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JP2023518414A - 治療のための細胞外小胞 - Google Patents

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JP2023518414A
JP2023518414A JP2022556038A JP2022556038A JP2023518414A JP 2023518414 A JP2023518414 A JP 2023518414A JP 2022556038 A JP2022556038 A JP 2022556038A JP 2022556038 A JP2022556038 A JP 2022556038A JP 2023518414 A JP2023518414 A JP 2023518414A
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ティム スース，
ケ シュー，
アーロン ノイス，
ケビン ピー． ドゥーリー，
エリック ジャン，
クリスティーン マッコイ，
ジョナサン フィン，
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コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド
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Abstract

本開示は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）からの１つ以上の抗原と、任意選択でアジュバントと、を含む細胞外小胞に関する。また、本明細書において、ＥＶを生成する方法、及びＥＶを使用して疾患または障害、例えば感染性疾患を治療及び／または予防するための方法を提供する。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
このＰＣＴ出願は、２０２０年３月２０日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２４０２３号、２０２０年３月２７日に出願された米国仮出願第６３／００１，０８８号、２０２０年３月３１日に出願された第６３／００３，１７１号、２０２０年４月７日に出願された第６３／００６，５８５号、２０２０年４月２９日に出願された第６３／０１７，５１４号、及び２０２１年１月２７日に出願された第６３／１４２，４１８号の優先権を主張する。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ－ＷＥＢを通じて電子的に提出された配列表への言及
本出願中で提出された、電子的に送信された配列表の内容（名称：４０００＿０９７ＰＣ０６＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：３５２，２９３バイト；作成日：２０２１年３月２２日）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、感染性疾患を含むがこれに限定されないさまざまな医学的障害を治療及び／または予防するために使用できるワクチンとして有用である改変された細胞外小胞、例えばエキソソーム（例えば、抗原及びアジュバント／免疫モジュレーターなどの１つ以上のペイロードを含む）に関する。本開示はまた、そのようなＥＶを製造する方法及びその使用にも関する。
ＥＶは、細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターである。それらは、がんなどの多く疾患の診断と予後における重要なバイオマーカーでもある。薬物送達ビヒクルとして、ＥＶは、多くの治療分野における新規治療法として、従来の薬物送達方法（例えば、ペプチド免疫、ＤＮＡワクチン）に比べて多くの利点を提供する。しかしながら、その利点にもかかわらず、多くのＥＶは臨床効果が限られている。例えば、樹状細胞由来のエキソソーム（ＤＥＸ）は、手術不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者における一次化学療法後の維持免疫療法として第ＩＩ相臨床試験で調査された。しかし、主要評価項目（少なくとも５０％の患者が化学療法中止後４ヶ月の無増悪生存期間（ＰＦＳ）を有する）に達しなかったため、試験は中止された。Ｂｅｓｓｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（４）：ｅ１０７１００８（２０１５）。
したがって、ＥＶベースの技術の治療的使用やその他の用途をより有効にするには、新しくより効果的な操作されたＥＶが必要である。
Ｂｅｓｓｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（４）：ｅ１０７１００８（２０１５）
コロナウイルスに由来する少なくとも１つの抗原を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）が本明細書で提供される。いくつかの態様では、コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスである。いくつかの態様では、抗原はユニバーサルＳＡＲＳコロナウイルス抗原である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の抗原を含み、第１の抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する。いくつかの態様では、第２の抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する。いくつかの態様では、第２の抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来しない。特定の態様では、第１の抗原と第２の抗原は同じである。いくつかの態様では、第１の抗原と第２の抗原は異なる。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶにおいて発現され得るＣＯＶＩＤ－１９ウイルスに由来する抗原は、スパイク（Ｓ）タンパク質に由来する。いくつかの態様では、抗原は、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。特定の態様では、抗原は、Ｓタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、本開示のＥＶにおいて発現されるＣＯＶＩＤ－１９ウイルスに由来する抗原は、エンベロープ（Ｅ）タンパク質に由来する。特定の態様では、抗原は、Ｅタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、本開示のＥＶにおいて発現され得るＣＯＶＩＤ－１９ウイルスに由来する抗原は、膜（Ｍ）タンパク質に由来する。特定の態様では、抗原は、Ｍタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、ＥＶは第２の抗原を含み、第２の抗原はＣＯＶＩＤ－１９ウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質に由来する。いくつかの態様では、第２の抗原は、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。特定の態様では、第２の抗原は、Ｓタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、ＥＶは第２の抗原を含み、第２の抗原はＣＯＶＩＤ－１９ウイルスのエンベロープ（Ｅ）タンパク質に由来する。特定の態様では、第２の抗原は、Ｅタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、ＥＶは第２の抗原を含み、ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスに由来する第２の抗原は膜（Ｍ）タンパク質に由来する。特定の態様では、第２の抗原は、Ｍタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、第１の抗原及び第２の抗原を含み、第１の抗原はＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、第２の抗原はＴ抗原を含む。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、細胞性免疫応答、体液性免疫応答、または細胞性免疫応答と体液性免疫応答の両方を誘導する。特定の態様では、細胞性免疫応答、体液性免疫応答、または細胞性免疫応答と体液性免疫応答の両方の誘導が、（ｉ）アジュバントもしくは抗原を含まない対応するＥＶ、または（ｉｉ）ＥＶを伴わないアジュバントもしくは抗原と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または以上増加する。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方を誘導する。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する。いくつかの態様では、ＥＶは、組織常在性メモリーＴ細胞応答を拡大する。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、第１の足場部分をさらに含む。特定の態様では、第１の抗原は、第１の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第２の抗原は、第１の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、本明細書に開示される第１の足場部分を含むＥＶは、第２の足場部分をさらに含む。特定の態様では、第１の抗原は、第１の足場部分に連結され、第２の抗原は第２の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第１の足場部分と第２の足場部分は同じである。いくつかの態様では、第１の足場部分と第２の足場部分は異なっている。
いくつかの態様では、第１の足場部分は足場Ｘである。いくつかの態様では、第１の足場部分は足場Ｙである。いくつかの態様では、第２の足場部分は足場Ｙである。いくつかの態様では、第２の足場部分は足場Ｘである。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶにおいて発現され得る足場Ｘは、（ｉ）ＥＶの内腔表面上に第１の抗原を固定すること、（ｉｉ）ＥＶの外側表面上に第１の抗原を固定すること、（ｉｉｉ）ＥＶの内腔表面上に第２の抗原を固定すること、（ｉｖ）ＥＶの外側表面上に第２の抗原を固定すること、または（ｖ）それらの組み合わせを可能とする。いくつかの態様では、足場Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンβ１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンα４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）のうちの一クラス；ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶにおいて発現され得る足場Ｙは、（ｉ）ＥＶの内腔表面上に第１の抗原を固定すること、（ｉｉ）ＥＶの内腔表面上に第２の抗原を固定すること、または（ｉｉｉ）それらの両方が可能である。特定の態様では、足場Ｙは、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳタンパク質）；ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質）；脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第２の足場部分に連結されている。特定の態様では、ａ）第１の足場部分及び第２の足場部分のそれぞれが足場Ｙであり；ｂ）第１の足場部分は足場Ｙであり、第２の足場部分は足場Ｘであり；ｃ）第１の足場部分は足場Ｘであり、第２の足場部分は足場Ｙであり；またはｄ）第１の足場部分及び第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘである。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの内腔に存在する。いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔に存在し、第２の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第１の足場部分は足場Ｙであり、第２の足場部分は足場Ｘであるか、またはｂ）第１の足場部分及び第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘである。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第２の足場部分に連結されている。特定の態様では、ａ）第１の足場部分は足場Ｘであり、第２の足場部分は足場Ｙであるか、またはｂ）第１の足場部分及び第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘである。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔に存在し、第２の抗原は、ＥＶの内腔に存在する。
いくつかの態様では、抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。そのような態様のいくつかでは、第１の足場部分と第２の足場部分は足場Ｘである。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの内腔に存在する。そのような態様のいくつかでは、第１の足場部分は足場Ｘである。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔に存在し、第２の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結されている。そのような態様のいくつかでは、第１の足場部分は足場Ｘである。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結されている。そのような態様のいくつかでは、第１の足場部分は足場Ｘである。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、第２の抗原を含み、（ｉ）第２の抗原は、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によって第１の足場部分に連結されるか、（ｉｉ）第２の抗原は、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によって第２の足場に連結されるか、（ｉｉｉ）第２の抗原は、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によって第１の足場部分に連結されるか、（ｉｖ）第２の抗原は、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によって第２の足場部分に連結されるか、または（ｖ）それらの組み合わせである。特定の態様では、リンカー及び／または親和性リガンドはポリペプチドである。いくつかの態様では、リンカーは非ポリペプチド部分である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶの第１の足場部分または第２の足場部分は、ＰＴＧＦＲＮタンパク質である。いくつかの態様では、第１の足場部分または第２の足場部分は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１の足場部分または第２の足場部分は、配列番号１に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶの第１の足場部分または第２の足場部分は、ＢＡＳＰ１タンパク質である。さらなる態様では、第１の足場部分または第２の足場部分は、（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）のペプチドを含み、それぞれの括弧内の位置はアミノ酸を表し、πはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＭｅｔからなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される任意のアミノ酸であり；５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。いくつかの態様では、第１の足場部分または第２の足場部分は、配列番号５０～１５５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、第１の足場部分または第２の足場部分は、配列番号３に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
また、本明細書では、（ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する第１の抗原と、（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する第２の抗原と、を含む単離された細胞外小胞が提供され、（ａ）第１の抗原は内腔表面上の第１の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｙに連結されているか；（ｂ）第１の抗原は内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在するか；（ｃ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；（ｄ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；（ｅ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；（ｆ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；（ｇ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；（ｈ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；（ｉ）第１の抗原はＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；（ｊ）第１の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；（ｋ）第１の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在するか；（ｌ）第１の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；（ｍ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；（ｎ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；（ｏ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在するか；（ｐ）第１の抗原はＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；（ｑ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；（ｒ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの内腔に存在するか；（ｓ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されているか；（ｔ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在するか；（ｕ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；（ｖ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；（ｗ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面に直接連結されているか；（ｘ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；（ｙ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されているか；（ｚ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面に直接連結されているか；（ａａ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されているか；（ｂｂ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面に直接連結されているか；（ｃｃ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されているか、または（ｄｄ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの外側に直接連結されている。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、免疫モジュレーターをさらに含む。特定の態様では、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面または外側表面に直接連結されている。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側表面上またはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶはアジュバントを含み、アジュバントはＥＶの内腔表面または外側表面に直接連結されている。特定の態様では、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか、またはＥＶの内腔に存在する。いくつかの態様では、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、アジュバントはＥＶの内腔に存在する。
いくつかの態様では、アジュバントは、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、炎症メディエーター、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、α－ｇａｌ－ｃｅｒ（ＮＫＴアゴニスト）、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０）、Ｃ型レクチンアゴニスト（例えば、ベータグルカン（デクチン１）、キチン、及びカードラン）、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの態様では、アジュバントはＳＴＩＮＧアゴニストである。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチドのＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドのＳＴＩＮＧアゴニストを含む。
いくつかの態様では、アジュバントはＴＬＲアゴニストである。いくつかの態様では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、リポテイコ酸、非定型ＬＰＳ、ＭＡＬＰ－２及びＭＡＬＰ－４０４、ＯｓｐＡ、ポリン、ＬｃｒＶ、リポマンナン、ＧＰＩアンカー、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、ザイモサン、ｈｓｐ６０、ｇＨ／ｇＬ糖タンパク質、ヘマグルチニン）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、二本鎖ＲＮＡ、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ））、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテイコ酸、β－デフェンシン２、フィブロネクチンＥＤＡ、ＨＭＧＢ１、スナピン、テネイシンＣ）、ＴＬＲ５アゴニスト（例えば、フラジェリン）、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト（例えば、一本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ－Ａ、ポリＧ１０、ポリＧ３、レシキモド）、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、メチル化されていないＣｐＧ ＤＮＡ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶはエキソソームである。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、標的化部分をさらに含む。いくつかの態様では、標的化部分は、樹状細胞のマーカーに特異的に結合する。特定の態様では、マーカーは樹状細胞のみに存在する。いくつかの態様では、樹状細胞は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、骨髄／通常型樹状細胞１（ｃＤＣ１）、骨髄／通常型樹状細胞２（ｃＤＣ２）、炎症性単球由来樹状細胞、ランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞、リゾチーム発現樹状細胞（ＬｙｓｏＤＣ）、クッパー細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、樹状細胞はｃＤＣ１である。いくつかの態様では、マーカーは、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９ａ）タンパク質、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－グラビング非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２０７、ＣＤ４０、Ｃｌｅｃ６、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＤＥＣ－２０５、レクチン様酸化型低密度リポタンパク質受容体－１（ＬＯＸ－１）、ＭＡＲＣＯ、Ｃｌｅｃ１２ａ、Ｃｌｅｃ１０ａ、ＤＣ－アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン－１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－１（ＣＤ３０３、Ｃｌｅｃ４ｃ）、デクチン－２、Ｂｓｔ－２（ＣＤ３１７）、ランゲリン、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ３０４、ＸＣＲ１、ＡＸＬ、シグレック６、ＣＤ２０９、ＳＩＲＰＡ、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＰＲ１８２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１０、またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の態様では、マーカーはＣｌｅｃ９ａタンパク質である。
いくつかの態様では、標的化部分は、Ｔ細胞のマーカーに特異的に結合する。特定の態様では、マーカーはＣＤ３分子を含む。
いくつかの態様では、標的化部分は、ＥＶの外側表面に直接連結されている。特定の態様では、標的化部分は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、標的化部分は、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によってＥＶの外側表面に直接連結されている。いくつかの態様では、標的化部分は、リンカーによって足場Ｘに連結されている。特定の態様では、リンカー及び／または親和性リガンドはポリペプチドである。
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＥＶと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物である。
本明細書で提供されるのは、本開示のＥＶを産生する細胞である。本開示は、１つ以上のベクターを含む細胞をさらに提供し、ベクターは、（ｉ）抗原（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｉｉ）アジュバント（例えば、本明細書に記載のもの）、（ｉｉｉ）免疫モジュレーター、（ｉｖ）標的化部分（例えば、本明細書に記載のもの）、または（ｖ）それらの組み合わせをコードする核酸配列を含む。
本明細書に記載のＥＶ及び使用説明書を含むキットが本明細書に提供される。また、本明細書に記載のＥＶのいずれかを含むＥＶ－薬物コンジュゲートも本明細書に提供される。
本明細書で提供されるのは、本明細書で開示される細胞を適切な条件下で培養することと、ＥＶを得ることと、を含む、ＥＶを作製する方法である。
本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されるＥＶのいずれかを対象に投与することを含む、それを必要とする対象において免疫応答を誘導する方法である。
本明細書に提供されるのは、疾患を予防または治療することをそれを必要とする対象において行う方法であって、本明細書に開示されるＥＶのいずれかを対象に投与することを含み、疾患が抗原に関連する方法である。特定の態様では、疾患は感染症である。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、非経口、経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、または腹腔内に投与される。
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法（例えば、免疫応答を誘導する、または疾患を予防もしくは治療する）は、対象に追加の治療剤を投与することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）アジュバント及び抗原を含む細胞外小胞を含むプライミング投与を対象に投与することと、（ｉｉ）抗原を含む細胞外小胞を含むブースティング投与を対象に投与することと、を含む、それを必要とする対象にワクチン接種する方法に関する。
いくつかの態様では、抗原はコロナウイルスに由来する。
いくつかの態様では、プライミング投与は皮下投与される。いくつかの態様では、ブースト投与は鼻腔内に投与される。
いくつかの態様では、アジュバントはＳＴＩＮＧアゴニストである。いくつかの態様では、抗原は、足場部分に連結されている。いくつかの態様では、足場部分は足場Ｘである。
いくつかの態様では、ブースティング投与中のＥＶは、アジュバントをいっさい含まない。
いくつかの態様では、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分は、アンカー部分、親和性剤、化学的コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、スプリットインテイン、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＡＬＦＡタグ、ストレプトアビジン／アビタグ、ソルターゼ、ＳＮＡＰタグ、ＰｒｏＡ／Ｆｃ結合ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせによってＥＶの表面に連結されている。
本開示は、プロデューサー細胞から単離されたＥＶに抗原をロードすることを含む、ワクチンのための細胞外小胞（ＥＶ）を調製する方法をさらに提供する。プロデューサー細胞から単離された細胞外小胞（ＥＶ）に抗原をロードすることを含む、疾患または障害のためのワクチンを製造する方法もまた本明細書に開示される。
いくつかの態様では、ＥＶはアジュバントをさらに含む。特定の態様では、ＥＶは、抗原のＥＶへのローディングの前にアジュバントを含む。
いくつかの態様では、ワクチンのためのＥＶを調製する方法及び／または疾患もしくは障害のためのワクチンを製造する方法は、アジュバントをロードすることをさらに含む。特定の態様では、アジュバントは、抗原のローディングの前または後にロードされる。特定の態様では、アジュバントは、抗原と一緒にロードされる。
いくつかの態様では、本明細書に記載の、ワクチンのためのＥＶを調製する方法及び／または疾患もしくは障害のためのワクチンを製造する方法に有用なＥＶの抗原は、アンカー部分、親和性剤、化学的コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、スプリットインテイン、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＡＬＦＡタグ、ストレプトアビジン／アビタグ、ソルターゼ、ＳＮＡＰタグ、ＰｒｏＡ／Ｆｃ結合ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせによってＥＶの外側表面及び／または内腔表面に連結されている。
いくつかの態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、原生動物、腫瘍、アレルゲン、自己抗原、またはそれらの任意の組み合わせに由来するか、及び／またはそれらを含む。特定の態様では、抗原は、パンデミックを引き起こすウイルスに由来する。特定の態様では、抗原は、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、クリミア・コンゴ出血熱（ＣＣＧＦ）ウイルス、ヘンドラウイルス、ラッサウイルス、マールブルグウイルス、サル痘ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、リフトバレー熱（ＲＶＦ）ウイルス、痘瘡ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、麻疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）、パルボウイルス（例えば、Ｂ１９ウイルス）、ノルボウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ライノウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはそれらの任意の組み合わせに由来する。いくつかの態様では、抗原は、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ細菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ）、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、連鎖状球菌細菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、赤痢菌細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、クラミジア細菌（例えば、ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ、ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｕｓ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、またはそれらの任意の組み合わせに由来する。
いくつかの態様では、ＥＶへの抗原のローディングは、ＥＶをプロデューサー細胞から単離後、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約７ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１１ヶ月、少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約２年、少なくとも約３年、少なくとも約４年、少なくとも約５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも２５年、またはそれ以上で生じる。
いくつかの態様では、ワクチンの製造に必要な時間（「製造時間」）は、参照製造時間（例えば、抗原をプロデューサー細胞に導入することによって抗原のローディングが生じる方法の製造時間、または従来のペプチドワクチンなど、ＥＶを含まないワクチンを産生するための方法の製造時間）と比較して短縮される。特定の態様では、製造時間は、参照製造時間と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上短縮される。いくつかの態様では、製造時間は、約１２ヶ月未満、約１１ヶ月未満、約１０ヶ月未満、約９ヶ月未満、約８ヶ月未満、約７ヶ月未満、約６ヶ月未満、約５ヶ月未満、約４ヶ月未満、約３ヶ月未満、約２ヶ月未満、または約１ヶ月未満である。いくつかの態様では、製造時間は約６ヶ月未満である。
いくつかの態様では、本明細書に記載の、ワクチンのためのＥＶを調製する方法及び／または疾患もしくは障害のためのワクチンを製造する方法に有用なＥＶは、標的化部分をさらに含む。いくつかの態様では、標的化部分は、ＥＶへの抗原のローディングの前である。
いくつかの態様では、ワクチンのためのＥＶを調製する方法及び／または疾患もしくは障害のためのワクチンを製造する方法は、標的化部分をロードすることをさらに含む。特定の態様では、標的化部分は、抗原のローディングの前または後にロードされる。特定の態様では、標的化部分は、抗原と一緒にロードされる。
いくつかの態様では、抗原のローディング後、ＥＶは、Ｔ細胞免疫応答、Ｂ細胞免疫応答、またはＴ細胞免疫応答とＢ細胞免疫応答の両方を誘導することができる。
また、本明細書に記載の方法のいずれかによって調製されたＥＶも本明細書に提供される。ＥＶ及び使用説明書などを含むキットが本明細書に提供される。
また、本明細書に記載のＥＶのいずれかを含むワクチンも本明細書に提供され、抗原は、ワクチンの投与を受ける対象において免疫応答を誘発することができる。特定の態様では、ワクチンは地域化または個別化されている。
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＥＶまたはワクチンのいずれかを対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法である。特定の態様では、疾患または障害は感染性疾患を含む。
１つ以上の抗原、１つ以上のアジュバント、１つ以上の標的化部分の分子、またはそれらの任意の組み合わせを含む例示的なＥＶを示す。 １つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗原（例えば、外側表面上の足場Ｘに連結されたスパイクタンパク質；及び内腔表面上の足場Ｘに連結されたＴ細胞エピトープ）と、１つ以上のアジュバント（例えば、内腔にロードされたＳＴＩＮＧアゴニスト）と、を含む例示的なＥＶを示す。 コロナウイルススパイクタンパク質のダウン（閉鎖）及びアップ（開放）の立体配座の図を提供する。示されているように、アップ立体配座では、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が表面に露出している。 本明細書に開示されるＥＶにおいてコロナウイルススパイク抗原を発現させることができる例示的な方法の例示を提供する。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、全長三量体スパイクタンパク質は、ＥＶの表面（例えば、外側表面）に直接連結され得る（図「Ｉ」を参照されたい）。いくつかの態様では、全長三量体スパイクタンパク質の単量体サブユニットは、ＥＶの表面（例えば、外側表面）に直接連結され得る（図「ＩＩ」を参照されたい）。いくつかの態様では、全長三量体スパイクタンパク質の単量体サブユニットは、足場Ｘに連結されてＥＶの表面（例えば、外側表面）上に発現され得る（図「ＩＩＩ」を参照されたい）。いくつかの態様では、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（すなわち、サブユニット）は、足場Ｘに連結されてＥＶの表面（例えば、外側表面）上に発現され得る（図「ＩＶ」を参照されたい）。 足場部分（例えば、足場Ｘ）に連結されたＥＶの表面（例えば、外側表面）上で、コロナウイルススパイクタンパク質の異なるサブユニットがどのように別々に発現され得るかの例示を提供する。 スパイクタンパク質抗原及びＴ抗原をＥＶにおいて一緒に発現させることができる例示的な方法の例示を提供する。示されているように、第１ステップでは、スパイクタンパク質抗原を足場Ｘに連結させ、次いでＥＶの表面上に発現させることができる。次いで、ＥＶをさらに改変して、ＥＶの内腔表面上にＴ抗原を発現させることができる。図の左側では、Ｔ抗原が足場ＸのＣ末端に連結されており、他のペイロード（例えば、アジュバント及び／または免疫モジュレーター）を足場Ｙに連結させることができる。右側では、Ｔ抗原が足場Ｙに連結されている。 本開示に記載の親和性リガンドを含む例示的な足場Ｘ融合タンパク質の例示を提供する。示されるように、親和性リガンドは、コロナウイルススパイクタンパク質抗原（例えば、全長三量体スパイクタンパク質の単量体サブユニット（図「Ｉ」を参照されたい）またはスパイクタンパク質のＲＢＤ（図「ＩＩ」を参照されたい）との融合として合成され得る。次いで、親和性リガンドを使用して、コロナウイルススパイクタンパク質抗原をＥＶ上の部分、例えば足場Ｘ部分に連結またはコンジュゲートさせることができる。 本明細書に記載の例示的な「プライムプル」投与戦略の投与スケジュール及び実験計画を記載する表を提供する。異なる治療群は以下の通りである：（１）１回目の投与：皮下にＰＢＳ；２回目の投与：鼻腔内にＰＢＳ；（２）１回目の投与：皮下にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；２回目の投与：鼻腔内にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；（３）１回目の投与：皮下にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；２回目の投与：鼻腔内にＰｒＸ－ＯＶＡ；（４）１回目の投与：鼻腔内にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；２回目の投与：皮下にＰｒＸ ＯＶＡ；（５）１回目の投与：鼻腔内にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；２回目の投与：鼻腔内にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；（６）１回目の投与：皮下にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；２回目の投与：皮下にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；（７）１回目の投与：皮内にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；２回目の投与：鼻腔内にＰｒＸ－ＯＶＡ；（８）１回目の投与：皮内にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；２回目の投与：皮内にＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ；（９）１回目の投与：皮下に組み換えＯＶＡ＋可溶性ＳＴＩＮＧアゴニスト；２回目の投与：鼻腔内に組換えＯＶＡ＋可溶性ＳＴＩＮＧアゴニスト。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の肺におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の数を提供する。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、フローサイトメトリー（ＣＤ４４ｈｉ及びＣＤ６２Ｌｌｏ）を使用して定量化された。結果は、肺における全細胞のパーセンテージとして示される。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の肺におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の数を提供する。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、フローサイトメトリー（ＣＤ４４ｈｉ及びＣＤ６２Ｌｌｏ）を使用して定量化された。結果は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の総数として示される。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の肺におけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞の総数（ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定される）を提供する。ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を提供する。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の肺におけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞の総数（ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定される）を提供する。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を提供する。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の肺におけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞の総数（ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定される）を提供する。異なる群（図８に記載）からの動物の肺における非特異的Ｔ細胞炎症性活性化の比較を提供する。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の肺におけるＴ細胞の総数を提供する。Ｔ細胞の数は、フローサイトメトリーを使用して、以下の表現型発現：Ｌｙ６Ｇ－、ＩＡ／ＩＥ－、ＣＤ２４－、ＣＤ１１ｃ－、及びＣＤ１１ｂ－を有する細胞をゲーティングすることによって定量化された。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の肺におけるＴ細胞の総数を提供する。抗原非依存的にＴ細胞を活性化するＰＭＡ／イオノマイシンで肺細胞を刺激することにより、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、肺におけるＴ細胞の数を定量化した。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を提供する。抗原特異的Ｔ細胞の数は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを使用して定量化された。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を提供する。抗原特異的Ｔ細胞の数は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを使用して定量化された。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の数を提供する。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、フローサイトメトリー（ＣＤ４４ｈｉ及びＣＤ６２Ｌｌｏ）を使用して定量化された。結果は、肺における全細胞のパーセンテージとして示される。 「プライムプル」投与戦略（図８に記載）を用いてＥＶで処置した動物の脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の数を提供する。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、フローサイトメトリー（ＣＤ４４ｈｉ及びＣＤ６２Ｌｌｏ）を使用して定量化された。結果は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の総数として示される。 コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤ領域を含むＥＶでワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体応答の比較を提供する。それぞれの群の動物は、ＥＶ構築物の２回の投与を受けた：０日目のプライミング投与と１４日目のブースティング投与。異なる処置群及びそれぞれの投与の投与経路（皮下（ＳＱ）または鼻腔内（ＩＮ）のいずれか）を示す。試験したすべてのＥＶで、ＲＢＤはＰＴＧＦＲＮ（全長または短縮型）のＮ末端に融合し、ＥＶの外側表面に結合された。異なるＥＶには、（ｉ）「ｅｘｏＲＢＤ（ｓ）」＝短縮化されたＰＴＧＦＲＮに融合したＲＢＤ；（ｉｉ）「ＳＴＩＮＧ ｅｘｏＲＢＤ（ｓ）」＝ＥＶの内腔における短縮化されたＰＴＧＦＲＮ＋ＳＴＩＮＧアゴニストに融合したＲＢＤ；（ｉｉｉ）「ＳＴＩＮＧ」＝可溶性ＳＴＩＮＧアゴニスト（すなわち、ＥＶと結合しない）；（ｉｖ）「ｅｘｏＲＢＤ（ｌ）」＝全長ＰＴＧＦＲＮに融合したＲＢＤ；（ｖ）「ＳＴＩＮＧ ｅｘｏＲＢＤ（ｌ）」＝ＥＶの内腔における全長ＰＴＧＦＲＮに融合したＲＢＤ＋ＳＴＩＮＧアゴニスト；または（ｖｉ）「ＰＴＧＦＲＮ」＝ＥＶの内腔におけるＰＴＧＦＲＮ単独（すなわち、ＲＢＤに融合していない）＋ＳＴＩＮＧアゴニストを含む。 コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤ領域を含むＥＶでワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体応答の比較を提供する。それぞれの群の動物は、ＥＶ構築物の２回の投与を受けた：０日目のプライミング投与と１４日目のブースティング投与。最初のワクチン接種後２８日目に異なる処置群からの動物の血清中で検出された抗ＲＢＤ抗体の量を示す。市販の抗ＲＢＤ抗体を陽性対照（「Ａｂ」）として使用し、ＲＢＤのみを含むウェルを陰性対照（「ＲＢＤ」）として使用した。 コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤ領域を含むＥＶでワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体応答の比較を提供する。それぞれの群の動物は、ＥＶ構築物の２回の投与を受けた：０日目のプライミング投与と１４日目のブースティング投与。中和データを示す。群１～５の結果を提供する。異なる群の曲線のそれぞれは、個々の動物を表す。 コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤ領域を含むＥＶでワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体応答の比較を提供する。それぞれの群の動物は、ＥＶ構築物の２回の投与を受けた：０日目のプライミング投与と１４日目のブースティング投与。中和データを示す。群６～１０の結果を提供する。異なる群の曲線のそれぞれは、個々の動物を表す。 コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤを含むＥＶでワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体応答に対するＢ細胞共刺激因子の影響を提供する。それぞれの群からの動物は、皮下に２回ワクチン接種された：記載される異なるワクチン組成物を用いて、０日目にプライミング投与及び１４日目にブースティング投与。さまざまなワクチン接種レジメンには以下が含まれる：（ｉ）「ｅｘｏＲＢＤ＋ＳＴＩＮＧ」＝内腔にＳＴＩＮＧと共ロードされたＰＴＧＦＲＮに融合したＲＢＤ；（ｉｉ）「ｅｘｏＲＢＤ＋ＳＴＩＮＧ／ＰｒＸ－Ｉｔｇｂ１＋ＳＴＩＮＧ」＝ＰＴＧＦＲＮに融合したＲＢＤが内腔にＳＴＩＮＧと共ロードされ、表面に結合したＩｔｇｂ１に対する内腔にＳＴＩＮＧと共ロードされたＴヘルパーペプチドエピトープを有するＰＴＧＦＲＮエキソソームと共投与される；（ｉｉｉ）「ｅｘｏＲＢＤ＋ＳＴＩＮＧ／ＰｒＸ－ＯＶＡ＋ＳＴＩＮＧ」＝ＰＴＧＦＲＮに融合されたＲＢＤが内腔にＳＴＩＮＧと共ロードされ、ＳＴＩＮＧと共ロードされたＰＴＧＦＲＮに融合されたＯＶＡ（オボアルブミン）を発現するエキソソームと共投与される；（ｉｖ）「ｅｘｏＲＢＤ＋ＳＴＩＮＧ／抗ＣＤ４０アゴニスト（ＩＰ）」＝内腔にＳＴＩＮＧと共ロードされたＰＴＧＦＲＮに融合したＲＢＤと腹腔内に投与した可溶性抗ＣＤ４０アゴニスト抗体；（ｖ）「ＰｒＸＳｐｉｋｅ＋ＳＴＩＮＧ」＝ＰＴＧＦＲＮエキソソームの表面に結合し、内腔内でＳＴＩＮＧと共ロードされたコロナウイルススパイクタンパク質；（ｖｉ）「ｒＲＢＤ＋ＳＴＩＮＧ」＝組換えＲＢＤタンパク質＋可溶性ＳＴＩＮＧ；（ｖｉｉ）「ｒＳｐｉｋｅ＋ＳＴＩＮＧ」＝組換えスパイクタンパク質＋ＳＴＩＮＧ；または（ｖｉｉｉ）ＰＢＳ単独。 コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤを含むＥＶでワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体応答に対するＢ細胞共刺激因子の影響を提供する。それぞれの群からの動物は、皮下に２回ワクチン接種された：図１５Ａに記載される異なるワクチン組成物を用いて、０日目にプライミング投与及び１４日目にブースティング投与。最初のワクチン接種後３５日目の皮下投与後の異なる群からの動物の血清中で検出された抗ＲＢＤ抗体の量を示す。 コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤを含むＥＶでワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体応答に対するＢ細胞共刺激因子の影響を提供する。それぞれの群からの動物は、皮下に２回ワクチン接種された：図１５Ａに記載される異なるワクチン組成物を用いて、０日目にプライミング投与及び１４日目にブースティング投与。皮下投与後の中和データを示す。群１～５の結果を提供する。異なる群の曲線のそれぞれは、個々の動物を表す。 コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤを含むＥＶでワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体応答に対するＢ細胞共刺激因子の影響を提供する。それぞれの群からの動物は、皮下に２回ワクチン接種された：図１５Ａに記載される異なるワクチン組成物を用いて、０日目にプライミング投与及び１４日目にブースティング投与。皮下投与後の中和データを示す。群６～１０の結果を提供する。異なる群の曲線のそれぞれは、個々の動物を表す。 本明細書に記載のＥＶがインビボで抗原特異的抗体を誘導する能力に対するミョウバン及びＣｐＧアジュバントの効果を示す。投与スケジュール及び実験計画を示す表を提供する。 明細書に記載のＥＶがインビボで抗原特異的抗体を誘導する能力に対するミョウバン及びＣｐＧアジュバントの効果を示す。最初の処置後１４日目の異なる処置群からの動物の血清中の抗ＯＶＡ ＩｇＧレベルの比較を提供する。 明細書に記載のＥＶがインビボで抗原特異的抗体を誘導する能力に対するミョウバン及びＣｐＧアジュバントの効果を示す。最初の処置後２８日目の異なる処置群からの動物の血清中の抗ＯＶＡ ＩｇＧレベルの比較を提供する。 明細書に記載のＥＶがインビボで抗原特異的抗体を誘導する能力に対するミョウバン及びＣｐＧアジュバントの効果を示す。最初の処置後４２日目の異なる処置群からの動物の血清中の抗ＯＶＡ ＩｇＧレベルの比較を提供する。 明細書に記載のＥＶがインビボで抗原特異的抗体を誘導する能力に対するミョウバン及びＣｐＧアジュバントの効果を示す。最初の処置後１４日目の異なる処置群からの動物の血清中の抗ＯＶＡ ＩｇＭレベルの比較を提供する。 明細書に記載のＥＶがインビボで抗原特異的抗体を誘導する能力に対するミョウバン及びＣｐＧアジュバントの効果を示す。最初の処置後２８日目の異なる処置群からの動物の血清中の抗ＯＶＡ ＩｇＭレベルの比較を提供する。 明細書に記載のＥＶがインビボで抗原特異的抗体を誘導する能力に対するミョウバン及びＣｐＧアジュバントの効果を示す。最初の処置後４２日目の異なる処置群からの動物の血清中の抗ＯＶＡ ＩｇＭレベルの比較を提供する。 コロナウイルス抗原を含むようにＥＶを改変するための、本明細書に記載のプラグアンドプレイシステムの使用を示す。ＡＬＦＡタグ付きＲＢＤタンパク質と、ＥＶの外側表面上の足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）に融合されたＡＬＦＡナノボディ（ＮｂＡＬＦＡ）との間の相互作用を示す概略図を提供する（「Ｅｘｏ－ＡＬＦＡ－ＲＢＤ」）。 コロナウイルス抗原を含むようにＥＶを改変するための、本明細書に記載のプラグアンドプレイシステムの使用を示す。固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによるＲＢＤ－ＡＬＦＡｔａｇ－Ｈｉｓタンパク質の精製を示す。 コロナウイルス抗原を含むようにＥＶを改変するための、本明細書に記載のプラグアンドプレイシステムの使用を示す。精製されたＲＢＤ－ＡＬＦＡｔａｇ－Ｈｉｓタンパク質の純度及び分子量を実証するＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。 コロナウイルス抗原を含むようにＥＶを改変するための、本明細書に記載のプラグアンドプレイシステムの使用を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定されたＮｂＡＬＦＡ ＥＶ上へのＲＢＤ－ＡＬＦＡｔａｇタンパク質のローディングを示す。 コロナウイルス抗原を含むようにＥＶを改変するための、本明細書に記載のプラグアンドプレイシステムの使用を示す。ウエスタンブロットによって測定されたＮｂＡＬＦＡ ＥＶ上へのＲＢＤ－ＡＬＦＡｔａｇタンパク質のローディングを示す。 コロナウイルス抗原を含むようにＥＶを改変するための、本明細書に記載のプラグアンドプレイシステムの使用を示す。図１７Ｄ及び図１７Ｅに示される結果の定量的比較を提供する。 組換えＲＢＤタンパク質またはＥＶの外側表面上に提示されたＲＢＤタンパク質でワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体レベルの比較を提供する。ＲＢＤタンパク質は、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に直接融合された。動物に以下のうちの１つをワクチン接種した：（ｉ）「ｅｘｏＲＢＤ」＝ＰＴＧＦＲＮに直接融合したＲＢＤ；（ｉｉ）「ｒＲＢＤ＋ＳＴＩＮＧ」＝組換えＲＢＤタンパク質＋可溶性ＳＴＩＮＧアゴニスト；（ｉｉｉ）「ｒＲＢＤ＋Ｅｘｏ」＝組み換えＲＢＤタンパク質＋ＥＶ単独（すなわち、ＲＢＤはＥＶに結合しない）；（ｉｖ）ＰＢＳ単独。投与されたＲＢＤの量は、それぞれのバーに表示される。 組換えＲＢＤタンパク質またはＥＶの外側表面上に提示されたＲＢＤタンパク質でワクチン接種された動物における抗ＲＢＤ抗体レベルの比較を提供する。ＲＢＤタンパク質は、本明細書に記載のＡＬＦＡプラグアンドプレイシステムを使用してコンジュゲートされた。動物は以下のうちの１つをワクチン接種した：（ｉ）「ＮｂＡＬＦＡ Ｅｘｏ＋ＲＢＤ－ＡＬＦＡｔａｇ」＝ＡＬＦＡプラグアンドプレイシステムを使用してＰＴＧＦＲＮにコンジュゲートされたＲＢＤ；（ｉｉ）「ｒＲＢＤ」＝組み換えＲＢＤタンパク質単独；（ｉｉｉ）「ｒＲＢＤ」＝組み換えＲＢＤタンパク質＋可溶性ＳＴＩＮＧアゴニスト；（ｉｖ）「Ｅｘｏ＋ｒＲＢＤ」＝組み換えＲＢＤタンパク質＋ＥＶ単独（すなわち、ＲＢＤはＥＶと結合していない）；及び（ｖ）ＰＢＳ単独。投与されたＲＢＤの量は、それぞれのバーに表示される。 コロナウイルスのＲＢＤ及びＴ細胞エピトープを本明細書に記載のＥＶに提示することができる異なる方法の概略図を提供する。ＲＢＤタンパク質は、全長ＰＴＧＦＲＮ（図Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩを参照されたい）またはＰＴＧＦＲＮ断片（図ＩＶ及びＶを参照されたい）のＮ末端に融合される。コロナウイルスのＴ細胞エピトープは、コンカテマータンパク質抗原（図Ｉを参照されたい）またはコンカテマーペプチド抗原（図ＩＩ～Ｖを参照されたい）としてＥＶの内腔表面に提示される。 コロナウイルスのＲＢＤ及びＴ細胞エピトープを本明細書に記載のＥＶに提示することができる異なる方法の概略図を提供する。ＲＢＤタンパク質は、全長ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合され、単一の汎ＳＡＲＳ Ｔ細胞エピトープを含む単一のペプチド（例えば、スパイク（Ｓ）タンパク質、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、または膜（Ｍ）タンパク質）は、ＰＴＧＦＲＮのＣ末端に融合した内腔表面上に提示される。 コロナウイルスのＲＢＤ及びＴ細胞エピトープを本明細書に記載のＥＶに提示することができる異なる方法の概略図を提供する。ＲＢＤタンパク質が全長ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合され、コロナウイルスのＳ２（左画像）及びＯＲＦ３ａ（右画像）タンパク質が内腔表面上に提示される（例えば、ＢＡＳＰ－１部分またはＰＴＧＦＲＮのＣ末端に融合される）。 ウエスタンブロットによって測定された図１９Ａ（すなわち、図Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶ）に記載のＥＶに含まれるＴ細胞エピトープの発現を示す。 ＨｉＢｉＴアッセイによって測定された図１９Ａ（すなわち、図Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶ）に記載のＥＶに含まれるＴ細胞エピトープの発現を示す。 本明細書に記載のＥＶがコロナウイルス抗原の複数のコピーを発現できることを示す。ＥＶの外側表面上の全長ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合されたＲＢＤタンパク質（図Ｉ）またはＰＴＧＦＲＮ断片のＮ末端に融合された全スパイクタンパク質（図ＩＩ及びＩＩＩ）の模式図を提供する。図ＩとＩＩＩでは、ＨｉＢｉＴはＰＴＧＦＲＮのＣ末端にコンジュゲートされた。 本明細書に記載のＥＶがコロナウイルス抗原の複数のコピーを発現できることを示す。ＨｉＢｉＴアッセイを用いて測定されたＥＶにおけるコンストラクトの発現レベルを示す。 本明細書に記載のＥＶを改変して、ＥＶの外側表面上または内腔表面上のいずれかにコロナウイルスのＴ細胞エピトープを含むことができることを示す。（１～４）は、全長ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合されたＲＢＤタンパク質（１）、及び全長ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合された８個のＴ細胞エピトープペプチド（８量体）からなるコンカテマーの外側表面発現（２）、または完全長ＰＴＧＦＲＮのＣ末端への融合による８量体コンカテマーの内腔発現（３）；またはＢＡＳＰ－１への融合による内腔発現（４）の概略図を提供する。（５～１０）は、４量体コンカテマーペプチド（群１及び２）として発現された上記（２～４）に記載された８量体コンカテマーの概略図を提供する。それぞれ、表面発現のために全長ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合される（５及び８）、または、全長ＰＴＧＦＲＮのＣ末端への融合により内腔内で発現される（６及び９）、またはＢＡＳＰ－１への融合による（５及び１０）。それぞれ、ＦＬＡＧタグとＨｉＢｉＴをＰＴＧＦＲＮのＣ末端（１、２及び５）または８量体（３及び４）または４量体（６、７、９及び１０）のＣ末端のいずれかにコンジュゲートした。 本明細書に記載のＥＶを改変して、ＥＶの外側表面上または内腔表面上のいずれかにコロナウイルスのＴ細胞エピトープを含むことができることを示す。ＨｉＢｉＴを使用して測定されたＥＶ中の構築物の発現レベルを示す。 本明細書に記載のＥＶを改変して、ＥＶの外側表面上または内腔表面上のいずれかにコロナウイルスのＴ細胞エピトープを含むことができることを示す。ＨｉＢｉｔタグに対するウエスタンブロットを使用して測定されたＥＶ中の構築物の発現レベルを示す。 Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ腫瘍モデルにおける、本明細書に記載のＥＶの抗腫瘍効果を示す。投与スケジュール及び実験計画を提供する。 Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ腫瘍モデルにおける、本明細書に記載のＥＶの抗腫瘍効果を示す。処置後のさまざまな時点での異なる処置群からの動物における腫瘍体積を提供する。 Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ腫瘍モデルにおける、本明細書に記載のＥＶの抗腫瘍効果を示す。異なる処置群からの動物の生存率を提供する。 Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ腫瘍モデルにおける、本明細書に記載のＥＶの抗腫瘍効果を示す。動物における腫瘍増殖速度を提供する。 本開示のＥＶベースのワクチンの調製に関与するプロセス全体を図示する概略図を示す。 ＰＴＧＦＲＮタンパク質のＮ末端に融合されたアクセプタードメインを含むように改変されたエキソソームを示す。アクセプタードメインには、（１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ひし形）、（２）ＣｆａＣ（四角）、及び（３）ＡＬＦＡＮｂ（三角）が含まれていた。エキソソーム産生中にＰＴＧＦＲＮに融合したそれぞれのアクセプタードメインを過剰発現するように操作された安定したＨＥＫ２９３細胞株の細胞増殖を示す。 ＰＴＧＦＲＮタンパク質のＮ末端に融合されたアクセプタードメインを含むように改変されたエキソソームを示す。アクセプタードメインには、（１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ひし形）、（２）ＣｆａＣ（四角）、及び（３）ＡＬＦＡＮｂ（三角）が含まれていた。図２５Ａに示されるのと同じ期間にわたる安定細胞プールの生存率を示す。 ＰＴＧＦＲＮタンパク質のＮ末端に融合されたアクセプタードメインを含むように改変されたエキソソームを示す。アクセプタードメインには、（１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ひし形）、（２）ＣｆａＣ（四角）、及び（３）ＡＬＦＡＮｂ（三角）が含まれていた。イオジキサノール密度勾配超遠心法を用いたアクセプタードメイン－ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質を含むエキソソームの精製の成功を示す。 ＰＴＧＦＲＮタンパク質のＮ末端に融合されたアクセプタードメインを含むように改変されたエキソソームを示す。アクセプタードメインには、（１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ（ひし形）、（２）ＣｆａＣ（四角）、及び（３）ＡＬＦＡＮｂ（三角）が含まれていた。操作されていないエキソソーム（ＷＴ）と比較したそれぞれのアクセプタードメインの導入遺伝子発現を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を提供する。 ドナードメインに融合したＮａｎｏＬｕｃの、ＰＴＧＦＲＮに融合した同族のアクセプタードメインを発現するエキソソームへのローディングを評価するためのワークフローを提供する。未結合のＮａｎｏＬｕｃは超遠心分離（ＵＣ）によって除去され、得られたエキソソームはさまざまなアッセイによって分析される。 ＡＬＦＡタグに融合したＮａｎｏＬｕｃでＡＬＦＡナノボディ（ＡＬＦＡＮｂ）を過剰発現するエキソソームを標識するためのワークフローを提供する。 ＮａｎｏＬｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇとＡＬＦＡＮｂ発現エキソソームとの結合を示すロード後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及びＵＣクリーンアップを提供する。 ＡＬＦＡタグまたはポリヒスチジンタグに融合したＮａｎｏＬｕｃの標準曲線を提供する。 （ｉ）ＡＬＦＡタグに融合したＮａｎｏＬｕｃまたは（ｉｉ）ポリヒスチジンタグに融合したＮａｎｏＬｕｃの、改変されたエキソソーム上へのローディングの定量分析を提供する。定量値は、図２８Ａからの標準曲線を使用して決定された。バックグラウンドのヒスチジンタグ発現に対する倍率変化が注目される。 経時的なＡＬＦＡ－ＮａｎｏＬｕｃ相互作用の安定性を評価するためのワークフローを提供する。 ポリヒスチジンタグに融合したＮａｎｏＬｕｃと比較したＡＬＦＡ－ＮａｎｏＬｕｃ発現の安定性の定量分析を提供する。 ＣｆａＣを過剰発現するエキソソームをＣｆａＮに融合したＮａｎｏＬｕｃで標識するためのワークフローを提供する。 ＮａｎｏＬｕｃ－ＣｆａＮとＣｆａＣ発現エキソソームとの結合を示すロード後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及びＵＣクリーンアップを提供する。 ＣｆａＮまたはポリヒスチジンタグに融合したＮａｎｏＬｕｃの標準曲線を提供する。 （ｉ）ＣｆａＮに融合したＮａｎｏＬｕｃまたは（ｉｉ）ポリヒスチジンタグに融合したＮａｎｏＬｕｃの、改変されたエキソソーム上へのローディングの定量分析を提供する。定量値は、図３１Ａからの標準曲線を使用して決定された。バックグラウンドのヒスチジンタグ発現に対する倍率変化が注目される。 ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを過剰発現するエキソソームをＳｐｙＴａｇに融合したＮａｎｏＬｕｃで標識するためのワークフローを提供する。 ＮａｎｏＬｕｃ－ＳｐｙＴａｇとＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ発現エキソソームとの結合を示すロード後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及びＵＣクリーンアップを提供する。 ＳｐｙＴａｇまたはポリヒスチジンタグに融合したＮａｎｏＬｕｃの標準曲線を提供する。 （ｉ）ＳｐｙＴａｇに融合したＮａｎｏＬｕｃまたは（ｉｉ）ポリヒスチジンタグに融合したＮａｎｏＬｕｃの、改変されたエキソソーム上へのローディングの定量分析を提供する。定量値は、図３３Ａからの標準曲線を使用して決定された。バックグラウンドのヒスチジンタグ発現に対する倍率変化が注目される。 改変されたエキソソームにおける以下のドナードメインのうちの１つに融合されたＮａｎｏＬｕｃのローディングの比較を提供する：（ｉ）ＡＬＦＡタグ、（ｉｉ）ＣｆａＮ、及び（ｉｉｉ）ＳｐｙＴａｇ。 エキソソーム膜に結合する足場タンパク質への目的の部分の表面コンジュゲーションを示す概略図を示す。 エキソソームにコンジュゲートされた小分子及びオリゴヌクレオチドの機構的特徴を列挙する表を示す。ｐＡＢ－ｐＮＰ：ｐ－アミノベンジルアルコールｐ－ニトロフェニルカーボネート；ＤＢＣＯ：ジベンジルシクロオクチン。 中間体としての脂質リンカー反応性基を列挙した表を示す。リンカーの反応基と、目的の部分のそれぞれの官能基が列挙されている。 小分子であるＭＣＣ－９５０のコンジュゲーションの例を示す。ＭＣＣ－９５０－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－マレイミドコンジュゲーションを示す。 小分子であるＭＣＣ－９５０のコンジュゲーションの例を示す。ＭＣＣ－９５０－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－メタクリレートコンジュゲーションを示す。 小分子であるＭＣＣ－９５０のコンジュゲーションの例を示す。ＭＣＣ－９５０－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ピリジニルジスルフィドコンジュゲーションを示す。 小分子であるＭＣＣ－９５０のコンジュゲーションの例を示す。エキソソーム結合足場タンパク質上のスルフヒドリル基のコンジュゲーション部位を示す概略図を示す。 オリゴヌクレオチド／タンパク質コンジュゲーションの例を示す。オリゴマレイミドコンジュゲーションと、エキソソーム結合足場タンパク質上のスルフヒドリル基のコンジュゲーション部位を示す概略図を示す。 オリゴヌクレオチド／タンパク質コンジュゲーションの例を示す。オリゴ－ＮＨＳエステルコンジュゲーションと、エキソソーム結合足場タンパク質上の第一級アミン基上のコンジュゲーション部位を示す概略図を示す。 エキソソームの足場タンパク質上の官能基とその活性化、コンジュゲートするタンパク質／ペプチド上の官能基、及び結合の分解性を列挙する表を示す。官能基が同じであるため、タンパク質からタンパク質／ペプチドへのコンジュゲーションの選択肢はクリックケミストリーに限定される。ＤＢＣＯ：ジベンジルシクロオクチン。 タンパク質／ペプチドコンジュゲーション（シッフ塩基が有効）の例を示す。 タンパク質／ペプチドコンジュゲーション（クリックケミストリー）の例を示す。 本明細書に記載のＡＬＦＡプラグアンドプレイシステムを備えるＥＶの概略図を提供する。ＡＬＦＡナノボディ（ＮｂＡＬＦＡ）は、ＥＶ（「ＮｂＡＬＦＡ ＥＶ」）の外側表面上の足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）に融合される。結晶構造は、ＮｂＡＬＦＡとＡＬＦＡタグの安定した非共有相互作用を示している。 本明細書に記載のＡＬＦＡプラグアンドプレイシステムを備えるＥＶの概略図を提供する。ＮｂＡＬＦＡ ＥＶの外側表面上への目的の部分（ＭＯＩ）のローディングを示す。本明細書にさらに記載されるように、目的の部分はＡＬＦＡタグに融合され、次いで、ＮｂＡＬＦＡ ＥＶと混合され、ＮｂＡＬＦＡ ＥＶの外側表面への目的のＡＬＦＡタグ付加部分の安定した結合をもたらす。ＥＶには、同じ目的の部分（上の図を参照）または異なる目的の部分の混合物（下の図を参照）をロードできる。 ＮｂＡＬＦＡ ＥＶに複数の目的の部分を同時にロードできることを示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（上）及びウエスタンブロット（下）の結果を提供する。野生型ＥＶまたはＮｂＡＬＦＡ ＥＶを、１０μｇのＮＬｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇまたはＡＬＦＡタグに融合したマウスＩＬ－１２のモル当量（「ｍＩＬ１２－ＡＬＦＡｔａｇ」）と混合した。
本開示は、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ウイルス及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに由来する１つ以上の抗原を送達する操作されたＥＶを対象とする。ＥＶプラットフォームは、１つ以上の抗原の内腔発現と、１つ以上の抗原の表面発現を可能にし、モジュラーワクチン接種システムを作成するように設計される。さまざまなアジュバントをＥＶに組み込むことで、さまざまな抗原に対する免疫応答を強化できる。操作されたＥＶは、１つ以上のペイロードを含むことができ、ＥＶの少なくとも１つの特性（例えば、本明細書に開示されるものなど）及びその使用を改善することができる。いくつかの態様では、１つ以上のペイロードは、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーターを含む。特定の態様では、ＥＶは、１つ以上の追加の部分（例えば、標的化部分）を含む。いくつかの態様では、１つ以上のペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）、及び／または１つ以上の追加の部分（例えば、標的化部分）は、ＥＶの表面またはＥＶの内腔表面の１つ以上の足場部分に付着（または連結）させることができる。さまざまな態様の非限定的な例が、本開示に示されている。
Ｉ． 定義
本記載を、より容易に理解することができるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体を通して記載されている。
用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、その実態の１つまたは複数を指し、例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を表すと理解されることは留意されたい。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書中では交換可能に用いられる。
さらに、「及び／または」は、本明細書で使用される場合、他のものを伴ってまたは伴わずに、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示として受け取られるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」等の語句で使用されるとき、「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」等の語句で使用されるとき、「及び／または」という用語は、次の態様の各々を包含することを意図する：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
それぞれの態様が「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（～を含む）」なる文言によって記述される場合、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（～からなる）」及び／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（～から本質的になる）」によって記述される以外の点では同様の他の態様も提供されるものと理解される。
別段の定義がなされないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で承認された形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含むものとする。特に明記しない限り、ヌクレオチド配列は５’から３’の方向で左から右に書かれている。アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシの方向で記述される。本明細書中で提供する見出しは、本明細書全体を参照することによって有し得る本開示のさまざまな態様を制限するものではない。したがって、すぐ下に定義されている用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義されている。
「約」という用語は、本明細書では、おおよそ、大体、おおよそ、またはその範囲内の意味で使用される。用語「約」を数値範囲と併用して使用する場合、この用語は、記載の数値の境界を上下に引き伸ばすことによって、その範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、例えば１０パーセント、上または下（より高いまたはより低い）の分散によって、記載された値の上下に数値を修正することができる。
本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」または「ＥＶ」という用語は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有するすべての膜結合小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞）を含む。一般的に、細胞外小胞は直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内にある場合、細胞外小胞の外側表面に提示される場合、及び／または膜を貫通している場合、のいずれかの形で、さまざまなマクロ分子ペイロードを含むことができる。いくつかの態様では、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。特定の態様では、細胞外小胞は、足場部分を含む。例として、かつ非限定的に、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的操作または間接的操作による細胞由来の小胞（例えば、連続押出またはアルカリ溶液での処理による）、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、直接原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合による）を含む。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植された組織もしくは臓器、原核細胞または真核細胞、及び／または培養された細胞に由来するものであってよい。いくつかの態様では、細胞外小胞は、１つ以上の導入遺伝子産物を発現する細胞によって生成される。
本明細書中で使用される場合、「エキソソーム」という用語は、直径が２０～３００ｎｍ（例えば、４０～２００ｎｍ）の細胞外小胞を指す。エキソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を囲む膜を含み、いくつかの態様では、直接の原形質膜出芽によって、または後期エンドソームもしくは多小胞体と原形質膜との融合によって、細胞（例えば、プロデューサー細胞）から生成され得る。特定の態様では、エキソソームは足場部分を含む。以下に記載するように、エキソソームは、プロデューサー細胞に由来することができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、１つ以上の導入遺伝子産物を発現する細胞によって産生される。特に明記しない限り、「細胞外小胞」及び「エキソソーム」という用語は交換可能に使用することができる。
本明細書中で使用される場合、「ナノ小胞」という用語は、直径が２０～２５０ｎｍ（例えば、３０～１５０ｎｍ）の細胞外小胞を指し、細胞（例えば、プロデューサー細胞）から、操作なしでは細胞によってナノ小胞が生成されないような、直接または間接の操作によって生成される。ナノ小胞を産生するための細胞の適切な操作には、連続押出、アルカリ溶液での処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ナノ小胞の産生は、プロデューサー細胞の破壊を生じ得る。いくつかの態様では、本明細書に記載のナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合により、細胞に由来する小胞を実質的に含まない。いくつかの態様では、ナノ小胞は、足場部分を含む。事前にプロデューサー細胞に由来したナノ小胞は、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づいてプロデューサー細胞から単離され得る。
本明細書で使用される場合、用語「～と結合する」は、本開示のＥＶの文脈で使用される場合、ＥＶとの物理的相互作用を指す。例えば、目的の部分（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）がＥＶに結合している場合、目的の部分はＥＶの外側表面に連結され、ＥＶの内腔表面、及び／またはＥＶの内腔に連結されている。本明細書に記載されるように、目的の部分は、ＥＶの外側表面及び／または内腔表面に直接連結され得る。いくつかの態様では、目的の部分は、本明細書に記載のものなどの１つ以上の足場／固定部分を介して、外側表面及び／または内腔表面に連結されている。したがって、目的の部分がＥＶと結合していない場合、いくつかの態様では、目的の部分は可溶型である。
本明細書で使用される場合、「表面を操作されたＥＶ」（例えば、足場Ｘで操作されたＥＶ）という用語は、膜またはＥＶの表面がその組成において改変されているため、操作されたＥＶの表面が操作される前のＥＶまたは天然に存在するＥＶの表面とは異なるＥＶを指す。操作は、ＥＶの表面上、またはＥＶの膜内に対して行うことができ、その結果、ＥＶの表面が変化する。例えば、膜は、そのタンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が改変される。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、あらかじめまたは同時に改変した細胞から産生させることによって、変更することができる。具体的には、組成は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作によってあらかじめ改変した細胞から産生させることによって、変更することができる。いくつかの態様では、表面を操作されたＥＶは、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶが天然に発現しないタンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含み、これらは、ＥＶの表面に露出し得るか、またはＥＶの表面に露出した部分の固定点（接着部）であり得る。他の態様では、表面を操作されたＥＶは、天然のエキソソームタンパク質（例えば、足場Ｘ）またはその断片もしくはバリアントのより高い発現（例えば、より多い数）を含み、これらは、ＥＶの表面に露出し得るか、またはＥＶの表面に露出した部分の固定点（接着部）であり得る。
本明細書で使用される場合、「内腔を操作されたＥＶ」（例えば、足場Ｙで操作されたＥＶ）という用語は、膜またはＥＶの内腔がその組成において改変されているため、操作されたＥＶの内腔が操作される前のＥＶまたは天然に存在するＥＶの内腔とは異なるＥＶを指す。操作は、ＥＶの内腔または膜内で直接行うことができ、その結果、ＥＶの内腔が変化する。例えば、膜は、そのタンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が改変され、その結果、ＥＶの内腔が改変される。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法によって、あらかじめ改変した細胞から産生させることによって、変更することができる。具体的には、組成は、遺伝子操作によって、または遺伝子操作によってあらかじめ改変した細胞から産生させることによって、変更することができる。いくつかの態様では、内腔を操作されたエキソソームは、外因性タンパク質（すなわち、ＥＶが天然に発現しないタンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含み、これらは、ＥＶの内腔に露出し得るか、またはＥＶの内部層に露出した部分の固定点（接着部）であり得る。いくつかの態様では、内腔を操作されたＥＶは、天然のエキソソームタンパク質（例えば、足場Ｘもしくは足場Ｙ）またはその断片もしくはバリアントのより高い発現を含み、これらは、エキソソームの内腔に露出し得るか、またはエキソソームの内腔に露出した部分の固定点（接着部）であり得る。
「改変された」という用語は、本明細書に記載のＥＶと関連して使用される場合、改変されたＥＶが天然に存在するＥＶとは異なるような、ＥＶ及び／またはそのプロデューサー細胞の改変または操作を指す。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変されたＥＶは、天然に存在するＥＶの膜と比較して、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が異なる膜を含む（例えば、膜がより高い密度または多くの数の天然のエキソソームタンパク質を含む、及び／または膜がエキソソームには天然にみられないタンパク質（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）を含む）。特定の態様では、膜に対するそのような改変は、ＥＶ（例えば、本明細書に記載の表面を操作されたＥＶ）の外側表面を変化させる。特定の態様では、膜に対するそのような改変は、ＥＶ（例えば、本明細書に記載の内腔を操作されたＥＶ）の内腔を変化させる。
本明細書で使用される場合、「足場部分」という用語は、ペイロードまたは任意の他の目的の化合物（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）をＥＶに、ＥＶの内腔表面上または外側表面上のいずれかに固定するため固定するのに使用できる分子を指す。特定の態様では、足場部分は合成分子を含む。いくつかの態様では、足場部分は、非ポリペプチド部分を含む。他の態様では、足場部分は、ＥＶに天然に存在する脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。いくつかの態様では、足場部分は、ＥＶに天然に存在しない脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。特定の態様では、足場部分は足場Ｘである。いくつかの態様では、足場部分は足場Ｙである。さらなる態様では、足場部分は足場Ｘと足場Ｙの両方を含む。本開示で使用できる他の足場の非限定的な例としては以下が挙げられる：アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；ネプリライシン、ＡＫＡ膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）；ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）；ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ。
本明細書で使用される場合、「足場Ｘ」という用語は、エキソソームの表面で最近同定されたエキソソームタンパク質を指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１９５，２９０号を参照されたい。足場Ｘタンパク質の非限定的な例としては、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（「ＰＴＧＦＲＮタンパク質」）；ベイシジン（「ＢＳＧタンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８タンパク質」）；インテグリンβ１（「ＩＴＧＢ１タンパク質」）；インテグリンα４（「ＩＴＧＡ４タンパク質」）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２タンパク質」）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ２タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ３タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ４タンパク質」、「ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂタンパク質」）が挙げられる。いくつかの態様では、足場Ｘタンパク質は、タンパク質全体またはその断片（例えば、機能的断片、例えば、ＥＶの外側表面上または内腔表面上に別の部分を固定することができる最小断片）であり得る。いくつかの態様では、足場Ｘは、部分（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）をエキソソームの外側表面または内腔表面に固定することができる。
本明細書で使用される場合、「足場Ｙ」という用語は、エキソソームの内腔で新たに同定されたエキソソームタンパク質を指す。例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１６７９号を参照されたい。これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。足場Ｙタンパク質の非限定的な例としては、以下が挙げられる：ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳタンパク質」）；ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質」）；及び脳酸可溶性タンパク質１（「ＢＡＳＰ１タンパク質」）。いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、タンパク質全体またはその断片（例えば、機能的断片、例えば、エキソソームの内腔表面に部分を固定することができる最小断片）であり得る。いくつかの態様では、足場Ｙは、部分（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）をＥＶの内腔表面に固定することができる。
本明細書で使用される場合、タンパク質（例えば、治療用タンパク質、足場Ｘ、または足場Ｙ）の「断片」という用語は、天然に存在する配列よりも短いタンパク質のアミノ酸配列、天然に存在するタンパク質と比較してタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端が削除された、もしくはその任意の部分が削除されたタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、「機能的断片」という用語は、タンパク質機能を保持したタンパク質断片を指す。したがって、いくつかの態様では、足場Ｘタンパク質の機能的断片は、部分をＥＶの内腔表面上または外側表面上に固定する能力を保持している。同様に、特定の態様では、足場Ｙタンパク質の機能的断片は、部分をＥＶの内腔表面上に固定する能力を保持している。断片が機能的断片であるかどうかは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及び断片と、例えばＧＦＰなどの自家蛍光タンパク質との融合を含む、ＥＶのタンパク質含有量を決定するための任意の周知の方法によって評価することができる。特定の態様では、足場Ｘタンパク質の機能的断片は、天然に存在する足場Ｘタンパク質の能力、例えば、部分を固定する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％を保持する。いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質の機能的断片は、天然に存在する足場Ｙタンパク質の能力、例えば、別の分子を固定する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％を保持する。
本明細書で使用される場合、分子（例えば、機能性分子、抗原、足場Ｘ、及び／または足場Ｙ）の「バリアント」という用語は、当該技術分野で既知の方法により比較した場合に、別の分子と特定の構造的及び機能的同一性を共有する分子を指す。例えば、あるタンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再構成を含み得る。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義され、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、ポリペプチドのアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置換される場合、その置換は保存的であるとみなされる。別の態様では、一連のアミノ酸は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる、構造的に類似した一連のもので保存的に置換され得る。
２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「配列同一パーセント」または「同一パーセント」という用語は、比較ウインドウにわたってそれぞれの配列によって共有される同一の一致位置の数を指し、２個の配列の最適なアラインメントを得るために導入する必要のある付加または欠失（すなわちギャップ）を考慮したものである。一致する位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的配列と参照配列の両方に存在する任意の位置である。ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸ではないため、標的配列に存在するギャップはカウントされない。同様に、参照配列のヌクレオチドまたはアミノ酸ではなく、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされるため、参照配列に存在するギャップはカウントされない。
配列同一性のパーセンテージ（％）は、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両方の配列に存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得て、一致する位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、その結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。配列同士の比較及び２個の配列間の配列同一パーセントの決定は、オンラインでの使用とダウンロード用に容易に入手可能なソフトウェアを使用して行うことができる。適切なソフトウェアプログラムは、さまざまな供給源から入手可能であり、タンパク質とヌクレオチド配列の両方のアライメント用のものがある。配列同一性パーセントを決定するための１つの適切なプログラムはｂｌ２ｓｅｑであり、これは米国政府の国立生物工学情報センターＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手できるプログラムのＢＬＡＳＴスイートの一部である。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して２つの配列間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列の比較に使用され、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列の比較に使用される。他の適切なプログラムは、例えば、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であり、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａの欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）からも入手可能な、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの参照配列とアラインメントする単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの標的配列内の異なる領域は、それぞれが、それら固有の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセント値は最も近い小数に四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数である点に留意されたい。
当業者であれば、配列同一パーセントを計算するための配列アラインメントの生成が、一次配列データによってのみ行われるバイナリー配列間比較に限定されない点は理解されよう。配列アラインメントは、複数の配列アラインメントから導出することができる。複数の配列アラインメントを生成するための１つの適切なプログラムは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２であり、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手できる。別の適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手できるＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、例えばＥＢＩから代替的に入手可能である。
配列アラインメントは、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、または系統発生データなどの異種供給源からのデータと統合することによって生成できることも理解されるであろう。異種データを統合して多重配列アラインメントを生成する適当なプログラムとしてｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手できるか、代替的に例えばＥＢＩからも入手できるＴ－Ｃｏｆｆｅｅがある。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的なアラインメントは、自動または手動のいずれかでキュレートすることができる点も理解されよう。
ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、またはその両方に改変を含むことができる。一態様では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの特性または活性を変化させない改変を含む。別の態様では、ヌクレオチドバリアントは、遺伝コードの縮重によるサイレント置換によって生成される。他の態様では、バリアントは、５～１０個、１～５個、または１～２個のアミノ酸が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されている。ポリヌクレオチドバリアントは、さまざまな理由で、例えば特定の宿主のコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡのコドンを他のもの、例えばＥ． ｃｏｌｉなどの細菌宿主に変更する）ために生成することができる。
タンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用してバリアントを生成して、ポリペプチドの特性を改善または改変することができる。例えば、生物学的機能を実質的に失うことなく、分泌タンパク質のＮ末端またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失させることができる。全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２９８４－２９８８（１９９３）は、３、８、または２７個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失した後でもヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロン ガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０アミノ酸残基を削除した後、最大１０倍高い活性を示した（すべての内容が参照により本明細書に組み込まれるＤｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８））。
さらに、多くの証拠は、バリアントがしばしば天然に存在するタンパク質と同様の生物学的活性を保持していることを示している。例えば、Ｇａｙｌｅ及び共同研究者（全体が参照により本明細書に組み込まれるＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範な変異分析を実施した。彼らは、ランダムな変異導入を使用して、分子の全長にわたってバリアントあたり平均２．５アミノ酸の変化を持つ３，５００を超える個々のＩＬ－１ａ変異体を生成した。複数の変異を、考えられるすべてのアミノ酸位置で調べた。研究者らは、「ほとんどの分子は、［結合または生物学的活性］にほとんど影響を及ぼさずに改変できる」ことを発見した（要約を参照されたい）。実際、調べた３，５００を超えるヌクレオチド配列のうち、２３のユニークなアミノ酸配列のみが、野生型とは活性が大きく異なるタンパク質を生成した。
上述のように、ポリペプチドバリアントには、例えば、改変されたポリペプチドが含まれる。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストリル化、酸化、ＰＥＧ化（全体が参照により本明細書に組み込まれるＭｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセム化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化が挙げられる。いくつかの態様では、足場Ｘ及び／または足場Ｙは、任意の便宜の良い位置で改変される。
本明細書で使用される場合、本明細書に記載の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、標的化部分、親和性リガンド、及び／または足場部分）がＥＶで「発現する」場合、それは、分子がＥＶ内またはＥＶ上に存在することを意味する。本明細書に記載されるように、ＥＶは、その外側表面上、その内腔表面上、内腔、またはそれらの組み合わせで目的の分子を発現することができる。いくつかの態様では、分子は、ＥＶが目的の分子を発現するように、プロデューサー細胞に外因的に導入され得るか、またはＥＶに直接導入され得る。いくつかの態様では、目的の分子は、ＥＶとは別に産生され得、次いで、ＥＶが分子を発現するように、ＥＶに存在する部分にコンジュゲートまたは連結され得る。例えば、いくつかの態様では、抗原（例えば、コロナウイルスのスパイクＳタンパク質、例えば、スパイクＳタンパク質の受容体結合ドメインに由来する）は、本明細書に開示される親和性リガンドに融合され得る。次に、抗原－親和性リガンド融合物を、親和性リガンドを介してＥＶの表面上に発現する足場部分に連結またはコンジュゲートさせることができる。ＥＶ内またはＥＶ上で目的の分子を発現させる異なる方法に関する追加の開示は、本開示の他の箇所に記載されている。
本明細書で使用される場合、「に連結される」、「融合される」、または「にコンジュゲートされる」という用語は交換可能に使用され、細胞外小胞の内腔表面または外側表面上の、第１の部分と第２の部分の間、例えば、それぞれ足場Ｘと抗原（またはアジュバントもしくは免疫モジュレーター）の間、例えば、それぞれ細胞外小胞内または細胞外小胞上に発現する足場部分と抗原の間、例えば足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）に形成される共有または非共有結合を指す。いくつかの態様では、本明細書に開示されるペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）及び／または標的化部分は、ＥＶの外側表面及び／または内腔表面に直接連結され得る。本明細書で使用される用語「直接連結される」、「直接融合される」、または「直接コンジュゲートされる」は、部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）を、本明細書に開示される足場部分を使用しないでＥＶの表面に連結（融合またはコンジュゲート）するプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、互いに連結またはコンジュゲートしている２つ以上のタンパク質を指す。例えば、いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶにおいて発現され得る融合タンパク質は、（ｉ）ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）と、（ｉｉ）足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）と、を含む。いくつかの態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、親和性リガンド（例えば、本明細書に記載のもの）を介して足場部分に連結またはコンジュゲートされる。いくつかの態様では、本開示に有用なＥＶで発現可能な融合タンパク質は、（ｉ）標的化部分と、（ｉｉ）足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）と、を含む。いくつかの態様では、標的化部分は、親和性リガンド（例えば、本明細書に記載のもの）を介して足場部分に連結またはコンジュゲートされる。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本開示のＥＶは複数の融合タンパク質を発現することができ、第１の融合タンパク質は、（ｉ）ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）と、（ｉｉ）足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）とを含み、第２の融合タンパク質は、（ｉ）標的化部分と、（ｉｉ）足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）と、を含む。
用語「カプセル化された」、またはこの用語の文法的に異なる形式（例えば、カプセル化、またはカプセル化すること）は、２つの部分を化学的または物理的に連結することなく、第１の部分（例えば、抗原、アジュバント、または免疫モジュレーター）が第２の部分（例えば、ＥＶ）の内部にある状態またはプロセスを指す。いくつかの態様では、「カプセル化された」という用語は、「の内腔内」及び「ロードされた」と交換可能に使用される場合がある。第１の部分（例えば、ペイロード、例えば、抗原、アジュバント、または免疫モジュレーター）を第２の部分（例えば、ＥＶ）にカプセル化する（またはロードする）非限定的な例は、本明細書の他の箇所に開示されている。
本明細書で使用される場合、「プロデューサー細胞」という用語は、ＥＶを生成するために使用される細胞を指す。プロデューサー細胞は、インビトロで培養された細胞、またはインビボの細胞であってよい。プロデューサー細胞としては、ＥＶの生成に有効であることが知られている細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞ではない。特定の態様では、プロデューサー細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、クッパー－ブロウィッツ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。いくつかの態様では、プロデューサー細胞は、天然に存在する抗原提示細胞ではない（すなわち、改変されている）。特定の態様では、プロデューサー細胞は、天然に存在する樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、クッパー－ブロウィッツ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。そのようなプロデューサー細胞に関するさらなる開示は、本開示の他の箇所で提供される。いくつかの態様では、本開示で有用なＥＶは、ＥＶの表面に露出したＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子上に抗原を担持しない（すなわち、抗原はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子上に提示されない）が、代わりに、足場Ｘ及び／または足場Ｙへの付着により、ＥＶの内腔またはＥＶの表面上に抗原を担持し得る。
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣクラスＩ分子」は、ＭＨＣクラスＩ分子をコードする野生型またはバリアントのＨＬＡクラスＩ遺伝子のタンパク質産物を指す。したがって、「ＨＬＡクラスＩ分子」及び「ＭＨＣクラスＩ分子」は、本明細書において交換可能に使用される。
ＭＨＣクラスＩ分子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（もう１つはＭＨＣクラスＩＩ）の２つの主要なクラスの１つであり、有顎脊椎動物の体内のすべての有核細胞の細胞表面に見られる。血小板にも発生するが、赤血球には発生しない。それらの機能は、細胞内から細胞傷害性Ｔ細胞にタンパク質のペプチド断片を提示することである。これにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質の助けを借りて提示される特定の非自己抗原に対する免疫系からの即時応答がトリガーされる。ＭＨＣクラスＩ分子は細胞質タンパク質に由来するペプチドを提示するため、ＭＨＣクラスＩ提示の経路は細胞質経路または内因性経路と呼ばれることがよくある。
ヒトでは、ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃである。ＭＨＣクラスＩ分子は、α鎖とβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）鎖の２つのタンパク質鎖で構成されている。ヒトβ２ｍはＢ２Ｍ遺伝子によってコードされている。クラスＩ ＭＨＣ分子は、プロテアソームによる細胞質タンパク質の分解から主に生成するペプチドに結合する。次いで、ＭＨＣ Ｉ：ペプチド複合体は、小胞体を介して細胞の外側原形質膜に挿入される。エピトープペプチドは、クラスＩ ＭＨＣ分子の細胞外部分に結合する。したがって、クラスＩ ＭＨＣの機能は、細胞内タンパク質を細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に提示することである。しかしながら、クラスＩ ＭＨＣはまた、交差提示として知られるプロセスにおいて、外因性タンパク質から生成されたペプチドを提示することができる。
正常な細胞は、そのクラスＩ ＭＨＣで正常な細胞タンパク質のターンオーバーからのペプチドを表示し、ＣＴＬは中枢及び末梢の寛容メカニズムによりそれらに応答して活性化されない。ウイルス感染後などに細胞が外来タンパク質を発現すると、クラスＩ ＭＨＣ の一部がこれらのペプチドを細胞表面上に表示する。その結果、ＭＨＣ：ペプチド複合体に特異的なＣＴＬは、存在する細胞を認識して殺傷する。代替的に、クラスＩ ＭＨＣ自体がナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の阻害リガンドとして機能し得る。一部のウイルスがＣＴＬ応答を回避するために採用するメカニズムである表面クラスＩ ＭＨＣの正常レベルの低下は、ＮＫ細胞の殺傷を活性化する。
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣクラスＩＩ分子」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする野生型またはバリアントのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のタンパク質産物を指す。したがって、「ＨＬＡクラスＩＩ分子」及び「ＭＨＣクラスＩＩ分子」は、本明細書において交換可能に使用される。
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、通常、樹状細胞、単核食細胞、一部の内皮細胞、胸腺上皮細胞、及びＢ細胞などのプロフェッショナルな抗原提示細胞にのみ見られる主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子のクラスである。これらの細胞は、免疫応答の開始に重要である。クラスＩＩペプチドによって提示される抗原は、細胞外タンパク質（ＭＨＣクラスＩのような細胞質ではない）由来である。
ＭＨＣクラスＩ分子と同様に、クラスＩＩ分子もヘテロ二量体であるが、この場合、２つの均質なペプチド、α及びβ鎖からなり、その両方ともＭＨＣにおいてコードされている。サブ表記α１、α２などは、ＨＬＡ遺伝子内の別個のドメインを指す。それぞれのドメインは通常、遺伝子内の異なるエクソンによってコードされ、いくつかの遺伝子は、リーダー配列、膜貫通配列などをコードするドメインをさらに有している。これらの分子は、細胞外領域と膜貫通配列及び細胞質尾部との両方を持っている。鎖のα１とβ１領域は一緒になって膜遠位のペプチド結合ドメインを形成するが、鎖の残りの細胞外部分であるα２とβ２領域は膜近位の免疫グロブリン様ドメインを形成する。抗原またはペプチドが結合する抗原結合溝は、２つのαヘリックス壁とβシートで構成されている。ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原結合溝は両端で開放し、一方、クラスＩ分子上の対応する溝は、各末端で閉鎖されているため、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される抗原は、より長く、概して１５～２４個のアミノ酸残基長である。ＭＨＣクラスＩＩ分子のローディングは食作用によって起こる。細胞外タンパク質は、エンドサイトーシスされ、リソソームで消化され、得られたエピトープペプチド断片は、細胞表面への移動の前に、ＭＨＣクラスＩＩ分子上にローディングされる。ヒトでは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質複合体は、ヒト白血球抗原遺伝子複合体（ＨＬＡ）によってコードされている。ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲである。ＨＬＡ遺伝子複合体の変異は、ＭＨＣクラスＩＩ欠損症の一種である裸リンパ球症候群（ＢＬＳ）を引き起こす可能性がある。
本明細書で使用される場合、「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」、または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、ならびに「抽出された」及び「抽出すること」という用語は交換可能に使用され、１つ以上の精製プロセス、例えば、所望のＥＶ調製物の選択または濃縮が行われた、所望のＥＶの調製物（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）の状態を指す。いくつかの態様では、本明細書中で使用する単離することまたは精製することは、プロデューサー細胞を含む試料からＥＶを回収、（例えば、その画分を）部分的に回収するプロセスである。いくつかの態様では、単離されたＥＶ組成物は検出可能な望ましくない活性を有しないか、または、代替的には、望ましくない活性のレベルもしくは量は、許容されるレベルもしくは量以下である。他の態様では、単離されたＥＶ組成物は、許容される量及び／または濃度以上の所望のＥＶの量及び／または濃度を有する。他の態様では、単離されたＥＶ組成物は、組成物が得られる出発物質（例えば、プロデューサー細胞調製物）と比較して濃縮されている。この濃縮は、出発材料と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。いくつかの態様では、単離されたＥＶ調製物は、残留生物学的産物を実質的に含まない。いくつかの態様では、単離されたＥＶ調製物は、いかなる混入生物物質も１００％含まないか、９９％含まないか、９８％含まないか、９７％含まないか、９６％含まないか、９５％含まないか、９４％含まないか、９３％含まないか、９２％含まないか、９１％含まないか、または９０％含まない。残留生物学的産物としては、非生物物質（化学物質を含む）、または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物が挙げられ得る。残留生物学的産物を実質的に含まない、とは、ＥＶ組成物が検出可能なプロデューサー細胞を含有せず、ＥＶのみが検出可能であることを意味する場合もある。
本明細書で使用される場合、「免疫モジュレーター」という用語は、細胞外小胞と接触する標的（例えば、標的細胞）に作用して、免疫系を調節する薬剤（すなわち、ペイロード）を指す。ＥＶ及び／またはプロデューサー細胞に導入することができる免疫モジュレーターの非限定的な例としては、チェックポイント阻害剤のモジュレーター、チェックポイント阻害剤のリガンド、サイトカイン、それらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせなどの薬剤が挙げられる。免疫モジュレーターはまた、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、抗原結合断片、ポリヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドコンジュゲートホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、または低分子が挙げられ得る。
本明細書中で使用される場合、「生体内分布改変剤」という用語は、インビボまたはインビトロでの（例えば、異なる種の細胞の混合培養物中での）細胞外小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞）の分布を改変することができる薬剤を指す。いくつかの態様では、「標的化部分」という用語は、生体内分布改変剤という用語と交換可能に使用することができる。いくつかの態様では、標的化部分は、ＥＶの指向性を改変する（「指向性部分」）。本明細書中で使用される場合、「指向性部分」という用語は、ＥＶ上で発現すると、ＥＶの天然の挙動を改変及び／または増強する標的化部分を指す。例えば、いくつかの態様では、指向性部分は、特定の細胞、組織、または器官へのＥＶの取り込みを促進することができる。本開示で使用できる指向性部分の非限定的な例としては、樹状細胞（例えば、Ｃｌｅｃ９ＡまたはＤＥＣ２０５）またはＴ細胞（例えば、ＣＤ３）上で特異的に発現するマーカーに結合できるものが挙げられる。別段の指示がない限り、本明細書で使用される場合、「標的化部分」という用語は、指向性部分を包含する。生体分布剤は、タンパク質、ペプチド、脂質、もしくは炭水化物などの生体分子、または合成分子を含み得る。例えば、生体分布改変剤は、親和性リガンド（例えば、抗体、ＶＨＨドメイン、ファージディスプレイペプチド、フィブロネクチンドメイン、ラクダ科動物、ＶＮＡＲ）、合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、天然リガンド／分子（例えば、ＣＤ４０Ｌ、アルブミン、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ５５、ＣＤ５９）、組換えタンパク質（例えば、ＸＴＥＮ）であり得るが、これらに限定されない。
特定の態様では、生体内分布改変剤及び／または標的化部分は、ＥＶの表面上に提示される。生体内分布改変剤は、足場タンパク質（例えば、足場Ｘ）に（例えば、遺伝的にコードされた融合分子として）融合されることにより、ＥＶ表面上に提示され得る。いくつかの態様では、生体内分布改変剤は、生体内分布改変剤をＥＶ表面分子に付着させる化学反応によってＥＶ表面上に提示され得る。非限定的な例はＰＥＧ化である。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、抗原、アジュバント、または免疫モジュレーターに加えて、生体内分布改変剤をさらに含むことができる。本開示で使用することのできる生体内分布改変剤または標的化剤の非限定的な例としては、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９ａ）タンパク質、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－グラビング非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２０７、ＣＤ４０、Ｃｌｅｃ６、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＤＥＣ－２０５、レクチン様酸化型低密度リポタンパク質受容体－１（ＬＯＸ－１）、ＭＡＲＣＯ、Ｃｌｅｃ１２ａ、Ｃｌｅｃ１０ａ、ＤＣ－アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン－１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－１（ＣＤ３０３、Ｃｌｅｃ４ｃ）、デクチン－２、Ｂｓｔ－２（ＣＤ３１７）、ＣＤ３、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。特定の態様では、標的化部分はＣｌｅｃ９ａタンパク質である。いくつかの態様では、標的化部分はＣＤ３分子である。
本明細書で使用される場合、「Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ」（Ｃｌｅｃ９ａ）タンパク質という用語は、活性化受容体として機能し、骨髄系細胞（例、ＤＣ）上に発現するグループＶ Ｃ型レクチン様受容体（ＣＴＬＲ）を指す。Ｈｕｙｓａｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３（２４）：１６６９３－７０１（２００８）；米国特許第９，９８８，４３１ Ｂ２号、そのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｃｌｅｃ９ａの同義語は知られており、ＣＤ３７０、ＤＮＧＲ－１、５Ｂ５、ＨＥＥＥ９３４１、及び９Ａを含むＣ型レクチンドメインが含まれる。いくつかの態様では、Ｃｌｅｃ９ａタンパク質は、ヒトｃＤＣ１細胞上で発現する。いくつかの態様では、Ｃｌｅｃ９ａタンパク質は、マウスｃＤＣ１細胞及びｐＤＣ細胞の上で発現する。特に明記しない限り、本明細書中で使用される場合、Ｃｌｅｃ９ａは、１つ以上の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）由来のＣｌｅｃ９ａを指し得る。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３」または「表面抗原分類３」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合するタンパク質複合体を指す。ＣＤ３分子は、４つの異なる鎖（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び２つのＣＤ３ε鎖）で構成されている。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖と結合して、Ｔリンパ球の活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子が一緒になってＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含むすべてのＴ細胞上で発現する。特に明記しない限り、本明細書中で使用される場合、ＣＤ３は、１つ以上の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）由来のＣＤ３を指し得る。
本明細書で使用される場合、「ペイロード」という用語は、ＥＶと接触する標的（例えば、標的細胞）に作用する薬剤を指す。いくつかの態様では、別段の指示がない限り、ペイロードという用語は、「生物学的に活性な分子」という用語と交換可能に使用することができる。ＥＶに含めることができるペイロードの非限定的な例は、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーターである。ＥＶ及び／またはプロデューサー細胞に導入することができるペイロードとしては、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨げるヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドのような制御機能を有するＲＮＡ分子、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドコンジュゲートホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、またはそれらの組み合わせ）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分または毒素を含む、または翻訳を妨げるアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬及び毒素）などの薬剤が挙げられる。特定の態様では、ペイロードは抗原を含む。本明細書中で使用される場合、「抗原」という用語は、対象に導入された場合にそれ自体に対する免疫応答（細胞性または体液性）を誘発する任意の薬剤を指す。
本明細書で使用される場合、「親和性リガンド」という用語は、例えば標的細胞またはＥＶ上で発現する特定のマーカー、例えば足場部分、例えばＥＶ上のＰＴＧＦＲＮに選択的かつ優先的に結合することができる分子を指す。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、親和性リガンドは、目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）の、ＥＶの表面上の部分、例えば、本明細書に開示される足場部分に対する結合を増加させることができるペプチド（例えば、直鎖状ペプチド）またはタンパク質を含む。本開示で使用できる親和性リガンドの非限定的な例としては、抗体、ファージディスプレイペプチド、フィブロネクチンドメイン、ラクダ科動物、ＶＮＡＲ、ＶＨＨドメイン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、天然であるかまたは部分的もしくは全体的に合成されたものであるかによらず免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。「抗体」は、抗原に特異的に結合し認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。抗体という用語の使用には、全抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び組換え抗体、それらの断片を含むことを意味し、単鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドをさらに含む。抗体は、所望の生物学的活性または機能を有するものである限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。ＥＶとともに使用できる親和性リガンドのさらなる説明は、本開示の他の箇所で提供される（例えば、セクションＩＩ．Ｉを参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「アクセプタードメイン」という用語は、同族タンパク質「ドナードメイン」との安定した相互作用（共有結合または非共有結合のいずれか）を形成するタンパク質配列を指す。本明細書で実証されるように、いくつかの態様では、アクセプタードメインは、足場部分（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）への融合を介してＥＶの表面上に提示され得る。いくつかの態様では、アクセプターＥＶ（すなわち、アクセプタードメインを含むＥＶ）を可溶性ドナー（ドナードメイン及び目的の標的分子を含む）と混合することによって、目的の標的分子をＥＶの表面上に提示することが可能であり得る。
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、診断、治療または療法が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の組成物及び方法は、ヒトの治療と獣医学的用途の両方に適用可能である。いくつかの態様では、対象は哺乳動物であり、他の態様では、対象はヒトである。本明細書中で使用される場合、「哺乳動物対象」としては、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含むがこれらに限定されないすべての哺乳動物が含まれる。
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、ＥＶを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）濃度パーセンテージで約１０％未満のマクロ分子しか含まないことを意味する。特定の画分は、約０．００１（ｍ／ｖ）％未満、約０．０１（ｍ／ｖ）％未満、約０．０５（ｍ／ｖ）％未満、約０．１（ｍ／ｖ）％未満、約０．２％未満（ｍ／ｖ）、約０．３（ｍ／ｖ）％未満、約０．４（ｍ／ｖ）％未満、約０．５（ｍ／ｖ）％未満、約０．６（ｍ／ｖ）％未満、約０．７（ｍ／ｖ）％未満、約０．８（ｍ／ｖ）％未満、約０．９（ｍ／ｖ）％未満、約１（ｍ／ｖ）％未満、約２（ｍ／ｖ）％未満、約３（ｍ／ｖ）％未満、約４（ｍ／ｖ）％未満、約５（ｍ／ｖ）％未満、約６（ｍ／ｖ）％未満、約７（ｍ／ｖ）％未満、約８（ｍ／ｖ）％未満、約９（ｍ／ｖ）％未満、または約１０（ｍ／ｖ）％未満の高分子を含有してもよい。
本明細書中で使用される場合、「高分子」という用語は、核酸、混入タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを意味する。
本明細書中で使用される場合、「従来のエキソソームタンパク質」という用語とは、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂを含むがこれらに限定されない、エキソソーム内で豊富であることが以前に知られているタンパク質、その断片、またはそれに結合するペプチドを意味する。
本明細書中で使用される場合、「投与」とは、薬学的に許容される経路を介して、本明細書に開示するＥＶを含む組成物を対象に与えることを意味する。投与経路は、静脈内投与、例えば、静脈内注射及び静脈内注入であり得る。追加の投与経路として、例えば、皮下、筋肉内、経口、経鼻、及び肺への投与が挙げられる。ＥＶは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与することができる。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」とは、外来因子または異常な、例えばコロナウイルスに対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、この応答は、これらの因子及びそれらによって引き起こされる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の１つ以上の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞、または好中球）、及びこれらの細胞または肝臓のいずれかによって生成される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用によって媒介され、侵入する病原体、病原体の感染した細胞もしくは組織、またはその他の異常細胞、または自己免疫または病的炎症の場合は、正常なヒト細胞または組織の選択的な標的化、結合、損傷、破壊、及び／または脊椎動物の体からの排除をもたらす。免疫反応には、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、Ｔｈ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＴｒｅｇ細胞の活性化もしくは阻害、または他の任意の免疫系の細胞、例えばＮＫ細胞の活性化もしくは阻害が含まれる。したがって、免疫応答は、体液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞によって媒介される）、細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞によって媒介される）、または体液性と細胞性免疫応答の両方を含み得る。いくつかの態様では、免疫応答は「抑制性」免疫応答である。「抑制性」免疫応答は、刺激（例えば、抗原）の効果を遮断または減少させる免疫応答である。特定の態様では、抑制性免疫応答は、刺激に対する抑制性抗体の産生を含む。いくつかの態様では、免疫応答は「刺激性」免疫応答である。「刺激性」免疫応答は、コロナウイルスの標的抗原を破壊して排除できるエフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）の生成をもたらす免疫応答である。
本明細書で使用される場合、「細胞性免疫応答」という用語は、「細胞媒介性免疫応答」という用語と交換可能に使用でき、主に抗体が関与しない免疫応答を指す。代わりに、細胞性免疫応答は、活性化の際に（例えば、抗原刺激を介して）さまざまなエフェクター分子（例えば、サイトカイン、パーフォリン、グランザイム）を産生する異なる免疫細胞（例えば、食細胞及び抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球）の活性化を伴う。本明細書で使用される場合、「体液性免疫応答」という用語は、分泌抗体、補体タンパク質、及び特定の抗菌ペプチドなどの細胞外液に見られる巨大分子によって主に媒介される免疫応答を指す。「抗体介在性免疫応答」という用語は、抗体によって媒介される体液性免疫応答の態様を指す。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、免疫応答の媒介に関与する免疫系の任意の細胞を指す。免疫細胞の非限定的な例としては、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞、好中球、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、免疫細胞はＣＤ３を発現する。特定の態様では、ＣＤ３発現免疫細胞はＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞）である。いくつかの態様では、本明細書に開示される標的化部分（例えば、抗ＣＤ３）で標的化され得る免疫細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様では、免疫細胞はメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様では、免疫細胞はエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様では、免疫細胞はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様では、免疫細胞はメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様では、免疫細胞はエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの態様では、免疫細胞は樹状細胞である。特定の態様では、樹状細胞は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、通常型樹状細胞１（ｃＤＣ１）、通常型樹状細胞２（ｃＤＣ２）、炎症性単球由来樹状細胞、ランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞、リゾチーム発現樹状細胞（ＬｙｓｏＤＣ）、クッパー細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。したがって、特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶが特異的に標的とすることができる免疫細胞としては、通常型樹状細胞１（ｃＤＣ１）及び／または形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」または「Ｔ－細胞」という用語は、胸腺で成熟するリンパ球のタイプを指す。Ｔ細胞は、細胞性免疫において重要な役割を果たし、細胞表面上にＴ細胞受容体が存在することによって、Ｂ細胞などの他のリンパ球と区別される。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及びガンマ－デルタＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現するすべての種類の免疫細胞が含まれる。
「ナイーブ」Ｔ細胞は、免疫学的に未分化のままである（すなわち、活性化されていない）成熟Ｔ細胞を指す。胸腺でのポジティブ選択及びネガティブ選択の後、Ｔ細胞はＣＤ４＋ナイーブＴ細胞またはＣＤ８＋ナイーブＴ細胞として出現する。ナイーブ状態のＴ細胞は、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ＋）、ＩＬ－７受容体－α（ＩＬ－７Ｒ－α）、及びＣＤ１３２を発現するが、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６９、またはＣＤ４５ＲＯを発現しない。本明細書で使用される場合、「未成熟」はまた、ＴＳＣＭ細胞またはＴＣＭ細胞などの、ナイーブＴ細胞または未熟Ｔ細胞のいずれかに特徴的な表現型を示すＴ細胞を指すことができる。例えば、未熟Ｔ細胞は、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ＋）、ＩＬ－７Ｒα、ＣＤ１３２、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ９５、ＣＸＣＲ３、及びＬＦＡ－１のうちの１つ以上を発現することができる。ナイーブまたは未熟なＴ細胞は、ＴＥＭ細胞及びＴＥＦＦ細胞などの最終分化エフェクターＴ細胞と対比することができる。
本明細書で使用される場合、「エフェクター」Ｔ細胞または「ＴＥＦＦ」細胞という用語は、さらなる分化を必要とせずに病原体または細胞の除去を媒介できるＴ細胞を指す。このように、エフェクターＴ細胞はナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞とは区別され、これらの細胞はしばしばエフェクター細胞になる前に分化及び増殖する必要がある。
本明細書で使用される場合、「メモリー」Ｔ細胞という用語は、以前に遭遇し、その同族抗原に応答したＴ細胞のサブセットを指す。いくつかの態様では、この用語は、「抗原を経験した」Ｔ細胞と同義である。いくつかの態様では、メモリーＴ細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞またはセントラルメモリーＴ細胞であり得る。いくつかの態様では、メモリーＴ細胞は、組織常在性メモリーＴ細胞である。本明細書で使用される場合、「組織常在性メモリーＴ細胞」または「ＴＲＭ細胞」は、再循環することなく組織（例えば、皮膚、肺、胃腸管）を占有するＴ細胞の系列を指す。ＴＲＭ細胞は、血液、二次リンパ器官のＴ細胞ゾーン、リンパ及び非リンパ組織の間を再循環するセントラルメモリー及びエフェクターメモリーＴ細胞とは転写的、表現型的、及び機能的に異なる。ＴＲＭ細胞の役割の１つは、リンパ外組織の感染に対する免疫保護を提供することである。
本明細書で使用される場合、「樹状細胞」または「ＤＣ」という用語は、細胞外及び細胞内タンパク質をプロセシングし、ナイーブＴ細胞をプライミングするためにＭＨＣ分子との関連で抗原を提示することができる骨髄由来免疫細胞のクラスを指す。いくつかの態様では、樹状細胞は、通常型樹状細胞１（ｃＤＣ１）、通常型樹状細胞２（ｃＤＣ２）、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、炎症性単球由来樹状細胞、ランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞、リゾチーム発現樹状細胞（ＬｙｓｏＤＣ）、クッパー細胞、またはそれらの組み合わせなどのさらなるサブタイプに分けることができる。特定の態様では、異なるＤＣサブセットは、それらの表現型発現に基づいて区別され得る。例えば、いくつかの態様では、ヒトｃＤＣ１細胞はＣＤ１ｃ－及びＣＤ１４１＋である。いくつかの態様では、ヒトｃＤＣ２細胞はＣＤ１ｃ＋及びＣＤ１４１－である。いくつかの態様では、ヒトｐＤＣ細胞はＣＤ１２３＋である。いくつかの態様では、マウスｃＤＣ１細胞は、ＸＣＲ１＋、Ｃｌｅｃ９ａ＋、及びＳｉｒｐａ－である。いくつかの態様では、マウスｃＤＣ２細胞は、ＣＤ８＋、ＣＤ１１ｂ＋、Ｓｉｒｐａ＋、ＸＣＲ１－、及びＣＤ１ｃ，ｂ＋である。いくつかの態様では、マウスｐＤＣ細胞は、ＣＤ１３７＋、ＸＣＲ１－、及びＳｉｒｐａ－である。異なるＤＣサブセットを識別するための他の表現型マーカーは、当該技術分野で知られている。例えば、Ｃｏｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５４（１）：３－２０（２０１８）を参照されたい。いくつかの態様では、異なるＤＣサブセットは、それらの機能的特性に基づいて区別され得る。例えば、特定の態様では、ｐＤＣは大量のＩＦＮ－αを産生するが、ｃＤＣ１及びｃＤＣ２はＩＬ－１２、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインを産生する。異なるＤＣサブセットを区別する他の方法は、当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第８，４２６，５６５Ｂ２号及び第９，９８８，４３１号を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、結合分子（例えば、抗体）と、結合分子に化学的にコンジュゲートした１つ以上の部分、例えば、治療用部分または診断用部分とを含む化合物を指す。一般に、イムノコンジュゲートは、一般式：Ａ－（Ｌ－Ｍ）ｎによって定義され、ここで、Ａは結合分子（例えば、抗体）であり、Ｌは任意選択のリンカーであり、Ｍは、例えば、治療剤、検出可能なラベルなどであってよい異種部分であり、ｎは整数である。いくつかの態様では、複数の異種部分は、同じ結合分子（例えば、抗体）中の異なる結合点に化学的にコンジュゲートされ得る。他の態様では、複数の異種部分が連結され、結合分子（例えば、抗体）中の結合点に結合され得る。他の態様では、複数の異種部分（同じまたは異なる）は、結合分子（例えば、抗体）にコンジュゲートされ得る。
イムノコンジュゲートは、逆の順序で一般式によって定義することもできる。いくつかの態様では、イムノコンジュゲートは「抗体－薬物コンジュゲート」（「ＡＤＣ」）である。本開示の文脈において、「イムノコンジュゲート」という用語は、化学的または酵素的に結合した分子に限定されない。本開示で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語には、遺伝的融合も含まれる。本開示のいくつかの態様では、生物活性分子はイムノコンジュゲートである。「抗体－薬物コンジュゲート」及び「ＡＤＣ」という用語は交換可能に使用され、治療剤（本明細書では薬剤、薬物、もしくは活性医薬成分と呼ばれることもある）、または複数の薬剤に、例えば共有結合で連結された抗体を指す。本開示のいくつかの態様では、生物活性分子（すなわち、ペイロード）は抗体－薬物コンジュゲートである。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」とは、例えば、疾患または状態の重症度の低下、疾患の経過期間の短縮、疾患または病態に関連する１つ以上の症状の改善または排除、疾患または病態を必ずしも治癒させることなく、疾患または病態を有する対象に有益な効果を提供することを意味する。この用語には、疾患もしくは状態またはそれらの症状の予防または防止も含まれる。一態様では、「治療すること」または「治療」という用語は、対象に抗原に対する免疫応答を誘導することを意味する。
本明細書中で使用される場合、「予防する」または「予防すること」とは、特定の結果の発生または重症度を低下または減少させることを指す。いくつかの態様では、結果を予防することは、予防的治療によって達成される。
ＩＩ． 細胞外小胞
本明細書に開示されるのは、対象の免疫系を調節することができるＥＶである。本明細書に記載されるように、本明細書に記載のＥＶは、ＥＶが以下の特性のうちの１つ以上を含むという点で、対象の免疫系を調節するための他のプラットフォーム（例えば、タンパク質免疫）とは異なる：（ｉ）部分（例えば、抗原）提示の柔軟性、（ｉｉ）多様なアジュバント及び免疫調節の組み合わせ、（ｉｉｉ）強化された細胞特異的指向性、（ｉｖ）強化されたクリアランス阻害、または（ｖ）それらの任意の組み合わせ。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、部分ディスプレイの柔軟性を提供する。例えば、目的の部分（例えば、抗原）は、（ｉ）ＥＶの表面（例えば、外側表面及び／または内腔表面）に直接連結することができ、（ｉｉ）足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）に連結して、次いでＥＶの表面（例えば、外側表面及び／または内腔表面）上に発現させることができ、（ｉｉｉ）ＥＶの内腔に発現させることができ、または（ｉｖ）それらの組み合わせであり得る。ＥＶを迅速に操作するそのような能力は、本明細書に記載の疾患及び障害を治療するためのＥＶベースのワクチンを開発するのに特に有用である。例えば、特定のペイロード及び／または標的化部分を発現するように操作された単一のＥＶは、部分（例えば、目的の抗原）を単にＥＶに「プラギング」（または、部分（例えば、目的の抗原）をＥＶへの「クリップオン」結合として急速に結合する）ことによって、広範囲の疾患または障害を治療するのに使用することができる。そのようなモジュラーまたは「プラグアンドプレイ」ＥＶの生成方法を、本開示の他の箇所で提供する。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、目的の異なる部分（例えば、抗原、アジュバント、免疫調節剤、及び／または標的化部分）の多様な組み合わせを可能にする。特定の態様では、ＥＶは、広範囲のアジュバント及び免疫調節剤の組み合わせを可能にする。単一のＥＶに組み合わせることができるアジュバント及び免疫調節剤の非限定的な例としては、小分子アゴニスト（例えば、ＳＴＩＮＧ）、小分子アンタゴニスト、共刺激タンパク質、アンチセンス、及び細菌アジュバントオリゴヌクレオチドが挙げられる。一緒に組み合わせることができる異なる部分に関するさらなる開示は、本開示の他の箇所で提供される。
いくつかの態様では、本明細書に記載のＥＶは、強化された細胞特異的指向性を示すように操作することができる。例えば、ＥＶは、特定の細胞上のマーカーに特異的に結合できる標的化部分（例えば、抗体及び／またはタンパク質）をその外側表面上に発現するように操作することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載のＥＶは、特定のタイプの免疫応答（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／またはＴｒｅｇ／寛容原性免疫応答）を誘導するように操作することができる。そのような特性に関するさらなる開示は、本開示の他の箇所で提供される。
本開示において有用なＥＶは、複数（例えば、少なくとも２つ）の外因性生物活性分子（例えば、抗原、抗体またはその抗原結合断片、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）、及び／または他の部分（例えば、標的化部分）を一緒に単一のＥＶ中に産生するように操作されている。いくつかの態様では、ＥＶは、３つの外因性生物活性分子を含む。他の態様では、ＥＶは、４つの外因性生物活性分子を含む。さらなる態様では、ＥＶは、５つ以上の外因性生物活性分子を含む。いくつかの態様では、ＥＶは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の外因性生物活性分子を含む。
いくつかの態様では、ＥＶは、２つ以上の外因性生物活性分子、例えば、（ｉ）１つ以上の抗原と、（ｉｉ）１つ以上のアジュバントと、を含む。他の態様では、ＥＶは、２つ以上の外因性生物活性分子、例えば、（ｉ）１つ以上の抗原と、（ｉｉ）１つ以上の免疫モジュレーターと、を含む。さらなる態様では、ＥＶは、２つ以上の外因性生物活性分子、例えば、（ｉ）１つ以上の抗原と、（ｉｉ）１つ以上の免疫モジュレーターと、（ｉｉｉ）１つ以上のアジュバントと、を含む。特定の態様では、ＥＶは、１つ以上の追加の部分、例えば、標的化部分をさらに含み得る。いくつかの態様では、抗原は、主要組織適合性複合体Ｉ及び／またはＩＩ分子上で発現（または提示）されない。他の態様では、ＥＶ中の抗原はＭＨＣクラスＩまたはＩＩ複合体の一部として発現または提示されないが、ＥＶは依然としてＥＶの表面上にＭＨＣクラスＩ／ＩＩ分子を含むことができる。したがって、特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と直接相互作用して抗原に対する免疫応答を誘導しない。同様に、特定の態様では、本開示のＥＶは、クロスドレッシングによって抗原を標的細胞（例えば、樹状細胞）の表面に直接移さない。クロスドレッシングは、Ｔ細胞の活性化を誘導するために、樹状細胞（ＤＥＸ）に由来するＥＶによって一般的に使用されるメカニズムである。Ｐｉｔｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６（４）：１２２４－３２（２０１６）を参照されたい。他の態様では、本開示のＥＶは、抗原提示細胞によって飲み込まれ、ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩ複合体として抗原提示細胞の表面上に発現され得る。
特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶはまた、標的化部分などの追加の部分を含むことができる。いくつかの態様では、抗原は、主要組織適合性複合体Ｉ及び／またはＩＩ分子上で発現または提示される。他の態様では、ＥＶ中の抗原はＭＨＣクラスＩまたはＩＩ複合体の一部として発現または提示され、ＥＶはＥＶの表面上にＭＨＣクラスＩ／ＩＩ分子を含むことができる。したがって、特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶは、Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と直接相互作用して抗原に対する免疫応答を誘導する。同様に、特定の態様では、本開示のＥＶは、クロスドレッシングによって抗原を標的細胞（例えば、樹状細胞）の表面に直接移す。「クロスドレッシング」は、Ｔ細胞の活性化を誘導するために、樹状細胞（ＤＥＸ）に由来するＥＶによって一般的に使用されるメカニズムである。Ｐｉｔｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６（４）：１２２４－３２（２０１６）を参照されたい。他の態様では、本開示のＥＶは、抗原提示細胞によって飲み込まれ、ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩ複合体として抗原提示細胞の表面上に発現され得る。
上記のように、本明細書に記載のＥＶは、直径が約２０～３００ｎｍの細胞外小胞である。特定の態様では、本開示のＥＶは、約２０～２９０ｎｍ、約２０～２８０ｎｍ、約２０～２７０ｎｍ、約２０～２６０ｎｍ、約２０～２５０ｎｍ、約２０～２４０ｎｍ、約２０～２３０ｎｍ、約２０～２２０ｎｍ、約２０～２１０ｎｍ、約２０～２００ｎｍ、約２０～１９０ｎｍ、約２０～１８０ｎｍ、約２０～１７０ｎｍ、約２０～１６０ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約２０～１４０ｎｍ、約２０～１３０ｎｍ、約２０～１２０ｎｍ、約２０～１１０ｎｍ、約２０～１００ｎｍ、約２０～９０ｎｍ、約２０～８０ｎｍ、約２０～７０ｎｍ、約２０～６０ｎｍ、約２０～５０ｎｍ、約２０～４０ｎｍ、または約２０～３０ｎｍの直径を有する。本明細書に記載のＥＶのサイズは、以下に記載する方法に従って測定することができる。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、内側表面及び外側表面を含む二脂質膜（「ＥＶ膜」）を含む。特定の態様では、内側表面は、ＥＶの内部コア（すなわち、内腔）に面する。特定の態様では、外側表面は、プロデューサー細胞または標的細胞のエンドソーム、多小胞体、または膜／細胞質と接触した状態にあり得る。
いくつかの態様では、ＥＶ膜は脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの態様では、ＥＶ膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。
いくつかの態様では、ＥＶ膜は、内側リーフレット及び外側リーフレットを含む。内側リーフレット及び外側リーフレットの組成は、当該技術分野で既知の２層間分布アッセイによって決定され得、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照されたい。いくつかの態様では、外側リーフレットの組成は、およそ７０～９０％のコリンリン脂質、およそ０～１５％の酸性リン脂質、及びおよそ５～３０％のホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの態様では、内側リーフレットの組成は、およそ１５～４０％のコリンリン脂質、およそ１０～５０％の酸性リン脂質、及びおよそ３０～６０％のホスファチジルエタノールアミンである。
いくつかの態様では、ＥＶ膜は、グリカンなどの１つ以上の多糖類を含む。
いくつかの態様では、ＥＶ膜はさらに、１つ以上の足場部分を含み、これは、例えば、抗原及び／またはアジュバント及び／または免疫モジュレーターをＥＶに（例えば、内腔表面上または外側表面上のいずれかに）固定することができる。特定の態様では、足場部分はポリペプチド（「エキソソームタンパク質」）である。他の態様では、足場部分は非ポリペプチド部分である。いくつかの態様では、エキソソームタンパク質は、膜貫通タンパク質、内在性タンパク質及び末梢タンパク質などの、エキソソーム膜上で濃縮されたさまざまな膜タンパク質を含む。それらには、さまざまなＣＤタンパク質、トランスポーター、インテグリン、レクチン、及びカドヘリンが含まれる。特定の態様では、足場部分は、足場Ｘを含む。他の態様では、足場部分は、足場Ｙを含む。さらなる態様では、足場部分は、足場Ｘと足場Ｙの両方を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）を標的に送達することができる。ペイロードは、ＥＶと接触する標的（例えば、標的細胞）に作用する薬剤である。接触は、インビトロで、または対象内で発生し得る。ＥＶに導入することができるペイロードの非限定的な例としては、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨げるヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドのような制御機能を有するＲＮＡ分子、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、またはペプチドコンジュゲートホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ））、アミノ酸（例えば、検出可能な部分または毒素を含む、翻訳を妨げるアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬及び毒素）などの薬剤が挙げられる。
本明細書で実証されるように、いくつかの態様では、本開示のＥＶは、エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞を誘導することができる。特定の態様では、メモリーＴ細胞は、組織常在性メモリーＴ細胞である。そのようなＥＶは、本明細書に記載のものなどの特定の感染性疾患、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのワクチンとして特に有用であり得る。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、免疫応答に関与するシグナル伝達経路の活性化を本質的に誘導することができる。特定の態様では、免疫応答に関与するシグナル伝達経路は、トール様受容体（ＴＬＲ）、レチノイド酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様受容体（ＲＬＲ）、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）の経路、またはその組み合わせを含む。いくつかの態様では、そのようなシグナル伝達経路の活性化は、Ｉ型インターフェロンの産生をもたらし得る。例えば、特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶの二脂質膜は、以下の特徴のうちの１つを共有する１つ以上の脂質を含む：（ｉ）不飽和脂質尾部、（ｉｉ）ジヒドロイミダゾールリンカー、（ｉｉｉ）環状アミン頭部基、及び（ｉｖ）それらの組み合わせ。このような特徴を持つ脂質は、ＴＬＲ／ＲＬＲ非依存性ＳＴＩＮＧ経路を活性化することが示されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７：１１７４－１１８５（Ｏｃｔ． ２０１９）を参照されたい。
ＩＩ．Ａ 抗原
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶベースのワクチンを産生するためにベースＥＶに添加することができる抗原は、対象において有益な免疫応答を誘発することができる、当該技術分野で知られている任意の抗原を含む。本明細書で使用される場合、「有益な免疫応答」は、本明細書に記載されるような疾患または障害を治療（例えば、１つ以上の症状を軽減及び／または緩和）及び／または予防することができる免疫応答である。
いくつかの態様では、抗原はペプチドを含む。特定の態様では、ペプチドは、天然ペプチド（例えば、天然に存在する生物、例えばウイルスに由来するものなど）を含む。いくつかの態様では、ペプチドは合成ペプチドを含む。いくつかの態様では、ペプチドは天然ペプチドと合成ペプチドの両方を含む。
いくつかの態様では、ペプチドは、約１５０アミノ酸未満の長さ、約１４０アミノ酸未満の長さ、約１３０アミノ酸未満の長さ、約１２０アミノ酸未満の長さ、約１１０アミノ酸未満の長さ、約１００アミノ酸未満の長さ、約９０アミノ酸未満の長さ、約８０アミノ酸未満の長さ、約７０アミノ酸未満の長さ、約６０アミノ酸未満の長さ、約５０アミノ酸未満の長さ、約４０アミノ酸未満の長さ、約３０アミノ酸未満の長さ、約２０アミノ酸未満の長さ、または約１０アミノ酸未満の長さである。特定の態様では、ペプチドは約１００アミノ酸未満の長さである。いくつかの態様では、ペプチドは約８０アミノ酸未満の長さである。
いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡである。いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、エピトープをコードする合成ｍＲＮＡである。
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、抗原は、アンカー部分、親和性剤、化学的コンジュゲーション、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないさまざまな方法によって、ＥＶの外側表面及び／または内腔表面に連結され得る。そのような方法を使用してＥＶの表面への抗原の結合を改善するために、本明細書に記載の抗原をさらに改変することができる。特定の態様では、抗原は、Ｎ末端リジンを含むように改変されたペプチドを含む。
いくつかの態様では、そのような改変は、化学的コンジュゲーションによるＥＶの表面への抗原の付着結合を可能にする。例えば、クリックケミストリーコンジュゲーションを可能にするために、アジドまたは歪みアルキン（例えば、二フッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ））をＥＶ及び／または抗原に結合（または連結）させる必要がある。特定の態様では、ＤＩＦＯは、抗原のＮ末端リジン上の第１級アミン側鎖にコンジュゲートし、次に、ＥＶの表面に結合できるアジドと相互作用することができる。いくつかの態様では、アジドは（Ｎ末端リジン上の第１級アミン側鎖を介して）抗原に結合することができ、歪みアルキンはＥＶの表面に結合することができる。
いくつかの態様では、Ｎ末端リジンを含むように抗原を改変することは、固定部分を使用して抗原をＥＶの表面に連結するのにも有用であり得る。そのような態様では、アンカー部分（すなわち、コレステロール、脂肪酸、及び／またはビタミンＥ）は、第１級アミン側鎖を介してＮ末端リジンに結合することができる。結合すると、抗原はアンカー部分を介してＥＶの膜に容易に挿入できる。
当業者には明らかであるように、抗原をＥＶの外側表面及び／または内腔面に連結するための上記のアプローチは、ＥＶ上の１つ以上のタンパク質を改変して、アジド、歪みアルキン（例えば、二フッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）、またはそれらの組み合わせ）などの分子の結合を可能にする側鎖を有する非天然アミノ酸を含むようにすることによっても行うことができる。抗原をＥＶの表面に連結するためのそのようなアプローチに関するさらなる開示は、本開示の他の箇所で提供される。上記の開示は抗原の文脈で提供されているが、同様のアプローチを使用して他の目的の部分（例えば、アジュバント、標的化部分、及び／または足場部分）をＥＶの表面に結合させることができることは、当業者には容易に明らかであろう。
本開示から明らかなように、本開示に有用な抗原は、さまざまな構造及び／または長さを含むことができる。いくつかの態様では、構造及び／または長さの違いは、本明細書に記載のＥＶベースのワクチンの効力に影響を及ぼし得る。いくつかの態様では、抗原は、それが由来するタンパク質の直鎖状エピトープ（例えば、コロナウイルスのＴ細胞抗原及び／またはＢ細胞抗原）、立体配座エピトープ、またはその両方を含む。
可能な抗原構造の非限定的な例を以下に提供する。本明細書で記載されるように、例示的な構造の任意の単一の態様を修正することができる。例えば、以下に示す構成要素のいずれかの長さは変更できる（長くしたり短くしたりできる）。さらに、構成要素のいずれかを除去するか（例えば、スペーサーを除去する）、または追加の構成要素を追加することができる（例えば、さらにスペーサーを追加する）。
いくつかの態様では、抗原は単一の抗原を含む。いくつかの態様では、抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、またはその両方を含むＴ細胞抗原を含む。例えば、特定の態様では、抗原は以下の構造を有する：（第１の隣接領域）－（Ｔ細胞抗原）－（第２の隣接領域）。いくつかの態様では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み、９アミノ酸の長さであり（例えば、コロナウイルスのＴ細胞抗原）、第１の隣接領域及び第２の隣接領域のそれぞれは５アミノ酸の長さであり、結果として抗原全体は１９アミノ酸の長さとなる。いくつかの態様では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含み、２５アミノ酸の長さであり（例えば、コロナウイルスのＴ細胞抗原）、第１の隣接領域及び第２の隣接領域のそれぞれは５アミノ酸の長さであり、結果として抗原全体は３５アミノ酸の長さとなる。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、抗原はＮ末端リジンを含む。
特定の態様では、抗原はＢ細胞抗原を含む。特定の態様では、そのような抗原は以下の構造を有する：（Ｂ細胞抗原）－（スペーサー）－（Ｔヘルパーペプチド）。特定の態様では、Ｂ細胞抗原（例えば、コロナウイルスのＳ２抗原）は３１アミノ酸の長さであり、スペーサーは３アミノ酸の長さであり、Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥ）は１３アミノ酸の長さであり、結果として抗原全体は４７アミノ酸の長さとなる。使用できるスペーサーの非限定的な例は、以下のアミノ酸配列の１つを含む：ＣＰＧＰＧ（配列番号５７９）、ＡＡＹ、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号５８０）、またはそれらの組み合わせ。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、抗原はＮ末端リジンを含む。
いくつかの態様では、抗原は、抗原の複数のエピトープのコンカテマーを含む。例えば、特定の態様では、抗原は次の構造を有する：（第１の隣接領域）－（第１のＴ細胞抗原）－（第１のスペーサー）－（第２のＴ細胞抗原）－（第２のスペーサー）－（第３のＴ細胞抗原）－（第２の隣接領域）。いくつかの態様では、第１の隣接領域及び第２の隣接領域は５アミノ酸の長さであり；第１のＴ細胞抗原、第２のＴ細胞抗原、及び第３のＴ細胞抗原は、９アミノ酸の長さであり；第１のスペーサー及び第２のスペーサーは３アミノ酸の長さであり、結果として抗原全体は４３アミノ酸の長さとなる。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、抗原はＮ末端リジンを含む。
いくつかの態様では、本開示のＥＶベースのワクチンの効力は、構造及び／または全長（例えば、隣接領域、スペーサー、及び／またはＴ及びＢ細胞抗原の長さ）を改変することによって調節することができる。
本開示の他の箇所に記載されるように、本明細書に記載のＥＶベースのワクチンは、例えば、目的の抗原をベースＥＶに単純に添加することによって、広範囲の疾患及び障害を治療するために使用することができる。いくつかの態様では、抗原は、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、原生動物、腫瘍、アレルゲン、自己抗原、またはそれらの任意の組み合わせに由来するか、及び／またはそれらを含む。
いくつかの態様では、抗原はウイルスに由来する。いくつかの態様では、抗原は、パンデミックを引き起こすウイルスに由来する。本明細書で使用される場合、「パンデミック」という用語は、特定の疾患が急速に広まり、広い地域と大部分の人口を巻き込み、短期間で州、国、または大陸の境界を越えて世界的な流行を形成できることを指す。特定の態様では、本明細書に記載のＥＶベースのワクチンを生成するためにＥＶに添加することのできる抗原は、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、クリミア・コンゴ出血熱（ＣＣＧＦ）ウイルス、ヘンドラウイルス、ラッサウイルス、マールブルグウイルス、サル痘ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、リフトバレー熱（ＲＶＦ）ウイルス、痘瘡ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、麻疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）、パルボウイルス（例えば、Ｂ１９ウイルス）、ノルボウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ライノウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるウイルスに由来する。
いくつかの態様では、抗原は、非ウイルス性病原体（例えば、細菌、寄生虫、真菌、原生動物、またはそれらの組み合わせ）に由来する。そのような病原体の非限定的な例は、次を含む：Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ細菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ）、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、連鎖状球菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、赤痢菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、クラミジア（例えば、ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ、ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｕｓ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、またはそれらの任意の組み合わせ。
本開示のＥＶで（例えば、本明細書に記載のプラグアンドプレイ法を使用して）発現させることができる抗原の追加の例は、ＷＯ２０２０１９１３６１Ａ２に提供されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、ペイロードは、対象において免疫応答を誘導することができる、コロナウイルス由来の抗原（本明細書において「コロナウイルス抗原」とも呼ばれる）である。いくつかの態様では、コロナウイルスは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、デルタコロナウイルス、またはそれらの組み合わせである。そのようなコロナウイルスの例示的な説明は、例えば、Ｋｒｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ａｄｖ ７（１０）：ｅａｂｆ１００４（Ｍａｒ． ２０２１）に提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの態様では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）を含む。いくつかの態様では、コロナウイルスは、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ；ＥＭＣ／２０１２としても知られる）を含む。別段の指示がない限り、本明細書に開示されるＥＶで発現され得る抗原は、コロナウイルスの任意の種に由来し得る。例えば、特定の態様では、本明細書に記載のＥＶは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １５７（１２）：２３４９－５５（Ｄｅｃ． ２０１２）に記載されているようなコウモリコロナウイルス（ＢｔＣｏＶ）に由来する抗原を含む。いくつかの態様では、コロナウイルスは、人畜共通コロナウイルス（すなわち、動物からヒトに飛び移った）を含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７１（６５３０）：７３５－７４１（Ｆｅｂ． ２０２１）を参照されたい。本開示の特定の態様はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連するが、いくつかの態様では、そのような開示が他のタイプのコロナウイルス（例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）に等しく適用できることは当業者には明らかであろう。さらに、本明細書に記載のコロナウイルスに関する任意の関連する開示が、本明細書に記載の他の抗原にも等しく適用できることは、当業者には明らかであろう。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、単一の抗原を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは複数の抗原を含む。特定の態様では、複数の抗原のそれぞれは異なる。例えば、いくつかの態様では、複数の抗原は、同じ種のコロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９の複数の異なるタンパク質）に由来することができる。いくつかの態様では、複数の抗原は、コロナウイルスの異なる種に由来し得る（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに由来する１つ以上のタンパク質）。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なる抗原を含む。本明細書に開示されるように、抗原は、足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）を使用してＥＶの表面に連結され得る。特定の態様では、抗原は、ＥＶの表面に直接（すなわち、足場部分を使用せずに）連結され得る。いくつかの態様では、抗原はＥＶの内腔に存在し得る。本開示から明らかなように、いくつかの態様では、抗原（例えば、コロナウイルス抗原）を含むＥＶは、可溶型である（すなわち、ＥＶと結合していない）１つ以上の追加の抗原と組み合わせて使用することができる。例えば、特定の態様では、本明細書に記載のＥＶベースのワクチンは、（ｉ）コロナウイルスのＲＢＤタンパク質（「ｅｘｏＲＢＤ」）を含むＥＶと、（ｉｉ）コロナウイルスＴ細胞エピトープを含む可溶性ペプチド抗原と、を含む。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、ｅｘｏＲＢＤは、アジュバント（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト）をさらに含むことができる。
いくつかの態様では、ＥＶは、本明細書に記載の１つ以上の追加のペイロード（例えば、アジュバント及び／または免疫モジュレーター）と組み合わせて、１つ以上の抗原を含む。いくつかの態様では、ＥＶは、１つ以上の追加の部分（例えば、標的化部分）を含み得る。例えば、特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶは、（ｉ）１つ以上の追加の抗原と、（ｉｉ）１つ以上の追加のペイロード（例えば、アジュバント及び／または免疫モジュレーターと、（ｉｉｉ）１つ以上の標的化部分と、を含み得る。
いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、任意のＳＡＲＳコロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに対する免疫応答を誘導することができるユニバーサル抗原である。したがって、いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、ＳＡＲＳコロナウイルスのタンパク質由来の少なくとも５つの連続したアミノ酸に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ユニバーサル抗原は、複数のコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＭＥＲＳ）のタンパク質に由来するため、ユニバーサル抗原を含むＥＶは、ＥＶが対象に投与されたとき、多くの異なるタイプのコロナウイルスに対する免疫応答を誘導することができる（すなわち、交差反応性免疫応答）。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、ユニバーサル抗原は、異なるコロナウイルスのＲＢＤタンパク質に由来する（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＭＥＲＳに由来するＲＢＤ）。
本開示に有用なコロナウイルス抗原は、コロナウイルスゲノムの任意のコード領域に由来することができる。例えば、いくつかの態様では、コロナウイルス抗原は、ウイルス複製に必須ではないが病因において役割を果たしていると思われるものなどのアクセサリータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の１つ以上に由来する。このようなＯＲＦの非限定的な例としては、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、ＯＲＦ３ａ、ＯＲＦ３ｂ、ＯＲＦ７ｂ、ＯＲＦ９ｂ、ＯＲＦ９ｃ、ＯＲＦ１０、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ Ｊ １７（１）：１３１（Ａｕｇ． ２０２０）；及びＦｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５８９：１２５－１３０（Ｓｅｐ． ２０２０）を参照されたい。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の態様では、コロナウイルス抗原は、コロナウイルス構造タンパク質である、スパイクタンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質、及びヌクレオキャプシドタンパク質のうちの１つ以上に由来する。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは少なくとも２つの抗原を含み、第１の抗原は体液性免疫応答、例えばＢ細胞応答を誘導することができ、第２の抗原は細胞性免疫応答、例えばＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞）応答を誘導することができる。いくつかの態様では、体液性免疫応答誘導抗原は、ＥＶの外側表面に存在する。いくつかの態様では、細胞性免疫応答誘導抗原は、ＥＶの内腔内（内腔表面上）に存在する。いくつかの態様では、体液性免疫応答誘導抗原は、ＥＶの内腔内（内腔表面上）に存在する。いくつかの態様では、細胞性免疫応答誘導抗原は、ＥＶの外側表面に存在する。
いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来するスパイクタンパク質の受容体結合モチーフ（「受容体結合ドメイン」（ＲＢＤ）としても知られる）を含む。本明細書で使用される場合、「受容体結合ドメイン」または「ＲＢＤ」という用語は、配列番号５８１に示されるようなコロナウイルスのすべての既知のＲＢＤ、及びその任意のバリアントを含む。いくつかの態様では、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来するＳタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも５つのアミノ酸を含む。本明細書に開示されるコロナウイルスのスパイクタンパク質は、三量体クラスＩ融合タンパク質を含み、これは、ダウン（閉鎖）またはアップ（開放）の立体配座であり得る。図３に示すように、コロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメインは、スパイクタンパク質がアップ（開放）立体配座にあるときに露出する。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、ＥＶはコロナウイルスのスパイクタンパク質（またはその断片）を抗原として含む。そのような態様では、スパイクタンパク質は、三量体構成であり得る。いくつかの態様では、スパイクタンパク質は、単量体サブユニットとしてＥＶに提示され得る。本明細書に開示されるコロナウイルスのスパイクタンパク質、ならびに異なるサブユニット（例えば、ＲＢＤ）に関するさらなる開示は、Ｄｕ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７：２２６－２３６（２００９）において提供され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の態様では、ＲＢＤは単量体である。いくつかの態様では、ＲＢＤは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １８２（３）：７２２－７３３（Ａｕｇ． ２０２０）に記載されているように二量体である。
いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する、スパイクタンパク質Ｓ１、Ｓ２、及び／またはＳ２’に由来する少なくとも５つのアミノ酸を含む。いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する、スパイクタンパク質Ｓ１に由来する少なくとも５つのアミノ酸を含む。いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する、スパイクタンパク質Ｓ２に由来する少なくとも５つのアミノ酸を含む。いくつかの態様では、抗原は、グリコシル化を欠くコロナウイルススパイクＳ２タンパク質の高度に保存された領域（「グリカンホール」）を含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＹｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８：１５０９２（Ａｐｒ． ２０１７）を参照されたい。いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する、スパイクタンパク質Ｓ２’に由来する少なくとも５つのアミノ酸を含む。いくつかの態様では、本開示に有用な抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する、スパイクタンパク質Ｓ２’に由来する少なくとも５つのアミノ酸を含む。特定の態様では、抗原は、Ｓ２タンパク質に由来する直鎖状エピトープを含む。いくつかの態様では、抗原は、Ｓ２タンパク質の立体配座エピトープを含み、立体配座エピトープは、免疫応答を誘発することができ、及び／またはＳ２タンパク質に天然に見られる折り畳みに折り畳むことができる。
いくつかの態様では、抗原は、コロナウイルス、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来するアミノ酸エピトープを含む。いくつかの態様では、ＥＶは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の抗原を含み、第１の抗原は、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する。いくつかの態様では、第２の抗原もまた、コロナウイルス、例えばＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する。いくつかの態様では、第２の抗原は、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来しない。いくつかの態様では、第１の抗原及び第２の抗原は、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する。いくつかの態様では、第１の抗原と第２の抗原は同じである。いくつかの態様では、第１の抗原と第２の抗原は同じである。他の態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来しない。
いくつかの態様では、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、スパイク（Ｓ）タンパク質（任意のそのバリアントを含む）に由来する。特定の態様では抗原はＳタンパク質全体を含む。いくつかの態様では、抗原は、Ｓタンパク質の断片を含む。いくつかの態様では、抗原は、Ｓタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、エンベロープ（Ｅ）タンパク質（任意のそのバリアントを含む）に由来する。特定の態様では抗原はＥタンパク質全体を含む。いくつかの態様では、抗原は、Ｅタンパク質の断片を含む。いくつかの態様では、抗原は、Ｅタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、膜（Ｍ）タンパク質（任意のそのバリアントを含む）に由来する。特定の態様では抗原はＭタンパク質全体を含む。いくつかの態様では、抗原は、Ｍタンパク質の断片を含む。いくつかの態様では、抗原は、Ｍタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＳタンパク質に由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＳタンパク質に由来する。いくつかの態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルス、例えばＣＯＶＩＤ－１９ウイルスのＳタンパク質に由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＥタンパク質に由来する。いくつかの態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＳタンパク質に由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＭタンパク質に由来する。
いくつかの態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＥタンパク質に由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＳタンパク質に由来する。いくつかの態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＥタンパク質に由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＥタンパク質に由来する。いくつかの態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＥタンパク質に由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＭタンパク質に由来する。
いくつかの態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＭタンパク質に由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＳタンパク質に由来する。いくつかの態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＭタンパク質に由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＥタンパク質に由来する。いくつかの態様では、第１の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＭタンパク質に由来し、第２の抗原はコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスのＭタンパク質に由来する。例示的なコロナウイルス配列を以下に開示する：
Figure 2023518414000001
いくつかの態様では、本開示に有用な（例えば、体液性免疫応答を誘導するための）抗原は、スパイクタンパク質（Ｓ１タンパク質）の受容体結合ドメイン及び／または他の保存された領域（例えば、Ｍタンパク質及び／またはＮタンパク質内）以外のコロナウイルスの領域に由来する。特定の態様では、そのような抗原を含むＥＶは、ウイルス感染の抗体依存性増強のリスクを低減することができる。
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、コロナウイルス由来の抗原は、足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）に連結されたＥＶにおいて発現する。いくつかの態様では、本明細書に開示されるコロナウイルス抗原は、ＥＶの表面（例えば、外側表面）に直接連結され得る。本開示の他の箇所でさらに記載されているように、いくつかの態様では、本開示のＥＶで発現することができるコロナウイルス抗原は、コロナウイルスに由来するスパイクタンパク質を含む。特定の態様では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの態様では、ＥＶで発現され得るコロナウイルススパイクタンパク質（すなわち、抗原）は、完全な（すなわち、全長）三量体タンパク質（すなわち、「スパイク三量体」）を含む。したがって、特定の態様では、スパイク三量体は、ＥＶの表面（例えば、外側表面）に直接連結されている。
いくつかの態様では、ＥＶで発現され得るコロナウイルススパイクタンパク質（すなわち、抗原）は、三量体スパイクタンパク質の単量体サブユニット（すなわち、「スパイク単量体」）を含む。いくつかの態様では、スパイク単量体は、ＥＶの表面（例えば、外側表面）に直接連結されている。いくつかの態様では、スパイク単量体は、本明細書に開示される足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）に連結されたＥＶの表面（例えば、外側表面）上で発現する。特定の態様では、スパイク単量体は、足場Ｘに連結されたＥＶの外側表面上で発現する。
いくつかの態様では、ＥＶで発現され得るコロナウイルススパイクタンパク質（すなわち、抗原）は、全長スパイクタンパク質の１つ以上のサブユニット（すなわち、「ｅｘｏ－スプリット－スパイク」）を含む。コロナウイルススパイクタンパク質の構造は、その異なるサブユニットとともに、当該技術分野で知られている。例えば、Ｆａｎｇ Ｌｉ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ ３（１）：２３７－２６１（Ｓｅｐ． ２０１６）を参照されたい。いくつかの態様では、コロナウイルススパイクタンパク質のサブユニットのいずれかが、本開示のＥＶにおいて発現され得る。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、スパイクタンパク質の１つ以上のサブユニットは、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。いくつかの態様では、ＲＢＤは、ＥＶの表面（例えば、外側表面）に直接連結されている。いくつかの態様では、ＲＢＤは、本明細書に開示される足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）に連結されたＥＶの表面（例えば、外側表面）上で発現する。特定の態様では、コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤは、足場Ｘに連結されたＥＶの外側表面上で発現される。当業者には明らかである。
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本明細書に記載のＥＶは、複数（例えば、２つ以上）のコロナウイルス抗原（例えば、本明細書に開示される）を発現することができる。特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶは、スパイクタンパク質（例えば、全長タンパク質またはそのサブユニット）と、Ｔ細胞エピトープを含むコロナウイルス抗原（「Ｔ抗原」）と、を発現することができる（例えば、図２を参照されたい）。これらの態様のいくつかにおいて、スパイクタンパク質抗原（例えば、受容体結合ドメイン）は、ＥＶの外側表面上で発現できるが、Ｔ抗原は、ＥＶの内腔表面上で発現する。
したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、（ｉ）スパイクタンパク質抗原（例えば、受容体結合ドメイン）と、（ｉｉ）Ｔ抗原と、を含み、スパイクタンパク質抗原は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに（例えば、Ｎ末端で）連結され、Ｔ抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに（例えば、Ｃ末端で）連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは以下を含む：（ｉ）スパイクタンパク質抗原（例えば、受容体結合ドメイン）と、（ｉｉ）Ｔ抗原と、を含み、スパイクタンパク質抗原は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに（例えば、Ｎ末端で）連結され、Ｔ抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは以下を含む：（ｉ）スパイクタンパク質抗原（例えば、受容体結合ドメイン）と、（ｉｉ）Ｔ抗原と、を含み、スパイクタンパク質抗原は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに（例えば、Ｎ末端で）連結され、Ｔ抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは以下を含む：（ｉ）スパイクタンパク質抗原（例えば、受容体結合ドメイン）と、（ｉｉ）Ｔ抗原と、を含み、スパイクタンパク質抗原は、ＥＶの外側表面に直接連結され、Ｔ抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに（例えば、Ｃ末端で）連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）スパイクタンパク質抗原（例えば、受容体結合ドメイン）と、（ｉｉ）Ｔ抗原と、を含み、スパイクタンパク質抗原はＥＶの外側表面に直接連結され、Ｔ抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）スパイクタンパク質抗原（例えば、受容体結合ドメイン）と、（ｉｉ）Ｔ抗原と、を含み、スパイクタンパク質抗原はＥＶの外側表面に直接連結され、Ｔ抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されている。
いくつかの態様では、本明細書に記載のＥＶベースのワクチンを産生するためにＥＶに添加することができる抗原は、コロナウイルスＴ細胞抗原のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８（１１）：５６１２－８（Ｊｕｎ． ２００４）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０４（１）：２００－６（Ｊｕｌ． ２００４）；Ｔｓａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３４４（１）：６３－７１（Ｍａｙ ２００６）；Ｌｖ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：６１（Ｄｅｃ． ２００９）；及びＡｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ １２（３）：２５４（Ｍａｒ． ２０２０）；Ｇｒｉｆｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ ２７：６７１－６８０（Ａｐｒ． ２０２０）に記載されるようなものである。表２（以下）も参照されたい。
Figure 2023518414000002
Figure 2023518414000003
Figure 2023518414000004
Figure 2023518414000005
Figure 2023518414000006
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、上記のスパイクタンパク質抗原及びＴ抗原を含むＥＶは、本明細書に開示される１つ以上の追加の部分（例えば、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）をさらに発現することができる。そのようなＥＶに関するさらなる開示は、本開示の他の箇所で提供される。
いくつかの態様では、抗原、例えば、第１の抗原及び／または第２の抗原は、ＥＶの外側表面上または内腔（例えば、内腔表面上）で発現する。いくつかの態様では、第１の抗原及び／または第２の抗原は、脂質二重層に直接接続してＥＶの外側表面上または内腔表面内に発現する。そのような態様では、第１の抗原及び／または第２の抗原は、足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）に連結され得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載のＥＶは、第１の足場部分を含む。特定の態様では、第１の抗原は、第１の足場部分に連結されている。他の態様では、第２の抗原は、第１の足場部分に連結されている。さらなる態様では第１の抗原と第２の抗原の両方は、第１の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、第２の足場部分をさらに含む。特定の態様では、第１の抗原は、第１の足場部分に連結され、第２の抗原は第２の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第１の足場部分と第２の足場部分は同じ（例えば、両方ともが足場Ｘまたは両方ともが足場Ｙ）である。他の態様では、第１の足場部分と第２の足場部分は異なる（例えば、第１の足場部分が足場Ｘであり、第２の足場部分が足場Ｙである；あるいは、第１の足場部分が足場Ｙであり、第２の足場部分が足場Ｘである）。
足場Ｘの非限定的な例としては以下が挙げられる：プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブ制御因子（ＰＴＧＦＲＮ）、ベイシジン（ＢＳＧ）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）、インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１）、インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４）、４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）、及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ）。特定の態様では、足場Ｘはタンパク質全体である。他の態様では、足場Ｘはタンパク質断片（例えば、機能的断片）である。
他の態様では、本開示に有用な足場部分、第１の足場部分、第２の足場部分、及び／または第３の足場部分としては、テトラスパニン分子（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９など）、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２及びＬＡＭＰ２Ｂ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン及びその断片、これらのタンパク質またはその断片のいずれかに親和性を有するペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない従来のエキソソームタンパク質が挙げられる。
足場Ｙの非限定的な例としては、以下が挙げられる：ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質；ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）タンパク質；及び脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）タンパク質。いくつかの態様では、足場Ｙはタンパク質全体である。特定の態様では、足場Ｙはタンパク質断片（例えば、機能的断片）である。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔表面の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの内腔に存在する。本明細書で使用される場合、分子（例えば、第１の抗原または第２の抗原）がＥＶの「内腔に存在する」と記載されている場合、それは、分子が本明細書に記載の足場部分に連結されていないことを意味する。いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔に存在し、第２の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結されている。そのような態様では、第１の足場は足場Ｘまたは足場Ｙであり得る。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第２の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、第１の抗原は、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。これらの態様では、第１の足場部分は足場Ｙであってよく、第２の足場部分は足場Ｘであってよい。他の態様では、第１の足場部分及び第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘであってよい。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第２の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第２の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、第１の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第２の足場部分に連結されている。そのような態様では、第１の足場部分は足場Ｘであり、第２の足場部分は足場Ｙであるか、また第１の足場部分及び第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘである。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔に存在し、第２の抗原は、ＥＶの内腔に存在する。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。他の態様では、第２の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、第１の抗原は、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第１の足場部分と第２の足場部分は足場Ｘである。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの内腔に存在する。いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔に存在し、第２の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結されている。そのような態様では、第１の足場は足場Ｘであり得る。
いくつかの態様では、第１の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結されている。他の態様では、第１の抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、第２の抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結されている。これらの態様では、第１の足場は足場Ｘであり得る。
特定の態様の非限定的な例には、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含むＥＶが含まれ、
（ａ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の第１の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面の第２の足場Ｙに連結されているか；
（ｂ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｃ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、第２の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｙに連結されているか；
（ｄ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面の足場Ｘに連結されているか；
（ｅ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、第２の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｆ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｘに連結されているか；
（ｇ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、第２の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｘに連結されているか；
（ｈ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｉ）第１の抗原はＥＶの外側表面の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｊ）第１の抗原はＥＶの外側表面の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｙに連結されているか；
（ｋ）第１の抗原はＥＶの外側表面の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｌ）第１の抗原はＥＶの外側表面の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｘに連結されているか；
（ｍ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｎ）第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｏ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｐ）第１の抗原はＥＶの外側表面の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｑ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｒ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、第２の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｓ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
（ｔ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在するか；
（ｕ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｙに連結されているか；
（ｖ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｘに連結されているか；
（ｗ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの外側に直接連結されているか；
（ｘ）第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの外側の足場Ｘに連結されているか；
（ｙ）抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
（ｚ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの外側に直接連結されているか；
（ａａ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
（ｂｂ）第１の抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側に直接連結されているか；
（ｃｃ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されているか、または
（ｄｄ）第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの外側に直接連結されている。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、第２の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、第２の抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔に存在している。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの外側に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、第２の抗原はＥＶの外側上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、第２の抗原はＥＶの外側に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、第２の抗原はＥＶの外側に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）第１の抗原と、（ｉｉ）第２の抗原と、を含み、第１の抗原はＥＶの内腔に存在し、第２の抗原はＥＶの外側に直接連結されている。
ＩＩ．Ｂ アジュバント
上記のように、本開示のＥＶは、アジュバントを（例えば、抗原及び／または本明細書に開示される他のペイロードと組み合わせて）含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは複数のアジュバントを含む。特定の態様では、複数のアジュバントのそれぞれは異なる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるアジュバントを含む。本明細書に開示されるように、アジュバントは、足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）を使用してＥＶの表面に連結され得る。特定の態様では、アジュバントは、ＥＶの表面に直接（すなわち、足場部分を使用せずに）連結され得る。いくつかの態様では、アジュバントはＥＶの内腔に存在し得る。
いくつかの態様では、ＥＶは、１つ以上の追加のペイロード（例えば、抗原、及び／または免疫モジュレーター）と組み合わせて１つ以上のアジュバントを含む。例えば、特定の態様では、本明細書に記載のＥＶは、抗原とアジュバントとを含み、アジュバントは、抗原の添加前にＥＶに存在する。そのような態様では、アジュバントは、ＥＶ（例えば、ベースＥＶ）を産生するときにプロデューサー細胞に導入することができる。いくつかの態様では、アジュバントは、プロデューサー細胞から単離された後にＥＶに添加され得る。そのような態様では、アジュバントは、抗原を添加する前に、単離されたＥＶに添加され得る。いくつかの態様では、アジュバントは抗原を添加した後にＥＶに添加される。いくつかの態様では、アジュバントは、抗原と一緒にＥＶに添加される。いくつかの態様では、ＥＶは、１つ以上の追加の部分（例えば、標的化部分）を含み得る。例えば、特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶは、（ｉ）１つ以上の追加のアジュバントと、（ｉｉ）１つ以上の追加のペイロード（例えば、抗原及び／または免疫モジュレーターと、（ｉｉｉ）１つ以上の標的化部分と、を含み得る。本明細書に記載されているように、いくつかの態様では、アジュバント、追加のペイロード、及び／または標的化部分のいずれかが、ＥＶの他の部分のいずれかの添加の前にＥＶに存在し得る（例えば、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分は、抗原の添加前にＥＶに存在することができる）。特定の態様では、アジュバント、追加のペイロード、及び／または標的化部分をＥＶに同時に追加することができる。
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、ペイロードの治療効果を高める（例えば、抗原に対する免疫応答を高める）任意の物質を指す。したがって、アジュバントを含む本明細書に記載のＥＶは、例えば抗原に対する免疫応答を、参照（例えば、アジュバントを含まない対応するＥＶ、または抗原を単独でもしくはアジュバントと組み合わせて含む非ＥＶ送達ビヒクル）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約１，０００％、またはそれ以上高めることができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるアジュバントをＥＶに組み込むことは、例えば抗原に対する免疫応答を、参照（例えば、抗原単独を含む対応するＥＶ、または抗原単独もしくはアジュバントとの組み合わせを含む非ＥＶ送達ビヒクル）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、またはそれ以上高めることができる。
いくつかの態様では、本明細書に記載のＥＶ（例えば、ワクチンとして使用できるもの）は、単一のアジュバントを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは複数のアジュバントを含む。そのような態様では、複数のアジュバントの一部またはすべては、（ｉ）アジュバントを含むベースＥＶが産生されるように、プロデューサー細胞に導入することができるか；（ｉｉ）ＥＶに添加でき、ＥＶはプロデューサー細胞から単離されているが、抗原の追加前であるか；（ｉｉｉ）抗原の添加後にＥＶに追加できるか；（ｉｖ）抗原と一緒にＥＶに追加できるか；または（ｖ）それらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの態様では、複数のアジュバントのそれぞれは異なる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるアジュバントを含む。本明細書に開示されるように、アジュバントは、足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）を使用してＥＶの表面に連結され得る。特定の態様では、アジュバントは、ＥＶの表面に直接（すなわち、足場部分を使用せずに）連結され得る。いくつかの態様では、アジュバントはＥＶの内腔に存在し得る。
本開示で使用することのできるアジュバントの非限定的な例としては以下が挙げられる：インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、炎症メディエーター、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、α－ｇａｌ－ｃｅｒ（ＮＫＴアゴニスト）、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０）、Ｃ型レクチンアゴニスト（例えば、ベータグルカン（デクチン１）、キチン、及びカードラン）、及びそれらの組み合わせ。本明細書に記載のＥＶとともに使用することができるアジュバントの追加の例は、本開示を通して提供される。
いくつかの態様では、アジュバントはＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの態様では、ＴＬＲ９アゴニストはＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」（ＣｐＧ ＯＤＮ）という用語は、特定の配列コンテクスト（ＣｐＧモチーフ）においてメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む短い合成一本鎖核酸分子を指す。ＣｐＧ ＯＤＮには、クラスＡ（タイプＤ）、クラスＢ（タイプＫ）、及びクラスＣの３つの主要なクラスがある。いくつかの態様では、アジュバントはＣｐＧ－Ａ ＯＤＮである。「ＣｐＧ－Ａ」ＯＤＮは、ホスホジエステル（ＰＯ）中心ＣｐＧ含有パリンドロームモチーフ及びホスホロチオ化（ＰＳ）改変３’ポリＧストリングによって特徴付けられる。それらはｐＤＣからの高いＩＦＮ－α産生を誘導するが、ＴＬＲ９依存性ＮＦ－κＢシグナル伝達及び炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ－６）産生の弱い刺激因子である。いくつかの態様では、アジュバントはＣｐＧ－Ｂ ＯＤＮである。「ＣｐＧ－Ｂ」ＯＤＮは、１つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む完全なＰＳ骨格を含む。それらはＢ細胞とＴＬＲ９依存性ＮＦ－κＢシグナル伝達を強く活性化するが、ＩＦＮ－α分泌を弱く刺激する。いくつかの態様では、アジュバントは、ＣｐＧ－Ｃ ＯＤＮである。「ＣｐＧ－Ｃ」ＯＤＮは、クラスＡとクラスＢの両方の機能を兼ね備えている。それらは完全なＰＳ骨格とＣｐＧ含有回文モチーフを含む。ＣクラスＣｐＧ ＯＤＮは、ｐＤＣからの強力なＩＦＮ－α産生とＢ細胞刺激を誘導する。
いくつかの態様では、アジュバントはＴＬＲ４アゴニストである。特定の態様では、ＴＬＲ４アゴニストは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒ５９５リポ多糖（ＬＰＳまたはエンドトキシン）由来のリピドＡの誘導体を含む。
いくつかの態様では、アジュバント（例えば、本明細書に開示されるものなど）をＥＶに組み込むことは、ＥＶによって誘導される免疫応答を拡大することができる。本明細書で使用される場合、「免疫応答を拡大する」とは、免疫応答の多様性を増強することを指す。いくつかの態様では、免疫応答の多様性は、エピトープ拡散（すなわち、抗原上のより多くの／多様なエピトープに対する免疫応答（細胞性免疫応答及び／または体液性免疫応答）を誘導及び／または増加させること）によって増強することができる。いくつかの態様では、免疫応答の多様性は、異なる及び／または複数の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、及び／またはＩｇＥ）の産生を通じて増強され得る。
いくつかの態様では、アジュバント（例えば、本明細書に開示されるものなど）はまた、ＥＶによって誘導される免疫応答の種類を調節することもできる。例えば、いくつかの態様では、ＥＶにアジュバントを組み込むことは、免疫応答をよりＴｈ１表現型に向かわせるのを助けることができる。本明細書で使用される場合、「Ｔｈ１」免疫応答は、一般的に、自然細胞（例えば、マクロファージ）の殺菌活性を活性化し、Ｂ細胞がオプソニン作用（食作用のマーキング）及び補体結合抗体を作るのを助け、及び／または細胞性免疫（すなわち、抗体によって媒介されない）をもたらすことのできる、ＩＦＮ－γの産生によって特徴付けられる。一般に、Ｔｈ１応答は、細胞内病原体（宿主細胞内にあるウイルス及び細菌）に対してより効果的である。
いくつかの態様では、ＥＶにアジュバントを組み込むことは、免疫応答をよりＴｈ２表現型に向かわせるのを助けることができる。本明細書で使用される場合、「Ｔｈ２」免疫応答は、ＩＬ－５（寄生虫のクリアランスにおいて好酸球を誘導する）及びＩＬ－４（Ｂ細胞アイソタイプスイッチングを促進する）などの特定のサイトカインの放出によって特徴付けることができる。一般的に、Ｔｈ２応答は、細胞外細菌、蠕虫及び毒素を含む寄生虫に対してより効果的である。
いくつかの態様では、ＥＶにアジュバントを組み込むことは、免疫応答をよりＴｈ１７表現型に向かわせるのを助けることができる。本明細書で使用される場合、「Ｔｈ１７」免疫応答は、Ｔｈ１７細胞によって媒介される。本明細書で使用される場合、「Ｔｈ１７細胞」は、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などの炎症促進性サイトカインの産生によって特徴付けられるＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットを指す。Ｔｈ１７細胞は、好中球及びマクロファージを感染組織に動員することにより、感染に対する宿主防御において重要な役割を果たすと一般に考えられている。
いくつかの態様では、ＥＶにアジュバントを組み込むことは、免疫応答をより細胞性免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介の）に向かわせるのを助けることができる。いくつかの態様では、ＥＶにアジュバントを組み込むことは、免疫応答をより体液性免疫応答（例えば、抗体媒介の）に向かわせるのを助けることができる。
いくつかの態様では、アジュバントは、サイトゾルパターン認識受容体の活性化を誘導する。いくつかの態様では、そのようなアジュバントはウイルス核酸模倣物である。いずれか１つの理論に拘束されるものではないが、そのようなアジュバントを含むＥＶは、Ｔｈ１（例えば、ＩＦＮ）及び／または抗体媒介性免疫応答を優先的に誘導することができる。細胞質パターン認識受容体の非限定的な例としては以下が挙げられる：インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－１）、メラノーマ分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン、ロイシンリッチリピート及びピリンドメイン含有（ＮＬＲＰ）、インフラマソーム、またはそれらの組み合わせ。特定の態様では、アジュバントはＳＴＩＮＧアゴニストである。インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）は、典型的には細菌によって産生される環状ジヌクレオチドの細胞質センサーである。活性化されると、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α（アルファ）、ＩＦＮ－β（ベータ）、ＩＦＮ－κ（カッパ）、ＩＦＮ－δ（デルタ）、ＩＦＮ－ε（イプシロン）、ＩＦＮ－τ（タウ）、ＩＦＮ－ω（オメガ）、及びＩＦＮ－ζ（ゼータ、リミチンとしても知られる））の産生を導き、免疫応答を開始する。特定の態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、環状ジヌクレオチドのＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドのＳＴＩＮＧアゴニストを含む。本明細書で記載されるように、いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶの内腔にロードされる。いくつかの態様では、そのようなＥＶは、本明細書では「ｅｘｏＳＴＩＮＧ」と呼ばれる。ｅｘｏＳＴＩＮＧの非限定的な例は、国際公開第ＷＯ２０１９１８３５７８Ａ１号に提供され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。有用なＳＴＩＮＧアゴニストのさらなる開示も、本開示全体にわたって提供される。
ｃＧＭＰ、環状ジ－ＧＭＰ（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ）、ｃＡＭＰ、環状ジ－ＡＭＰ（ｃ－ｄｉ－ＡＭＰ）、環状－ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、環状ｄｉ－ＩＭＰ（ｃ－ｄｉ－ＩＭＰ）、環状ＡＭＰ－ＩＭＰ（ｃＡＩＭＰ）などであるがこれらに限定されない環状プリンジヌクレオチド、及びそれらの任意の類似体は、患者の免疫応答または炎症応答を刺激または増強することが知られている。ＣＤＮは、環状ジヌクレオチド同士を結合する２’２’、２’３’、２’５’、３’３’、もしくは３’５’結合、またはそれらの任意の組み合わせを有し得る。
環状プリンジヌクレオチドは、標準的な有機化学技術によって改変することでプリンジヌクレオチドの類似体を生成することができる。適切なプリンジヌクレオチドとしては、アデニン、グアニン、イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、イソグアニン、または当該技術分野で知られている他の適切なプリンジヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。環状ジヌクレオチドは改変された類似体であってもよい。ホスホロチオエート、ビホスホロチオエート、フルオリネート、及びジフルオリネートの改変を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の適切な改変を使用することができる。
５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）、または当該技術分野で知られている他の任意の非環状ジヌクレオチドアゴニストなどの非環状ジヌクレオチドアゴニストも使用することができる。
本開示で使用できるＳＴＩＮＧアゴニストの非限定的な例としては、ＤＭＸＡＡ、ＳＴＩＮＧアゴニスト－１、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡ、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ｃ－ジ－ＧＭＰ、ＭＬ－ＲＲ－Ｓ２ ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃ－ｄｉ－ＡＭ（ＰＳ）２、２’３’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＨＳ、３’３’－ｃＧＡＭＰ、３’３’－ｃＧＡＭＰｄＦＳＨ、ｃＡＩＭＰ、ｃＡＩＭ（ＰＳ）２、３’３－ｃＡＩＭＰ、３’３’－ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ、２’２’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭ（ＰＳ）２、３’３’－ｃＧＡＭＰ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。ＳＴＩＮＧアゴニストの非限定的な例は、米国特許第９，６９５，２１２号、ＷＯ２０１４／１８９８０５Ａ１、ＷＯ２０１４／１７９３３５Ａ１、ＷＯ２０１８／１００５５８Ａ１、米国特許第１０，０１１，６３０Ｂ２号、ＷＯ２０１７／０２７６４６Ａ１、ＷＯ２０１７／１６１３４９Ａ１、及びＷＯ２０１６／０９６１７４Ａ１に見出すことができ、これらはそれぞれ参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、該化合物または薬学的に許容されるその塩を含む。全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／０９６１７４Ａ１を参照されたい。
いくつかの態様では、本開示に有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＷＯ２０１４／０９３９３６、ＷＯ２０１４／１８９８０５、ＷＯ２０１５／０７７３５４、Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １１，１０１８－１０３０（２０１５）、ＷＯ２０１３／１８５０５２、Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．２８３，２８３ｒａ５２（２０１５）、ＷＯ２０１４／１８９８０６、ＷＯ２０１５／１８５５６５、ＷＯ２０１４／１７９７６０、ＷＯ２０１４／１７９３３５、ＷＯ２０１５／０１７６５２、ＷＯ２０１６／０９６５７７、ＷＯ２０１６／１２０３０５、ＷＯ２０１６／１４５１０２、ＷＯ２０１７／０２７６４６、ＷＯ２０１７／０７５４７７、ＷＯ２０１７／０２７６４５、ＷＯ２０１８／１００５５８、ＷＯ２０１７／１７５１４７、ＷＯ２０１７／１７５１５６に記載される化合物を含み、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０６、ＣＬ６１１、ＣＬ６０２、ＣＬ６５５、ＣＬ６０４、ＣＬ６０９、ＣＬ６１４、ＣＬ６５６、ＣＬ６４７、ＣＬ６２６、ＣＬ６２９、ＣＬ６０３、ＣＬ６３２、ＣＬ６３３、ＣＬ６５９、またはそれらの薬学的に許容されるそれらの塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０６またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６１１またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０２またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６５５またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０４またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０９またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６１４またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６５６またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６４７またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６２６またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６２９またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６０３またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６３２またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６３３またはその薬学的に許容されるその塩である。いくつかの態様では、本開示で有用なＳＴＩＮＧアゴニストは、ＣＬ６５９またはその薬学的に許容されるその塩である。
いくつかの態様では、ＥＶは、環状ジヌクレオチドのＳＴＩＮＧアゴニスト及び／または非環状ジヌクレオチドのＳＴＩＮＧアゴニストを含む。いくつかの態様では、いくつかの環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストが本明細書に開示されるＥＶ上に存在する場合、そのようなＳＴＩＮＧアゴニストは同じであっても異なっていてもよい。いくつかの態様では、いくつかの非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストが存在する場合、そのようなＳＴＩＮＧアゴニストは同じであっても異なっていてもよい。いくつかの態様では、本開示のＥＶ組成物は、ＥＶの２つ以上の集団を含むことができ、ＥＶのそれぞれの集団は、異なるＳＴＩＮＧアゴニストまたはそれらの組み合わせを含む。
ＳＴＩＮＧアゴニストはまた、細胞外小胞またはＥＶ（例えば、内腔に結合していない）中へアゴニストのカプセル化（すなわち、ローディング）を増加させるように改変することができる。いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、足場部分、例えば、足場Ｙに連結されている。特定の態様では、改変は、ＥＶの外側表面上のＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、本明細書に開示される足場部分、例えば足場Ｘに連結された）のより良好な発現を可能とする。この改変には、アゴニストを化学物質または酵素で処理することによる、またはＳＴＩＮＧアゴニストの極性または電荷を物理的または化学的に変化させることによる脂質結合タグの付加が含まれ得る。ＳＴＩＮＧアゴニストは、単一の処理によって、または処理の組み合わせ、例えば、脂質結合タグのみを付加することのみ、または脂質結合タグを付加し、かつ極性を変化させることによって改変することができる。上記の例は、非限定的な例示的な例として意図されている。任意の改変の組み合わせを実施することができることが想到される。改変は、非改変アゴニストのカプセル化（すなわち、ローディング）と比較して、ＥＶにおけるアゴニストのカプセル化（すなわち、ローディング）を約２倍～約１０，０００倍、約１０倍～約１，０００倍、または約１００倍～約５００倍増加させることができる。改変は、非改変アゴニストのカプセル化（すなわち、ローディング）と比較して、ＥＶにおけるアゴニストのカプセル化（すなわち、ローディング）を、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、または少なくとも約１０，０００倍増加させることができる。
いくつかの態様では、ＳＴＩＮＧアゴニストは、ＥＶの表面（例えば、ＥＶの外側表面及び／または内腔表面（例えば本明細書に開示される足場部分、例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙに連結されている））上でのアゴニストのより良い発現を可能にするように改変され得る。上記の改変のいずれかを使用できる。改変は、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面及び／または内腔表面上でのアゴニストの発現を、非改変のアゴニストの対応する発現と比較して、約２倍～１０，０００倍、約１０倍～１，０００倍、または約１００倍～５００倍増加させることができる。改変は、非改変アゴニストの発現と比較して、ＥＶの外側表面上のアゴニストの発現を、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、または少なくとも約１０，０００倍増加させることができる。改変は、非改変アゴニストの発現と比較して、ＥＶの内腔表面上のアゴニストの発現を、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、少なくとも約９，０００倍、または少なくとも約１０，０００倍増加させることができる。
ＥＶに結合するＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ～１０００μＭであり得る。結合するＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１～０．０５μＭ、約０．０５～０．１μＭ、約０．１～０．５μＭ、約０．５～１μＭ、約１～５μＭ、約５～１０μＭ、約１０～１５μＭ、約１５～２０μＭ、約２０～２５μＭ、約２５～３０μＭ、約３０～３５μＭ、約３５～４０μＭ、約４５～５０μＭ、約５５～６０μＭ、約６５～７０μＭ、約７０～７５μＭ、約７５～８０μＭ、約８０～８５μＭ、約８５～９０μＭ、約９０～９５μＭ、約９５～１００μＭ、約１００～１５０μＭ、約１５０～２００μＭ、約２００～２５０μＭ、約２５０～３００μＭ、約３００～３５０μＭ、約２５０～４００μＭ、約４００～４５０μＭ、約４５０～５００μＭ、約５００～５５０μＭ、約５５０～６００μＭ、約６００～６５０μＭ、約６５０～７００μＭ、約７００～７５０μＭ、約７５０～８００μＭ、約８００～８５０μＭ、約８０５～９００μＭ、約９００～９５０μＭ、または約９５０～１０００μＭであり得る。結合するＳＴＩＮＧアゴニストの濃度は、約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約４５μＭ、約５０μＭ、約５５μＭ、約６０μＭ、約６５μＭ、約７０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約８５μＭ、約９０μＭ、約９５μＭ、約１００μＭ、約１５０μＭ、約２００μＭ、約２５０μＭ、約３００μＭ、約３５０μＭ、約４００μＭ、約４５０μＭ、約５００μＭ、約５５０μＭ、約６００μＭ、約６５０μＭ、約７００μＭ、約７５０μＭ、約８００μＭ、約８５０μＭ、約９００μＭ、約９５０μＭ、または約１，０００μＭ以上であり得る。
いくつかの態様では、アジュバントはＴＬＲアゴニストである。ＴＬＲアゴニストの非限定的な例は、次を含む：ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、リポテイコ酸、非定型ＬＰＳ、ＭＡＬＰ－２及びＭＡＬＰ－４０４、ＯｓｐＡ、ポリン、ＬｃｒＶ、リポマンナン、ＧＰＩアンカー、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、ザイモサン、ｈｓｐ６０、ｇＨ／ｇＬ糖タンパク質、ヘマグルチニン）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、二本鎖ＲＮＡ、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ））、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテイコ酸、β－デフェンシン２、フィブロネクチンＥＤＡ、ＨＭＧＢ１、スナピン、テネイシンＣ）、ＴＬＲ５アゴニスト（例えば、フラジェリン）、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト（例えば、一本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ－Ａ、ポリＧ１０、ポリＧ３、レシキモド）、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、メチル化されていないＣｐＧ ＤＮＡ）、及びそれらの組み合わせ。ＴＬＲアゴニストの非限定的な例は、ＷＯ２００８１１５３１９Ａ２、ＵＳ２０１３０２０２７０７Ａ１、ＵＳ２０１２０２１９６１５Ａ１、ＵＳ２０１０００２９５８５Ａ１、ＷＯ２００９０３０９９６Ａ１、ＷＯ２００９０８８４０１Ａ２、及びＷＯ２０１１０４４２４６Ａ１に見ることができ、これらのそれぞれは参照によりその全体が組み込まれる。いずれか１つの理論に拘束されるものではないが、いくつかの態様では、アジュバントとしてＴＬＲアゴニストを含むＥＶは、Ｔｈ１及び／または抗体媒介性免疫応答を優先的に誘導することができる。
いくつかの態様では、アジュバントは炎症メディエーターである。
いくつかの態様では、アジュバントは、アルミニウム含有アジュバント（本明細書では「ミョウバン」とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、アジュバントはアルミニウム塩を含む。特定の態様では、アルミニウム塩は水酸化アルミニウムである。いずれか１つの理論に拘束されるものではないが、いくつかの態様では、アジュバントとしてアルミニウム塩を含むＥＶは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）（例えば、ＮＬＲＰ３）活性化を媒介することができる。特定の態様では、そのようなＥＶは、Ｔｈ２細胞及び／または抗体媒介性免疫応答を優先的に誘導することができる。いくつかの態様では、アルミニウム含有アジュバントは、ＣｐＧなどの１つ以上の追加のアジュバントと組み合わせて使用することができる。
いくつかの態様では、本開示のＥＶとともに使用できるアジュバントは、エマルション（油中水）を含む。特定の態様では、エマルションはＭＦ５９及びＡＳ０３を含む。いずれか１つの理論に拘束されるものではないが、いくつかの態様では、エマルションをアジュバントとして含むＥＶは、ＡＰＣ抗原の取り込みを増強することができる。特定の態様では、そのようなＥＶは、強力な中和抗体を誘導することができる。いくつかの態様では、そのようなＥＶは、Ｔｈ１媒介免疫応答とＴｈ２媒介免疫応答の両方を誘導するのに有用である。いくつかの態様では、当該技術分野で知られている任意の適切なアジュバントを本開示とともに使用することができる（例えば、ＡＳ０４及びＡＳ０１）。
いくつかの態様では、１つ以上の抗原は、ＥＶの外側表面上または内腔（例えば、内腔表面上）で発現する。いくつかの態様では、アジュバントは、脂質二重層に直接接続してＥＶの外側表面上または内腔表面内に発現する。そのような態様では、抗原、例えば第１の抗原及び／または第２の抗原、及び／またはアジュバントは、足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）に連結され得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載のＥＶは、第１の足場部分を含む。特定の態様では、抗原は、第１の足場部分に連結されている。他の態様では、アジュバントは、第１の足場部分に連結されている。さらなる態様では抗原とアジュバントの両方は、第１の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、第２の足場部分をさらに含む。特定の態様では、抗原は第１の足場部分に連結され、アジュバントは第２の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第１の足場部分と第２の足場部分は同じ（例えば、両方ともが足場Ｘまたは両方ともが足場Ｙ）である。他の態様では、第１の足場部分と第２の足場部分は異なる（例えば、第１の足場部分が足場Ｘであり、第２の足場部分が足場Ｙである；あるいは、第１の足場部分が足場Ｙであり、第２の足場部分が足場Ｘである）。
足場Ｘの非限定的な例としては以下が挙げられる：プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブ制御因子（ＰＴＧＦＲＮ）、ベイシジン（ＢＳＧ）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）、インテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１）、インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４）、４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）、及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ）。特定の態様では、足場Ｘはタンパク質全体である。他の態様では、足場Ｘはタンパク質断片（例えば、機能的断片）である。
他の態様では、本開示に有用な足場部分、第１の足場部分、第２の足場部分、及び／または第３の足場部分としては、テトラスパニン分子（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９など）、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２及びＬＡＭＰ２Ｂ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン及びその断片、これらのタンパク質またはその断片のいずれかに親和性を有するペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含むがそれらに限定されない従来のエキソソームタンパク質が挙げられる。
足場Ｙの非限定的な例としては、以下が挙げられる：ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質；ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）タンパク質；及び脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）タンパク質。いくつかの態様では、足場Ｙはタンパク質全体である。特定の態様では、足場Ｙはタンパク質断片（例えば、機能的断片）である。
いくつかの態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、アジュバントはＥＶの内腔に存在する。いくつかの態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの内腔に存在し、アジュバントはＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結されている。そのような態様では、第１の足場は足場Ｘまたは足場Ｙであり得る。
いくつかの態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。これらの態様では、第１の足場部分は足場Ｙであってよく、第２の足場部分は足場Ｘであってよい。他の態様では、第１の足場部分及び第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘであってよい。
いくつかの態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の第２の足場部分に連結されている。他の態様では、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの内腔表面上の第２の足場部分に連結されている。そのような態様では、第１の足場部分は足場Ｘであり、第２の足場部分は足場Ｙであるか、また第１の足場部分及び第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘである。
いくつかの態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの内腔に存在し、アジュバントはＥＶの内腔に存在している。
いくつかの態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。他の態様では、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている。いくつかの態様では、第１の足場部分と第２の足場部分は足場Ｘである。
いくつかの態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、アジュバントはＥＶの内腔に存在する。いくつかの態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの内腔に存在し、アジュバントはＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結されている。そのような態様では、第１の足場は足場Ｘであり得る。
いくつかの態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結されている。他の態様では、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結されている。これらの態様では、第１の足場は足場Ｘであり得る。
特定の態様の非限定的な例としては、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含むＥＶが挙げられ、以下のようになっている：
（ａ）抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｙに連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｙに連結されているか；
（ｂ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｃ）抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｄ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントはＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｅ）抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、アジュバントはＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｆ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｇ）抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｈ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｉ）抗原はＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｊ）抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｋ）抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｌ）抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｍ）抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｎ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｏ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｐ）抗原はＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｑ）抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｒ）抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、アジュバントはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｓ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
（ｔ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントはＥＶの内腔に存在するか；
（ｕ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｖ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｗ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントはＥＶの外側に直接連結されているか；
（ｘ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントはＥＶの外側上の足場Ｘに連結されているか；
（ｙ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
（ｚ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントはＥＶの外側に直接連結されているか；
（ａａ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
（ｂｂ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの外側に直接連結されているか；
（ｃｃ）抗原はＥＶの内腔に存在し、アジュバントはＥＶの内腔表面に直接連結されているか、または
（ｄｄ）抗原はＥＶの内腔に存在し、アジュバントはＥＶの外側に直接連結されている。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｙに連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、アジュバントはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、アジュバントはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔に存在している。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントは、ＥＶの外側に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、アジュバントは、ＥＶの外側上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、アジュバントは、ＥＶの外側に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、アジュバントは、ＥＶの外側に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在し、アジュバントは、ＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）アジュバントと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在し、アジュバントは、ＥＶの外側に直接連結されている。
いくつかの態様では、アジュバント及び／または抗原は、ＥＶにおけるカプセル化（すなわち、ローディング）を増加させるために改変され得る。この改変には、アゴニスト（すなわち、アジュバント及び／または抗原）を化学物質または酵素で処理することによる、またはアジュバント及び／または抗原の極性または電荷を物理的または化学的に変化させることによる脂質結合タグの付加が含まれ得る。アジュバント及び／または抗原は、単一の処理によって、または処理の組み合わせ、例えば、脂質結合タグのみを付加することのみ、または脂質結合タグを付加し、かつ極性を変化させることによって改変することができる。上記の例は、非限定的な例示的な例として意図されている。任意の改変の組み合わせを実施することができることが想到される。改変は、非改変アゴニスト（すなわち、アジュバント及び／または抗原）のカプセル化（すなわち、ローディング）と比較して、ＥＶにおけるアジュバント及び／または抗原のカプセル化（すなわち、ローディング）を、約２倍～約１０，０００倍、約１０倍～１，０００倍、または約１００倍～約５００倍増加させることができる。改変は、非改変のアジュバント及び／または抗原のカプセル化（すなわち、ローディング）と比較して、ＥＶにおけるアジュバント及び／または抗原のカプセル化（すなわち、ローディング）を、少なくとも約２倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約２００倍、約３００倍、約４００倍、約５００倍、約６００倍、約７００倍、約８００倍、約９００倍、約１，０００倍、約２，０００倍、約３，０００倍、約４，０００倍、約５，０００倍、約６，０００倍、約７，０００倍、約８，０００倍、約９，０００倍、または約１０，０００倍増加させることができる。
いくつかの態様では、アジュバント及び／または抗原は、ＥＶの表面（例えば、ＥＶの外側表面及び／または内腔表面（例えば本明細書に開示される足場部分、例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙに連結されている））上でのより良い発現を可能にするように改変され得る。上記の改変のいずれかを使用できる。改変は、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面及び／または内腔表面上でのアゴニストの発現を、非改変のアゴニストの対応する発現と比較して、約２倍～１０，０００倍、約１０倍～１，０００倍、または約１００倍～５００倍増加させることができる。改変は、非改変アゴニストの発現と比較して、ＥＶの外側表面上のアゴニストの発現を、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、または少なくとも約１０，０００倍増加させることができる。改変は、非改変アゴニストの発現と比較して、ＥＶの内腔表面上のアゴニストの発現を、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、または少なくとも約１０，０００倍増加させることができる。
ＩＩ．Ｃ 標的化部分（例えば、指向性部分）
いくつかの態様では、ＥＶは、ＥＶに関連するコンビナトリアル効果（例えば、エキソソームにロードされたペイロード、例えばＳＴＩＮＧアゴニストの効果）を増強するために、ＥＶの取り込み（例えば、標的化部分）を指示すること、細胞経路を活性化すること、またはブロックすることを助けることができる追加のタンパク質（またはその断片）を提示するようにさらに改変される。特定の態様では、本明細書に開示されるＥＶは、インビボまたはインビトロでＥＶの分布を改変することができる標的化部分をさらに含む。いくつかの態様では、標的化部分はタンパク質、ペプチド、脂質などの生体分子、または合成分子を含み得る。いずれかの理論に拘束されるものではないが、本開示から明らかなように、いくつかの態様では、そのような部分の添加は、例えば、対象に投与された場合に、本明細書に記載のＥＶの治療効果をさらに増強することができる。さらに、本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、標的化部分は、本明細書に記載の他の部分（例えば、抗原）の添加前にＥＶに存在し得る。そのような態様では、標的化部分は、ＥＶ（例えば、ベースＥＶ）を産生するときにプロデューサー細胞に導入することができる。いくつかの態様では、標的化部分は、プロデューサー細胞から単離された後にＥＶに添加され得る。そのような態様では、標的化部分は、本明細書に記載の他の部分（例えば、抗原）を添加する前に、単離されたＥＶに添加することができる。いくつかの態様では、標的化部分は、本明細書に記載の他の部分（例えば、抗原）を添加した後に、ＥＶに添加される。いくつかの態様では、標的化部分は、本明細書に記載の他の部分と一緒にＥＶに添加される。
いくつかの態様では、本開示の標的化部分は、特定の種類の細胞のマーカーに特異的に結合する。いくつかの態様では、細胞は免疫細胞、例えば、樹状細胞である。特定の態様では、マーカーは樹状細胞のみで発現する。いくつかの態様では、樹状細胞は、前駆（Ｐｒｅ）樹状細胞、炎症性単樹状細胞、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、骨髄／通常型樹状細胞１（ｃＤＣ１）、骨髄／通常型樹状細胞２（ｃＤＣ２）、炎症性単球由来樹状細胞、ランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞、リゾチーム発現樹状細胞（ＬｙｓｏＤＣ）、クッパー細胞、非古典的単球、またはそれらの任意の組み合わせを含む。これらの樹状細胞で発現するマーカーは、当該技術分野で知られている。例えば、Ｃｏｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５４（１）：３－２０（２０１８）を参照されたい。いくつかの態様では、標的化部分はタンパク質であり、タンパク質は、ＤＥＣ２０５、ＣＬＥＣ９Ａ、ＣＬＥＣ６、ＤＣＩＲ、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＬＯＸ－１、ＭＡＲＣＯ、Ｃｌｅｃ１２ａ、Ｃｌｅｃ１０ａ、ＤＣ－アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン－１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－２（ＣＤ３０３、Ｃｌｅｃ４ｃ）、デクチン－２、Ｂｓｔ－２（ＣＤ３１７）、ランゲリン、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ３０４、ＸＣＲ１、ＡＸＬ、シグレック６、ＣＤ２０９、ＳＩＲＰＡ、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＰＲ１８２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１０、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるマーカーに特異的に結合することができる抗体またはその断片である。いくつかの態様では、本開示に有用なマーカーは、Ｃ型レクチン様ドメインを含む。特定の態様では、マーカーはＣｌｅｃ９ａであり、樹状細胞はｃＤＣ１である。
いくつかの態様では、本明細書に開示される標的化部分は、その任意のバリアントを含む、ヒトとマウスの両方のＣｌｅｃ９ａに結合することができる。いくつかの態様では、本開示の標的化部分は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、ウマ、またはラットを含むがこれらに限定されない他の種由来のＣｌｅｃ９ａに結合することができる。そのようなＣｌｅｃ９ａタンパク質の配列は当該技術分野で知られている。例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８，４２６，５６５Ｂ２号を参照されたい。
いくつかの態様では、本開示の標的化部分は、Ｔ細胞のマーカーに特異的に結合する。特定の態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
いくつかの態様では、本明細書に開示される標的化部分は、ヒトＣＤ３タンパク質またはその断片に結合する。ヒトＣＤ３タンパク質の配列は当該技術分野で知られている。
いくつかの態様では、本明細書に開示される標的化部分は、その任意のバリアントを含む、ヒトとマウスの両方のＣＤ３に結合することができる。いくつかの態様では、本開示の標的化部分は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、ウマ、またはラットを含むがこれらに限定されない他の種由来のＣＤ３に結合することができる。そのようなＣＤ３タンパク質の配列はまた当該技術分野で知られている。
いくつかの態様では、本開示に有用な標的化部分は、Ｂ細胞上で発現するマーカーに特異的に結合する。Ｂ細胞上で発現するマーカーの非限定的な例としては、ＣＤ４０、ＣＤ２２、ＣＤ１９、Ｂ２２０、ＩｇＭ、ＭＨＣＩＩ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、標的化部分は、濾胞性ＤＣによるＥＶの取り込みを増加させることができる。本明細書で使用される場合、「濾胞性」ＤＣ（ＦＤＣ）は、リンパ組織（例えば、リンパ節、脾臓、及び粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ））のＢ細胞領域の一次濾胞及び二次濾胞に見られる免疫細胞の非移動性集団である。ＦＤＣは、骨髄造血幹細胞に由来するのではなく、間葉由来であるという点でＤＣとは異なる。ＦＤＣは胚中心内のＢ細胞に抗原を提示し、Ｂ細胞抗体の親和性成熟とＢ細胞メモリー応答を調節する。そのような指向性部分の非限定的な例としては、ＩｇＧ、ＩｇＧ－抗原複合体、ＩｇＧ－Ｆｃ、Ｓ ａｕｒｅｕｓ Ｄドメイン二量体、抗ＣＲ１抗体、抗ＣＲ２抗体、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、本明細書に開示される標的部分は、標的部分に特異的なマーカーを発現する細胞（例えば、ＣＤ３：ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞；Ｃｌｅｃ９ａ：樹状細胞；ＣＤ４０、ＣＤ２２、またはＣＤ１９：Ｂ細胞）によるＥＶのより大きな取り込みを可能にすることができる。いくつかの態様では、ＥＶの取り込みは、参照（例えば、標的化部分を含まない対応するＥＶまたは非ＥＶ送達ビヒクル）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、またはそれ以上増加する。いくつかの態様では、参照は、本明細書に開示される標的化部分を発現しないＥＶを含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶの取り込みの増加は、より大きな免疫応答を可能にすることができる。したがって、特定の態様では、本明細書に開示される標的化部分を発現するＥＶは、免疫応答（例えば、エキソソーム上にロードされたコロナウイルス抗原に対する）を、参照（例えば、標的化部分を含まない対応するＥＶまたは非ＥＶ送達ビヒクル）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、またはそれ以上増加させる。いくつかの態様では、参照は、本明細書に開示される標的化部分を発現しないＥＶを含む。特定の態様では、免疫応答は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）及び／またはＢ細胞によって媒介される。
上記のように、本明細書に開示される標的化部分は、ペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの態様では、標的化部分は、Ｃｌｅｃ９ａに特異的に結合できるペプチドである。例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７（２６）：４０４３７－４０４５０（２０１６）を参照されたい。例えば、特定の態様では、ペプチドはＣｌｅｃ９ａの可溶性断片を含む。そのようなペプチドの非限定的な例は、米国特許第９，９８８，４３１Ｂ２号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の態様では、ペプチドは、Ａｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３６（４）：６３５－４５（２０１２）；及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３６（４）：６４６－５７（２０１２）に記載されるようなＣｌｅｃ９ａのリガンド（天然または合成）を含む。Ｃｌｅｃ９ａリガンドを含むペプチドの非限定的な例は、国際公開第ＷＯ２０１３／０５３００８ Ａ２号に記載され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、標的化部分は、ＣＤ３に特異的に結合できるペプチドである。例えば、特定の態様では、ペプチドはＣＤ３の可溶性断片を含む。特定の態様では、ペプチドは、ＣＤ３のリガンド（天然または合成）を含む。
いくつかの態様では、標的化部分は、抗体またはその抗原結合断片である。特定の態様では、標的化部分は、単鎖Ｆｖ抗体断片である。特定の態様では、標的化部分は、単鎖Ｆ（ａｂ）抗体断片である。特定の態様では、標的化部分はナノボディである。特定の態様では、標的化部分はモノボディである。
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、１つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）の標的化部分を含む。特定の態様では、１つ以上の標的化部分は、本明細書に開示される他の外因性の生物学活性分子（例えば、治療用分子、アジュバント、または免疫モジュレーター）と組み合わせて発現する。いくつかの態様では、１つ以上の標的化部分は、ＥＶの外側表面上に発現させることができる。したがって、特定の態様では、１つ以上の標的化部分は、ＥＶの外側表面上の足場部分（例えば、足場Ｘ）に連結されている。１つ以上の標的化部分が他の外因性生物活性分子（例えば、治療分子、アジュバント、または免疫モジュレーター）と組み合わせて発現する場合、他の外因性生物活性分子はＥＶの表面（例えば、外側表面または内腔表面）上、または内腔で発現し得る。
プロデューサー細胞は、追加のタンパク質またはその断片をコードする追加の外因性配列を含むように改変することができる。代替的に、追加のタンパク質またはその断片は、当該技術分野で既知の任意の適切な連結化学によってＥＶに共有結合で連結またはコンジュゲートさせることもできる。適切な連結化学の非限定的な例としては、アミン反応性基、カルボキシル反応性基、スルフヒドリル反応性基、アルデヒド反応性基、光反応性基、ＣｌｉｃｋＩＴ化学、ビオチン－ストレプトアビジンもしくは他のアビジンコンジュゲーション、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
ＩＩ．Ｄ 免疫モジュレーター
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、免疫モジュレーターを（例えば、抗原及び／または本明細書に開示される他のペイロードとともに）含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、複数の免疫モジュレーターを含む。特定の態様では、複数の免疫モジュレーターのそれぞれは異なる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なる免疫モジュレーターを含む。
特定の態様では、ＥＶは、１つ以上の追加のペイロード（例えば、抗原、及び／またはアジュバント）と組み合わせて１つ以上の免疫モジュレーターを含む。いくつかの態様では、ＥＶは、１つ以上の追加の部分（例えば、標的化部分）を含み得る。例えば、特定の態様では、本明細書に記載の開示されるＥＶは、（ｉ）１つ以上の免疫モジュレーターと、（ｉｉ）１つ以上の追加のペイロード（例えば、抗原及び／またはアジュバント）と、（ｉｉｉ）１つ以上の標的化部分と、を含み得る。本明細書に記載されるように、特定の態様では、免疫モジュレーターは、本明細書に記載の他の部分（例えば、抗原）の添加前にＥＶに存在し得る。そのような態様では、免疫モジュレーターは、ＥＶ（例えば、ベースＥＶ）を産生するときにプロデューサー細胞に導入することができる。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、プロデューサー細胞から単離された後にＥＶに添加され得る。そのような態様では、免疫モジュレーターは、本明細書に記載の他の部分（例えば、抗原）を添加する前に、単離されたＥＶに添加することができる。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、本明細書に記載の他の部分（例えば、抗原）を添加した後に、ＥＶに添加される。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、本明細書に記載の他の部分と一緒にＥＶに添加される。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＥＶの表面（例えば、外側表面または内腔表面）上または内腔で発現し得る。したがって、特定の態様では、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側表面上またはＥＶの内腔表面上の足場部分（例えば、足場Ｘ）に連結されている。他の態様では、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の足場部分（例えば、足場Ｙ）に連結されている。さらなる態様では、免疫モジュレーターは、エキソソームの内腔に存在する（すなわち、足場Ｘまたは足場Ｙのいずれにも連結されていない）。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側表面及び／または内腔表面に直接（すなわち、足場部分を使用せずに）連結され得る。
そのような態様の非限定的な例としては、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含むＥＶが挙げられ、以下のようになっている：
（ａ）抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｙに連結されているか；
（ｂ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｃ）抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｄ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｅ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｆ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｇ）抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレータートはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。
特定の態様の非限定的な例としては、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含むＥＶが挙げられ、以下のようになっている：
（ａ）抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｙに連結されているか；
（ｂ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｃ）抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｄ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｅ）抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、免疫モジュレーターはＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｆ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｇ）抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｈ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｉ）抗原はＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｊ）抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｋ）抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｌ）抗原はＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｍ）抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｎ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｏ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｐ）抗原はＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｑ）抗原はＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
（ｒ）抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていないか；
（ｓ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
（ｔ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在するか；
（ｕ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
（ｖ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
（ｗ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターはＥＶの外側に直接連結されているか；
（ｘ）抗原はＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターはＥＶの外側上の足場Ｘに連結されているか；
（ｙ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
（ｚ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの外側に直接連結されているか；
（ａａ）抗原はＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
（ｂｂ）抗原はＥＶの内腔表面の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの外側に直接連結されているか；
（ｃｃ）抗原はＥＶの内腔に存在し、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面に直接連結されているか、または
（ｄｄ）抗原はＥＶの内腔に存在し、免疫モジュレーターはＥＶの外側に直接連結されている。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、免疫モジュレーターはＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原はＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されておらず、免疫モジュレーターはＥＶの内腔に存在していずれの足場部分にも連結されていない。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔に存在している。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面に直接連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側上の足場Ｘに連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在し、免疫モジュレーターは、ＥＶの内腔表面に直接連結されている。いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）例えばコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及び／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する抗原と、（ｉｉ）免疫モジュレーターと、を含み、抗原は、ＥＶの内腔に存在し、免疫モジュレーターは、ＥＶの外側に直接連結されている。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、自然免疫応答を調節することができる。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、適応免疫応答を調節することができる。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、細胞傷害性Ｔ細胞を標的とすることによって適応免疫応答を調節する。さらなる態様では、免疫モジュレーターは、Ｂ細胞を標的とすることによって適応免疫応答を調節する（例えば、抗原特異的抗体の産生をもたらす）。特定の態様では、本明細書に開示される免疫モジュレーターは、細胞傷害性Ｔ細胞またはＢ細胞へのエキソソームの分布を調節することができる（すなわち、生体内分布改変剤）。
いくつかの態様では、本開示に有用な免疫モジュレーターは、特定のリンパ球サブセットの活性化を特異的に誘導することができる。例えば、いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化を特異的に誘導することができる。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、ほぼすべての適応免疫応答に必要とされるため、おそらく適応免疫において最も重要な細胞である。それらは、Ｂ細胞を活性化して抗体を分泌させ、マクロファージが摂取した微生物を破壊するのを助けるだけでなく、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化して感染した標的細胞を殺傷するのも助ける（Ｃｒｏｔｔ Ｓ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５（３）：１８５－１８９（Ｍａｒ． ２０１５））。特定の態様では、免疫モジュレーターは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化を特異的に誘導できるペプチドである。いくつかの態様では、そのようなペプチドは、本明細書において「ＣＤ４＋Ｔヘルパーペプチド」と呼ばれる。いくつかの態様では、ＣＤ４＋Ｔヘルパーペプチドは、破傷風、麻疹、ジフテリア毒素、またはそれらの組み合わせに由来する。本開示に有用なＣＤ４＋Ｔヘルプペプチドはまた、ＰＡＤＲＥペプチド（ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ；配列番号３８６）を含み得る。特定の態様では、そのようなペプチドは、抗原非依存的にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化（すなわち、非特異的活性化）を誘導することができるので、本明細書において「ユニバーサルＣＤ４＋Ｔヘルパーペプチド」と呼ばれる。いくつかの態様では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸配列ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号３８３）（破傷風のアミノ酸残基８３０～８４３）を含む。いくつかの態様では、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸配列ＱＳＩＡＬＳＳＬＭＶＡＱＡＩＰ（配列番号３８４）（ジフテリア毒素のアミノ酸残基３５６～３７０）を含む。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ネガティブチェックポイント調節因子の阻害剤、またはネガティブチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤を含む。特定の態様では、ネガティブチェックポイント調節因子は、細胞障害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ＣＤ７３、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤である。特定の態様では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＣＴＬＡ－４のモノクローナル抗体（「抗ＣＴＬＡ－４抗体」）である。特定の態様では、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４のモノクローナル抗体の断片である。特定の態様では、抗体断片は、ＣＴＬＡ－４のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。特定の態様では、阻害剤は、ＣＴＬＡ－４に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの態様では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブである。他の態様では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、トレメリムマブである。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）の阻害剤である。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の阻害剤である。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）の阻害剤である。特定の態様では、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２の阻害剤は、ＰＤ－１（「抗ＰＤ－１抗体」）、ＰＤ－Ｌ１（「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」）、またはＰＤ－Ｌ２（「抗ＰＤ－Ｌ２抗体」）のモノクローナル抗体である。いくつかの態様では、阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体の断片である。特定の態様では、抗体断片は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。特定の態様では、阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの態様では、抗ＰＤ－１抗体はニボルマブである。いくつかの態様では、抗ＰＤ１抗体は、ペムブロリズマブである。いくつかの態様では、抗ＰＤ１抗体は、ピディリズマブである。いくつかの態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアテゾリズマブである。他の態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体はアベルマブである。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤である。特定の態様では、ＬＡＧ３の阻害剤はＬＡＧ３のモノクローナル抗体（「抗ＬＡＧ３抗体」）である。いくつかの態様では、阻害剤は抗ＬＡＧ３抗体の断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。特定の態様では、阻害剤は、ＬＡＧ３に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３）の阻害剤である。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）の阻害剤である。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の阻害剤である。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）の阻害剤である。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）の阻害剤である。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の阻害剤である。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＣＤ２０、ＣＤ３９、またはＣＤ７３の阻害剤である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤を含む。特定の態様では、正の共刺激分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー（例えば、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲ）を含む。いくつかの態様では、正の共刺激分子の活性化剤は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバー（ＴＮＦα、ＴＮＦ－Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４－１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ－２）である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）の活性化剤である。特定の態様では、ＯＸ４０の活性化剤は、アゴニスト抗ＯＸ４０抗体である。さらなる態様では、ＯＸ４０の活性化剤は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＣＤ２７の活性化剤である。特定の態様では、ＣＤ２７の活性化剤は、アゴニスト抗ＣＤ２７抗体である。他の態様では、ＣＤ２７の活性化剤は、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＣＤ４０の活性化剤である。特定の態様では、ＣＤ４０の活性化剤は、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。いくつかの態様では、ＣＤ４０の活性化剤は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。特定の態様では、ＣＤ４０Ｌは単量体ＣＤ４０Ｌである。他の態様では、ＣＤ４０Ｌは三量体ＣＤ４０Ｌである。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）の活性化剤である。特定の態様では、ＧＩＴＲの活性化剤は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体である。他の態様では、ＧＩＴＲの活性化剤は、ＧＩＴＲの天然リガンドである。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、４－１ＢＢの活性化剤である。特定の態様では、４－１ＢＢの活性化剤は、アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体である。特定の態様では、４－１ＢＢの活性化剤は、４－１ＢＢの天然リガンドである。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターはＦａｓ受容体（Ｆａｓ）である。そのような態様では、Ｆａｓ受容体はＥＶの表面上に提示されている。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）である。特定の態様では、ＦａｓリガンドはＥＶの表面上に提示されている。いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、抗Ｆａｓ抗体または抗ＦａｓＬ抗体である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子の活性化剤である。特定の態様では、ＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子は、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である。いくつかの態様では、免疫調節成分は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）の活性化剤である。特定の態様では、ＩＣＯＳの活性化剤は、アゴニスト抗ＩＣＯＳ抗体である。他の態様では、ＩＣＯＳの活性化剤は、ＩＣＯＳのリガンド（ＩＣＯＳＬ）である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ＣＤ２８の活性化剤である。いくつかの態様では、ＣＤ２８の活性化剤は、アゴニスト抗ＣＤ２８抗体である。他の態様では、ＣＤ２８の活性化剤は、ＣＤ２８の天然リガンドである。特定の態様では、ＣＤ２８のリガンドは、ＣＤ８０である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーを含む。いくつかの態様では、サイトカインは、（ｉ）サイトカインの共通ガンマ鎖ファミリー；（ｉｉ）サイトカインのＩＬ－１ファミリー；（ｉｉｉ）造血サイトカイン；（ｉｖ）インターフェロン（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型）；（ｖ）サイトカインのＴＮＦファミリー；（ｖｉ）サイトカインのＩＬ－１７ファミリー；（ｖｉｉ）損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）；（ｖｉｉｉ）寛容原性サイトカイン；または（ｉｘ）それらの組み合わせから選択される。特定の態様では、サイトカインとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、ＩＬ－３６γ、ＩＬ－３６ｒａ、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－２３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、マクロファージ－コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｆｌｔ－３、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２２、ＩＬ－２４、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、リンホトキシンベータ（ＴＮＦ－γ）、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－１７Ｃ、ＩＬ－１７Ｄ、ＩＬ－１７Ｅ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２５、ＴＳＬＰ、ＩＬ－３５、ＩＬ－２７、ＴＧＦ－β、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、ケモカインを含む。特定の態様では、ケモカインとしては、（ｉ）ＣＣケモカイン（例えば、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８）；（ｉｉ）ＣＸＣケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７）；（ｉｉｉ）Ｃケモカイン（例えば、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２）；（ｉｖ）ＣＸ３Ｃケモカイン（例えば、ＣＸ３ＣＬ１）；（ｖ）またはその組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の阻害剤を含む。ＬＰＡは、プログラム細胞死から細胞を保護及びレスキューする非常に強力な内因性脂質メディエーターである。ＬＰＡは、その高親和性ＬＰＡ－１受容体を介して、線維形成の重要なメディエーターである。
いくつかの態様では、本開示で使用できる免疫モジュレーターは、胚中心応答に必要な細胞内相互作用をサポートするタンパク質を含む。特定の態様では、そのようなタンパク質は、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーメンバーまたはＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ）を含む。いくつかの態様では、ＳＬＡＭファミリーメンバーは、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ２２９（Ｌｙ９）、Ｌｙ１０８、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ－Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ、ＣＤ２Ｆ－１０、またはそれらの組み合わせを含む。胚中心応答において役割を果たすことができる他の免疫モジュレーターの非限定的な例としては、ＩＣＯＳ－ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０－４０Ｌ、ＣＤ２８／Ｂ７、ＰＤ－１／Ｌ１、ＩＬ－４／ＩＬ４Ｒ、ＩＬ２１／ＩＬ２１Ｒ、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＣＤ１８０、ＣＤ２２、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその誘導体を含む。特定の態様では、免疫モジュレーターはＴＣＲα鎖またはその誘導体である。他の態様では、免疫モジュレーターは、ＴＣＲβ鎖またはその誘導体を含む。さらなる態様では、免疫モジュレーターはＴ細胞の共受容体またはその誘導体である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはその誘導体である。いくつかの態様では、ＣＡＲは、本明細書に開示される抗原（例えば、腫瘍抗原、例えば、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ－ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ－７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソセリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ－３、がん精巣抗原、ＭＡＲＴ－１ ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド）のうちの１つ以上に結合する。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、Ｔ細胞受容体または共受容体の活性化剤である。特定の態様では、免疫調節成分は、ＣＤ３の活性化剤である。特定の態様では、活性化剤は、ＣＤ３のモノクローナル抗体の断片である。特定の態様では、抗体断片は、ＣＤ３に対するモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。特定の態様では、活性化剤は、ＣＤ３に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。特定の態様では、免疫調節成分は、ＣＤ２８の活性化剤である。特定の態様では、活性化剤は、ＣＤ２８のモノクローナル抗体の断片である。特定の態様では、抗体断片は、ＣＤ２８のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。特定の態様では、活性化剤は、ＣＤ２８に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、寛容誘導因子を含む。特定の態様では、寛容誘導因子はＮＦ－κＢ阻害剤を含む。本開示で使用できるＮＦ－κＢ阻害剤の非限定的な例としては、ＩＫＫ複合体阻害剤（例えば、ＴＰＣＡ－１、ＮＦ－κＢ活性化阻害剤ＶＩ（ＢＯＴ－６４）、ＢＭＳ ３４５５４１、Ａｍｌｅｘａｎｏｘ、ＳＣ－５１４（ＧＫ ０１１４０）、ＩＭＤ ０３５４、ＩＫＫ－１６）、ＩκＢ分解阻害剤（例えば、ＢＡＹ １１－７０８２、ＭＧ－１１５、ＭＧ－１３２、ラクタシスチン、エポキソマイシン、パルテノライド、カルフィルゾミブ、ＭＬＮ－４９２４（ペボネディスタット））、ＮＦ－κＢ核移行阻害剤（例えば、ＪＳＨ－２３、ロリプラム）、ｐ６５アセチル化阻害剤（例えば、没食子酸、アナカルド酸）、ＮＦ－κＢ－ＤＮＡ結合阻害剤（例えば、ＧＹＹ ４１３７、ｐ－ＸＳＣ、ＣＶ ３９８８、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２））、ＮＦ－κＢトランス活性化阻害剤（例えば、ＬＹ ２９４００２、ワートマニン、メサラミン）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｕｐｔａ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７９９：７７５－７８７（２０１０）も参照されたい。いくつかの態様では、ＮＦ－κＢ活性を阻害することができ、本明細書に開示されるＥＶとともに使用することができる免疫モジュレーターは、ＮＦ－κＢを特異的に標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。さらなる態様では、寛容を誘導することができる免疫モジュレーターとしては、ＣＯＸ－２阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン及び誘導体、例えば、ｍＴｏｒを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド）、プロスタグランジン、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）、抗ロイコトリエン、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）リガンド、ビタミンＤ、レチノイン酸、ステロイド、Ｆａｓ受容体／リガンド、ＣＤ２２リガンド、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－２７、代謝調節剤（例えば、グルタミン酸）、糖鎖（例えば、ＥＳ６２、ＬｅｗｉｓＸ、ＬＮＦＰＩＩＩ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト、受容体の免疫グロブリン様転写物（ＩＬＴ）ファミリー（例えば、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬＴ－２）、ミノサイクリン、ＴＬＲ４アゴニスト、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、アゴニストである。特定の態様では、アゴニストは、ホルモンまたは神経伝達物質のような内因性アゴニストである。他の態様では、アゴニストは、薬物のような外因性アゴニストである。いくつかの態様では、アゴニストは、受容体に結合することなくアゴニスト応答を生み出すことができる物理的アゴニストである。いくつかの態様では、アゴニストは、内因性アゴニストよりも大きな最大応答を産生できるスーパーアゴニストである。特定の態様では、アゴニストは、受容体で完全な効力を有する完全アゴニストである。他の態様では、アゴニストは、完全アゴニストと比較して、受容体で部分的効力のみを有する部分アゴニストである。いくつかの態様では、アゴニストは、受容体の恒常的活性を阻害できる逆アゴニストである。いくつかの態様では、アゴニストは、受容体に対する効果を産生するために他の共アゴニストと協働する共アゴニストである。特定の態様では、アゴニストは、共有結合の形成を通じて受容体に永久的に結合する不可逆的アゴニストである。特定の態様では、アゴニストは、特定の型の受容体に対する選択的アゴニストである。
いくつかの態様では、免疫モジュレーターは、アンタゴニストである。いくつかの態様では、アンタゴニストは、競合的アンタゴニストであり、受容体を活性化することなく内因性リガンドまたはアゴニストと同じ結合部位で受容体に可逆的に結合する。競合的アンタゴニストは、最大応答を達成するために必要なアゴニストの量に影響を及ぼし得る。いくつかの態様では、アンタゴニストは非競合的アンタゴニストであり、受容体の活性部位または受容体のアロステリック部位に結合する。非競合的アンタゴニストは、任意の量のアゴニストによって達成され得る最大応答の規模を低下できる。いくつかの他の態様では、アンタゴニストは、別個のアロステリック結合部位へのその結合の前にアゴニストによる受容体活性化を必要とする非競合的アンタゴニストである。
さまざまな態様では、免疫モジュレーターは、抗体または抗原結合断片を含む。免疫調節成分は、全長タンパク質またはその断片であり得る。抗体または抗原結合断片は、天然の供給源に由来するか、または部分的もしくは全体的に合成的に産生され得る。いくつかの態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体である。特定の態様では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。いくつかの他の態様では、抗体は、ポリクローナル抗体である。ある特定の態様では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片から選択される。ある特定の態様では、抗原結合断片は、ｓｃＦｖまたは（ｓｃＦｖ）２断片である。特定の他の態様では、抗体または抗原結合断片は、ナノボディ（登録商標）（単一ドメイン抗体）である。いくつかの態様では、抗体または抗原結合断片は、二重特異性または多重特異性抗体である。
さまざまな態様では、抗体または抗原結合断片は、完全にヒトである。いくつかの態様では、抗体または抗原結合断片は、ヒト化されている。いくつかの態様では、抗体または抗原結合断片は、キメラである。これらの態様のいくつかでは、キメラ抗体は、非ヒトＶ領域ドメインとヒトＣ領域ドメインとを有する。いくつかの態様では、抗体または抗原結合断片は、マウスまたは獣医学のような非ヒトである。
特定の態様では、免疫調節成分は、ポリヌクレオチドである。これらの態様のいくつかにおいて、ポリヌクレオチドとしては、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチドコンジュゲートホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、またはｌｎｃＲＮＡ）である。これらの態様のいくつかでは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、それは所望のポリペプチドに翻訳され得る。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ分子である。これらの態様のいくつかでは、ｍｉＲＮＡ分子が標的細胞においてネイティブｍＲＮＡをサイレンシングできるように、ｍｉＲＮＡは、標的細胞の細胞質に送達される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、がん遺伝子または他の調節不全ポリペプチドの発現に干渉できる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。これらの態様のいくつかでは、ｓｉＲＮＡ分子が標的細胞においてネイティブｍＲＮＡをサイレンシングできるように、ｓｉＲＮＡは、標的細胞の細胞質に送達される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）である。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御し、疾患を調節することができる長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡに転写され得るＤＮＡである。これらの態様のいくつかでは、転写されたＲＮＡは、所望のポリペプチドに翻訳され得る。
いくつかの態様では、免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である。
さまざまな態様では、ＥＶ組成物は、原子、分子などの、混合物、融合物、組み合わせ、及びコンジュゲートを含む、２つ以上の上記の免疫調節成分を含む。いくつかの態様では、組成物は、膜に結合するか、または細胞外小胞の密閉容積内に封入された、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の異なる免疫調節成分を含む。特定の態様では、組成物は、ポリペプチドと組み合わされた核酸を含む。特定の態様では、組成物は、互いにコンジュゲート化した２つ以上のポリペプチドを含む。特定の態様では、組成物は、生物学的活性分子にコンジュゲート化したタンパク質を含む。これらの態様のいくつかでは、生物学的活性分子は、プロドラッグである。
いくつかの態様では、任意の適切な方法を使用して、目的の抗原または他の任意の分子（例えば、本明細書に記載のアジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）をＥＶの外側表面及び／または内腔表面に連結することができる。特定の態様では、目的の抗原または任意の他の分子は、当該技術分野で知られている任意の好適なカップリング戦略によってＥＶの外側表面及び／または内腔表面に連結されている。いくつかの態様では、カップリング戦略としては、アンカー部分、親和性剤、化学的コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、スプリットインテイン、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＡＬＦＡタグ、ストレプトアビジン／アビタグ、ソルターゼ、ＳＮＡＰタグ、ＰｒｏＡ／Ｆｃ結合ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、アンカー部分としては、コレステロール、脂肪酸（例えば、パルミチン酸）、トコフェロール（例えば、ビタミンＥ）、アルキル鎖、芳香環、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、化学的コンジュゲーションとしては、マレイミド部分、銅を含まない、双直交クリック化学（例えば、アジド／歪みアルキン（ＤＩＦＯ））、金属触媒クリック化学（例えば、ＣＵＡＡＣ、ＲＵＡＡＣ）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。目的の抗原または任意の他の分子を連結する異なるアプローチに関する追加の説明は、本開示の他の箇所で提供される。例えば、いくつかの態様では、上記のカップリング戦略のいずれも、本明細書に記載の足場部分（例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ）と組み合わせて使用することができる。
ＩＩ．Ｅ 足場Ｘの操作されたＥＶ
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、その組成が改変された膜を含む。例えば、それらの膜組成は、膜のタンパク質、脂質、またはグリカン含量を変更することによって改変することができる。
いくつかの態様では、表面を操作されたＥＶは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合などの化学的及び／または物理的方法により生成される。他の態様では、表面を操作されたＥＶは、遺伝子操作によって生成される。遺伝子改変されたプロデューサー細胞または遺伝子改変された細胞の子孫から生成されるＥＶは、改変された膜組成を含み得る。いくつかの態様では、表面を操作されたＥＶは、より高いまたはより低い密度（例えば、より多い数）の足場部分（例えば、足場Ｘ）を有するか、または足場部分のバリアントもしくは断片を含む。
例えば、表面（例えば、足場Ｘ）を操作されたＥＶは、足場部分（例えば、足場Ｘ）またはそのバリアントもしくはその断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から生成される。外因性配列から発現される足場部分を含むＥＶは、改変された膜組成を含み得る。
足場部分のさまざまな改変または断片を、本開示の態様で使用することができる。例えば、結合剤への親和性が高められるように改変された足場部分は、結合剤を使用して精製することができる表面を操作されたＥＶを生成するために使用することができる。ＥＶ及び／または膜をより効果的に標的化するように改変された足場部分を使用することができる。エキソソーム膜への特異的かつ効果的な標的化に必要な最小限の断片を含むように改変された足場部分も使用することができる。
足場部分は、融合分子、例えば抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーターへの足場Ｘの融合分子として発現されるように操作することができる。例えば、融合分子は、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーターに連結された本明細書に開示される足場部分（例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片もしくはバリアント）を含み得る。融合分子の場合、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーターは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される融合分子は、親和性リガンドをさらに含む。例えば、特定の態様では、親和性リガンドは、目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）に融合され、次いで、目的の分子は、親和性リガンドを介して、ＥＶ上の部分、例えば、足場Ｘにコンジュゲートされる。特定の態様では、親和性リガンドは、目的の分子のＥＶ上の部分、例えば足場Ｘへの結合を増加させる。
いくつかの態様では、本明細書に記載の表面（例えば、足場Ｘ）を操作されたＥＶは、当該技術分野で知られたＥＶと比較して優れた特性を示す。例えば、表面（例えば、足場Ｘ）を操作されたものは、天然に存在するＥＶ、または従来のエキソソームタンパク質を使用して生成されたＥＶと比較して、それらの表面上により高度に濃縮された改変タンパク質を含む。さらに、本開示の表面（例えば、足場Ｘ）を操作されたＥＶは、天然に存在するＥＶ、または従来のエキソソームタンパク質を使用して生成されたＥＶと比較して、より高い、より特異的な、またはより制御された生物活性を有し得る。
いくつかの態様では、足場Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。ＰＴＧＦＲＮタンパク質は、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ－１）、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ－Ｆ）、プロスタグランジンＦ２α受容体調節タンパク質、プロスタグランジンＦ２α受容体関連タンパク質、またはＣＤ３１５と称される場合もある。ヒトＰＴＧＦＲＮタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｐ２Ｂ２）の全長アミノ酸配列は、表７に配列番号１として示されている。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドはシグナルペプチド（配列番号１のアミノ酸１～２５）、細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸２６～８３２）、膜貫通ドメイン（配列番号１のアミノ酸８３３～８５３）、及び細胞質ドメイン（配列番号１のアミノ酸８５４～８７９）を含む。成熟ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチドを含まない配列番号１、すなわち、配列番号１のアミノ酸２６～８７９からなる。いくつかの態様では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。他の態様では、本開示で有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメイン、及び（ｉ）膜貫通ドメインのＮ末端の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１１０個、少なくとも１２０個、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０個のアミノ酸、（ｉｉ）膜貫通ドメインのＣ末端の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個のアミノ酸、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。
いくつかの態様では、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの断片は、ＩｇＶなどの１つ以上の機能的ドメインまたは構造的ドメインを欠いている。
他の態様では、足場Ｘは、配列番号１のアミノ酸２６～８７９に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３３に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３３のアミノ酸配列を含むが、ただし１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除く。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、足場Ｘは、配列番号３３のアミノ酸配列と、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸、またはそれ以上の、配列番号３３のＮ末端及び／またはＣ末端と、を含む。
他の態様では、足場Ｘは、配列番号２、３、４、５、６、または７に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号２、３、４、５、６、または７のアミノ酸配列を含むが、ただし１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除く。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、足場Ｘは、配列番号２、３、４、５、６、または７のアミノ酸配列と、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸、またはそれ以上の、配列番号２、３、４、５、６、または７のＮ末端及び／またはＣ末端と、を含む。
Figure 2023518414000007
Figure 2023518414000008
他の足場Ｘタンパク質の非限定的な例は、２０１９年２月５日に発行された米国特許第ＵＳ１０１９５２９０Ｂ１号に見出すことができ、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、配列は、天然タンパク質のＮ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００アミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。いくつかの態様では、配列は、天然タンパク質のＣ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００アミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。いくつかの態様では、配列は、天然タンパク質のＮ末端とＣ末端の両方から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００アミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。いくつかの態様では、配列は、天然タンパク質の１つ以上の機能的または構造的ドメインを欠く足場部分の断片をコードする。
いくつかの態様では、足場部分、例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質は、１つ以上の異種タンパク質に連結されている。１つ以上の異種タンパク質を、足場部分のＮ末端に連結することができる。１つ以上の異種タンパク質を、足場部分のＣ末端に連結することができる。いくつかの態様では、１つ以上の異種タンパク質を、足場部分のＮ末端とＣ末端の両方に連結する。いくつかの態様では、異種タンパク質は哺乳動物タンパク質である。いくつかの態様では、異種タンパク質はヒトタンパク質である。
いくつかの態様では、足場Ｘを使用して、任意の部分をＥＶの内腔表面と外側表面上に同時に連結することもできる。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドを使用して、ＥＶの外側表面に加えて、内腔内部（例えば、内腔表面上）に本明細書に開示される１つ以上のペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）を連結することができる。したがって、特定の態様では、足場Ｘは、二重の目的、例えば、ＥＶの内腔表面上の抗原、及びＥＶの外側表面上のアジュバントもしくは免疫モジュレーターのためにか、ＥＶの外側表面上の抗原、及び内腔表面上のアジュバントもしくは免疫モジュレーターのためにか、ＥＶの内腔表面上のアジュバント及び外側表面上の免疫モジュレーターのためにか、またはＥＶの内腔表面上の免疫モジュレーター及びＥＶの外側表面上のアジュバントのために使用できる。
ＩＩ．Ｆ 足場Ｙの操作されたＥＶ
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、天然のＥＶとは異なる内部空間（すなわち、内腔）を含む。例えば、ＥＶの内腔表面の組成が、天然のエキソソームの組成とは異なるタンパク質、脂質、またはグリカン含有量を有するように、ＥＶを変化させることができる。
いくつかの態様では、操作されたＥＶは、足場部分（例えば、足場Ｙ）、またはＥＶの内腔表面の組成または含有量を変化させる足場部分の改変もしくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞から生成することができる。ＥＶの内腔表面上で発現させることができるエキソソームタンパク質のさまざまな改変または断片を、本開示の態様で使用することができる。
いくつかの態様では、ＥＶの内腔表面を変化させることができるエキソソームタンパク質としては、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）タンパク質、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
Figure 2023518414000009
成熟ＢＡＳＰ１タンパク質配列は、配列番号４９からの最初のＭｅｔを欠いており、したがって、配列番号４９のアミノ酸２～２２７を含んでいる。同様に、成熟ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質も、それぞれ配列番号４７及び４８からの最初のＭｅｔを欠いている。したがって、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、配列番号４７のアミノ酸２～３３２を含む。成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、配列番号４８のアミノ酸２～２２７を含む。
他の態様では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号４９のアミノ酸２～２２７に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｙは、配列番号５０～１５５のいずれか１つに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の態様では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号４９のアミノ酸配列を含むが、ただし１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異であることを除く。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号５０～１５５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸、またはそれ以上の、配列番号５０～１５５のＮ末端及び／またはＣ末端と、を含む。
いくつかの態様では、配列番号４７～１５５のいずれかのタンパク質配列は、本開示のための足場Ｙ（例えば、抗原及び／またはアジュバント及び／または免疫モジュレーターに連結された足場部分）であるのに十分である。
足場タンパク質の非限定的な例は、２０１９年５月２３日に公開されたＷＯ／２０１９／０９９９４２及び２０２０年５月２２日に公開されたＷＯ／２０２０／１０１７４０に見出すことができ、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
他の態様では、脂質アンカーは、当該技術分野で公知の任意の脂質アンカー、例えば、パルミチン酸またはグリコシルホスファチジルイノシトールであり得る。通常ではない状況において、例えば、ミリスチン酸が制限されている培地を使用することにより、短鎖及び不飽和を含む他のいくつかの脂肪酸をＮ末端グリシンに結合させることができる。例えば、ＢＫチャネルでは、ミリスチン酸は、ヒドロキシエステル結合を介して、翻訳後に内部のセリン／トレオニンまたはチロシン残基に結合することが報告されている。当該技術分野で知られている膜アンカーを以下の表に示す：
Figure 2023518414000010
ＩＩ．Ｇ コンジュゲート化ＥＶ
抗体とは異なり、ＥＶは、その表面に結合した多数の分子、例えば、ＥＶあたり数千から数万の分子を収容することができる。したがって、ＥＶ－薬物コンジュゲートは、高濃度の治療用化合物を個別の細胞型に送達すると同時に、化合物への全体的な全身曝露を制限し、これにより、オフターゲット毒性が減少するためのプラットフォームを表す。
本開示は、図３１に示すように、遊離チオール基を含む第１の分子実体をマレイミド基を含む第２の分子実体と反応させることによって操作されたＥＶであって、マレイミド部分は、マレイミド部分を介して、第１の分子実体を第２の分子実体と共有結合させるＥＶを提供する。
マレイミド部分を介してＥＶに結合することのできる生物活性分子の非限定的な例としては、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨げるヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡのような制御機能を有するＲＮＡ分子）、モルホリノ、アミノ酸（例えば、検出可能な部分または毒素を含む、翻訳を妨げるアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び小分子（例えば、小分子薬及び毒素）、抗原（例えばワクチン抗原）、アジュバント（例えば、ワクチンアジュバント）などの薬剤が挙げられる。
いくつかの態様では、本開示のＥＶは、１つを超えるタイプの生物活性分子を含むことができる。いくつかの態様では、生物活性分子は、例えば、環状ジヌクレオチドなどの小分子、オーリスタチンなどの毒物（例えば、モノエチルオーリスタチンＥ、ＭＭＡＥ）、抗体（例えば、ネイキッド抗体または抗体－薬物コンジュゲート）、ＳＴＩＮＧアゴニスト、寛容化剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＲＯＴＡＣ、モルホリノ、リゾホスファチジン酸受容体アンタゴニスト（例えば、ＬＰＡ１ アンタゴニスト）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、例えば、ワクチン抗原と、任意選択でワクチンアジュバントと、を含み得る。いくつかの態様では、本開示のＥＶは、治療用ペイロード（例えば、ＳＴＩＮＧまたは以下に開示される１つのペイロード）、ならびに標的化部分及び／または指向性部分を含み得る。
ＩＩ．Ｈ リンカー
上記のように、本開示の細胞外小胞（ＥＶ）は、目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、または免疫モジュレーター）をＥＶ（例えば、外側表面または内腔表面上）に連結する１つ以上のリンカーを含み得る。いくつかの態様では、目的の分子（すなわち、ペイロード）（例えば、抗原、アジュバント、または免疫モジュレーター）は、ＥＶに直接または足場部分（例えば、足場Ｘもしくは足場Ｙ）を介して連結されている。例えば、特定の態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、足場Ｘを介してエキソソームの外側表面に連結されている。さらなる態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、足場Ｘまたは足場Ｙを介してエキソソームの内腔表面に連結されている。いくつかの態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、足場Ｘを介してエキソソームの内腔表面に連結されている。いくつかの態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、足場Ｙを介してエキソソームの内腔表面に連結されている。いくつかの態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、足場Ｘ及び足場Ｙを介してエキソソームの内腔表面に連結されている。いくつかの態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、リンカー（例えば本明細書に記載されるもの）を介して足場Ｘにコンジュゲートされている。特定の態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、１つを超えるリンカー（すなわち、「リンカーの組み合わせ」）を使用して足場Ｘにコンジュゲートされている。いくつかの態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、リンカー（例えば、本明細書に記載のもの）を介して足場Ｙにコンジュゲートされている。特定の態様では、ペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）は、リンカーの組み合わせを使用して足場Ｘにコンジュゲートされている。いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、本明細書に開示する少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ以上の異なるリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーの組み合わせにおけるリンカーは、エステル結合（例えば、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートエステル）によって連結され得る。
リンカーは、当該技術分野で知られている任意の化学部分であってよい。
本明細書中で使用される場合、「リンカー」という用語は、ペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。いくつかの態様では、２つ以上のリンカーをタンデムに連結することができる。複数のリンカーが存在する場合、それぞれのリンカーは同じであっても異なっていてよい。一般に、リンカーは柔軟性を与えるか、または立体障害を防止／改善する。リンカーは典型的には切断されないが、特定の態様では、そのような切断が望ましい場合もある。したがって、いくつかの態様では、リンカーは、リンカーの配列内に位置するか、またはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接し得る、１つ以上のプロテアーゼ切断可能な部位を含み得る。
いくつかの態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００のアミノ酸を含み得る。
いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００のアミノ酸を含み得る。
他の態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１，０００のアミノ酸を含み得る。ペプチドリンカーは、１～約５アミノ酸、１～約１０アミノ酸、１～約２０アミノ酸、約１０～約５０アミノ酸、約５０～約１００アミノ酸、約１００～約２００アミノ酸、約２００～約３００アミノ酸、約３００～約４００アミノ酸、約４００～約５００アミノ酸、約５００～約６００アミノ酸、約６００～約７００アミノ酸、約７００～約８００アミノ酸、約８００～約９００のアミノ酸、または約９００～約１０００のアミノ酸を含み得る。
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本開示に有用なリンカーは、グリシン／セリンリンカーを含む。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍ（配列番号３７４）（式中、ｎは、１～１００の任意の整数であり、ｍは、１～１００の任意の整数である）によるグリシン／セリンリンカーである。いくつかの態様では、グリシン／セリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－Ｓｅｒｙ］ｚ（配列番号３７５）（式中、ｘは、１～４の整数であり、ｙは０または１であり、ｚは、１～５０の整数である）で記載される。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｎ（配列番号３７６）（ｎは、１～１００の整数であり得る）を含む。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎ（配列番号３７７）（式中、ｎは、１～１００の整数である）を含み得る。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎ（配列番号３７８）（ｎは、１～１００の整数である）を含み得る。特定の態様では、ペプチドリンカーは、配列ＧＧＧＧ（配列番号１９７）を含む。
いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０３）を含む。特定の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０４）を含む。そのような態様では、ｎは、１～１００の整数であり得る。いくつかの態様では、ｎは１から２０までの整数、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり得る。いくつかの態様では、ｎは、１～１００の整数である。
本開示に有用なリンカーの例としては、ＧＧＧ、ＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１９８）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号１９９）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２００）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２０１）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２０２）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、リンカーは、ポリＧ配列（ＧＧＧＧ）ｎ（配列番号３７３）（式中、ｎは１～１００の整数であり得る）である。
いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち非天然である。一態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸の第１の直線配列を、第１の直鎖状配列が自然では連結されていない、または遺伝子的に融合されていないアミノ酸の第２の直鎖状配列に連結または遺伝子的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然または非天然のペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変された形態（例えば、付加、置換、または欠失などの変異を含む）である非天然のポリペプチドを含むことができる。
いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、非天然アミノ酸を含み得る。さらに他の態様では、ペプチドリンカーは、天然には存在しない直鎖状配列中に存在する天然アミノ酸を含み得る。さらに他の態様では、ペプチドリンカーは、天然のポリペプチド配列を含み得る。
いくつかの態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーを含む。他の態様では、リンカーは、非ペプチドリンカーからなる。いくつかの態様では、非ペプチドリンカーは、例えば、マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、メトキシルポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾネート（ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ－ＳＰＤＰ）、４－スクシンイミジルオキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）などであり得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，３７５，０７８号を参照されたい）。
リンカーは切断しやすい場合があり（「切断可能なリンカー」）、それにより、生体活性分子（例えば、抗原、アジュバント、または免疫モジュレーター）の放出を促進する。したがって、いくつかの態様では、本開示で使用できるリンカーは、切断可能なリンカーを含む。そのような切断可能なリンカーは、例えば、生体活性分子が活性状態を維持する条件下で、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断、及びジスルフィド結合の切断を受けやすい。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、スペーサーを含む。特定の態様では、スペーサーはＰＥＧを含む。
いくつかの態様では、リンカーは、「還元感受性リンカー」である。いくつかの態様では、還元感受性リンカーは、ジスルフィド結合を含む。いくつかの態様では、リンカーは、「酸不安定性リンカー」である。いくつかの態様では、酸不安定性リンカーは、ヒドラゾンを含む。適切な酸不安定性リンカーとしてはまた、例えば、ｃｉｓ－アコニットリンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせも挙げられる。
いくつかの態様では、リンカーは、切断不可能なリンカー（すなわち、切断に対して耐性または実質的に耐性）を含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示するリンカーの組み合わせは、切断可能なリンカーのみを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示するリンカーの組み合わせは、切断不可能なリンカーのみを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示するリンカーの組み合わせは切断可能なリンカーと切断不可能なリンカーの両方を含む。本開示で使用できる切断可能なリンカー及び切断不可能なリンカーに関する追加の開示は以下に提供される。
ＩＩ．Ｉ 親和性リガンド
本明細書に開示されるＥＶは、目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）をＥＶ（例えば、外側表面もしくは内腔表面上）に、または標的細胞に、連結またはコンジュゲートする１つ以上の親和性リガンドを含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される親和性リガンドは、以下の特性の１つ以上を有する：（ｉ）合成ライブラリーに由来する、（ｉｉ）遅いオフレートに重点を置いて、足場部分（例えば、足場Ｘ）に対するサブナノモルの親和性、（ｉｉｉ）足場部分（例えば、足場Ｘ）の膜遠位ＩｇＶドメイン上のエピトープに結合する、（ｉｖ）ジスルフィド結合を含まない、（ｖ）Ｎ結合型グリコシル化部位を含まない、（ｖｉ）２０個未満のアミノ酸長、（ｖｉｉ）単量体、（ｖｉｉｉ）生理的ｐＨで電気的に中性、（ｉｘ）親水性、（ｘ）プロテアーゼ消化に耐性、（ｘｉ）原核生物及び真核生物の宿主での発現に適している、（ｘｉｉ）Ｎ末端またはＣ末端での融合に対応可能である、（ｘｉｉｉ）非免疫原性、（ｘｉｖ）例えばＥＶの精製及び／または分離のためのタグを含み得る、ならびに（ｘｖ）それらの組み合わせ。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本明細書に開示される親和性リガンドは、ＥＶの表面上に発現する部分に特異的に（例えば、高い親和性で）結合することができる。特定の態様では、親和性リガンドは、ＥＶの表面上に発現する足場部分に特異的に結合する。いくつかの態様では、親和性リガンドは、ＥＶの表面上に発現する任意の部分（例えば、コレステロール）に特異的に結合する。いくつかの態様では、本明細書に開示される親和性リガンドは、標的細胞上に発現する部分に特異的に（例えば、高い親和性で）結合することができる。そのような親和性リガンドの非限定的な例は、本開示全体にわたって提供される。
上記のように、本開示に有用な親和性リガンドは、１つ以上のタグを発現するように操作することができる。いくつかの態様では、そのようなタグは、親和性リガンドにコンジュゲートされた薬剤の精製及び／または分離において有用であり得る。例えば、いくつかの態様では、ＥＶは、目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）と、タグと、を含む親和性リガンド融合にコンジュゲートされた足場部分を含む。そのような態様では、タグを使用して、ＥＶを含む試料からＥＶを精製及び／または分離することができる。いくつかの態様では、上記の親和性リガンド融合のタグは、親和性リガンドと目的の分子との間に存在する。いくつかの態様では、上記の親和性リガンド融合のタグは、タグが目的の分子の活性を妨害しない限り、目的の分子の末端（例えば、Ｎ末端）に存在することができる。試料から薬剤を精製及び／または分離するために当該技術分野で有用な任意のタグを、本開示で使用することができる。このようなタグの非限定的な例としては、ポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、インフルエンザウイルスＨＡタグ、チオレドキシン、ブドウ球菌プロテインＡタグ、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ、ＡｖｉＴａｇエピトープ（その後のビオチン化のため）、ｃ－ｍｙｃエピトープ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５５，４１３号を参照されたい。
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、目的の分子は、足場部分を介してＥＶの表面上で発現し得る。これらの態様のいくつかにおいて、目的の分子は、親和性リガンドを介して足場部分に連結またはコンジュゲートすることができる。例えば、本明細書に記載されるように、特定の態様では、親和性リガンドは、目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）に融合され得、次いで、目的の分子は、親和性リガンドを介して、ＥＶの表面上に発現する部分（例えば、足場部分）にコンジュゲートされ得る。いくつかの態様では、親和性リガンドは、目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）のＥＶ上の部分（例えば、足場部分）への結合を増加させる。特定の態様では、目的の分子のＥＶ上の部分（例えば、足場部分）への結合は、参照（例えば、目的の分子の親和性リガンドを使用しないＥＶ上の部分（例えば、足場部分）への結合）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、またはそれ以上増加する。
いくつかの態様では、本開示で使用できる親和性リガンドは直鎖状ペプチドを含む。いくつかの態様では、親和性リガンドは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００のアミノ酸を含む。
いずれか１つの理論に拘束されるものではないが、親和性リガンド（例えば、本明細書に開示される）を使用して、目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）をＥＶの表面上に発現する部分（例えば足場部分）に連結またはコンジュゲートさせると、本明細書に開示されるＥＶの１つ以上の特性を改善することができる。例えば、いくつかの態様では、目的の分子のＥＶ上の部分（例えば、足場部分）への結合を増加させることによって、本明細書に開示される親和性リガンドは、ＥＶの表面（例えば、外側表面）上の目的の分子の発現の増加を可能にすることができる。したがって、特定の態様では、（ｉ）目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）と、（ｉｉ）親和性リガンドと、（ｉｉｉ）足場部分と、を含む融合タンパク質は、参照（例えば、親和性リガンドを含まない対応する融合タンパク質）と比較して、より高い密度でＥＶ（例えば、外側表面）に存在する。いくつかの態様では、エキソソームの表面上の融合タンパク質の密度は、参照と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、少なくとも約６，０００倍、少なくとも約７，０００倍、少なくとも約８，０００倍、少なくとも約９，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、またはそれ以上増加する。
いくつかの態様では、目的の分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）のＥＶの表面上に発現する部分（例えば、足場部分）への改善された結合は、本明細書に開示されるＥＶを産生するために必要な時間を短縮することができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示される親和性リガンドは、本明細書に開示される操作されたＥＶ（例えば、目的の分子及び足場部分を含む）を産生するために必要な時間を短縮することができる。いくつかの態様では、操作されたＥＶを産生するために必要な時間は、参照（例えば、親和性リガンドを含まない対応するＥＶを産生するために必要な時間）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上短縮される。
いくつかの態様では、本開示に有用な親和性リガンドは、プロテアーゼ（例えば、トロンビン）切断部位などの切断部位を含む。
親和性リガンドを含むＥＶの非限定的な例を以下に記載する。本明細書に開示される親和性リガンドが、本明細書に開示される他のＥＶと組み合わせて使用できることは、当業者には明らかであろう。
いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）抗原と、（ｉｉ）足場部分と、（ｉｉｉ）親和性リガンドと、を含み、親和性リガンドは、抗原を足場部分に連結またはコンジュゲートするために使用される。図７に示されるように、いくつかの態様では、そのようなＥＶを生成するために、親和性リガンドを抗原（例えば、スパイクＳタンパク質）に融合させ、次いで抗原－親和性リガンド融合体を親和性リガンドを介して足場部分に連結またはコンジュゲートさせる。特定の態様では、抗原は、本明細書に開示されるコロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）のスパイク（Ｓ）タンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。特定の態様では、足場部分は足場Ｘを含む。したがって、いくつかの態様では、ＥＶは、（ｉ）コロナウイルスＳタンパク質のＲＢＤと、（ｉｉ）足場Ｘと、（ｉｉｉ）親和性リガンドと、を含み、親和性リガンドは、コロナウイルスＳタンパク質のＲＢＤを足場Ｘに連結またはコンジュゲートするために使用される。いくつかの態様では、親和性リガンドは、コロナウイルスＳタンパク質のＲＢＤの断片を連結またはコンジュゲートするために使用され得る。特定の態様では、本明細書に開示される親和性リガンドを使用して足場Ｘに連結またはコンジュゲートすることができるコロナウイルスＳタンパク質のＲＢＤの断片は、約１００アミノ酸未満（例えば、約９０アミノ酸未満、約８０未満のアミノ酸、約７０未満のアミノ酸、約６０未満のアミノ酸、約５０未満のアミノ酸、約４０未満のアミノ酸、約３０未満のアミノ酸、約２０未満のアミノ酸、約１０アミノ酸未満、またはそれ以上）の長さである。
ＩＩＩ． 医薬組成物
本明細書において、所望の程度の純度を有する本開示のＥＶと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを、対象への投与に適した形態で含む医薬組成物が提供される。薬学的に許容される賦形剤または担体は、部分的には、投与される特定の組成物によって、及び組成物を投与するために使用する特定の方法によって決定することができる。したがって、複数の細胞外小胞を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ． ２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照されたい）。医薬組成物は一般的に滅菌して製剤化され、米国食品医薬品局の医薬品製造管理及び品質管理基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠する。
いくつかの態様では、医薬組成物は、本明細書に記載の１つ以上の治療剤とエキソソームとを含む。特定の態様では、ＥＶは、薬学的に許容される担体中で１つ以上の追加の治療剤と共投与される。いくつかの態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与の前に投与される。他の態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、追加の治療剤の投与の後に投与される。さらなる態様では、ＥＶを含む医薬組成物は、追加の治療剤と同時に投与される。
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量及び濃度において、レシピエント（例えば、動物またはヒト）に対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
担体または希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び化合物の使用は、当該技術分野で公知である。任意の従来の媒体または化合物が本明細書に記載の細胞外小胞と不適合でない限り、組成物におけるその使用が企図される。補助的な治療剤もまた、組成物中に組み込むことができる。典型的には、医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。ＥＶは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内経路、または吸入剤によって投与され得る。特定の態様では、エキソソームを含む医薬組成物は、例えば、注射によって静脈内投与される。ＥＶは、任意選択、ＥＶが意図される疾患、障害、または状態の治療に少なくとも部分的に有効である他の治療剤と組み合わせて投与することができる。
溶液または懸濁液は、以下の成分、すなわち、水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗微生物化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩のような緩衝液；及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような浸透圧を調節するための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスまたはプラスチック製の複数回投与用バイアルに封入することができる。
注射可能な使用に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。組成物は一般的に滅菌されており、容易に注射器で使用できる程度の流動性を有する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防御は、さまざまな抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アルコルビン酸、チメロサールなどによっても達成できる。必要に応じて、等張化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを、組成物に添加することができる。例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収を遅延させる化合物を組成物に含めることによって注射用組成物の長期的吸収をもたらすことができる。
ＥＶを、有効量で、かつ適切な溶媒中に、必要に応じて本明細書中に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせとともに混合することによって滅菌注射液を調製することができる。一般的に、分散液は、ＥＶを、塩基性分散媒及び任意の所望の他の成分を含む無菌ビヒクルに混合することによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、以前に滅菌濾過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末が得られる、真空乾燥及び凍結乾燥である。ＥＶは、ＥＶの持続的またはパルス放出を可能とする形で製剤化することができるデポー注射またはインプラント製剤の形態で投与することができる。
エキソソームを含む組成物の全身投与は、経粘膜手段によることもできる。経粘膜投与の場合、浸透する障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、当該技術分野で周知であり、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、例えば、点鼻薬の使用を通じて達成され得る。
特定の態様では、エキソソームを含む医薬組成物は、医薬組成物の恩恵を受けるであろう対象に静脈内投与される。ある特定の他の態様では、組成物は、リンパ系に、例えば、リンパ内注射によってまたは結節内注射によって（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０５（ ４６）：１７９０８（２００８）を参照されたい）、または筋肉内注射によって、皮下投与によって、胸腺もしくは肝臓への直接注射によって投与される。
特定の態様では、エキソソームを含む医薬組成物は、液体懸濁液として投与される。特定の態様では、医薬組成物は、投与に続いてデポーを形成できる製剤として投与される。特定の好ましい態様では、デポーは、ＥＶを循環中に徐放するか、またはデポー形態のままで維持する。
典型的には、薬学的に許容される組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、生体適合性があり、毒性がなく、対象への投与に適している。水が担体の成分である場合、水は高度に精製され、エンドトキシンなどの汚染物質を含まないように処理される。
薬学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱油であり得るが、これらに限定されない。医薬組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、風味増強剤、乳化剤、懸濁剤、及び／または防腐剤をさらに含み得る。
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載のＥＶと、任意選択で、薬学的に活性な薬剤または治療剤と、を含む。治療剤は、生物学的薬剤、小分子薬剤、または核酸薬剤であり得る。
本明細書に記載のＥＶを含む医薬組成物を含む剤形を提供する。いくつかの態様では、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁液として製剤化される。
特定の態様では、エキソソームの製剤を、残留複製能のある核酸を損傷するために、放射線、例えば、Ｘ線、γ線、β粒子、α粒子、中性子、陽子、元素核、紫外線に曝露させる。
特定の態様では、エキソソームの製剤を、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００ｋＧｙを超える照射線量を使用するγ照射に曝露させる。
特定の態様では、エキソソームの製剤を、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、または１００００ｍＳｖを超える照射線量を使用するＸ線照射に曝露させる。
ＩＶ． キット
本明細書に記載の１つ以上のエキソソームを含むキットも本明細書で提供される。いくつかの態様では、本明細書において、本明細書に記載の医薬組成物の１つ以上の成分、例えば、本明細書中に提供する１つ以上のエキソソームで満たされた１つ以上の容器と、任意選択で使用説明書を含む医薬パックまたはキットが提供される。いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載の医薬組成物及び本明細書に記載のものなどの任意の予防薬または治療剤を含む。
Ｖ． ＥＶを産生する方法
本開示のＥＶは、目的の部分（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分）を発現するようにＥＶを迅速に操作できるという点で、従来のワクチンとは異なる。本明細書に記載されるように、目的の部分は、（ｉ）ＥＶの表面（例えば、外側表面及び／または内腔表面）に直接連結することができ、（ｉｉ）足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）に連結して、次いでＥＶの表面（例えば、外側表面及び／または内腔表面）上に発現させることができ、（ｉｉｉ）ＥＶの内腔に発現させることができ、または（ｉｖ）それらの組み合わせであり得る。そのようなＥＶを迅速に操作できる能力は、ＥＶベースのワクチンを開発するのに特に有用である。例えば、特定のペイロード及び／または標的化部分を発現するように操作された単一のＥＶは、目的の抗原を単にＥＶに「差し込む」ことによって、広範囲の疾患または障害を治療するのに使用することができる。
したがって、いくつかの態様では、本開示は、そのようなモジュラーまたは「プラグアンドプレイ」ＥＶワクチンを産生する方法を対象とする。特定の態様では、ＥＶベースのワクチンを産生する方法は、目的の抗原が操作されたＥＶで発現されるように、操作されたＥＶを目的の抗原と混合することを含む。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、ＥＶで発現され得る目的の抗原は、コロナウイルスの全長タンパク質（例えば、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、及び／または膜タンパク質）を含む。特定の態様では、目的の抗原は、全長タンパク質のサブユニット（例えば、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン）を含む。いくつかの態様では、ＥＶは、本明細書に開示される方法を使用して、複数（例えば、２つ以上）のコロナウイルス抗原、例えば、本開示に記載されるものなどを発現するように操作され得る。いくつかの態様では、操作されたＥＶは、本明細書に開示される１つ以上のペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）を含む。特定の態様では、操作されたＥＶは、１つ以上の足場部分（例えば、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）をさらに含む。いくつかの態様では、操作されたＥＶは、１つ以上の標的化部分をさらに含む。いくつかの態様では、操作されたＥＶは、本明細書に開示される方法のいずれかを使用して産生され得る。
本開示から明らかなように、本明細書に開示されるＥＶベースのワクチンプラットフォーム（例えば、モジュラーまたは「プラグアンドプレイ」ＥＶ）の特徴の１つは、ＥＶがプロデューサー細胞から単離され、それらが本明細書に開示される方法とともに使用されるまで無期限に保存できることである。本明細書で使用される場合、「プロデューサー細胞から単離された」ＥＶは、それらが産生された細胞から独立して存在するＥＶを指す。いくつかの態様では、産生されると、本開示に有用なＥＶは、プロデューサー細胞を含む培養物から精製または抽出され、さらなる使用（例えば、１つ以上の本明細書に開示されている抗原の添加）の準備が整うまで別の容器に保存される。このようなＥＶは、本明細書では「ベースＥＶ」または「ベースエキソソーム」とも呼ばれる。本明細書で記載されるように、ベースＥＶは、天然に存在するＥＶとは異なり得る。例えば、ベースＥＶは、（例えば、産生中に目的の部分をプロデューサー細胞に導入することによって）遺伝子改変することができ、またはＥＶが産生されてプロデューサー細胞から単離された後に改変することができる。
例えば、本明細書に記載されるように、ベースＥＶを産生する際に、それらは、広範囲の疾患または障害（例えば、アジュバント及び／または標的化部分）において有益であるもののような、１つ以上の目的の部分を含むように最初に産生され得る。次いで、必要に応じて、神経障害の治療に有用な抗原などの目的の特定の抗原をプラグインまたはクリッピングするだけでベースＥＶを迅速に改変できる。これにより、本明細書に記載の疾患または障害（例えば、神経障害）を治療するのに使用できるワクチンを産生または製造できる。そのような抗原は、プロデューサー細胞からベースＥＶを単離した後、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約７ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１１ヶ月、少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約２年、少なくとも約３年、少なくとも約４年、もしくは少なくとも約５年、またはそれ以上でベースＥＶに添加することができる。
いずれか１つの理論に拘束されるものではないが、そのようなベースＥＶの使用は、特に大規模な製造規模で、ワクチン産生の１つ以上の態様を大幅に改善することができる。多くの伝統的なワクチン（例えば、ペプチドベース）が特定の疾患または障害の治療及び／または予防に使用されてきたが、それらは一般に免疫原性が低く、反復投与及び／または高用量を必要とする。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｏｓ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：８８４（２０１８）を参照されたい。さらに、国や年齢層ごとに異なる製剤が必要なため、製造が複雑なため、安全で効果的なワクチンを開発及び製造するには、多くの場合、数年かかる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｍｉｔｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３７８（９７８９）：４２８－４３８（Ｊｕｌ． ２０１１）を参照されたい。したがって、目的の抗原をベースＥＶに単純に「プラグ」または「クリップオン」する能力は、特定の個体または個体のサブセット（例えば、年齢層）においてより地域的及び／またはより蔓延している疾患または障害を治療しようとする場合に非常に有利であり得る。
したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示される方法により、ワクチンの製造または生産に必要な時間（「製造時間」）は、参照製造時間と比較して短縮される。特定の態様では、参照製造時間は、非ＥＶベースのワクチンを製造または生産するのに必要な時間を指す。いくつかの態様では、参照製造時間は、抗原がプロデューサー細胞から単離されたＥＶに添加されない（例えば、抗原をプロデューサー細胞に導入することによってＥＶが産生されると、ＥＶが抗原を含むようになる）ＥＶベースのワクチンを製造または産生するのに必要な時間を指す。いくつかの態様では、製造時間は、参照製造時間と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上短縮される。いくつかの態様では、製造時間は、約１２ヶ月未満、約１１ヶ月未満、約１０ヶ月未満、約９ヶ月未満、約８ヶ月未満、約７ヶ月未満、約６ヶ月未満、約５ヶ月未満、約４ヶ月未満、約３ヶ月未満、約２ヶ月未満、または約１ヶ月未満である。いくつかの態様では、製造時間は約６ヶ月未満である。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法を使用して産生または製造できるＥＶは、地域化されたワクチンである。本明細書で使用される場合、「地域化されたワクチン」または「地域ワクチン」という用語は、世界の特定の地域に合わせて調整されたワクチンを指す。例えば、感染性病原体（ウイルスなど）の特定の遺伝的サブタイプ／血清型の地理的単離には、世界中の病原体の広範な多様性に対処するように設計されたワクチンとは対照的に、よりカスタマイズされたワクチンが必要になる可能性がある。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法を使用して、プロデューサー細胞から単離されたＥＶに抗原を加えることによって、そのような地域化されたワクチンを産生または製造することができ、抗原は、世界の特定の地域内で蔓延している特定の病原体（または病原体の遺伝子サブタイプ／血清型）に関連していると判定されている。そのような病原体の非限定的な例は、本開示の他の箇所で提供される。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法を使用して産生または製造できるＥＶベースのワクチンは、個別化されたワクチンである。本明細書で使用される場合、「個別化されたワクチン（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ）」及び「個別化されたワクチン（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ）」という用語は、交換可能に使用でき、特定の個体または個体のサブセットに合わせて調整されたワクチンを指す。多くのネオアンチゲンは、個体または個体のサブセット（例えば、特定の遺伝的背景を共有する人）の特定のがん細胞に特異的であるため、そのような個別化ワクチンは、例えば、ネオアンチゲンを使用するがんワクチンにとって特に興味深い可能性がある。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法を使用して、プロデューサー細胞から単離されたＥＶに抗原を添加することによって、そのような地域化されたワクチンを産生または製造することができ、抗原は、特定の個体または個体のサブセットにおいて、治療効果（例えば、免疫応答を誘導する）を有する（または有する可能性が高い）と判定されている。
当業者には明らかであるように、地域特異的及び／または個体特異的抗原を同定する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、そのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００９／０１６９５７６；ＵＳ２０１４／０１７８４３８；Ｓａｋｋｈａｃｈｏｒｎｐｈｏｐ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１７：７０－８（Ｊｕｎ． ２０１５）；及びＸｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８（１）：１０６７（Ｊａｎ． ２０１８）を参照されたい。
いくつかの態様では、本開示はまた、本明細書に記載のＥＶの産生方法に関する。いくつかの態様では、方法は、ＥＶの２つ以上の成分（例えば、（ｉ）抗原及びアジュバント、（ｉｉ）抗原及び免疫モジュレーター、（ｉｉｉ）抗原及び標的化部分、（ｉｖ）抗原、アジュバント、及び標的化部分、（ｖ）抗原、免疫モジュレーター、及び標的化部分、（ｖｉ）抗原、アジュバント、及び免疫モジュレーター、（ｖｉｉ）抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び標的化部分）を含むプロデューサー細胞からＥＶを取得することと、任意選択で、取得したＥＶを単離することと、を含む。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示されるＥＶの２つ以上の成分（例えば、（ｉ）抗原及びアジュバント、（ｉｉ）抗原及び免疫モジュレーター、（ｉｉｉ）抗原及び標的化部分、（ｉｖ）抗原、アジュバント、及び標的化部分、（ｖ）抗原、免疫モジュレーター、及び標的化部分、（ｖｉ）抗原、アジュバント、及び免疫モジュレーター、（ｖｉｉ）抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び標的化部分）を導入することによりプロデューサー細胞を改変することと、改変されたプロデューサー細胞からＥＶを取得することと、任意選択で、取得したＥＶを単離することと、を含む。さらなる態様では、方法は、プロデューサー細胞からＥＶを取得することと、取得されたＥＶを単離することと、単離されたＥＶを改変すること（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター、及び／または標的化部分など、複数の外因性生物活性分子を挿入することによって）と、を含む。特定の態様では、方法は、単離されたＥＶを医薬組成物に製剤化することをさらに含む。
本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、本明細書に提供される方法を使用して産生され得るＥＶは、以下の特徴のうちの１つ以上を含む：（ｉ）内腔Ｔ細胞抗原（例えば、足場部分を使用してＥＶの内腔表面に結合されている）；（ｉｉ）表面Ｂ細胞抗原（例えば、足場部分を使用してＥＶの外側表面に結合されている）；（ｉｉｉ）ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えば、ＥＶの内腔にロードされる）。本明細書に記載の足場部分（例えば、足場Ｘ及び足場Ｙ）に加えて、任意の適切な方法を使用して、目的の抗原または他の任意の分子（例えば、アジュバント、及び／または標的化部分）をＥＶの外側表面及び／または内腔表面に連結することができる。特定の態様では、目的の抗原または任意の他の分子（例えば、アジュバント及び／または標的化部分）は、当該技術分野で知られている任意の好適なカップリング戦略によってＥＶの外側表面及び／または内腔表面に連結されている。いくつかの態様では、カップリング戦略としては、アンカー部分、親和性剤、化学的コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、スプリットインテイン、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＡＬＦＡタグ、ストレプトアビジン／アビタグ、ソルターゼ、ＳＮＡＰタグ、ＰｒｏＡ／Ｆｃ結合ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、アンカー部分としては、コレステロール、脂肪酸（例えば、パルミチン酸）、トコフェロール（例えば、ビタミンＥ）、アルキル鎖、芳香環、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、化学的コンジュゲーションとしては、マレイミド部分、銅を含まない、双直交クリック化学（例えば、アジド／歪みアルキン（ＤＩＦＯ））、金属触媒クリック化学（例えば、ＣＵＡＡＣ、ＲＵＡＡＣ）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。目的の抗原または任意の他の分子（例えば、アジュバント及び／または標的化部分）を連結する異なるアプローチに関する追加の説明は、本開示の他の箇所で提供される。
いくつかの態様では、本開示に有用なＴ細胞抗原を同定するために、インシリコ構造ベースのネットワーク分析を使用して、病原体、例えば、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、及び／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶ）の１つ以上の保存されたＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）エピトープを決定することができる。コロナウイルスのＴ細胞エピトープの非限定的な例を表２に提供する。いくつかの態様では、ネットワーク分析は、コロナウイルスのスパイク、ヌクレオキャプシド、及び／または非構造タンパク質（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、及び／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶ）に適用される。いくつかの態様では、Ｔ細胞エピトープはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり、異なるタイプのコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、及び／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶ）にわたって保存されている。このような分析に関する追加の開示は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧａｉｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６４（６４３９）：４８０－４８４（Ｍａｙ ２０１９）に提供される。
いくつかの態様では、本開示に有用なＢ細胞抗原を同定するために、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、及び／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶ）のスパイクタンパク質を評価して、さまざまなタイプのコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）、及び／またはＭＥＲＳ－ＣｏＶ）にわたって保存されているＢ細胞エピトープを決定できる。本明細書に記載されるように、特定の態様では、ＥＶに（例えば、足場部分を使用してＥＶの外側表面に）結合させることができるＢ細胞抗原は、コロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。ＲＢＤに関する追加の開示は、本明細書の他の箇所で提供される。
Ｖ． プロデューサー細胞を改変する方法
上記のように、いくつかの態様では、ＥＶを産生する方法は、プロデューサー細胞を複数（例えば、２つ以上）の目的の分子（例えば、本明細書に記載の外因性生物活性分子（例えば、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター）、及び／または標的化部分）で改変することを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されるプロデューサー細胞は、本明細書に開示される足場部分（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）でさらに改変され得る。
いくつかの態様では、プロデューサー細胞は、哺乳動物細胞株、植物細胞株、昆虫細胞株、真菌細胞株、または原核細胞株であり得る。ある特定の態様では、プロデューサー細胞は、哺乳動物細胞株である。哺乳動物細胞株の非限定的な例としては、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ－１０８０細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＰＥＲＣ－６細胞株、ＣＥＶＥＣ細胞株、線維芽細胞株、羊膜細胞株、上皮細胞株、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞株、及びこれらの組み合わせが挙げられる。特定の態様では、哺乳動物細胞株としては、ＨＥＫ－２９３細胞、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪性間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、またはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様では、プロデューサー細胞は、初代細胞である。特定の態様では、初代細胞は、初代哺乳動物細胞、初代植物細胞、初代昆虫細胞、初代真菌細胞、または初代原核細胞であり得る。
いくつかの態様では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、Ｔヘルパー細胞、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）などの免疫細胞ではない。他の態様では、プロデューサー細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、クッパー－ブロウィッツ細胞、またはそのような細胞のいずれかに由来する細胞）ではない。いくつかの態様では、プロデューサー細胞は、天然に存在する抗原提示細胞ではない（すなわち、改変されている）。特定の態様では、プロデューサー細胞は、天然に存在する樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、クッパー－ブロウィッツ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、導入遺伝子またはｍＲＮＡであり得、トランスフェクション、ウイルス形質導入、エレクトロポレーション、押し出し、超音波処理、細胞融合、または当該技術分野で知られている他の方法によってプロデューサー細胞に導入することができる。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、トランスフェクションによってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの態様では、カチオン性脂質及びポリマーのような合成マクロ分子を使用して１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）を適切なプロデューサー細胞に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。いくつかの態様では、カチオン性脂質は、電荷相互作用によって１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）と複合体を形成する。これらの態様のいくつかでは、正に荷電した複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。いくつかの他の態様では、カチオン性ポリマーを使用してプロデューサー細胞にトランスフェクトすることができる。これらの態様のいくつかでは、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。特定の態様では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質を使用して１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）をプロデューサー細胞に導入することができる。１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）はまた、粒子介在型トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃、またはパーティクルボンバードメント法などの物理的方法を使用してプロデューサー細胞中に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。例えば、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子を使用してプロデューサー細胞のトランスフェクション効率を評価することができる。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、ウイルス形質導入によってプロデューサー細胞に導入される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、及びスプーマウイルスを含む多くのウイルスを遺伝子導入ビヒクルとして使用することができる。ウイルス媒介型の遺伝子導入ビヒクルとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスに基づくベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターが挙げられる。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、エレクトロポレーションによってプロデューサー細胞に導入される。エレクトロポレーションは、細胞膜に一過性の孔を形成し、細胞内へのさまざまな分子の導入を可能とする。いくつかの態様では、ＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびにポリペプチド及び非ポリペプチド治療剤を、エレクトロポレーションによってプロデューサー細胞に導入することができる。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、マイクロインジェクションによってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの態様では、ガラス製マイクロピペットを使用して、顕微鏡レベルで、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）をプロデューサー細胞内に注射することができる。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、押し出しによってプロデューサー細胞に導入される。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、超音波処理によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの態様では、プロデューサー細胞は、高強度音波に曝露され、細胞膜の一過性の破壊が引き起こされ、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）のローディングを可能にする。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、細胞融合によってプロデューサー細胞に導入される。いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、電気的細胞融合によって導入される。他の態様では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用してプロデューサー細胞を融合する。さらなる態様では、センダイウイルスを使用してプロデューサー細胞を融合する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、低張溶解によってプロデューサー細胞に導入される。そのような態様では、プロデューサー細胞を、低イオン強度緩衝液に曝露し、それらを破裂させて１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）のローディングを可能にすることができる。他の態様では、低張溶液に対する制御された透析を使用して、プロデューサー細胞を膨潤させ、プロデューサー細胞膜に孔を作製することができる。プロデューサー細胞を、その後、膜の再シール形成を可能にする条件に曝露する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、界面活性剤処理によってプロデューサー細胞に導入される。特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）のローディングを可能にする孔を作製することによってプロデューサー細胞膜を一過性に損わせる穏やかな界面活性剤で、プロデューサー細胞を処理する。プロデューサー細胞にロードした後、界面活性剤を洗い流し、それによって膜を再シール形成する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、受容体媒介性エンドサイトーシスによってプロデューサー細胞に導入される。特定の態様では、プロデューサー細胞は、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）の結合時に受容体及び結合する部分の内部移行を誘導する表面受容体を有する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、濾過によってプロデューサー細胞に導入される。特定の態様では、プロデューサー細胞と１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）をプロデューサー細胞より小さい孔径のフィルターに強制的に通すことで、プロデューサー細胞膜の一過性の破壊を引き起こし、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）をプロデューサー細胞に入れることができる。
いくつかの態様では、プロデューサー細胞を、数回の凍結融解サイクルに供し、細胞膜破壊を生じさせ、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分のローディングを可能にする。
Ｖ．Ｂ ＥＶを改変する方法
いくつかの態様では、ＥＶの産生方法は、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）をＥＶに直接導入することによって、単離されたＥＶを改変することを含む。特定の態様では、１つ以上の部分は、抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、標的化部分、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、１つ以上の部分は、本明細書に開示される足場部分（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）を含む。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、トランスフェクションによってＥＶに導入される。いくつかの態様では、カチオン性脂質及びポリマーのような合成マクロ分子を使用して１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）をＥＶに導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。特定の態様では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質を使用して１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）をＥＶに導入することができる。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、エレクトロポレーションによってＥＶに導入される。いくつかの態様では、ＥＶ膜に一過性の孔を生じさせ、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）のローディングを可能にする電場に、ＥＶを曝露する。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、マイクロインジェクションによってＥＶに導入される。いくつかの態様では、ガラス製マイクロピペットを使用して、顕微鏡レベルで、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）を直接、ＥＶ内に注射することができる。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、押し出しによってＥＶに導入される。
特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、超音波処理によってＥＶに導入される。いくつかの態様では、ＥＶは、高強度音波に曝露され、ＥＶ膜の一過性の破壊が引き起こされ、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）のローディングを可能にする。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）をＥＶの表面にコンジュゲートすることができる（すなわち、ＥＶの外側表面またはＥＶの内腔表面に直接コンジュゲートまたは連結することができる）。コンジュゲーションは、当該技術分野で公知の方法により、化学的または酵素的に達成することができる。
いくつかの態様では、ＥＶは、化学的にコンジュゲートされた１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）を含む。化学的コンジュゲーションは、本明細書に開示されるリンカーまたは親和性リガンドを使用して、または使用せずに、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）を別の分子に共有結合させることによって達成することができる。そのようなコンジュゲートの形成は、当該技術分野の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するためのさまざまな技法が知られており、特定の技法の選択はコンジュゲートさせる物質によって導かれる。特定の態様では、ポリペプチドをＥＶとコンジュゲートさせる。いくつかの態様では、脂質、炭水化物、核酸、及び小分子のような非ポリペプチドを、ＥＶとコンジュゲートさせる。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、低張溶解によってＥＶに導入される。そのような態様では、ＥＶを、低イオン強度緩衝液に曝露し、それらを破裂させて１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）のローディングを可能にすることができる。他の態様では、低張溶液に対する制御された透析を使用して、ＥＶを膨潤させ、ＥＶ膜に孔を作製することができる。ＥＶを、その後、膜の再シール形成を可能にする条件に曝露する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、界面活性剤処理によってＥＶに導入される。特定の態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）のローディングを可能にする孔を作製することによってＥＶ膜を一過性に損わせる穏やかな界面活性剤で、細胞外小胞を処理する。ＥＶにロードした後、界面活性剤を洗い流し、それによって膜を再シール形成する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）は、受容体媒介性エンドサイトーシスによってＥＶに導入される。特定の態様では、ＥＶは、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）の結合時に受容体及び結合する部分の内部移行を誘導する表面受容体を有する。
いくつかの態様では、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）を、機械による発火によってＥＶに導入する。特定の態様では、細胞外小胞は、金マイクロキャリアなどの重い粒子または荷電粒子に結合させた１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分）によって粒子を当てられ得る。これらの態様のいくつかでは、粒子は、粒子がＥＶ膜を横断するように機械的または電気的に加速され得る。
いくつかの態様では、細胞外小胞を、数回の凍結融解サイクルに供し、ＥＶ膜破壊を生じさせ、１つ以上の部分（例えば、ペイロード及び／または標的化部分のローディングを可能にする。
Ｖ．Ｃ ＥＶを分離する方法
いくつかの態様では、本明細書に開示するＥＶの産生方法は、プロデューサー細胞からＥＶを単離することを含む。特定の態様では、ＥＶは、プロデューサー細胞から細胞培地中に放出される。ＥＶの単離のすべての既知の様式は、本明細書での使用に適すると思われることが企図される。例えば、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、濾過、分子ふるいなど）、密度（例えば、通常の遠心分離または勾配遠心分離）、スベドベリ定数（例えば、外力を伴うかまたは伴わない沈降など）に基づく分離を含めて、ＥＶの物理的特性を用いて、ＥＶを培地または他の供給源材料から分離することができる。代替的にまたは追加的に、単離は、１つ以上の生物学的特性に基づくことができ、表面マーカーを使用し得る方法（例えば、沈殿、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合、アフィニティ精製など）を含む。
単離及び濃縮は、典型的には連続遠心分離を含む、一般的かつ非選択的様式で行うことができる。代替的に、単離及び濃縮は、ＥＶまたはプロデューサー細胞特異的表面マーカーを使用するような、より特異的かつ選択的な様式で行うことができる。例えば、特異的表面マーカーは、免疫沈降、ＦＡＣＳソーティング、アフィニティ精製、及びビーズ結合リガンドを用いた磁気分離において使用され得る。
いくつかの態様では、サイズ排除クロマトグラフィーを利用して、ＥＶを単離することができる。サイズ排除クロマトグラフィー技法は、当該技術分野で公知である。例示的で非限定的な技法を、本明細書に提供する。いくつかの態様では、ボイド容積画分は単離され、目的のＥＶを含む。さらに、いくつかの態様では、当該技術分野で一般に公知のように、（１つ以上のクロマトグラフィー画分の）遠心分離技法によって、クロマトグラフィー分離後にＥＶをさらに単離することができる。いくつかの態様では、例えば、密度勾配遠心分離を利用して、細胞外小胞をさらに単離することができる。特定の態様では、プロデューサー細胞由来のＥＶを他の起源のＥＶからさらに分離することが望ましい場合がある。例えば、プロデューサー細胞に特異的な抗原抗体を使用する免疫吸着剤捕捉により、プロデューサー細胞由来のＥＶを非プロデューサー細胞由来のＥＶから分離することができる。
いくつかの態様では、ＥＶの単離は、示差遠心分離、サイズに基づく膜濾過、免疫沈降、ＦＡＣＳソーティング、及び磁気分離を含むがこれらに限定されない方法の組み合わせを含み得る。
ＶＩＩ． 治療の方法
本開示は、感染性の疾患または障害、例えばコロナウイルス感染症を予防及び／または治療することをそれを必要とする対象において行う方法であって、本明細書中に開示されるＥＶを、対象に投与することを含む、方法を提供する。いずれかの１つの理論に拘束されるものではないが、いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、感染性の疾患または障害に関連する分子（例えば、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、及び／またはＥタンパク質）に特異的に結合することができる中和抗体を誘導することによって、これらの感染性の疾患または障害を治療及び／または予防することができる。
本開示のＥＶは、当該技術分野で知られている任意の有用な方法及び／または経路によって対象に投与することができる。いくつかの態様では、ＥＶは、対象の循環系に静脈内投与される。いくつかの態様では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の静脈中に投与される。
いくつかの態様では、ＥＶは、対象の循環系に動脈内投与される。いくつかの態様では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の動脈中に投与される。
いくつかの態様では、ＥＶは、鼻腔内投与によって対象に投与される。いくつかの態様では、ＥＶは、局所投与または全身投与のいずれかの形態で、鼻を通して吹き込むことができる。特定の態様では、ＥＶは鼻スプレーとして投与される。いくつかの態様では、鼻腔内投与は、本明細書に開示されるＥＶの胃腸組織への効果的な送達を可能にすることができる。胃腸組織に送達されるそのようなＥＶは、さまざまな腸関連病原体に対する保護を提供するのに有用であり得る。
いくつかの態様では、ＥＶは、腹腔内投与によって対象に投与される。いくつかの態様では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の腹膜中に投与される。いくつかの態様では、腹腔内投与は、リンパ管へのＥＶの分布をもたらす。いくつかの態様では、腹腔内投与は、胸腺、脾臓、及び／または骨髄へのＥＶの分布をもたらす。いくつかの態様では、腹腔内投与は、１つ以上のリンパ節へのＥＶの分布をもたらす。いくつかの態様では、腹腔内投与は、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節、または胸骨リンパ節のうちの１つ以上へのＥＶの分布をもたらす。いくつかの態様では、腹腔内投与は、膵臓へのＥＶの分布をもたらす。
本明細書に開示されるＥＶを投与するために使用できる他の投与経路の非限定的な例としては、非経口、局所、経口、皮下、皮内、経皮、直腸、腹腔内、筋肉内、舌下、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書に開示されるように、いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて対象に投与することができる。特定の態様では、１つ以上の追加の治療剤及びＥＶが同時に投与される。いくつかの態様では、１つ以上の追加の治療剤及びＥＶが逐次的に投与される。いくつかの態様では、ＥＶは、１つ以上の追加の治療剤の投与の前に対象に投与される。特定の態様では、ＥＶは、１つ以上の追加の治療剤の投与の後に対象に投与される。本明細書で使用される場合、「治療剤」という用語は、本明細書で開示される感染性の疾患または障害の治療に使用できる任意の薬剤を指す。いくつかの態様では、本開示のＥＶと組み合わせて使用できる１つ以上の追加の治療剤は、ＥＶでは発現しないペイロード（例えば、抗原、アジュバント、及び／または免疫モジュレーター）を含む。例えば、本明細書に開示される治療方法は、それを必要とする対象に（ｉ）抗原のないＥＶと、（ｉｉ）ＥＶで発現されない抗原（例えば、可溶性抗原）と、を投与することを含み得る。
いくつかの態様では、本開示で治療することができる対象は、ヒトである。いくつかの態様では、対象は非ヒト哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ニワトリ、トリ、及びクマ）である。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示されるＥＶは、動物（すなわち、非ヒト哺乳動物）の健康を改善するために使用することができる。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）アジュバント及び抗原を含む細胞外小胞を含むプライミング投与を対象に投与することと、（ｉｉ）抗原を含む細胞外小胞を含むブースティング投与を対象に投与することと、を含む、それを必要とする対象にワクチン接種する方法に関する。
いくつかの態様では、抗原はコロナウイルスに由来する。
いくつかの態様では、プライミング投与は皮下投与される。いくつかの態様では、ブースト投与は鼻腔内に投与される。
いくつかの態様では、アジュバントはＳＴＩＮＧアゴニストである。いくつかの態様では、抗原は、足場部分に連結されている。いくつかの態様では、足場部分は足場Ｘである。
いくつかの態様では、ブースティング投与中のＥＶは、アジュバントをいっさい含まない。
本明細書に記載の投与方法のいずれかにおいて、いくつかの態様では、ＥＶは、「プライムプル」投与レジメンを使用して対象に投与することができる。本明細書で使用される用語「プライムプル」投与レジメンは、対象が第１の投与レジメン（本明細書では「プライミング投与」とも呼ばれる）で最初に免疫され、次いでその後、第２の投与レジメン（本明細書では「ブースティング投与」とも呼ばれる）を受ける投与スケジュールを指す。特定の態様では、第１の投与レジメンは第１のＥＶを含み、第２の投与レジメンは第２のＥＶを含み、第１のＥＶと第２のＥＶは組成が異なる。例えば、特定の態様では、第１のＥＶは、抗原及び本明細書に記載の１つ以上の他の部分（例えば、アジュバント、免疫調節、及び／または標的化部分）を含み、第２のＥＶは、抗原を含むが、第１のＥＶに存在する１つ以上の他の部分を含まない。いくつかの態様では、第１の投与レジメンと第２の投与レジメンは、異なる投与経路（例えば、当該技術分野で知られている及び／または本明細書に開示されている投与経路の任意の組み合わせ）によって対象に投与される。
したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載の投与（またはワクチン接種）方法は、（ｉ）抗原及びアジュバントを含む第１のＥＶを含むプライミング投与を対象に投与することと、（ｉｉ）抗原を含むが第１のＥＶに存在するアジュバントを含まない第２のＥＶを含むブースティング投与を対象に投与することと、を含む。いくつかの態様では、第２のＥＶはアジュバントを含まない。いずれか１つの理論に束縛されるものではないが、いくつかの態様では、プライムプル投与レジメンは、例えば対象にブースティング投与を投与する際にアジュバントの使用を必要としないことにより、本明細書に記載のＥＶベースのワクチンの安全性をさらに改善することができる。これにより、特定のアジュバントで発生する可能性のある非特異的な炎症のリスクを回避できる。
さらに、いくつかの態様では、プライムプル投与レジメンの使用は、目的の特定の組織（例えば、肺またはコロナウイルス感染の他の部位）への免疫細胞の遊走を増強し得る。例えば、特定の態様では、対象は、１つ以上の免疫細胞をプライミングまたは活性化するための第１の投与レジメンを受け、その後、第２の投与レジメンを受け、この第２の投与レジメンは、プライミングされた免疫細胞の目的の特定の組織への遊走を促進することができる。いくつかの態様では、これは、（ｉ）組織特異的投与経路を用いて第２の投与レジメンを投与すること、（ｉｉ）第２の投与レジメンのＥＶを１つ以上の組織特異的標的化部分を含むように改変すること、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方によって達成することができる。そのような投与経路及び標的化部分の非限定的な例は、本開示全体にわたって提供される。
本開示を実施する際には、別段の指示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来的技法を採用し、このような技法は当業者の技能の範囲内である。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５） ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． 米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７） Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７） Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ． １５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６） Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ． ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
上で引用されるすべての参照文献、及び本明細書で引用されるすべての参照文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
次の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定のためのものではない。
実施例１：操作されたエキソソームの生成
本明細書に記載のエキソソームを生成するために、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株（ＨＥＫ２９３ＳＦ）を使用した。次いで、目的の薬剤（例えば、抗原、アジュバント、または免疫モジュレーター）に連結された足場Ｘ及び／または足場Ｙで細胞を安定的にトランスフェクトした。図１Ａ、図１Ｂ、及び図２を参照されたい。例えば、ＣＤ４０Ｌ発現エキソソームは、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞に、単量体（ｐＣＢ－５１８からｐＣＢ－５２６）または強制三量体（ｐＣＢ－６０７及びｐＣＢ－５２７）として発現されたＣＤ４０Ｌ－ＧＦＰ ＰＴＧＦＲＮ融合分子をトランスフェクトすることによって生成された。三量体ＣＤ４０Ｌ－ＧＦＰ ＰＴＧＦＲＮ融合分子の例を図１Ａに示す。同様に、ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）発現エキソソームを生成するために、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞において、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１～１０への融合物（「ＢＡＳＰ１（１－１０）－ＯＶＡ」）としてオボアルブミンを安定に発現させた。
トランスフェクション時に、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を、既知組成培地で７日間、高密度に増殖させる。培養上清を回収し、３００～８００×ｇで５分間、室温で遠心分離して、細胞と大きな残屑を除去した。次いで、培地上清に１０００Ｕ／ＬのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を補充し、３７℃の水浴中で１時間インキュベートした。上清を回収し、１６０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離して残留する細胞残屑及びその他の大きな夾雑物を除去した。次いで、上清を１３３，９００×ｇで３時間、４℃で超遠心分離にかけ、エキソソームをペレット化した。上清を捨て、残留培地をチューブの底からすべて吸引した。ペレットを２００～１０００μＬのＰＢＳ（－Ｃａ－Ｍｇ）中に再懸濁した。
エキソソーム集団をさらに濃縮するため、ペレットを密度勾配精製（スクロースまたはＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標））により処理した。
この勾配を、ＳＷ４１ Ｔｉローターに入れた１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ中、２００，０００×ｇで１６時間、４℃でスピンしてエキソソーム画分を分離した。
このエキソソーム層を上層から静かに取り出し、３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ中、約３２．５ｍＬのＰＢＳに希釈し、１３３，９００×ｇで３時間、４℃で再度超遠心分離を行って、精製されたエキソソームをペレット化した。得られたペレットを最小量のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁し、４℃で保存した。
ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配では、ＳＷ４１ Ｔｉローター用の１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ中、等量の１０％、３０％、及び４５％のＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）を用いて３段階の無菌勾配を調製する。ペレットをＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配に加え、２０００００×ｇで１６時間、４℃で超遠心分離を行ってエキソソーム画分を分離した。次いで、エキソソーム層を、チューブの上層約３ｍＬから静かに回収した。
このエキソソーム画分を、３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ中、約３２ｍＬのＰＢＳに希釈し、１３３９００×ｇで３時間、４℃で超遠心分離を行って精製されたエキソソームをペレット化した。次いで、ペレット化したエキソソームを、最小量のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁し、使用する準備ができるまで４℃で保存する。
実施例２：抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導する操作されたエキソソームの有効性
ウイルス特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、一次ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染後の病原体クリアランスに必要である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的メモリーＣＤ８ Ｔ細胞は、影響を受けやすい宿主を致命的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染から保護する。強力な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成するｅｘｏＶＡＣＣプラットフォームの能力と、組織常在性メモリーＴ細胞応答を拡大する能力は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に対するＣＤ８ Ｔ細胞ベースのワクチンを開発するユニークな機会を提供する。
本明細書に記載のＥＶが抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できることを実証するために、オボアルブミン（ＯＶＡ）を含むＥＶを本明細書に記載の方法を使用して構築した。ＯＶＡはＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合され、ＥＶの外側表面上に提示された（「ＰｒＸ－ＯＶＡ」）。ＥＶの一部には、ＥＶの内腔にＳＴＩＮＧアゴニストがさらにロードされた（「ＰｒＸ－ＯＶＡ－ＳＴＩＮＧ」）。次いで、本明細書に記載のプライムアンドプル投与戦略を使用して、ＥＶをマウスに投与した。図８に示すように、皮下（ＳＱ）、鼻腔内（ＩＮ）、または皮内（ＩＤ）投与により、動物に２回（すなわち、０日目及び初回投与後７日目）ワクチン接種した。初回投与後１４日目に動物を屠殺し、動物においてＴ細胞免疫応答を観察した。
図９Ａ、９Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１１Ａ、及び１１Ｂに示されるように、本明細書に記載のＥＶを受けた動物は、組換えＯＶＡ＋可溶性ＳＴＩＮＧアゴニスト（すなわち、群９）で処置された動物と比較して、肺（すなわち群２～８）において有意に多くの全Ｔ細胞数を有しており、本明細書に記載のＥＶの効力を実証する。総Ｔ細胞の増加は、ＯＶＡ特異的エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、ＯＶＡ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増加と相関していた。投与経路のさまざまな組み合わせは、最小限の効果しかないように見えた。さらに、ＯＶＡ特異的エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、ブーストに使用されたＥＶがＳＴＩＮＧアゴニストを含まない肺でも観察され（すなわち、グループ３、４、及び７）、本明細書に記載のＥＶを使用してブーストするためにアジュバントは必要ではないことを示唆する。また、図１０Ｃに示されるように、アジュバント添加ブースティング投与が鼻腔内投与された群２及び５と比較して、本明細書に記載のプライムプル投与戦略は、肺における非特異的Ｔ細胞炎症性活性化をもたらさなかった（群３及び４）。同様の結果が脾臓で観察された（図１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、及び１３Ｂを参照されたい）。
上記の結果は、本明細書に記載のＥＶの安全性と、本開示のプライミングアンドプルレジメンの有効性を実証している。
実施例３：コロナウイルス細胞外小胞ワクチンの開発
コロナウイルスの治療における本明細書に記載のＥＶの有効性を評価するために、コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤを含むＥＶを、本明細書に記載の方法を使用して構築した（「ｅｘｏＲＢＤ」）。ＲＢＤタンパク質は、全長ＰＴＧＦＲＮ（「ｅｘｏＲＢＤ（ｌ）」）またはＰＴＧＦＲＮ断片（「ｅｘｏＲＢＤ（ｓ）」）のいずれかのＮ末端に融合された。ＥＶの一部には、ＥＶの内腔にＳＴＩＮＧアゴニストがさらにロードされた（「ＳＴＩＮＧ ｅｘｏＲＢＤ」）。次いで、図１４Ａに示すように、異なるＥＶを使用してマウスにワクチン接種した。動物のそれぞれは、皮下（ＳＱ）または鼻腔内（ＩＮ）投与のいずれかを介して２回の投与（０日目及び１４日目）を受けた。次いで、初回投与後２８日目に動物から血清を採取し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗ＲＢＤ抗体応答を評価した。
図１４Ｂに示されるように、ｅｘｏＲＢＤ（ＳＴＩＮＧアゴニストを含むかまたは含まない）でワクチン接種されたすべての動物において、血清中に有意なレベルの抗ＲＢＤ抗体があった。同様に、投与経路の特定の組み合わせは、有意な効果があるようには見えなかった。また、実施例２で観察されたように、ＳＴＩＮＧアゴニストが２回目の投与の一部として含まれていない場合（可溶性ＳＴＩＮＧとして、またはＥＶの内腔にロードされて）でさえ、有意なレベルの抗ＲＢＤ抗体が観察された。さらに、ＥＶワクチン接種群のいくつかからの動物で観察された抗体も中和していた（例えば、図１４Ｃ及び１４Ｄの群１、３、５、及び８を参照されたい）。
次に、ＴヘルパーエピトープまたはＢ細胞免疫モジュレーターの追加が抗ＲＢＤ抗体レベルをさらに高めることができるかどうかを評価するために、ＴヘルパーエピトープＩｔｇｂ１またはオボアルブミン（ＯＶＡ）のいずれかを含むＥＶは、外側表面上でＰＴＧＦＲＮに融合されている（「ＰｒＸ－Ｉｔｇｂ１」）。または（「ＰｒＸ－ＯＶＡ」）を、外側表面上でＲＢＤがＰＴＧＦＲＮに融合したＥＶと共投与するか、または代替的に外側表面上でＲＢＤがＰＴＧＦＲＮと融合したＥＶをＢ細胞共刺激剤（抗ＣＤ４０アゴニスト抗体）とともに投与した。マウスは、図１５に示されるように、異なるＥＶでワクチン接種された（０日目及び１４日目）。次いで、初回投与後３５日目に動物を屠殺し、動物の抗ＲＢＤ抗体レベル及び中和抗体活性を観察した。
図１５Ｂ～１５Ｇに示すように、ＣＤ４０活性化によるＢ細胞共刺激は、抗ＲＢＤ抗体レベル及び中和活性を増強した。
実施例４：コロナウイルス抗原を含むＥＶのさらなる特性評価
本明細書に記載のＥＶが、コロナウイルス感染症などの感染性疾患の治療に有用な抗原を発現するように操作できることをさらに実証するために、コロナウイルスのＢ細胞抗原とＴ細胞抗原の両方を含むようにＥＶを操作した。具体的には、実施例３に記載されているように、コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤタンパク質をＰＴＧＦＲＮ（全長と断片の両方）のＮ末端に融合させ、ＥＶの外側表面上に提示した。さらに、ＥＶはコロナウイルスのＴ細胞エピトープ（例えば、スパイクタンパク質、ヌクレオキャプシド、膜タンパク質、及び／またはＯＲＦ３ａ）を含むように操作され、単一ペプチドとして、コンカテマーペプチド抗原として、またはコンカテマータンパク質抗原として、ＥＶの内腔表面上に発現した（ＰＴＧＦＲＮまたはＢＡＳＰ１に融合）（図１９Ａ、１９Ｂ、及び１９Ｃを参照されたい）。抗原の発現は、ウエスタンブロットとＨｉＢｉＴアッセイの両方によって確認された（それぞれ図２０Ａ及び２０Ｂを参照されたい）。
コロナウイルス抗原の発現レベルを評価するために、ＥＶは、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合した、コロナウイルスの、ＲＢＤタンパク質またはスパイクタンパク質全体のいずれかを含むように操作され、ＥＶの外側表面上に提示された（図２１Ａを参照されたい）。図２１Ｂに示されるように、構築されたＥＶのそれぞれは、外側表面上にコロナウイルス抗原の複数のコピーを発現した。
次に、ＥＶにおけるコロナウイルスのＴ細胞エピトープの発現をさらに評価するために、ＥＶを改変して、外側表面上（ＰＴＧＦＲＮに融合）または内腔表面上（ＰＴＧＦＲＮまたはＢＡＳＰ－１に融合）にコロナウイルスのコンカテマーＴ細胞エピトープを含むようにした（図２２Ａを参照されたい）。発現は、ウエスタンブロットとＨｉＢｉＴアッセイの両方によって確認された（図２２Ｂ及び２２Ｃを参照されたい）。
上記の結果は、本明細書に開示されるさまざまな疾患または障害、例えば、コロナウイルス感染の治療に有用であり得る複数の抗原（Ｂ細胞抗原とＴ細胞抗原の両方）を含むように操作することができるため、本明細書に記載されるＥＶの汎用性を実証する。
実施例５． ｅｘｏＶＡＣＣ（商標）：強力で調整可能なＢ細胞応答及びＴ細胞応答を誘導する、新規なエキソソームベースのワクチンプラットフォーム。
背景：ｅｘｏＶＡＣＣ（商標）は、外因性抗原、アジュバント、及び免疫モジュレーターを抗原提示細胞に選択的に送達して、強力な細胞性免疫応答及び体液性免疫応答を誘導するように設計された、新規なエキソソームベースのワクチンプラットフォームである。エキソソームは天然の細胞外送達小胞であるが、本質的に非免疫原性である。ｅｘｏＶＡＣＣ（商標）免疫原性に影響を及ぼす特性をよりよく理解するために、さまざまな抗原アジュバントの設計を調査した。エキソソーム足場タンパク質ＰＴＧＦＲＮ及びＢＡＳＰ１を使用して、ＰＴＧＦＲＮとの融合によってエキソソーム表面上に、またはＢＡＳＰ１との融合によって内腔に、モデル抗原ＯＶＡを選択的に発現させた。本発明者らは、異なるアジュバントを共ロードし、異なる投与経路で免疫したマウスの体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を評価した。異なる処置群を図１６Ａに記載する。
結果：エキソソーム表面上に発現したＯＶＡによる免疫は、単回の免疫の１４日後の早期に抗ＯＶＡ ＩｇＧ抗体応答を誘導し、隔週のブースト免疫後に増加した。図１６Ｂ～１６Ｇを参照されたい。抗体応答は、アジュバントなしで、従来の可溶性ＯＶＡ及びアジュバントで免疫したマウスよりも高いレベルで誘導された。特に、ミョウバン、ＣｐＧ、またはミョウバンとＣｐＧアジュバントの両方がエキソソームにロードされた場合、抗体応答は増強されなかった。対照的に、内腔にＯＶＡを発現するエキソソームで免疫したマウスは、数回のブースト免疫後でも抗体応答が非常に乏しかった。抗ＯＶＡ ＩｇＧ抗体レベルは、同量の可溶性ＯＶＡで免疫したマウスよりも有意に低かった。しかしながら、内腔ＯＶＡを発現するエキソソームにアジュバントをロードすると、表面ＯＶＡを発現するエキソソームで免疫したマウスに匹敵する抗体応答が誘導された。同様に、アジュバントなしで内腔ＯＶＡを発現するエキソソームの免疫化も、複数回の投与後及び複数の投与経路（ＲｏＡ）を介しても、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できなかった。
先に示したように（例えば、実施例２を参照されたい）、アジュバントのローディングは、複数のＲｏＡを介した単一の免疫化後に強力なＴエフェクターメモリー（ＴＥＭ）及び組織常在性メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）応答を誘導した。特に、抗原特異的ＴＲＭの誘導は、可溶性ＯＶＡ及びアジュバントによる免疫と比較して著しく優れていた。表面上にＯＶＡを発現するエキソソームも、強力なＴ細胞応答を誘導した。ＯＶＡ特異的な肺のＴＲＭ及びＴＥＭは、ＳＴＩＮＧアジュバント添加エキソソームのＩＮ免疫を介して誘導されたが、マウスを最初にアジュバント添加エキソソームによってＳＣで免疫し、続いてアジュバント添加せずにＩＮでブーストを行った「プライムプル」レジメンによっても誘導された。対照的に、プライムプッシュレジメンを使用して可溶性ＯＶＡ及びＳＴＩＮＧアジュバントで免疫化されたマウスは、強いＴ細胞応答を誘発しなかった。
最後に、Ｅ．Ｇ７－ＯＶＡ腫瘍モデルにおいて、内腔でＯＶＡを発現し、ＳＴＩＮＧアゴニストアジュバント（「ｅｘｏＶＡＣＣ」）をロードされたエキソソームの有効性を評価した。図２３Ａに示すように、マウスは、以下のうちの１つのうちの１つを単回投与された：（１）皮下投与によるＰＢＳ単独；（２）鼻腔内投与によるｅｘｏＶＡＣＣ；（３）皮下投与によるｅｘｏＶＡＣＣ；（４）鼻腔内投与による可溶性ＯＶＡ＋ＰｏｌｙＩ：Ｃ；（５）皮下投与による可溶性ＯＶＡ＋ＰｏｌｙＩ：Ｃ。皮下（ＳＣ）または鼻腔内（ＩＮ）のいずれかで投与された単一の予防免疫は、可溶性ＯＶＡ及びポリＩ：Ｃで免疫されたマウスと比較して、腫瘍増殖速度を有意に低下させ（図２３Ｂ及び２３Ｄ）、生存率を改善した（図２３Ｃ）。ＯＶＡエキソソームによってＳＣで免疫したマウスの３３％が完全奏功を示した。
結論：ｅｘｏＶＡＣＣ（商標）は、抗原の向きとアジュバントのローディングによって抗原特異的免疫応答を調節できるようにする汎用性の高いワクチンプラットフォームである。ｅｘｏＶＡＣＣ（商標）は、さまざまな動物モデルにおいて、従来のワクチン製剤と比較して、複数の投与経路を介して優れた全身性及び組織常在性免疫応答を誘導した。
実施例６． コロナウイルス抗原を含むＥｘｏ－ＶＡＣＣ（商標）のワクチン接種
コロナウイルス抗原のみを有するＥｘｏ－ＶＡＣＣ（商標）、及びコロナウイルス抗原とアジュバント、例えば、ＳＴＩＮＧアゴニストとを有するＥｘｏ－ＶＡＣＣ（商標）は、本開示、例えば、実施例３及び４に従って作製された。エキソソームを調整したのち、エキソソームがワクチン接種レジメン、例えばプライムプルレジメンを用いて対象に投与された。例えば、特定の例では、対象は、コロナウイルス抗原及びアジュバント、例えばＳＴＩＮＧアゴニストを含むエキソソームを含むプライミング投与を皮下投与された。次いで、対象は、コロナウイルス抗原を含むがアジュバントを含まないエキソソームを含むブースティング投与を鼻腔内投与された。
実施例３でさらに記載されるように、そのようなプライム－プル投与レジメンは、インビボでコロナウイルス特異的免疫応答を誘導するのに有効であった（例えば、図１４Ｃ、１４Ｄ、及び１５Ｂ～１５Ｅを参照されたい）。ブースティング投与の一部としてアジュバントは必要ないため、本明細書で提供される結果は、本明細書に記載のＥＶを使用したプライムプル投与戦略が、コロナウイルスの治療において安全かつ効果的であり得ることを示唆している。
実施例７． ＡＬＦＡプラグアンドプレイシステムを用いたＲＢＤを含むＥＶの構築
本明細書に記載のＥＶを使用してコロナウイルスを治療できることのさらなる実証として、本明細書に記載のＡＬＦＡプラグアンドプレイシステムを使用して、コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤタンパク質を含むようにＥＶを改変した。簡潔に述べると、ＮｂＡＬＦＡナノボディは、表面提示足場ＰＴＧＦＲＮへの融合物としてＥＶ表面上に発現した。ＲＢＤは、それぞれ従来の一過性トランスフェクションとカラムクロマトグラフィーを使用して発現及び精製され、ＡＬＦＡタグに融合された。図１７Ａ。室温で３０分間混合することにより、ＲＢＤ－ＡＬＦＡｔａｇをＮｂＡＬＦＡ ＥＶにコンジュゲート結合させた。非結合のＡＬＦＡタグ付きＲＢＤは、超遠心分離またはサイズ排除クロマトグラフィーによって除去され、その結果、ＮｂＡＬＦＡ ＥＶの表面上にＡＬＦＡタグ付きＲＢＤが安定して結合した。図１７Ｂ～１７Ｆは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウエスタンブロットの両方を使用して、ＥＶへのＡＬＦＡタグ付きＲＢＤの成功した精製及びローディングを示す。
次いで、ＥＶをマウスに投与し、抗ＲＢＤ抗体応答を観察した。具体的には、動物に以下のうちの１つを単回皮下投与した：（ｉ）「ｅｘｏＲＢＤ」＝ＰＴＧＦＲＮに直接融合されたＲＢＤ；（ｉｉ）「ｒＲＢＤ＋ＳＴＩＮＧ」＝組み換えＲＢＤタンパク質＋可溶性ＳＴＩＮＧアゴニスト；（ｉｉｉ）「ｒＲＢＤ＋Ｅｘｏ」＝組み換えＲＢＤタンパク質＋ＥＶ単独（すなわち、ＥＶに結合していないＲＢＤ）；及び（ｉｖ）ＰＢＳ単独。図１７Ｂにおいて、動物は以下のうちの１つでワクチン接種された：（ｉ）「ＮｂＡＬＦＡ Ｅｘｏ＋ＲＢＤ－ＡＬＦＡｔａｇ」＝ＡＬＦＡプラグアンドプレイシステムを用いてＰＴＧＦＲＮにコンジュゲートされたＲＢＤ；（ｉｉ）「ｒＲＢＤ」＝組み換えＲＢＤタンパク質単独；（ｉｉｉ）「ｒＲＢＤ」＝組み換えＲＢＤタンパク質＋可溶性ＳＴＩＮＧアゴニスト；（ｉｖ）「Ｅｘｏ＋ｒＲＢＤ」＝組み換えＲＢＤタンパク質＋ＥＶ単独（すなわち、ＥＶに結合していないＲＢＤ）；及び（ｖ）ＰＢＳ単独。対照動物には、８μｇの組換えＲＢＤ単独（ｒＲＢＤ）、環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストをアジュバント添加した２０μｇのｒＲＢＤ（ｒＲＢＤ＋ＳＴＩＮＧ）、８μｇのｒＲＢＤをエキソソームと共投与（ｒＲＢＤ＋Ｅｘｏ）、またはＰＢＳ単独を投与した。ワクチン接種の１４日後、それぞれの動物から非致死採血を行い、抗ＲＢＤ抗体力価を従来のプレートベースのＥＬＩＳＡによって決定した。
図１８Ａ及び１８Ｂに示されるように、ｒＲＢＤ、アジュバント添加ｒＲＢＤ、またはｒＲＢＤと共投与されたエキソソームと比較して、ＡＬＦＡタグ付きＲＢＤを提示するエキソソームから優れた免疫原性が観察され、エキソソーム表面上の抗原の提示が免疫原性応答を誘発するために重要であったことを示唆した。データはまた、ＡＬＦＡシステムがインビボ環境で期待どおりに機能していたことを示唆している。
まとめると、上記の実施例で提供されたデータは、本明細書に記載のＥＶ（例えば、コロナウイルス抗原を含む）が強力なコロナウイルス特異的免疫応答を誘発できることを示しており、ＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルスの治療に有用であり得ることを示唆している。
実施例８．ＰＴＧＦＲＮに融合したアクセプタードメインを含むＥＶの構築
ワクチンプラットフォームとして本明細書に記載されているＥＶの汎用性をさらに実証するために、ＥＶの表面に分子を迅速かつ効率的に結合する能力について、いくつかの異なる「プラグアンドプレイ」または「クリップオン」戦略を分析した。
簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞を、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合したアクセプタードメインをコードする構築物でトランスフェクトした。３つの異なるアクセプタードメインを分析した：（１）ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、（２）ＣｆａＣ、及び（３）ＡＬＦＡＮｂ。図２５Ａ及び２５Ｂに示されるように、ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質のすべてが、トランスフェクション後少なくとも１週間安定して発現した。次いで、ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）が首尾よく産生され、プロデューサー細胞から精製された（図２５Ｃ及び２５Ｄを参照されたい）。
本明細書に記載され、さらに図２６に示されるように、本明細書で生成されたＥＶ（例えば、エキソソーム）は、目的の部分（例えば、抗原）が迅速に結合され得る「ベース」ＥＶとして有用であり得る。
実施例９． ＡＬＦＡタグに融合したＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを含むＥＶの構築
本明細書に記載のＥＶベースのワクチンの能力にさらに取り組むために、ＰＴＧＦＲＮに融合したＡＬＦＡＮｂを過剰発現するＥＶを、ＡＬＦＡタグペプチドに融合した可溶発現ＮａｎｏＬｕｃで機能化した。ＡＬＦＡタグはＡＬＦＡＮｂと相互作用して、安定した非共有相互作用を形成することができる。図２７Ａは、使用される一般的な方法を提供する。そして、図２７Ｂに示されるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＮａｎｏＬｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇの１Ｘまたは１０Ｘモル過剰で、ＮａｎｏＬｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇがエキソソーム表面上に発現したＡＬＦＡＮｂ－ＰＴＧＦＲＮタンパク質と結合することができることを確認した。図２８Ａ及び２８Ｂに示されるように、対照（すなわち、ポリヒスチジンタグに融合されたＮａｎｏＬｕｃと混合されたエキソソーム）と比較して、ＮａｎｏＬｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇのローディングがエキソソーム上で有意に高く、ローディングがＡＬＦＡタグとエキソソーム上のＡＬＦＡＮｂ－ＰＴＧＦＲＮ融合体との間の特異的な相互作用のためであったことを示している。そして、図２９Ａ及び２９Ｂに示されるように、ＡＬＦＡタグとＡＬＦＡＮｂ－ＰＴＧＦＲＮ融合体との間の相互作用は、生理学的条件下で長期間安定したままであった。
実施例１０． Ｃｆａスプリットインテインに融合されたＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを含むＥＶの構築
上記の結果を確認するために、ＰＴＧＦＲＮに融合したＣｆａＣを過剰発現するＥＶを、ＣｆａＮに融合した可溶発現ＮａｎｏＬｕｃで機能化した。同様に、ポリヒスチジンタグに融合したＮａｎｏＬｕｃを対照として使用した。使用される一般的な方法を図３０Ａに提供する。インテイントランススプライシングはＮａｎｏＬｕｃの共有結合をもたらすので、分子量の明確なシフトがＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮＬ－ＰＴＧＦＲＮ）によって観察された（図３０Ｂを参照されたい）。ＮａｎｏＬｕｃの発現をエキソソームで測定したところ、ＮａｎｏＬｕｃの成功した結合がさらに確認された。図３１Ａ及び３１Ｂに示されるように、ＮａｎｏＬｕｃ－ヒスチジン対照と混合されたエキソソームと比較して、ＮａｎｏＬｕｃ－ＣｆａＮと混合されたエキソソームは、有意に高いＮａｎｏＬｕｃ発現を有していた。
実施例１１． モジュラーＥＶの追加構築
上記の実施例に加えて、図３２Ａに記載されるように、ＰＴＧＦＲＮに融合したＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを過剰発現する単離されたＥＶを、ＳｐｙＴａｇに融合した可溶発現ＮａｎｏＬｕｃで機能化した。図３２Ｂに提供されるＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＰＴＧＦＲＮ過剰発現エキソソームへのＮａｎｏＬｕｃ－ＳｐｙＴａｇのローディングを確認する。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ／ＳｐｙＴａｇは自発的なイソペプチド結合を形成するので、ＮａｎｏＬｕｃ－ＳｐｙＴａｇの共有結合は分子量の明らかな変化をもたらし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＮＬ－ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＰＴＧＦＲＮ）によって見ることができる（図３２Ｂを参照されたい）。図３３Ａ及び３３Ｂは、結果を定量的に確認する。
図３４に示されるように、先に議論したアクセプタードメイン（すなわち、ＡＬＦＡＮｂ、ＣｆａＣ、及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）で同様の結果が観察された。
まとめると、上記の結果は、本明細書に記載のＥＶ（例えば、エキソソーム）が、広範囲の疾患及び障害を迅速に治療するための有用なワクチンプラットフォームになり得ることを確認する。
実施例１２．ＥＶにおける複数のペイロードのローディングの分析
次に、本明細書に記載のＥＶが複数のペイロード（例えば、抗原、アジュバント、免疫調節部分、及び／または標的化部分）を含む能力を評価した。簡潔に述べると、ＡＬＦＡタグペプチド（１０μｇ）に融合したＮＡＮＯＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）（Ｎｌｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇ）と、ＡＬＦＡタグペプチドに融合したマウスＩＬ－１２（ｍＩＬ１２－ＡＬＦＡｔａｇ）のモル当量を、以下のＥＶと個別または同時に混合した：（１）天然ＥＶ；または（２）ＰＴＧＦＲＮに融合したＡＬＦＡ特異的ナノボディ（ＮｂＡＬＦＡ）を過剰発現する操作されたＥＶ（ＮｂＡＬＦＡ－ＥＶ）。混合物を室温で３０分間インキュベートした。次に、未結合のＮｌｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇ及び／またはｍＩＬ１２－ＡＬＦＡｔａｇを超遠心分離（１００，０００×ｇで２０分間）により除去した。ＥＶペレットをＰＢＳに再懸濁し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットで分析した。
図４４に示されるように、天然ＥＶでは、Ｎｌｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇまたはｍＩＬ１２－ＡＬＦＡｔａｇのいずれについても有意なローディングは観察されなかった。しかしながら、ＮｂＡＬＦＡ－ＥＶでは、ウエスタンブロットとＳＤＳ－ＰＡＧＥの両方で測定されるとき、Ｎｌｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇとｍＩＬ１２－ＡＬＦＡｔａｇの有意なローディングが観察された。同様の結果は、Ｎｌｕｃ－ＡＬＦＡｔａｇとｍＩＬ１２－ＡＬＦＡｔａｇが個別に、または同時にロードされた場合に観察された。
上記の結果は、本開示のＥＶが、複数のペイロードを同時に含むように容易に改変できることをさらに実証している。本明細書に記載されるように、そのようなＥＶは、本明細書に開示されるようなさまざまな疾患及び障害を治療するのに有用であり得る。
参照による組み込み
本出願に引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書は、恰もそれぞれの個別の刊行物、特許、特許出願、または他の文書があらゆる目的で参照によって個別に組み込まれていることが示されているものと同様にして、あらゆる目的でそれらの全体を参照により本明細書に組み込まれている。
均等物
さまざまな具体的態様を説明及び記載したが、上記の明細書は限定的なものではない。本開示（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができることは認識されよう。多くの変形例が、本明細書を検討することで当業者には明らかとなろう。

Claims (150)

  1. コロナウイルスに由来する少なくとも１つの抗原を含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）。
  2. 前記コロナウイルスが重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルスである、請求項１に記載のＥＶ。
  3. 前記抗原がユニバーサルＳＡＲＳコロナウイルス抗原である、請求項１または２に記載のＥＶ。
  4. 少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の抗原を含み、第１の抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する、請求項１～３のいずれか一項に記載のＥＶ。
  5. 第２の抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する、請求項４に記載のＥＶ。
  6. 第２の抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来しない、請求項４に記載のＥＶ。
  7. 前記第１の抗原と前記第２の抗原が同じである、請求項４または５に記載のＥＶ。
  8. 前記第１の抗原と前記第２の抗原が異なっている、請求項４または５に記載のＥＶ。
  9. 前記ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス由来の抗原がスパイク（Ｓ）タンパク質由来である、請求項１～８のいずれか一項に記載のＥＶ。
  10. 前記抗原が前記Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、請求項９に記載のＥＶ。
  11. 前記抗原が、前記Ｓタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む、請求項９または１０に記載のＥＶ。
  12. 前記ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス由来の抗原がエンベロープ（Ｅ）タンパク質由来である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＥＶ。
  13. 前記抗原が、前記Ｅタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む、請求項１２に記載のＥＶ。
  14. 前記ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス由来の抗原が膜（Ｍ）タンパク質由来である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＥＶ。
  15. 前記抗原が、前記Ｍタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む、請求項１４に記載のＥＶ。
  16. 前記第２の抗原がＣＯＶＩＤ－１９ウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質に由来する、請求項４～１５のいずれか一項に記載のＥＶ。
  17. 前記第２の抗原が前記Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、請求項１６に記載のＥＶ。
  18. 前記第２の抗原が、前記Ｓタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む、請求項１６または１７に記載のＥＶ。
  19. 前記第２の抗原がＣＯＶＩＤ－１９ウイルスのエンベロープ（Ｅ）タンパク質に由来する、請求項４～１８のいずれか一項に記載のＥＶ。
  20. 前記第２の抗原が、前記Ｅタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む、請求項１９に記載のＥＶ。
  21. 前記ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス由来の第２の抗原が膜（Ｍ）タンパク質由来である、請求項４～２０のいずれか一項に記載のＥＶ。
  22. 前記第２の抗原が、前記Ｍタンパク質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含む、請求項２１に記載のＥＶ。
  23. 第１の抗原が前記Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、前記第２の抗原がＴ抗原を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＥＶ。
  24. 少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＥＶ。
  25. 細胞性免疫応答、体液性免疫応答、または細胞性免疫応答と体液性免疫応答の両方を誘導する、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  26. 前記細胞性免疫応答、前記体液性免疫応答、または細胞性免疫応答と体液性免疫応答の両方の誘導が、（ｉ）前記アジュバントもしくは前記抗原を含まない対応するＥＶ、または（ｉｉ）前記ＥＶを伴わない前記アジュバントもしくは前記抗原と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、または以上増加する、請求項２５に記載のＥＶ。
  27. ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方を誘導する、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＥＶ。
  28. ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＥＶ。
  29. 前記ＥＶが組織常在性メモリーＴ細胞応答を拡大する、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＥＶ。
  30. 前記ＥＶが第１の足場部分をさらに含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＥＶ。
  31. 前記第１の抗原が前記第１の足場部分に連結されている、請求項３０に記載のＥＶ。
  32. 前記第２の抗原が前記第１の足場部分に連結されている、請求項３０または３１に記載のＥＶ。
  33. 前記ＥＶが第２の足場部分をさらに含む、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のＥＶ。
  34. 前記第１の抗原が前記第１の足場部分に連結され、前記第２の抗原が前記第２の足場部分に連結されている、請求項３３に記載のＥＶ。
  35. 前記第１の足場部分と前記第２の足場部分が同じである、請求項３３または３４に記載のＥＶ。
  36. 前記第１の足場部分と前記第２の足場部分が異なっている、請求項３３または３４に記載のＥＶ。
  37. 前記第１の足場部分が足場Ｘである、請求項３０～３６のいずれか一項に記載のＥＶ。
  38. 前記第１の足場部分が足場Ｙである、請求項３０～３６のいずれか一項に記載のＥＶ。
  39. 前記第２の足場部分が足場Ｙである、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記第２の足場部分が足場Ｘである、請求項３３～３８のいずれか一項に記載のＥＶ。
  41. 前記足場Ｘが、（ｉ）前記ＥＶの内腔表面上に前記第１の抗原を固定すること、（ｉｉ）前記ＥＶの外側表面上に前記第１の抗原を固定すること、（ｉｉｉ）前記ＥＶの内腔表面上に前記第２の抗原を固定すること、（ｉｖ）前記ＥＶの外側表面上に前記第２の抗原を固定すること、または（ｖ）それらの組み合わせを可能とする、請求項３７または４０のＥＶ。
  42. 前記足場Ｘが、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンβ１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンα４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；及びＡＴＰトランスポータータンパク質（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）のうちの一クラス；ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３７、４０、及び４１のいずれか一項に記載のＥＶ。
  43. 前記足場Ｙが、（ｉ）前記ＥＶの内腔表面上に前記第１の抗原を固定すること、（ｉｉ）前記ＥＶの内腔表面上に前記第２の抗原を固定すること、または（ｉｉｉ）それらの両方を可能とする、請求項３８または３９のＥＶ。
  44. 前記足場Ｙが、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳタンパク質）；ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質）；脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３８、３９、及び４３のいずれか一項に記載のＥＶ。
  45. 前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第２の足場部分に連結されている、請求項３３～４３のいずれか一項に記載のＥＶ。
  46. ａ．前記第１の足場部分と前記第２の足場部分のそれぞれが足場Ｙであるか；
    ｂ．前記第１の足場部分が足場Ｙであり、前記第２の足場部分が足場Ｘであるか；
    ｃ．前記第１の足場部分が足場Ｘであり、前記第２の足場部分が足場Ｙであるか；
    ｄ．前記第１の足場部分と前記第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘである、請求項４３に記載のＥＶ。
  47. 前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔に存在する、請求項４～４６のいずれか一項に記載のＥＶ。
  48. 前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔に存在し、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結されている、請求項４～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  49. 前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている、請求項４～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  50. ａ．前記第１の足場部分が足場Ｙであり、前記第２の足場部分が足場Ｘであるか；
    ｂ．前記第１の足場部分と前記第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘである、請求項３３～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  51. 前記第１の抗原が前記ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第２の足場部分に連結されている、請求項４～４４１のいずれか一項に記載のＥＶ。
  52. ａ．前記第１の足場部分が足場Ｘであり、前記第２の足場部分が足場Ｙであるか；
    ｂ．前記第１の足場部分と前記第２の足場部分のそれぞれが足場Ｘである、請求項５１に記載のＥＶ。
  53. 前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔に存在し、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔に存在する、請求項４～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  54. 前記抗原が前記ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、前記アジュバントが前記ＥＶの外側表面上の第２の足場部分に連結されている、請求項４～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  55. 前記第１の足場部分と前記第２の足場部分が足場Ｘである、請求項５４に記載のＥＶ。
  56. 前記第１の抗原が前記ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔に存在する、請求項４～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  57. 前記第１の足場部分が足場Ｘである、請求項５６に記載のＥＶ。
  58. 前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔に存在し、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面上の第１の足場部分に連結されている、請求項４～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  59. 前記第１の足場部分が足場Ｘである、請求項５８に記載のＥＶ。
  60. 前記第１の抗原が前記ＥＶの表面上の第１の足場部分に連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の前記第１の足場部分に連結されている、請求項４～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  61. 前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第１の足場部分に連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面上の前記第１の足場部分に連結されている、請求項４～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  62. 前記第１の足場部分が足場Ｘである、請求項６０または６１に記載のＥＶ。
  63. （ｉ）前記第２の抗原が、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によって前記第１の足場部分に連結されるか、（ｉｉ）前記第２の抗原が、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によって前記第２の足場に連結されるか、（ｉｉｉ）前記第２の抗原が、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によって前記第１の足場部分に連結されるか、（ｉｖ）前記第２の抗原が、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によって前記第２の足場部分に連結されるか、または（ｖ）それらの組み合わせである、請求項３０～４４のいずれか一項に記載のＥＶ。
  64. 前記リンカー及び／または前記親和性リガンドがポリペプチドである、請求項６３に記載のＥＶ。
  65. 前記リンカーが非ポリペプチド部分である、請求項６３に記載のＥＶ。
  66. 前記第１の足場部分または前記第２の足場部分がＰＴＧＦＲＮタンパク質である、請求項３３～６５のいずれか一項に記載のＥＶ。
  67. 前記第１の足場部分または前記第２の足場部分が配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３３～６５のいずれか一項に記載のＥＶ。
  68. 前記第１の足場部分または第２の足場部分が、配列番号１に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３３～６５のいずれか一項に記載のＥＶ。
  69. 前記第１の足場部分または前記第２の足場部分がＢＡＳＰ１タンパク質である、請求項３３～６５のいずれか一項に記載のＥＶ。
  70. 前記第１の足場部分または前記第２の足場部分が、（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）のペプチドを含み、それぞれの括弧内の位置はアミノ酸を表し、πはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＭｅｔからなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される任意のアミノ酸であり；５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない、請求項３３～６９のいずれか一項に記載のＥＶ。
  71. 前記第１の足場部分または前記第２の足場部分が配列番号５０～１５５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項３３～７０のいずれか一項に記載のＥＶ。
  72. 前記第１の足場部分または第２の足場部分が、配列番号３に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３３～７０のいずれか一項に記載のＥＶ。
  73. （ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する第１の抗原と、（ｉｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）のウイルスに由来する第２の抗原と、を含む、単離された細胞外小胞であって、
    ａ．前記第１の抗原が内腔表面上の第１の足場Ｙに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｙに連結されているか；
    ｂ．前記第１の抗原が内腔表面上の足場Ｙに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔に存在するか；
    ｃ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔に存在し、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
    ｄ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
    ｅ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔に存在し、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
    ｆ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
    ｇ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔に存在し、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
    ｈ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
    ｉ．前記第１の抗原が前記ＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
    ｊ．前記第１の抗原が前記ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
    ｋ．前記第１の抗原が前記ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔に存在するか；
    ｌ．前記第１の抗原が前記ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の前記足場Ｘに連結されているか；
    ｍ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
    ｎ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原は前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
    ｏ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔に存在するか；
    ｐ．前記第１の抗原が前記ＥＶの外側表面上の第１の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
    ｑ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第１の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の第２の足場Ｘに連結されているか；
    ｒ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔に存在し、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔に存在するか；
    ｓ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
    ｔ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔に存在するか；
    ｕ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されているか；
    ｖ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されているか；
    ｗ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面に直接連結されているか；
    ｘ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されているか；
    ｙ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
    ｚ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面に直接連結されているか；
    ａａ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結されているか；
    ｂｂ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結され、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側表面に直接連結されているか；
    ｃｃ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔に存在し、前記第２の抗原が前記ＥＶの内腔表面に直接連結されているか、または
    ｄｄ．前記第１の抗原が前記ＥＶの内腔に存在し、前記第２の抗原が前記ＥＶの外側に直接連結されている、単離された細胞外小胞。
  74. 前記ＥＶが免疫モジュレーターをさらに含む、請求項１～７３のいずれか一項に記載のＥＶ。
  75. 前記免疫モジュレーターが、前記ＥＶの内腔表面または外側表面に直接連結されている、請求項７４１に記載のＥＶ。
  76. 前記免疫モジュレーターが、前記ＥＶの外側表面上または前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｘに連結されている、請求項７３または７４に記載のＥＶ。
  77. 前記免疫モジュレーターが、前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている、請求項７３または７４に記載のＥＶ。
  78. 前記アジュバントが、前記ＥＶの内腔表面または外側表面に直接連結されている、請求項２４～７７のいずれか一項に記載のＥＶ。
  79. 前記アジュバントが、前記ＥＶの外側表面上または前記ＥＶの内腔表面内の足場Ｘに連結されている、請求項７８に記載のＥＶ。
  80. 前記アジュバントが、前記ＥＶの内腔表面上の足場Ｙに連結されている、請求項７８に記載のＥＶ。
  81. 前記アジュバントが前記ＥＶの内腔に存在する、請求項７８に記載のＥＶ。
  82. 前記アジュバントが、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、炎症メディエーター、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、α－ｇａｌ－ｃｅｒ（ＮＫＴアゴニスト）、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０）、Ｃ型レクチンアゴニスト（例えば、ベータグルカン（デクチン１）、キチン、及びカードラン）、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２４～８１のいずれか一項に記載のＥＶ。
  83. 前記アジュバントが、ＳＴＩＮＧアゴニストである、請求項８２に記載のＥＶ。
  84. 前記ＳＴＩＮＧアゴニストが環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストまたは非環状ジヌクレオチドＳＴＩＮＧアゴニストを含む、請求項８３に記載のＥＶ。
  85. 前記アジュバントが、ＴＬＲアゴニストである、請求項８２に記載のＥＶ。
  86. 前記ＴＬＲアゴニストが、ＴＬＲ２アゴニスト（例えば、リポテイコ酸、非定型ＬＰＳ、ＭＡＬＰ－２及びＭＡＬＰ－４０４、ＯｓｐＡ、ポリン、ＬｃｒＶ、リポマンナン、ＧＰＩアンカー、リゾホスファチジルセリン、リポホスホグリカン（ＬＰＧ）、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、ザイモサン、ｈｓｐ６０、ｇＨ／ｇＬ糖タンパク質、ヘマグルチニン）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、二本鎖ＲＮＡ、例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ））、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リポテイコ酸、β－デフェンシン２、フィブロネクチンＥＤＡ、ＨＭＧＢ１、スナピン、テネイシンＣ）、ＴＬＲ５アゴニスト（例えば、フラジェリン）、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト（例えば、一本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ－Ａ、ポリＧ１０、ポリＧ３、レシキモド）、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、メチル化されていないＣｐＧ ＤＮＡ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８５に記載のＥＶ。
  87. 前記ＥＶがエキソソームである、請求項１～８６のいずれか一項に記載のＥＶ。
  88. 標的化部分をさらに含む、請求項１～８７のいずれか一項に記載のＥＶ。
  89. 前記標的化部分が、樹状細胞のマーカーに特異的に結合する、請求項８８に記載のＥＶ。
  90. 前記マーカーが樹状細胞のみに存在する、請求項８９に記載のＥＶ。
  91. 前記樹状細胞が、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、骨髄／通常型樹状細胞１（ｃＤＣ１）、骨髄／通常型樹状細胞２（ｃＤＣ２）、炎症性単球由来樹状細胞、ランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞、リゾチーム発現樹状細胞（ＬｙｓｏＤＣ）、クッパー細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８９または９０に記載のＥＶ。
  92. 前記樹状細胞がｃＤＣ１である、請求項９１に記載のＥＶ。
  93. 前記マーカーが、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９ａ）タンパク質、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－グラビング非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、ＣＤ２０７、ＣＤ４０、Ｃｌｅｃ６、樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、ＤＥＣ－２０５、レクチン様酸化型低密度リポタンパク質受容体－１（ＬＯＸ－１）、ＭＡＲＣＯ、Ｃｌｅｃ１２ａ、Ｃｌｅｃ１０ａ、ＤＣ－アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン－１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－１（ＣＤ３０３、Ｃｌｅｃ４ｃ）、デクチン－２、Ｂｓｔ－２（ＣＤ３１７）、ランゲリン、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ３０４、ＸＣＲ１、ＡＸＬ、シグレック６、ＣＤ２０９、ＳＩＲＰＡ、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＰＲ１８２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１０、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９０～９２のいずれか一項に記載のＥＶ。
  94. 前記マーカーがＣｌｅｃ９ａタンパク質である、請求項９３に記載のＥＶ。
  95. 前記標的化部分が、Ｔ細胞のマーカーに特異的に結合する、請求項８９に記載のＥＶ。
  96. 前記マーカーがＣＤ３分子を含む、請求項９５に記載のＥＶ。
  97. 前記標的化部分が、前記ＥＶの外側表面に直接連結されている、請求項８８～９６のいずれか一項に記載のＥＶ。
  98. 前記標的化部分が、前記ＥＶの外側表面上の足場Ｘに連結されている、請求項８８～９７のいずれか一項に記載のＥＶ。
  99. 前記標的化部分が、リンカーによって前記ＥＶの外側表面に直接連結されている、請求項９７に記載のＥＶ。
  100. 前記標的化部分が、リンカー、親和性リガンド、またはその両方によって前記足場Ｘに連結されている、請求項９８に記載のＥＶ。
  101. 前記リンカー及び／または前記親和性リガンドがポリペプチドである、請求項９９または１００に記載のＥＶ。
  102. 請求項１～１０１のいずれか一項に記載のＥＶと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  103. 請求項１～１０１のいずれか一項に記載のＥＶを産生する細胞。
  104. １つ以上のベクターを含む細胞であって、前記ベクターが、（ｉ）請求項１～１０１のいずれか一項に記載の抗原、（ｉｉ）請求項２１～９９のいずれか一項に記載のアジュバント、（ｉｉｉ）請求項８８～１０１のいずれか一項に記載の標的化部分、または（ｉｖ）それらの組み合わせ、をコードする核酸配列を含む、前記細胞。
  105. 請求項１～１０１のいずれか一項に記載のＥＶと、使用説明書と、を含む、キット。
  106. 請求項１～１０１のいずれか一項に記載のＥＶを含むＥＶ－薬物コンジュゲート。
  107. 請求項１０３または１０４に記載の細胞を適切な条件下で培養することと、ＥＶを得ることと、を含む、ＥＶを作製する方法。
  108. 免疫応答を増強することをそれを必要とする対象において行う方法であって、請求項１～１０１のいずれか一項に記載のＥＶを前記対象に投与することを含む、前記方法。
  109. 疾患を予防または治療することをそれを必要とする対象において行う方法であって、請求項１～１０１のいずれか一項に記載のＥＶを投与することを含み、前記疾患が前記抗原に関連している、前記方法。
  110. 前記疾患が感染症である、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記ＥＶが、非経口、経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、または腹腔内に投与される、請求項１０９～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 追加の治療剤を投与することを含む、請求項１０８～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. ワクチン接種することをそれを必要とする対象に行う方法であって、（ｉ）アジュバント及び抗原を含む細胞外小胞を含むプライミング投与を前記対象に投与することと、（ｉｉ）前記抗原を含む細胞外小胞を含むブースティング投与を前記対象に投与することと、を含む、前記方法。
  114. 前記抗原がコロナウイルスに由来する、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記プライミング投与が、皮下投与される、請求項１１３または１１４に記載の方法。
  116. 前記ブースト用量が鼻腔内投与される、請求項１１３～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記アジュバントがＳＴＩＮＧアゴニストである、請求項１１３～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記抗原が足場部分に連結されている、請求項１１３～１１７のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記足場部分が足場Ｘである、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記ブースティング投与中のＥＶがアジュバントを含まない、請求項１１３～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記抗原、アジュバント、免疫モジュレーター、及び／または標的化部分が、アンカー部分、親和性剤、化学的コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、スプリットインテイン、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＡＬＦＡタグ、ストレプトアビジン／アビタグ、ソルターゼ、ＳＮＡＰタグ、ＰｒｏＡ／Ｆｃ結合ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせによって前記ＥＶの表面に連結されている、請求項１～１０１のいずれか一項に記載のＥＶ。
  122. ワクチンのための細胞外小胞（ＥＶ）を調製する方法であって、プロデューサー細胞から単離されたＥＶに抗原をロードすることを含む、前記方法。
  123. 疾患または障害のためのワクチンを製造する方法であって、プロデューサー細胞から単離された細胞外小胞（ＥＶ）に抗原をロードすることを含む、前記方法。
  124. 前記ＥＶがアジュバントをさらに含む、請求項１２２または１２３に記載の方法。
  125. 前記ＥＶが、前記抗原の前記ＥＶへのローディングの前に前記アジュバントを含む、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記アジュバントをロードすることをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
  127. 前記アジュバントが、前記抗原のローディングの前または後にロードされる、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記アジュバントが前記抗原と一緒にロードされる、請求項１２６に記載の方法。
  129. 前記抗原が、アンカー部分、親和性剤、化学的コンジュゲーション、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、スプリットインテイン、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、ＡＬＦＡタグ、ストレプトアビジン／アビタグ、ソルターゼ、ＳＮＡＰタグ、ＰｒｏＡ／Ｆｃ結合ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせによって前記ＥＶの外側表面及び／または内腔表面に連結されている、請求項１２２～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記抗原が、ウイルス、細菌、寄生虫、真菌、原生動物、腫瘍、アレルゲン、自己抗原、またはそれらの任意の組み合わせに由来するか、及び／またはそれらを含む、請求項１２２～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記抗原が、パンデミックを引き起こすウイルスに由来する、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記抗原が、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、クリミア・コンゴ出血熱（ＣＣＧＦ）ウイルス、ヘンドラウイルス、ラッサウイルス、マールブルグウイルス、サル痘ウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、リフトバレー熱（ＲＶＦ）ウイルス、痘瘡ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、麻疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）、パルボウイルス（例えば、Ｂ１９ウイルス）、ノルボウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、ライノウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはそれらの任意の組み合わせに由来する、請求項１２２～１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記抗原が、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ細菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ）、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、連鎖状球菌細菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、赤痢菌細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、クラミジア細菌（例えば、ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ、ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｕｓ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、またはそれらの任意の組み合わせに由来する、請求項１２２～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記ＥＶへの前記抗原のローディングが、前記ＥＶを前記プロデューサー細胞から単離後、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約７ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１１ヶ月、少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約２年、少なくとも約３年、少なくとも約４年、少なくとも約５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも２５年、またはそれ以上で生じる、請求項１２２～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記ワクチンの製造に必要な時間（「製造時間」）が、参照製造時間（例えば、前記抗原を前記プロデューサー細胞に導入することによって前記抗原のローディングが生じる方法の製造時間、または従来のペプチドワクチンなど、ＥＶを含まないワクチンを産生するための方法の製造時間）と比較して短縮されている、請求項１２３～１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記製造時間が、前記参照製造時間と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上短縮されている、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記製造時間が、約１２ヶ月未満、約１１ヶ月未満、約１０ヶ月未満、約９ヶ月未満、約８ヶ月未満、約７ヶ月未満、約６ヶ月未満、約５ヶ月未満、約４ヶ月未満、約３ヶ月未満、約２ヶ月未満、または約１ヶ月未満である、請求項１３５または１３６に記載の方法。
  138. 前記製造時間が約６ヶ月未満である、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記ＥＶが標的化部分をさらに含む、請求項１２２～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 前記ＥＶが、前記抗原の前記ＥＶへのローディングの前に前記標的化部分を含む、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記標的化部分をロードすることをさらに含む、請求項１３９または１４０に記載の方法。
  142. 前記標的化部分が、前記抗原のローディングの前または後にロードされる、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記標的化部分が前記抗原と一緒にロードされる、請求項１４１に記載の方法。
  144. 前記抗原のローディング後、前記ＥＶが、Ｔ細胞免疫応答、Ｂ細胞免疫応答、またはＴ細胞免疫応答とＢ細胞免疫応答の両方を誘導することができる、請求項１２２～１４３のいずれか一項に記載の方法。
  145. 請求項１２２～１４４のいずれか一項に記載の方法によって調製された細胞外小胞（ＥＶ）。
  146. 請求項１４５に記載のＥＶと、使用説明書と、を含むキット。
  147. 請求項１４５に記載のＥＶを含むワクチンであって、前記抗原が、前記ワクチンの投与を受ける対象において免疫応答を誘発することができる、前記ワクチン。
  148. 地域化または個別化されている、請求項１４７に記載のワクチン。
  149. 疾患または障害を治療することをそれを必要とする対象において行う方法であって、請求項１４５に記載のＥＶまたは請求項１４８もしくは１４８に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、前記方法。
  150. 前記疾患または障害が感染性疾患を含む、請求項１４９に記載の方法。
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