフィルタサイズ、及び／又はフィルタ容量を増加させることを含み得る。所定のレベルは、約６％ ｄＯ_２、約８％ ｄＯ_２、約１０％ ｄＯ_２、又は約１２％ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは約８％ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは、約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．６ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、又は約０．８ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。

［００１４］増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１５％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２５％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約３０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約５０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約７５％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１００％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約３０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約５０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約７５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１００％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約１０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約１５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約２０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約２５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約３０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約５０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約７５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約１００％増加させることを含み得る。

［００１５］濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約２４時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１８時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１２時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約９時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約６時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約５時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約４時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約３時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約２時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約３０分間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約２０分間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１５分間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１０分間以内に完了し得る。

［００１６］濾過は、約１００，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約５０，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約２５，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約２５，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約１５，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約１０，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約５，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約４，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約３，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約２，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約１，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約５００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約２５０Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約１００Ｌ以下の容量で実施され得る。

［００１７］濾過は、少なくとも約５０Ｌの容量で実施され得る。濾過は、少なくとも約１００Ｌの容量で実施され得る。濾過は、約１００Ｌから約２，０００Ｌの容量で実施され得るか、又は濾過は、約１００Ｌから約２５，０００Ｌの容量で実施され得る。濾過は、少なくとも１，０００Ｌの容量で実施され得る。例えば、濾過は、約１，０００Ｌから約２，０００Ｌの容量で実施され得るか、又は濾過は、約１，０００Ｌから約２５，０００Ｌの容量で実施され得る。

［００１８］濾過は、約２５，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１８時間以内（例えば、約１２時間以内、約９時間以内、又は約６時間以内）に完了し得る。濾過は、約１５，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１２時間以内（例えば、約９時間以内、約６時間以内、又は約３時間以内）に完了し得る。濾過は、約１０，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約９時間以内（例えば、約６時間以内、約３時間以内、約１時間以内）に完了し得る。濾過は、約５，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約９時間（例えば、約６時間以内、約３時間以内、又は約１時間以内）に完了し得る。濾過は、約２，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１時間以内（例えば、約３０分以内、又は約２０分以内）に完了し得る。濾過は、約１，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約３０分以内（例えば、約２０分以内、又は約１０分以内）に完了し得る。

［００１９］濾過は、少なくとも約５ Ｌ／分、１０Ｌ／分、約２０Ｌ／分、約３０Ｌ／分、約４０Ｌ／分、約５０Ｌ／分、約６０Ｌ／分、約７０Ｌ／分、又は約８０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも１０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも２０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも４０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも５０Ｌ／分の速度で実施され得る。

［００２０］濾過は、約１７０Ｌ／分、約１５０Ｌ／分、約１３０Ｌ／分、約１１０Ｌ／分、約１００Ｌ／分、約９０Ｌ／分、又は約８０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１７０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１５０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１３０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１１０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１００Ｌ／分以内の速度で実施され得る。

［００２１］濾過は、約５Ｌ／分から約１７０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約１０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約２０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約３０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約４０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約５０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約１０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約２０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約３０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約４０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約５０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約１０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約２０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約３０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約４０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約５０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。

［００２２］濾過は、１分あたり総容量の少なくとも０．１％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも０．２５％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも０．５％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも１％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも２．５％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも５％の割合で実施され得る。

［００２３］方法は、濾過の開始前に酸素レベルをモニタリングすること、例えば、濾過の開始前に少なくとも約１０分間（例えば、少なくとも約１５分間）酸素レベルをモニタリングすることを含み得る。方法は、濾過中にｄＯ_２のレベルをモニタリングすることを含み得る。方法は、濾過の開始前に酸素レベルをモニタリングすることと、濾過中にｄＯ_２のレベルをモニタリングすることとを含み得る。方法が酸素レベルをモニタリングすることを含むとき、酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することは、モニタリングされた酸素レベルが所定のレベルに近づいたことに応じて、溶液に酸素を添加することを含み得る。方法が酸素レベルをモニタリングすることを含むとき、酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することは、モニタリングされた酸素レベルが所定のレベルに近づいたことに応じて、溶液の酸素化を増加させること及び／又は濾過を最適化することを含み得る。ｄＯ_２のレベルは、任意の適切な技法を使用してモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、電気化学酸素センサ又は光学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、電気化学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、光学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。

［００２４］実施態様では、方法は、システイン溶液及び銅（ＩＩ）溶液を提供することを含み、濾過は、システイン溶液と銅（ＩＩ）溶液を別々に濾過し、その後、濾過したシステイン溶液と濾過した銅（ＩＩ）溶液とを合わせて、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を形成することを含む。濾過の後まで銅（ＩＩ）溶液とシステイン溶液を別々に保持することにより、銅は、濾過前及び濾過中に可溶性の銅（ＩＩ）に保持される。

［００２５］システイン溶液は、銅以外の、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の成分の少なくとも大部分を含み得る。システイン溶液は、銅、及び鉄などの他の微量元素以外の、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の成分の実質的にすべてを含み得る。システイン溶液は、銅及び鉄以外の、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の成分の実質的にすべてを含み得る。システイン溶液は、銅以外の、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の成分の実質的にすべてを含み得る。

［００２６］銅溶液は、システイン以外の、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の成分の少なくとも大部分を含み得る。

［００２７］銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度は、約０．００５μＭから約１．５ Ｍ、例えば０．００５μＭから約１Ｍの範囲であり得る。この範囲の上限は、温度依存的であり得る。よって、少なくとも約３０℃の温度での使用が意図される溶液は、最高約１．５Ｍの濃度を有し得る一方、室温未満（例えば、約２０℃未満の温度、例えば、約１０℃未満の温度）での使用又は保管が意図される化合物は、最高約１Ｍの濃度を有し得る。最終溶液が細胞培地である場合、銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度は、約０．００５μＭから約５μＭの範囲であり得る。最終溶液が細胞培養供給物である場合、銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度は、約０．１ｍＭから約１５０ｍＭの範囲であり得る。最終溶液が細胞培養添加物である場合、銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度は、約１ｍＭから約１．５Ｍ、例えば、約１ｍＭから約１Ｍの範囲であり得る。

［００２８］実施態様では、濾過は、滅菌濾過を含む。滅菌濾過は、約０．５μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含み得る。滅菌濾過は、約０．２μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含み得る。滅菌濾過は、約０．１μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含み得る。滅菌濾過は、約０．１μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含み得る。実施態様では、濾過培地は、１つ又は複数の膜、中空糸、カラム、らせん状の膜、チューブ、キャピラリー、カプセル、カセット、ディスク、フリット、又はプラグを含む。

［００２９］実施態様では、システインは、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体として実質的に提供される。例えば、システインは、約１ｍＭ未満の遊離システインを含み得る。例えば、システインは、０．５ｍＭ未満の遊離システイン（又は０．１ｍＭ未満の遊離システイン）を含み得る。スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体は、銅（ＩＩ）と反応して不溶性の銅（Ｉ）を形成することはない。

［００３０］システインは、溶液に銅（ＩＩ）を添加する前に、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体に実質的に変換され得る。システイン誘導体は、ジスルフィド及び／又はチアゾリジン部分を含み得る。

［００３１］システイン誘導体は、ジスルフィドを含み得る。例えば、システイン誘導体は、システイン、Ｓ－スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイニルグリシン、Ｌ－システイン混合ジスルフィド、及び／又はＳ－スルホグルタチオンを含み得る。システイン誘導体は、シスチンを含み得る。

［００３２］システイン誘導体は、チアゾリジン部分を含み得る。例えば、システイン誘導体は、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレート、２－メチル－１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、２－（２－カルボキシエチル）２１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸、２－アルキル－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、２－アリール－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、及び炭水化物ベースのチアゾリジン（例えば、Ｄ－リボース－Ｌ－システイン）を含み得る。システイン誘導体は、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレートを含み得る。

［００３３］システイン誘導体は、シスチン、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレート、Ｓ－スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイニルグリシン、システイン Ｓ－結合型Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡＣ－ｃｙｓ）、ホモシスチン、Ｌ－システイン混合ジスルフィド、Ｌ－システイン混合ペプチド、Ｓ－アルキル化システイン、チオール保護基を有するシステイン（例えば、ＦＭＯＣ保護システイン）、２－メチル－１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、２－（２－カルボキシエチル）２１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、還元及び酸化グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｓ－スルホグルタチオン、Ｓ－アシル－ＧＳＨ、Ｓ－カルボキシ－Ｌ－システイン、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸、２－アルキル－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、２－アリール－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、又は炭水化物ベースのチアゾリジン（例えば、Ｄ－リボース－Ｌ－システイン）のうちの少なくとも１つを含み得る。

［００３４］実施態様では、銅は、銅（ＩＩ）キレート剤の形態であり得る。キレートは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ネオクプロイン（ｎｅｏｃｕｐｒｉｏｎｅ）、バソクプロイン（ｂａｔｈｏｃｕｐｒｉｏｎｅ）、Ｄ－ペニシラミン、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、８－ヒドロキシキノリン、クリオキノール、及び５，７－ジクロロ－２－［（ジメチルアミノ）メチル］－８－キノリノール（ＰＢＴ２）から選択される少なくとも１つのキレート剤を含み得る。

［００３５］第２の態様では、本開示は、可溶性の銅の損失を伴わずに、銅（ＩＩ）、システイン、及び他の成分を含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を調製する方法を提供する。方法は、システイン及び他の成分を含む水溶液を提供することと；銅（ＩＩ）を含む水溶液を提供することと；システイン及び他の成分を含む水溶液と、銅（ＩＩ）を含む水溶液とを別々に濾過することと；濾過された溶液を合わせて、細胞培地、細胞培養供給物、細胞培養添加物を提供することとを含む。

［００３６］システイン及び他の成分を含む水溶液の調製は、システイン及び他の成分を水性溶媒系（例えば、水）に溶解及び／又は可溶化することを含み得る。システイン及び他の成分を含む溶液の調製は、システイン及び他の成分を、酸、塩基、又は水混和性有機溶媒を含む最初の溶媒系に溶解及び／又は可溶化し、続いて、最初の溶媒系を水及び任意選択的に他の成分で希釈して、水溶液を形成することを含み得る。

［００３７］銅（ＩＩ）を含む水溶液の調製は、銅（ＩＩ）塩を水性溶媒系（例えば、水）に溶解することを含み得る。銅（ＩＩ）を含む溶液の調製は、銅（ＩＩ）塩を、酸、塩基、又は水混和性有機溶媒を含む最初の溶媒系に溶解及び／又は可溶化し、続いて、最初の溶媒系を水及び任意選択的に他の成分で希釈して、水溶液を形成することを含み得る。

［００３８］酸は、無機酸又は有機酸であり得る。例示的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、又は亜リン酸等が含まれる。例示的な有機酸には、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン等の比較的無毒性の有機酸が含まれる。例示的な塩基には、アンモニア；ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、又はマグネシウム等の水酸化物；ナトリウム、カリウム、若しくはアンモニウムの炭酸塩又は重炭酸塩が含まれる。例示的な水混和性有機溶媒には、エタノール、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｄｉｎｅ）が含まれる。

［００３９］銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度は、約０．００５μＭから約１Ｍの範囲であり得る。最終溶液が細胞培地である場合、銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度は、約０．００５μＭから約５μＭの範囲であり得る。最終溶液が細胞培養供給物である場合、銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度は、約０．１ｍＭから約１５０ｍＭの範囲であり得る。最終溶液が細胞培養添加物である場合、銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度は、約１ｍＭから約１Ｍの範囲であり得る。

［００４０］ある実施態様では、濾過は、少なくとも所定のレベルの溶存酸素（ｄＯ_２）を含む溶液を用いて実施される。酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することにより、銅（Ｉ）を可溶性の銅（ＩＩ）に迅速に変換し、多量の不溶性の銅（Ｉ）の蓄積を防止し得る。所定のレベルは、少なくとも約６％のｄＯ_２のレベルであり得る。所定のレベルは、少なくとも約８％のｄＯ_２のレベル、例えば、少なくとも約１０％のｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約１２％のｄＯ_２のレベルであり得る。濾過は、少なくとも約６％の溶存酸素（ｄＯ_２）のｄＯ_２レベルを含む溶液を用いて実施され得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約８％ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約１０％のｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約１２％のｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約６％ ｄＯ_２に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約８％ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約１０％のｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約１２％のｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約６％ ｄＯ_２に維持することを含み得る。

［００４１］所定のレベルは、少なくとも約０．４ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、例えば、少なくとも約０．６ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約０．８ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベルであり得る。濾過は、少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌの溶存酸素（ｄＯ_２）のｄＯ_２レベルを含む溶液を用いて実施され得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約０．６ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約０．８ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約０．６ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約０．８ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２に維持することを含み得る。

［００４２］ある実施態様では、ｄＯ_２レベルは、溶液を酸素化すること及び／又は濾過を最適化することによって、少なくとも必要レベルで維持される。必要レベルは、約６％ ｄＯ_２、約８％ ｄＯ_２、約１０％ ｄＯ_２、又は約１２％ ｄＯ_２であり得る。必要レベルは約８％ ｄＯ_２であり得る。必要レベルは、約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．６ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、又は約０．８ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。必要レベルは約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。

［００４３］酸素化は、酸素を含むガスで溶液をスパージすることを含み得る。酸素化は、溶液を撹拌及び／又は混合して、酸素を含むガスと溶液の接触を増加させることを含み得る。酸素化は、酸素を含むガスで溶液をスパージすることと、溶液を撹拌又は混合して、酸素を含むガスと溶液の接触を増加させることとを含み得る。酸素を含むガスは、大気であり得る。

［００４４］濾過を最適化することは、ｄＯ_２レベルが濾過中に所定のレベルより下にならないように、濾過速度、及び／又はフィルタサイズ、及び／又はフィルタ容量を増加させることを含み得る。所定のレベルは、約６％ ｄＯ_２、約８％ ｄＯ_２、約１０％ ｄＯ_２、又は約１２％ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは約８％ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは、約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．６ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、又は約０．８ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。

［００４５］増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１５％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２５％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約３０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約５０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約７５％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１００％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約３０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約５０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約７５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１００％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約１０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約１５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約２０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約２５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約３０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約５０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約７５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約１００％増加させることを含み得る。

［００４６］方法は、濾過の開始前に酸素レベルをモニタリングすること、例えば、濾過の開始前に少なくとも約１０分間（例えば、少なくとも約１５分間）酸素レベルをモニタリングすることを含み得る。方法は、濾過中にｄＯ_２のレベルをモニタリングすることを含み得る。方法は、濾過の開始前に酸素レベルをモニタリングすることと、濾過中にｄＯ_２のレベルをモニタリングすることとを含み得る。方法が酸素レベルをモニタリングすることを含むとき、酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することは、モニタリングされた酸素レベルが所定のレベルに近づいたことに応じて、溶液に酸素を添加することを含み得る。方法が酸素レベルをモニタリングすることを含むとき、酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することは、モニタリングされた酸素レベルが所定のレベルに近づいたことに応じて、溶液の酸素化を増加させること及び／又は濾過を最適化することを含み得る。ｄＯ_２のレベルは、任意の適切な技法を使用してモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、電気化学酸素センサ又は光学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、電気化学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、光学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。

［００４７］実施態様では、システインは、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体として実質的に提供される。例えば、システインは、約１ｍＭ未満の遊離システインを含み得る。例えば、システインは、０．５ｍＭ未満の遊離システイン（又は０．１ｍＭ未満の遊離システイン）を含み得る。スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体は、銅（ＩＩ）と反応して不溶性の銅（Ｉ）を形成することはない。

［００４８］システインは、溶液に銅（ＩＩ）を添加する前に、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体に実質的に変換され得る。システイン誘導体は、ジスルフィド及び／又はチアゾリジン部分を含み得る。

［００４９］システイン誘導体は、ジスルフィドを含み得る。例えば、システイン誘導体は、シスチン、Ｓ－スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイニルグリシン、Ｌ－システイン混合ジスルフィド、及び／又はＳ－スルホグルタチオンを含み得る。システイン誘導体は、シスチンを含み得る。

［００５０］システイン誘導体は、チアゾリジン部分を含み得る。例えば、システイン誘導体は、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレート、２－メチル－１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、２－（２－カルボキシエチル）２１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸、２－アルキル－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、２－アリール－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、及び炭水化物ベースのチアゾリジン（例えば、Ｄ－リボース－Ｌ－システイン）を含み得る。システイン誘導体は、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレートを含み得る。

［００５１］システイン誘導体は、シスチン、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレート、Ｓ－スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイニルグリシン、システイン Ｓ－結合型Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡＣ－ｃｙｓ）、ホモシスチン、Ｌ－システイン混合ジスルフィド、Ｌ－システイン混合ペプチド、Ｓ－アルキル化システイン、チオール保護基を有するシステイン（例えば、ＦＭＯＣ保護システイン）、２－メチル－１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、２－（２－カルボキシエチル）２１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、還元及び酸化グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｓ－スルホグルタチオン、Ｓ－アシル－ＧＳＨ、Ｓ－カルボキシ－Ｌ－システイン、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸、２－アルキル－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、２－アリール－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、又は炭水化物ベースのチアゾリジン（例えば、Ｄ－リボース－Ｌ－システイン）のうちの少なくとも１つを含み得る。

［００５２］実施態様では、銅は、銅（ＩＩ）キレートの形態であり得る。キレートは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ネオクプロイン、バソクプロイン、Ｄ－ペニシラミン、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、８－ヒドロキシキノリン、クリオキノール、及び５，７－時クロロ－２－［（ジメチルアミノ）メチル］－８－キノリノール（ＰＢＴ２）から選択される少なくとも１つのキレート剤を含み得る。

［００５３］第３の態様では、本開示は、可溶性の銅の損失を伴わずに、銅（ＩＩ）、システイン、及び他の成分を含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を調製する方法を提供する。方法は、銅（ＩＩ）、システイン、及びその他の成分を含む溶液を濾過して、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を提供することを含む。

［００５４］濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約２４時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１８時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１２時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約９時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約６時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約５時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約４時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約３時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約２時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１時間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約３０分間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約２０分間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１５分間以内に完了し得る。濾過は、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１０分間以内に完了し得る。

［００５５］濾過は、約１００，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約５０，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約２５，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約２５，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約１５，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約１０，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約５，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約４，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約３，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約２，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約１，０００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約５００Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約２５０Ｌ以下の容量で実施され得る。濾過は、約１００Ｌ以下の容量で実施され得る。

［００５６］濾過は、少なくとも約５０Ｌの容量で実施され得る。濾過は、少なくとも約１００Ｌの容量で実施され得る。濾過は、約１００Ｌから約２，０００Ｌの容量で実施され得るか、又は濾過は、約１００Ｌから約２５，０００Ｌの容量で実施され得る。濾過は、少なくとも１，０００Ｌの容量で実施され得る。例えば、濾過は、約１，０００Ｌから約２，０００Ｌの容量で実施され得るか、又は濾過は、約１，０００Ｌから約２５，０００Ｌの容量で実施され得る。

［００５７］濾過は、約２５，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１８時間以内（例えば、約１２時間以内、約９時間以内、又は約６時間以内）に完了し得る。濾過は、約１５，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１２時間以内（例えば、約９時間以内、約６時間以内、又は約３時間以内）に完了し得る。濾過は、約１０，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約９時間以内（例えば、約６時間以内、約３時間以内、約１時間以内）に完了し得る。濾過は、約５，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約９時間（例えば、約６時間以内、約３時間以内、又は約１時間以内）に完了し得る。濾過は、約２，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約１時間以内（例えば、約３０分以内、又は約２０分以内）に完了し得る。濾過は、約１，０００Ｌ以下の容量を含む溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約３０分以内（例えば、約２０分以内、又は約１０分以内）に完了し得る。

［００５８］濾過は、少なくとも約５Ｌ／分、１０Ｌ／分、約２０Ｌ／分、約３０Ｌ／分、約４０Ｌ／分、約５０Ｌ／分、約６０Ｌ／分、約７０Ｌ／分、又は約８０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも１０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも２０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも４０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、少なくとも５０Ｌ／分の速度で実施され得る。

［００５９］濾過は、約１７０Ｌ／分、約１５０Ｌ／分、約１３０Ｌ／分、約１１０Ｌ／分、約１００Ｌ／分、約９０Ｌ／分、又は約８０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１７０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１５０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１３０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１１０Ｌ／分以内の速度で実施され得る。濾過は、約１００Ｌ／分以内の速度で実施され得る。

［００６０］濾過は、約５Ｌ／分から約１７０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約１０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約２０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約３０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約４０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約５０Ｌ／分から約１５０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約１０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約２０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約３０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約４０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約５０Ｌ／分から約１３０Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約１０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約２０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約３０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約４０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。濾過は、約５０Ｌ／分から約１００Ｌ／分の速度で実施され得る。

［００６１］濾過は、１分あたり総容量の少なくとも０．１％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも０．２５％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも０．５％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも１％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも２．５％の割合で実施され得る。濾過は、１分あたり総容量の少なくとも５％の割合で実施され得る。

［００６２］実施態様では、濾過は、滅菌濾過を含む。滅菌濾過は、約０．５μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含み得る。滅菌濾過は、約０．２μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含み得る。滅菌濾過は、約０．１μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含み得る。滅菌濾過は、約０．１μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含み得る。

［００６３］ある実施態様では、濾過は、少なくとも所定のレベルの溶存酸素（ｄＯ_２）を含む溶液を用いて実施される。酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することにより、銅（Ｉ）を可溶性の銅（ＩＩ）に迅速に変換し、多量の不溶性の銅（Ｉ）の蓄積を防止し得る。所定のレベルは、少なくとも約６％のｄＯ_２のレベルであり得る。所定のレベルは、少なくとも約８％のｄＯ_２のレベル、例えば、少なくとも約１０％のｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約１２％のｄＯ_２のレベルであり得る。濾過は、少なくとも約６％の溶存酸素（ｄＯ_２）のｄＯ_２レベルを含む溶液を用いて実施され得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約８％ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約１０％のｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約１２％のｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約６％ ｄＯ_２に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約８％ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約１０％のｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約１２％のｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約６％ ｄＯ_２に維持することを含み得る。

［００６４］所定のレベルは、少なくとも約０．４ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、例えば、少なくとも約０．６ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約０．８ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベルであり得る。濾過は、少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌの溶存酸素（ｄＯ_２）のｄＯ_２レベルを含む溶液を用いて実施され得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約０．６ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約０．８ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２（例えば、少なくとも約０．６ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル、又は少なくとも約０．８ｍｇ／ＬのｄＯ_２のレベル）に維持することを含み得る。方法は、さらに、溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１５分間、少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２に維持することを含み得る。

［００６５］ある実施態様では、ｄＯ_２レベルは、溶液を酸素化すること及び／又は濾過を最適化することによって、少なくとも必要レベルで維持される。必要レベルは、約６％ ｄＯ_２、約８％ ｄＯ_２、約１０％ ｄＯ_２、又は約１２％ ｄＯ_２であり得る。必要レベルは約８％ ｄＯ_２であり得る。必要レベルは、約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．６ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、又は約０．８ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。必要レベルは約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。

［００６６］酸素化は、酸素を含むガスで溶液をスパージすることを含み得る。酸素化は、溶液を撹拌及び／又は混合して、酸素を含むガスと溶液の接触を増加させることを含み得る。酸素化は、酸素を含むガスで溶液をスパージすることと、溶液を撹拌又は混合して、酸素を含むガスと溶液の接触を増加させることとを含み得る。酸素を含むガスは、大気であり得る。

［００６７］濾過を最適化することは、ｄＯ_２レベルが濾過中に所定のレベルより下にならないように、濾過速度、及び／又はフィルタサイズ、及び／又はフィルタ容量を増加させることを含み得る。所定のレベルは、約６％ ｄＯ_２、約８％ ｄＯ_２、約１０％ ｄＯ_２、又は約１２％ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは約８％ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは、約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．６ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、又は約０．８ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。

［００６８］増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１５％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２５％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約３０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約５０％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約７５％増加させることを含み得る。増加させることは、濾過速度（及び任意選択的に、フィルタサイズ、及び／又は任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１００％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約２５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約３０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約５０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約７５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタサイズ（及び任意選択的にフィルタ容量）を少なくとも約１００％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約１０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約１５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約２０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約２５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約３０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約５０％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約７５％増加させることを含み得る。増加させることは、フィルタ容量を少なくとも約１００％増加させることを含み得る。

［００６９］方法は、濾過の開始前に酸素レベルをモニタリングすること、例えば、濾過の開始前に少なくとも約１０分間（例えば、少なくとも約１５分間）酸素レベルをモニタリングすることを含み得る。方法は、濾過中にｄＯ_２のレベルをモニタリングすることを含み得る。方法は、濾過の開始前に酸素レベルをモニタリングすることと、濾過中にｄＯ_２のレベルをモニタリングすることとを含み得る。方法が酸素レベルをモニタリングすることを含むとき、酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することは、モニタリングされた酸素レベルが所定のレベルに近づいたことに応じて、溶液に酸素を添加することを含み得る。方法が酸素レベルをモニタリングすることを含むとき、酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することは、モニタリングされた酸素レベルが所定のレベルに近づいたことに応じて、溶液の酸素化を増加させること及び／又は濾過を最適化することを含み得る。ｄＯ_２のレベルは、任意の適切な技法を使用してモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、電気化学酸素センサ又は光学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、電気化学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、光学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。

［００７０］実施態様では、システインは、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体として実質的に提供される。例えば、システインは、約１ｍＭ未満の遊離システインを含み得る。例えば、システインは、０．５ｍＭ未満の遊離システイン（又は０．１ｍＭ未満の遊離システイン）を含み得る。スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体は、銅（ＩＩ）と反応して不溶性の銅（Ｉ）を形成することはない。

［００７１］システインは、溶液に銅（ＩＩ）を添加する前に、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体に実質的に変換され得る。システイン誘導体は、ジスルフィド及び／又はチアゾリジン部分を含み得る。

［００７２］システイン誘導体は、ジスルフィドを含み得る。例えば、システイン誘導体は、シスチン、Ｓ－スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイニルグリシン、Ｌ－システイン混合ジスルフィド、及び／又はＳ－スルホグルタチオンを含み得る。システイン誘導体は、シスチンを含み得る。

［００７３］システイン誘導体は、チアゾリジン部分を含み得る。例えば、システイン誘導体は、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレート、２－メチル－１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、２－（２－カルボキシエチル）２１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸、２－アルキル－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、２－アリール－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、及び炭水化物ベースのチアゾリジン（例えば、Ｄ－リボース－Ｌ－システイン）を含み得る。システイン誘導体は、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレートを含み得る。

［００７４］システイン誘導体は、シスチン、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレート、Ｓ－スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイニルグリシン、システイン Ｓ－結合型Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡＣ－ｃｙｓ）、ホモシスチン、Ｌ－システイン混合ジスルフィド、Ｌ－システイン混合ペプチド、Ｓ－アルキル化システイン、チオール保護基を有するシステイン（例えば、ＦＭＯＣ保護システイン）、２－メチル－１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、２－（２－カルボキシエチル）２１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、還元及び酸化グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｓ－スルホグルタチオン、Ｓ－アシル－ＧＳＨ、Ｓ－カルボキシ－Ｌ－システイン、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸、２－アルキル－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、２－アリール－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、又は炭水化物ベースのチアゾリジン（例えば、Ｄ－リボース－Ｌ－システイン）のうちの少なくとも１つを含み得る。

［００７５］実施態様では、銅は、銅（ＩＩ）キレートの形態であり得る。キレートは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ネオクプロイン、バソクプロイン、Ｄ－ペニシラミン、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、８－ヒドロキシキノリン、クリオキノール、及び５，７－時クロロ－２－［（ジメチルアミノ）メチル］－８－キノリノール（ＰＢＴ２）から選択される少なくとも１つのキレート剤を含み得る。

［００７６］第１、第２、又は第３の態様のいずれかの実施態様では、他の成分は、少なくとも１つの炭素源、及び／又は少なくとも１つの窒素源、及び／又は少なくとも１つのビタミン、及び／又は少なくとも１つの緩衝剤、及び／又は少なくとも１つの無機塩、及び／又は銅以外の少なくとも１つの微量金属、及び／又は少なくとも１つのポリアミン、及び／又は少なくとも１つの（必須）脂肪酸、及び／又は少なくとも１つの抗酸化剤、及び／又は少なくとも１つのコルチコステロイド、及び／又は少なくとも１つのキレート剤、及び／又は少なくとも１つのリパーゼ阻害剤を含む。他の成分は、少なくとも１つの炭素源、及び／又は少なくとも１つの窒素源、及び／又は少なくとも１つのビタミン、及び／又は少なくとも１つの緩衝剤、及び／又は少なくとも１つの無機塩、及び／又は銅以外の少なくとも１つの微量金属、及び／又は少なくとも１つのポリアミン、及び／又は少なくとも１つの（必須）脂肪酸を含み得る。他の成分は、少なくとも１つの炭素源を含み得る。他の成分は、少なくとも１つの窒素源を含み得る。他の成分は、少なくとも１つのビタミンを含み得る。他の成分は、少なくとも１つの緩衝剤を含み得る。他の成分は、少なくとも１つの無機塩を含み得る。他の成分は、少なくとも銅以外の１つの微量金属を含み得る。他の成分は、少なくとも１つのポリアミンを含み得る。他の成分は、少なくとも１つの（必須）脂肪酸を含み得る。他の成分は、少なくとも１つの炭素源、少なくとも１つの窒素源、少なくとも１つのビタミン、少なくとも１つの緩衝剤、少なくとも１つの無機塩、少なくとも１つの銅以外の微量金属、少なくとも１つのポリアミン、及び少なくとも１つの（必須）脂肪酸を含み得る。

［００７７］少なくとも１つの炭素源は、糖、任意選択的に単糖又は二糖を含み得る。糖は、少なくとも１つの（例えば、２つ以上の）グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、リボース、及びデオキシリボースを含み得る。糖は、グルコース及び／又はデオキシリボースを含み得る。

［００７８］少なくとも１つの窒素源（例えば、２つ以上の窒素源）は、少なくとも１つのアミノ酸及び／又はアンモニア／アンモニウムを含み得る。少なくとも１つの窒素源は、少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。少なくとも１つのアミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン、Ｌ－システイン， Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリンから選択され得る。

［００７９］少なくとも１つのビタミン（例えば、２つ以上のビタミン）は、アスコルビン酸（例えば、アスコルビン酸マグネシウム塩）、ビオチン、コリン（例えば、塩化コリン）、Ｄ－Ｃａ２＋－パントテネート、葉酸、イノシトール、メナジオン、ナイアシンアミド、ニコチン酸、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ピリドキサール、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＡアセテート、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ２、及びビタミン様活性を有する物質（例えば、アルファリポ酸又はジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ））から選択され得る。

［００８０］少なくとも１つの緩衝剤は、Ｇｏｏｄの緩衝剤（例えば、ａｓ ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ ｉｎ Ｎ．Ｅ． Ｇｏｏｄ， ｅｔ ａｌ．， “Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９６６），５（２）， ４６７－４７７； Ｎ．Ｅ． Ｇｏｏｄ ａｎｄ Ｓ． Ｉｚａｗａ， “Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， （１９７２）， Ｖｏｌ． ２４， ５３－６８；及びＷ．Ｊ． Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， （１９８０）， １０４（２）， ３００－３１０に開示されるようなもの）などの、約６から約８の範囲のｐＨで緩衝し得る少なくとも１つの緩衝剤（例えば、２つ以上の緩衝剤）を含み得る。少なくとも１つの緩衝剤は、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、リン酸水素、リン酸二水素、乳酸塩、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及び２－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（ビス－トリス）を含む少なくとも１つの緩衝剤から選択される少なくとも１つの緩衝剤（例えば、２つ以上の緩衝剤）を含み得る。

［００８１］少なくとも１つの無機塩（例えば、２つ以上の無機塩）は、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、又は鉄の、少なくとも１つの可溶性塩を含み得る。可溶性塩は、２５℃の水中で少なくとも１ｇ／Ｌの溶解度を有する塩であり得る。少なくとも１つの無機塩（例えば、２つ以上の無機塩）は、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、及びクエン酸鉄キレート又は硫酸鉄キレートのうちの少なくとも１つを含み得る。

［００８２］銅以外の少なくとも１つの微量金属（例えば、２つ以上の微量金属）は、バリウム、臭素、コバルト、ヨウ素、マンガン、クロム、ニッケル、セレン、バナジウム、チタン、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、スズ、ジルコニウム、カドミウム、亜鉛、及びアルミニウムのうちの少なくとも１つのイオンを含み得る。

［００８３］少なくとも１つのポリアミン（例えば、２つ以上のポリアミン）は、プトレスシン、カダベリン、スペルミン、及びスペルミジンのうちの少なくとも１つを含み得る。

［００８４］少なくとも１つの（必須）脂肪酸（例えば、少なくとも２つの脂肪酸）は、ｎ－３、ｎ－６、ｎ－９脂肪酸及びコレストロールから選択され得る。少なくとも１つの（必須）脂肪酸（例えば、少なくとも２つの脂肪酸）は、リノール酸（ＡＬＡ）、リノレン酸（ＬＡ）、ドコサヘキセン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）から選択され得る。例えば、少なくとも１つの必須脂肪酸（例えば、少なくとも２つの脂肪酸）は、ＡＬＡ及びリノレン酸ＬＡから選択され得る。

［００８５］少なくとも１つの抗酸化剤（例えば、２つ以上の抗酸化剤）は、アスコルビン酸、タウリン、ヒポタウリン、トコフェロール、及びトコトリエノールのうちの少なくとも１つを含み得る。

［００８６］少なくとも１つのコルチコステロイド（例えば、２つ以上のコルチコステロイド）は、少なくとも１つのグルココルチコイド（例えば、ヒドロコルチゾン）又はミネラロコルチコイド（例えば、アルドステロン）を含み得る。

［００８７］少なくとも１つの金属キレート剤（例えば、２つ以上のキレート剤）は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ネオクプロイン、バソクプロイン、Ｄ－ペニシラミン、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、８－ヒドロキシキノリン、クリオキノール、及び５，７－ジクロロ－２－［（ジメチルアミノ）メチル］－８－キノリノール（ＰＢＴ２）、１，２－ビス（２－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１，２－ビス（２－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸テトラキス（アセトキシメチルエステル）（ＢＡＰＴＡ－ＡＭ）、メシル酸デフェロキサミンのうちの少なくとも１つを含み得る。

［００８８］第４の態様では、本開示は、培地中で細胞を培養する方法を提供する。方法は、第１の態様の方法によって培地中の銅損を防止すること、又は第２若しくは第３の態様の方法によって培地を調製すること；細胞を培地と接触させること；及び培地中で細胞を培養することを含む。

［００８９］細胞は、真核細胞、原核細胞、又は古細菌細胞であり得る。真核細胞は、哺乳動物細胞であり得る。細胞は、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ－２１細胞を含む）、及びそれらの誘導体から選択され得る。

［００９０］培地中で細胞を培養することは、細胞を増殖させることを含み得る。方法は、増殖した細胞を単離及び／又は精製することをさらに含み得る。

［００９１］第５の態様では、本開示は、生物学的生成物を作製する方法を提供する。方法は、第１の態様によって培地中の銅損を防止すること又は第２若しくは第３の態様によって培地を調製すること；前記生物学的生成物を発現するように構成された細胞を培地と接触させること；及び細胞が生物学的生成物を発現するような条件下で、培地中で細胞を培養することを含む。

［００９２］生物学的生成物は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ウイルス若しくはウイルス様粒子、核酸若しくはその断片；任意選択的に、抗体、又は抗体の生物学的に機能的な断片であり得る。

［００９３］細胞は、真核細胞、原核細胞、又は古細菌細胞であり得る。真核細胞は、哺乳動物細胞であり得る。細胞は、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ－２１細胞を含む）、及びそれらの誘導体から選択され得る。

［００９４］方法は、生成物を単離及び／又は精製することをさらに含み得る。

［００９５］第６の態様では、方法は、第２若しくは第３の態様の方法によって得ることができるか又は得られる、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を提供する。

［００９６］第７の態様では、本開示は、細胞を培養するための第６の態様の、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の使用を提供する。培養することは、前記細胞から生物学的生成物を生成することを含み得る。培養することは、前記細胞を増殖させることを含み得る。培養することは、前記細胞を増殖させることと、前記細胞から生物学的生成物を生成することとを含み得る。使用は、生物学的生成物を単離することをさらに含み得る。

［００９７］以下、添付の図面を参照して、本発明の実施態様をさらに説明する。

Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍでの濾過による銅の除去の経時変化を図示する。アリコート（ｎ＝３）は各時点で濾過され、銅含有量は濾過されていない培地と比較された。 微量金属添加後の例示的な培地において、いくつかのパラメータが経時的にどのように変化したかを示す。ａ）は、システインモノマーの濃度プロファイルを提供し、ｂ）は、飽和度％と比較した溶存酸素（ｄＯ_２）の濃度プロファイルを提供し、ｃ）は、酸化還元電位を提供し、ｄ）は、銅除去、システインモノマー、及び溶存酸素の結果を重ね合わせ、これらのパラメータのそれぞれの相対的なレベルを比較できるようにしている。 ａ）非混合系での出発システイン濃度の増加、ｂ）混合系での出発システイン濃度の増加、ｃ）システイン枯渇後の窒素スパージ、及びｄ）システイン枯渇前の窒素スパージによって拡大した銅の除去を示す。 システインとピルベートの縮合反応による２，４チアゾリジンの生成を示す。 簡易培地においてエルマン試薬で測定したシステインモノマープロファイルを提供する。金属イオンやピルベートを含まない簡易培地、ピルベートを含む簡易培地、金属イオンを含む簡易培地、並びにピルベート及び金属イオンを含む簡易培地の４つの条件を比較した。 システインを含む細胞培地の銅除去、システインモノマー、溶存酸素、酸化還元プロファイルの一貫性を示す複製データを提供する（図１、２との比較）。

［００９８］本明細書及び特許請求の範囲を通じて、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」及び「ｃｏｎｔａｉｎ（含有する、含む）」並びにそれらの変形は、「含むがこれに限定されない」を意味し、それらは他の部分、添加物、成分、整数又は工程を除外することを意図しない（そして除外しない）。本明細書の及び特許請求の範囲を通じて、文脈上他に必要とされない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈上他に必要とされない限り、単数形と同様に複数形を企図するものと理解されるものとする。

［００９９］本開示の特定の態様、実施態様又は実施例に関連して記載される特徴、整数、特色、化合物、化学的部分又は基は、それらと両立しない場合を除き、本明細書に記載の任意の他の態様、実施態様又は実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示された特徴の全て、及び／又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの工程の全ては、そのような特徴及び／又は工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本開示は、前述のいずれの実施態様の詳細にも限定されない。本開示は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なものも若しくは任意の新規な組み合わせ、又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの工程の任意の新規なもの若しくは任意の新規な組み合わせに及ぶ。

［００１００］読者の注意は、本願と同時又はそれ以前に本明細書と関連して出願され、本明細書とともに一般に公開されているすべての論文及び文献に向けられ、かかるすべての論文及び文献の内容は参照により本明細書に援用される。

［００１０１］本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。

定義
［００１０２］以下の用語及び方法の説明は、本開示をより良く説明し、当業者が本開示を実施する際の指針とするために提供されるものである。

［００１０３］本明細書で使用される場合の「可溶性の銅」という用語は、溶媒和された銅イオン、すなわち、溶媒分子によって囲まれているか又は錯体化されている溶液中の銅イオンへの言及を含む。溶液は、任意選択的には極性有機溶媒（エタノールなど）を含む、水溶液であり得る。可溶性の銅は、銅（ＩＩ）イオン、例えば、２０℃で１００ｍＬあたり１ｇ超の水への溶解度を有する銅（ＩＩ）塩を含み得るか又はそれからなり得る

［００１０４］本明細書で使用される場合の「不溶性」という用語は、２０℃で１００ｍＬあたり０．０５ｇ未満の水への溶解度を有する固体（例えば、銅（Ｉ）を含む種）への言及を含む。

［００１０５］本明細書で使用される場合の「溶液」という用語は、文脈上別途必要とされない限り、複数の物質を含む液相への言及を含む。溶液が、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物であるとき、溶媒は、典型的には水であり、溶液中のその他の物質は、典型的には溶質である。溶質は、沈殿によって溶液から失われる場合がある。

［００１０６］本明細書で使用される場合の「濾過」という用語は、溶液が多孔性材料（フィルタ）を通過するプロセスへの言及を含む。溶液中に存在する固体粒子は、特に粒子がフィルタの孔よりも大きいとき、フィルタ上で保持される。細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の濾過は、最大約０．２μｍ（例えば、最大約０．１μｍ）など、最大約０．５μｍ，の孔サイズを有するフィルタを使用して実施され得る。本明細書で使用される場合の「滅菌濾過」という用語は、ウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、伝達性海綿状脳症の病原体などの微生物を溶液から除去するのに十分小さい孔サイズを有するフィルタを用いて実施される濾過を指す。滅菌濾過は、最大０．０５μｍの孔サイズなど、最大約０．１μｍの孔サイズを有するナノフィルタを使用する場合がある。滅菌濾過は、約４ＬＲＶ超の関連微生物の対数減少値（ＬＲＶ）を提供し得る。

［００１０７］銅などの溶液成分に関する「濾過可能」という用語は、成分が完全に溶媒和されているか、又は濾過中に粒子がフィルタ培地の孔を定量的に通過するために十分に小さい粒子サイズを有していることを意味する。濾過可能な成分は、フィルタの孔サイズの最大９０％（例えば、最大７０％）の最大寸法を有する粒子を含み得る。濾過可能な成分は、完全に溶媒和された種、及び任意選択的にフィルタの孔サイズの最大９０％（例えば、最大７０％）の最大寸法を有する粒子からなり得るか又はそれらを含み得る。

［００１０８］本明細書で使用される場合の「溶存酸素」（ｄＯ_２）という用語は、溶液中に溶解した酸素のレベルへの言及を含む。ｄＯ_２は、「％ ｄＯ_２」の相対単位で提供されてもよく、これは、溶液の温度（約８℃から約４０℃の範囲の温度など）での２１２．２ｍｂａｒのＯ_２分圧に基づく、水中のＯ_２の飽和割合を表す。例えば、ｄＯ_２は、少なくとも約８％ ｄＯ_２であり得る。ｄＯ_２は、「ｍｇ／Ｌ」の絶対単位で提供されてもよい。例えば、ｄＯ_２は、８℃の温度で少なくとも約１ｍｇ／Ｌであってもよく、及び／又はｄＯ_２は、４０℃の温度で少なくとも約０．３ｍｇ／Ｌであってもよい。

［００１０９］本明細書で使用される場合の「大気」という用語は、窒素、酸素、水蒸気、アルゴン、二酸化炭素、及び微量気体を含む、海面での地球大気と同様の組成を有する組成物を有する空気への言及を含む。乾燥大気中の酸素レベルは、典型的には、約２０から約２１体積％である。

［００１１０］本明細書で使用される場合の「キレート」という用語は、金属イオンと少なくとも１つの多座（例えば、二座、三座、四座、五座、六座など）の配位子とを含む錯体を指す。銅（ＩＩ）中の例示的な金属イオン。例示的な多座配位子には、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）、ネオクプロイン、バソクプロイン、Ｄ－ペニシラミン、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、８－ヒドロキシキノリン、クリオキノール、及び５，７－ジクロロ－２－［（ジメチルアミノ）メチル］－８－キノリノール（ＰＢＴ２）が含まれる。例示的な多座配位子が特定の酸又は塩基の形態で示されているが、配位子は任意の適切な共役酸又は共役塩基の形態で提供され得ることが理解されよう。

［００１１１］本明細書で使用される場合の「システイン」という用語は、アミノ酸Ｌ－システイン、その互変異性体、幾何異性体、塩又は溶媒和物への言及を含む

本明細書で使用される場合の「システイン誘導体」という用語は、ジスルフィドの水素が別の部分への結合と置き換えられているシステインの誘導体への言及を含み、そのため、システイン誘導体は、スルフヒドリル基を含まない。例えば、システイン誘導体は、ジスルフィド又はチアゾリジン部分を含み得る。

［００１１２］本明細書で使用される場合の「細胞培地」という用語は、細胞を培養するための栄養液を指す。「細胞培養供給物」及び「細胞培養添加物」は、培地性能を改善するために細胞培地に添加され得る栄養補充物を表す。例えば、細胞培養供給物 及び／又は細胞培養添加物は、細胞のバッチ培養中に細胞培地に添加され得る。細胞培地は、化学的に定義され得るか、又は定義されていない成分を含み得る。

［００１１３］本明細書で使用される場合の「接触させること」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞を、中で細胞が培養される培地とともに培養容器内に置くことへの言及を含む。「接触させること」という用語は、細胞を培地と混合することと、培地を培養容器内の細胞上にピペットすることと、培地内に細胞を浸すこととを包含する。

［００１１４］本明細書で使用される場合の「組み合わせること」という用語は、細胞培地製剤内で原料を混合又は混和することへの言及を含む。

［００１１５］本明細書で使用される場合の「化学的に定義された」培地は、中に入ったすべての原料が既知である培地である。化学的に定義された培地は、未知の成分を含む血清、胚抽出物、加水分解物とは区別される。本開示の細胞培地は、化学的に定義された培地であり得る。本開示の細胞培養供給物は、化学的に定義されていてもよい。本開示の細胞培養添加物は、化学的に定義されていてもよい。

［００１１６］本明細書で使用される場合の「定義されていない培地」又は「定義されていない成分を含む培地」は、未知の１つ又は複数の原料を含む培地への言及を含む。定義されていない成分は、例えば、血清、ペプトン、加水分解物（酵母、植物、又は血清加水分解物など）、及び胚抽出物によって提供され得る。

［００１１７］本明細書で使用される場合の「原料」という用語は、化学的起源か又は生物学的起源かを問わず、細胞の成長若しくは増殖、又は細胞による生成物の発現を維持又は促進するために、細胞培地、供給物、又は添加物で使用することができる任意の化合物を指す。「成分」、「栄養物」、及び「原料」という用語は、互換的に使用されてもよく、すべて、このような化合物を指すことを意味する。細胞培地に使用される典型的な原料には、炭素源（単糖類など）、窒素源（アミノ酸など）、ビタミン類、緩衝剤、無機塩、微量金属、ポリアミン、脂質、脂肪酸が含まれる。例示的な原料には、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質等が含まれる。細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの培養を促進又は維持するその他の原料は、特定の必要性に従って、当業者によって選択され得る。

［００１１８］細胞培地は、多くの原料から構成されており、これらの原料は培地によって異なる。本明細書で使用される場合の「１×製剤」は、細胞培地に見られるいくつか又はすべての原料を実施濃度で含有する任意の水溶液を指すことを意味する。「１×製剤」は、例えば、細胞培地、又はその培地の材料の任意のサブグループを指すことができる。１×溶液中の原料の濃度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持又は培養するのに使用される細胞培養製剤に見られる原料の濃度とほぼ同じである。細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に使用される細胞培地は、定義による１×製剤である。多くの原料が存在するとき、１×製剤中の各原料は、細胞培地中のそれらの原料の濃度にほぼ等しい濃度を有する。よって、「１×製剤」について言及するとき、溶液中の各原料は、説明されている細胞培地中に見られる濃度と同じ又はほぼ同じ濃度を有することが意図される。細胞培地の１×製剤中の原料の濃度は、当業者によく知られており、関連する成分及び成分の濃度は、細胞型又は用途次第である。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉａ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｆｏｒ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｌｌｅｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ （１９８４）； Ｈ．Ｊ． Ｍｏｒｔｏｎ， 「Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ」， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ （１９７０）， ６（２）， ８９－１０８；及びＪ． Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａｌｋ， ｅｔ ａｌ．， （２０１０）， 「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ-ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄｓ」， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ２４（４）， １０５３－１０６３； を参照のこと。これらの文献のすべては、その全体が参照により本明細書に援用される。ただし、培地と比較して、１×製剤では、特に、１×製剤に含まれる成分が少ないとき、浸透圧及び／又はｐＨが異なる場合がある。

［００１１９］本明細書で使用される場合の「ｎｎ×製剤」（ここで、「ｎｎ」は１より大きい整数である）は、溶液中の各原料が、１×製剤中の対応する原料よりも約ｎｎ倍濃度が高く提供される溶液を指す。細胞培養供給物及び細胞培養添加物は、１Ｘから１．５×１０^９×製剤、例えば、１×から１０，０００×製剤として提供され得る。例えば、細胞培養供給物は、１×から１，０００×製剤として提供され得る。当業者であれば理解できるように、所与の製剤の「ｎｎ×」上限は、製剤中の各成分の溶解度、及び対応する１×製剤中の各成分の必要濃度に依拠することになる。よって、対応する１×製剤において比較的低濃度でも必要とされる比較的高い溶解度を有する成分のみを含む供給物及び添加物では、通常、より高い「ｎｎ」が可能である。

［００１２０］本明細書で使用される場合の「細胞」という用語は、真核細胞、原核細胞、及び古細菌細胞への言及を含む。文脈上別途要求されない限り、細胞への言及は、複数（細胞）への言及を含み得る。真核細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ－２１細胞を含む）、及びそれらの誘導体であり得る。原核細胞は、大腸菌、シュードモナス種、バチルス種、ストレプトミセス種、ラクトバチルス種、ラクトコッカス種、及びそれらの誘導体であり得る。古細菌細胞は、ハロアーキア及びそれらの誘導体であり得る。

細胞培地
［００１２１］細胞培地は多くの成分を含む。細胞培地は、制御された、人工の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境で細胞を維持及び成長させるのに必要な栄養物を提供する。細胞培地の特性及び組成は、特定の細胞要件によってさまざまである。重要なパラメータには、浸透圧、ｐＨ、及び栄養製剤が含まれる。

［００１２２］培地は、アミノ酸、グルコース、塩、ビタミン、及びその他の栄養物の混合物を含み、粉末又は液体のいずれかの形態で供給業者から入手可能である。これらの成分の要件は、細胞株によってさまざまである。ｐＨの調節は最適な培養条件にとって重要であり、一般に、適切な緩衝系を使用して達成される。ＣＤＭは、無菌状態で調製及び使用されるときに再現性のあるコンタミネーションフリーの培地を提供するため、治療及び関連用途に好ましいが、いくつかの細胞型には、血清、タンパク質、又はその他の生物学的抽出物（酵母抽出物又は植物若しくは動物物質の酵素消化物など）を含む培地を使用することが必要な場合がある。

［００１２３］細胞培養には、ビタミン、アミノ酸、有機塩、無機塩、及び緩衝剤から本質的になる極めて単純な定義培地も使用されてきた。しかし、このような培地（「基礎培地」と呼ばれることが多い）では、ほとんどの動物細胞が必要とする栄養含有量が、通常著しく不足している。したがって、これらの培地は、完全な培地を形成するために、例えば、供給物又はその他の添加物を補充する必要がある場合が多い。さらに、バッチ培養系では、培養細胞の生存率を、及び／又はポリペプチド（例えば、抗体、又は抗体の生物学的に機能する断片）、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ウイルス若しくはウイルス様粒子、核酸、又はその断片などの生物学的生成物の生成を維持するために、濃縮した供給物又は添加物で培地を定期的に補充することが多い。

［００１２４］基礎培地に存在し得る原料には、アミノ酸（窒素源）、ビタミン、無機塩、糖類（炭素源）、緩衝塩、及び脂質が含まれる。ある哺乳動物細胞培養系と共に使用するための基礎培地は、エタノールアミン、Ｄ－グルコース、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］－ピペラジン－Ｎ’－［２－エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、リノール酸、リポ酸、フェノールレッド、ＰＬＵＲＯＮｌＣ Ｆ６８、プトレシン、ピルビン酸ナトリウムを含み得る。

［００１２５］培地に含まれ得るアミノ酸原料には、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ-システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ-ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン（ｒｎｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、Ｌ フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、及びそれらの誘導体が含まれる。これらのアミノ酸は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から、商業的に入手することができる。

［００１２６］培地に含まれ得るビタミン原料には、ビオチン、塩化コリン、Ｄ－Ｃａ^２＋－パントテネート、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、及びビタミンＢ１２が含まれる。これらのビタミンは、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から、商業的に入手することができる。

［００１２７］培地に使用され得る無機塩原料には、１つ又は複数のカルシウム塩（例えばＣａＣｌ_２）、Ｆｅ（ＮＯ_３）_３、ＫＣｌ、１つ又は複数のマグネシウム塩（例えばＭｇＣｌ２及び／又はＭｇＳＯ_４）、１つ又は複数のマンガン塩（例えばＭｎＣｌ_２）、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎ_２ＨＰＯ_４、並びに微量元素セレニウム、バナジウム、亜鉛、及び銅のイオンが含まれる。これらの微量元素は、様々な形態で、好ましくは、Ｎａ_２ＳｅＯ_３、ＮＨ_４ＶＯ_３、ＺｎＳＯ_４、及びＣｕＳＯ_４などの塩の形態で提供され得る。これらの無機塩は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から、商業的に入手することができる。

［００１２８］哺乳動物の培養に有用な例示的な培地には、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地が含まれ、これらは、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ （１９７９）， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚ． ５８：４４； Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ （１９８０）， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５；米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；又は同第４，５６０，６５５号；国際公開第９０／０３４３０号；同第８７／００１９５号；米国再発行特許第３０，９８５号；又は米国特許第５，１２２，４６９号（これらの開示のすべては参照により本明細書に援用される）に記載されるいずれの培地も、宿主細胞の培地として使用され得る。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ^ＴＭ薬物等）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、並びにグルコース又は等価エネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物も当業者に既知の適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞で既に使用したものであり、当業者に明らかであろう。例示的な培養条件は、Ｍ． Ｔａｋａｇｉ ａｎｄ Ｋ． Ｕｅｄａ， 「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏ ｌｕｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， （１９９４）， ４１， ５６５－５７０； Ｈ．Ｊ． Ｍｏｒｔｏｎ， 「Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ」， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ （１９７０）， ６（２）， ８９－１０８； Ｊ． Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａｌｋ， ｅｔ ａｌ．， （２０１０）， 「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ-ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄｓ」， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ２４（４）， １０５３－１０６３； Ｒ．Ｊ． Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， 「Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ （ＣＨＯ） ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｋｅｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」， ＢＩｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． （２０１９）， １１６（１２）， ３４４６－３４５６； Ｓ． Ｊａｎｏｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａ ｆｅｄ‐ｂａｔｃｈ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎｔｏ ｓｅｍｉ‐ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｏｄｅ： Ｔｈｅ ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｍａｌｌ‐ｓｃａｌｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋｓ ａｓ ｓｃａｌｅ‐ｄｏｗｎ ｍｏｄｅｌ」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， （２０１９）， ３５（２）， ｅ２７５７；及びＭ． Ｋｕｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， 「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｆｅｄ‐ｂａｔｃｈ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｆｅｅｄｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ＣＨＯ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ， １５ Ａｐｒｉｌ ２０１９， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｂｔｐｒ．２８２１に提供されており、これらのすべての参照によりその全体が本明細書に援用される。

［００１２９］本開示及び本発明の細胞培地、供給物、又は添加物は、銅（ＩＩ）及びシステインを含む。例示的な培地、供給物、及び添加物に存在する銅（ＩＩ）及びシステイン（システイン誘導体を含む）の量を表１に示す。

システインは、Ｌ－システインとして提供され得、複数の水和物及び／又は塩の形態で提供され得る。これらのシステイン含有形態は、培養物及び／又は生成物と接触するプロセス実施濃度の溶媒が細胞培養性能又は生成物品質に影響を与えない場合、水、有機溶媒、塩基性溶媒、又は酸性溶媒に可溶化して溶解度を高め得る。ある特定の細胞型では、少なくともシステインの一部（例えば、実質的にすべてのシステイン）が、システイン誘導体として提供され得る。例えば、本明細書で開示されるように、実質的にすべてのシステインは、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体として提供され得る。銅（ＩＩ）は、複数の水和物及び／又は塩の形態（典型的には、いくらかの水分を含む硫酸塩）で提供され得る。これらの銅含有形態は、培養物及び／又は生成物と接触するプロセス実施濃度の溶媒が細胞培養性能又は生成物品質に影響を与えない場合、水、有機溶媒、塩基性溶媒、又は酸性溶媒に可溶化して溶解度を高め得る。

［００１３０］細胞培地、供給物、及び添加物の他の成分は、少なくとも１つの炭素源、及び／又は少なくとも１つの窒素源、及び／又は少なくとも１つのビタミン、及び／又は少なくとも１つの緩衝剤、及び／又は少なくとも１つの無機塩、及び／又は銅以外の少なくとも１つの微量金属、及び／又は少なくとも１つのポリアミン、及び／又は少なくとも１つの（必須）脂肪酸を含む。他の成分は、少なくとも１つの炭素源を含み得る。他の成分は、少なくとも１つの窒素源を含み得る。他の成分は、少なくとも１つのビタミンを含み得る。他の成分は、少なくとも１つの緩衝剤を含み得る。他の成分は、少なくとも１つの無機塩を含み得る。他の成分は、少なくとも銅以外の１つの微量金属を含み得る。他の成分は、少なくとも１つのポリアミンを含み得る。他の成分は、少なくとも１つの（必須）脂肪酸を含み得る。他の成分は、少なくとも１つの炭素源、少なくとも１つの窒素源、少なくとも１つのビタミン、少なくとも１つの緩衝剤、少なくとも１つの無機塩、少なくとも１つの銅以外の微量金属、少なくとも１つのポリアミン、及び少なくとも１つの（必須）脂肪酸を含み得る。

［００１３１］少なくとも１つの炭素源は、糖、任意選択的に単糖又は二糖を含み得る。糖は、少なくとも１つの（例えば、２つ以上の）グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース、リボース、及びデオキシリボースを含み得る。糖は、グルコース及び／又はデオキシリボースを含み得る。

［００１３２］少なくとも１つの窒素源（例えば、２つ以上の窒素源）は、少なくとも１つのアミノ酸及び／又はアンモニア／アンモニウムを含み得る。少なくとも１つの窒素源は、少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。少なくとも１つのアミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン、Ｌ－システイン， Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリン、又はそれらの誘導体から選択され得る。実施態様では、少なくとも１つのアミノ酸は、限定されないが、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン、Ｌ－システイン， Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリン、又はそれらの誘導体を含む。

［００１３３］少なくとも１つのビタミン（例えば、２つ以上のビタミン）は、アスコルビン酸（例えば、アスコルビン酸マグネシウム塩）、ビオチン、コリン（例えば、塩化コリン）、Ｄ－Ｃａ２＋－パントテネート、葉酸、イノシトール、メナジオン、ナイアシンアミド、ニコチン酸、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ピリドキサール、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＡアセテート、ビタミンＢ１２、及びビタミンＤ２から選択され得る。

［００１３４］少なくとも１つの緩衝剤は、Ｇｏｏｄの緩衝剤（例えば、ａｓ ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ ｉｎ Ｎ．Ｅ． Ｇｏｏｄ， ｅｔ ａｌ．， “Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （１９６６），５（２）， ４６７－４７７； Ｎ．Ｅ． Ｇｏｏｄ ａｎｄ Ｓ． Ｉｚａｗａ， “Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， （１９７２）， Ｖｏｌ． ２４， ５３－６８；及びＷ．Ｊ． Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， （１９８０）， １０４（２）， ３００－３１０に開示されるようなもの）などの、約６から約８の範囲のｐＨで緩衝し得る少なくとも１つの緩衝剤（例えば、２つ以上の緩衝剤）を含み得る。少なくとも１つの緩衝剤は、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、乳酸塩、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及び２－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（ビス－トリス）を含む少なくとも１つの緩衝剤から選択される少なくとも１つの緩衝剤（例えば、２つ以上の緩衝剤）を含み得る。

［００１３５］少なくとも１つの無機塩（例えば、２つ以上の無機塩）は、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、又は鉄の、少なくとも１つの可溶性塩を含み得る。可溶性塩は、２５℃の水中で少なくとも１ｇ／Ｌの溶解度を有する塩であり得る。少なくとも１つの無機塩（例えば、２つ以上の無機塩）は、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、及びクエン酸鉄キレート又は硫酸鉄キレートのうちの少なくとも１つを含み得る。銅以外の少なくとも１つの微量金属（例えば、２つ以上の微量金属）は、バリウム、臭素、コバルト、ヨウ素、マンガン、クロム、ニッケル、セレン、バナジウム、チタン、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、スズ、ジルコニウム、カドミウム、亜鉛、及びアルミニウムのうちの少なくとも１つのイオンを含み得る。

［００１３６］少なくとも１つのポリアミン（例えば、２つ以上のポリアミン）は、プトレスシン、カダベリン、スペルミン、及びスペルミジンのうちの少なくとも１つを含み得る。

［００１３７］少なくとも１つの（必須）脂肪酸（例えば、少なくとも２つの脂肪酸）は、限定されないが、ｎ－３、ｎ－６、ｎ－９脂肪酸及びコレストロールを含み得る。少なくとも１つの（必須）脂肪酸（例えば、少なくとも２つの脂肪酸）は、限定されないが、リノール酸（ＡＬＡ）、リノレン酸（ＬＡ）、ドコサヘキセン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）等を含み得る。少なくとも１つの必須脂肪酸（例えば、少なくとも２つの脂肪酸）は、リノール酸及びリノレン酸から選択され得る。

［００１３８］ある態様は、本発明の方法によって得られるか又は得ることができる、銅（ＩＩ）及びシステインを含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を提供する。

銅損を防止する及び／又は培地を調製する方法
［００１３９］細胞培地、供給物、又は添加物は、調製中に銅を失う場合がある。特に、細胞培地、供給物、又は添加物が濾過（例えば、滅菌濾過）されるとき、可溶性の銅種（例えば、銅（Ｉ）種）がフィルタ上に保持され得る。これは問題であるが、それは、濾過、特に無菌濾過は、無菌培地、供給物、及び添加物を提供するために広く用いられている方法であり、これらの組成物は、典型的には、末端滅菌によって分解される成分を含むためである。

［００１４０］我々は、細胞培地に存在することが多いシステインが、銅の濾過除去を引き起こすことに大きく関与していることを突き止めた。例えば、システインを含まない修飾培地を試験したところ、銅損は観察されなかった。システインではなくシスチン（酸化二量体形態）を使用した培地でも、濾過中の銅の除去は観察されなかった。我々は、また、銅の損失の経時変化の一過性は、鉄及びピルベートに影響されることを観察した。銅損はｐＨに依存し、中性ｐＨ付近で最も激しく起こるが、特定の緩衝液種に制限されることはなかった。システインは、典型的には、銅と比較してて有意に過剰に存在するため、培地／供給物／添加物からの比較的控えめなシステインの損失は、典型的には、溶液中のシステインの全体的なレベルにほとんど影響を及ぼさず、一方、銅損は、典型的にはより大きな影響を及ぼすことに留意すべきである。

［００１４１］システインは、金属イオン触媒及び酸素の存在下で、二量体の形態であるシスチンに酸化される（Ｃａｖａｌｌｉｎｉ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｃｏｐｐｅｒ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｔｏ ｃｙｓｔｉｎｅ． Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ． １９６９；１３０（１）：３５４－３６１、その全体が参照により本明細書に援用される）。システインの酸化は以下によって生じる：

ただし、実質的な反応：

「ＲＳＨ」 はシステインであり、「ＲＳＳＲ」はシスチンである。

［００１４２］第１の反応ではシステインが酸素と反応してシスチン及び過酸化水素を生成し、第２の反応では過酸化水素が第２の当量のシステインと反応して、さらに１当量のシスチンと２当量の水を生成する。銅と鉄の両方がシステインの酸化を触媒するが、銅の方がより活性の高い触媒であることが報告されている（Ｍｕｎｄａｙ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｎａｎｏｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｒｏｎ ｓａｌｔｓ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２００４；３６（６）：７５７－７６４； Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ Ｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｐｐｅｒ－ａｎｄ ｉｒｏｎ－ｃａｔａｌｙｓｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｂｙ ｄｉｏｘｙｇｅｎ． Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ． １９８９；４３、これらはその全体が参照により本明細書に援用される）。触媒反応の第１の工程は、システインによる金属イオンの還元的キレート反応で、システイン－銅（Ｉ）又はシステイン－鉄（ＩＩ）錯体が得られると考えられている（Ｐｅｃｃｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｖｅｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｐｐｅｒ ｃａｔａｌｙｓｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ． Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ． １９９７；１３（３－４）：３５５－３６７、これはその全体が参照により本明細書に援用される）。したがって、酸化されるシステインモノマーが存在する場合、金属イオンは還元され、銅の場合、銅（Ｉ）の状態になる。

［００１４３］よって、システインの酸化は、可溶性の銅（Ｉ）種の形成をもたらす。細胞培地でこれが生じることは、銅（Ｉ）のアッセイで確認された。さらに、我々は、十分な量のｄＯ_２が存在下では、比較的不溶性の銅（Ｉ）は容易に酸化されて可溶性の銅を表す銅（ＩＩ）に戻ることも突き止めた。

［００１４４］既知の化学は、以下の反応によって示される：

正味の反応を提供する：

［００１４５］理論に縛られることはなく、Ｃｕ（Ｉ）－システイン錯体でも遊離のＣｕ（Ｉ）と同様の反応が起こり、触媒が分解してＣｕ（ＩＩ）が放出されると考えられる。このメカニズムにより、濾過中の銅の除去が起こるためにｄＯ_２は低い必要がある理由、及び銅が再び濾過可能になるために酸素が必要である理由を説明することができる。

［００１４６］したがって、不溶性の銅（Ｉ）を避けるための一つの方法は、銅（Ｉ）種の沈殿を防ぐために溶液中に十分なｄＯ_２が存在することを確実にすることである。これは、多くの方法で達成され得る。
例えば、濾過の前及び／又は濾過中に、酸素レベルは、銅（Ｉ）の銅（ＩＩ）への定量的酸化を確実にするために十分に高い所定のレベルに保たれる場合がある。所定のレベルは、少なくとも約６％ ｄＯ_２、少なくとも約８％ ｄＯ_２、少なくとも約１０％ ｄＯ_２、又は少なくとも約１２％ ｄＯ_２であり得る。所定のレベルは、約０．３ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．４ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、約０．６ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２、又は約０．８ｍｇ／Ｌ ｄＯ_２であり得る。さらに（又はあるいは）、濾過は、銅（Ｉ）種の沈殿を防ぐために溶液中に十分なｄＯ_２が残っている間に濾過が完了するように最適化され得る。例えば、濾過は、ｄＯ_２レベルが濾過中に所定のレベルより下にならないように、濾過速度、及び／又はフィルタサイズ、及び／又はフィルタ容量を増加させることによって最適化され得る。

［００１４７］濾過は、処理される所与の体積に対する一定のろ過時間の必要性を満たすための濾過ユニット動作変数の操作（例えば、濾過の方法（例えば、デッドエンド膜）に基づくフィルタエリア、流量などの操作）、及び当業者に知られている技術を使用して、経験的に又は経験及び理論のアプローチでシステムを特徴付けることによって最適化することができる。例えば、Ｏｚｔｕｒｋ Ｓ ａｎｄ Ｈｕ Ｗ， Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， ２００５； Ｒａｊｎｉａｋ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ - Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｓｃａｌｅ－ｕｐ ｔｏ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ， ２００８を参照のこと。これらの開示全体は、参照により本明細書に援用される。

［００１４８］例えば、最適なフィルタサイズは、関連する大規模濾過ユニット操作の関数としての様々なエンドポイント（一定流量に対するＰｍａｘ（圧力）又はＴｍａｘ（濁度）、一定圧力に対するＶｍａｘ（体積））に基づいて実施することができる経験的フィルタサイジング研究を用いて決定され得る。これにより、所与の時間内にバッチ量を処理する流束を維持するために必要なフィルタエリアを定義することが可能になる。もちろん、生産現場／ラインでは、スペースやコストなどに基づいて現実的な限界がある。当業界スケーのスケーリングに使用されるスケールアップ／スケールダウンに使用される典型的な標準化（単位なし）流速は、１０から８０００の範囲であり、５０Ｌから２５０００Ｌの処理媒体量をカバーすることが可能である。また、これらの方法は、必要に応じて、より大きな体積又はより小さな体積をカバーするために外挿されてもよい。

濾過は、最大約０．２μｍ（例えば、最大約０．１μｍ）など、最大約０．５μｍ，の孔サイズを有するフィルタを使用して実施され得る。濾過は、滅菌濾過、例えば、最大０．０５μｍの孔サイズなど、最大約０．１μｍの孔サイズを有するナノフィルタを用いて実施される濾過を含み得る。滅菌濾過は、約４ＬＲＶ超の関連微生物（例えばウイルス）の対数減少値（ＬＲＶ）を提供し得る。細胞培養液のナノ濾過は、細胞培地、供給物、及び添加物の調製などの上流工程で、微生物汚染を低減するための重要なアプローチとなる。例えば、Ｓｈｉｒｏｔａ， Ｍ． ａｎｄ Ｋｉｓｓ， Ｒ．， 「Ｒｉｓｋ Ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔ Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ」， Ａｄｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２０１７， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／１０＿２０１７＿３８；及びＭｉｅｓｅｇａｅｓ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｕｓ ｒｅｔｅｎｔｉｖｅ ｆｉｌｔｅｒｓ． Ｉｎ： Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ Ｍ （ｅｄ） Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ， ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ， ２０１０， ｐｐ １－１１を参照のこと。これらは、その全体が参照により本明細書に援用される。フィルタは、限定されないが、膜フィルタ（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｒｗａ．ｃｏｍ／ＷａｔｅｒＷｏｒｋｓＭｎｌ／Ｃｈａｐｔｅｒ％２０１９％２０Ｍｅｍｂｒａｎｅ％２０Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．ｐｄｆを参照のこと。その全体が参照により本明細書に援用される）、中空糸フィルタ、カラムフィルタ、らせん状膜フィルタ、チューブフィルタ、キャピラリーフィルタ、カプセルフィルタ、カセットフィルタ、ディスクフィルタ、フリットフィルタ、及びプラグフィルタが含まれる。

［００１５０］銅（Ｉ）種の沈殿を防止するために溶液中に十分なｄＯ_２が存在することを確実にする任意の方法は、濾過の開始前に酸素レベルをモニタリングすること、例えば、濾過の開始前に少なくとも約１０分間（例えば、少なくとも約１５分間）酸素レベルをモニタリングすることを含み得る。方法は、濾過中にｄＯ_２のレベルをモニタリングすることを含み得る。方法は、濾過の開始前に酸素レベルをモニタリングすることと、濾過中にｄＯ_２のレベルをモニタリングすることとを含み得る。方法が酸素レベルをモニタリングすることを含むとき、酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することは、モニタリングされた酸素レベルが所定のレベルに近づいたことに応じて、溶液に酸素を添加することを含み得る。方法が酸素レベルをモニタリングすることを含むとき、酸素レベルを少なくとも所定のレベルに維持することは、モニタリングされた酸素レベルが所定のレベルに近づいたことに応じて、溶液の酸素化を増加させること及び／又は濾過を最適化することを含み得る。ｄＯ_２のレベルは、任意の適切な技法を使用してモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、電気化学酸素センサ又は光学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、電気化学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。ｄＯ_２のレベルは、光学酸素センサを用いてモニタリングされ得る。溶存酸素を検出するための適切な酸素センサ及び方法は、当業者に知られている。例えば、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｏｘｙｇｅｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ： Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｘｙｇｅｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ ＧｍｂＨ， ２０１６； Ｗｅｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， 「Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｆｒｏｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｏｎｌｉｎｅ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」， Ｓｅｎｓｏｒｓ， ２０１９， １９， ３９９５を参照のこと。これらは、その全体が参照により本明細書に援用される。

［００１５１］シスチンへのシステインの酸化に加えて、培地中のシステインは、システイン及びピルベートの縮合によっても消費され、シッフ塩基中間体によって２，４－チアゾリジンを生成し得る（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＭＸ ａｎｄ Ｈｅｓｓ ＷＣ， Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｙｒｕｖｉｃ Ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｓｔｉｎｅ ａｎｄ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９３７， １２２； Ｎｉｓｈｉｕｃｈ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ， １９７６， １２（９）； Ｒｏｈａｃ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｎ-ｓｕｌｆｕｒ ｂｏｎｄ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒａｄｉｃａｌ ＳＡＭ ｅｎｚｙｍｅ ＨｙｄＥ， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１６， ８（５）， ４９１－５００；これらは、その全体が参照により本明細書に援用される）。この反応は、システイン及びピルベートを含む細胞培地中で生じ、２，４チアゾリジン生成物が質量分析によって確認されたことがこれまでに報告されている（Ｋｕｓｃｈｅｌｅｗｓｋｉ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ， ２０１７；これは、その全体が参照により本明細書に援用される）。これは、銅損を防止するために使用することができる別のアプローチを提供する。システインが、例えばピルベートとの縮合によって、競合反応で反応した場合、システインは銅（ＩＩ）を不溶性の銅（Ｉ）の形態に還元するのに利用できない。しかし、システインが銅（ＩＩ）及びピルベートの両方の存在下にある場合、両方の反応が生じる場合があるため、可溶性の銅（ＩＩ）の一部はまだ溶液から失われることがある。

［００１５２］細胞培地、供給物、又は添加物が、システイン誘導体を効率的に代謝することができる細胞との使用が意図されている場合、銅（ＩＩ）を溶液に加える前に、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体としてシステインを実質的に提供することによって、可溶性の銅の損失を避けることが可能であり得る。例えば、システインは、約１ｍＭ未満の遊離システインを含み得る。例えば、システインは、０．５ｍＭ未満の遊離システイン（又は０．１ｍＭ未満の遊離システイン）を含み得る。スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体は、銅（ＩＩ）と反応して不溶性の銅（Ｉ）を形成することはない。しかし、このアプローチは、培地、供給物、又は添加物が、そのようなシステイン誘導体を効率的に代謝しない細胞との使用が意図されている場合、可溶性の銅の損失を防止する本明細書に開示される他の方法よりも適していない。

［００１５３］システイン誘導体は、ジスルフィド、チアゾリジン部分、又は保護部分、又は保護硫黄基を含み得る。システイン誘導体は、ジスルフィド及び／又はチアゾリジン部分を含み得る。システイン誘導体は、ジスルフィドを含み得る。例えば、システイン誘導体は、システイン、Ｓ－スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイニルグリシン、Ｌ－システイン混合ジスルフィド、及び／又はＳ－スルホグルタチオンを含み得る。システイン誘導体は、シスチンを含み得る。システイン誘導体は、チアゾリジン部分を含み得る。例えば、システイン誘導体は、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレート、２－メチル－１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、２－（２－カルボキシエチル）２１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸、２－アルキル－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、２－アリール－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、及び炭水化物ベースのチアゾリジン（例えば、Ｄ－リボース－Ｌ－システイン）を含み得る。システイン誘導体は、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレートを含み得る。システイン誘導体は、シスチン、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレート、Ｓ－スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイニルグリシン、システイン Ｓ－結合型Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡＣ－ｃｙｓ）、ホモシスチン、Ｌ－システイン混合ジスルフィド、Ｌ－システイン混合ペプチド、Ｓ－アルキル化システイン、チオール保護基を有するシステイン（例えば、ＦＭＯＣ保護システイン）、２－メチル－１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、２－（２－カルボキシエチル）２１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、還元及び酸化グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｓ－スルホグルタチオン、Ｓ－アシル－ＧＳＨ、Ｓ－カルボキシ－Ｌ－システイン、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸、２－アルキル－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、２－アリール－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、又は炭水化物ベースのチアゾリジン（例えば、Ｄ－リボース－Ｌ－システイン）のうちの少なくとも１つを含み得る。

［００１５４］銅は、銅（ＩＩ）キレートの形態で提供され得る。キレートは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ネオクプロイン、バソクプロイン、Ｄ－ペニシラミン、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、８－ヒドロキシキノリン、クリオキノール、及び５，７－ジクロロ－２－［（ジメチルアミノ）メチル］－８－キノリノール（ＰＢＴ２）から選択される少なくとも１つのキレート剤を含み得る。いかなる理論にも縛られることを望むものではなく、銅を銅（ＩＩ）キレートの形態にすることで、銅から銅（Ｉ）への顕著な還元を防ぎ、それによって溶液からの可溶性の銅の損失を避けることができると考えられている。

［００１５５］細胞培地、供給物、又は添加物中の銅の損失を防ぐためのさらなるアプローチは、銅（ＩＩ）溶液とシステイン溶液とを別々に濾過し、その後、濾過した２つの溶液を合わせて最終溶液を形成することである。これは、試薬及び体積の大部分をシステイン溶液に提供し、その溶液を濾過し、濾過した銅溶液をボーラス添加することで可能である。これは有利であり得るが、それは、銅が典型的には最終溶液中で比較的に低濃度で提供される微量元素であるためである。別のアプローチは、銅及び成分の大部分を一つの濾過した溶液に提供し、その後、濾過したシステイン溶液を加えて、最終溶液を形成することであろう。当業者が理解するように、銅（ＩＩ）溶液とシステイン溶液とが別々に濾過されることを条件として、別々に濾過し、その後濾過された溶液を最終的に濾過された培地、供給物、又は添加物と組み合わせる様々な順序及び組み合わせが、そのような方法論において使用され得る。さらに、最終的に無菌溶液が所望される場合、濾過された溶液は無菌的に取り扱われることが望ましい。

［００１５６］これは、不溶性の銅（Ｉ）種を形成する、濾過前又は濾過中の銅（ＩＩ）とシステインとの間の反応を防止する。濾過後に銅（Ｉ）種が形成される可能性はあるが、これは培地、供給物、又は添加物中に残留することになる。さらに、細胞培養では培養中に溶液に酸素を添加するため、不溶性の銅（Ｉ）は培養中に可溶性の銅（ＩＩ）に酸化されることになる。よって、培地、供給物、又は添加物中のすべての銅は、培養された細胞によって使用可能となる。

［００１５７］本開示の態様は、溶液中の銅損を防ぐ方法を提供する。溶液は、銅（ＩＩ）及びシステインを含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物である。この方法は、溶液の濾過の前後に、実質的に同量の可溶性の銅を有することを含む。

［００１５８］本開示の別の態様は、可溶性の銅の損失を伴わずに、銅（ＩＩ）、システイン、及び他の成分を含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を調製する方法を提供する。方法は、システイン及び他の成分を含む水溶液を提供することと；銅（ＩＩ）を含む水溶液を提供することと；システイン及び他の成分を含む水溶液と、銅（ＩＩ）を含む水溶液とを別々に濾過することと；濾過された溶液を合わせて、細胞培地、細胞培養供給物、細胞培養添加物を提供することとを含む。

［００１５９］本開示のさらなる態様は、可溶性の銅の損失を伴わずに、銅（ＩＩ）、システイン、及び他の成分を含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を調製する方法を提供する。方法は、銅（ＩＩ）、システイン、及びその他の成分を含む溶液を濾過して、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を提供することを含む。

生物学的生成物を培養及び／又は作製する方法
［００１６０］細胞を培養する方法及び培養した細胞から生物学的生成物を作製する方法も提供される。

［００１６１］ＣＨＯなどの哺乳動物細胞における組換え抗体の生成、回収、及び精製のためのプロトコルには、次の工程が含まれ得る。細胞は、撹拌タンクバイオリアクターシステムで培養されてもよく、フェドバッチ培養という手順が用いられる。好ましいフェドバッチ培養では、哺乳動物宿主細胞及び培地が、まず培養容器に供給され、追加の培養栄養素が、培養中に培養物に連続して又は個別に増加して供給され、培養終了前に、周期的に細胞及び／又は生成物が回収されるか又は回収されない。フェドバッチ培養には、例えば、周期的に全ての培養物（細胞及び培地を含む）が取り除かれ、新鮮な培地で交換される、半連続式フェドバッチ培養が含まれ得る。フェドバッチ培養は、細胞培養のための全ての構成成分（細胞及び全ての培養栄養素を含む）が、培養プロセスの開始時に培養容器に供給される、単純なバッチ培養とは区別される。フェドバッチ培養はさらに、上清がプロセス中に培養容器から除去されない限りにおいて、還流培養とは区別することができる（還流培養では、細胞は例えば、濾過、封入、マイクロ担体へのアンカリング等により、培養物中に保持される。そして培地が連続して又は断続的に導入され、培養容器から除去される）。

［００１６２］さらに、培養の細胞は、特定の宿主細胞及び企図される特定の生成計画に適し得る任意のスキーム又はルーチンに従って増殖され得る。したがって、一工程又は多工程の培養手順が用いられてもよい。単一工程培養において、宿主細胞は、培養環境に播種され、本開示のプロセスが、細胞培養の１回の生成段階の間に用いられる。あるいは、多工程培養が使用され得る。多工程培養では、細胞は多数の工程又は段階で培養され得る。例えば、細胞を、第１工程又は増殖期の培養物中で成長させることができる。この段階において、場合により貯蔵庫から取り除かれた細胞が、成長及び高生存能を促進するのに好適な培地に播種される。新鮮な培地を宿主細胞培養物に添加することにより、細胞を好適な期間、増殖期で維持することができる。

［００１６３］細胞培養の増殖期に、哺乳動物細胞の成長を促進するために、フェドバッチ又は連続細胞培養条件が工夫され得る。増殖期において、細胞は、増殖のために最大化された条件下、及び期間、増殖する。培養条件、例えば温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ_２）などは、特定の宿主で用いられるものであり、当業者には明らかであろう。概して、ｐＨは、酸（例えばＣＯ_２）又は塩基（例えばＮａ２ＣＯ_３又はＮａＯＨ）のいずれかを使用して、約６．５と７．５の間のレベルに調整される。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を培養するのに好適な温度範囲は、約３０～３８℃であり、好適なｄＯ_２は、空気飽和度の５％と９０％の間である。

特定の段階において、細胞は、細胞培養の生成段階又は工程を接種するために使用される場合がある。あるいは、上記のように、生成段階又は工程は、播種又は増殖期若しくは工程と連続的である場合がある。

［００１６５］細胞培養の生成段階における細胞培養環境は、通常、制御される。したがって、糖タンパク質が生成される場合、哺乳動物宿主細胞の細胞特異的生産性に影響を与える因子は、得られる糖タンパク質において所望のシアル酸含量が達成されるように操作され得る。好ましい態様では、細胞培養プロセスの生成段階は、細胞培養の生産段階のためのパラメータが従事する細胞培養の移行段階によって先行される。このプロセスのさらなる詳細は、米国特許第５，７２１，１２１号及びＣｈａｄｅｒｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２１（２）：５５０－３ （２００５）に記載されており、これらの開示全体は、参照により本明細書に明示的に援用される。

［００１６６］十分な期間培養した後、発現したタンパク質などの生物学的生成物を精製することができる。細胞破片由来のタンパク質又は他の生成物の精製のための手順は、最初はタンパク質の発現部位に依存する。あるタンパク質又はその他の生成物は、細胞から周囲の増殖培地中に直接分泌させることができ、他のものは細胞内で作製される。細胞内で作製される場合、精製方法の第１の工程は細胞の溶解を伴い、これは機械的せん断、浸透圧ショック、又は酵素処理を含む様々な方法により行うことができる。このような破壊により、細胞の内容物すべてがホモジネート中に放出され、更にはサイズが小さいために除去の困難な細胞内断片が生成される。これらは概して分画遠心法又は濾過により除去される。直接分泌されるタンパク質にも、小さいながら、生物学的生成物（例えばタンパク質）の生成実行過程において、細胞の自然死及び細胞内宿主細胞タンパク質と成分の放出によって同じ問題が生じる。

［００１６７］対象の生物学的生成物（例えばタンパク質）を含有する清澄溶液が得られた後、通常、細胞によって生成される他の成分からそれを分離することが、異なるクロマトグラフィー技術の組み合わせを使用して試みられる。これらの技術は、生成物の混合物を、生成物の電荷、疎水性の度合い、又はサイズに基づいて分離する。複数の異なるクロマトグラフィー樹脂が、これらの技術のそれぞれに利用可能であり、関与する特定の生成物に対する精製スキームの正確な調整が可能である。これらの分離方法の各々の基本は、タンパク質又は同様の種を異なる速度で長いカラム上を移動させることができることで、それらが、カラム上を移動するほど物理的に分離するか、又は分離培地に選択的に付着し、次いで異なる溶媒により別々に溶出されることである。いくつかの事例では、不純物がカラムに特異的に付着し、対象のタンパク質が付着しないとき、即ち、対象のタンパク質が「フロースルー（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）」中に存在するとき、所望のタンパク質が不純物から分離される。よって、宿主細胞の細胞培養物からの組換えタンパク質の精製には、１つ又は複数のアフィニティ（例えば、プロテインＡ）及び／又はイオン交換クロマトグラフィー工程を含み得る。

［００１６８］哺乳動物宿主細胞に加えて、他の真核生物体を、組換えタンパク質等の生物学的生成物の発現のための宿主細胞として使用することができる。一般的なパン酵母又はサッカロミセス・セレビシエなどの酵母宿主細胞での発現について、適切なベクターには、２ミクロンプラスミドに基づくエピソーム複製ベクター、集積ベクター、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターが含まれる。異種タンパク質の組換え生産に適した他の酵母には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ （１９８１）； ＥＰ １３９，３８３。１９８５年５月２日公開）；クルイベロミセス宿主（米国特許第４，９４３，５２９号； Ｆｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２： ９６８ ９７５ （１９９１））、例えば、Ｋ． ラクチス（ＭＷ９８－８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４； Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ７３７ （１９８３））、Ｋ． フラジリス（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ． ブルガリカス（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ． ウィッケラミイ（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ． ワルティイ（ｗａｌｔｉｉ） （ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ． ドゥロソフィラルム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： １３５ （１９９０））、Ｋ．サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ． マルシアナス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ＥＰ ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（ＥＰ １８３，０７０； Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２８： ２６５ ２７８ （１９８８））；カンジダ；トリコデルマ・リージア（ＥＰ ２４４，２３４）； アカパンカビ（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ５２５９ ５２６３ （１９７９））；シュワンニオミセス、例えばシュワンニオミセス・オクシデンタリス（ＥＰ ３９４，５３８ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ３１ Ｏｃｔ． １９９０）；並びに糸状菌、例えば、アカパンカビ属、アオカビ属、トリポクラディウム属（国際公開第９１／００３５７号。１９９１年１月１０日公開）、及びアスペルギルス宿主、例えばＡ． ニードランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２： ２８４ ２８９ （１９８３）； Ｔｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ２６： ２０５ ２２１ （１９８３）； Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０ １４７４ （１９８４））、及びＡ．ニゲル（Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４： ４７５ ４７９ （１９８５））が含まれる。これらの文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。メチロトローフ酵母がここでは適切であり、これには、限定されないが、ハンゼヌラ属、カンジダ属、クロエケラ属、ピキア属、サッカロミセス属、トルロプシス属、及びロドトルラ属からなる属から選択されるメタノール上で増殖できる酵母が含まれる。例示的なこのクラスの酵母の特定の種のリストは、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）に記載されており、この文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。列挙された酵母及びその他の酵母の発現系は、当該技術分野でよく知られており、市販されている。

［００１６９］昆虫宿主細胞、例えばＳｆ９細胞での発現について、適切なベクターにはバキュロウイルスベクターが含まれる。植物宿主細胞、特にタバコのような双子葉植物宿主での発現について、適切な発現ベクターには、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドに由来するベクターが含まれる。

［００１７０］適切な方法はまた、原核生物又は古細菌宿主細胞の培養にも及ぶ。本開示の手段によって保護されるべき抗体及び他のタンパク質を発現するのに適した原核生物宿主細胞及び古細菌宿主細胞には、グラム陰性生物体又はグラム陽性生物体などの古細菌及び真正細菌が含まれる。有用な細菌の例には、大腸菌属（例えば、大腸菌）、バチルス属（例えば、枯草菌）、エンテロバクター属、シュードモナス種（例えば、緑膿菌）、ネズミチフス菌、セラチア・マルセセンス、クレブシエラ属、プロテウス属、シゲラ属、根粒菌属、ビトレオシラ属、又はパラコッカス属が含まれる。一実施態様では、グラム陰性細胞が使用される。大腸菌株の例には、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ２ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８７）， ｐｐ． １１９０－１２１９； ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ． ２７，３２５）、及びそれらの誘導体（遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ （ΔｔｏｎＡ） ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ） ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲを有する株３３Ｄ３を含む（米国特許第５，６３９，６３５号）が含まれる。他の株及びその誘導体、例えば、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上記の細菌のいずれかの誘導体を構成するための方法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ８：３０９－３１４ （１９９０）に記載されている。この文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。概して、細菌の細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌の選択が必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０等の既知のプラスミドを使用してレプリコンを提供するとき、大腸菌、セラチア、又はサルモネラ種が宿主として適切に使用され得る。典型的には、宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌することが必要であり、追加のプロテアーゼ阻害剤が細胞培養物中に組み込まれることが望ましい場合がある。

［００１７１］非哺乳動物宿主細胞培養物から組換えタンパク質などの生物学的生成物を生成、回収、及び生成するための方法も、当該技術分野でよく知られている。ポリペプチドが、非哺乳動物細胞、例えば真菌又は大腸菌等の微生物中で生成されるとき、ポリペプチドは、細胞内部で又は細胞周辺腔内で回収されることになる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ａｎｄ Ｌｉｔｔｌｅ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １２： １７３ ２０１ （１９９９）； Ｓｋｅｒｒａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０： １０３８ １０４０ （１９８８）；これらは、その全体が参照により本明細書に援用される）。そのため、細胞溶解等の抽出によりタンパク質を細胞から細胞外培地へ放出することが必要である。このような破壊により、細胞の内容物すべてがホモジネート中に放出され、更にはサイズが小さいために除去の困難な細胞内断片が生成される。これらは概して分画遠心法又は濾過により除去される。

［００１７２］細胞溶解は、典型的には、ホモジナイゼーションやヘッドミリングなどの機械的破砕技術を使用して達成される。目的のタンパク質は概して効果的に放出されるが、このような技術にはいくつかの欠点がある（Ｅｎｇｌｅｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｄｓ．， ３７ ５５ （１９９４）。その全体が参照により本明細書に援用される）。温度上昇は、処理中に生じることが多く、これは、タンパク質の不活性化をもたらし得る。さらに、得られた懸濁液には、広範囲の汚染タンパク質、核酸、及び多糖類が含まれている。核酸及び多糖類は溶液の粘度を増加させ、遠心分離、クロスフロー濾過、又はクロマトグラフィーによるその後の処理を複雑にする可能性がある。これらの夾雑物と目的のタンパク質との複雑な会合は、精製プロセスを複雑にし、容認できないほど低い収量をもたらす可能性がある。微生物発酵ブロス又はホモジネートから異種ポリペプチドを精製するための改善された方法は、例えば、米国特許第７，１６９，９０８号に記載されており、その全開示は参照により本明細書に明示的に援用される。

［００１７３］ある態様では、本開示は、培地中で細胞を培養する方法を提供する。方法は、本発明の方法によって培地中の銅損を防止すること、又は本発明の方法によって培地を調製することと；細胞を培地と接触させることと；培地中で細胞を培養することとを含む。

［００１７４］別の態様では、本開示は、生物学的生成物を作製する方法を提供する。方法は、本発明の方法によって培地中の銅損を防止すること又は本発明の方法によって培地を調製することと；前記生物学的生成物を発現するように構成された細胞を培地と接触させることと；細胞が生物学的生成物を発現するような条件下で、培地中で細胞を培養することとを含む。

［００１７５］さらなる態様では、細胞を培養するための、本発明の細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の使用を提供する。

［００１７６］本明細書に記載の培養、発酵、生物学的生成物の作製方法、回収及び精製方法は、例示のみを目的としていることが強調される。開示された方法は、組換えタンパク質又は他の生物学的生成物の生成、回収、及び精製のために開発された任意の製造プロセスと組み合わせることができる。

アッセイ
［００１７７］システイン（モノマー）の定量化のためのアッセイ
［００１７８］システインの濃度は、システイン酸化の状況でシステインを測定するために一般的に使用される方法である、遊離チオールに対するエルマン試薬アッセイを使用して決定することができる（Ｓｍｉｔｈ ＲＣ， ｅｔ ａｌ．， Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｉｏｌｓ Ｂｙ Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ， Ｓｕｌｆｕｒ， ａｎｄ Ｓｉｌｉｃｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ． １９９４；９０（１－４）：１４７－１５４；及びＭｕｎｄａｙ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ－ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｎａｎｏｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｒｏｎ ｓａｌｔｓ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２００４；３６（６）：７５７－７６４。これらは、その全体が参照により本明細書に援用される）。このアッセイは、エルマン試薬（ＤＴＮＢ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を培地に添加し、４１２ｎｍでの吸光度を測定することによって実施された。Ｂｅｅｒの法則と１３，６００Ｍ^－１ｃｍ^－１の吸光係数を使用して（Ｅｌｌｍａｎ ＧＬ， Ｔｉｓｓｕｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐｓ， Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ， １９５９；８２（１）：７０－７７による。その全体が参照により本明細書に援用される）、読み取り値を、遊離チオールの濃度に変換した。培地が有意な濃度で他の遊離チオールを含まない場合、これはシステインモノマーの濃度を提供する。他の遊離チオールが存在する場合、システインモノマーの濃度を提供するために、得られた値を非システインモノマーチオールから補正する必要がある。

［００１７９］銅（Ｉ）のバソクプロインアッセイ
［００１８０］このアッセイは、銅（Ｉ）の存在を確認するために使用することができる。Ｂｌａｉｒ Ｄ ａｎｄ Ｄｉｅｈｌ Ｈ， Ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｂａｔｈｏｃｕｐｒｏｉｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ， ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｉｒｏｎ ａｎｄ ｃｏｐｐｅｒ， Ｔａｌａｎｔａ． １９６１；７（３－４）に記載されている、キレート剤の水溶性バージョン、バソクプロイン ジスルホン酸を使用した（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）。バソクプロインは、選択的にＣｕ（Ｉ）と結合するキレート剤であり（Ｓｍｉｔｈ Ｇ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＤＨ， Ｎｅｗ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ｃｏｐｐｅｒ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９５３；２５（３）を参照）、酸素によってＣｕ（Ｉ）がＣｕ（ＩＩ）へ酸化するのを防ぐ。バソクプロイン－Ｃｕ（Ｉ）複合体は、吸光係数１３，３００Ｍ^－１ｃｍ^－１の４８３ｎｍでの吸光度によって定量化でき、それによってＣｕ（Ｉ）のレベルを決定することができる。

［００１８１］ピルベート、アセテート、及び微量金属の決定
［００１８２］ピルベートは、Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ機器で利用可能なピルベートアッセイキットなどのピルベートアッセイキットを使用して測定することができる。このアッセイは、乳酸デヒドロゲナーゼを使用し、３４０ｎｍでのＮＡＤＨの吸光度を測定して酵素的である。

［００１８３］アセテートは、イオン交換クロマトグラフィー法を使用して測定することができる。例えば、アセテートは、ＲＦＩＣ ＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１－ＨＣカラム（Ｄｉｏｎｅｘ）及び導電率検出を備えたＤｉｏｎｅｘ ３０００シリーズＨＰＬＣで測定することができる。アセテートはＫＯＨ勾配で溶出され、サンプルの結果は標準曲線と比較され得る。

［００１８４］微量金属は、誘導結合プラズマ－発光分光法（ＩＣＰ－ＯＥＳ）又は誘導結合プラズマ－質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）などの原子検出の従来の方法を使用して、当業者によって定量化され得る。例示的なＩＣＰ－ＯＥＳ法では、サンプルは、硝酸で希釈し、その後、微量金属がイオン化されるアルゴンプラズマに吸引され得る。サンプル中の微量金属は、特定の波長での分光計の読み取り値によって決定することができ、強度の読み取り値は、定量化のために標準曲線と比較された。

［００１８５］濾過による銅除去のアッセイ
［００１８６］細胞培養物、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物等の溶液を濾過することは、フィルタ上で不溶性の銅の損失につながり得る。除去された銅の量は、フィルタから銅を回収した後に、例えば上記の「微量金属決定」アッセイを使用して定量化することができる。銅は、任意の適切なやり方でフィルタから回収され得る。

［００１８７］フィルタが特定の溶媒系に容易に溶解する材料から作製されている場合、フィルタ及びフィルタ上に存在する銅は、適切な溶媒に溶解され得る。例えば、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルタは、ＤＭＳＯで完全に溶解され得る。その後、ＤＭＳＯ溶液を５％硝酸で希釈した。濾過された培地、濾過されていない培地、及び溶解したフィルタ溶液の銅含有量は、ＩＣＰ－ＯＥＳ によって定量化され、それにより、濾過によって溶液から除去された銅の量が決定された。

［００１８８］溶液から除去された銅を回収する別のアプローチは、流れを逆にして、除去された銅をフィルタからフラッシュすることである。例えば、フィルタ面積が３．９ｃｍ^２のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ ＰＥＳ ０．２２μｍフィルタでは、１Ｌの培地を濾過した後、５％ 硝酸 ５０ｍＬの逆流でフィルタをフラッシュすることができる。フィルタ培地、濾過されていない培地、及び５％ 硝酸洗浄液の銅含有量は、ＩＣＰ－ＯＥＳ によって定量化された。この方法は、逆流と適合する任意のフィルタに容易に適用することができる。

［００１８９］使用され得る特定のアッセイの例は以下の通りである。１．５Ｌの培地を２Ｌガラスビーカーで調製し、環境からの酸素移動を最小限に抑えるためにパラフィルムで覆った。ビーカーを、ＲＰＭ設定が較正されたＣｏｒｎｉｎｇ ＰＣ－６２０Ｄ撹拌プレート上に置いた。ガス移動を増加させる渦を発生させずに均一な溶液を維持するために、混合を６０ＲＰＭに設定した。Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＩｎＰｒｏ ６８６０ｉ 光学式溶存酸素プローブとＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＩｎＰｒｏ ３２５３ｉ ｐＨ／ＯＲＰ（酸化還元電位）センサが組み込まれた。酸素環境は、酸素又は窒素のいずれかを小径のディップチューブを通してスパージすることによって操作した。銅の除去は、４０ｍｌの培地を５０ｍｌのコニカルチューブにピペッティングし、容量の半分をｓｔｅｒｉｆｌｉｐで濾過し、ＩＣＰ－ＯＥＳ によって銅の除去を定量化することによって測定した。

材料及び方法
［００１９０］化学的に定義された培地１（ＣＤＭ１）として、専用のＣＨＯ細胞培地を使用した。培地は、化学的に定義されており、タンパク質を含まず、さまざまなアミノ酸、ビタミン、グルコース、重炭酸緩衝液、塩、及び微量元素を含んでいる。この研究にとって重要な培地中の２つの微量元素は、鉄と銅である。どちらも低μＭ濃度で存在し、鉄は銅よりもはるかに豊富である。この研究に関連する２つの成分であるシステインとピルベートは、低ミリモル範囲（１～１０ｍＭ）にあり、ピルベートは常にシステインを超えている。培地はｐＨ７に滴定され、浸透圧はおよそ３００ｍＯｓｍであった。

［００１９１］完全な化学的に定義された培地（ＣＤＭ）レシピは、多くの成分を含有している。したがって、システインと銅の化学を研究するための簡素化された培地レシピが開発された。この培地は、ｐＨ、緩衝成分、イオン強度、浸透圧、銅及び鉄の微量金属イオン、並びにシステイン及びシステインと相互作用することが知られている成分（ピルベートなど）を維持する。

［００１９２］本明細書で使用される場合の簡素化された培地は、ＣＤＭ１に存在する、すべての重要な成分化学、ｐＨ緩衝、及び酸化還元活性成分を有するＣＤＭ１の最小限の生存可能な生成物のバージョンであった。ＣＤＭ１と簡素化された培地の両方で実験を行うことで、ＣＤＭ培地成分の完全な複雑さの有無にかかわらず効果を決定することが可能であった。

［００１９３］多数の条件及び時点を試験するために、高スループットシステムを開発した。この方法では、５０ｍｌのコニカルチューブ及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）の０．２２μＭ ＰＥＳ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルタユニットを使用した（特に明記しない限り）。培地（ＣＤＭ１及び簡素化された培地）を調製し、４０ｍｌをコニカルチューブに等分した。その後、これらを撹拌せずに周囲条件下で保存した。調製後の様々な時点で、１つのアリコートの容量の半分をｓｔｅｒｉｆｌｉｐを使用して濾過し、２０ｍｌを濾過せずに残した。濾過した培地と濾過していない培地の両方の銅含有量を、ＩＣＰ－ＯＥＳアッセイで定量し、濾過中に除去された銅を決定した。

実施例１：濾過による銅除去の経時変化
［００１９４］ＣＤＭ１培地の培地調製後に濾過によって除去される銅種は一時的なものである。ＣＤＭ１中のシスチン及び銅の濃度は、本明細書の「表１」で定義される基礎培地の範囲内であった。時間依存性を特徴付けるために、培地を調製し、銅の除去が観察されなくなるまで４５分ごとに一連のサンプルを濾過した。銅除去の時間経過プロファイルを図１に示す。最初は銅は完全に溶けており、濾過によって除去されない。しかし、およそ１時間後、銅は濾過によって除去され始める。１２時間後、銅は再び完全に濾過可能になる。１時間と１２時間との間、銅の除去はＵ字型の曲線を示し、４時間と６時間との間におよそ８０％の最大損失が生じる。これは銅特有の現象である。培地中の他の測定可能な微量金属の損失は観察されなかった。

［００１９５］濾過できない銅がＣｕ（Ｉ）の形態であることを確認するために、上記の「銅（Ｉ）のバソクプロイン分析」を使用した。銅の添加から４時間後のシステイン含有培地は、Ｃｕ（Ｉ）について陽性であると試験されたが、シスチンで調製された培地の対照ケースでは陰性であった（銅の損失は観察されなかった）。Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ_４の原液もＣｕ（Ｉ）に対して陰性であった。

実施例２：培地成分ノックアウト研究
［００１９６］培地成分ノックアウト研究を実施した。これらは、システインが銅の濾過除去を引き起こす主要な成分であることを確認した。修飾培地がシステインを含まなかった場合は、銅損は観察されなかった。システインではなくシスチン（酸化二量体形態）を使用した培地でも、濾過中の銅の除去は観察されなかった。我々は、また、銅の損失の経時変化の一過性は、鉄及びピルベートに影響されることを観察した。銅損はｐＨに依存し、中性ｐＨ付近で最も激しく起こるが、特定の緩衝液種に制限されることはなかった。

実施例３：システイン酸化プロセスの検査
［００１９７］微量金属の添加後、システインモノマー濃度、ｄＯ_２、及び経時的な酸化還元電位を測定することにより、システインの酸化プロセスをモニタリングした。図２は、システインモノマー、ｄＯ_２、及び酸化還元電位の時間経過と、システインモノマー、ｄＯ_２、及び銅損失プロファイルのオーバーレイとを示している。これらのプロファイルに基づくと、銅の損失はシステインが酸化されている間のみ発生するようである。これらのプロファイルは、実験間で一貫している。

［００１９８］培地への金属イオンの添加は、システインを酸化して酸素を消費する反応を引き起こし、ｄＯ_２とシステインモノマーの即時低下を引き起こす。ｄＯ_２が制限されると、銅が濾過できなくなり、システインモノマーの減少速度が大幅に遅くなることが観察される。システインモノマーが制限されるまで、ｄＯ_２は低く維持され、銅は濾過できない。システインモノマーが枯渇すると、ｄＯ_２が上昇し始め（周囲拡散の結果として）、銅は濾過可能な形態に戻る。

［００１９９］システインモノマーの反応は、酸化還元電位を測定することによって追跡することもできる。システインは、負の酸化還元電位を引き起こす比較的強力な還元剤である（Ｊｏｃｅｌｙｎ ＰＣ， Ｔｈｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｒｅｄｏｘ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ‐Ｃｙｓｔｉｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｔｈｉｏｌ‐Ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ Ｌｉｐｏｉｃ Ａｃｉｄ， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９６７；２（３）。その全体が参照により本明細書に援用される）。図２ｃに酸化還元電位プロファイルを示す。最初に酸素が消費されると、酸化還元電位が低下し、ＤＯがゼロになるときに最小値に達する。その後、システインモノマーが消費されるにつれて、酸化還元電位はあまり還元されなくなる。システインモノマーの濃度がゼロに近づくと、酸化還元電位がゼロよりわずかに上で安定し、穏やかな酸化環境を示す。これは、シスチンが溶液中に存在する結果だと思われる。

［００２００］システインからシスチンへの酸化反応は、ｐＨ７で－２２０ｍＶの電位を有すると報告されており（Ｊｏｃｅｌｙｎ ＰＣ， ｉｂｉｄ）、これは観測された最小観測電位の－２００ｍＶとよく相関している。細胞培地は、典型的には、他の酸化還元活性成分（例えばチロシン）を含むが、測定期間中はシステインが最も影響力のある成分であるように思われる。

［００２０１］例示の配合では、銅は、銅（ＩＩ）の溶解度の高い形態であるＣｕ（ＩＩ）ＳＯ_４として培地に添加される。システイン酸化を触媒するとき、銅は、溶解度が著しく低い形態であるＣｕ（Ｉ）に変換され、保持される。いかなる理論にも縛られることを望むものではなく、システイン／シスチンとの複合形態である可能性が高いシステイン酸化の銅（Ｉ）中間体は、溶解度が低く、濾過によって除去される沈殿物を形成するという仮説が立てられている。このことは、多くの銅チオレートの溶解度が非常に低く、しばしば沈殿物を形成するという報告と一致している。

［００２０２］Ｇａｒｒｅｌｓ ＲＭ， Ｃｈｒｉｓｔ ＣＬ， Ｅｈ－ｐＨ Ｄｉａｇｒａｍｓ． Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ， １９６５， ａｔ ｐａｇｅ ２３２（その全体が参照により本明細書に援用される）で銅、鉄、及び硫黄の水性系を記載しているプールべ（酸化還元電位／ｐＨ）図は、例示的な培地で観察される条件（ｐＨ７及び０から－２００ｍＶの範囲の酸化還元電位）において、これらの３分子が取り得る少なくとも６つの異なる形態が存在することを示している。システインを硫黄に置き換えて、同じ種が発生すると単純に考えることはできないが、この図は、相互作用の複雑さと、酸化還元電位の変化に伴う種の遷移を表している。このことから、システイン酸化中、同様に多数の銅－鉄－チオール種が発生し得ると考えるのが妥当である。いかなる理論にも縛られることを望むものではなく、これらの形態の１つ又は複数は不溶性であり、濾過によって除去され得る銅を含む沈殿物を引き起こすことが示唆される。システイン又は鉄の測定可能な損失は観察されないが、銅は、典型的には、細胞培地及び関連する組成物中に、システイン及び鉄よりも有意に低い濃度で存在する。システイン又は鉄のいずれかが銅と同じモルレベルで除去された場合、その損失は、通常、培地、供給物、又は添加物の組成物中のシステイン及び鉄のレベル全体に有意な影響を与えるほど大きくはないだろう。

実施例４：システイン濃度の上昇の影響
［００２０３］２つの異なる初期システイン濃度、３ｍＭ及び６ｍＭの培地での銅除去の経時変化を調査した。図３ａは、高スループットシステム（非混合）を使用した、これらの異なるシステイン濃度での銅除去プロファイルを示し、図３ｂは、小規模システム（混合）でのプロファイルを示している。初期のシステインモノマーが増加すると、銅が濾過によって除去される時間が延長された。

［００２０４］低ｄＯ_２状態及びシステインモノマーの枯渇までの時間は、銅の除去に伴って延長された。これは、初期システインの増加が銅除去の期間を延長した理由が、システインの酸化がより長く発生していたためであることを裏付けた。

［００２０５］システインモノマーの濃度を調整することによって不溶性の銅種の時間枠を制御する能力は、銅除去の原因としてのシステイン酸化をさらにサポートする。

実施例５：低ｄＯ_２の影響
［００２０６］図２ｄを調べると、金属イオンが培地に添加されるとすぐにシステインの酸化が始まることが示されたが、銅はｄＯ_２が限界に達するまで濾過できなくなる。システインモノマーが限界になると、ｄＯ_２が上昇し始め、銅が再び濾過可能になる。銅除去が生じるには低ｄＯ_２が必要であり、銅が濾過可能な形態に戻るには酸素が必要であると思われる。これは、システムに窒素をスパージすることによってｄＯ_２をゼロに維持した２つの実験によって裏付けられた。

［００２０７］第１の実験では、システインモノマーが枯渇に達したおよそ４時間後に窒素のスパージを開始し、８時間後にシステムに酸素をゆっくりと再導入した。図３ｃは、窒素のスパージによってゼロｄＯ_２環境が維持されている間に銅除去が延長されたことを示している。ｄＯ_２レベルが上昇し始めると、銅は、より溶解度の高い銅（ＩＩ）酸化状態に酸化されるため、再び濾過可能になった。

［００２０８］第２の実験では、システインモノマーが枯渇する少し前に（後の時点で枯渇することが確認された）スパージを開始し、１１時間まで維持した。この時点で、窒素のスパージを停止し、激しく撹拌してｄＯ_２を急激に増加させた。図３ｄは、この実験で、スパージが開始された後、銅の除去量がほぼ１００％に増加し、酸素が再導入されるまでそのレベルにとどまったことを示している。ｄＯ_２の急速な増加は、銅の濾過可能性も同様に急速に回復させた。

［００２０９］これらの２つの実験は、ｄＯ_２をゼロで維持することにより銅除去を無限に延長できること、及び銅が濾過可能な形態に戻るには酸素が必要であることを示している。この調査は、ほぼゼロのｄＯ_２での小さな変化を区別することはできないが、第２の実験では、窒素のスパージを使用してほぼゼロの酸素環境に到達すると、銅が濾過中に定量的に除去され得ることも示している。これは、非窒素スパージ実験で銅の部分的な除去しか見られない理由が、システインの酸化だけではゼロｄＯ_２に達するのに十分ではないためであることを示唆している。微量のレベルの酸素が残り、不溶性の銅（Ｉ）の一部を濾過可能な銅（ＩＩ）の形態に変換する場合がある。

実施例６：システインとピルベートの反応
［００２１０］典型的な細胞培地では、遊離システインは２つの主要な反応経路に関与し得る。第１はシスチンへの酸化である。第２は、図４に示すように、２，４チアゾリジンへのシステイン及びピルベートの縮合である。これらの２つの反応は、システインモノマーについて競合するが、簡素化された培地配合を使用して、金属イオンを除去して酸化反応を防止するか、又はピルベートを除去して縮合反応を防止するか、又は金属イオン及びピルベートを除去して両方の反応を防止するかによって、どの反応が生じているかを調節した。次に、システインモノマー濃度の減少を観察して、相対的な反応速度を理解した。図５は、簡素化された培地＋／－金属イオン及び＋／－ピルベートのシステインモノマープロファイルを示している。

［００２１１］図４に示すように、システインとピルベートの縮合反応により、水分子と水素イオンがチアゾリジンと共に生成される。重炭酸塩が緩衝種として使用されるとき、ＣＯ_２のガス放出によるｐＨの化学量論的変化を測定することは困難であるが、簡素化された培地で重炭酸塩をＭＯＰＳ緩衝液に置き換えたとき、チアゾリジンに変換されたシステインの量のｐＨのほぼ化学量論的な低下を測定することができた。これは、チアゾリジン形成がシステイン濃度に比例するｐＨ低下の原因であることを示しており、これは、システインとピルベートを含むＣＤＭの培地保持中に観察される。

［００２１２］さらに、システインの添加前及びシステインモノマーの枯渇後にピルベート濃度を測定した。金属イオンが存在しない場合、ピルベート濃度は３．０ｍＭ減少し、化学量論的にシステインの３．０ｍＭの減少と相関し、チアゾリジンへの完全な変換が示唆された。さらに、金属イオンが存在しない場合、ｄＯ_２は変化せず、システインが酸化しなかったというさらなる証拠が示される。

［００２１３］金属イオンが含まれたとき、ピルベートのデータは、２つの反応間のシステインモノマーについての競合を裏付けた。ピルベート濃度の減少は少なく（１．７ｍＭ）、チアゾリジンへの部分的な変換が示唆され、残りのシステイン（１．３ｍＭ）がシスチン（０．６５ｍＭ）に酸化したと計算される。さらに、システインの酸化に特徴的なｄＯ_２低下が観察された。

［００２１４］ピルベートは不溶性の種を形成する銅のメカニズムに直接関与していないが、細胞培地中のピルベートの存在は、銅除去の経時変化に大きな影響を与える。不溶性の銅種は、酸化に利用可能なシステインモノマーがなくなるまで維持され、酸素がシステイン酸化反応を制限するようになった後、ピルベートとの縮合が残りのモノマーの多くを消費する原因となることを示した。ピルベートが存在しない場合は、酸化反応がシステイン消費への唯一の経路となる。酸素の利用可能性によって制限されるため、酸化反応はシステインをすべて消費するのにはるかに長い時間がかかり、銅除去にはより長い時間がかかることになる。

［００２１５］ピルベートと金属イオンが簡素化された培地に存在するとき、少量のアセテート（簡素化された培地では０．１２ｍＭ）が生成されることがわかった。ピルベートイオンと金属イオンの両方が存在しない限り、アセテートは検出されなかった。式１に示すように、システインの酸化の第１の工程では過酸化水素が生成され、式２に示すように追加のシステインを酸化させることができる。ただし、過酸化水素は非常に反応性が高く、さまざまな培地成分と相互作用する可能性がある。一例は、我々が観察したピルベートからアセテートへの酸化である。式７は、この反応が、典型的にはどのように表されるかを示している（Ｎａｔｈ ＫＡ，ｅｔ ａｌ．， ａｌｐｈａ－Ｋｅｔｏａｃｉｄｓ ｓｃａｖｅｎｇｅ Ｈ_２Ｏ_２ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｍｅｎａｄｉｏｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， １９９５， ２６８（１）； Ｇｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ ＡＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｉｎ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｄａｍａｇｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ， Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １９９７， ２３（３）， ４２６－４３４。これらの全体が参照により本明細書に援用される）。

［００２１６］式１～３に記載されているシステイン酸化の化学量論は、消費された酸素のモルに対して酸化したシステインの４：１モルである。これは、過酸化水素とシステインの完全な反応を前提としている。培地では、ピルベートなどの他の培地成分と反応する過酸化水素の傾向の結果として、化学量論比は４：１未満である。

実施例７：銅のフィルタの材料及び細孔サイズの影響
［００２１７］フィルタを使用した実施例１～６は、細孔サイズが０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルタを使用した。また、ポリビニリデンジフルオリド又はポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）及びニトロセルロース膜と、０．２２μｍから８μｍの範囲の細孔サイズも試験した。濾過中の銅除去は、膜の材料や細孔サイズに依存しないことがわかった。

［００２１８］さらに、濾過中に除去された銅は、本明細書に記載の濾過による銅除去のアッセイを使用してフィルタ材料から回収できることも実証した。フィルタを溶解することにより、濾過中に培地から除去された銅の９９％を回収することができ、フィルタを単にバックフラッシュすることにより、除去された銅の８９％を回収することができた。

Claims (57)

1. 溶液中の銅損を防止する方法であって、
   溶液が、銅（ＩＩ）及びシステインを含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物であり、
   溶液の濾過の前後で実質的に同量の可溶性の銅を有することを含む、
   方法。
2. 濾過が、少なくとも約６％ ｄＯ_２の溶存酸素（ｄＯ_２）レベル、任意選択的に少なくとも約８％ ｄＯ_２の溶存酸素（ｄＯ_２）レベルを含む溶液を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
3. 溶液のｄＯ_２レベルを、濾過の開始前に少なくとも約１０分間、少なくとも約６％ ｄＯ_２（又は少なくとも約８％ ｄＯ_２）で維持することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. ｄＯ_２レベルが、
   ａ． 溶液を酸素化すること；及び／又は
   ｂ． 濾過を最適化すること
   により、必要レベルで維持される、請求項２又は３に記載の方法。
5. 酸素化が、
   酸素を含むガスで溶液をスパージすること；及び／又は
   溶液を撹拌又は混合して、酸素を含むガスと溶液の接触を増加させること
   を含む、請求項４に記載の方法。
6. 酸素を含むガスが大気である、請求項５に記載の方法。
7. 濾過を最適化することが、濾過中にｄＯ_２レベルが８％を下回らないように、濾過速度、フィルタサイズ、及び／又はフィルタ容量を増加させることを含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 濾過が、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約２４時間以内に完了する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 濾過が、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約５時間、約１時間、又は約３０分間以内に実施される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
10. 濾過が、１分あたり総容量の少なくとも０．５％の割合で、任意選択的には１分あたり総容量の少なくとも５％の割合で実施される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. システイン溶液及び銅（ＩＩ）溶液を提供することを含み、
    濾過が、システイン溶液と銅（ＩＩ）溶液とを別々に濾過し、その後濾過したシステイン溶液と濾過した銅（ＩＩ）溶液とを合わせて、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を形成することを含む、
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. システイン溶液が、銅以外の、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の成分の少なくとも大部分を含む、請求項１１に記載の方法。
13. システイン溶液が、銅、及び任意選択的に鉄以外の、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の成分の実質的にすべてを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度が、約０．００５μＭから約１Ｍの範囲である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 濾過が滅菌濾過を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 滅菌濾過が、約０．５μｍ以下、任意選択的には約０．２μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 滅菌濾過が、少なくとも約０．１μｍの細孔サイズを有する濾過培地の使用を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. システインが、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体として実質的に提供される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. システインが、銅（ＩＩ）を溶液に添加する前に、スルフヒドリル基を含まないシステイン誘導体に実質的に変換される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. システイン誘導体が、ジスルフィド又はチアゾリジン部分を含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. システイン誘導体がジスルフィドを含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. システイン誘導体がチアゾリジン部分を含む、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. システイン誘導体が、シスチン、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレート、Ｓ－スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイニルグリシン、システイン Ｓ－結合型Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡＣ－ｃｙｓ）、ホモシスチン、Ｌ－システイン混合ジスルフィド、Ｌ－システイン混合ペプチド、Ｓ－アルキル化システイン、チオール保護基を有するシステイン（例えば、ＦＭＯＣ保護システイン）、２－メチル－１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、２－（２－カルボキシエチル）２１，３－チアゾリジン－２，４－ジカルボン酸、還元及び酸化グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｓ－スルホグルタチオン、Ｓ－アシル－ＧＳＨ、Ｓ－カルボキシ－Ｌ－システイン、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸、２－アルキル－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、２－アリール－チアゾリジン－４（Ｒ）－カルボン酸、及び炭水化物ベースのチアゾリジン（例えば、Ｄ－リボース－Ｌ－システイン）からなる群より選択される、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. システイン誘導体がシスチンを含む、請求項２３に記載の方法。
25. システイン誘導体が、４－カルボキシ－２－メチルチアゾリジン－２－カルボキシレートを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 銅が、銅（ＩＩ）キレートの形態である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. キレートが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ネオクプロイン、バソクプロイン、Ｄ－ペニシラミン、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、ジメルカプロール（ＢＡＬ）、８－ヒドロキシキノリン、クリオキノール、及び５，７－ジクロロ－２－［（ジメチルアミノ）メチル］－８－キノリノール（ＰＢＴ２）から選択されるキレート剤を含む、請求項２１に記載の方法。
28. 可溶性の銅の損失を伴わずに、銅（ＩＩ）、システイン、及び他の成分を含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を調製する方法であって、
    システイン及び他の成分を含む水溶液を提供することと；
    銅（ＩＩ）を含む水溶液を提供することと；
    システイン及び他の成分を含む水溶液と、銅（ＩＩ）を含む水溶液とを別々に濾過することと；
    濾過した溶液を合わせて、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を提供することと
    を含む、方法。
29. システイン及び他の成分を含む水溶液の調製が、システイン及び他の成分を水に溶解及び／又は可溶化することを含む、請求項２８に記載の方法。
30. 銅（ＩＩ）を含む水溶液の調製が、水に銅（ＩＩ）塩を溶解することを含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
31. 銅（ＩＩ）溶液中の銅の濃度が、約０．００５μＭから約１Ｍの範囲である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 可溶性の銅の損失を伴わずに、銅（ＩＩ）、システイン、及び他の成分を含む、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を調製する方法であって、
    銅（ＩＩ）、システイン、及び他の成分を含む溶液を濾過して、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物を提供することを含む、
    方法。
33. 濾過が、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約２４時間以内に完了し、任意選択的には、濾過が、溶液に銅（ＩＩ）を添加してから約３０分以内に実施される、請求項３２に記載の方法。
34. 溶液が、銅（ＩＩ）塩、システイン、及び他の成分を水に溶解及び／又は可溶化することによって調製される、請求項３２又は３３に記載の方法。
35. 各濾過が滅菌濾過を含む、請求項２８から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 各滅菌濾過が、約０．５μｍ以下、任意選択的には約０．２μｍ以下の細孔サイズを有する濾過培地の使用を含む、請求項３５に記載の方法。
37. 滅菌濾過が、少なくとも０．１μｍの細孔サイズを有する濾過培地の使用を含む、請求項３５又は３６に記載の方法。
38. 請求項２から７、及び１８から２７のいずれか一項に記載の特徴をさらに含む、請求項２８から３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 他の成分が、少なくとも１つの炭素源、及び／又は少なくとも１つの窒素源、及び／又は少なくとも１つのビタミン、及び／又は少なくとも１つの緩衝剤、及び／又は少なくとも１つの無機塩、及び／又は銅以外の少なくとも１つの微量金属、及び／又は少なくとも１つのポリアミン、及び／又は少なくとも１つの（必須）脂肪酸を含む、請求項２８から３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 少なくとも１つの炭素源が、糖類、任意選択的に、単糖又は二糖、例えばグルコース及び／又はデオキシリボースを含む、請求項３９に記載の方法。
41. 少なくとも１つの窒素源が、少なくとも１つのアミノ酸を含み、任意選択的には、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリン、又はそれらの誘導体から任意選択的に選択される、請求項３９又は４０に記載の方法。
42. 少なくとも１つのビタミンが、アスコルビン酸、ビオチン、コリン、Ｄ－Ｃａ^２＋－パントテネート、葉酸、イノシトール、メナジオン、ナイアシンアミド、ニコチン酸、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ピリドキサール、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＡアセテート、ビタミンＢ_１２、及びビタミンＤ_２から選択される、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 少なくとも１つの緩衝剤が、炭酸塩、重炭酸塩、リン酸塩、リン酸水素、リン酸二水素、乳酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＥＳ、及びＢｉｓ－Ｔｒｉｓを含む、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 少なくとも１つの無機塩が、ＣａＣｌ_２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ_３、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、及びクエン酸鉄キレート又は硫酸鉄キレートのうちの少なくとも１つを含む、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 銅以外の少なくとも１つの微量金属が、バリウム、臭素、コバルト、ヨウ素、マンガン、クロム、ニッケル、セレン、バナジウム、チタン、ゲルマニウム、モリブデン、ケイ素、鉄、フッ素、銀、ルビジウム、スズ、ジルコニウム、カドミウム、亜鉛、及びアルミニウムのうちの少なくとも１つのイオンを含む、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 少なくとも１つのポリアミンが、プトレスシン、カダベリン、スペルミン、及びスペルミジンのうちの少なくとも１つを含む、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 少なくとも１つの必須脂肪酸が、リノール酸及びリノレン酸から選択される、請求項３９から４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 培地中で細胞を培養する方法であって、
    請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法によって培地中の銅損を防止するか、又は請求項２８から４７のいずれか一項に記載の方法によって培地を調製することと、
    細胞を培地と接触させることと、
    培地中で細胞を培養することと
    を含む、方法。
49. 細胞が、真核細胞、原核細胞、又は古細菌細胞である、請求項４８に記載の方法。
50. 真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項４９に記載の方法。
51. 哺乳動物細胞が、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ－２１細胞を含む）、及びそれらの誘導体から選択される、請求項５０に記載の方法。
52. 培地中で細胞を培養することが、細胞を増殖させることを含む、請求項４８から５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 生物学的生成物を作製する方法であって、
    請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法によって培地中の銅損を防止することと、
    前記生物学的生成物を発現するように構成された細胞を培地と接触させることと、
    細胞が生物学的生成物を発現するような条件下で、培地中で細胞を培養することと、
    を含む、方法。
54. 生物学的生成物が、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ウイルス若しくはウイルス様粒子、核酸、又はその断片；任意選択的に、抗体、又は抗体の生物学的に機能的な断片である、請求項５３に記載の方法。
55. 生物学的生成物を単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
56. 請求項２８から４７のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるか又は得られる、細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物。
57. 任意選択的に、前記細胞から生物学的生成物を生成することを含み、且つ／又は、任意選択的に、前記細胞を増殖させることを含む、細胞を培養するための、請求項５６に記載の細胞培地、細胞培養供給物、又は細胞培養添加物の使用。
    

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