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JP2023516676A - オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療のための組成物及び方法 - Google Patents

オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療のための組成物及び方法 Download PDF

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JP2023516676A JP2022552798A JP2022552798A JP2023516676A JP 2023516676 A JP2023516676 A JP 2023516676A JP 2022552798 A JP2022552798 A JP 2022552798A JP 2022552798 A JP2022552798 A JP 2022552798A JP 2023516676 A JP2023516676 A JP 2023516676A
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Abstract

本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための組成物及び方法について記載する。組成物は、脂質製剤と、ＯＴＣ酵素をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と、を含む。脂質製剤は、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子中に、イオン化可能なカチオン性脂質を含むことができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９８４，７６４号に対する優先権を主張し、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年３月１日に作成された上記ＡＳＣＩＩの写しは、０４９３８６－５２９００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、３７９，６５０バイトのサイズである。
技術分野
本開示は、疾患の治療における治療薬としてのｍＲＮＡの使用に関する。より具体的には、本開示は、尿素回路異常症であるオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための、脂質ナノ粒子組成物及び方法に関する。
背景技術
哺乳類によるアミノ酸の破壊は、排出物であるアンモニア（ＮＨ３）の産生をもたらす。体内でアンモニアが増加することは毒性の害であり、哺乳類は、アンモニアを尿素（（ＮＨ２）２ＣＯ）に転換するための代謝プロセス尿素回路を開発し、これにより、安全に分泌されることができる。尿素回路のプロセスは主に、肝臓で生じる。肝臓で産生された尿素は次に、血流中に放出され、ここで腎臓まで移動し、最終的に尿内で排泄される。哺乳類が体から窒素を十分クリアランスできない場合、高アンモニア血症の状態が生じ得、これは、体に有害作用を呈し、脳損傷または死をももたらし得る。
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）は、タンパク質の破壊、及び、体からのアンモニアの除去において役割を果たす、尿素回路中の６つの酵素のうちの１つである。この代謝プロセスは主に、ミトコンドリアにて見出されているＯＴＣにより、肝細胞で生じる。ＯＴＣは特に、カルバモイルホスフェート及びオルニチンをシトルリンに転換することを担う。ネイティブＯＴＣ ｍＲＮＡは、細胞質基質由来の発生期のプレタンパク質をミトコンドリアにリダイレクトさせるのに必要な、ミトコンドリアシグナル伝達ペプチド（ＭＳＰ）をコードする。ＯＴＣタンパク質は、細胞質基質内に前駆体として存在し、ＭＳＰが、プレペプチドをミトコンドリアにリダイレクトさせ、ここで、ＭＳＰの切断、及び、機能性タンパク質のミトコンドリアマトリックスへの送達を受ける。
ＯＴＣ酵素の欠損は、血中での、アンモニアの形態での、窒素の過剰蓄積（高アンモニア血症）をもたらす。過剰のアンモニアは神経毒であり、血液を通って中枢神経系まで移動し、ＯＴＣ欠損症と関連する症状及び身体所見をもたらす。これらの症状としては、嘔吐、拒食症、進行性嗜眠、及び昏睡を挙げることができる。未治療のままとなった場合、高アンモニア血症が発症して、昏睡、及び、命を脅かす合併症まで進行する場合がある。
ＯＴＣ欠損症の重症度及び開始年齢は、同じ家族内においてさえも、人によって異なる。深刻な形態の障害は、出生直後（新生児期間）に、何人かの乳児、典型的には男の子に影響を及ぼす。より穏やかな形態の障害は、乳児期の後期に、何名かの子どもに影響を及ぼす。男の子と女の子の両方において、小児期の間にＯＴＣ欠損症の症状が進行し得る。現在、ＯＴＣ欠損症の治療は、アンモニアスカベンジャーの使用により、過剰のアンモニアを形成しないようにすること、または、高アンモニア血症の発症中に過剰のアンモニアを取り除くことに向けられている。ＯＴＣ欠損症に対する長期治療法では、食事制限と、体から窒素を転換及び排泄する代替法（代替経路両方）の刺激とを組み合わせる。
ＯＴＣ欠損症を有する個体における食事制限は、タンパク質の摂取量を制限し、過剰アンモニアの発生を避けることを目的とする。しかし、十分なタンパク質は、罹患した乳児により摂取され、適切な成長が確実になされなければならない。ＯＴＣ欠損症を有する乳児には、必須アミノ酸により補充される、低タンパク質かつ高カロリー食が与えられる。
食事制限に加えて、ＯＴＣ欠損症を有する個体は、体からの窒素の除去を刺激する投薬により治療される。これらの投薬は、窒素廃棄物を転換及び除去する尿素回路に対する、代替法を提供する。これらの投薬は、多くの患者の口には合わず、多くの場合、腹壁を通って胃に配置される管（胃腸管）、または、鼻を通って胃に達する細管（経鼻胃管）を介して投与される。
改善が見られない場合、または、高アンモニア血症昏睡が進行する場合、機械により、罹患者の血液を濾過（血液透析）することによる、廃棄物の除去が必要となり得る。血液透析は、高アンモニア血症昏睡の間に、ＯＴＣ欠損症を有すると最初に診断された乳児、子ども、及び成人を治療するためにもまた使用される。
場合によっては、肝臓移植は適切な治療オプションであり得、これは、ＯＴＣ欠損症における、高アンモニア血症に対する潜在的なキュアとして示されている。しかし、この手術はリスクが高く、術後合併症をもたらす可能性がある。また、肝臓移植後、患者は、免疫抑制治療法のために、人生を通して投薬レジメンを受ける必要がある。
現在利用可能な治療とは対照的に、治療剤としての核酸の使用が、疾患治療における、大きな課題と大きな可能性の両方を呈する、新しい医学分野である。核酸を用いる、可能性のある治療方法の中でも、所望の酵素をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達が、対象の標的化細胞に必要な酵素活性をもたらす可能性を有する。しかし、ｍＲＮＡベースの治療法は、十分なｍＲＮＡのインビボ半減期の達成、有効量の酵素が産生される、十分なｍＲＮＡの翻訳効率の実現、ｍＲＮＡに対する拒絶反応（例えば、免疫原性）の最小化、及び、ｍＲＮＡの標的細胞への効率的な送達を含む、いくつかの障壁に直面している。
上手く用いられている標的細胞に核酸を送達する一方法は、リポソームまたは脂質ナノ粒子などの脂質製剤中への、核酸の封入である。脂質製剤の使用はある程度成功しているものの、これらの製剤で使用される脂質の中には、低いインビボ分解能及び低い潜在能を示すものもあることが発見されている。
上記課題の観点から、ＯＴＣ酵素欠損症の治療のための新規アプローチ及び治療法が依然として必要とされており、例えば、ｍＲＮＡベースの治療法と関連する課題及び制限を克服する戦略が必要とされている。不十分な安定性、ＯＴＣのミトコンドリアへの効率的な移動、及び、標的細胞への効率的な送達は依然として、大きな課題のままである。
本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための組成物及び方法を含む。本開示の組成物は、向上したインビボ安定性及び翻訳効率を示す、特別に設計されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。加えて、特別に設計されたｍＲＮＡから翻訳されたＯＴＣタンパク質は、肝細胞ミトコンドリアへの取り込みの向上を示す。特別に設計されたｍＲＮＡをさらに、ｍＲＮＡを肝細胞に送達するための、高潜在能（例えば、生物学的利用能）、加えて、高レベルの生分解性を付与するカチオン性脂質を含む脂質製剤と組み合わせることで、組成物の治療効果と、その安全性プロファイルの両方を改善する。
いくつかの実施形態では、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡ；及び、イオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質製剤を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、式（Ｉ）の化合物、または、本明細書に記載するその立体配置のいずれかである。いくつかの実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、
Figure 2023516676000002
 から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示の脂質製剤は、ヘルパー脂質（例えば、中性脂質もしくは非カチオン性脂質）、コレステロール、及び／またはＰＥＧ脂質をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する組成物の投与と必要とする対象に、当該組成物を投与することを含む、ＯＴＣ欠損症の治療方法を提供する。
主題技術のさらなる特徴及び利点は、以下の説明に記載され、一部は説明から明らかになり、または主題技術の実施によって習得され得る。主題技術の利点は、記載された説明及びその実施形態、ならびに添付の図面において、特に指摘される構造によって実現及び達成されるであろう。
前述の一般的な説明と以下に述べる詳細な説明とは、共に例示的なものであり、主題技術にさらなる説明を加えることを意図していると理解すべきである。
図１Ａ～Ｂは、Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用して、２４時間（図１Ａ）及び４８時間（図１Ｂ）における、肝細胞株Ｈｅｐａ１，６（マウス）及びＨｅｐ３Ｂ（ヒト）での、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質発現を図示する散布図を示す。
図２は、スクリーニングの第１ラウンドの２４時間における、Ｈｅｐａ１，６細胞中でスクリーニングした化合物との、タンパク質安定性の相関を図示する散布図を示す。
図３は、スクリーニングの第１ラウンドの２４時間における、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中でスクリーニングした化合物との、タンパク質安定性の相関を図示する散布図を示す。
図４は、スクリーニングの第２ラウンドにおける、２４時間及び４８時間でのヒト初代肝細胞でスクリーニングした化合物（第１ラウンドをベースにして新たに設計した化合物）の、タンパク質安定性の相関を示す散布図を示す。
図５は、スクリーニングの第２ラウンドにおける、２４時間及び４８時間でのヒト初代肝細胞でスクリーニングした化合物（第１ラウンドをベースにして新たに設計した化合物）の、タンパク質安定性の相関を示す散布図を示す。
図６は、スクリーニングの第３ラウンドにおける、２４時間及び４８時間でのヒト初代肝細胞でスクリーニングした化合物（ラウンド１及び２をベースにして新たに設計した化合物）の、タンパク質安定性の相関を示す散布図を示す。
図７は、スクリーニングの第３ラウンドにおける、２４時間及び４８時間でのヒト初代肝細胞でスクリーニングした化合物（ラウンド１及び２をベースにして新たに設計した化合物）の、タンパク質安定性の相関を示す散布図を示す。
図８は、選択されたＯＴＣ ｍＲＮＡをトランスフェクションした、ヒト初代肝細胞中でのＯＴＣタンパク質発現レベルを図示するプロットである。コンストラクト１７９９．７は、配列番号１７５の配列を有するｍＲＮＡであり、配列番号１７５中のウリジンの１００％が、５－メトキシウリジン（５ＭｅＯＵ）である。
図９Ａ～Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇで、脂質製剤化ヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）ｍＲＮＡを投与した、Ｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける、経時的なＯＴＣ発現レベルを図示する棒グラフを示す。ｈＯＴＣ（図９Ａ）または内部マウスＯＴＣ（図９Ｂ）に対して特異的な重ペプチドを使用する、複数反応モニタリング（ＭＲＭ）により、発現レベルを測定した。
図１０は、ウリジンの１００％がＮ１－メチルシュードウリジン（Ｎ１ＭＰＵ）であり、ウリジンの１００％が５－メトキシウリジン（５ＭｅＯＵ）である、２つの異なるウリジン化学作用を使用して、ＯＴＣ－ｍＲＮＡを３ｍｇ／ｋｇで投与したＳｐｆ／ａｓｈマウスにおけるＯＴＣ発現レベルを図示する棒グラフである。
図１１は、３つの異なる用量でＯＴＣ ｍＲＮＡを投与し、２つの異なるウリジン化学作用（Ｎ１ＭＰＵ及び５ＭｅＯＵ）を使用する、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、ＯＴＣ発現レベルを図示するグラフである。
図１２は、３つの異なる用量：０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇで、ＯＴＣ ｍＲＮＡ １７９９．７を投与したＳｐｆ／ａｓｈマウスにおいて測定した、尿オロチン酸塩レベルを図示するグラフである。コンストラクト１７９９．７は、配列番号１７５の配列を有するｍＲＮＡであり、配列番号１７５中のウリジンの１００％が、５ＭｅＯＵである。
図１３は、２つの異なるウリジン化学作用（Ｎ１ＭＰＵ及び５ＭｅＯＵ）を用いて、１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇでＯＴＣ ｍＲＮＡを投与したＳｐｆ／ａｓｈマウスにおける、９６時間でのヒトＯＴＣ発現レベルと、尿オロチン酸塩とを比較する散布図である。
図１４は、選択されたＯＴＣ ｍＲＮＡを１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇで投与した、Ｓｐｆ／ａｓｈマウスにおけるＯＴＣ ｍＲＮＡのタンパク質発現レベルを図示するウエスタンブロットである。
図１５は、選択されたＯＴＣ ｍＲＮＡで治療したＳｐｆ／ａｓｈマウスの、ミトコンドリア画分とサイトゾル画分におけるタンパク質発現レベルを図示する、ウエスタンブロットの結果を示す。
図１６は、選択されたＯＴＣ ｍＲＮＡで治療した、Ｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける尿オロチン酸塩の経時的な発現を図示するプロットである。
図１７は、３つの異なる用量のＯＴＣ ｍＲＮＡ １７９９．７での治療中の、高タンパク質食を受けるＯＴＣ欠損マウス（Ｓｐｆ／ａｓｈ）の生残を図示するプロットである。
図１８は、異なる修飾を有するＯＴＣ ｍＲＮＡ（コンストラクト２２６２）を投与したオスＢａｌｂ／ｃマウスにおける、ｈＯＴＣの発現レベルを図示するプロットである。
図１９は、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、及び３．０ｍｇ／ｋｇの用量での、いくつかの異なるＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質製剤に対する、野生型マウスでのヒトＯＴＣタンパク質発現のレベルを示すグラフである。ｍＯＴＣと標識した点線は、野生型マウスにおけるマウスＯＴＣに対する、ベースラインの発現レベルを示す。
図２０は、１．０ｍｇ／ｋｇ及び３．０ｍｇ／ｋｇの用量での、４つの異なるＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質製剤に対する、野生型マウスの組織サンプルにおけるヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）の発現を示すグラフである。
図２１は、本明細書に記載する、脂質＃３を含む脂質製剤に対する、高アンモニア血症を誘発し、高タンパク質食（ＨＰＤ）を給餌した後の、Ｓｐｆ／ａｓｈ（ＯＴＣ低次形態）マウスの生残を示すグラフである。
図２２は、本明細書に記載する、脂質＃２を含む脂質製剤に対する、高アンモニア血症を誘発し、高タンパク質食（ＨＰＤ）を給餌した後の、Ｓｐｆ／ａｓｈ（ＯＴＣ低次形態）マウスの生残を示すグラフである。
図２３は、本明細書に記載する、脂質＃７を含む脂質製剤に対する、高アンモニア血症を誘発し、高タンパク質食（ＨＰＤ）を給餌した後の、Ｓｐｆ／ａｓｈ（ＯＴＣ低次形態）マウスの生残を示すグラフである。
図２４は、本明細書に記載する異なるイオン化可能なカチオン性脂質を有するＯＴＣ ｍＲＮＡ製剤を使用する脂質忍容性研究における、野生型マウスの生残率を示すグラフである。
図２５は、本明細書に記載する脂質＃７を含むＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質製剤を投与したマウスに由来する組織サンプルに対する、経時的な脂質クリアランスを示すグラフである。
図２６は、本明細書に記載する脂質＃３を含むＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質製剤を投与したマウスに由来する組織サンプルに対する、経時的な脂質クリアランスを示すグラフである。
主題技術の様々な構成が、本開示から当業者には速やかに明らかとなるものと理解され、主題技術の様々な構成は、実例として図示及び説明されている。理解されるように、主題技術は、他の及び異なる構成が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべてが主題技術の範囲から逸脱することなく、種々の他の点において変更が可能である。したがって、要約、図面、及び詳細な説明は、本質的に実例と見なされるべきであり、限定として見なされるべきではない。
以下に説明する詳細の説明は、主題技術のさまざまな構成の説明として意図され、主題技術が実践され得る構成のみを示すことを意図するものではない。添付図面は本明細書に組み込まれており、詳細の説明の一部を構成する。詳細の説明は、主題技術の完全な理解をもたらすための、具体的な詳細を含む。しかし、主題技術を、これらの具体的な詳細を伴わずに実践可能であることが、当業者には明らかとなろう。
いくつかの実施形態では、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡ；ならびに、
Figure 2023516676000003
 からから選択されるイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質製剤を含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３または配列番号４の配列に少なくとも９５％の同一性を有するＯＴＣ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３の配列からなるＯＴＣ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４の配列からなるＯＴＣ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５４～２５８からなる群から選択される配列を有するコード領域を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５４の配列を有するコード領域を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５５の配列を有するコード領域を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５６の配列を有するコード領域を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５７の配列を有するコード領域を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５８の配列を有するコード領域を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６の配列を含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２３または配列番号２４の配列を有するコザック配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１６～２２から選択される配列を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約６０～約１２５個の連続アデニンヌクレオチドを含む、３’ポリ－アデノシン（ポリＡ）テールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップをさらに含む。いくつかの実施形態では、５’キャップは、本明細書で開示する式キャップ（ＩＶ）の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＧｍであり、式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＯＨであり、Ｒ３はＯＣＨ３であり、各Ｌは、ホスホジエステル結合により結合したホスフェートであり、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した、ＯＴＣ活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡであり、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、５’キャップは、本明細書で開示する式キャップ（ＸＩ）の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＡｍｐＧであり、式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４はそれぞれＯＨであり、ｎは１であり、各Ｌは、ホスホジエステル結合により結合したホスフェートであり、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した、ＯＴＣ活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１、７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１９の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５１の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５３の配列を含む。
実施形態では、本明細書に記載する配列のいずれか１つ以上を、明示的に除外することができる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのウリジンヌクレオチドの約１～約１００％は、５－メトキシウリジン、または、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのウリジンヌクレオチドの１００％が、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡのウリジンヌクレオチドの１００％が、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。
いくつかの実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、
Figure 2023516676000004
 である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は、
Figure 2023516676000005
 である。
いくつかの実施形態では、イオン化可能なカチオン性脂質は
Figure 2023516676000006
 である。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１００ｎｍ未満の平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５５ｎｍ～約８５ｎｍの平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの少なくとも約５０％を封入する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの少なくとも約８５％を封入する。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）から選択されるヘルパー脂質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、コレステロールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ＤＭＧは、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧである。
実施形態では、列挙した脂質類のいずれか１つ以上を、明示的に除外することができる。
いくつかの実施形態では、脂質製剤の脂質部分は、約４８ｍｏｌ％～約６６ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質、約２ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約２５ｍｏｌ％～約４２ｍｏｌ％のコレステロール、及び、約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、脂質製剤の脂質部分は、約５５ｍｏｌ％～約６１ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約２９ｍｏｌ％～約３８ｍｏｌ％のコレステロール、及び、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。いくつかの実施形態では、脂質製剤の脂質部分は、約５６ｍｏｌ％～約５８ｍｏｌ％のイオン化可能なカチオン性脂質、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約３１ｍｏｌ％～約３４ｍｏｌ％のコレステロール、及び、約１．２５ｍｏｌ％～約１．７５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。濃度は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値またはサブレンジであってよい。比率は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値またはサブレンジであってよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、約５０：１～約１０：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、約４０：１～約２０：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、約３５：１～約２５：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、約２８：１～約３２：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、約２９：１～約３１：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、約７．４のｐＨでＨＥＰＥＳ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳ緩衝液は、約７ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、組成物は、約２．０ｍｇ／ｍＬ～約４．０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１種以上の凍結保護剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、１種以上の凍結保護剤は、スクロース、グリセロール、または、スクロースとグリセロールの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、約７０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースと、約５０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬの濃度のグリセロールの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、細胞を、本明細書で記載する組成物のいずれかと接触させることを含む、細胞内でのオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素の産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は肝細胞である。
いくつかの実施形態では、治療に有効な量の、本明細書で記載する組成物のいずれかを、ＯＴＣ欠損症の治療を必要とする対象に投与することを含む、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は成人である。いくつかの実施形態では、対象は子どもである。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ活性を有する酵素は、対象の肝細胞内で産生される。いくつかの実施形態では、投与することは、静脈内投与を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、対象に、少なくとも１ヶ月に１回投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象に、少なくとも１ヶ月に２回投与される。いくつかの実施形態では、組成物は対象に、対象の１ｋｇ当たり約０．２ｍｇのｍＲＮＡ～対象の１ｋｇ当たり約１０ｍｇの用量で、投与される。量は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値またはサブレンジであってよい。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物のいずれかを哺乳類に投与することを含む、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素を哺乳類で発現させる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療における、本明細書で記載する組成物のいずれかの使用を提供する。
ポリヌクレオチド
本開示の組成物及び方法は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡを含む。ｍＲＮＡは、インビボ半減期及び翻訳効率を向上させる、いくつかの特徴を含むことができる。加えて、本開示は、転写によりＯＴＣ活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡを産生するための、ＤＮＡスキャフォールドを提供する。ＤＮＡスキャフォールドは、プラスミドＤＮＡを含むＤＮＡの任意の適当な形態であることができる。本開示により想到されるポリヌクレオチドを、以下にさらに詳細に記載する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡによりコードされるＯＴＣタンパク質は、野生型ヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）である。本明細書に記載するｍＲＮＡによりコードされるＯＴＣタンパク質は、ＯＴＣタンパク質をコードする「コード配列」（ＣＤＳ）とも本明細書で呼ばれる、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む異種ｍＲＮＡコンストラクトから産生されるのが好ましい。コード配列はコドン最適化されているのが好ましい。
本明細書に記載するｍＲＮＡによりコードされるヒトＯＴＣタンパク質は、表１に示す配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質を含むのが好ましい。配列番号４は、配列番号３の野生型ＯＴＣ（表１）から修飾され、１つ以上の予測されたユビキチン化部位が取り除かれており、これにより、ユビキチンリガーゼによるユビキチン化及び分解を受けにくいタンパク質が得られる。予測されたユビキチン化部位を取り除くことは、アスパラギン、アルギニン、ロイシン、リジン、またはフェニルアラニンなどの、ユビキチン化を支持することが発見されているＮ末端残基を、アラニン、グリシン、メチオニン、セリン、トレオニン、バリン、及びプロリンなどの、ユビキチン化に対して安定化することが発見されているＮ末端残基で置き換えることを含むのが好ましい。このように、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質を安定化させることは、酵素活性を発揮する、細胞質基質からミトコンドリアへの輸送の間に、修飾ＯＴＣタンパク質の安定性を保護するのに特に有利である。
本明細書に記載するｍＲＮＡによりコードされるＯＴＣタンパク質は、カルバモイルホスフェート及びオルニチンから、（肝臓及び小腸での）シトルリンの合成を触媒するＯＴＣタンパク質活性を維持しながら、表１に示す配列番号３のヒト野生型ＯＴＣタンパク質に、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００同一であるタンパク質配列を含むのが好ましい。
Figure 2023516676000007
Figure 2023516676000008
Figure 2023516676000009
Figure 2023516676000010
本明細書に記載するｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質に実質的に同一であるアミノ酸配列をコードするのが好ましい。
本明細書に記載するｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号３の野生型ヒトＯＴＣタンパク質に実質的に同一であるアミノ酸配列をコードするのが好ましい。本明細書に記載するｍＲＮＡによりコードされるＯＴＣタンパク質は、カルバモイルホスフェート及びオルニチンから、（肝臓及び小腸での）シトルリンの合成を触媒するＯＴＣタンパク質活性を維持しながら、表１に示す配列番号３の修飾ヒトＯＴＣタンパク質に、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００同一であるタンパク質配列を含むのが好ましい。
本明細書に記載するｍＲＮＡのＯＲＦまたはＣＤＳは、配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質に実質的に同一であるアミノ酸配列をコードするのが好ましい。
ヒトＯＴＣタンパク質をコードする、本明細書に記載するｍＲＮＡのＯＲＦまたはＣＤＳは、表１の配列番号１のｍＲＮＡコード配列に、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００同一である、コドン最適化ポリヌクレオチド配列を含むのが好ましい。
本明細書に記載するｍＲＮＡは、トリプル終止コドンを作製するＣＤＳのすぐ下流（即ち、ＣＤＳから３’方向）にある配列をさらに含むのが好ましい。トリプル終止コドンを組み込んで、翻訳効率を向上させることができる。いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、本明細書に記載するｍＲＮＡ配列のＯＴＣ ＣＤＳのすぐ下流にある、配列ＡＵＡＡＧＵＧＡＡ（配列番号２５）を含むことができる。
コドン最適化
タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の同一配列を、野生型に対して変更して、タンパク質のアミノ酸をコードするコドンの最良の組み合わせを選択することができる。ｍＲＮＡに関して、ｍＲＮＡの全てまたは一部、例えば、コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、当該領域内のコドンに対して最適化することができる。コドン最適化配列は、他の利点をもたらしながら、コードされたタンパク質のタンパク質発現レベルを増加させることができる（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３４６－５３）。配列中のコドンの最適化は、高コドン適応指数（ＣＡＩ）、Ｌｏｗ－Ｕ法、ｍＲＮＡ二次構造、ｃｉｓ調節配列、ＧＣ含有量、及び、多くの他の同様の変数を含む、ｍＲＮＡコンストラクトのいくつかの特徴に左右される。これらの変数は、タンパク質発現レベルと相関することが示されてきた（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．２００６，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：２８５）。高ＣＡＩ（コドン適応指数）法は、全タンパク質コード配列に対して最も頻繁に使用される同義コドンを取り出す。各アミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンは、ヒトゲノムの７４，２１８個のタンパク質コード遺伝子から推定される。Ｌｏｗ－Ｕ法は、より少ないＵ部分を有する同義コドンで置換可能な、Ｕ含有コドンのみを標的にする。置換の選択肢が少ない場合は、より頻繁に使用されるコドンを選択する。配列中の残りのコドンは、Ｌｏｗ－Ｕ法により変更されない。本方法は、例えば、５－メトキシウリジンまたはＮ１－メチルシュードウリジンにより合成可能なコード配列を設計するための、開示されたｍＲＮＡと組み合わせて使用することができる。修飾ヌクレオチドモノマーの使用と組み合わせた、コドン最適化の方法は、Ｕ．Ｓ．２０１８／０３２７４７１に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
加えて、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型の任意の領域のヌクレオチド配列を、コドン最適化することができる。コドン最適化法は、当技術分野において既知であり、いくつかの目標の１つ以上を実現するための努力において使用することができる。これらの目標としては、標的及び宿主生物中でコドン頻度を一致させて適切なフォールディングを確実にすること、ＧＣヌクレオチドペア含有量をバイアスして、ｍＲＮＡ安定性を増加させる、もしくは二次構造を減少させること、遺伝子コンストラクトもしくは発現を損なわせ得るタンデムリピートコドンもしくはベースランを最小限に抑えること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質追跡配列を挿入もしくは除去すること、コードされたタンパク質中の翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去、シャッフルすること、制限酵素切断部位を挿入または削除すること、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、翻訳速度を調節して、タンパク質の様々なドメインが適切にフォールドすることを可能にすること、または、ｍＲＮＡ内の問題がある二次構造を減少させる、もしくは取り除くことが挙げられる。適当なコドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当技術分野において既知である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型の任意の領域のヌクレオチド配列を、コドン最適化することができる。一次ｃＤＮＡ鋳型は、鋳型鎖中での特定のヌクレオチドの発生または出現頻度を低下させることを含み得るのが好ましい。例えば、鋳型中でのヌクレオチドの発生は、鋳型中の上記ヌクレオチドの２５％を下回るレベルまで低下させることができる。さらなる実施例では、鋳型中でのヌクレオチドの発生は、鋳型中の上記ヌクレオチドの２０％を下回るレベルまで低下させることができる。いくつかの実施例では、鋳型中でのヌクレオチドの発生は、鋳型中の上記ヌクレオチドの１６％を下回るレベルまで低下させることができる。好ましくは、鋳型中でのヌクレオチドの発生は、鋳型中の上記ヌクレオチドの１５％を下回るレベルまで低下させることができ、及び、好ましくは、１２％を下回るレベルまで低下させることができる。
いくつかの実施形態では、減少したヌクレオチドはウリジンである。例えば、本開示は、ウラシル含有量が変更された核酸であって、野生型配列中の少なくとも１つのコドンが代替のコドンで置換され、ウラシル変更配列が生成された、上記核酸を提供する。変更されたウラシル配列は、以下の性質のうちの少なくとも１つを有することができる：
（ｉ）全ウラシル含有量（即ち、核酸のセクション、例えば、オープンリーディングフレームの核酸中での、全ヌクレオチド含有量に対するウラシルの割合）の増加もしくは減少；
（ｉｉ）局所ウラシル含有量の増加もしくは減少（即ち、ウラシル含有量の変化が特定のサブ配列に限定されている）；
（ｉｉｉ）全ウラシル含有量の変化を伴わない、ウラシル分布の変化；
（ｉｖ）ウラシルクラスター化（例えば、クラスターの数、クラスターの位置、もしくはクラスター間の距離）の変化；または
（ｖ）これらの組み合わせ。
いくつかの実施形態では、核酸配列中のウラシル核酸塩基の割合は、野生型核酸配列中のウラシル核酸塩基の割合と比較して、低下している。例えば、核酸塩基の３０％は、野生型配列中のウラシルであり得るが、ウラシルである核酸塩基は、本開示の核酸配列中の核酸塩基の、好ましくは１５％未満、好ましくは１２％未満、及び好ましくは、核酸塩基の１０％未満である。百分率でのウラシル含有量は、配列中のウラシルの数をヌクレオチドの総数で除し、１００を掛けることにより測定することができる。
いくつかの実施形態では、核酸配列のサブ配列中のウラシル核酸塩基の割合は、野生型配列の対応するサブ配列中のウラシル核酸塩基の割合と比較して、低下している。例えば、野生型配列は、局所ウラシル含有量の３０％の５’末端領域（例えば、３０個のコドン）を有することができ、当該同一領域内のウラシル含有量は、本開示の核酸配列の、好ましくは１５％以下、好ましくは１２％以下、及び好ましくは１０％以下まで低下させることができる。これらのサブ配列は、本開示の異種５’及び３’ＵＴＲ配列の野生型配列の一部でもまたあることができる。
いくつかの実施形態では、本開示の核酸配列中のコドンは、例えば、タンパク質翻訳において有害作用を有し得るウラシルクラスターの数、サイズ、位置、または分布を減少または変更する。より少数のウラシル含有量が、特定の態様においては望ましいものの、野生型配列のいくつかのサブ配列のウラシル含有量、及び、具体的には局所ウラシル含有量は、野生型配列よりも多く、依然として、有益な特徴（例えば、発現の増加）を維持する。
いくつかの実施形態では、ウラシル修飾配列は、野生型配列と比較したときに、より低いＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を誘発する。いくつかのＴＬＲは核酸を認識し、核酸に対して応答する。高頻度ウイルス構成成分である二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、ＴＬＲ３を活性化することが示されている。一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡはＴＬＲ７を活性化する。ＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有するＲＮＡは、ヒトＴＬＲ８のリガンドである。細菌及びウイルスＤＮＡに特徴的な非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するＤＮＡは、ＴＬＲ９を活性化する。
本明細書で使用する場合、用語「ＴＬＲ応答」とは、ＴＬＲ７受容体による一本鎖ＲＮＡの認識と定義され、受容体による一本鎖ＲＮＡの認識によって引き起こされる、ＲＮＡの分解及び／または生理学的応答を包含するのが好ましい。ＲＮＡのＴＬＲ７への結合を測定し定量する方法は、当技術分野において既知である。同様に、ＲＮＡが、ＴＬＲ７が媒介する生理学的応答（例えば、サイトカイン分泌）をトリガーしたか否かを測定する方法は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ応答は、ＴＬＲ７の代わりにＴＬＲ３、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９により媒介されることができる。ＴＬＲ７が媒介する応答の抑制は、ヌクレオシド修飾により実現することができる。ＲＮＡは、自然界で１００個を超える異なるヌクレオシド修飾を受ける。例えば、ヒトｒＲＮＡは、細菌ｒＲＮＡよりも、１０倍のシュードウラシル（’Ｐ）、及び、２５倍の２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを有する。細菌ｍＲＮＡはヌクレオシド修飾を含有しないが、哺乳類ｍＲＮＡは、Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に加えて、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン、及び、多くの２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示するポリヌクレオチド、及び、好ましくは、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドのウラシル含有量は、参照配列中の配列の全核酸塩基の、約５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示するポリヌクレオチド、及び、好ましくは、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドのウラシル含有量は、約５％～約２５％である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示するポリヌクレオチド、及び、好ましくは、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドのウラシル含有量は、約１５％～約２５％である。
天然及び修飾ヌクレオチド
本明細書に記載するｍＲＮＡは、１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを含むのが好ましい。核酸モノマーの例としては、当該技術分野において既知の任意のそのようなヌクレオチドを含む、非天然、修飾、及び、化学修飾ヌクレオチドが挙げられる。ヌクレオチドは、塩基部分または糖部分のいずれかにおいて人工的に修飾されていることができる。自然界では、大部分のポリヌクレオチドは、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびに、ピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含む、「非修飾」または「天然」ヌクレオチドである、ヌクレオチドを含む。これらの塩基は典型的には、１’部位にて、リボースまたはデオキシリボースに固定されている。化学修飾ヌクレオチドを含むｍＲＮＡポリヌクレオチドの使用は、ｍＲＮＡ発現、発現速度、半減期、及び／または、発現したタンパク質の濃度を改善することが示されている。化学修飾ヌクレオチドを含むｍＲＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質の局在化においても有用であり、これにより、免疫応答及び／または分解経路などの、有害な生物応答を回避する。
修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、５－ヒドロキシシチジン、５－アルキルシチジン、５－ヒドロキシアルキルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－アルコキシシチジン、５－アルキニルシチジン、５－ハロシチジン、２－チオシチジン、Ｎ４－アルキルシチジン、Ｎ４－アミノシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、及び、Ｎ４，Ｎ４－ジアルキルシチジンが挙げられる。
修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、５－プロピニルシチジン、５－ブロモシチジン、５－ヨードシチジン、２－チオシチジン；Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４－アミノシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、及び、Ｎ４，Ｎ４－ジメチルシチジンが挙げられる。
修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、５－ヒドロキシウリジン、５－アルキルウリジン、５－ヒドロキシアルキルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシアルキルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－アルコキシウリジン、５－アルキニルウリジン、５－ハロウリジン、２－チオウリジン、及び６－アルキルウリジンが挙げられる。
修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシメチルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン（本明細書では「５ＭｅＯＵ」とも呼ばれる）、５－プロピニルウリジン、５－ブロモウリジン、５－フルオロウリジン、５－ヨードウリジン、２－チオウリジン、及び６－メチルウリジンが挙げられる。
修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルバモイルメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、５－メチルジヒドロウリジン、５－タウリノメチルウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン、２－チオ－２’Ｏ－メチルウリジン、及び３，２’－Ｏ－ジメチルウリジンが挙げられる。
修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、Ｎ６－メチルアデノシン、２－アミノアデノシン、３－メチルアデノシン、８－アザアデノシン、７－デアザアデノシン、８－オキソアデノシン、８－ブロモアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン、Ｎ６－アセチル－アデノシン、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、α－チオ－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－アデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン、１，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン、２－アミノ－Ｎ６－メチル－プリン、１－チオ－アデノシン、２’－Ｆ－アラ－アデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－アラ－アデノシン、及び、Ｎ６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデノシンが挙げられる。
修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、Ｎ１－アルキルグアノシン、Ｎ２－アルキルグアノシン、チエノグアノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソグアノシン、８－ブロモグアノシン、Ｏ６－アルキルグアノシン、キサントシン、イノシン、及びＮ１－アルキルイノシンが挙げられる。
修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、Ｎ１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、チエノグアノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソグアノシン、８－ブロモグアノシン、Ｏ６－メチルグアノシン、キサントシン、イノシン、及びＮ１－メチルイノシンが挙げられる。
修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、シュードウリジンが挙げられる。シュードウリジンの例としては、Ｎ１－アルキルシュードウリジン、Ｎ１－シクロアルキルシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシアルキルシュードウリジン、Ｎ１－フェニルシュードウリジン、Ｎ１－フェニルアルキルシュードウリジン、Ｎ１－アミノアルキルシュードウリジン、Ｎ３－アルキルシュードウリジン、Ｎ６－アルキルシュードウリジン、Ｎ６－アルコキシシュードウリジン、Ｎ６－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ６－ヒドロキシアルキルシュードウリジン、Ｎ６－モルホリノシュードウリジン、Ｎ６－フェニルシュードウリジン、及び、Ｎ６－ハロシュードウリジンが挙げられる。シュードウリジンの例としては、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－アルキルシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－アルコキシシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－ヒドロキシアルキルシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－モルホリノシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－フェニルシュードウリジン、及び、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－ハロシュードウリジンが挙げられる。これらの例では、アルキル、シクロアルキル、及びフェニル置換基は、非置換であってよいか、または、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、もしくはニトロ置換基でさらに置換されてよい。
シュードウリジンの例としては、Ｎ１－メチルシュードウリジン（本明細書では「Ｎ１ＭＰＵ」とも呼ばれる）、Ｎ１－エチルシュードウリジン、Ｎ１－プロピルシュードウリジン、Ｎ１－シクロプロピルシュードウリジン、Ｎ１－フェニルシュードウリジン、Ｎ１－アミノメチルシュードウリジン、Ｎ３－メチルシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシシュードウリジン、及び、Ｎ１－ヒドロキシメチルシュードウリジンが挙げられる。
核酸モノマーの例としては、当該技術分野において既知の任意のそのようなヌクレオチドを含む、修飾及び化学修飾ヌクレオチドが挙げられる。
修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、当該技術分野において既知の任意のこのようなヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルプリンヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチド、２’－デオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５－Ｃ－メチル－ヌクレオチド、及び、反転デオキシ脱塩基モノマー残基が挙げられる。
修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、３’末端安定化ヌクレオチド、３’－グリセリルヌクレオチド、３’－反転脱塩基ヌクレオチド、及び、３’－反転チミジンが挙げられる。
修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、ロック核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’－Ｏ，４－Ｃ－メチレン－（Ｄ－リボフラノシル）ヌクレオチド、２’－メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’－メチル－チオ－エチル、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、及び、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドが挙げられる。例示的実施形態では、修飾モノマーは、ロック核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）である。
修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、２’，４’－収縮２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、及び２’－Ｏ－エチル（ｃＥｔ）修飾ＤＮＡが挙げられる。
修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、２’－アミノヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノヌクレオチド、２’－Ｃ－アリルヌクレオチド、及び、２’－Ｏ－アリルヌクレオチドが挙げられる。
修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、Ｎ６－メチルアデノシンヌクレオチドが挙げられる。
修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、修飾塩基５－（３－アミノ）プロピルウリジン、５－（２－メルカプト）エチルウリジン、５－ブロモウリジン；８－ブロモグアノシン、または７－デアザアデノシンを含むヌクレオチドモノマーが挙げられる。
修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、２’－Ｏ－アミノプロピル置換ヌクレオチドが挙げられる。
修飾及び化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、ヌクレオチドの２’－ＯＨ基を、２’－Ｒ、２’－ＯＲ、２’－ハロゲン、２’－ＳＲ、または２’－アミノ［式中、ＲはＨ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであることができる。］で置き換えることが挙げられる。
上述の塩基修飾の例を、糖修飾及び結合修飾を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造のさらなる修飾を組み合わせることができる。特定の修飾または化学修飾ヌクレオチドモノマーは、自然界で発見することができる。
好ましいヌクレオチド修飾としては、Ｎ１－メチルシュードウリジン及び５－メトキシウリジンが挙げられる。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
分子遺伝学では、非翻訳領域（ＵＴＲ）とは、ｍＲＮＡの鎖のコード配列の各末端上にある、２つのセクションのいずれかを意味する。ＵＴＲが５’側で発見される場合、これは、５’ＵＴＲ（またはリーダー配列）と呼ばれる。または、ＵＴＲが３’側で発見される場合、これは、３’ＵＴＲ（または、トレーラー配列）と呼ばれる。ｍＲＮＡはインビボでタンパク質に翻訳されるため、５’及び３’ＵＴＲを含む、ｍＲＮＡのいくつかの領域は通常翻訳されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をさらに含む。５’ＵＴＲは、コード配列の上流にある。５’ＵＴＲの中には、リボソームを結合させ、翻訳を開始させる、リボソームにより認識される配列が存在する。対照的に、３’ＵＴＲは通常、コード領域の翻訳終止コドンの直後に見いだされる。３’ＵＴＲは、翻訳終了、加えて、翻訳後修飾において、重要な役割を果たすことができる。したがって、当該技術分野において理解されるように、５’及び／または３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの翻訳能力または翻訳効率に影響を及ぼし得る。５’ＵＴＲは、比較的安定していることで、当該技術分野において既知であるｍＲＮＡ分子（例えば、ヒストン、チューブリン、グロビン、グリセルアルデヒド１－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アクチン、または、クエン酸サイクル酵素）に由来し、翻訳可能なオリゴマーの安定性を増加させることができる。他の実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ヒトＩＬ－６、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノゲンα鎖、ヒトトランスサイレチン、ヒトハプトグロビン、ヒトα－１抗キモトリプシン、ヒト抗トロンビン、ヒトα－１－アンチトリプシン、ヒトアルブミン、ヒトβグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト補体Ｃ５、Ｓｙｎｋ（シアノバクテリアのＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．に由来する、チラコイドカリウムチャネルタンパク質）、マウスβグロビン、マウスアルブミン、及びタバコエッチウイルスの５’ＵＴＲから選択される配列、または、前述のいずれかのフラグメントを含む。５’ＵＴＲは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）に由来するのが好ましい。本明細書に記載するｍＲＮＡは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにより発現される遺伝子に由来する、５’ＵＴＲ配列を含むのが好ましい。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにより発現される遺伝子の５’ＵＴＲ配列は、ＡＴ１Ｇ５８４２０であるのが好ましい。５ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの例は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３５４１９に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。好ましい５’ＵＴＲ配列は、表２に示すように、配列番号５～１０、１２５～１２７、及び２２７～２４７を含む。
Figure 2023516676000011
Figure 2023516676000012
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、配列番号６（ＡＴ１Ｇ５８４２０）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノゲンα鎖、ヒトハプトグロビン、ヒト抗トロンビン、ヒトαグロビン、ヒトβグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト増殖因子、ヒトヘプシジン、ＭＡＬＡＴ－１、マウスβグロビン、マウスアルブミン、及び、ゼノパスβグロビンの３’ＵＴＲから選択される配列、または、前述のいずれかのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、ゼノパスβグロビンに由来する。例示的な３’ＵＴＲ配列は、表３に示すように、配列番号１６～２２を含む。
Figure 2023516676000013
トリプル終止コドン
いくつかの実施形態では、ＯＴＣをコードする翻訳可能なオリゴマーは、トリプル終止コドンを作製するコード領域（即ち、ＯＲＦ）のすぐ下流の配列を含むことができる。トリプル終止コドンは、３つの連続終止コドンの配列である。トリプル終止コドンは、発現カセットの完全な孤立を確実に行うことができ、これを組み込んで、翻訳効率を向上させることができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載するＯＲＦのすぐ下流に、配列ＵＡＧ、ＵＧＡ、またはＵＡＡのいずれかの３つの組み合わせを含むことができる。３つの組み合わせは、３つの同一コドン、３つの異なるコドン、または、３つの終止コドンの任意の他の順列であることができる。
翻訳エンハンサー及びコザック配列
翻訳を開始するためには、リボソームとｍＲＮＡの間に適切な相互作用を確立させて、翻訳開始領域の正確な位置を測定しなければならない。しかし、リボソームはまた、翻訳開始領域から分離して、ｍＲＮＡ翻訳の間に下流配列に向かってスライドしなければならない。ｍＲＮＡの開始配列の上流にある翻訳エンハンサーは、タンパク質生合成の収率を向上させる。いくつかの研究では、翻訳エンハンサーの効果が調査されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、翻訳エンハンサー配列を含む。これらの翻訳エンハンサー配列は、本明細書に記載するｍＲＮＡの翻訳効率を向上させ、これにより、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の産生の増加がもたらされる。翻訳エンハンサー領域は、ｍＲＮＡ配列の５’または３’ＵＴＲに位置することができる。翻訳エンハンサー領域の例としては、ＴＥＶ ５’ＵＴＲ、及び、ゼノパスβグロビン３’ＵＴＲに由来する、自然に存在するエンハンサー領域が挙げられる。例示的な５’ＵＴＲエンハンサー配列としては、ＨＳＰ７０－Ｐ２、ＨＳＰ７０－Ｍ１、ＨＳＰ７２－Ｍ２、ＨＳＰ１７．９、及びＨＳＰ７０－Ｐ１を含む、ヒト熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）をコードするｍＲＮＡに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の実施形態に従い使用される、好ましい翻訳エンハンサー配列は、表４に示すように、配列番号１１～１５により表される。
Figure 2023516676000014
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、コザック配列を含む。当該技術分野において理解されるように、コザック配列は、ｍＲＮＡの翻訳の効率的な開始を可能にする、真核細胞ｍＲＮＡの翻訳開始部位を中心とする短いコンセンサス配列である。例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｍａｒｉｌｙｎ（１９８８）Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，８：２７３７－２７４４；Ｋｏｚａｋ，Ｍａｒｉｌｙｎ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６６：１９８６７－１９８７０；Ｋｏｚａｋ，Ｍａｒｉｌｙｎ（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：８３０１－８３０５；及びＫｏｚａｋ，Ｍａｒｉｌｙｎ（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１０８：２２９－２４１を参照されたい。これにより、確実に、タンパク質が遺伝メッセージから正しく翻訳され、リボソームのアセンブリ及び翻訳開始を媒介する。リボソーム翻訳機構は、コザック配列との関係においては、ＡＵＧ開始コドンを認識する。コザック配列は、ＯＴＣに対するコード配列の上流、５’ＵＴＲの下流挿入することができる、または、ＯＴＣに対するコード配列の上流、及び５’ＵＴＲの下流に挿入される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、配列ＧＣＣＡＣＣ（配列番号２３）を有するコザック配列を含む。本明細書に記載するｍＲＮＡは、配列ＧＣＣＡ（配列番号２４）を有する、部分コザック配列「ｐ」を含むのが好ましい。
５’キャップ
あらゆる真核細胞生命体（及び、いくつかのウイルス）に存在する、ｍＲＮＡの５’末端のキャップ構造は、ｍＲＮＡをインビボで安定化させるのに重要である。自然に存在するキャップ構造は、グアニン塩基のＮ７位にてメチル化された、リボ－グアノシン残基を含む。この７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）は、ｍＲＮＡ分子の５末端にて、５’－～５’－トリホスフェート鎖を介して結合する。５末端にｍ７Ｇｐｐｐフラグメントが存在することは、これが、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、ｍＲＮＡの、核から細胞質への輸送を容易にし、翻訳開始複合体のアセンブリにおいて重要な役割を果たす（Ｃｅｌｌ ９：６４５－６５３，（１９７６）；Ｎａｔｕｒｅ ２６６：２３５，（１９７７）；Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｌｅｔｔｅｒ ９６：１－１１，（１９７８）；Ｃｅｌｌ ４０：２２３－２４，（１９８５）；Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５：１７３－２０７，（１９８８）；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：９１３－９６３，（１９９９）；及びＪ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０３３７－３０４０，（１９９９））ため、ｍＲＮＡ変異に不可欠である。
キャップ構造を有するこれらのｍＲＮＡのみが、キャップ依存性翻訳において活性であり、ｍＲＮＡの「切頭」は、タンパク質合成のための鋳型活性の、ほぼ完全な喪失をもたらす（Ｎａｔｕｒｅ，２５５：３３－３７，（１９７５）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２５３：５２２８－５２３１，（１９７８）；及び Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：１１８９－１１９３，（１９７５））。
真核細胞ｍＲＮＡの別の要素は、転写位置１（キャップ１）、ならびに、場合によっては転写位置１及び２（キャップ２）に位置する、２’－Ｏ－メチルヌクレオシド残基の存在である。ｍＲＮＡの２’－Ｏ－メチル化により、高効率のインビボでのｍＲＮＡ翻訳がもたらされ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３９５２－３９５６（１９８０））、さらに、５’キャップｍＲＮＡのヌクレアーゼ安定性を改善する。キャップ１（及びキャップ２）を有するｍＲＮＡは、細胞に、本物のｍＲＮＡ５’末端を認識させ、場合によっては、感染性遺伝エレメントから出てくる転写物に対して区別させる、固有の標識である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３：４８２－４９２（２０１５））。
５’キャップ構造のいくつかの例、及び、これを含むｍＲＮＡの調製方法は、ＷＯ２０１５／０５１１６９Ａ２、ＷＯ／２０１５／０６１４９１、ＵＳ２０１８／０２７３５７６、ならびに、米国特許第８，０９３，３６７号、同第８，３０４，５２９号、及びＵ．Ｓ．１０，４８７，１０５に記載されている。いくつかの実施形態では、５’はｍ７ＧｐｐｐＡｍｐＧであり、これは当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、５’キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧまたはｍ７ＧｐｐｐＧｍであり、これは当技術分野において既知である。５’キャップ構造の実施形態に対する構造式を、以下に示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＩ）の構造を有する５’キャップを含む。
Figure 2023516676000015
 ［式中、Ｂ１は天然または修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｎは０または１であり、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表す。］。いくつかの実施形態では、Ｂ１はＧ、ｍ７Ｇ、またはＡである。いくつかの実施形態では、ｎは０である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。いくつかの実施形態では、Ｂ１はＡまたはｍ６Ａであり、Ｒ１はＯＣＨ３であり、式中、Ｇはグアニンであり、ｍ７Ｇは７－メチルグアニンであり、Ａはアデニンであり、ｍ６ＡはＮ６－メチルアデニンである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＩＩ）の構造を有する５’キャップを含む。
Figure 2023516676000016
 ［式中、Ｂ１及びＢ２はそれぞれ独立して天然または修飾核酸塩基であり、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、ｎは０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｂ１はＧ、ｍ７Ｇ、またはＡである。いくつかの実施形態では、ｎは０である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。いくつかの実施形態では、Ｂ１はＡまたはｍ６Ａであり、Ｒ１はＯＣＨ３であり、式中、Ｇはグアニンであり、ｍ７Ｇは７－メチルグアニンであり、Ａはアデニンであり、ｍ６ＡはＮ６－メチルアデニンである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＩＩＩ）の構造を有する５’キャップを含む。
Figure 2023516676000017
 ［式中、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３はそれぞれ独立して天然または修飾核酸塩基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、ｎは０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｂ１はＧ、ｍ７Ｇ、またはＡである。いくつかの実施形態では、Ｂ１はＡまたはｍ６Ａであり、Ｒ１はＯＣＨ３であり、式中、Ｇはグアニンであり、ｍ７Ｇは７－メチルグアニンであり、Ａはアデニンであり、ｍ６ＡはＮ６－メチルアデニンである。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＩＶ）の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＧ ５’キャップ類似体を含む。
Figure 2023516676000018
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、ｎは、０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、５’はｍ７ＧｐｐｐＧであり、式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれＯＨであり、ｎは１であり、各Ｌはホスフェートである。いくつかの実施形態では、ｎは１である。いくつかの実施形態では、５’キャップはｍ７ＧｐｐｐＧｍであり、式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＯＨであり、Ｒ３はＯＣＨ３であり、各Ｌはホスフェートであり、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した、ＯＴＣ活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡであり、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＶ）の構造を有するｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ ５’キャップ類似体を含む。
Figure 2023516676000019
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、かつ、ｎは、０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７ＧｐＮの５’キャップ類似体［式中、Ｎは天然または修飾ヌクレオチドである。］を含み、５’キャップ類似体は、式（キャップＶＩ）の構造を有する。
Figure 2023516676000020
 ［式中、Ｂ３は天然または修飾核酸塩基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、かつ、ｎは、０または３である。］いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｂ１はＧ、ｍ７Ｇ、またはＡである。いくつかの実施形態では、Ｂ１はＡまたはｍ６Ａであり、Ｒ１はＯＣＨ３であり、式中、Ｇはグアニンであり、ｍ７Ｇは７－メチルグアニンであり、Ａはアデニンであり、ｍ６ＡはＮ６－メチルアデニンである。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＶＩＩ）の構造を有するｍ７Ｇｐｐｐｍ７ＧｐＧ ５’キャップ類似体を含む。
Figure 2023516676000021
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、かつ、ｎは、０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＶＩＩＩ）の構造を有するｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇｐｍ７Ｇ ５’キャップ類似体を含む。
Figure 2023516676000022
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、ｎは、０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＩＸ）の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＡ ５’キャップ類似体を含む。
Figure 2023516676000023
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、かつ、ｎは、０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つはＯＨである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、ｍ７ＧｐｐｐＡｐＮの５’キャップ類似体［式中、Ｎは天然または修飾ヌクレオチドである。］を含み、５’キャップ類似体は、式（キャップＸ）の構造を有する。
Figure 2023516676000024
 ［式中、Ｂ３は天然または修飾核酸塩基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、かつ、ｎは、０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｂ３はＧ、ｍ７Ｇ、またはｍ６Ａであり、式中、Ｇはグアニンであり、ｍ７Ｇは７－メチルグアニンであり、Ａはアデニンであり、ｍ６ＡはＮ６－メチルアデニンである。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＸＩ）の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＡｍｐＧ ５’キャップ類似体を含む。
Figure 2023516676000025
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、かつ、ｎは、０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、式キャップＸＩの化合物はｍ７ＧｐｐｐＡｍｐＧであり、式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４はそれぞれＯＨであり、ｎは１であり、各Ｌはホスフェート結合である。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＸＩＩ）の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＡｐｍ７Ｇ ５’キャップ類似体を含む。
Figure 2023516676000026
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、かつ、ｎは、０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｍＲＮＡは、式（キャップＸＩＩＩ）の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＡｍｐｍ７Ｇ ５’キャップ類似体を含む。
Figure 2023516676000027
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４はそれぞれ独立してハロゲン、ＯＨ、及びＯＣＨ３から選択され、各Ｌはホスフェート、ホスホロチオエート、及びボランホスフェートからなる群から独立して選択され［各Ｌはジエステル結合により結合している。］、ｍＲＮＡは、その５’末端で結合した本開示のｍＲＮＡを表し、かつ、ｎは、０または１である。］。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４のうちの少なくとも１つはＯＨである。いくつかの実施形態では、ｎは１である。
ポリアデニン（ポリＡ）テール
ポリアデニル化とは、通常、約１００～１２０モノマー長のアデニンヌクレオチド鎖であるポリ（Ａ）テールを、ｍＲＮＡに付加することである。真核生物では、ポリアデニル化は、翻訳のための成熟ｍＲＮＡを作製するプロセスの一部であり、遺伝子の転写が完了すると、開始する。新たに作製されたプレｍＲＮＡの最も３’側のセグメントはまず、一連のタンパク質により切断され、次に、これらのタンパク質は、３’末端にてポリ（Ａ）テールを合成する。ポリ（Ａ）テールは、核外搬出、翻訳、及びｍＲＮＡの安定に重要である。テールは経時的に短くなり、十分短くなると、ｍＲＮＡが合成により分解される。しかし、いくつかの細胞型では、短いポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡは、細胞質基質中での再ポリアデニル化により、後での活性化のために保管される。
本明細書に記載するｍＲＮＡは、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たすことができる、３’テール領域を含むのが好ましい。テール領域は、３’ポリ（Ａ）及び／または３’ポリ（Ｃ）領域であることができる。テール領域は３’ポリ（Ａ）テールであるのが好ましい。本明細書で使用する場合、「３’ポリ（Ａ）テール」とは、例えば、１０～２５０個の連続アデニンヌクレオチド；６０～１２５個の連続アデニンヌクレオチド、９０～１２５個の連続アデニンヌクレオチド、９５～１２５個の連続アデニンヌクレオチド、９５～１２１個の連続アデニンヌクレオチド、１００～１２１個の連続アデニンヌクレオチド、１１０～１２１個の連続アデニンヌクレオチド；１１２～１２１個の連続アデニンヌクレオチド；１１４～１２１個のアデニン連続ヌクレオチド；または、１１５～１２１個の連続アデニンヌクレオチドのサイズの範囲であることができる、連続アデニンヌクレオチドのポリマーである。本明細書に記載する３’ポリ（Ａ）テールは、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、または１２５個の連続アデニンヌクレオチドを含むのが好ましい。３’ポリ（Ａ）テールは、当該技術分野において既知の様々な方法を使用して付加することができる、例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、合成、またはインビトロ転写ＲＮＡにテールを付加することができる。他の方法としては、転写ベクターを使用して、ポリ（Ａ）テールをコードすること、または、（例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ及び／またはＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用する、スプリントライゲーションによる）リガーゼを使用することが挙げられ、ポリ（Ａ）は、センスＲＮＡの３’末端にライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、上記方法のいずれかの組み合わせを利用する。
ｍＲＮＡの設計及び合成
本開示の好ましいｍＲＮＡ配列のコンストラクトを、表５に記載する。
Figure 2023516676000028
Figure 2023516676000029
Figure 2023516676000030
Figure 2023516676000031
Figure 2023516676000032
Figure 2023516676000033
Figure 2023516676000034
Figure 2023516676000035
Figure 2023516676000036
好ましいｍＲＮＡ配列は、表５に列挙するｍＲＮＡ配列全てを含む。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡ配列のウラシルヌクレオチドの０％～１００％、好ましくは１％～１００％、好ましくは２５％～１００％、好ましくは５０％～１００％、及び好ましくは７５％～００％が修飾された、表５に列挙するｍＲＮＡ配列全てを含む。ウラシルヌクレオチドの１％～１００％が、Ｎ１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンであるのが好ましい。ウラシルヌクレオチドの１００％がＮ１－メチルシュードウリジンであるのが好ましい。ウラシルヌクレオチドの１００％が５－メトキシウリジンであるのが好ましい。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ配列は、５’キャップ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにより発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲ、任意の翻訳エンハンサー配列、任意のコザック配列または部分コザック配列、ＯＴＣタンパク質をコードするコドン最適化コード配列（ＣＤＳ／ＯＲＦ）、３’ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）テールを含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化ＣＤＳは、配列番号３または配列番号４のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにより発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲは、表２に見出される５’ＵＴＲから選択される。いくつかの実施形態では、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにより発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲは、配列番号６、配列番号１２５～１２７、及び配列番号２２７～２４７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、配列番号６の配列に少なくとも９０％の同一性を有するＡＴ１Ｇ５８４２０である。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、配列番号６の配列を有するＡＴ１Ｇ５８４２０である。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列のウラシル含有量は、配列番号１のウラシル含有量の割合と比較して低下している。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ配列のウラシルヌクレオチドの０％～１００％が修飾されている。いくつかの実施形態では、ウラシルヌクレオチドの０％～１００％がＮ１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、ウラシルヌクレオチドの１００％がＮ１－メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態では、ウラシルヌクレオチドの１００％が５－メトキシウリジンである。
好ましいｍＲＮＡコンストラクトは、コドン最適化コード配列、及び、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにより発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲを含み、配列番号６２、６７、６８、６９、７３、１１３－１１９、及び１２１－１２７から選択される。
本開示の好ましいｍＲＮＡコンストラクトは、配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質をコードする最適化ＯＲＦを有し、１２１個のヌクレオチドの３’ポリＡテールを含む、ｍＲＮＡコンストラクト１９２１（配列番号１１９）を含む。別の好ましいｍＲＮＡコンストラクトは、配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質をコードし、１００個のヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールを含む、コンストラクト２２６０（配列番号２５１）を含む。別の好ましいｍＲＮＡコンストラクトは、配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質をコードし、１００個のヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールを含む、コンストラクト２２６２（配列番号２５２）を含む。
本開示の好ましいｍＲＮＡ配列は、配列番号３の野生型ヒトＯＴＣをコードするコドン最適化ＯＲＦを有し、１２１個のヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールを有する、ｍＲＮＡコンストラクト１７９９（配列番号７３）を含む。本開示の別の好ましいｍＲＮＡコンストラクトは、配列番号３の野生型ヒトＯＴＣをコードするコドン最適化ＯＲＦを有し、１００個のヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）テールを含む、ｍＲＮＡコンストラクト２０１６（配列番号２５３）を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコンストラクト１７９９、２０１６、１９２１、２２６０、及び２２６２のウリジンヌクレオチドの１００％がＮ１－メチルシュードウリジンである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡコンストラクト１７９９、２０１６、１９２１、２２６０、及び２２６２のウラシルヌクレオチドの１００％が５－メトキシウリジンである。
本開示に従って使用するためのｍＲＮＡは、増加した翻訳効率を示すことができる。本明細書で使用する場合、翻訳効率とは、開示に従ったｍＲＮＡの翻訳による、タンパク質またはポリペプチドの産生の尺度を意味する。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、開示に従いコドン最適化されていない、及び／または、本開示の好ましいＵＴＲを含まない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、少なくとも２倍、３倍、５倍、または１０倍増加した、インビボでの翻訳効率を示すことができる。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、最適化されていない、及び／または、本開示の好ましいＵＴＲを含まない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、少なくとも２倍、３倍、５倍、または１０倍増加した、インビボでのポリペプチドまたはタンパク質レベルを提供することができる。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、開示に従いコドン最適化されていない、及び／または、本開示の好ましいＵＴＲを含まない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、インビボでのポリペプチドまたはタンパク質のレベルの増加を提供することができる。例えば、ポリペプチドまたはタンパク質のレベルは、約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、またはそれ以上増加することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、開示に従いコドン最適化されていない、及び／または、本開示の好ましいＵＴＲを含まない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡに対して、哺乳類細胞の細胞質中での機能的半減期の増加を提供することができる。本発明の翻訳可能な分子は、開示に従いコドン最適化されていない、及び／または、本開示の好ましいＵＴＲを含まない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、増加した活性の半減期を有することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、開示に従いコドン最適化されていない、及び／または、本開示の好ましいＵＴＲを含まない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、細胞の先天性免疫応答を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、開示に従いコドン最適化されていない、及び／または、本開示の好ましいＵＴＲを含まない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、有効な治療法に必要な用量レベルを低下させることができる。
本開示のｍＲＮＡ剤は、任意の適当な手段により入手することができる。ｍＲＮＡの製造方法は当技術分野において既知であり、当業者に速やかに明らかとなろう。本開示に従って使用するためのｍＲＮＡは、化学合成、インビトロ転写（ＩＶＴ）、または、より長い前駆体の酵素もしくは化学切断などを含むがこれらに限定されない、任意の利用可能な技術に従って調製することができる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、一次相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コンストラクトから作製される。ｃＤＮＡコンストラクトは、逆転写酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の作用により、ＲＮＡ鋳型上で作製される。本明細書に記載する一次ｃＤＮＡコンストラクトの設計及び合成のプロセスは一般に、遺伝子構築、ｍＲＮＡ作製（修飾を伴う、または伴わないいずれか）、及び精製のステップを含む。ＩＶＴ法では、ＯＴＣタンパク質をコードする標的ポリヌクレオチド配列をまず、ベクターへの組み込みのために選択肢、これを増幅してｃＤＮＡ鋳型を作製する。任意に、標的ポリヌクレオチド配列及び／または任意のフランキング配列を、コドン最適化してよい。次に、ｃＤＮＡ鋳型を使用して、インビトロ転写（ＩＶＴ）によりｍＲＮＡを作製する。作製後、ｍＲＮＡは精製、及びクリーンアッププロセスを受け得る。これらのステップは、以下により詳細に示す。
遺伝子構築のステップとしては、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド直鎖化及びクリーンアップ、ならびに、ｃＤＮＡ鋳型合成及びクリーンアップが挙げられるが、これらに限定されない。ヒトＯＴＣタンパク質（例えば、配列番号３または配列番号４）が作製のために選択されると、一次コンストラクトが設計される。一次コンストラクトの中に、選択した核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）転写産物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を使用して、対象ポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１領域を構築することができる。ＯＲＦは、野生型ＯＲＦ、そのアイソフォーム、バリアント、またはフラグメントを含むことができる。本明細書で使用する場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、目的のポリペプチドをコード可能な核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すことを意味する。ＯＲＦは多くの場合、開始コドンであるＡＴＧから開始し、ナンセンスコドンまたは終止コドンまたはシグナルで終了する。
ｃＤＮＡ鋳型を、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを使用して転写し、本明細書に記載するｍＲＮＡ配列を作製することができる。システムは通常、転写緩衝液、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む、本明細書に記載するＮＴＰから選択することができるが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、及び、限定されるものではないが、修飾核酸を組み込むことが可能なポリメラーゼなどの変異ポリメラーゼから選択することができるが、これらに限定されない。
一次ｃＤＮＡ鋳型、または転写ｍＲＮＡ配列もまた、キャッピング及び／またはテーリング反応を受けることができる。当該技術分野において既知の方法によりキャッピング反応を行い、一次コンストラクトの５’末端に５’キャップを付加することができる。キャッピング法としては、Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）の使用、または、例えば、キャップ剤をＩＶＴ反応の一部として含めることにより、インビトロ転写の開始時にキャッピングを行うことが挙げられるが、これらに限定されない。（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．（２００９）５３：１２９）。ポリ（Ａ）テール反応は、限定されるものではないが、２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼなどの、当該技術分野において既知の方法により、及び、本明細書に記載する方法により実施することができる。ｃＤＮＡから生成した一次コンストラクトがポリＴを含まない場合、一次コンストラクトをきれいにする前にポリ（Ａ）テーリング反応を行うのが有益であり得る。
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードする、コドン最適化ｃＤＮＡコンストラクトが、本明細書に記載するｍＲＮＡ配列を生成するのに特に有益である。例えば、このようなｃＤＮＡコンストラクトを、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードするポリリボヌクレオチドをインビトロで転写するための土台として使用することができる。表６は、表５に列挙するｍＲＮＡ配列のインビトロ転写に使用する、例示的なｃＤＮＡＯＲＦ鋳型の一覧を示す。
Figure 2023516676000037
Figure 2023516676000038
Figure 2023516676000039
好ましいｃＤＮＡ鋳型配列は、配列番号３の野生型ヒトＯＴＣをコードする最適化コード配列を有する、配列番号１７５のＤＮＡ配列（ｐ１７７９）を含む。好ましいｃＤＮＡ鋳型配列は、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードする最適化コード配列を有する、配列番号２２１のｃＤＮＡ配列（ｐ１９２１）もまた含む。
本開示は、好ましくは少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターもまた提供する。調節配列は当該技術分野において認識されており、コードされたポリペプチドの発現を指令するように選択される。
したがって、「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び、他の発現調節エレメントを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、及び／または、発現されることが所望されるタンパク質の種類といった因子に左右され得る。
本開示は、ベクターまたはプラスミドなどの発現コンストラクト中で、１つ以上の調節クレオチド配列に作動可能に連結され得るヒトＯＴＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）もまた提供する。特定の実施形態では、このようなコンストラクトはＤＮＡコンストラクトである。調節ヌクレオチド配列は通常、発現に使用される宿主細胞に好適である。様々な宿主細胞に対する多くの種類の適切な発現ベクター、及び適当な調節配列が、当技術分野において既知である。
通常、上記１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、ならびに、エンハンサーまたはアクティベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野において既知の体質性または誘導性プロモーターは、本開示の実施形態により想倒される。プロモーターは、自然に存在するプロモーター、または、２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターのいずれかであることができる。
発現コンストラクトは、プラスミドなどのエピソーム上の細胞に存在することができるか、または、発現コンストラクトは染色体に挿入されることができる。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、形質転換した宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択可能なマーカー遺伝子は当該技術分野において周知であり、使用される宿主細胞で変化する。
本開示は、本明細書に記載するオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする、本明細書に記載するｍＲＮＡまたはＤＮＡをトランスフェクトした宿主細胞もまた提供する。いくつかの実施形態では、ヒトＯＴＣポリペプチドは、配列番号４の配列を有する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用する）、酵母菌、または哺乳類細胞で発現することができる。他の適当な宿主細胞は、当業者に既知である。
本開示は、配列番号２６～２２９のいずれか１つのｍＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞もまた提供する。
本開示は、配列番号３のヒト野生型ＯＴＣタンパク質、または、配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質を産生する方法もまた提供する。いくつかの実施形態では、ＯＴＣタンパク質は配列番号４であり、配列番号１１９のｍＲＮＡによりコードされる。例えば、ＯＴＣタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞は、ポリペプチドの発現を生じさせるのに適切な条件下で培養することができる。ポリペプチドは細胞の混合物及びポリペプチドを含有する培地から分泌及び単離することができる。あるいは、ポリペプチドは細胞質または膜画分に保持することができ、細胞を回収して溶解し、タンパク質を単離する。細胞培養液は、宿主細胞、培地、及び他の副生成物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該技術分野において周知である。
本明細書に記載する、発現したＯＴＣタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、及び、（ＯＴＣポリペプチド）の特定のエピトープに対して特異的な抗体による、イムノアフィニティー精製を含む、タンパク質を精製するための、当該技術分野において既知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこれら両方から単離することができる。
脂質ベース製剤
核酸を標的細胞に細胞内送達することをベースにする治療法は、細胞外及び細胞内障壁の両方に直面する。実際、裸の核酸材料は、その毒性、血清中での安定性の低さ、急速な腎クリアランス、標的細胞による取り込みの低下、食細胞の取り込み、及び、免疫応答を活性化する能力（臨床開発をできないようにする全ての要件）が原因で、容易に全身投与をすることができない。外来性核酸材料（例えば、ｍＲＮＡ）がヒトの生物学的系に入ると、細網内皮細胞系（ＲＥＳ）により外来病原体として認識され、血管系の中、または外で、標的細胞と出くわす機会を有する前に、血液循環からクリアランスされてしまう。血流中の、裸の核酸の半減期は、約数分であることが報告されている（Ｋａｗａｂａｔａ Ｋ，Ｔａｋａｋｕｒａ Ｙ，Ｈａｓｈｉｄａ ＭＰｈａｒｍ Ｒｅｓ．１９９５ Ｊｕｎ；１２（６）：８２５－３０）。化学修飾及び適切な送達法により、ＲＥＳによる取り込みを減少させ、ユビキタスヌクレアーゼによる分解から核酸を守ることができ、これにより、核酸ベースの治療法の安定性及び有効性が増加する。加えて、ＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞による取り込みが好ましくないアニオン性親水性ポリマーであり、これらは、表面でもアニオン性である。それ故、核酸ベースの治療法の成功は、遺伝物質を効率的かつ効果的に標的細胞に送達し、最小限の毒性で、インビボでの十分な発現レベルを得ることができる、ビヒクルまたはベクターの開発に大幅に左右される。
さらに、標的細胞への内部化の際に、核酸送達ベクターは、細胞内バリアにより、エンドソームの閉じ込め、リソソーム分解、ベクターからの核酸取り出し、（ＤＮＡに対する）核メンブレンにまたがる転座、（ＲＮＡに対する）細胞質での放出などを含む困難に面する。したがって、核酸ベースの治療法の成功は、ベクターが、遺伝子の発現といった、十分なレベルの所望の活性を入手するために、核酸を細胞の内側の標的部位に送達する能力に左右される。
いくつかの遺伝子治療法は、ウイルス性送達ベクター（例えば、ＡＡＶ）を上手く利用することができているが、脂質ベース製剤は、その生体適合性、及び、大規模製造の容易さによって、ＲＮＡ及び他の核酸化合物に対する、最も有望なデリバリーシステムの１つとしての認知が増加している。脂質ベース核酸治療法における、最も著しい進歩の１つは、パチシラン（ＡＬＮ－ＴＴＲ０２）が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び欧州委員会（ＥＣ）により認可された、最初のｓｉＲＮＡ治療薬となった２０１８年８月に起こった。ＡＬＮ－ＴＴＲ０２は、いわゆる、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）トランスフェクト技術に基づくｓｉＲＮＡ製剤である。パチシランが成功したにもかかわらず、脂質製剤による、ｍＲＮＡを含む核酸治療薬の送達は依然として、開発途上にある。
様々な実施形態に従った、核酸治療薬に対する、当該技術分野において認識されている、いくつかの脂質製剤送達ビヒクルとしては、ポリマーベースキャリア、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子及びリポソーム、ナノリソソーム、セラミド含有ナノリソソーム、多胞体リポソーム、プロテオリソソーム、天然及び合成送達エクソソームの両方、天然、合成、及び半合成ラメラ体、ナノ粒子、ミセル、ならびにエマルションが挙げられる。これらの脂質製剤は、その構造及び組成が変化し得、急速に進化する分野で予想することができるように、いくつかの異なる用語が、１種類の送達ビヒクルを説明するために、当該技術分野において使用されている。同時に、脂質製剤という用語は、科学文献を通じて、その意図する意味が多様化しており、この一貫していない使用により、脂質製剤のいくつかの用語の正確な意味の混乱が生じている。いくつかの可能性ある脂質製剤の中でも、リポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子が、本開示の目的のために、本明細書で特に詳細に説明され、定義されている。
リポソーム
従来のリポソームは、少なくとも１つの二分子膜、及び、内部の水区画からなる小胞である。リポソームの二分子膜は通常、空間的に分離された親水性及び疎水性ドメインを含む、合成または天然由来の脂質といった、両親媒性分子により形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７－３２１，１９９８）。リポソームの二分子膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性剤（例えば、ポリマーソーム、ニオソームなど）によってもまた形成することができる。これらは一般に、球状小胞として存在し、２０ｎｍ～数ミクロンサイズの範囲であることができる。リポソーム製剤はコロイド状分散体として調製することができるか、または、凍結乾燥して安定性リスクを低下させる、及び、リポソームベース薬剤に対する貯蔵寿命を改善することができる。リポソーム組成物の調製方法は当技術分野において既知であり、当業者の範囲内であろう。
１つの二分子膜のみを有するリポソームは、ユニラメラであると呼ばれ、２つ以上の二分子膜を有するリポソームは、マルチラメラと呼ばれる。最も一般的なタイプのリポソームは、小型ユニラメラベシクル（ＳＵＶ）、大型ユニラメラベシクル（ＬＵＶ）、及びマルチラメラベシクル（ＭＬＶ）である。リポソームとは対照的に、リソソーム、ミセル、及び逆ミセルは、脂質の単一層で構成される。一般的に、リポソームは単一内部区画を有するものと考えられるが、製剤の中には、多胞体リポソーム（ＭＶＬ）であることができるものもあり、これらは、共通の中心を持たないいくつかの脂質二分子膜により分離されている、多数の不連続な内部水性区画で構成される。
リポソームは基本的に、生物膜の類似体であることを考慮すると、その優れた生体適合性により、リポソームは長く、薬物送達ビヒクルとして認知されており、天然及び合成リン脂質の両方から調製することができる（Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；９：１８３３－１８４３）。薬物送達ビヒクルとしての使用において、リポソームは、疎水性膜により囲まれた水溶液コアを有するため、コアに溶解した親水性溶質はすぐに二分子膜を通過することができず、疎水性化合物は二分子膜と会合する。したがって、リポソームは疎水性及び／または親水性分子でロードすることができる。リポソームを使用して、ＲＮＡなどの核酸を運搬する場合、核酸を、水相中のリポソーム区画の中に含める。
カチオン性リポソーム
リポソームはカチオン性、アニオン性、及び／または中性脂質で構成されることができる。リポソームの重要なサブクラスとして、カチオン性リポソームは、正に帯電した脂質から全体的に、もしくは部分的に作製されるリポソーム、または、より具体的には、カチオン性基及び親油性部分の両方を含む脂質である。リポソームに関して上で概略した一般的な特徴に加えて、カチオン性リポソームで使用される、カチオン性脂質の正に帯電した部分は、いくつかの利点、及び、いくつかの固有の構造的形質をもたらす。例えば、カチオン性脂質の親油性部分は疎水性であるが故に、リポソームの水性内部から、親油性部分そのものが離れ、他の無極性及び疎水性部分と会合する。逆に、カチオン性部分は水性媒体と会合し、より重要なことには、カチオン性リポソームの水性内部において複合体を形成可能な、極性分子及び種と会合する。これらの理由のために、カチオン性リポソームは、静電相互作用による、負に帯電した核酸への指向性により、遺伝子両方で使用するためにますます調査がされており、生体適合性、低毒性、及び、インビボ臨床用途で必要な大規模作製の可能性をもたらす複合体が得られる。カチオン性リポソームで使用するのに適当なカチオン性脂質を、本明細書で以下に列挙する。
脂質ナノ粒子
リポソーム及びカチオン性リポソームとは対照的に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、固相に化合物を封入する、１つの単一層または二分子層の脂質を含む構造を有する。したがって、リポソームとは異なり、脂質ナノ粒子は、その内部に水相または他の液相を有しないが、二分子層または単一層シェル由来の脂質は直接、内部化合物と複合体化されることで、その中に固体コアを封入する。脂質ナノ粒子は通常、形状及びサイズが比較的均一な分散体を有する、球状小胞である。源は、どのサイズがナノ粒子として脂質粒子を認めるかによって変化するものの、脂質ナノ粒子は１０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の直径を有することができるという点においてはある程度一致するものがある。しおかし、より一般的には、１２０ｎｍ、またはさらに、１００ｎｍ未満であると考えられる。
脂質ナノ粒子核酸デリバリーシステムに関して、脂質シェルを製剤化して、核酸コアの負に帯電した主鎖と複合体化し、これと会合可能な、イオン化可能なカチオン性脂質を含める。見かけのｐＫａ値が約７を下回る、イオン化可能なカチオン性脂質は、カチオン性脂質の、核酸の負に帯電した主鎖との複合体化をもたらし、正に帯電した場合に、イオン化可能な脂質のｐＫａを下回るｐＨ値にて、脂質ナノ粒子にロードするという利点を有する。次に、生理的ｐＨ値において、脂質ナノ粒子は、比較的中性の外側を採用して、静脈内投与後の、粒子の循環半減期の著しい増加を可能にする。核酸送達の文脈において、脂質ナノ粒子は、高い核酸の封入効率、強力なトランスフェクション、組織まで貫通して治療薬を送達することの改善、ならびに、低レベルの細胞毒性及び免疫原性を含む、他の脂質ベース核酸デリバリーシステムよりも多くの利点をもたらす。
核酸用の脂質ナノ粒子デリバリーシステムの開発に先立ち、カチオン性脂質は、核酸薬剤を送達するための合成材料として、幅広く研究されていた。これらの初期の努力においては、生理的ｐＨにて互いに混合した後、核酸をカチオン性脂質により縮合して、リポプレックスとして知られている脂質核酸複合体を形成した。しかし、リポプレックスは不安定であることが分かり、サブミクロンスケールから数ミクロンの範囲の広範なサイズ分布を特徴とした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）試薬などのリポプレックスは，インビトロトランスフェクションに合理的な実用性が見出されている。しかし、これらの第一世代リポプレックスは、インビボでは有用であることが証明されていない。大きな粒径及び正電荷（カチオン性脂質により付与される）は、急速な血漿クリアランス、溶血性及び他の毒性、加えて、免疫系の活性化をもたらす。
脂質ｍＲＮＡ製剤
本明細書で開示するｍＲＮＡ、またはその薬学的に許容される塩を、脂質製剤（即ち、脂質ベースの送達ビヒクル）に組み込むことができる。
本開示の文脈では、脂質ベースの送達ビヒクルは通常、所望のｍＲＮＡを標的細胞または組織に送達する役割を果たす。脂質ベースの送達ビヒクルは、当該技術分野において既知の、任意の適当な脂質ベースの送達ビヒクルであることができる。いくつかの実施形態では、脂質ベースの送達ビヒクルは、リポソーム、カチオン性リポソーム、または、本開示のｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、脂質ベースの送達ビヒクルは、ナノ粒子、または脂質分子の二分子膜、及び、本開示のｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、脂質二分子膜は、中性脂質またはポリマーをさらに含むのが好ましい。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、液体媒質を含むのが好ましい。いくつかの実施形態では、製剤は、核酸をさらに封入するのが好ましい。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、核酸、及び中性脂質またはポリマーをさらに含むのが好ましい。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、核酸を封入するのが好ましい。
本明細書は、脂質製剤に封入される、１つ以上の治療用ｍＲＮＡ分子を含む脂質製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質製剤はリポソームを含む。いくつかの実施形態では、脂質製剤はカチオン性リポソームを含む。いくつかの実施形態では、脂質製剤は、脂質ナノ粒子を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、脂質製剤中のｍＲＮＡが、水溶液中でヌクレアーゼ分解に耐性を有するように、脂質製剤の脂質部分内に完全に封入されている。他の実施形態では、本明細書に記載する脂質製剤は、ヒトなどの哺乳類に対して実質的に無毒である。
本開示の脂質製剤は通常、約１：１～約１００：１、約１：１～約５０：１、約２：１～約４５：１、約３：１～約４０：１、約５：１～約３８：１、または約１０：１～約４０：１、または約１５：１～約３５：１、または約２０：１～約４０：１；または約２５：１～約３５：１；または約２７：１～約３２：１；または約２８：１～約３２：１；または約２９：１～約３１：１の、全脂質：ＲＮＡ非（質量／質量比）を有する。いくつかの好ましい実施形態では、全脂質：ＲＮＡ比（質量／質量比）は、約２５：１～約３５：１である。比率は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値または部分値であってよい。
本開示の脂質製剤は通常、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、もしくは約１５０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。直径は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値または部分値であってよい。加えて、核酸は、本開示の脂質ナノ粒子中に存在する場合、ヌクレアーゼによる分解に対して水溶液中で耐性である。
好ましい実施形態では、脂質製剤は、ｍＲＮＡ、カチオン性脂質（例えば、本明細書に記載する１種以上のカチオン性脂質またはその塩）、リン脂質、及び、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、１種以上のＰＥＧ－脂質複合体）を含む。脂質製剤は、コレステロールもまた含むことができる。
核酸－脂質製剤中では、ｍＲＮＡは、製剤の脂質部分に完全に封入されることができ、これにより、核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡを含む脂質製剤は、脂質製剤の脂質部分に完全に封入され、これにより核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。特定の場合において、脂質製剤中のｍＲＮＡは、３７℃において、粒子をヌクレアーゼに曝露した後、少なくとも２０、３０、４５、または６０分間、実質的に分解しない。特定の他の場合において、脂質製剤中のｍＲＮＡは、３７℃において、血清中で製剤をインキュベートした後、少なくとも３０、４５、もしくは６０分間、または、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間、実質的に分解しない。他の実施形態では、ｍＲＮＡは、製剤の脂質部分と複合体化される。本開示の製剤の利点の１つは、核酸－脂質組成物が、ヒトなどの哺乳類に対して実質的に無毒であるということである。
核酸の文脈において、完全封入は、膜不透過性蛍光色素排除アッセイを実施することによって決定され得、これは、核酸と会合したときに増強した蛍光を有する色素を使用する。封入は、色素を脂質製剤に添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性洗剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって決定される。脂質層の洗剤媒介性破壊は、封入された核酸を放出し、それが膜不透過性色素と相互作用することを可能にする。核酸封入は、Ｅ＝（Ｉ０－Ｉ）／Ｉ０として計算することができ、式中、／及びＩ０は、洗剤の添加前及び添加後の蛍光強度を指す。
他の実施形態では、本開示は、複数の核酸－リポソーム、核酸－カチオン性リポソーム、または核酸－脂質ナノ粒子を含む、核酸－脂質組成物を提供する。いくつかの実施形態では、核酸－脂質組成物は、複数のｍＲＮＡ－リポソームを含む。いくつかの実施形態では、核酸－脂質組成物は、複数のｍＲＮＡ－カチオン性リポソームを含む。いくつかの実施形態では、核酸－脂質組成物は、複数のｍＲＮＡ－脂質ナノ粒子を含む。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、粒子の約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約３０％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、または少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％（もしくは任意のそれらの部分もしくはそれらの中の範囲）が、中にｍＲＮＡを封入するように、製剤の脂質部分に完全に封入されたｍＲＮＡを含む。量は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値または部分値であってよい。
脂質製剤の使用目的に応じて、構成成分の割合は変化してよく、特定の製剤の送達効率は、当該技術分野において既知のアッセイを使用して測定することができる。
いくつかの実施形態に従うと、本明細書に記載する、発現可能なポリヌクレオチド及び異種ｍＲＮＡコンストラクトは、脂質製剤化されている。脂質製剤は、リポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子から選択されるのが好ましいが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、脂質製剤は、
（ａ）本開示のｍＲＮＡ、
（ｂ）カチオン性脂質、
（ｃ）凝集低下剤（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質）、
（ｄ）場合により非カチオン性脂質（中性脂質など）、及び
（ｅ）場合によりステロール
を含むカチオン性リポソームまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はイオン化可能なカチオン性脂質である。一実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、約４０～７０％のイオン化可能なカチオン性脂質：約２～１５％のヘルパー脂質：約２０～４５％のステロール；約０．５～５％のＰＥＧ脂質のモル比で、（ｉ）少なくとも１種のカチオン性脂質；（ｉｉ）ヘルパー脂質；（ｉｉｉ）ステロール（例えば、コレステロール）；及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質からなる。例示的なカチオン性脂質（イオン化可能なカチオン性脂質を含む）、ヘルパー脂質（例えば、中性脂質）、ステロール、及び、リガンド含有脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）は、本明細書で以下に記載する。
カチオン性脂質
脂質製剤は、カチオン性リポソームまたは脂質ナノ粒子を形成するのに適当なカチオン性脂質を含むのが好ましい。カチオン性脂質は、負に帯電した膜に結合して、取り込みを誘発することができるため、核酸送達用に広く研究されている。一般に、カチオン性脂質は、正の親水性頭部基、２つ（またはそれ以上）の親油性尾部、またはステロイド部分、及びこれらの２つのドメイン間の連結子を含有する両親媒性物質である。好ましくは、カチオン性脂質は、およそ生理学的ｐＨで正味の正電荷を担持する。カチオン性リポソームは、伝統的には、オリゴヌクレオチドのための最も一般的に使用される非ウイルス送達系であり、例えば、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴ、及びｓｉＲＮＡ／小ヘアピンＲＮＡ－ｓｈＲＮＡが挙げられる。カチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）及びＤＯＴＭＡ（Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルスルフェート）は、静電相互作用によって、負に帯電した核酸との複合体またはリポプレックスを形成し、高いインビトロトランスフェクション効率を提供することができる。
本開示の脂質製剤では、カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）（Ｎ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド及び１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩としても知られる）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－ｙ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｃ１２－２００）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ）、３－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＭＣ３エーテル）、４－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルブタン－１－アミン（ＭＣ４エーテル）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。他のカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３Ｐ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｉ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシｐｒｏｐ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、及び２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＸＴＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、例えば、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む）、及びリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む）などの、カチオン性脂質の市販の調製物を使用することができる。
他の適当なカチオン性脂質は、国際公開第ＷＯ０９／０８６５５８号、同第ＷＯ０９／１２７０６０号、同第ＷＯ１０／０４８５３６号、同第ＷＯ１０／０５４４０６号、同第ＷＯ１０／０８８５３７号、同第ＷＯ１０／１２９７０９号、及び同第ＷＯ２０１１／１５３４９３号；米国特許公開第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０１２８７６０号、及び同第２０１２／００２７８０３号；米国特許第８，１５８，６０１号；及びＬｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７（５）、１８６４－６９，２０１０に開示されており、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
他の適切なカチオン性脂質には、アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ－及びＮ－プロピル－Ｎ－エチルアミノ－）を含む、代替脂肪酸基及び他のジアルキルアミノ基を有するものが含まれる。これらの脂質は、アミノ脂質と呼ばれるカチオン性脂質のサブカテゴリーの一部である。本明細書に記載の脂質製剤のいくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、アミノ脂質である。一般的に、飽和度の低いアシル鎖を有するアミノ脂質は、大きさを揃えやすい。とりわけ、濾過滅菌のために複合体を約０．３ミクロン以下の大きさとしなければならない場合には、特に大きさを揃えやすい。炭素鎖長がＣ１４～Ｃ２２である不飽和脂肪酸を含有しているアミノ脂質を使用し得る。他の足場を使用して、アミノ脂質のアミノ基と、脂肪酸または脂肪アルキルの部分とを分離し得る。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６号による式Ｉのカチオン性脂質を含む。この文脈では、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６の開示も参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のアミノ脂質またはカチオン性脂質は、イオン化可能であり、プロトン化可能または脱プロトン化可能な基の少なくとも１つを有している。その結果、脂質は、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下のｐＨにおいて正の電荷を有しており、第２のｐＨ（好ましくは、生理学的ｐＨ以上）において中性である。もちろん、ｐＨの機能としてのプロトンの添加または除去は、平衡プロセスであり、荷電脂質または中性脂質と言うときは、主要な種の性質を指しており、全ての脂質が、荷電形態または中性形態で存在することを必要としないことが理解される。プロトン化可能または脱プロトン化可能な基の２つ以上を有している脂質、または、両性イオンである脂質は、本開示における使用から除外されない。ある特定の実施形態では、プロトン化可能脂質は、約４～約１１の範囲においてプロトン化可能基のｐＫａを有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能カチオン性脂質は、約５～約７のｐＫａを有する。いくつかの実施形態では、イオン化可能カチオン性脂質のｐＫａは、約６～約７である。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、式Ｉのイオン化可能なカチオン性脂質
Figure 2023516676000040
 または、その薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含み、式中、Ｒ５及びＲ６は各々独立して、直鎖または分枝Ｃ１－Ｃ３１アルキル、Ｃ２－Ｃ３１アルケニル、またはＣ２－Ｃ３１アルキニル及びコレステリルからなる群から選択され；Ｌ５及びＬ６は各々独立して、直鎖Ｃ１－Ｃ２０アルキル及びＣ２－Ｃ２０アルケニルからなる群から選択され；Ｘ５は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成されるか、または、－ＯＣ（Ｏ）－であり、これにより－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ６が形成され；Ｘ６は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成されるか、または、－ＯＣ（Ｏ）－であり、これにより－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ５が形成され；Ｘ７はＳまたはＯであり；Ｌ７は存在しないか低級アルキルであり；Ｒ４は直鎖または分枝Ｃ１－Ｃ６アルキルであり；Ｒ７及びＲ８は各々独立して、水素及び直鎖または分枝Ｃ１－Ｃ６アルキルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｘ７は、Ｓである。
いくつかの実施形態では、Ｘ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成され、Ｘ６は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成される。
いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ８は各々独立して、メチル、エチル、及びイソプロピルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｌ５及びＬ６は各々独立して、Ｃ１－Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、Ｌ６は、Ｃ１－Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、Ｃ１－Ｃ２アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ５及びＬ６は各々、直鎖Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ５及びＬ６は各々、直鎖Ｃ９アルキルである。
いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々独立して、アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、Ｃ２－Ｃ９アルケニルである。いくつかの実施形態では、アルケニルは、単一の二重結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々、アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、分枝アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々独立して、Ｃ９アルキル、Ｃ９アルケニル、及びＣ９アルキニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々独立して、Ｃ１１アルキル、Ｃ１１アルケニル、及びＣ１１アルキニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々独立して、Ｃ７アルキル、Ｃ７アルケニル、及びＣ７アルキニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）２または－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）（（ＣＨ２）ｐ－１ＣＨ３）［式中、ｐは４～８である。］である。いくつかの実施形態では、ｐは、５であり、Ｌ５は、Ｃ１－Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、ｐは、６であり、Ｌ５は、Ｃ３である。いくつかの実施形態では、ｐは、７である。いくつかの実施形態では、ｐは、８であり、Ｌ５はＣ１－Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）（（ＣＨ２）ｐ－１ＣＨ３）［式中、ｐは７または８である。］である。
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、エチレンまたはプロピレンである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ｎ－プロピレンまたはイソブチレンである。
いくつかの実施形態では、Ｌ７は、不在であり、Ｒ４は、エチレンであり、Ｘ７は、Ｓであり、Ｒ７及びＲ８は各々、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、不在であり、Ｒ４は、ｎ－プロピレンであり、Ｘ７は、Ｓであり、Ｒ７及びＲ８は各々、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、不在であり、Ｒ４は、エチレンであり、Ｘ７は、Ｓであり、Ｒ７及びＲ８は各々、エチルである。
いくつかの実施形態では、Ｘ７は、Ｓであり、Ｘ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成され、Ｘ６は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成され、Ｌ５及びＬ６は各々独立して、直鎖Ｃ３－Ｃ７アルキルであり、Ｌ７は、不在であり、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）２であり、Ｒ６は、Ｃ７－Ｃ１２アルケニルである。いくつかのさらなる実施形態では、ｐは、６であり、Ｒ６は、Ｃ９アルケニルである。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、
Figure 2023516676000041
Figure 2023516676000042
Figure 2023516676000043
Figure 2023516676000044
Figure 2023516676000045
Figure 2023516676000046
Figure 2023516676000047
Figure 2023516676000048
Figure 2023516676000049
 からなる群から選択されるイオン化可能なカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、ＬＩＰＩＤ＃１～ＬＩＰＩＤ＃８からなる群から選択される、イオン化可能なカチオン性脂質を含むことができる：
Figure 2023516676000050
Figure 2023516676000051
Figure 2023516676000052
いくつかの実施形態では、脂質製剤は、
Figure 2023516676000053
 から選択される構造を有するイオン化可能なカチオン性脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの好ましい実施形態では、脂質製剤は、構造
Figure 2023516676000054
 を有するイオン化可能なカチオン性脂質、またはその薬学的に許容される塩を含む。
本明細書で列挙する任意の１種以上の脂質を、明示的に除外することができる。
ヘルパー脂質及びステロール
本開示のｍＲＮＡ－脂質製剤は、ヘルパー脂質を含むことができ、これは、中性ヘルパー脂質、非カチオン性脂質、非カチオン性ヘルパー脂質、アニオン性脂質、アニオン性ヘルパー脂質、または中性脂質とも呼ぶことができる。脂質製剤、特にカチオン性リポソーム及び脂質ナノ粒子は、ヘルパー脂質が製剤中に存在する場合、細胞取り込みが増加することが発見されている。（Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．２０１４；１５（９）：８８２－９２）。例えば、いくつかの研究では、カチオン性脂質よりも膜融合性である（即ち、融合を容易にする）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジ－オレオイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及び、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）などの、中性及び双性イオン脂質が、脂質－核酸複合体の多型の形質に影響を及ぼすことができ、ラメラの六方晶相への転移を促進し、故に、融合、及び細胞膜の破壊を誘発することが示されている。（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１４ Ｊａｎ；９（１）：１０５－２０）。加えて、ヘルパー脂質を使用することで、毒性及び免疫原性といった、多くの効果的なカチオン性脂質を用いることによる任意の潜在的な有害作用を減らすのに役立つことができる。
本開示の脂質製剤に好適な非カチオン性脂質の非限定例としては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチド酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びこれらの混合物などのリン脂質が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンのリン脂質も使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０－Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレイルに由来するアシル基である。
非カチオン性脂質のさらなる例としては、コレステロールなどのステロール、及びその誘導体が挙げられる。ある研究では、ヘルパー脂質として、コレステロールは、核酸と相互作用する脂質層の帯電の間隔を広げ、電荷分布が、核酸の電荷分布とより密接に一致するようにすると結論づけられている。（Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．２０１２ Ｍａｒ ７；９（６８）：５４８－５６１）。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、５α－コレスタノール、５α－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノールなどの極性類似体；５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５α－コレスタノン、及びコレステリルデカノエートなどの非極性類似体；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルなどの極性類似体である。
いくつかの実施形態では、脂質製剤に存在するヘルパー脂質は、１種以上のリン脂質と、コレステロールまたはその誘導体との混合物を含むか、またはこれからなる。他の実施形態では、脂質製剤に存在する中性脂質は、１種以上のリン脂質、例えば、コレステロール非含有脂質製剤を含むか、またはこれからなる。さらに他の実施形態では、脂質製剤に存在する中性脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、リン脂質非含有脂質製剤を含むか、またはこれからなる。
ヘルパー脂質の他の例としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル系ポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリール硫酸ポリエチルオキシ化脂肪酸アミド、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム、セラミド、及びスフィンゴミエリンなどの脂質を含有する無リンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、脂質製剤に存在する全脂質の、約２ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約３ｍｏｌ％～約１８ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％～約１６ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１４ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、または、約２ｍｏｌ％、約３ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％、約９ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、約１１ｍｏｌ％、もしくは約１２ｍｏｌ％（またはこれらの任意の端数もしくはこれらの中の範囲）を占める。
脂質製剤中のコレステロールまたはコレステロール誘導体は、脂質製剤に存在する全脂質の、最大約４０ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％、または約６０ｍｏｌ％を占め得る。いくつかの実施形態では、コレステロールまたはコレステロール誘導体は、脂質製剤に存在する全脂質の、約１５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、もしくは約２８ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、または、約２５ｍｏｌ％、約２６ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％、約２８ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、約３６ｍｏｌ％、もしくは約３７ｍｏｌ％を占める。
いくつかの実施形態では、混合物中のリン脂質成分は、脂質製剤に存在する全脂質の、約２ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約３ｍｏｌ％～約１８ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％～約１６ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１４ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、または、約２ｍｏｌ％、約３ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％、約９ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、約１１ｍｏｌ％、もしくは約１２ｍｏｌ％（またはこれらの任意の端数もしくはこれらの中の範囲）を占め得る。
脂質製剤中に存在するヘルパー脂質の割合は目標量であり、製剤中に存在するヘルパー脂質の実際の量は、例えば、±５ｍｏｌ％変化し得る。
カチオン性脂質化合物またはイオン化可能なカチオン性脂質化合物を含有する脂質製剤は、モル基準で、約３０～７０％のカチオン性脂質化合物、約２５～４０％のコレステロール、約２～１５％のヘルパー脂質、及び、約０．５～５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質であり得、割合は、製剤中に存在する全脂質に対するものである。いくつかの実施形態では、組成物は、約４０～６５％のカチオン性脂質化合物、約２５～３５％のコレステロール、約３～９％のヘルパー脂質、及び、約０．５～３％のＰＥＧ脂質で構成され、割合は、製剤中に存在する全脂質に対するものである。
製剤は、例えば、８～３０％の核酸、５～３０％のヘルパー脂質、及び０～２０％のコレステロール；４～２５％のカチオン性脂質、４～２５％のヘルパー脂質、２～２５％のコレステロール、１０～３５％のコレステロール－ＰＥＧ、及び５％のコレステロール－アミン；または２～３０％のカチオン性脂質、２～３０％のヘルパー脂質、１～１５％のコレステロール、２～３５％のコレステロール－ＰＥＧ、及び１～２０％のコレステロール－アミン；または最大９０％のカチオン性脂質及び２～１０％のヘルパー脂質、またはさらには１００％のカチオン性脂質を含有する脂質粒子製剤であり得る。
脂質複合体
本明細書に記載する脂質製剤は、脂質複合体をさらに含むことができる。複合脂質は、粒子の凝集を防止するという点で有用である。好適な複合脂質としては、ＰＥＧ－脂質複合体、カチオン性ポリマー－脂質複合体、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、脂質送達ビヒクルを、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物）を、その表面、または、結合したＰＥＧ鎖の末端に結合させることによる特異的標的化に使用することができる（Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５ Ｄｅｃ １；６：２８６）。
好ましい実施形態では、脂質複合体はＰＥＧ脂質である。ＰＥＧ化と呼ばれる技術である、コーティングまたは表面リガンドとして、脂質製剤にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含めることにより、ナノ粒子を免疫系から保護し、ＲＥＳの取り込みから逃れるのに役立つ（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１１ Ｊｕｎ；６（４）：７１５－２８）。ＰＥＧ化は、脂質製剤及びそのペイロードを、物理的、化学的、及び生物学的メカニズムにより安定化させるために、幅広く使用されている。洗剤のようなＰＥＧ脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）は、脂質製剤の中に入って、表面に水和層及び立体バリアを形成することができる。ＰＥＧ化の程度に基づき、表面層は一般に、２つの種類、即ち、ブラシ様の層と、マッシュルーム様の層に分けることができる。ＰＥＧ－ＤＳＰＥ安定化製剤に関して、ＰＥＧは、低度のＰＥＧ化（通常、５ｍｏｌ％未満）で、マッシュルームコンフォメーションを取り、ＰＥＧ－ＤＳＰＥの含有量が、一定レベルを超えて増加するにつれ、ブラシコンフォメーションに移る（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１；２０１１：１２）。ＰＥＧ化の増加により、脂質製剤の循環半減期の著しい増加がもたらされることが示されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２０１１ Ａｕｇ １５；１３（）：５０７－３０；Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１０ Ａｕｇ ３；１４５（３）：１７８－８１）。
ＰＥＧ脂質の適当な例としては、ジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＡ）、ジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミンなどリン脂質に結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＰＥ）、セラミドに複合されたＰＥＧ、コレステロールに複合されたＰＥＧ、またはその誘導体、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンＰＥＧ反復単位の直鎖水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、それらの分子量によって分類され、以下を含む：モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ－ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－アミン（ＭｅＰＥＧ－ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール－トレシレート（ＭｅＰＥＧ－ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－イミダゾリル－カルボニル（ＭｅＰＥＧ－ＩＭ）、ならびに末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシル基を含有する化合物（例えば、ＨＯ－ＰＥＧ－Ｓ、ＨＯ－ＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ、ＨＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２）。
本明細書に記載するＰＥＧ－脂質複合体のＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を含んでよい。特定の場合には、ＰＥＧ部分は、約７５０ダルトン～約５，０００ダルトン（例えば約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約２，０００ダルトン）の平均分子量を有する。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。平均分子量は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値または部分値であってよい。
ある特定の場合では、ＰＥＧは、所望により、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリール基によって置換され得る。ＰＥＧは、脂質に直接複合され得るか、またはリンカー部分を介して脂質に連結され得る。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧを脂質に結合するのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。好ましい実施形態では、リンカー部分は、非エステル含有リンカー部分である。好適な非エステル含有リンカー部分としては、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、アミノ（－ＮＲ－）、カルボニル（－Ｃ（Ｏ）－）、カルバメート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、スクシニル（－（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）、スクシンアミジル（－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、エーテル、ならびにこれらの組み合わせ（カルバメートリンカー部分及びアミドリンカー部分の両方を含有するリンカーなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、カルバメートリンカーを使用してＰＥＧを脂質に結合する。
他の実施形態では、エステル含有リンカー部分は、ＰＥＧを脂質に結合するために使用される。好適なエステル含有リンカー部分としては、例えば、カーボネート（－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－）、スクシノイル、リン酸エステル（－Ｏ－（Ｏ）ＰＯＨ－Ｏ－）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
様々な鎖長及び飽和度の様々なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンをＰＥＧに複合させて、脂質複合体を形成することができる。そのようなホスファチジルエタノールアミンは市販されているか、または当業者に既知の従来の技術を使用して単離または合成することができる。Ｃ１０～Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有する飽和または不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンが好ましい。モノ－またはジ－不飽和脂肪酸を有するホスファチジルエタノールアミン、ならびに飽和及び不飽和脂肪酸の混合物も使用することができる。好適なホスファチジルエタノールアミンとしては、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体である。これらの実施形態では、ＰＥＧは、好ましくは、７５０または２，０００ダルトンの平均分子量を有する。特定の実施形態では、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基は、メチル基で置換される。
前述に加えて、ＰＥＧの代わりに他の親水性ポリマーを使用することができる。ＰＥＧの代わりに使用することができる好適なポリマーの例としては、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド及びポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、脂質複合体（例えば、ＰＥＧ脂質）は、脂質製剤に存在する全脂質の、約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、または約１．４ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％（またはこれらの任意の端数もしくはこれらの中の範囲）を占める。他の実施形態では、脂質複合体（例えば、ＰＥＧ脂質）は、脂質製剤に存在する全脂質の、約０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、または５％（またはこれらの任意の端数もしくはこれらの中の範囲）を占める。量は、端点を含む、列挙した範囲内の任意の値または部分値であってよい。
本開示の脂質製剤中に存在する脂質複合体（例えば、ＰＥＧ脂質）の割合は目標量であり、製剤中に存在する脂質複合体の実際の量は、例えば±０．５ｍｏｌ％変化してよい。用いる脂質複合体に応じ、かつ脂質製剤が膜融合性に変化する速度に応じて、脂質複合体の濃度は変化し得ることを当業者は理解するであろう。
脂質製剤の細胞取り込みの作用機序
核酸、特にリポソーム、カチオン性リポソーム、及び脂質ナノ粒子の細胞内送達のための脂質製剤は、標的細胞のエンドサイトーシスメカニズムを利用する標的細胞の浸透による細胞取り込みのために設計され、一定量の脂質送達ビヒクルが、標的細胞の細胞質基質に送達される。（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２８（３）：１４６－１５７，２０１８）。具体的には、本明細書に記載するオルニチントランスカルバミラーゼｍＲＮＡ－脂質製剤の場合、ｍＲＮＡ－脂質製剤は、Ａｐｏ－Ｅ受容体が媒介するエンドサイトーシスにより、肝臓内の肝細胞に侵入する。エンドサイトーシスの前に、脂質送達ビヒクルの表面において、ＰＥＧ脂質などの官能性リガンドが表面から脱落し、これにより、標的細胞への内部化が引き起こされる。エンドサイトーシスの間に、細胞の原形質膜のいくつかの部分がベクターを取り囲み、ベクターを小胞内に取り込み、その後、細胞膜から取り出され、細胞質基質に入り、最終的に、エンドリソソーム経路を通過する。イオン化可能なカチオン性脂質を含有する送達ビヒクルに関して、エンドソームが進むにつれて酸性度が増加することにより、表面に強力な正電荷を有するビヒクルが得られる。次に、送達ビヒクルとエンドソーム膜との相互作用により、ペイロードのサイトゾル送達をもたらす、膜機能事象がもたらされる。ｍＲＮＡペイロードに関して、細胞自身の内部翻訳プロセスが次いで、ｍＲＮＡを、コードされたタンパク質に翻訳する。コードされたタンパク質は次に、細胞内での標的化細胞器官または位置への運搬を含む、翻訳後処理をさらに受けることができる。ＯＴＣタンパク質の場合、ＯＴＣタンパク質は、ミトコンドリアに運搬される。
脂質複合体の組成及び濃度を制御することで、脂質複合体が脂質製剤から交換される速度、及び、結果的に、脂質製剤が膜融合性となる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質製剤が膜融合性となる速度を変化させる、及び／または制御することができる。脂質製剤が膜融合性となる速度を制御することができる他の方法は、本開示を読むことで当業者に明らかとなろう。また、脂質複合体の組成及び濃度を制御することで、リポソームまたは脂質粒径を制御することができる。
脂質製剤の製造
核酸を含む脂質製剤の、多くの異なる調製方法が存在する（Ｃｕｒｒ．ＤｒｕｇＭｅｔａｂｏｌ．２０１４，１５，８８２－８９２；Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ２０１４，１７７，８－１８；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｔｕｄ．Ｒｅｓ．２０１２，３，１４－２０）。薄膜水和、二重エマルション、逆相蒸発、マイクロ流体調製、二重非対称遠心分離、エタノール注入、洗剤透析、エタノール希釈による自発的小胞形成、及び、予形成されたリポソームへの封入の技術を、本明細書で簡潔に記載する。
薄膜水和
薄膜水和（ＴＦＨ）またはＢａｎｇｈａｍ法では、脂質を有機溶媒に溶解した後、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させ、薄い脂質層を形成する。ロードされる化合物を含有する水性緩衝液溶液による層水和の後、マルチラメラベシクル（ＭＬＶ）が形成され、膜を通す押出成形、または、開始ＭＬＶの超音波処理により、サイズを小さくして、小型または大型ユニラメラベシクル（ＬＵＶ及びＳＵＶ）を作製することができる。
二重エマルション
二重エマルション技術によってもまた脂質製剤を形成可能であり、これには、水／有機溶媒混合物中での、脂質の溶解が伴う。水滴を含有する有機溶液を過剰の水性媒体と混合して、水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）二重エマルションが形成される。激しい機械的振盪の後、水滴の一部が崩壊し、大型ユニラメラベシクル（ＬＵＶ）が得られる。
逆相蒸発
逆相蒸発（ＲＥＶ）法によってもまた、核酸と共にロードされるＬＵＶの実現が可能となる。本技術では、リン脂質を、有機溶媒及び水性緩衝液に溶解することで、２相系を形成する。次に、得られた懸濁液を、混合物が透明な１相分散体となるまで、簡便に超音波処理する。減圧下にて有機溶媒を蒸発させた後で、脂質製剤が得られる。本方法は、核酸を含む異なる大型及び小型親水性分子を封入するために使用されている。
マイクロ流体の調製
他のバルク技術とは異なり、マイクロ流体法は、脂質水和プロセス制御の可能性をもたらす。本方法は、流れを操作する方法に従って、連続流マイクロ流体型及び液滴ベースマイクロ流体型に分類することができる。連続流モードで操作を行う、マイクロ流体流体力学フォーカス（ＭＨＦ）法では、脂質はイソプロピルアルコールに溶解され、本方法では、２つの水性緩衝液の流れのマイクロチャネル交差接合部に、流体力学的に焦点を当てる。小胞サイズは流速を制御することで、故に、脂質溶液／緩衝液希釈プロセスを制御することで制御することができる。３つの入口と、１つの出口とで構成されるマイクロ流体デバイスを使用することにより、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）脂質製剤の作製方法を使用することができる。
二重非対称遠心分離
二重非対称遠心分離（ＤＡＣ）は、自身の縦軸を中心にしたさらなる回転を利用するため、より一般的な遠心分離とは異なる。効率的な均質化が、２つの重なり合った移動が生み出されることで実現される。試料は、通常の遠心分離器と同じように外に押し出された後、さらなる回転により、バイアルの中心に向かって押される。脂質とＮａＣｌ溶液を混合することで、粘稠な小胞リン脂質ゲル（ＶＰＣ）が得られ、これを次に希釈して、脂質製剤分散体を得る。脂質製剤のサイズは、ＤＡＣの速度、脂質濃度、及び均質化時間を最適化することにより制御することができる。
エタノール注入
エタノール注入（ＥＩ）法は、核酸封入に使用することができる。本方法は、エタノール性溶液の急速な注入をもたらし、脂質を、封入される核酸を含有する水性媒体に、針を使用することで溶解させる。小胞は、リン脂質が媒体全体に分散したときに、自然発生的に形成される。
洗剤透析
洗剤透析法を使用して、核酸を封入することができる。簡潔に述べると、脂質及びプラスミドを、適切なイオン強度の洗剤溶液に溶解し、透析により洗剤を取り除いた後で、安定した脂質製剤が形成される。次に、封入されていない核酸をイオン交換クロマトグラフィーにより取り除き、空の小胞をスクロース密度勾配遠心分離により取り除く。本技術は、カチオン性脂質の含有量、及び、透析緩衝液の塩濃度に非常に感度が高く、本方法はまた、規模を大きくするのも困難である。
エタノール希釈による自発的小胞形成
安定した脂質製剤は、段階的な、または滴下によるエタノール希釈が、エタノールに溶解した脂質を、核酸を含有する急速混合水性緩衝液に、制御しながら添加することにより、核酸がロードされた小胞の瞬間的な形成をもたらす、エタノール希釈法による自発的な小胞形成によってもまた作製することができる。
予形成されたリポソームへの封入
核酸の閉じ込めは、２つの異なる方法：（１）カチオン性リポソームを核酸と単純に混合して、「リポプレックス」と呼ばれる静電複合体を得ること（これらを上手く使用することで、細胞培養物をトランスフェクトすることができるが、低い封入効率及びインビボでの不十分な性能を特徴とする）、ならびに、（２）最大４０％の濃度まで、カチオン性小胞の懸濁液に無水エタノールをゆっくり添加した後、核酸を滴加して、ロードされた小胞を実現する、リポソーム脱安定化（しかし、封入プロセスを特徴とする、２つの主たるステップは感度が高すぎて、粒子のサイズが低下してしまう）により、予形成されたリポソームから始めることでもまた行うことができる。
ＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質製剤
本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）活性（ＯＴＣ ｍＲＮＡ）を有する酵素をコードするｍＲＮＡを含む脂質製剤を提供する。本開示のＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質製剤による、１つ以上の標的細胞のトランスフェクションの後で、そのようなｍＲＮＡによりコードされたＯＴＣ酵素の発現が刺激され、そのような標的細胞がＯＴＣ酵素を発現する能力が増加する。ＯＴＣ ｍＲＮＡは、インビボでＯＴＣ酵素を発現させるための任意の好適なｍＲＮＡであることができる。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡは、配列番号４のＯＴＣ酵素を含む、細胞分解に対する増加したインビボ安定性、及び／または増加したミトコンドリア取り込みを有するように組み換えられた、修飾ＯＴＣ酵素をコードする。
第１のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤においては、ＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤は、式（Ｉ）の化合物、及び、ＯＴＣ活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３に９５％の同一性を有する配列からなるＯＴＣ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３からなるＯＴＣ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４に９５％の同一性を有する配列からなるＯＴＣ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４からなるＯＴＣ酵素をコードする。式Ｉの化合物は、その親油性、潜在能、特定の標的細胞に対する選択性、インビボ生分解性、毒性及び免疫原性プロファイル、及び、式（Ｉ）の化合物のイオン化可能／プロトン化可能な基のｐＫａを含む望ましい性質に基づき選択することができる。
第１のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいくつかの実施形態では、Ｘ７はＳである。いくつかの実施形態では、Ｘ５は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成され、Ｘ６は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成される。いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ８は各々独立して、メチル、エチル、及びイソプロピルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｌ５及びＬ６は各々独立して、Ｃ１－Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ５は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、Ｌ６は、Ｃ１－Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ６は、Ｃ１－Ｃ２アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ５及びＬ６は各々、直鎖Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ５及びＬ６は各々、直鎖Ｃ９アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々独立して、アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、Ｃ２－Ｃ９アルケニルである。いくつかの実施形態では、アルケニルは、単一の二重結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々、アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、分枝アルカンである。いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々独立して、Ｃ９アルキル、Ｃ９アルケニル、及びＣ９アルキニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々独立して、Ｃ１１アルキル、Ｃ１１アルケニル、及びＣ１１アルキニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ５及びＲ６は各々独立して、Ｃ７アルキル、Ｃ７アルケニル、及びＣ７アルキニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）２または－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）（（ＣＨ２）ｐ－１ＣＨ３）［式中、ｐは４～８である。］である。いくつかの実施形態では、ｐは、５であり、Ｌ５は、Ｃ１－Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、ｐは、６であり、Ｌ５は、Ｃ３である。いくつかの実施形態では、ｐは、７である。いくつかの実施形態では、ｐは、８であり、Ｌ５はＣ１－Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）（（ＣＨ２）ｐ－１ＣＨ３）からなり、ｐは７または８である。いくつかの実施形態では、Ｒ４はエチレンまたはプロピレンである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、ｎ－プロピレンまたはイソブチレンである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、不在であり、Ｒ４は、エチレンであり、Ｘ７は、Ｓであり、Ｒ７及びＲ８は各々、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、不在であり、Ｒ４は、ｎ－プロピレンであり、Ｘ７は、Ｓであり、Ｒ７及びＲ８は各々、メチルである。いくつかの実施形態では、Ｌ７は、不在であり、Ｒ４は、エチレンであり、Ｘ７は、Ｓであり、Ｒ７及びＲ８は各々、エチルである。
第１のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいくつかの実施形態では、Ｘ７は、Ｓであり、Ｘ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ６が形成され、Ｘ６は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、これにより－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ５が形成され、Ｌ５及びＬ６は各々独立して、直鎖Ｃ３－Ｃ７アルキルであり、Ｌ７は、不在であり、Ｒ５は、－ＣＨ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）２であり、Ｒ６は、Ｃ７－Ｃ１２アルケニルである。
いくつかのさらなる実施形態では、ｐは、６であり、Ｒ６は、Ｃ９アルケニルである。
ＯＴＣ活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡは、本開示の第１のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤に含めるのに好適である。いくつかの実施形態では、適当なｍＲＮＡは、配列番号３の配列の野生型ヒトＯＴＣ ｍＲＮＡである。ＯＴＣ ｍＲＮＡは、低い免疫原性、高いインビボ安定性、及び、高い翻訳効率を有するのが好ましい。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡはヒト肝細胞で発現可能である。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡは、コドン最適化されたコード領域を有する。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡは、修飾ウリジンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンヌクレオチドは、Ｎ１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンヌクレオチドは５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡは、本明細書に記載するＯＴＣ ｍＲＮＡコンストラクトのいずれかであることができる。
第１のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５４～２５８から選択されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦまたはコード領域）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５４の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５５の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５６の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５７の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５８の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約８５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９６％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９７％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９８％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９９．５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１、７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１から選択される配列を含む。
第１のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤の実施形態のいずれかでは、ＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤は、脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＯＴＣ ｍＲＮＡを完全に封入する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１００ｎｍ未満の平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５５～約８５ｎｍの平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの少なくとも約５０％を封入する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの少なくとも約８５％を封入する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約９０％を超える封入効率を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約９５％を超える封入効率を有する。
第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤においては、ＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤は、
Figure 2023516676000055
 から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、ならびに、ＯＴＣ活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡを含む。
ＯＴＣ活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡは、本開示の第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤に含めるのに好適である。いくつかの実施形態では、適当なｍＲＮＡは、配列番号３の野生型ヒトＯＴＣ ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３に９５％の同一性を有する配列からなるＯＴＣ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３からなるＯＴＣ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４に９５％の同一性を有する配列からなるＯＴＣ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４からなるＯＴＣ酵素をコードする。ＯＴＣ ｍＲＮＡは、低い免疫原性、高いインビボ安定性、及び、高い翻訳効率を有するのが好ましい。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡはヒト肝細胞で発現可能である。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡは、コドン最適化されたコード領域を有する。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡは、修飾ウリジンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンヌクレオチドは、Ｎ１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンヌクレオチドは５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ ｍＲＮＡは、本明細書に記載するＯＴＣ ｍＲＮＡコンストラクトのいずれかであることができる。
第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５４～２５８から選択されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦまたはコード領域）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５４の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５５の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５６の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５７の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号２５８の配列を有するＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約８５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９６％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９７％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９８％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列に約９９．５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１、７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１から選択される配列を含む。
第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤の実施形態のいずれかでは、ＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤は、脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＯＴＣ ｍＲＮＡを完全に封入する。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１００ｎｍ未満の平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５５ｎｍ～約８５ｎｍの平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの少なくとも約５０％を封入する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの少なくとも約８５％を封入する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約９０％を超える封入効率を有する。
いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかは、ヘルパー脂質をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、中性及びアニオン性脂質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。
いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかは、コレステロールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質複合体は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－ＤＭＧは、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧである。
いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかの脂質部分（製剤中での、脂質の総量を意味する）は、約４８ｍｏｌ％～約６６ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約２ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約２５～約４２ｍｏｌ％のコレステロール、及び、約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。
いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかの脂質部分は、約５５ｍｏｌ％～約６１ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約２９ｍｏｌ％～約３８ｍｏｌ％のコレステロール、及び、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。
いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかの脂質部分は、約５６ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約３１ｍｏｌ％～約３４ｍｏｌ％のコレステロール、及び、約１．２５ｍｏｌ％～約１．７５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む。
いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかは、約５０：１～約１０：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかは、約４０：１～約２０：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかは、約３５：１～約２５：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかは、約２８：１～約３２：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。いくつかの実施形態では、第１または第２のＯＴＣ ｍＲＮＡ－脂質製剤のいずれかは、約２９：１～約３１：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する。
薬学的組成物、及び治療方法
インビボでのｍＲＮＡの発現を容易にするために、本明細書に記載する核酸脂質製剤送達ビヒクルを、１種以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と、または、適当な賦形剤と混合される薬理学組成物中で、組み合わせることができる。薬剤の製剤及び投与技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎに見出すことができる。核酸脂質製剤は、本明細書に記載するＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤であるのが好ましい。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。本明細書で開示する薬学的組成物は、インビボでのＯＴＣ ｍＲＮＡの発現を促進するのが好ましい。
本開示の脂質製剤及び薬学的組成物を、対象の臨床状態、投与の部位及び方法、投与のスケジューリング、対象の年齢、性別、体重、ならびに、当該技術分野の臨床医に関する他の因子を考慮に入れて、現在の医事に従い投与及び服用することができる。本明細書での目的に関しての「有効量」とは、実験臨床研究、薬理学、臨床、及び医学技術分野における当業者に既知の、関係する考慮により決定することができる。いくつかの実施形態では、投与される量は、少なくともある程度の安定化、症状、及び、疾患進行の適切な指標として選択される他の指標の改善または除去、当業者による後退または改善を実現するのに効果的である。例えば、適当な量及び投与レジメンは、少なくとも一過性のタンパク質（例えば、酵素）産生を引き起こすものである。
いくつかの実施形態では、記載される薬学的組成物は全身投与される。適当な投与経路としては、例えば、経口、直腸、膣内、経粘膜、気管内もしくは吸引を含む肺、または腸投与；皮内、経皮（局所）、筋肉内、皮下、髄内注入、加えて、髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、または経鼻を含む非経口送達が挙げられる。特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋、及び心筋からなる群から選択される筋肉へのものである。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は静脈内投与される。いくつかの実施形態では、投与は、ｍＲＮＡの肝細胞（即ち、肝臓細胞）への送達をもたらす。いくつかの実施形態では、投与は、他の種類の肝臓細胞（例えば、星細胞など）よりも、肝細胞に対して選択性を示す。
薬学的組成物は、任意の所望の組織に投与することができる。いくつかの実施形態では、送達されるＯＴＣ ｍＲＮＡは、脂質製剤または薬学的組成物が投与された組織とは異なる組織で発現する。好ましい実施形態においてＯＴＣ ｍＲＮＡは肝臓に送達され、肝臓で発現する。
本明細書で開示する薬学的組成物は、１種以上の賦形剤を使用して製剤化され、（１）安定性を増加させ、（２）細胞トランスフェクションを増加させ、（３）（例えば、ポリヌクレオチド、一次コンストラクト、もしくはｍＲＮＡのデポー製剤からの）持続性もしくは遅延放出を可能にし、（４）生体内分布を変化させ（例えば、ポリヌクレオチド、一次コンストラクト、もしくはｍＲＮＡを、特定の組織もしくは細胞型に標的させ）、（５）インビボでコードされたタンパク質の翻訳を増加させ、及び／または、（６）インビボでコードされたタンパク質の放出プロファイルを変化させることができる。
本明細書で記載する薬学的組成物は、薬理学の技術分野で開発された既知の、または以下で述べる、任意の方法により調製することができる。一般に、このような予備的方法は、活性成分（即ち、核酸）を、賦形剤及び／または１種以上の他の副成分と会合させるステップを含む。本開示による薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／または複数の単一単位用量として調製、梱包、及び／または販売され得る。
薬学的組成物としては、本明細書で使用されるように、所望の特定の投薬形態に適するように、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤など、またはそれらを含む薬学的に許容される賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。
ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤などの、従来の賦形剤に加えて、本開示の賦形剤としては、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、一次ＤＮＡコンストラクトをトランスフェクトした細胞、または、ｍＲＮＡ（例えば、対象への移植用の）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、本明細書で記載する薬学的組成物は、それぞれ、互いに、脂質製剤中の核酸の安定性を増加させる、核酸による細胞トランスフェクションを増加させる、コードされたタンパク質の発現を増加させる、及び／または、コードされたタンパク質の放出プロファイルを変化させる量で、１種以上の賦形剤を含むことができる。さらに、本開示のｍＲＮＡは、自己集合核酸ナノ粒子を使用して製剤化することができる。
薬学的組成物を製剤化するための様々な賦形剤、及び、組成物を調製するための技術は、当技術分野において既知である（その全体が本明細書に参照により組み込まれている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２００６を参照されたい）。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的作用をもたらす、ないしは別の方法で薬学的組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様式で相互作用することなどにより、物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、従来の賦形剤媒体の使用は、本開示の実施形態の範囲内であると想到することができる。
本開示の組成物の剤形は固体であることができ、これは、投与前に液体中で再構成することができる。固体は粉末として投与することができる。固体はカプセル、錠剤、またはゲルの形態であることができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥されている核酸脂質製剤を含む。
好ましい実施形態では、本明細書で記載する薬学的組成物の剤形は、本明細書に記載するＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の液体懸濁液であることができる。いくつかの実施形態では、液体懸濁液は、緩衝化溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、緩衝化溶液は、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、及びトリスからなる群から選択される緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は約７．４のｐＨを有する。いくつかの好ましい実施形態では、緩衝液はＨＥＰＥＳである。いくつかのさらなる実施形態では、緩衝化溶液は、凍結保護剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、糖及びグリセロール、または、糖とグリセロールの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、糖は二量体糖である。いくつかの実施形態では、糖はスクロースである。いくつかの好ましい実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、スクロース、及びグリセロールを、７．４のｐＨで含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は貯蔵中に凍結され、投与前に解凍される。いくつかの実施形態では、懸濁液は約７０℃未満の温度で凍結される。いくつかの実施形態では、懸濁液は、静脈内投与の間に、滅菌水で希釈される。いくつかの実施形態では、静脈内投与は、懸濁液を、約２体積～約６体積の滅菌水で希釈することを含む。いくつかの実施形態では、懸濁液は、約０．１ｍｇ～約３．０ｍｇのＯＴＣ ｍＲＮＡ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇのイオン化可能なカチオン性脂質、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約２．５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ脂質、約１．８ｍｇ／ｍＬ～約３．５ｍｇ／ｍＬのヘルパー脂質、約４．５ｍｇ／ｍＬ～約７．５ｍｇ／ｍＬのコレステロール、約７ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの緩衝液、約２．０ｍｇ／ｍＬ～約４．０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、約７０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び、約５０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬのグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥ＯＴＣ－ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤は、本明細書に記載するように、緩衝液に再懸濁することができる。
本開示の薬学的組成物は、例えばｐＨ調整及び緩衝剤、張度調整剤、及び湿潤剤などの、生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される担体として、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリル酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、及びこれらの混合物をさらに含有することができる。固体組成物に関して、従来の無毒性の薬学的に許容される担体を使用することができ、これらには例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
本開示の特定の実施形態では、ｍＲＮＡ－脂質製剤は、徐放性製剤中で、例えば、持続放出性ポリマーを含む組成物中で投与することができる。活性剤は、急激な放出から保護する担体、例えば、ポリマー、マイクロカプセル化デリバリーシステム、または生体接着剤ゲルなどの制御放出性ビヒクルを用いて調製することができる。本開示の各種組成物中での、ｍＲＮＡの持続性送達は組成物中に、吸収を遅らせる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムヒドロゲル及びゼラチンを含めることによりもたらされることができる。
組成物を対象に投与した後で、ｍＲＮＡによりコードされたタンパク質産生物（例えば、機能的ＯＴＣタンパク質または酵素）は、少なくとも約１～７日間、またはそれ以上の間、標的組織内で検出可能である。治療効果を実現するのに必要なタンパク質産生物の量は、治療されるオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症または他の疾患の深刻さ、及び、患者の状態に応じて変化するであろう。例えば、タンパク質産生物は標的組織中で、対象に組成物を投与した後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５日間、またはそれ以上の間、少なくとも約０．０２５～１．５μｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも約０．０５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．０７５μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．２μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．３μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．４μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．６μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．７μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．８μｇ／ｍＬ、少なくとも約０．９μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．１μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．２μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．３μｇ／ｍＬ、少なくとも約１．４μｇ／ｍＬ、または、少なくとも約１．５μｇ／ｍＬ）の濃度（例えば、治療濃度）で検出可能である。
いくつかの実施形態では、体重に対して、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５．０ｍｇ／ｋｇのＯＴＣ ｍＲＮＡ濃度を、単回用量で、または、単一治療サイクルの一部として投与するように、本開示の組成物を対象に投与する。いくつかの実施形態では、総量が少なくとも約０．１ｍｇ、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１．０ｍｇ、少なくとも約２．０ｍｇ、少なくとも約３．０ｍｇ、少なくとも約４．０ｍｇ、少なくとも約５．０ｍｇ、少なくとも約６．０ｍｇ、少なくとも約７．０ｍｇ、少なくとも約８．０ｍｇ、少なくとも約９．０ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約２０ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約３５ｍｇ、少なくとも約４０ｍｇ、少なくとも約４５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約５５ｍｇ、少なくとも約６０ｍｇ、少なくとも約６５ｍｇ、少なくとも約７０ｍｇ、少なくとも約７５ｍｇ、少なくとも約８０ｍｇ、少なくとも約８５ｍｇ、少なくとも約９０ｍｇ、少なくとも約９５ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約１０５ｍｇ、少なくとも約１１０ｍｇ、少なくとも約１１５ｍｇ、少なくとも約１２０ｍｇ、または、少なくとも約１２５ｍｇのＯＴＣ ｍＲＮＡを、最大で約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、または約５００ｍｇのＯＴＣ ｍＲＮＡの最大投与量で、１回以上の用量で投与するように、本開示の組成物を対象に投与する。
本開示の組成物及びポリヌクレオチドを使用して、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を患う、またはこれに罹りやすい対象を治療することができる。ＯＴＣは、肝臓でほぼ排他的に発現し、ミトコンドリアマトリックスへの取り込みの際に２つのステップで切断される、前駆体ＯＴＣタンパク質をコードするホモ三量体ミトコンドリア酵素である。（Ｈｏｒｗｉｃｈ Ａ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １９８６；４４：４５１－４５９）。ＯＴＣ欠損症は、変異及び生物学的に不活性の形態の酵素オルニチントランスカルバミラーゼを生み出す遺伝病である。ＯＴＣ欠損症は多くの場合、生まれて最初の数日間、典型的には、タンパク質摂取の後で明らかとなる。古典的な、深刻な形態のＯＴＣ欠損症において、生まれて最初の数日以内に、患者は嗜眠、痙攣、昏睡、及び深刻な高アンモニア血症を示し、これらはすぐに、適切な医学的介在が存在しない、悪化性及び致死性のアウトカムをもたらす。（Ｍｏｒｒｉｓｈ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｉａｎｓ；Ｒｅｍｅｄｉｃａ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００５））。不適切に治療される場合、または、未治療のままとなる場合、ＯＴＣ欠損症由来の合併症としては、成長の遅れ、及び、精神遅滞を含み得る。ＯＴＣ欠損性対象は、進行性の肝臓損傷、皮膚損傷、及び脆弱毛を示し得る。いくつかの罹患者では、ＯＴＣ欠損症の徴候及び症状はさほど深刻ではなく、人生の後期まで現れない場合がある。
バンドＸｐ２１．１の中のＸ染色体のショートアームに位置するＯＴＣ遺伝子は、８５ｋｂを超えてまたがり、１０６２個のアミノ酸をコードする１０個のエクソンで構成される。（参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｉｎｄｇｒｅｎ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８４；２２６：６９８７７００；Ｈｏｒｗｉｃｈ，Ａ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：１０６８－１０７４，１９８４；Ｈｏｒｗｉｃｈ，Ａ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４４：４５１－４５９，１９８６；Ｈａｔａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００：７１７－７２５，１９８６）。ＯＴＣ酵素は、オルニチン及びカルバモイルホスフェートの、シトルリンへの転換を触媒する。ＯＴＣはＸ染色体に存在するため、メスが主なキャリアである一方で、非保存的変異を有するオスは、生後７２時間を超えて生存することはめったにない。
いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物を、１ヶ月に１回、対象に投与する。いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物を、１ヶ月に２回、対象に投与する。いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物を、１ヶ月に３回、対象に投与する。いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物を、１ヶ月に４回、対象に投与する。
健常な対象においては、ＯＴＣは、肝細胞ミトコンドリアにてほぼ排他的に発現する。健常な対象の脳では発現しないものの、ＯＴＣ欠損症は神経障害をもたらす可能性がある。例えば、出現が不均一である、ＯＴＣ欠損症の通常の症状のうちの１つは、高アンモニア血症昏睡である（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｎ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｐａｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒａｌ ２００３；７：１１５－１２１．）。
ＯＴＣ欠損症は不均一であり、２００個を超える固有の変異が報告され、大部分の欠失は、全変異の約１０～１５％を占める一方で、残りは一般的に、より少数のナンセンス、スプライス部位、及び小さな欠失変異を伴うミスセンス点変異である。（Ｍｏｒｒｉｓｈ Ａ．，ｅｔ ａｌ．）。ＯＴＣ欠損症のフェノタイプ発現もまた、非常に不均一であり、新生児の急性高アンモニア血症昏睡から、無症候性ヘミ接合成人まで変動する可能性がある。（Ｇｏｒｄｏｎ Ｎ．Ｅｕｒ Ｊ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００３；７：１１５－１２１）。深刻で命を脅かす新生児疾患をもたらすこれらの変異は、酵素活性の部位、または鎖間表面にて、タンパク質の内部の重要な構造及び機能ドメインにてクラスター化する一方で、遅発性疾患と関連する変異は、タンパク質表面に位置する（Ｍｏｒｒｉｓｈ Ａ．，ｅｔ ａｌ．）。穏やか、または部分的な形態のＯＴＣ欠損症を患う患者は、人生の後期に疾患が開始する場合があり、これは、再発性嘔吐、神経挙動の変化、または、高アンモニア血症と関連する発作として現れ得る。
あるいは、本開示の組成物は、例えば、好ましくは、デポーまたは持続放出性製剤で、標的化組織に薬学的組成物を直接注入することにより、全身的にではなく局部的に投与することができる。局所送達は、標的化される組織に応じて、様々な方法で影響を受ける可能性がある。例えば、本開示の組成物を含有するエアロゾルを（経鼻、気管、または気管支送達のために）吸引することができ、本開示の組成物を、例えば、損傷、疾患発現、または疼痛の部位に注射することができ、組成物経口、気管、もしくは食道適用のために、ロゼンジ内に提供することができる、胃もしくは腸への投与のために液体、錠剤、もしくはカプセル形態で供給することができる、もしくは、直腸もしくは膣内適用のために座薬形態で供給することができる、またはさらに、クリーム、ドロップ、もしくはさらに、注射を用いることで、眼に送達することができる。治療用分子またはリガンドと複合した本開示の組成物を含有する製剤は、例えば、組成物を、移植部位から周囲の細胞に拡散させることができる、ポリマー、または他の構造物もしくは物質と共に、外科投与することも可能である。あるいは、これらは、ポリマーまたは支持体を使用することなく、外科的に適用することができる。
本開示に従うと、治療に有効な用量の、提供される組成物は、定期的に投与した場合、治療前のベースラインタンパク質発現または活性レベルと比較して、対象において、ＯＴＣタンパク質発現または活性レベルの増加をもたらす。通常、ＯＴＣタンパク質発現または活性レベルは、血液、血漿もしくは血清、尿、または固体組織抽出物などの、対象から入手した生体試料で測定される。ベースラインレベルは、治療前に速やかに測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する薬学的組成物を投与することで、治療前のベースラインレベルと比較して、生体試料（例えば、血漿／血清または尿）中での、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の、ＯＴＣタンパク質発現または活性レベルの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、または少なくとも約１５日間の、生体試料（例えば、血漿／血清または尿）中での、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の、ＯＴＣタンパク質発現または活性レベルの増加がもたらされる。
いくつかの実施形態では、治療に有効な用量の、提供される組成物は、定期的に投与した場合、治療前のベースラインシトルリン産生と比較して、対象でのシトルリン産生の増加をもたらす。通常、治療前または後のシトルリンレベルは、血液、血漿もしくは血清、尿、または固体組織抽出物などの、対象から入手した生体試料で測定することができる。いくつかの実施形態では、本開示に従った治療により、ベースラインシトルリンレベルと比較して、それぞれ、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、または３倍、生体試料（例えば、血漿、血清、または尿）での、シトルリンレベルの増加がもたらされる。
本開示に従うと、治療に有効な用量の、提供される組成物は、定期的に投与した場合、強度、重症度、もしくは頻度を含む、ＯＴＣ欠損症の少なくとも１つの症状もしくは形質の低下をもたらすか、または、症状の開始が遅れる。いくつかの実施形態では、治療に有効な用量の、提供される組成物は、定期的に投与した場合、治療前のベースラインオロチン酸レベルと比較して、対象でのオロチン酸レベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、治療に有効な用量の、提供される組成物は、定期的に投与した場合、治療前のベースラインアンモニアレベルと比較して、対象でのアンモニアレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、治療に有効な用量の、提供される組成物は、定期的に投与した場合、治療前のベースライングルタミンレベルと比較して、対象でのグルタミンレベルの低下をもたらす。
通常、治療前または後の、オロチン酸、アンモニア、またはグルタミンレベルは、血液、血漿、血清、尿、または固体組織抽出物などの、対象から入手した生体試料で測定することができる。ベースラインのオロチン酸、アンモニア、またはグルタミンレベルは、治療前に速やかに測定することができる。いくつかの実施形態では、本開示に従った治療により、それぞれ、ベースラインのオロチン酸、アンモニア、またはグルタミンレベルと比較して、対象から入手した生体試料（例えば、血液、血清、または尿）において、オロチン酸、アンモニア、またはグルタミンレベルの、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の低下がもたらされる。いくつかの実施形態では、治療に有効な用量の、提供される組成物は、定期的に投与した場合、約５００μｍｏｌ／Ｌ、４００μｍｏｌ／Ｌ、３００μｍｏｌ／Ｌ、２００μｍｏｌ／Ｌ、１５０μｍｏｌ／Ｌ、または１００μｍｏｌ／Ｌ未満までの、血漿アンモニアレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、治療に有効な用量の、提供される組成物は、定期的に投与した場合、約８００μｍｏｌ／Ｌ、７００μｍｏｌ／Ｌ、または６００μｍｏｌ／Ｌまでの、血漿グルタミンレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、治療に有効な用量の、提供される組成物は、定期的に投与した場合、約２０μｍｏｌ／ｍｍｏｌ未満のクレアチニン、１５μｍｏｌ／ｍｍｏｌ未満のクレアチニン、または１０μｍｏｌ／ｍｍｏｌのクレアチニンまでの、尿中のオロチン酸レベルの低下をもたらす。
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療前のベースラインレベルと比較して、対象の肝臓での、ＯＴＣタンパク質レベルの増加がもたらされる。典型的には、ベースラインレベルは、治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の、肝臓内でのＯＴＣタンパク質レベルの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療されていない対象の肝臓でのＯＴＣタンパク質レベルと比較して、肝臓でのＯＴＣタンパク質レベルの増加がもたらされる。
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療前のベースラインレベルと比較して、対象の肝臓細胞（例えば、肝細胞）内でのＯＴＣタンパク質レベルの増加がもたらされる。典型的には、ベースラインレベルは、治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の、肝臓細胞内でのＯＴＣタンパク質レベルの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療されていない対象の肝臓細胞でのＯＴＣタンパク質レベルと比較して、肝臓細胞でのＯＴＣタンパク質レベルの増加がもたらされる。
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療前のベースラインレベルと比較して、対象の血漿または血清での、ＯＴＣタンパク質レベルの増加がもたらされる。典型的には、ベースラインレベルは、治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の、血漿または血清内でのＯＴＣタンパク質レベルの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療されていない対象の血漿または血清でのＯＴＣタンパク質レベルと比較して、血漿または血清でのＯＴＣタンパク質レベルの増加がもたらされる。
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療前のベースラインレベルと比較して、対象由来の生体試料でのＯＴＣ酵素活性の増加がもたらされる。典型的には、ベースラインレベルは、治療の直前に測定する。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、及び組織試料（例えば、肝臓）が挙げられる。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の、ＯＴＣ酵素活性の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することで、治療されない対象におけるＯＴＣ酵素活性と比較して、ＯＴＣ酵素活性の増加がもたらされる。
いくつかの実施形態では、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素欠損症を有することが疑われる対象に、治療的介入を施す方法であって、上記対象において、ＯＴＣ酵素活性指標のレベルを測定することと、ＯＴＣ酵素指標がＯＴＣ酵素活性の欠損を示す場合に、上記対象に治療的介入を施すことと、を含む、上記方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は成人である。いくつかの実施形態では、対象はヒト新生児である。いくつかの実施形態では、治療的介入は、本明細書に記載する様々な実施形態のうちのいずれかに従い組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ酵素活性指標のレベルを測定することは、肝臓生検におけるＯＴＣ酵素レベルを測定すること、対象の血液試料における窒素レベルを測定すること、肝臓生検におけるシトルリンレベルを測定すること、及び、対象の尿試料におけるオロチン酸を測定することから選択される。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ酵素活性指標のレベルを測定することは、肝臓生検におけるＯＴＣ酵素レベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ酵素活性指標のレベルを測定することは、対象の血液試料における窒素レベルを測定することと、肝臓生検におけるシトルリンレベルを測定することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＯＴＣ酵素活性指標のレベルを測定することは、対象の尿試料におけるオロチン酸を測定することを含む。
いくつかの実施形態では、ＯＴＣ欠損症を患うと識別された対象における、ＯＴＣ欠損症の治療方法を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する方法は、対象に、本明細書で提供するいずれかの組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３の配列を含むＯＴＣ酵素が対象で発現する。いくつかの実施形態では、配列番号４の配列を含むＯＴＣ酵素が対象で発現する。
組み合わせ
本明細書に記載するＯＴＣ ｍＲＮＡ、その製剤、または、コードされたＯＴＣタンパク質を、１種以上の他の治療薬、予防薬、診断薬、または造影剤と組み合わせて使用することができる。「と組み合わせて」とは、当該薬剤が同時に投与されなければならず、及び／または、合わせての送達のために製剤化されなければならないことを示唆することを意図するものではないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内である。組成物は、１種以上の他の所望の治療薬または医療操作と同時、この前、またはこの後に、投与することができる。一般に、各薬剤はその薬剤について決定された用量及び／またはタイムスケジュールで投与することができる。本開示の治療方法は、生物学的利用能を改善し得、代謝を低下及び／または変更させ得、排泄を阻害し得、及び／または体内での分布を変更させ得る薬剤と組み合わせた、薬学的組成物、予防組成物、診断組成物、または造影組成物の送達を包含するのが好ましい。非限定例として、本明細書で開示するｍＲＮＡ、及び、好ましくは、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードする配列番号２５１を含むｍＲＮＡ配列を、ＯＴＣ欠損症の治療用医薬品と組み合わせて使用することができる。医薬品としては、フェニル酪酸ナトリウム、フェニル酪酸グリセロール（例えば、Ｒａｖｉｃｔｉ（登録商標）として流通している）、フェニル酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、アルギニン、シトルリン、複数のビタミン、カルシウムサプリメントのうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない、または、低タンパク質／高カロリー食事計画と組み合わせられる。一般に、本明細書にて開示するＯＴＣ ｍＲＮＡ及びその製剤と組み合わせて利用される薬剤は、個別に利用されるレベルを超えないレベルにて利用されると予想される。いくつかの実施形態では、組み合わせて利用されるレベルは、個別に利用されるレベルよりも低いであろう。一実施形態では、組み合わせはそれぞれ、または合わせて、当該技術分野において既知である分裂投与計画に従い投与することができる。
定義
本明細書の様々な箇所において、本開示の化合物の置換基を、群または範囲で開示する。本開示が、このような群及び範囲のメンバーのそれぞれ１つ１つの個別の部分的組み合わせを含むことが具体的に意図される。例えば、用語「Ｃ１－６アルキル」とは具体的に、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、及びＣ６アルキルを個別に開示することを意図している。
語句「組み合わせて投与される」、または「併用投与」とは、２種以上の薬剤が同時に、または、これらが患者に、各薬剤の効果の重なりが存在するような間隔で、対象に投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、薬剤は互いに、約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤の投与は、組み合わせ（例えば、相乗）効果がもたらされるように、共に十分に緊密な間隔となる。
本明細書で使用する場合、用語「動物」とは、動物界における任意の要素を意味する。いくつかの実施形態において、「動物」とは、任意の成長段階におけるヒトを意味する。いくつかの実施形態において、「動物」とは、任意の成長段階における非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び虫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組み換え動物、またはクローンである。
関心の１つ以上の値に適用される、用語「およそ」または「約」は、記述される参照値と類似する値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、別途記載のない限りまたは別途内容から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）、述べられた基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）において、列挙される値の±１０％の範囲を指す。
用語「と会合した」、「複合した」、「結合した」、「付着した」、及び「繋がれた」とは、２つ以上の部位に関して用いる場合、部位が、直接、または結合剤として機能する１つ以上の追加の部分を介してのいずれかで、互いに物理的に会合または接続し、十分安定した構造であって、その構造が用いられる条件、例えば生理学的条件下において、その部位が物理的に会合したままとなる構造を形成することを意味する。「会合」は、直接の共有化学結合による厳密なものである必要はない。「会合した」要素が物理的に会合したままとなる十分に安定した、イオンもしくは水素結合、またはハイブリダイゼーションをベースにした接続性もまた、示唆することができる。
特許請求の範囲において、「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」などの冠詞は、その反対が示されるか、または別途文脈から明白でない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または記載は、その反対が示されるか、または別途文脈から明白でない限り、１つ、２つ以上、または全ての群要素が、所与の製品または過程において存在するか、用いられるか、または別途関連している場合に、満たされると考えられる。本開示は、群の正確に１つの要素が、所与の製品または過程において存在するか、用いられるか、または別途関連している実施形態を含む。本開示は、２つ以上、または全ての群要素が、所与の製品または過程において存在するか、それらにおいて用いられるか、または別途それらに関連している実施形態を含む。
本明細書で使用する場合、用語「アシル」とは、本明細書に定義するように、カルボニル基を介して親分子基に結合した、本明細書に定義する水素またはアルキル基（例えば、ハロアルキル基）を表し、ホルミル（即ち、カルボキシアルデヒド基）、アセチル、トリフルオロアセチル、プロピオニル、ブタノイルなどにより例示される。例示的な非置換アシル基は、１～７、１～１１、または１～２１個の炭素を含む。いくつかの実施形態では、アルキル基は、本明細書に記載する１、２、３、または４個の置換基でさらに置換されている。
本明細書で使用する場合、用語「アルケニル」とは、特に明記されない限り、１つ以上の炭素－炭素二重結合を含有する２～２０個の炭素（例えば、２～６、または２～１０個の炭素）の、一価の直鎖または分枝基を表し、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニルなどにより例示される。アルケニルは、シス及びトランス異性体の両方を含む。アルケニル基は、本明細書で定義される、アミノ、アリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）から独立して選択される、１、２、３、または４個の置換基で、または、本明細書に記載する例示的なアルキル置換基のいずれかで、場合により置換されることができる。
用語「アルコキシ」とは、特に明記しない限り、式－ＯＲ［式中、ＲはＣ１－２０アルキル基（例えば、Ｃ１－６またはＣ１－１０アルキル）である。］の化学置換基を表す。例示的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えば、ｎ－プロポキシ及びイソプロポキシ）、ｔ－ブトキシなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、アルキル基を、本明細書で定義する１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシまたはアルコキシ）でさらに置換することができる。
用語「アルコキシアルキル」は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を表す。例示的な非置換アルコキシアルキル基は、２～４０個の炭素（例えば、２～１２、または２～２０個の炭素、例えば、Ｃ１－６アルコキシ－Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－１０アルコキシ－Ｃ１－１０アルキル、またはＣ１－２０アルコキシ－Ｃ１－２０アルキル）を含む。いくつかの実施形態では、アルキル及びアルコキシはそれぞれ、対応する基に関して、本明細書で定義する１、２、３、または４個の置換基でさらに置換されることができる。
本明細書で使用する場合、用語「アルコキシカルボニル」とは、カルボニル原子を介して親分子基に結合した、本明細書で定義するアルコキシ（例えば、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ［式中、ＲはＨ、または、Ｃ１－６、Ｃ１－１０、もしくはＣ１－２０アルキル基で場合により置換されている。］）を表す。例示的な非置換アルコキシカルボニルは、１～２１個の炭素（例えば、１～１１個、または１～７個の炭素）を含む。いくつかの実施形態では、アルコキシ基は、本明細書に記載する１、２、３、または４個の置換基でさらに置換されている。
本明細書で使用する場合、用語「アルコキシカルボニルアルキル」とは、本明細書で定義するアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義するアルキル基（例えば、－アルキル－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ［式中、Ｒは、Ｃ１－２０、Ｃ１－１０、またはＣ１－６アルキル基で場合により置換されている。］）を表す。例示的な非置換アルコキシカルボニルアルキルは、３～４１個の炭素（例えば、３～１０、３～１３、３～１７、３～２１、または３～２１個の炭素、例えば、Ｃ１－６アルコキシカルボニル－Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－１０アルコキシカルボニル－Ｃ１－１０アルキル、または、Ｃ１－２０アルコキシカルボニル－Ｃ１－２０アルキル）を含む。いくつかの実施形態では、各アルキル及びアルコキシ基は、本明細書に記載する１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに独立して置換される。
本明細書で使用する場合、用語「アルコキシカルボニルアルケニル」とは、本明細書で定義するアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書で定義するアルケニル基（例えば、－アルケニル－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ［式中、Ｒは、Ｃ１－２０、Ｃ１－１０、またはＣ１－６アルキル基で場合により置換されている。］）を表す。例示的な非置換アルコキシカルボニルアルケニルは、４～４１個の炭素（例えば、４～１０、４～１３、４～１７、４～２１、または４～３１個の炭素、例えば、Ｃ１－６アルコキシカルボニル－Ｃ２－６アルケニル、Ｃ１－１０アルコキシカルボニル－Ｃ２－１０アルケニル、またはＣ１－２０アルコキシカルボニル－Ｃ２－２０アルケニル）を含む。いくつかの実施形態では、各アルキル、アルケニル、及びアルコキシ基は、本明細書に記載する１、２、３、または４個の置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに独立して置換される。
本明細書で使用する場合、用語「アルキル」は、特に明記しない限り、１～２０個の炭素（例えば、１～１０、または１～６）由来の直鎖及び分枝鎖飽和基の両方を含む。アルキル基は、メチル、エチル、ｎ－及びイソプロピル、ｎ－、ｓｅｃ－、イソ、及びｔｅｒｔ－ブチル、ネオペンチルなどにより例示され、（１）Ｃ１－６アルコキシ；（２）Ｃ１－６アルキルスルフィニル；（３）本明細書で定義するアミノ（例えば、非置換アミノ（即ち、－ＮＨ２）または「置換された」アミノ（即ち、－Ｎ（ＲＮ１）２［式中、ＲＮ１は、アミノに関して定義されているとおりである。］）；（４）－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－アリール－Ｃ１－６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２－９－ヘテロシクリル）オキシ；（８）Ｏ－保護基で場合により置換されているヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１－７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）Ｏ－保護基で場合により置換されている－ＣＯ２ＲＡ’［式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル）、（ｂ）Ｃ２－２０アルケニル（例えば、Ｃ２－６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、（ｆ）アミノ－Ｃ１－２０アルキル、（ｇ）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、Ｒ’はＨまたはＣ１－２０アルキルである。］、ならびに、（ｈ）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ－ポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、各ＲＮ１は独立して、水素または場合により置換されたＣ１－６アルキルである。］からなる群から選択される。］；（１５）－Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’［式中、ＲＢ’及びＲＣ’は独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１－６アルキル、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリールからなる群から選択される。］；（１６）－ＳＯ２ＲＤ’［式中、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１－６アルキル、（ｂ）Ｃ６－１０アリール、（ｃ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、及び（ｄ）ヒドロキシからなる群から選択される。］；（１７）－ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’［式中、ＲＥ’及びＲＦ’のそれぞれは独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１－６アルキル、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリールからなる群から選択される。］；（１８）－Ｃ（Ｏ）ＲＧ’［式中、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル）、（ｂ）Ｃ２－２０アルケニル（例えば、Ｃ２－６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、（ｆ）アミノ－Ｃ１－２０アルキル、（ｇ）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、Ｒ’はＨまたはＣ１－２０アルキルである。］、ならびに、（ｈ）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ－ポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、各ＲＮ１は独立して、水素または場合により置換されたＣ１－６アルキルである。］からなる群から独立して選択される。］；（１９）－ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’［式中、ＲＨ’は、（ａ１）水素、及び（ｂ１）Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２－２０アルケニル（例えば、Ｃ２－６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６－１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、（ｆ２）アミノ－Ｃ１－２０アルキル、（ｇ２）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、Ｒ’はＨまたはＣ１－２０アルキルである。］、ならびに、（ｈ２）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ－ポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、各ＲＮ１は独立して、水素または場合により置換されたＣ１－６アルキルである。］からなる群から独立して選択される。］；（２０）－ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’［式中、ＲＪ’は、（ａ１）水素、及び（ｂ１）Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２－２０アルケニル（例えば、Ｃ２－６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６－１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、（ｆ２）アミノ－Ｃ１－２０アルキル、（ｇ２）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、Ｒ’はＨまたはＣ１－２０アルキルである。］、ならびに、（ｈ２）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ－ポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、各ＲＮ１は独立して、水素または場合により置換されたＣ１－６アルキルである。］からなる群から独立して選択される。］；ならびに（２１）アミジンからなる群から独立して選択される、１、２、３、または、２個の以上の炭素のアルキル基の場合は、４個の置換基で、場合により置換されることができる。いくつかの実施形態では、これらの基のそれぞれは、本明細書に記載するとおりにさらに置換されることができる。例えば、Ｃ１アルカリルのアルキル基をオキソ基でさらに置換し、対応するアリールオイル置換基を得ることができる。
用語「低級アルキル」とは、鎖内に１～６個の炭素を有する基を意味し、当該鎖は、直鎖または分枝であってよい。好適なアルキル基の非限定例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、及びヘキシルが挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「アルキルスルフィニル」とは、－Ｓ（Ｏ）－基を介して親分子基に結合したアルキル基を表す。例示的な非置換アルキル基は、１～６、１～１０、または１～２０個の炭素である。いくつかの実施形態では、アルキル基は、本明細書で定義するように、１、２、３、または４個の置換基でさらに置換することができる。
本明細書で使用する場合、用語「アルキルスルフィニルアルキル」とは、アルキルスルフィニル基により置換された、本明細書で定義するアルキル基を表す。例示的な非置換アルキルスルフィニルアルキル基は、２～１２、２～２０、または２～４０個の炭素である。いくつかの実施形態では、各アルキル基は、本明細書で定義するように、１、２、３、または４個の置換基でさらに置換することができる。
本明細書で使用する場合、用語「アルキニル」とは、炭素－炭素三重結合を含有する２～２０個の炭素原子（例えば、２～４、２～６、または２～１０個の炭素）による、一価の直鎖または分枝鎖基を表し、エチニル、１－プロピニルなどにより例示される。アルキニル基は、本明細書で定義される、アリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）から独立して選択される、１、２、３、または４個の置換基で、または、本明細書に記載する例示的なアルキル置換基のいずれかで、場合により置換されることができる。
本明細書で使用する場合、用語「アミノ」は、－Ｎ（ＲＮ１）２を表し、式中、各ＲＮ１は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ－保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリル、シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、カルボキシアルキル（例えば、場合により置換されたアリールアルコキシカルボニル基、または本明細書に記載する任意のものなどのＯ－保護基で場合により置換されている）、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、または、本明細書に記載する他のもの）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、場合により置換されたアリールアルコキシカルボニル基、または本明細書に記載する任意のものなどのＯ－保護基で場合により置換されている）、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、または、アルキルヘテロシクリル（例えば、アルキルへテロアリール）であり、式中、これらの列挙したＲＮ１基のそれぞれは、各基に関して本明細書で定義するように場合により置換されていることができるか、または、２つのＲＮ１は組み合わさり、ヘテロシクリルまたはＮ－保護基を形成し、式中、各ＲＮ２は独立して、Ｈ、アルキル、またはアリールである。本開示のアミノ基は、非置換アミノ（即ち、－ＮＨ２）、または置換アミノ（即ち、－Ｎ（Ｒ’）２）であることができる。好ましい実施形態では、アミノは－ＮＨ２または－ＮＨＲＮ１であり、式中、ＲＮ１は独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２ ２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、もしくは本明細書に記載する他のもの）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、ｔ－ブトキシカルボニルアルキル）、またはアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル）、またはＣ１－１０アリールである。
本明細書に記載する用語「アミノ酸」とは、側鎖を有する分子、アミノ基、及び酸基（例えば、－ＣＯ２Ｈのカルボキシ基、または－ＳＯ３Ｈのスルホ基）を意味し、アミノ酸は、側鎖、アミノ基、または酸基（例えば、側鎖）により、親分子基に結合する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、カルボニル基により親分子基に結合しており、側鎖またはアミノ基は、カルボニル基に結合している。例示的な側鎖としては、場合により置換されたアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルキルアリール、アルキルヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、及びカルボキシアルキルが挙げられる。例示的なアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシルノルバリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリシン、セレノシステイン、セリン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが挙げられる。アミノ酸基は、（１）Ｃ１－６アルコキシ；（２）Ｃ１－６アルキルスルフィニル；（３）本明細書で定義するアミノ（例えば、非置換アミノ（即ち、－ＮＨ２）または「置換された」アミノ（即ち、－Ｎ（ＲＮ１）２［式中、ＲＮ１は、アミノに関して定義されているとおりである。］）；（４）Ｃ６－１０アリール－Ｃ１－６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２－９－ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１－７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）－Ｃ（Ｏ）２ＲＡ’［式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル）、（ｂ）Ｃ２－２０アルケニル（例えば、Ｃ２－６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、（ｆ）アミノ－Ｃ１－２０アルキル、（ｇ）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、Ｒ’はＨまたはＣ１－２０アルキルである。］、ならびに、（ｈ）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ－ポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、各ＲＮ１は独立して、水素または場合により置換されたＣ１－６アルキルである。］からなる群から独立して選択される。］；（１５）－Ｃ（Ｏ）ＮＲＢＲＣ’［式中、ＲＢ’及びＲＣ’は独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１－６アルキル、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリールからなる群から選択される。］；（１６）－ＳＯ２ＲＤ’［式中、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１－６アルキル、（ｂ）Ｃ６－１０アリール、（ｃ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、及び（ｄ）ヒドロキシからなる群から選択される。］；（１７）－ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’［式中、ＲＥ’及びＲＦ’のそれぞれは独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１－６アルキル、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリールからなる群から選択される。］；（１８）－Ｃ（Ｏ）ＲＧ’［式中、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル）、（ｂ）Ｃ２－２０アルケニル（例えば、Ｃ２－６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、（ｆ）アミノ－Ｃ１－２０アルキル、（ｇ）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、Ｒ’はＨまたはＣ１－２０アルキルである。］、ならびに、（ｈ）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ－ポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、各ＲＮ１は独立して、水素または場合により置換されたＣ１－６アルキルである。］からなる群から独立して選択される。］；（１９）－ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’［式中、ＲＨ’は、（ａ１）水素、及び（ｂ１）Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２－２０アルケニル（例えば、Ｃ２－６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６－１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、（ｆ２）アミノ－Ｃ１－２０アルキル、（ｇ２）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、Ｒ’はＨまたはＣ１－２０アルキルである。］、ならびに、（ｈ２）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ－ポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、各ＲＮ１は独立して、水素または場合により置換されたＣ１－６アルキルである。］からなる群から独立して選択される。］；（２０）－ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’［式中、ＲＪ’は、（ａ１）水素、及び（ｂ１）Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２－２０アルケニル（例えば、Ｃ２－６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６－１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、（ｆ２）アミノ－Ｃ１－２０アルキル、（ｇ２）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’のポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、Ｒ’はＨまたはＣ１－２０アルキルである。］、ならびに、（ｈ２）－ＮＲＮ１（ＣＨ）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１のアミノ－ポリエチレングリコール［式中、ｓ１は１～１０の整数であり（例えば、１～６または１～４）、ｓ２及びｓ３のそれぞれは独立して、０～１０の整数であり（例えば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）、各ＲＮ１は独立して、水素または場合により置換されたＣ１－６アルキルである。］からなる群から独立して選択される。］；ならびにアミジンからなる群から独立して選択される、１、２、３、または、２個の以上の炭素のアミノ酸基の場合は、４個の置換基で、場合により置換されることができる。いくつかの実施形態では、これらの基のそれぞれは、本明細書に記載するとおりにさらに置換されることができる。
本明細書で使用する場合、用語「アミノアルコキシ」とは、本明細書で定義するアミノ基により置換された、本明細書で定義するアルコキシ基を表す。アルキル及びアミノはそれぞれ、対応する基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’［式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１－６アルキル、（ｂ）Ｃ６－１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、例えばカルボキシからなる群から選択される。］）に対して、本明細書に記載する１、２、３、または４個の置換基でさらに置換されることができる。
本明細書で使用する場合、用語「アミノアルキル」とは、本明細書で定義するアミノ基により置換された、本明細書で定義するアルキル基を表す。アルキル及びアミノはそれぞれ、対応する基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’［式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１－６アルキル、（ｂ）Ｃ６－１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、例えばカルボキシ、及び／またはＮ－保護基からなる群から選択される。］）に対して、本明細書に記載する１、２、３、または４個の置換基でさらに置換されることができる。
本明細書で使用する場合、用語「アミノアルケニル」とは、本明細書で定義するアミノ基により置換された、本明細書で定義するアルケニル基を表す。アルケニル及びアミノはそれぞれ、対応する基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’［式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１－６アルキル、（ｂ）Ｃ６－１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール、例えばカルボキシからなる群から選択される。］）に対して、本明細書に記載する１、２、３、または４個の置換基でさらに置換されることができる。
用語「アニオン性脂質」とは、生理的ｐＨにて負に帯電した脂質を意味する。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。
一続きの項目に先行する語句「のうちの少なくとも１つ」は、当該項目のいずれかに分離するための用語「及び」または「または」と共に、一覧を各要素（即ち、各項目）ではなく、一覧を全体として修飾する。語句「のうちの少なくとも１つ」は、列挙された各項目のうちの少なくとも１つの選択を必要としない。むしろ、この語句により、項目のいずれか１つのうちの少なくとも１つ、及び／または、項目の任意の組み合わせのうちの少なくとも１つ、及び／または、項目のそれぞれのうちの少なくとも１つを含む意味が可能となる。例として、語句「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つ」、または「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つ」はそれぞれ、Ａのみ、Ｂのみ、またはＣのみ；Ａ、Ｂ、及びＣの任意の組み合わせ；及び／または、Ａ、Ｂ、及びＣのそれぞれのうちの少なくとも１つを意味する。
用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「を有する」などは、明細書または特許請求の範囲で使用され、このような用語は、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が、特許請求の範囲の移行句で用いられる場合に解釈されるのと同様の様式で、包括的であることを意図する。
用語「例示的な」とは、本明細書では、「一例、一事例、または一図解としての役割を果たす」ことを意味するために使用される。本明細書に記載する任意の実施形態は、他の実施形態よりも好ましい、または有利であると、必ずしも解釈される必要はない。
単数形での要素への言及は、特に明記されない限り、「１つ、そして唯一」を意味するものとは意図されず、「１つ以上」を意味するものと意図される。男性形（例えば、「彼の」）という代名詞は、女性形及び中性形の性別（例えば、「彼女の」、及び「その」）を含み、逆もまた同様である。用語「いくつかの」は、１つ以上を指す。下線を付した、及び／または、イタリック体表記の見出し及び副見出しは便宜のためだけに用いられており、主題技術を限定するものではなく、主題技術の記載の解釈と関連して参照されるものではない。既知の、または、当業者に今後知られることになる本開示を通して記載した様々な構成の要素の、あらゆる構造的及び機能的等価物は、参照により明示的に本明細書に組み込まれており、主題技術により包含されることを意図する。さらに、本明細書で開示するものは、そのような開示が、上記記載にて明示的に列挙されているか否かにかかわらず、公に示されることを意図するものではない。
本明細書で使用する場合、用語「ボラニル」は、－Ｂ（ＲＢ１）３を表し、式中、各ＲＢ１は、Ｈ、及び、場合により置換されたアルキルからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、ボラニル基は、アルキルに関して本明細書で定義するように、１、２、３、または４個の置換基で置換されることができる。
用語「生体適合性の」とは、免疫系により損傷、毒性、または拒絶の危険性をほぼ、または全くもたらさず、生細胞、組織、臓器、または系と適合性があることを意味する。
用語「生分解性の」とは、生命体の作用により、破壊されて無毒生成物となることができることを意味する。
語句「生物学的に活性な」とは、生物学的系及び／または生命体内で活性を有する、任意の物質の特徴を意味する。例えば、生命体に投与する際に、その生命体に生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部が生物学的に活性である、または、生物学的に関係すると考えられる活性を模倣する場合であっても、生物学的に活性であると考えることができる。
用語「ボランホスフェート」は、当該技術分野において理解される従来の意味を有し、プロトン化、脱プロトン化、及びこれらの互変異性形態を含むことができる。例えば、化合物の文脈内におけるボランホスフェートは、構造
Figure 2023516676000056
 を有することができる。
本明細書で使用する場合、用語「炭素環式」及び「カルボシクリル」とは、芳香族または非芳香族であり得る環が炭素原子により形成される、場合により置換されたＣ３－１２単環式、二環式、または三環式構造を意味する。炭素環式構造としてはシクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリール基が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「カルバモイル」とは、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（ＲＮ１）２を表し、式中、各ＲＮ１の意味は、本明細書で提供する「アミノ」の定義で見出される。
本明細書で使用する場合、用語「カルバモイルアルキル」とは、本明細書で定義するカルバモイル基により置換された、本明細書で定義するアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書で記載するように、１、２、３、または４個の置換基でさらに置換することができる。
本明細書で使用する場合、用語「カルバミル」とは、構造－ＮＲＮ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、または－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＮ１）２を有するカルバメート基を意味し、式中、各ＲＮ１の意味は、本明細書で提供する「アミノ」の定義で見出され、Ｒは、本明細書で定義する、アルキル、シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、またはアルキルヘテロシクリル（例えば、アルキルへテロアリール）である。
本明細書で使用する場合、用語「カルボニル」は、Ｃ＝Ｏとして表すこともできるＣ（Ｏ）基を表す。
用語「カルボキシアルデヒド」とは、構造－Ｃ（Ｏ）Ｈを有するアシル基を表す。
本明細書で使用する場合、用語「カルボキシ」とは、－ＣＯ２Ｈを意味する。
用語「カチオン性脂質」とは、正の親水性先端基；１、２、３個、またはそれ以上の疎水性脂肪酸または脂肪族アルキル鎖；及び、これらの２つのドメイン間に接続子を有する両親媒性脂質及びその塩を意味する。イオン化可能な、またはプロトン化可能なカチオン性脂質は通常、そのｐＫａを下回るｐＨでプロトン化され（即ち、正電荷を帯び）、ｐＫａを上回るｐＨでは実質的に中性である。好ましいイオン化可能なカチオン性脂質は、通常は薬７．４である生理的ｐＨを下回るｐＫａを有するものである。本開示のカチオン性脂質はまた、滴定可能なカチオン性脂質と称される場合もある。カチオン性脂質は、プロトン化可能な３級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）頭基を有する「アミノ脂質」であることができる。いくつかのアミノ例示的なアミノ脂質は、Ｃ１８アルキル鎖を含むことが可能であり、各アルキル鎖は独立して、０～３（例えば、０、１、２、または３）個の二重結合；及び、先端基とアルキル鎖との間に、エーテル、エステル、またはケタール結合を有する。そのようなカチオン性脂質としては、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ－ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＤＬｉｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＸＴＣ２、及びＣ２Ｋとしても知られている）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭ Ａ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ｙ－ＤＬｅｎ－Ｃ２Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＭＣ２としても知られている）、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（ＭＣ３としても知られている）、ならびに、（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ）（１－Ｂｌ １としても知られている）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「を含む」は、オープンであることが意図され、追加の要素またはステップの包含を可能にするが、当該包含を必要としない。用語「を含む」を本明細書で使用する場合、用語「からなる」は故に包含されており、開示される。
用語「組成物」は、特定量の特定成分を含む生成物、及び特定量の特定成分の組み合わせから直接的または間接的に得られる任意の生成物を意味する。
用語「市販されている化学物質」、及び、本明細書で説明される実施例で用いられる化学物質は、標準的な民間の供給元から入手することができ、そのような供給元としては、例えば、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、Ｓｉｇｍａ－Ａｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、Ａｖｏｃａｄｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ，Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏｎｅｔ（Ｃｏｒｎｗａｌｌ，Ｕ．Ｋ．）、Ｂｏｒｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）、Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｅａｓｔｍａｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｎｄｈａｍ，Ｎ．Ｈ．）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ，Ｕ．Ｋ．）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）、Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ（Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．）、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇ．）、及びＷａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖａ．）が挙げられる。
語句「化学文献に記載されている化合物」は、当業者に既知のように、化学化合物及び化学反応に関する参照図書及びデータベースを通して識別することができる。本明細書で開示する化合物の調製において有用な反応物質の合成を詳述する、または、本明細書で開示する化合物の調製について設営する記事を参照する、好適な参照図書及び論文としては、例えば、“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓ．Ｒ．Ｓａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ，“Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，” ２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｈ．Ｏ．Ｈｏｕｓｅ，“Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，” ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９７２；Ｔ．Ｌ．Ｇｌｉｃｈｒｉｓｔ，“Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” ２ｎｄ Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｊ．Ｍａｒｃｈ，“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，” ５ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１が挙げられ、好適及び類似の反応物質は、大部分の公的な、及び大学の図書館で入手可能なＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、加えて、オンラインデータベースにより調製される既知の化学物質のインデックスによってもまた、識別することができる（さらなる詳細に関しては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃに連絡を取ることができる）。既知ではあるが、カタログで市販されていない化学物質は、カスタム化学合成会社により調製することができ、標準的な化学物質供給会社（上述したものなど）の多くは、カスタム合成サービスを提供している。
用語「相補性ヌクレオチド塩基」とは、互いに水素結合を形成する、一対のヌクレオチド塩基を意味する。アデニン（Ａ）は、ＤＮＡではチミン（Ｔ）と、ＲＮＡではウラシル（Ｕ）と対形成し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対形成する。核酸の相補性セグメントまたは相補鎖は、互いにハイブリダイズする（即ち、水素結合により結合する）。「相補性」とは、核酸が、従来のワトソン・クリック、または、他の非従来的な結合様式のいずれかにより、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成することができることを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「シクロアルキル」とは、特に明記しない限り、３～８個の炭素由来の、一価の飽和または不飽和非芳香族環状炭化水素基を表し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロへプチル、二環ヘプチルなどにより例示される。シクロアルキル基が１個の炭素－炭素二重結合を含む場合、シクロアルキル基は「シクロアルケニル」基と呼ぶことができる。例示的なシクロアルケニル基としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどが挙げられる。本開示のシクロアルキル基は、（１）Ｃ１－７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１－２０アルキル（例えば、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ－Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキルスルフィニル－Ｃ１－６アルキル、アミノ－Ｃ１－６アルキル、アジド－Ｃ１－６アルキル、（カルボキシアルデヒド）－Ｃ１－６アルキル、ハロ－Ｃ１－６アルキル（例えば、ペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ－Ｃ１－６アルキル、ニトロ－Ｃ１－６アルキル、またはＣ１－６チオアルコキシ－Ｃ１－６アルキル）；（３）Ｃ１２アルコキシ（例えば、ペルフルオロアルコキシなどのＣ１－６アルコキシ）；（４）Ｃ１－６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６－１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリール；（８）アジド；（９）Ｃ３－８シクロアルキル；（１０）Ｃ１－６アルキル－Ｃ３－８シクロアルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１－１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１－１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１－１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１－２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１－６チオアルコキシ）；（１７）－（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’［式中、ｑは０～４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１－６アルキル、（ｂ）Ｃ６－１０アリール、（ｃ）水素、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリールからなる群から選択される。］；（１８）－（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ′ＲＣ′［式中、ｑは０～４の整数であり、ＲＢ’及びＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６－１０アルキル、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリールからなる群から独立して選択される。］；（１９）－（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ′［式中、ｑは０～４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ６－１０アルキル、（ｂ）Ｃ６－１０アリール、及び（ｃ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ６－１０アリールからなる群から選択される。］；（２０）－（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ′ＲＦ′［式中、ｑは０～４の整数であり、ＲＥ’及びＲＦ’のそれぞれは、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６－１０アルキル、（ｃ）Ｃ６－１０アリール、及び（ｄ）Ｃ１－６アルキル－Ｃ１－１０アリールはからなる群から独立して選択される。］；（２１）チオール；（２２）Ｃ６－１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３－８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６－１０アリール－Ｃ１－６アルコキシ；（２５）Ｃ１－６アルキル－Ｃ１－１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１－６アルキル－Ｃ１－１２ヘテロアリール）；（２６）オキソ；（２７）Ｃ２－２０アルケニル；ならびに、（２８）Ｃ２－２０アルキニルで場合により置換することができる。いくつかの実施形態では、これらの基のそれぞれは、本明細書に記載するとおりにさらに置換されることができる。例えば、Ｃ１－アルカリル、またはＣ１－アルキルヘテロシクリルのアルキル基を、オキソ基でさらに置換して、対応するアリーロイル及び（ヘテロシクリル）オイル置換基を得ることができる。
本明細書で使用する場合、用語「ジアステレオマー」とは、互いに鏡像ではなく、互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
用語「ジアシルグリセロール」または「ＤＡＧ」は、共に独立してエステル結合により、グリセロールの１位及び２位に結合した２～３０個の炭素を有する、２つの脂肪族アシル鎖Ｒ１及びＲ２を含む化合物を含む。アシル基は飽和であることができるか、または様々な不飽和度を有することができる。好適なアシル基としては、ラウロイル（Ｃ１２）、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）、及びイコソイル（Ｃ２０）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同一である、すなわち、Ｒ１及びＲ２は共にミリストイル（すなわちジミリストイル）であり、Ｒ１及びＲ２は共にステアロイル（すなわちジステアロイル）である。
用語「ジアルキルオキシプロピル」または「ＤＡＡ」は、共に独立して２～３０個の炭素を有する２つのアルキル鎖Ｒ及びＲを有する化合物を含む。アルキル基は飽和であることができるか、または様々な不飽和度を有することができる。
本明細書で使用する場合、薬剤の「有効量」、という用語は、有益な、または所望の結果、例えば臨床的結果をもたらすのに十分な量であり、それ故、「有効量」は、この用語が適用される文脈によって左右される。例えば、がんを治療する剤を投与する文脈において、有効量の薬剤とは、例えば、当該薬剤の投与を伴わずに得られる応答と比較して、がんの、本明細書で定義する治療を実現するのに十分な量である。
本明細書で使用する場合、「エナンチオマー」とは、少なくとも８０％（即ち、少なくとも９０％の１つのエナンチオマー、及び最大１０％の他のエナンチオマー）、好ましくは少なくとも９０％、ならびに、より好ましくは、少なくとも９８％の光学純度または鏡像異性体過剰率（当該技術分野において標準的な方法で測定される）を有する、本開示の化合物の、各個別の光学活性形態を意味する。
「オルニチントランスカルバミラーゼ活性を有する酵素」、「ＯＴＣ活性を有する酵素」、または「ＯＴＣ酵素」とは、カルバモイルホスフェートとオルニチンとの反応を触媒してシトルリン及びホスフェートを形成する、タンパク質または酵素を意味する。ＯＴＣは、毒性アンモニアを捕捉し、このアンモニアを、排泄のために、より毒性の低い尿素窒素源に転換する目的を有する尿素回路で、不可欠な役割を果たす。
用語「完全に封入されている」とは、遊離ＲＮＡを著しく分解する血清またはヌクレアーゼアッセイに曝露した後、核酸－脂質粒子内の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）が著しく分解されないことを意味する。完全に封入された場合、通常は遊離核酸の１００％を分解する処理において、粒子内の核酸の好ましくは２５％未満が分解され、より好ましくは粒子内の核酸の１０％未満、及び最も好ましくは５％未満が分解される。「完全に封入された」とは、核酸－脂質粒子が、インビボ投与の際に、その構成成分部分に速やかに分解しないことも意味する。
本明細書で使用する場合、用語「ハロ」及び「ハロゲン」は、臭素、塩素、ヨウ素、またはフッ素から選択されるハロゲンを表す。
本明細書で使用する場合、用語「ハロアルキル」とは、ハロゲン基（即ち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）により置換されている、本明細書で定義するアルキル基を表す。ハロアルキルは、１、２、３個のハロゲン、または、２つ以上の炭素のアルキル基の場合には、４個のハロゲンで置換されることができる。ハロアルキル基としては、ペルフルオロアルキル（例えば、－ＣＦ３）、－ＣＨＦ２、－ＣＨ２Ｆ、－ＣＣｌ３、－ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、及び－ＣＨＩＣＨ３が挙げられる。いくつかの実施形態では、ハロアルキル基は、アルキル基に関して本明細書に記載する、１、２、３、または４個の置換基でさらに置換されることができる。
本明細書で使用する場合、用語「ヘテロアルキル」とは、構成成分である炭素原子の１つまたは２つがそれぞれ、窒素、酸素、または硫黄で置換されている、本明細書で定義するアルキル基を意味する。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、アルキル基について本明細書で説明されるように、１、２、３、または４個の置換基とさらに置換することができる。
本明細書で使用する場合、用語「炭化水素」とは、炭素及び水素原子のみからなる基を表す。
本明細書で使用する場合、「ヒドロキシ」という用語は、－ＯＨ基を表す。いくつかの実施形態では、ヒドロキシ基は、アルキルに関して本明細書で定義する１、２、３、または４個の置換基（例えば、Ｏ－保護基）で置換することができる。
本明細書で使用する場合、用語「ヒドロキシアルケニル」は、１～３個のヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義するアルケニル基（ただし、１個のヒドロキシ基は、アルキル基の単独の炭素原子に結合することができる。）を表し、ジヒドロキシプロペニル、ヒドロキシイソペンテニルなどにより例示される。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアルケニル基は、アルキルに関して本明細書で定義する１、２、３、または４個の置換基（例えば、Ｏ－保護基）で置換することができる。
本明細書で使用する場合、用語「ヒドロキシアルキル」は、１～３個のヒドロキシ基で置換された、本明細書で定義するアルキル基（ただし、１個のヒドロキシ基は、アルキル基の単独の炭素原子に結合することができる。）を表し、ヒドロキシメチル、ジヒドロキシプロピルなどにより例示される。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアルキル基は、アルキルに関して本明細書で定義する１、２、３、または４個の置換基（例えば、Ｏ－保護基）で置換することができる。
用語「水和物」とは溶媒和物を意味し、溶媒分子はＨ２Ｏである。
本明細書で使用する場合、「異性体」とは、本開示のいずれか化合物の、任意の互変異性体、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本開示の化合物は１つ以上のキラル中心及び／まは二重結合を有することができ、それ故、立体異性体、例えば二重結合異性体（即ち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）、またはジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（即ち（＋）もしくは（－）、もしくはｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性体）として存在することが認識されている。本開示に従うと、本明細書で記述した化学構造、及びそれ故、本開示の化合物は、対応する全ての立体異性体、即ち、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオ的に純粋）、ならびに鏡像異性及び立体異性混合物（例えばラセミ化合物）の両方を包含する。本開示の化合物の、鏡像異性及び立体異性混合物は通常、周知の方法、例えばキラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体としての化合物の結晶化、または、化合物のキラル溶媒中での結晶化により、構成成分であるエナンチオマーまたは立体異性体に分解することができる。エナンチオマー及び立体異性体は、周知の非対称合成法により、立体異性的または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、及び触媒からもまた入手することができる。
用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、及び、一本鎖または二本鎖形態の、これらのポリマーを意味する。この用語には、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは連結を含む核酸であって、合成、天然、及び非天然のものであり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される核酸が包含される。そのような類似体の例としては、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「オキソ」とは、＝Ｏを表す。
本明細書で使用する場合、用語「立体異性体」とは、化合物が有し得る、全ての可能な異なる異性体形態、及び構造形態（例えば、本明細書で記載される任意の式の化合物）、特に、基本的な分子構造の全ての可能な立体化学異性形態及び構造異性体形態、全てのジアステレオマー、エナンチオマー、及び／または配座異性体を意味する。本開示のいくつかの化合物は、異なる互変異性形態で存在することができ、後者のものは全て、本開示の範囲に含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「スルホニル」は、－Ｓ（Ｏ）２－基を表す。
用語「化合物」とは、記載する構造の全ての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、及び同位体を含むことを意味する。
用語「保存された」とは、それぞれ、比較される２つ以上の配列の同じ位置において変更されずに発生する、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を意味する。相対的に保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸とは、配列の別の場所で現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連性が強い配列内で保存されているものである。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」と言われる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存されている」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドもしくはポリペプチドの長さ全体に適用することができる、または、それらの一部、領域、もしくは特徴に適用することができる。
用語「環状」とは、連続的な輪の存在を意味する。環状分子は円形である必要はなく、ただ、結合して未開裂のサブユニット鎖を形成する。本開示のｍＲＮＡなどの環状分子は、１つの単位または多量体であってよい、あるいは、複雑またはハイオーダーの構造の、１つ以上の構成要素を含んでよい。
「細胞障害性」とは、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、菌類、寄生原虫、プリオン、またはこれらの組み合わせを殺傷すること、または有害、毒性、もしくは致死効果を引き起こすことを意味する。
用語「送達」とは、化合物、物質、要素、部分、カーゴ、またはペイロードを送達する行為または様式を意味する。
用語「送達剤」または「送達ビヒクル」とは、少なくとも部分的には、ポリヌクレオチドの、標的化細胞へのインビボ送達を容易にする、任意の物質を意味する。
用語「消化」とは、より小さな片または構成要素に分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化により、ペプチドの産生がもたらされる。
「コードされたタンパク質切断シグナル」とは、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を意味する。
用語「組み換えられた」とは、開始時点、野生型、または自然分子とは異なる、構造的または化学的に関係ない特徴または性質を有するように設計される場合。
核酸配列の「発現」とは、以下の事象の１つ以上を意味する：（１）（例えば、転写による）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の作製、（２）（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）ＲＮＡ転写産物のプロセシング、（３）ＲＮＡの、ポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後改変。
「特徴」とは、性能、性質、または固有の要素を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「フラグメント」とは、部分を意味する。例えば、タンパク質のフラグメントは、培養細胞から単離した完全長タンパク質を分解することにより得られるポリペプチドを含んでよい。
「機能的」生物学的分子とは、特性決定される性質及び／または活性を示す形態の、生物学的分子である。
用語「相同性」とは、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体の関係性を意味する。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるまたは類似する場合、互いに「相同」であるとみなされる。用語「相同」とは必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を意味する。本開示に従うと、コードするポリペプチドが、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つの伸長に関して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または更に９９％である場合、２つのポリヌクレオチド配列は相同であるとみなされる。いくつかの実施形態では、相同なポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の、独自に明記されるアミノ酸の伸長をコードする能力を特徴とする。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列に関して、相同性は、少なくとも４～５個の、独自に明記されるアミノ酸の伸長をコードする能力により測定される。本開示に従うと、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つの伸長に関して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、相同であるとみなされる。
用語「疎水性脂質」は非限定的に、飽和及び不飽和の脂肪族炭化水素基を含むが、これらに限定されない無極性基を有する化合物を意味し、そのような基は、１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基（複数可）により置換されていてもよい。好適な例としては、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、及び、１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「同一性」とは、ポリマー分子間、例えば、オリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体の関係性を意味する。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のために、２つの配列をアラインすることにより実施することができる（例えば、最適アラインメントのために、第１及び第２の核酸配列の１つまたは両方にギャップを導入することができ、同一でない配列を、比較目的のために無視することができる）。特定の実施形態では、比較目的のためにアラインされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドを比較する。第１配列内の位置が、第２配列内の対応する位置と同じヌクレオチドにより占められている場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適な整列のために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に記載されているものなどの方法を使用して測定することができ、これらそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれている。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０の重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｍｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）を使用して測定することができる。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは代替的に、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して測定することができる。配列間の同一性パーセントを測定するために一般的に用いられる方法としては、参照により本明細書に組み込まれているＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。同一性を測定するための技術は、一般に入手可能なコンピュータプログラムにて体系化されている。２つの配列間の相同性を測定するための例示的なコンピューターソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「単離した」とは、（天然形態であるか、実験設定であるかにかかわらず）会合した構成成分の少なくともいくつかから分離している、物質または要素を意味する。単離された物質は、会合している物質に対して、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／または要素は、最初に会合していた他の構成成分と少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上を分離することができる。いくつかの実施形態では、単離した薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超えて、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用する場合、物質は、他の構成成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物が、形成または検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分分離としては、例えば、本開示の化合物中で濃縮された組成物を挙げることができる。実質的分離は、本開示の化合物、またはその塩を少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％含有する組成物を含むことができる。化合物及びその塩を単離する方法は、当該技術分野において日常的である。
用語「脂質」とは、脂肪酸のエステルを含む有機化合物を意味し、水には不溶性であるが、多くの有機溶媒には可溶性であることを特徴とする。脂質は通常、以下の少なくとも３つのクラスに分類される：（１）脂肪、油及びロウが含まれる「単純脂質」；（２）リン脂質及び糖脂質が含まれる「複合脂質」；ならびに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
用語「脂質送達ビヒクル」とは、治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を目的の標的部位（例えば細胞、組織、臓器など）に送達するために使用可能な脂質製剤を意味する。脂質送達ビヒクルは核酸－脂質粒子であることができ、これは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質）、粒子の凝集を防ぐ複合脂質（例えば、ＰＥＧ脂質）、及び場合によりコレステロールから形成することができる。通常、治療用核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は粒子の脂質部分に封入することで、酵素分解から保護することができる。
用語「脂質封入された」とは、脂質製剤に完全に封入された、部分的に封入された、またはこの両方である、ｍＲＮＡなどの核酸を意味する。好ましい実施形態では核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、脂質粒子に完全に封入されている。
用語「脂質複合体」は、脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質を意味する。このような脂質複合体としては、例えば、ジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体）、ジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧ複合体）、コレステロールに結合したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ、及び、セラミド、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質複合体、ポリアミドオリゴマーと複合したＰＥＧなどのＰＥＧ－脂質複合体、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接複合しても、またはリンカー部位を介して脂質に連結してもよい。例えばエステル非含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含有する、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質に結合させるのに適した任意のリンカー部分を使用することができる。特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分を使用する。
用語「両親媒性脂質（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｌｉｐｉｄ）」または「両親媒性脂質（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｌｉｐｉｄ）」とは、脂質材料の疎水性部分が疎水性相を向いている一方で、親水性部分が水相を向いている材料を意味する。親水性の特徴は、炭水化物、リン酸、カルボキシル、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシル及び他の同等の基などの極性基または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖の飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基（複数可）により置換された、そのような基を含むがこれらに限定されない、無極性基を包含することにより付与することができる。両親媒性化合物の例としては、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「リンカー」とは、原子群、例えば、１０～１０００個の原子を意味し、限定されるものではないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどの原子または基で構成することができる。リンカーは、第１の末端において、核酸塩基または糖部分の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、及び、第２の末端において、ペイロード（例えば、検出可能薬または治療薬）に結合することができる。リンカーは、核酸配列への組み込みに干渉しない程度に十分な長さを有してよい。リンカーは、本明細書に記載するように、（例えば、２つ以上のポリヌクレオチドの結合による）多量体、または複合体の形成、加えて、ペイロードを投与するといった、任意の有用な目的のために使用することができる。リンカーに組み込み可能な化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これらに限定されず、これらはそれぞれ、本明細書に記載するように、場合により置換することができる。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、リンカー内で切断可能な部分、例えばジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）、またはアゾ結合（－Ｎ＝Ｎ－）が挙げられるが、これらに限定されず、これらは還元剤または光分解を用いて切断することができる。選択的に切断可能な結合の非限定例としては、例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または他の還元剤、及び／または光分解により切断可能なアミド結合、加えて、例えば酸性または塩基性加水分解により切断可能なエステル結合が挙げられる。
用語「哺乳類」とは、ヒトもしくは他の哺乳類を意味するか、または、人間を意味する。
用語「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）とは、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードし、翻訳されて、インビトロ、インビボ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはエクスビボで、コードされた目的のタンパク質またはポリペプチドを産生可能な任意のポリヌクレオチドを意味する。
用語「修飾された」とは、本開示の分子、または、別の場合においては標準的な参照分子の、変化した状態または構造を意味する。分子は、化学的方法、構造的方法、及び機能的方法を含む多くの方法で修飾することができる。一実施形態では、本開示のｍＲＮＡ分子は、例えば、天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関係するため、非天然ヌクレオシド及び／またはヌクレオチドの導入により修飾される。キャップ構造などの、非標準ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なり得るものの、「修飾された」とはみなされない。
用語「自然に発生する」とは、人工的補助なしに自然に存在することを意味する。
用語「非ヒト脊椎動物」は、野生種及び家畜種を含む、ヒトを除く全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、哺乳類、例えばアルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、スイギュウ、及びヤクが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「ヌクレオチド」とは、当該技術分野において周知な、天然塩基（標準）、または修飾塩基を有するヌクレオチドを含むことを意味する。そのような塩基は通常、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは通常、塩基、糖、及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは未修飾であるか、または、糖、リン酸、及び／または塩基部分で修飾されることができる（ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド、及び他のものにも同じように言及される；例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ（上述）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．国際ＰＣＴ公開第ＷＯ ９３／１５１８７号；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ（上述）を参照されたい）。Ｌｉｍｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３，１９９４にまとめられているように、当該技術分野において既知の修飾核酸塩基のいくつかの例が存在する。核酸分子に組み込み可能な塩基修飾の非限定例のいくつかとしては、イノシン、プリン、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６－トリメトキシベンゼン、３－メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５－アルキルシチジン（例えば、５－メチルシチジン）、５－アルキルウリジン（例えば、リボチミジン、５－ハロウリジン（例えば、５－ブロモウリジン）、または、６－アザピリミジンもしくは６－アルキルピリミジン（例えば、６－メチルウリジン）、プロピン、及び他のもの（Ｂｕｒｇｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１４０９０，１９９６；Ｕｈｌｍａｎ ＆ Ｐｅｙｍａｎ，上述）が挙げられる。本態様において、「修飾塩基」とは、１’位における、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシル以外のヌクレオチド塩基、またはこれらの等価物を意味する。
用語「オフターゲット」とは、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物における、任意の意図しない影響を意味する。
用語「コドン最適化」とは、タンパク質発現レベルを増加させる、コードされたタンパク質アミノ酸配列を変えることなく、異なるコドンを選択することにより再設計されている、天然コード配列、（または、意図的に設計された、天然コード配列のバリアント）を意味する（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：３４６－５３）。高コドン適応指数（ＣＡＩ）、ＬｏｗＵ法、ｍＲＮＡ二次構造、ｃｉｓ－調節配列、ＧＣ含有量などの変数、及び多くの他の同様の変数が、タンパク質発現レベルといくばくか相関することが示されている（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ： ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．２００６，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：２８５）。高ＣＡＩ（コドン適応指数）法は、全タンパク質コード配列に対して最も頻繁に使用される同義コドンを取り出す。各アミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンは、ヒトゲノムの７４２１８個のタンパク質コード遺伝子から推定される。ＬｏｗＵ法は、より少ないＵ部分を有する同義コドンで置換可能な、Ｌｉ含有コドンのみを標的にする。置換の選択肢が少ない場合は、より頻繁に使用されるコドンを選択する。配列中の残りのコドンは、ＬｏｗＵ法により変更されない。本方法は、開示されたｍＲＮＡと組み合わせて使用し、５－メトキシウリジンにより合成可能なコード配列を設計することができる。
核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に対する用語「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、目的のポリペプチドをコード可能な配列の部分を意味する。ＯＲＦは通常、開始コドンＡＴＧで始まり、ナンセンスまたは終止コドンまたはシグナルで終了する。
語句「作動可能に連結した」とは、２つ以上の分子、構造体、転写物、要素、または部位などの間における機能的接続を意味する。
用語「患者」とは、治療を求めている可能性がある、もしくは治療を必要とし得る、治療を必要としている、治療を受けている、治療を受けるであろう対象、または、特定の疾患もしくは病状に関して訓練を受けた専門家によりケアを受けている対象を意味する。
語句「場合により置換されたＸ」（例えば、場合により置換されたアルキル）という語句は、「Ｘであって、Ｘは場合により置換されている」（例えば、「アルキルであって、上記アルキルは場合により置換されている」）に等しいことを意図している。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）それ自体は任意のものであると意味することを意図しているわけではない。
用語「ペプチド」は５０アミノ酸長以下、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしにヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために用いられる。
本明細書で使用する場合、語句「薬学的に許容される賦形剤」とは、本明細書に記載する化合物（例えば、活性化合物を懸濁または溶解することが可能なビヒクル）以外の、患者には実質的に無毒かつ非炎症性の性質を有する、任意成分を意味する。賦形剤としては、例えば、抗接着剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング剤、香味料、香料、滑剤（流動向上剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷用インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水を挙げることができる。例示的な賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、セラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
語句「薬学的に許容される塩」とは、親化合物が、既存の酸または塩基部位をその塩形態に転換すること（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させること）により改変されている、開示した化合物の誘導体を意味する。薬学的に許容される塩の例としては、塩基性残基のミネラルまたは有機酸塩（例えばアミン）、酸性残基のアルカリまたは有機塩（例えばカルボン酸）などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、加えて、無毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオン（アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されない）が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、無毒性無機または有機酸から形成される、親化合物の従来の無毒性塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法により、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般的に、このような塩は、これら化合物の遊離酸または塩基形態を、水中もしくは有機溶媒中、またはこの２つの混合物中（一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルなどの非水媒体が好ましい）で、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製することができる。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８、及び、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見出され、これらそれぞれの全体が、本明細書に参照により組み込まれている。
用語「薬物動態」とは、生体に投与される物質の命運の決定に関係する際の、分子または化合物の任意の１つ以上の性質を意味する。薬物動態は、吸収、分配、代謝、及び排泄の程度及び速度を含むいくつかの領域に分けられる。これは一般にＡＤＭＥとして呼ばれ、（Ａ）吸収（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）は、血液循環に入る物質のプロセスであり、（Ｄ）分配（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）は、体の流体及び組織全体にわたる、物質の分散または伝搬であり、（Ｍ）代謝（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）（または、生体内変化）は、親化合物の娘代謝物への不可逆的転換であり、（Ｅ）排泄（Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ）（または放出（Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ））とは、物質の体からの放出を意味する。稀に、薬剤によっては、体内組織に不可逆的に蓄積するものもある。
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される溶媒和物」とは、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている、本開示の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される量において生理学的に許容範囲内である。例えば、有機溶媒、水、またはこれらの混合物を含む溶液の結晶化、再結晶、または沈殿により、溶媒和物を調製することができる。好適な溶媒の例としては、エタノール、水（例えば、モノ、ジ、及びトリ水和物）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどがある。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。
用語「ホスフェート」は、当業者によって理解される通常の意味で用いられ、そのプロトン化形態、例えば、
Figure 2023516676000057
 を含む。本明細書で使用する場合、用語「モノホスフェート」、「ジホスフェート」、及び「トリホスフェート」は、当業者により理解される通常の意味で用いられ、プロトン化形態を含む。
用語「ホスホロチオエート」とは、一般式
Figure 2023516676000058
 の化合物、そのプロトン化形態、例えば、
Figure 2023516676000059
 ならびにその互変異性体、例えば、
Figure 2023516676000060
 を意味する。
用語「物理化学的」とは、物理的及び／または化学的性質を意味する、またはこれらに関係する。
用語「予防すること」とは、感染症、疾患、障害、及び／または病状の開始を部分的にまたは完全に遅らせること、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病状の１種以上の症状、特徴、または臨床症状の開始を部分的にまたは完全に遅らせること、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病状の１種以上の症状、特徴、または徴候の開始を部分的にまたは完全に遅らせること、感染症、特定の疾患、障害、及び／または病状の進行を部分的にまたは完全に遅らせること、及び／または、感染症、疾患、障害、及び／または病状と関連する病状の進展のリスクを低下させることを意味する。
用語「タンパク質切断部位」とは、アミノ酸鎖の切断制御を、化学的、酵素的、または光化学的手段により達成可能な部位を意味する。
語句「タンパク質切断シグナル」とは、切断のためにポリペプチドに印を付ける、またはポリペプチドを標識する少なくとも１つのアミノ酸を意味する。
用語「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」としては、本明細書において提供されるタンパク質、ならびにそのフラグメント、変異体、バリアント、及び変化が挙げられる。
用語「精製する」、「精製された」、「精製」とは、不必要な成分、材料の汚れ、混合物または不完全さを実質的に純粋に、またはきれいにすることを意味する。
用語「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボ－フラノース部分の２’位でヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えにより作製されたＲＮＡ、加えて、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／または変化により、自然に生じるＲＮＡとは異なる、変化ＲＮＡを含む。このような変化としては、干渉ＲＮＡの末端（複数可）などへの、または内部、例えば、ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド材料の付加を挙げることができる。本開示のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、天然に生じないヌクレオチド、または、化学合成したヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドといった、非標準的なヌクレオチドもまた含むことができる。これらの変化ＲＮＡは、類似体、または、天然に生じるＲＮＡの類似体と呼ぶことができる。本明細書で使用する場合、用語「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、及び多価ＲＮＡを含む、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含有する分子を意味する。
用語「試料」または「生体試料」とは、組織、細胞、または構成成分の一部（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊水臍帯血、尿、膣液、及び精液を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを意味する。試料は、生命体全体、または、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ流体、外皮部分、呼吸器、腸、及び泌尿生殖路、涙、唾液、母乳、血液細胞、腫瘍、臓器を含むがこれらに限定されないその組織、細胞、もしくは構成成分の一部の部分集合、または、それらの分画もしくは一部から調製したホモジェネート、溶解物、または抽出物を更に含むことができる。試料とは、細胞成分（例えばタンパク質または核酸分子）を含有し得る、ブイヨンまたはゲルなどの媒体を更に意味する。
語句「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、タンパク質の輸送または局在化を指令可能な配列を意味する。
用語「著しい」、または「著しく」とは、用語「実質的に」と同じ意味で用いられる。
語句「単回単位用量」とは、１用量／１回／単一経路／１箇所での接触、即ち、単回投与事象において投与される、任意の治療薬の用量である。
用語「類似性」とは、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／またはポリペプチド分子間の全体の関係性を意味する。互いのポリマー分子の類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算では、当該技術分野において理解される保存的置換を考慮に入れることを除いて、同一性パーセントの計算と同じ方法で実施することができる。
用語「溶媒和物」とは、本開示の化合物の、１つ以上の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的結合は、水素結合を含む、様々な程度のイオン結合及び共有結合を必要とする。特定の場合において、溶媒和物は、例えば、１つ以上の溶媒分子が、結晶性固体の結晶格子に組み込まれる場合に、単離することができるであろう。「溶媒和物」は、溶液相及び単離可能な溶媒和物の両方を包含する。好適な溶媒和物の非限定例としては、エタノラート、メタノラートなどが挙げられる。
用語「分割用量」とは、単回単位用量または合計の日用量を、２回以上の用量に分けることである。
用語「安定した」とは、反応混合物からの、有用な純度への単離に生残するのに十分に堅強であり、好ましくは、有効な治療薬への製剤化が可能である化合物を意味する。
用語「安定させる」、「安定した」、「安定領域」とは、安定させること、または安定することを意味する。
用語「置換された」とは、水素以外の特定の基による、または、それぞれ、例えば独立して選択される、同一もしくは異なることができる１つ以上の基、部分、もしくはラジカルによる置換を意味する。
用語「実質的に」とは、対象の特徴または性質を完全またはほぼ完全に示す、定性的な状態を意味する。生物学分野における当業者は、生物学現象及び化学現象は、たとえあったとしても、完結する、及び／または完結に向かう、または絶対的な結果を達成または回避することは滅多にないことを理解するであろう。それ故、本明細書で使用する用語「実質的に」とは、多くの生物学現象及び化学現象において特有の、完全性を潜在的に欠いていることを表現する。
語句「実質的に等しい」とは、用量間の時間差を意味し、この用語は、±２％を意味する。
語句「ほぼ同時に」とは複数回の用量を意味し、この用語は２秒以内を意味する。
語句「を患う」とは、疾患、障害、及び／または病状「を患う」個体が、疾患、障害、及び／または病状の１つ以上の症状を有すると診断された、または、これを示すことに関する。
語句「に感受性である」とは、疾患、障害、及び／または病状「に感受性である」個体が、疾患、障害、及び／または病状を診断されていない、及び／または、疾患、障害、及び／または病状の症状を示し得ないが、疾患またはその症状が進行する性質を有することに関する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または病状（例えば、がん）に感受性である個体は、以下の１つ以上によって特徴付けられることができる：（１）疾患、障害、及び／または病状の発達に関連する遺伝子変異、（２）疾患、障害、及び／または病状の発達に関連する遺伝子多型、（３）疾患、障害、及び／または病状に関連するタンパク質の発現及び／または活性の増加及び／または減少、（４）疾患、障害、及び／または病状の発達に関連する習慣及び／または生活様式、（５）疾患、障害、及び／または病状の家族歴、及び（６）疾患、障害、及び／または病状に関連する微生物への曝露及び／または感染。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または病状に感受性である個人は、疾患、障害、及び／または病状が進行する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または病状に感受性である個人は、疾患、障害、及び／または病状が進行しない。
用語「合成」とは、人の手により作製、調製、及び／または製造されたことを意味する。本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であることができる。
用語「標的化細胞」とは、目的の任意の１つ以上の細胞を意味する。細胞はインビトロ、インビボ、ｉｎ ｓｉｔｕで見出され得る、または生命体の組織もしくは臓器で見出され得る。生命体は動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト、そして最も好ましくは患者であることができる。
用語「治療薬」とは、対象に投与される際に、治療、診断、及び／または予防効果を有し、及び／または、所望の生物学的効果及び／または薬理学的効果を誘発する薬剤を意味する。
用語「治療に有効な量」とは、感染症、疾患、障害、及び／または病状を患う、または感受性である対象に投与されると、その感染症、疾患、障害、及び／または病状の治療、症状の改善、診断、予防、及び／または開始の遅延を行うのに十分な、送達される薬剤（例えば、核酸、薬剤、治療薬、診断用薬、予防薬など）の量を意味する。
用語「治療に有効なアウトカム」とは、感染症、疾患、障害、及び／または病状を患う、または感染しやすい対象において、その感染症、疾患、障害、及び／または病状の治療、症状の改善、診断、予防、及び／または開始の遅延を行うのに十分なアウトカムを意味する。
用語「合計の日用量」とは、２４時間周期で投与または処方される量である。合計の日用量は、単回用量として投与することができる。
用語「転写因子」とは、例えば、転写の活性化または抑制により、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を制御するＤＮＡ結合タンパク質を意味する。いくつかの転写因子は転写の制御のみをもたらすが、他の転写因子は、他のタンパク質と共同して作用する。いくつかの転写因子は、特定の条件下において、転写の活性化及び抑制の両方を行うことができる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内における特定のコンセンサス配列と遺伝子非常に類似した、特定の標的配列（複数可）に結合する。転写因子は、標的遺伝子のみ、または他の分子との複合体中の転写を制御することができる。
用語「治療すること」とは、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病状の１つ以上の症状または特徴を、部分的または完全に緩和する、軽減する、改善する、治癒する、開始を遅延させる、進行を阻害する、深刻度を低下させる、及び／または発生を低下させることを意味する。例えば、がんを「治療すること」とは、腫瘍の生残、増殖、及び／または拡大の阻害を意味することができる。疾患、障害及び／または病状と関連付けられる病態を発症するリスクを低下させるために、疾患、障害及び／または病状の徴候を示さない対象に対して、及び／または疾患、障害及び／または病状の初期の徴候のみを示す対象に対して、治療が施されてもよい。
用語「未修飾」とは、任意の方法で変化する前の、任意の物質、化合物または分子を意味する。未修飾とは、野生型または天然形態の生体分子を意味することができるが、必ずしもこれらを意味するわけではない。分子はひと続きの修飾を受けることができ、これにより、それぞれの修飾分子は、後続の修飾のための「未修飾」出発分子として機能することができる。
本明細書に記載する化合物は、不斉である（例えば、１つ以上の立体中心を有する）ことができる。エナンチオマー及びジアステレオマーといった、あらゆる立体異性体が、特に明記しない限り意図される。不斉置換炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学的に活性な形態、またはラセミ体で単離することができる。ラセミ混合物の分割、または立体選択法などによる、光学的に活性な形態を、光学的に活性な出発物質から調製する方法は、当技術分野において既知である。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合等の多くの幾何異性体もまた、本開示に記載される化合物中に存在することができ、全てのそのような安定した異性体が本発明において想倒される。本開示の化合物のシス及びトランス幾何異性体が説明され、異性体の混合物として、または分離された異性形態として単離され得る。
本開示の化合物は、互変異性形態もまた含む。互変異性形態は、単結合を、隣接する二重結合と交換すること、及び、付随するプロトンの移動により生じる。互変異性形態は、同じ実験式及び総電荷を有する、異性体プロトン化状態であるプロトトロピック互変異性体を含む。例示的なプロトトロピック互変異性体としては、ケトン－エノール対、アミド－イミド酸対、ラクタム－ラクチム対、アミド－イミド酸対、エナミン－イミン対、ならびに、１Ｈ－及び３Ｈ－イミダゾール、１Ｈ－、２Ｈ－、及び４Ｈ－１，２，４－トリアゾール、１Ｈ－及び２Ｈ－イソインドール、ならびに１Ｈ－及び２Ｈ－ピラゾールなどの、プロトンが複素環式系の２つ以上の位置を占有することができる環状形態が挙げられる。互変異性形態は、平衡であるか、または、適切な置換により、一方の形態に立体的に固定されていることができる。
本開示の化合物は、中間体または最終化合物において生じる、原子の同位体の全てもまた含む。「同位体」とは、同じ原子数を有しながら、原子核内の異なる数の中性子により、異なる質量数を有する原子を意味する。例えば、水素の同位体は、トリチウム及び重水素を含む。
本開示の化合物及び塩は、日常的な方法により、溶媒または水分子と組み合わせて調製し、溶媒和物及び水和物を形成することができる。
用語「半減期」とは、核酸またはタンパク質濃度または活性といったある量が、ある時点の開始時において測定したその値の半分に収まるために必要な時間である。
用語「インビトロ」は、生命体（例えば、動物、植物、または微生物）の中ではなく、人工環境において、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養中、ペトリ皿中などで起こる事象を指す。
用語「インビボ」とは、生命体（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはこれらの細胞もしくは組織）内で生じる事象を意味する。
用語「モノマー」とは、同一または異なる別の分子と結合しオリゴマーを形成可能な、単一のユニット、例えば単一の核酸を意味する。いくつかの実施形態では、モノマーはアンロック核酸、即ち、ＵＮＡモノマーであることができる。
用語「中性脂質」とは、選択されたｐＨにおいて非荷電の、または中性の双性イオン形態のいずれかで存在する脂質種を意味する。生理的ｐＨにおいて、そのような脂質としては例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが挙げられる。
用語「非カチオン性脂質」とは、本明細書に記載する両親媒性脂質、中性脂質、またはアニオン性脂質を意味する。
用語「オリゴマー」とは、「ポリヌクレオチド」と同じ意味で用いることができ、少なくとも２種類のモノマーを含む分子を意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含む。ＲＮＡモノマー、及び／またはアンロック核酸（ＵＮＡ）モノマーを含有するオリゴマーの場合、本開示のオリゴマーは、コード配列（ＣＤＳ）に加えて配列を含有することができる。これらの追加の配列は、未翻訳配列、即ち、宿主細胞によりタンパク質に転換されていない配列であることができる。これらの未翻訳配列は、５’キャップ、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、及びテール領域、例えば、ポリＡテール領域を含むことができる。本明細書でさらに詳細に説明するように、これらの未翻訳配列のいずれかは、１つ以上のＵＮＡモノマーを含有することができる－これらのＵＮＡモノマーは、宿主細胞の機構により翻訳されることができない。本開示の文脈において、「ｍＲＮＡ配列」、「ｍＲＮＡ配列」、「翻訳可能なポリヌクレオチド」、または「翻訳可能な化合物」とは、領域、例えば、タンパク質またはそのフラグメント、例えば、ヒトＣＦＴＲタンパク質またはそのフラグメントに転換可能な、ＲＮＡのコード領域（例えば、ヒトＣＦＴＲのコード配列、またはそのコドン最適化版）を含む配列を意味する。
用語「対象」とは、本開示に従った組成物を、例えば、実験、診断、予防、及び／または治療目的のために投与可能な、任意の生命体を意味する。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳類）、及び／または植物が挙げられる。
用語「翻訳可能な」とは、用語「発現可能な」と同じ意味で用いられることができ、ポリヌクレオチドまたはその一部が、宿主細胞によりポリペプチドに転換されることができる能力を意味する。当該技術分野において理解されるように、翻訳は、細胞の細胞質中のリボソームがポリペプチドを作製するプロセスである。翻訳においては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、リボソーム複合体中でｔＲＮＡにより解読され、特定のアミノ酸鎖、またはポリペプチドを作製する。さらに、用語「翻訳可能な」とは、オリゴマーを参照して本明細書中で使用する場合、オリゴマーの少なくとも一部分（例えば、オリゴマー配列のコード領域（コード配列またはＣＤＳとしても知られている））が、タンパク質またはそのフラグメントに転換可能であることを意味する。
用語「翻訳効率」とは、インビトロまたはインビボでのｍＲＮＡ配列の翻訳による、タンパク質またはポリペプチドの産生の尺度を意味する。本開示は、ｍＲＮＡ配列が発現してポリペプチドまたはタンパク質をもたらすことができる、一定範囲のｍＲＮＡ配列分子を提供する。
用語「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の個々の量を意味する。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投与量、及び／または、このような投与量の半分または３分の１を含むがこれらに限定されない、このような投与量の便利な画分と等しいことができる。
実施例
本開示の追加の実施形態は以下の実施例にてさらに詳細に説明されており、これらは、特許請求の範囲をいかなる方法によっても限定することを意図するものではない。
実施例１：インビトロ転写プロトコル
材料及び方法
本明細書に記載するｍＲＮＡのコンストラクトを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが媒介する、ＤＮＡ依存性ＲＮＡ転写産物を使用してインビトロで合成した。転写反応において、所望のポリヌクレオチド構成に応じて、修飾及び未修飾ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）を使用した。使用した修飾ＵＴＰは、各ＵＴＲの組み合わせに対して、直鎖化した鋳型を使用する、５－メトキシＵＴＰ（５ＭｅＯＵ）、Ｎ１－メチルシュードＵＴＰ、Ｎ１－メトキシメチルシュードＵＴＰ（Ｎ１－ＭＯＭ）、５－ヒドロキシメチルＵＴＰ、５－カルボキシＵＴＰ、及び、修飾ＵＴＰの混合物を含んだ。ｍＲＮＡはカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、全ｍＲＮＡにおける、ＤＮＡ及び二本鎖ＲＮＡのコンタミネーションは、酵素反応を使用して取り除き、ｍＲＮＡを濃縮して緩衝液を交換した。
脂質封入ｍＲＮＡの調製
エタノール中の脂質（イオン化可能なカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＭＧ）を、クエン酸塩緩衝液に溶解したＯＴＣ ｍＲＮＡと混合することにより、脂質封入ｍＲＮＡ粒子を調製した。混合した材料をリン酸緩衝液で即時希釈した。再生セルロースメンブレン（１００ｋＤ ＭＷＣＯ）を使用する、リン酸緩衝液に対する透析、または、変性ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空繊維メンブレン（１００ｋＤ ＭＷＣＯ）を使用する、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）により、エタノールを取り除いた。エタノールを完全に取り除いたら、緩衝液を、４０～６０ｍＭのＮａＣｌ、及び７～１２％のスクロース（ｐＨ７．３）を含有する、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液で交換した。配合物を濃縮した後、ＰＥＳフィルターを使用して、０．２μｍ濾過に通した。次に、配合物中のｍＲＮＡ濃度をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ蛍光定量アッセイにより測定し、その後、４０～６０ｍＭのＮａＣｌ、グリセロールを含有する７～１２％のスクロース（ｐＨ７．３）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈することにより、濃度を最終の所望の濃度に調整した。次に、最終配合物を、０．２μｍフィルターを通して濾過し、ガラス瓶に充填してストッパーをかけ、フタを閉めて－７０±５℃で置いた。凍結した配合物の、ｍＲＮＡ含有量をＨＰＬＣまたはＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイで、封入割合をＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイで、ｍＲＮＡの一体性をフラグメント分析器で、脂質含有量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で、粒径を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳでの静的光散乱法により、加えて、ｐＨ及び浸透圧を特性決定した。
Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）
９６ウェルコラーゲンプレートを使用して、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ウシ胎児血清（ＦＢＳ）培地にて、適切な密度で細胞を播種した。最適なコンフルエンスにて、細胞に、トランスフェクション試薬ミックス（ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ）に希釈した標的化ｍＲＮＡをトランスフェクションした。細胞をＣＯ２インキュベーターに配置し、増殖させた。所望の時点で、培地を取り除き、細胞を４％の新鮮なパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に２０分間固定した。その後、固定液を取り除き、細胞を、各回５分間、ＴＷＥＥＮ（ＴＢＳＴ）を含むトリス緩衝生理食塩水中で数回、易透化した。易透化洗浄が完了したら、細胞をブロッキング緩衝液（ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ）（Ｌｉ－Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ））で４５分間インキュベートした。次に、一次抗体を添加して１時間室温でインキュベートした。次に、細胞をＴＢＳＴ中で数回洗浄し、ブロッキング緩衝液に希釈し、ＣｅｌｌＴａｇ７００株を含有する二次抗体で、１時間インキュベートした。細胞をＴＢＳＴ中で数回洗浄した後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で最後の洗浄を行った。プレートを、Ｌｉｃｏｒ検出システムを使用してイメージングし、ＣｅｌｌＴａｇ７００により標識した細胞の総数に対して、データを正規化した。
実施例２：Ｈｅｐａ１，６、及びＨｅｐ３ＢにおけるＵＴＲスクリーニング－２４時間及び４８時間における相関。
配列番号３４の配列をＣＤＳ（コード配列）として含む、ｍＲＮＡコンストラクト＃５７１を使用して、ＵＴＲライブラリーをインビトロでスクリーニングした。市販されているトランスフェクション試薬を使用して、Ｈｅｐａ１，６及びＨｅｐ３Ｂ細胞に、異なるｍＲＮＡをトランスフェクションし、上述（Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイ、実施例１）のとおりにタンパク質発現を測定した。ＯＴＣタンパク質発現レベルを、近赤外線蛍光イメージングシステムにより測定した。市販されているＯＴＣ用抗体を、検出のために使用した。トランスフェクションしていない細胞、及び参照配列を、内部対照として使用した。図１Ａは、２４時間における、Ｈｅｐａ１，６、及びＨｅｐ３Ｂ細胞にて見出された、ＯＴＣタンパク質発現レベルの散布図である。図１Ｂは、４８時間における、Ｈｅｐａ１，６、及びＨｅｐ３Ｂ細胞にて見出された、ＯＴＣタンパク質発現レベルの散布図である。スクリーニングの目的は、ヒト（Ｈｅｐ３Ｂ）及びマウス（Ｈｅｐａ１，６）肝臓細胞における、ＯＴＣ発現レベルへのＵＴＲ特異的な影響を測定し、どのＵＴＲが両方のモデルで最も作用するかを測定する、及び特に、マウスからヒトへの翻訳可能性を評価することであった。最も発現するＵＴＲを、さらなるプロファイリング研究で使用した。
実施例３：２４時間での、Ｈｅｐａ１，６－及びＨｅｐ３Ｂにおけるタンパク質安定性ｍＲＮＡ化合物スクリーニング（ラウンド１）－相関。
タンパク質安定性アプローチに基づき設計した、表５の特定のｍＲＮＡコンストラクトのインビトロスクリーニングを実施した。ウリジン残基に対して、２つの異なる種類の化学的性質を有するｍＲＮＡコンストラクト：Ｎ１－メチルシュードウリジン（Ｎ１ＭＰＵ）及び５－メトキシウリジン（５ＭｅＯＵ）を試験した。各ｍＲＮＡ中のウリジンの１００％が、Ｎ１ＭＰＵのみまたは５ＭｅＯＵのみのいずれかであった（５ＭｅＯＵまたはＮ１ＭＰＵの組み合わせではなかった）。市販されているトランスフェクション試薬を使用して、Ｈｅｐａ１，６及びＨｅｐ３Ｂ細胞に、異なるｍＲＮＡをトランスフェクションし、上述（Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイ、実施例１）のとおりにタンパク質発現を測定した。ＯＴＣタンパク質発現レベルを、近赤外線蛍光イメージングシステムにより測定した。市販されているＯＴＣ用抗体を、検出のために使用した。トランスフェクションしていない細胞、及び参照配列を、内部対照として使用した。図２は、試験したｍＲＮＡの関数としての、ならびに、Ｎ１ＭＰＵ及び５ＭｅＯＵの化学的性質を含む、２４時間におけるＨｅｐａ１，６でのＯＴＣタンパク質発現レベルの相関を示す散布図である。図３は、試験したｍＲＮＡの関数としての、ならびに、Ｎ１ＭＰＵ及び５ＭｅＯＵの化学的性質を含む、２４時間におけるＨｅｐａ３ＢでのＯＴＣタンパク質発現レベルの相関を示す散布図である。マウス及びヒトの肝臓細胞で試験した、２つの異なる化学的性質を有するｍＲＮＡに対する、発現レベルの変動の度合いを、図に示す。本実験では、ｍＲＮＡ化合物の大部分が、Ｎ１ＭＰＵの化学的性質を使用するときよりも良好に発現することを確認することができる。
実施例４：２４時間及び４８時間での、ヒト一次肝細胞におけるタンパク質の安定性ｍＲＮＡ化合物スクリーニング（ラウンド２）－相関。
タンパク質安定性アプローチに基づき設計した、表５の特定のｍＲＮＡコンストラクトのインビトロスクリーニングを実施した。２つの異なる化学的性質を有するｍＲＮＡ：ウリジンの１００％がＮ１ＭＰＵであり、コンストラクトが、「．１」が続くｍＲＮＡコンストラクトの表記により示される、ウリジンと、ウリジンの１００％が５ＭｅＯＵであり、コンストラクトが、「．７」が続くｍＲＮＡコンストラクトの表記により示される、ウリジンを試験した。市販されているトランスフェクション試薬を使用して、ヒト一次肝細胞に、異なるｍＲＮＡをトランスフェクションし、上述（Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）、実施例１）のとおりにタンパク質発現を測定した。ＯＴＣタンパク質発現レベルを、近赤外線蛍光イメージングシステムにより測定した。市販されているＯＴＣ用抗体を、検出のために使用した。トランスフェクションしていない細胞、及び参照配列を、内部対照として使用した（図４及び図５）。結果は、がん細胞株（Ｈｅｐａ１，６；Ｈｅｐ３Ｂ；実施例３）で実施した実験とは対照的に、両方の化学的性質を有するｍＲＮＡが、ヒト一次肝細胞にて同様に発現したことを示す。
実施例５：２４時間及び４８時間での、ヒト一次肝細胞におけるタンパク質の安定性化合物スクリーニング（ラウンド３）－相関。
タンパク質安定性アプローチに基づき設計した、新規化合物のインビトロスクリーニングを実施した。２つの異なる化学的性質を有するｍＲＮＡを試験し、Ｎ１ＭＰＵは、「．１」が続くｍＲＮＡコンストラクトの名前で示し、５ＭｅＯＵは、「．７」が続くｍＲＮＡコンストラクトの名前で示す。市販されているトランスフェクション試薬を使用して、ヒト一次肝細胞に、異なるｍＲＮＡをトランスフェクションし、上述（Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイ、実施例１）のとおりにタンパク質発現を測定した。ＯＴＣタンパク質発現レベルを、近赤外線蛍光イメージングシステムにより測定した。市販されているＯＴＣタンパク質用抗体を、検出のために使用した。トランスフェクションしていない細胞、及び参照配列を、内部対照として使用した（図６及び図７）。結果は、がん細胞株（Ｈｅｐａ１，６；Ｈｅｐ３Ｂ；実施例３）で実施した実験とは対照的に、両方の化学的性質を有するｍＲＮＡが、ヒト一次肝細胞にて同様に発現したことを示す。
実施例６：配列番号３のＯＴＣタンパク質をコードする、ＯＴＣ ｍＲＮＡコンストラクト１７９９．７（５ＭｅＯＵの化学的性質）、及び、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードする、ＯＴＣ ｍＲＮＡコンストラクト１９２１．７（５ＭｅＯＵの化学的性質）をトランスフェクトしたヒト一次細胞における、ＯＴＣタンパク質発現レベル。
市販されているトランスフェクション試薬を使用して、ヒト一次肝細胞に、異なるｍＲＮＡをトランスフェクションし、上述（Ｉｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイ、実施例１）のとおりにタンパク質発現を測定した。最大９６時間の時間経過研究の間に、ＯＴＣタンパク質発現レベルを、近赤外線蛍光イメージングシステムにより測定した。市販されているＯＴＣ抗体を、検出のために使用した。トランスフェクションしていない細胞を内部対照として使用した。得られたプロットは、トランスフェクションしていない対照に対して正規化したＯＴＣタンパク質レベルを示す（図８）。本研究の目的は、トランスフェクションしたヒト一次肝細胞におけるインビトロ状態にて、未修飾タンパク質配列と修飾タンパク質配列（それぞれ、コンストラクト１７９９．７及び１９２１．７によりコードされる）の半減期を評価することであった。結果は、１９２１．７が、１７９９．７よりも安定した発現を示したことを示す。
実施例７：１０ｍｇ／ｋｇで投与したＳｐｆ／ａｓｈマウスにおける複数反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析により測定したＯＴＣ発現レベル。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、ＰＢＳまたは脂質製剤化（実施例１に記載する）ｈＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかのＩＶ注射を受けた。ＷＴマウスは内部対照として使用し、内部レベルを測定した。時間経過（６時間、２４時間、及び４８時間）を実施し、ＯＴＣに対するヒト特異的エピトープ及びマウス特異的エピトープを使用するＭＲＭにより、発現レベルを測定した。ヒト及びマウス特異的重ペプチドを、両方の種に由来するＯＴＣの全レベルを測定するように設計した。グラフは、ヒトＯＴＣ（図９Ａ）またはマウスＯＴＣ（図９Ｂ）に対して特異的なＭＲＭにより検出されたタンパク質の量（ｎｇ／ｍｇ組織）を表す。定量レベルのヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）が、送達されたｍＲＮＡの翻訳に由来する治療済マウスにて観察されたことを、このデータの集合は示す。高レベルの定量可能なｈＯＴＣタンパク質は、最大４８時間確認された。
実施例８：３ｍｇ／ｋｇで投与したマウスにおいて、ウエスタンブロットで測定したＯＴＣ発現レベル。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、２つの異なるウリジンヌクレオチド化学的性質（Ｎ１ＭＰＵ及び５ＭｅＯＵ）を使用して、３ｍｇ／ｋｇの用量で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかをＩＶ注射で受けた。ＷＴマウスは内部対照として使用し、内部レベルを測定した。動物を、投与の２４時間後に犠牲にした。ＯＴＣ特異的抗体を使用するウエスタンブロット（ＷＢ）により、ＯＴＣ発現レベルを測定した。図１０に示す結果では、バーは、ＷＴレベル（１００％）に対する発現割合を表す。ＷＴレベルの全ＯＴＣが、マウスバックグラウンドにおけるいくつかのコドン最適化配列に対して実現されたことを、データは示す。
実施例９：用量範囲発見研究において、ＭＲＭにより測定されたＯＴＣ発現レベル。
Ｂａｌｂ／ｃマウスは、３つの異なる用量（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇ）で、ＰＢＳまたは脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかをＩＶ注射で、及び、２つの異なるウリジン化学的性質（Ｎ１ＭＰＵ及び５ＭｅＯＵ）を使用して受けた。動物を、投与の２４時間後に犠牲にし、ＯＴＣに対するヒト及びマウス特異的エピトープを使用して、ＭＲＭにより発現レベルを測定した。ＭＲＭを使用して、ヒト特異的及びマウス特異的ＯＴＣタンパク質レベルを定量的に測定した（図１１）。図１１のグラフは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるヒトＯＴＣの発現（肝臓組織１ｍｇ当たりのｎｇ）を示す。水平の点線は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける相対的なマウスＯＴＣレベルを表す（図１１）。５ＭｅＯＵを使用するｍＲＮＡコンストラクト７１３、及び、Ｎ１ＭＰＵを使用するｍＲＮＡコンストラクト５７１に対する、ヒトＯＴＣ（ｈＯＴＣ）タンパク質の発現レベルを、図１１に示す。本図に示すデータは、ＷＴレベルのヒトＯＴＣは、マウスバックグラウンドにおいて、用量依存的な様式により、本明細書で開示するコドン最適化配列を用いて実現されたことを示す。
実施例１０：ＰＢＳ及びｍＲＮＡで治療したＳｐｆ／ａｓｈマウスで測定した、尿オロチン酸レベル。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、３つの異なる用量：０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇにおいて、ＰＢＳまたは脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡコンストラクト１７９９．７（５ＭｅＯＵ化学的性質）のいずれかをＩＶ注射で受けた。尿オロチン酸レベルを、未治療野生型（ＷＴ）、ならびに、未治療及び治療済Ｓｐｆ／ａｓｈマウスの両方で測定した。尿オロチン酸の時間経過を、Ｓｐｆ／ａｓｈ及びＷＴマウスで実施し、尿オロチン酸レベルを各時点で測定した。結果は、図１２で確認することができる。尿オロチン酸をクレアチニンに対して正規化し、これを、時間経過全体を、ｙ軸上でグラフに示し、これは、注射後の、ＯＴＣ活性の機能的回復の概念実証としての役割を果たした。３ｍｇ／ｋｇでは、最大１４日間、尿オロチン酸レベルの持続可能な低下が観察され、治療済Ｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける尿オロチン酸レベルの低下は、ＷＴマウスにおける尿オロチン酸レベルと同等であった。
実施例１１：投与後９６時間における、ヒトＯＴＣ発現レベルと尿オロチン酸を比較する、薬物動態学／薬力学（ＫＤ／ＰＤ）分析。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、２つの異なるウリジン化学的性質（Ｎ１ＭＰＵ及び５ＭｅＯＵ）を使用して、１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇにて、表５の、ＰＢＳまたは特定の脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかをＩＢＡ注射で受けた。ＷＴマウスを内部対照として使用した。ヒト特異的ＯＴＣレベルをＭＲＭにより測定し、尿オロチン酸を各試料において測定してクレアチニンに対して正規化した。得られたＰＫ／ＰＤプロファイルを図１３にプロットし、ＰＫ／ＰＤ分析は、タンパク質発現レベルと、化合物特異的な様式での尿オロチン酸の減少との相関を示す。コンストラクト１７９９．７（５ＭｅＯＵ化学的性質）は、高いＰＫ／ＰＤ相関を示した。
実施例１２：選択されたｍＲＮＡで治療したＳｐｆ／ａｓｈマウスインビボサンプルの分画。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳまたは脂質製剤化（実施例１に記載する）ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかをＩＶ注射で受けた。ＷＴマウスを内部対照として使用した。肝臓をマウスから収集し、試料の分画を肝臓試料で行って、サイトゾルとミトコンドリア画分を分離した。ヒト特異的（ｈＯＴＣ）及び交差反応性（ｃｒＯＴＣ）抗体を使用して、ウエスタンブロット（ＷＢ）によりＯＴＣレベルを測定した（図１４）。シクロオキシゲナーゼＩＶ（ＣｏｘＩＶ）をミトコンドリア対照として使用した。ＯＴＣタンパク質発現レベルを、近赤外線蛍光イメージングシステムにより測定し、全タンパク質に対して正規化した。ＷＴの結果は、２０１６及び２２６０ｍＲＮＡコンストラクトをＳｐｆ／ａｓｈマウスに送達したときの、ミトコンドリア及びサイトゾル画分内での、ＯＴＣ発現レベルの鎖を示す。これらの結果は、両方の化合物がミトコンドリアを効率的に標的化することができることを示す。
実施例１３：ｍＲＮＡコンストラクト２０１６及び２２６０で治療した、Ｓｐｆ／ａｓｈマウス試料のミトコンドリアｖｓサイトゾル画分のプロット。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、３ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳまたは脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかをＩＶ注射で受けた。ＷＴマウスを内部対照として使用した。試料分画を、マウスから収集した肝臓試料で実施し、サイトゾル及びミトコンドリア画分を分離した。ヒト特異的抗体を使用して、ウエスタンブロットによりＯＴＣレベルを測定した。ＯＴＣタンパク質発現レベルを、近赤外線蛍光イメージングシステム及び両方の画分により測定し、全タンパク質に対して正規化して、プロットした（図１５）。化合物２０１６及び２２６０の両方は、サイトゾルにて同様のタンパク質レベルを送達するものの、２２６０は、ミトコンドリアにおいては、２０１６よりもより多くのヒトＯＴＣを送達することを、図１４（実施例１２）に示すタンパク質発現レベルのプロットは示す。２２６０化合物は、本明細書で提供する修飾ミトコンドリアシグナル伝達ペプチド配列を含む。
実施例１４：ｍＲＮＡコンストラクト２２６０で治療したＳｐｆ／ａｓｈマウスにおける尿オロチン酸レベル。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、１ｍｇ／ｋｇ及び３ｍｇ／ｋｇで、ＰＢＳまたは脂質製剤化（実施例１に記載する）ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかをＩＶ注射で受けた。ＷＴマウスは、内部対照として含まれた。尿オロチン酸レベルを０、１、３、７、及び１４日目に測定し、レベルをクレアチニンに対して正規化した（図１６）。本アッセイの機能的読み出しは、尿オロチン酸レベルは、用量依存的な様式において、化合物２２６０を用いると最大１４日間低下したことを示す。
実施例１５：ＯＴＣ－ｍＲＮＡコンストラクト１７９９．７（５ＭｅＯＵの化学的性質）による治療の間の、高タンパク質食でのＳｐｆ／ａｓｈマウスの生残。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、３つの用量：０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇにおいて、ＰＢＳまたは脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡ（１７９９．７）のいずれかをＩＶ注射で受けた。マウスには、０日目から研究終了時まで、高タンパク質食を給餌した。治療した動物に、０、７、１４、２１、及び２８日目に静脈内注射をした（図１７のチャートでは、矢印で示す）。生残率は毎週測定した。図１７のプロットは、研究全体のタイムライン、及び、異なる群に対して観察された生残率をまとめている。本明細書に記載するヒトＯＴＣ ｍＲＮＡで治療した動物は、高アンモニア血症の危機の間により高い生残を示したことを、結果は示し、このことは、本明細書に記載するＯＴＣ ｍＲＮＡの、動物を毒性アンモニアから解毒する保護的な役割を示唆する。生残率は用量依存的であり、３ｍｇ／ｋｇの用量で治療した動物は、１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇで治療した動物よりも生残率が高かった。
実施例１６：異なる修飾を有するｍＲＮＡからの、ｈＯＴＣ発現レベルの比較。
脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡコンストラクト２２６２の用量を、１ｍｇ／ｋｇの用量にて、８～１０週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスに静脈内投与した。図１８に示すチャートの下（ｘ）軸に示されるように、本研究では異なる化学的性質を使用した。マウスの肝臓を、ＩＶ投与の２４時間後に収集し、ｈＯＴＣ特異的抗体を使用して、ウエスタンブロットを実施した。レベルを全タンパク質に対して正規化した（図１８）。各コンストラクトを、実施例１に記載するイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子として製剤化した。このデータの集合は、本明細書に記載するコドン最適化ｍＲＮＡの発現レベルにおける、異なるウリジンの化学的性質の影響を示す。
実施例１７：脂質製剤開発研究
脂質製剤を実施例１のとおりに調製し、脂質製剤中のイオン化可能なカチオン性脂質の、物理化学的性質：粒径（５５～８５ｎｍが望ましい）、多分散指数（０．２を超えてはならない）、及び、封入されたｍＲＮＡの割合（８５％以上）を評価した。製剤の物理化学的性質を、下表７にまとめる。
Figure 2023516676000061
インビボでの効能（タンパク質発現により測定される）と組み合わせた、製剤の物理化学的性質（粒径、多分散指数、及び封入されたｍＲＮＡの割合）の評価は、ＯＴＣ ｍＲＮＡによるさらなる評価のための、３つの脂質（脂質＃２、脂質＃３、及び脂質＃７）の選択に繋がった。
実験計画法（ＤＯＥ）アプローチに基づき、ツール脂質として脂質＃７を利用して、製剤中のイオン化可能なカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ２０００－ＤＭＧの、最適なモル百分率の測定に焦点を当てる、並行製剤開発研究を実施した。研究は、１．５％の固定ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ比率で、脂質＃７及びＤＳＰＣの比率を評価した。ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ比率は１．５％に固定し、ｍＲＮＡの封入、及びインビボの効能を最大化した。ＤＯＥ研究は、製剤の物理化学的性質：粒径（５５～８５ｎｍ）、多分散指数（０．２以下）、及び封入されたｍＲＮＡの割合（８５％以上）の評価に焦点を当てた。
ＤＯＥ研究で測定した脂質製剤の物理化学的性質を、下表８にまとめる。
Figure 2023516676000062
上記データに基づくと、脂質＃７のモル百分率は、製剤の物理化学的性質において重要な役割を果たした。最も顕著には、４２％の脂質＃７を含有する製剤は、最高のＰＤＩを有した（３つの製剤のうち２つが、許容される範囲の外側であった）一方で、５８％の脂質＃７を含有する製剤は、最低のＰＤＩを有した。逆に、５８％の脂質＃７を含有する製剤は最大の粒径を有したが、依然として許容される範囲内にあった。全製剤に関して、封入されたｍＲＮＡの割合は許容される範囲内にあり、４２％または５０％の脂質＃７を含有する製剤は、僅かに高い、封入されたｍＲＮＡの％を有した。
実施例１８：Ｂａｌｂ／ｃマウスでのＯＴＣ発現における、イオン化可能なカチオン性脂質の効果の比較。
脂質＃２、脂質＃７、脂質＃８、脂質＃４、脂質＃５、及び脂質＃６のそれぞれに対して、５７１個のｍＲＮＡコンストラクトを使用して、実施例１のとおりに脂質製剤を調製し、Ｂａｌｂ／ｃマウスでのｈＯＴＣの発現における、これらの脂質の用量依存的効果を試験した。０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、及び３．０ｍｇ／ｋｇの用量で、これらの脂質のそれぞれの製剤をマウスに静脈内投与した。発現レベルは、図１９において、野生型マウスＯＴＣ（ｍＯＴＣ）発現レベルと比較して示す。本図で確認できるように、製剤のそれぞれは用量依存的な発現を示し、用量が増加すると、ｈＯＴＣの濃度増加が確認された。脂質＃２及び脂質＃７を含む製剤が、最大レベルのｈＯＴＣ発現を示し、脂質＃７は、脂質＃２よりも約３～４倍高い発現を示す。
実施例１９：ＯＴＣ発現での、イオン化可能なカチオン性脂質の効果のさらなる比較。
脂質＃１、脂質＃２、脂質＃３、及び脂質＃７のそれぞれに対して、５７１個のｍＲＮＡコンストラクトを使用して、実施例１のとおりにさらに脂質製剤を調製し、Ｂａｌｂ／ｃマウスでのｈＯＴＣの発現における、これらの脂質の用量依存的効果を試験した。１．０ｍｇ／ｋｇ及び３．０ｍｇ／ｋｇの用量で、これらの脂質のそれぞれの製剤をマウスに静脈内投与した。発現レベルを図２０に示す。確認できるように、ｈＯＴＣ発現では用量に関連する増加があった。脂質＃３は、用量が増加すると例外的な用量反応を示したが、脂質＃７は、わずかな用量反応のみを有するようであった。
実施例２０：異なるイオン化可能なカチオン性脂質を使用する脂質製剤に対する、Ｓｐｆ／ａｓｈマウスの生残率
ヘミ接合のオスＳｐｆ／ａｓｈマウスモデルにおける一連の研究で、有効性及び潜在的な作用機序を明らかにした研究において、ＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質製剤の薬理を調査した。これらのマウスは、内部ＯＴＣ ｍＲＮＡの異常なスプライシングを引き起こす、Ｘ染色体（低形質モデル）の遺伝変異を有し、肝臓において、１０％未満の、残りのＯＴＣ酵素活性をもたらした。低形質Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、尿オロチン酸（オロエート）の濃度増加、血液グルタミンの濃度増加、ならびに、血液シトルリン及びアルギニンの濃度低下を含む、ＯＴＣＤ患者が持つのと同様の生化学的特徴を共有する。薬理学研究で使用したヘミ接合のオスＳｐｆ／ａｓｈマウスは、ホモ接合のマウスが生存可能ではないため、Ｂ６ＥｉＣ３Ｓｎ ａ／Ａ－Ｏｔｃｓｐｆａｓｈ／Ｊ ＨｅｔマウスとＢ６ＥｉＣ３ＳｎＦ１／Ｊマウスを交差させることでもたらした。ヘテロ接合のオスＢ６ＥｉＣ３ＳｎＦ１／Ｊマウスを、野生型（ＷＴ）対照として使用した。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは通常、深刻な高アンモニア血症、及び尿生成の減少を示さない。尿酸回路の急激な破壊は、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）のボーラス投与により引き起こされ、高アンモニア血症及び尿生成の減少をもたらした。加えて、尿素回路は、これらのマウスに高タンパク質食（ＨＰＤ）を維持することでもまた、ストレスがかかった。
生残率における、異なるイオン化可能なカチオン性脂質の効果を研究するために、Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、ＰＢＳ、または、３つの異なる脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡ（１７９９．７）組成物のうちの１つのいずれかをＩＶ注射で受けた。３つの異なる組成物は上記実施例１のとおりに調製し、脂質＃３、脂質＃２、または脂質＃７のいずれかを有した。製剤は３回の用量：脂質＃２及び脂質＃３に関しては、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇ、ならびに、脂質＃７製剤に関しては、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、及び１．０ｍｇ／ｋｇで投与した。マウスは、０日目から研究終了時まで、高タンパク質食であった。治療済動物には、０、７、１４、２１、及び２８日目に（図２１～２３のチャートで破線により示すように）静脈内注射をした。生残率は毎日測定した。図２１～２３のプロットは、研究全体のタイムライン、及び、異なる群に対して観察された生残率についてまとめている。本明細書に記載するヒトＯＴＣ ｍＲＮＡで治療した動物は、高アンモニア血症の危機の間により高い生残を示したことを、結果は示し、このことは、本明細書に記載するＯＴＣ ｍＲＮＡの、動物を毒性アンモニアから解毒する保護的な役割を示唆する。生残率は用量依存的であった。
高タンパク質食に曝露した際、死亡率は最も早くても４日目に観察された（脂質＃７、０．３ｍｇ／ｋｇ）。高タンパク質食、及び、ＰＢＳでの治療は、７日目に開始するＳｐｆ／ａｓｈマウスの急激な死亡率をもたらし、２８日目までに、死亡率は１００％となった。低用量治療は、少なくとも２週間、生残率を著しく延ばし、１００％の死亡率はそれぞれ、脂質＃２では４９日目、脂質＃３では５１日目、及び、脂質＃７では４９日目に観察された。中及び高用量の治療は、用量投与期間を通して、９０～１００％の生残率をもたらし、脂質＃７は１ｍｇ／ｋｇで、１００％の生残率を達成した。生残率の、用量に関連した改善は、２８日目～７０日目の「ウォッシュアウト期間」でも確認された。高用量レベルでは、Ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、最後の投与の少なくとも２週間は、高アンモニア血症が引き起こす死から守られた。中及び高用量レベルでは、最後の投与から６週間の監視期間の間は、１００％の死亡率が確認されなかった。０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇレベルの両方において、脂質＃７は生残の延長に最も有効であり、これに脂質＃３、そして脂質＃２が続いた。３．０ｍｇ／ｋｇレベルでは、脂質＃３は脂質＃２よりも有効であった。
実施例２１：脂質製剤の忍容性研究
ｍＲＮＡコンストラクト１７９９．７、ならびに、脂質＃２、脂質＃３、または脂質＃７のいずれかを使用する、実施例１で調製した脂質製剤を、高用量でＣＤ－１マウスにて試験した。０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目において、週に１回、１０ｍＬ／ｋｇの投与体積で、静脈内ボーラス治療を全ての動物が受けた。動物の罹患率及び死亡率を毎日観察し、体重を２週間に１回測定した。ＡＬＴ、ＡＳＴ、及び血清サイトカインの測定のために、最初及び最後の投与の６時間後に、全ての動物から採血をした。動物を、全体的な観察、全血ならびに臓器重量（肝臓及び脾臓）の測定、組織病理（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、及び肺）のための組織収集、ならびに、サイトカイン、血液学、及び臨床化学の分析のための採血のために、最終投与（３１日目）の７２時間後に終了させた。
本研究からの生残率結果を図２４に示し、これは、複数の用量を投与した後の、生残率におけるＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質製剤治療の用量依存的効果を示す。脂質＃３及び脂質＃２の両方に関しては、３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、ならびに、脂質＃７に関しては１ｍｇ／ｋｇで、１００％の生残率を観察した（両方の性別で）。オスは、脂質＃３及び脂質＃２に対して、メスよりも感受性が高いようであり、脂質＃２では、１０ｍｇ／ｋｇのオス群で１００％の死亡が確認された。さらに、脂質＃３及び脂質＃２に関しては１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、ならびに、脂質＃７に関しては３ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、死亡が観察された。１０ｍｇ／ｋｇでは、脂質＃３は脂質＃２よりもよく認容された。本研究から得られたデータは、忍容性に関して、脂質＃３＞脂質＃２＞脂質＃７のランキングを示唆した。
インビボ忍容性研究（体重、ＡＬＴ／ＡＳＴ、及びサイトカイン分析を含む）の完全な評価もまた実施した。生残に対応した、体重での用量依存的な傾向が観察された。しかし、研究を通して、全体的な体重増加における、生物学的な意義のある効果はないようであった。血液学パラメーターを、最終投与の７２時間後に観察した。ＲＢＣ、Ｈｇ、ＨＣＴ、ＭＣＶ、ＭＣＨ、リンパ球、単球、白血球に関しては、意義のある効果は観察されなかった。わずかな変化は観察されたが、動物間での変動、及び、用量依存性の欠落により、これらは、ＯＴＣ ｍＲＮＡ脂質製剤の投与に寄与することができなかった。１０ｍｇ／ｋｇでの脂質＃３に対しては、好酸球及び好塩基球での増加、ならびに、好塩基球の増加の傾向が観察された。
最初及び最終投与の６時間後、ならびに、最終投与の７２時間後の両方において、血清サイトカインを評価した。最終投与の７２時間後にベースラインに戻った、全ての脂質製剤化ＯＴＣ ｍＲＮＡ治療動物に関して、ＴＮＦ－α、ＩＬ１－β、ＩＦＮγ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、及びＩＦＮαに対して、有意な用量依存的な増加（いくつかのサイトカインに関しては、＞１００倍）が、最初及び最後の投与の６時間後に観察され、ただし、脂質＃７の３ｍｇ／ｋｇにおいては、ＴＮＦα及びＩＦＮγの例外があった。他の変化が投与後７２時間の時点で観察されたものの、用量群内での変動、及び、用量依存性の欠落により、これらは、ＯＴＣ ｍＲＮＡ製剤の投与に寄与することができなかった。
実施例２２：インビボ組織脂質クリアランス研究
さらなる研究を実施し、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、脂質＃７及び脂質＃３のインビボ組織クリアランスプロファイルを評価した。マウス組織及び血漿におけるクリアランスプロファイルは、図２５（脂質＃７）及び図２６（脂質＃３）で見出すことができる。全ての動物が、１０ｍＬ／ｋｇの投与退席で、１ｍｇ／ｋｇの脂質＃７製剤の単回静脈内ボーラス治療を受けた。血漿、肝臓、腎臓、及び脾臓をマウス（時点当たりｎ＝３匹のマウス）から、投与の０、２、１５、３０分；１、２、４、６、８、１２、２４、４８時間；及び、５、７、２１、２８日後に収集した。試料は全て、脂質＃７の濃度に対して分析した。
最高レベルの脂質＃７は肝臓で観察され、ランキングは肝臓＞脾臓＞血漿＞腎臓であった。血漿では、脂質＃７は、投与の１４日後には検出されなかった。投与の２８日（評価した最後の時点）後までに、脂質＃７は、脾臓では１８，４３３ｐｇ／ｍＬ、肝臓では１７，２３３ｐｇ／ｍＬ、及び、腎臓では２，３４０ｐｇ／ｍＬの濃度で検出された。脂質＃７の半減期は、血漿では５７時間、肝臓では８４時間、及び、腎臓では２３４時間と測定された。脂質＃７の組織半減期は、脾臓では測定することができなかった。
全ての動物が、１０ｍＬ／ｋｇの投与退席で、１ｍｇ／ｋｇの脂質＃３製剤の単回静脈内ボーラス治療を受けた。血漿を、投与の０．２５、１、２、４、６、１２、２４、１２０、及び１６８時間後に、マウスから収集した（時点当たりｎ＝３）。肝臓、腎臓、及び脾臓を、投与の０．０３３、０．２５、１、２、４、６、１２、２４，１２０、及び１６８時間；１、２、３、４週間後にマウスから収集した（時点当たりｎ＝３）。心臓、脳、及び肺を、投与の０．２５時間；１、２週間後に、マウスから収集した（時点当たりｎ＝３）。脂質＃３の組織濃度は、投与の０．２５時間～１週間後の試料のみで分析した。
最高レベルの脂質＃３は肝臓で観察され、ランキングは肝臓＞血漿＞脾臓＞腎臓＞肺＞心臓＞脳であった。血漿では、脂質＃３は、投与の４時間には検出されなかった。脂質３＃は、投与後のいずれの時点でも、脳組織で検出されなかった。脂質＃３のＴｍａｘは、腎臓では投与の０．０３３～１時間後、肝臓では投与の０．０３３～１時間後、及び、脾臓では投与の１～２時間後に生じた。２つの時点のみを心臓及び肺では評価したため、脂質＃３のＴｍａｘは測定することができなかった。肝臓では投与後１６８時間、他の全ての組織では、投与後１２０時間にわたり、脂質＃３の濃度が持続したが、アッセイの定量下限（ＬＬＱＱ）近くで測定された。脂質＃３の半減期は、血漿では０．４５時間、肝臓では２２時間、腎臓では１９時間、及び脾臓では２４時間と測定され、急激な組織クリアランスを示す。脂質＃３の組織半減期は、肺及び心臓では測定することができなかった。
さらなる考察
前述の説明が提供されることで、本明細書に記載する様々な構成を当業者が実施することが可能となる。主題技術を実装する他の多くの方法が存在し得る。本明細書に記載する様々な機能及び要素は、主題技術の範囲から逸脱することなく、これら示されるものとは異なって分けることができる。これらの構成に対する様々な変更は、当業者に速やかに明らかとなり、本明細書で定義する一般的な定義は、他の構成に適用可能である。したがって、主題技術の範囲を逸脱することなく、当業者によって、多くの変化及び変更を主題技術に加えることができる。
詳細の説明は多くの具体例を含有するものの、これらは、主題技術の範囲を限定するものとして解釈されてはならず、主題技術の異なる実施例及び態様を単に示すものとして解釈されなければならない。主題技術の範囲は、上で詳しく論じていない他の実施形態を含むことが理解されなければならない。本開示の範囲を逸脱することなく、様々な他の変更、変化、及び変動を、本明細書で開示する主題技術の方法及び装置の配置、操作、及び詳細においてなすことができる。加えて、装置または方法は、本開示の範囲に包含されるために、本開示の異なる実施形態により解決可能な（または、実現可能な全ての利点を有する）全ての課題を解決する必要はない。本明細書において「することができる（ｃａｎ）」、及びその派生形は、断定的な可能性とは反対で、「場合により」、または「任意に」という意味で理解されなければならない。
配列表

野生型ヒトＯＴＣに対するｍＲＮＡコード配列（配列番号１）
ＡＵＧＣＵＧＵＵＵＡＡＵＣＵＧＡＧＧＡＵＣＣＵＧＵＵＡＡＡＣＡＡＵＧＣＡＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＡＵＧＧＵＣＡＣＡＡＣＵＵＣＡＵＧＧＵＵＣＧＡＡＡＵＵＵＵＣＧＧＵＧＵＧＧＡＣＡＡＣＣＡＣＵＡＣＡＡＡＡＵＡＡＡＧＵＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＧＧＣＣＧＵＧＡＣＣＵＵＣＵＣＡＣＵＣＵＡＡＡＡＡＡＣ
ＵＵＵＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＵＵＡＡＡＵＡＵＡＵＧＣＵＡＵＧＧＣＵＡＵＣＡＧＣＡＧＡＵＣＵＧＡＡＡＵＵＵＡＧＧＡＵＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＵＡＵＵＵＧＣＣＵＵＵＡＵＵＧＣＡＡＧＧＧＡＡＧＵＣＣＵＵＡＧＧＣＡＵＧＡＵＵＵＵＵＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＵＡＣＵＣＧＡＡＣＡＡＧＡＵＵＧＵＣＵＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＣＵＵＵＧＣＡＣＵＵＣＵＧＧＧＡＧＧＡＣＡＵＣＣＵＵＧＵＵＵＵＣＵＵＡＣＣＡＣＡＣＡＡＧＡＵＡＵＵＣＡＵＵＵＧＧＧＵＧＵＧＡＡＵＧＡＡＡＧＵＣＵＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＧＵＧＵＡＵＵＧＵＣＵＡＧＣＡＵＧＧＣＡＧＡＵＧＣＡＧＵＡＵＵＧＧＣＵＣＧＡＧＵＧＵＡＵＡＡＡＣＡＡＵＣＡＧＡＵＵＵＧＧＡＣＡＣＣＣＵＧＧＣＵＡＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＣＡＵＣＣＣＡＡＵＵＡＵＣＡＡＵＧＧＧＣＵＧＵＣＡＧＡＵＵＵＧＵＡＣＣＡＵＣＣＵＡＵＣＣＡＧＡＵＣＣＵＧＧＣＵＧＡＵＵＡＣＣＵＣＡＣＧＣＵＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＵＡＵＡＧＣＵＣＵＣＵＧＡＡＡＧＧＵＣＵＵＡＣＣＣＵＣＡＧＣＵＧＧＡＵＣＧＧＧＧＡＵＧＧＧＡＡＣＡＡＵＡＵＣＣＵＧＣＡＣＵＣＣＡＵＣＡＵＧＡＵＧＡＧＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＵＵＣＧＧＡＡＵＧＣＡＣＣＵＵＣＡＧＧＣＡＧＣＵＡＣＵＣＣＡＡＡＧＧＧＵＵＡＵＧＡＧＣＣＧＧＡＵＧＣＵＡＧＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＵＵＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＵＡＵＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＵＧＧＵＡＣＣＡＡＧＣＵＧＵＵＧＣＵＧＡＣＡＡＡＵＧＡＵＣＣＡＵＵＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＡＵＧＧＡＧＧＣＡＡＵＧＵＡＵＵＡＡＵＵＡＣＡＧＡＣＡＣＵＵＧＧＡＵＡＡＧＣＡＵＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＵＣＣＡＧＧＣＵＵＵＣＣＡＡＧＧＵＵＡＣＣＡＧＧＵＵＡＣＡＡＵＧＡＡＧＡＣＵＧＣＵＡＡＡＧＵＵＧＣＵＧＣＣＵＣＵＧＡＣＵＧＧＡＣＡＵＵＵＵＵＡＣＡＣＵＧＣＵＵＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＵＧＧＡＵＧＡＵＧＡＡＧＵＣＵＵＵＵＡＵＵＣＵＣＣＵＣＧＡＵＣＡＣＵＡＧＵＧＵＵＣＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＵＧＧＡＣＡＡＵＣＡＵＧＧＣＵＧＵＣＡＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＧＡＣＡＧＡＵＵＡＣＵＣＡＣＣＵＣＡＧＣＵＣＣＡＧＡＡＧＣＣＵＡＡＡＵＵＵＵＧＡ

野生型ヒトＯＴＣに対するＤＮＡコード配列（配列番号２）
ＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＡＡＴＧＧＴＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＴＴＴＣＧＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＴＴＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＧＧＧＡＡＧＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＣＴＣＧＡＡＣＡＡＧＡＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＣＣＡＣＡＣＡＡＧＡＴＡＴＴＣＡＴＴＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＡＡＧＴＣＴＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＧＴＧＴＡＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＴＡＴＴＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＡＴＴＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＴＴＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＴＧＴＣＡＧＡＴＴＴＧＴＡＣＣＡＴＣＣＴＡＴＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＴＡＣＣＴＣＡＣＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＴＡＴＡＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＧＧＴＣＴＴＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴＴＣＧＧＡＡＴＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＡＣＴＣＣＡＡＡＧＧＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣＧＧＡＴＧＣＴＡＧＴＧＴＡＡＣＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＡＡＴＧＴＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＡＣＡＣＴＴＧＧＡＴＡＡＧＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＡＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＣＴＴＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＴＴＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＣＧＡＴＣＡＣＴＡＧＴＧＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＴＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＡＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＴＴＡＣＴＣＡＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＴＧＡ

ヒト野生型ＯＴＣアミノ酸配列
（配列番号３）
ＭＬＦＮＬＲＩＬＬＮＮＡＡＦＲＮＧＨＮＦＭＶＲＮＦＲＣＧＱＰＬＱＮＫＶＱＬＫＧＲＤＬＬＴＬＫＮＦＴＧＥＥＩＫＹＭＬＷＬＳＡＤＬＫＦＲＩＫＱＫＧＥＹＬＰＬＬＱＧＫＳＬＧＭＩＦＥＫＲＳＴＲＴＲＬＳＴＥＴＧＦＡＬＬＧＧＨＰＣＦＬＴＴＱＤＩＨＬＧＶＮＥＳＬＴＤＴＡＲＶＬＳＳＭＡＤＡＶＬＡＲＶＹＫＱＳＤＬＤＴＬＡＫＥＡＳＩＰＩＩＮＧＬＳＤＬＹＨＰＩＱＩＬＡＤＹＬＴＬＱＥＨＹＳＳＬＫＧＬＴＬＳＷＩＧＤＧＮＮＩＬＨＳＩＭＭＳＡＡＫＦＧＭＨＬＱＡＡＴＰＫＧＹＥＰＤＡＳＶＴＫＬＡＥＱＹＡＫＥＮＧＴＫＬＬＬＴＮＤＰＬＥＡＡＨＧＧＮＶＬＩＴＤＴＷＩＳＭＧＱＥＥＥＫＫＫＲＬＱＡＦＱＧＹＱＶＴＭＫＴＡＫＶＡＡＳＤＷＴＦＬＨＣＬＰＲＫＰＥＥＶＤＤＥＶＦＹＳＰＲＳＬＶＦＰＥＡＥＮＲＫＷＴＩＭＡＶＭＶＳＬＬＴＤＹＳＰＱＬＱＫＰＫＦ

修飾ＯＴＣアミノ酸配列
（配列番号４）
ＭＬＶＦＮＬＲＩＬＬＮＮＡＡＦＲＮＧＨＮＦＭＶＲＮＦＲＣＧＱＰＬＱＮＲＶＱＬＫＧＲＤＬＬＴＬＫＮＦＴＧＥＥＩＲＹＭＬＷＬＳＡＤＬＫＦＲＩＫＱＫＧＥＹＬＰＬＬＱＧＫＳＬＧＭＩＦＥＫＲＳＴＲＴＲＬＳＴＥＴＧＦＡＬＬＧＧＨＰＣＦＬＴＴＱＤＩＨＬＧＶＮＥＳＬＴＤＴＡＲＶＬＳＳＭＡＤＡＶＬＡＲＶＹＫＱＳＤＬＤＴＬＡＫＥＡＳＩＰＩＩＮＧＬＳＤＬＹＨＰＩＱＩＬＡＤＹＬＴＬＱＥＨＹＳＳＬＫＧＬＴＬＳＷＩＧＤＧＮＮＩＬＨＳＩＭＭＳＡＡＫＦＧＭＨＬＱＡＡＴＰＫＧＹＥＰＤＡＳＶＴＫＬＡＥＱＹＡＫＥＮＧＴＫＬＬＬＴＮＤＰＬＥＡＡＨＧＧＮＶＬＩＴＤＴＷＩＳＭＧＱＥＥＥＫＫＫＲＬＱＡＦＱＧＹＱＶＴＭＫＴＡＫＶＡＡＳＤＷＴＦＬＨＣＬＰＲＫＰＥＥＶＤＤＥＶＦＹＳＰＲＳＬＶＦＰＥＡＥＮＲＫＷＴＩＭＡＶＭＶＳＬＬＴＤＹＳＰＱＬＱＫＰＫＦ

ＴＥＶ（配列番号５）

ＴＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣＡＡＧＣＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＡＣＧＡＡＣＧＡＴＡＧ

ＡＴ１Ｇ５８４２０（配列番号６）
ＡＴＴＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＣＣＧＣＣＡ

ＡＲＣ５－２（配列番号７）
ＣＴＴＡＡＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＴＡＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴｇＧＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＧＧＣＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＧＴＧＧＴＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＴＣＣＴＡＣ

ＨＣＶ（配列番号８）
ＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴ ＡＣＡＧＣＣＴＣＣＡ ＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣ ＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡ ＧＣＣＡＴＡＧＴＧＧ ＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡＣ ＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧ ＣＣＧＧＧＡＡＧＡＣ ＴＧＧＧＴＣＣＴＴＴ ＣＴＴＧＧＡＴＡＡＡ ＣＣＣＡＣＴＣＴＡＴＧＣＣＣＧＧＣＣＡＴ ＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣ ＣＣＣＣＧＣＡＡＧＡ ＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧ ＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧ ＧＧＴＴＧＣＧ

ヒトアルブミン（配列番号９）
ＡＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＴＴＡＧＴＧＣＴＡＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＡＣＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡ

ＥＭＣＶ（配列番号１０）
ＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣ ＣＣＣＣＣＣＴＡＡＣ ＧＴＴＡＣＴＧＧＣＣ ＧＡＡＧＣＣＧＣＴＴ ＧＧＡＡＴＡＡＧＧＣ ＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴ ＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴ ＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣ ＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣ ＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧ ＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧ ＧＣＣＣＧＧＡＡＡＣ ＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴ ＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧ ＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡ ＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣ ＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣ ＡＡＡＧＧＡＡＴＧＣ ＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴ ＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧ ＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧ ＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡ ＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡ ＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡ ＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣ ＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣ ＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡ ＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣ ＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧ ＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧ ＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣ ＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡ ＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧ ＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣ ＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧ ＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧ ＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴ ＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡ ＡＧＡＧＴＣＡＡＡＴ ＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣ ＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣ ＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣ ＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣ ＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡ ＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡ ＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡ ＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴ ＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴ ＧＣＴＴＴＡＣＧＴＧ ＴＧＴＴＴＡＧＴＣＧ ＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡ ＡＣＧＴＣＴＡＧＧＣ ＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣ ＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴ ＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴ ＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣ ＧＡＴＧＡＴＡＡＴ
ＨＳＰ７０－Ｐ２（配列番号１１）
ＧＴＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＣＴＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＴＡ

ＨＳＰ７０－Ｍ１（配列番号１２）
ＣＴＣＴＣＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＧＡＡＣＣＡＡＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧ

ＨＳＰ７２－Ｍ２（配列番号１３）
ＡＣＣＴＧＴＧＡＧＧＧＴＴＣＧＡＡＧＧＡＡＧＴＡＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＣＴＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧ

ＨＳＰ１７．９（配列番号１４）
ＡＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＣＧＣＡＡＡＧＡＣ

ＨＳＰ７０－Ｐ１（配列番号１５）
ＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴ

ＸＢＧ（配列番号１６）
ＣＴＡＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＴＡＣＣＡＣＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＡＡＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＡＣＣＡＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＴＡＧＣＣＡＴＴＣＧＴＡＴＣＴＧＣＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴ

ヒトハプトグロビン（配列番号１７）
ＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＣＣＧＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＧＡＴＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＣＧＡＴＡＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＧＡＣＣＣＡＴ

ヒトアポリポタンパク質Ｅ（配列番号１８）
ＡＣＧＣＣＧＡＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＣＡＣＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＡＡＡＧＡＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＴＴＣＡＣＧＣＡ

ＨＣＶ（配列番号１９）
ＴＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＡＣＣＣＴＡＧＣＴＡＣＡＣＴＣＣＡＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＴＧＣＣＧＴＡＡＣＴＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴ

マウスアルブミン（配列番号２０）
ＡＣＡＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＴＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＴＣＴＡＣ
ヒトαグロビン（配列番号２１）
ＧＣＴＧＧＡＧＣＣＴＣＧＧＴＡＧＣＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＡＣＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＡＧＴＣＴＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡ

ＥＭＣＶ（配列番号２２）
ＴＡＧＴＧＣＡＧＴＣＡＣ ＴＧＧＣＡＣＡＡＣＧ ＣＧＴＴＧＣＣＣＧＧ ＴＡＡＧＣＣＡＡＴＣ ＧＧＧＴＡＴＡＣＡＣ ＧＧＴＣＧＴＣＡＴＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧ ＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡ ＣＴＴＴＧＣＡＡＧＡ ＴＡＧＴＣＴＡＧＡＧ ＴＡＧＴＡＡＡＡＴＡ ＡＡＴＡＧＴＡＴＡＡＧ

（配列番号２３）
ＧＣＣＡＣＣ

（配列番号２４）
ＧＣＣＡ

（配列番号２５）
ＡＵＡＡＧＵＧＡＡ

＞ｍＡＲＭ５６３（配列番号２６）
ＵＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＵＡＵＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡＵＣＵＣＡＡＧＣＡＡＵＣＡＡＧＣＡＵＵＣＵＡＣＵＵＣＵＡＵＵＧＣＡＧＣＡＡＵＵＵＡＡＡＵＣＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＵＵＵＵＣＵＧＡＡＡＡＵＵＵＵＣＡＣＣＡＵＵＵＡＣＧＡＡＣＧＡＵＡＧＣＣＡＣＣＡＵＧＣＵＧＵＵＵＡＡＵＣＵＧＡＧＧＡＵＣＣＵＧＵＵＡＡＡＣＡＡＵＧＣＡＧＣＵＵＵＵＡＧＡＡＡＵＧＧＵＣＡＣＡＡＣＵＵＣＡＵＧＧＵＵＣＧＡＡＡＵＵＵＵＣＧＧＵＧＵＧＧＡＣＡＡＣＣＡＣＵＡＣＡＡＡＡＵＡＡＡＧＵＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＧＧＣＣＧＵＧＡＣＣＵＵＣＵＣＡＣＵＣＵＡＡＡＡＡＡＣＵＵＵＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＵＵＡＡＡＵＡＵＡＵＧＣＵＡＵＧＧＣＵＡＵＣＡＧＣＡＧＡＵＣＵＧＡＡＡＵＵＵＡＧＧＡＵＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＵＡＵＵＵＧＣＣＵＵＵＡＵＵＧＣＡＡＧＧＧＡＡＧＵＣＣＵＵＡＧＧＣＡＵＧＡＵＵＵＵＵＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＵＡＣＵＣＧＡＡＣＡＡＧＡＵＵＧＵＣＵＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＣＵＵＵＧＣＡＣＵＵＣＵＧＧＧＡＧＧＡＣＡＵＣＣＵＵＧＵＵＵＵＣＵＵＡＣＣＡＣＡＣＡＡＧＡＵＡＵＵＣＡＵＵＵＧＧＧＵＧＵＧＡＡＵＧＡＡＡＧＵＣＵＣＡＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＧＵＧＵＡＵＵＧＵＣＵＡＧＣＡＵＧＧＣＡＧＡＵＧＣＡＧＵＡＵＵＧＧＣＵＣＧＡＧＵＧＵＡＵＡＡＡＣＡＡＵＣＡＧＡＵＵＵＧＧＡＣＡＣＣＣＵＧＧＣＵＡＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＣＡＵＣＣＣＡＡＵＵＡＵＣＡＡＵＧＧＧＣＵＧＵＣＡＧＡＵＵＵＧＵＡＣＣＡＵＣＣＵＡＵＣＣＡＧＡＵＣＣＵＧＧＣＵＧＡＵＵＡＣＣＵＣＡＣＧＣＵＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＵＡＵＡＧＣＵＣＵＣＵＧＡＡＡＧＧＵＣＵＵＡＣＣＣＵＣＡＧＣＵＧＧＡＵＣＧＧＧＧＡＵＧＧＧＡＡＣＡＡＵＡＵＣＣＵＧＣＡＣＵＣＣＡＵＣＡＵＧＡＵＧＡＧＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＵＵＣＧＧＡＡＵＧＣＡＣＣＵＵＣＡＧＧＣＡＧＣＵＡＣＵＣＣＡＡＡＧＧＧＵＵＡＵＧＡＧＣＣＧＧＡＵＧＣＵＡＧＵＧＵＡＡＣＣＡＡＧＵＵＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＵＡＵＧＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＵＧＧＵＡＣＣＡＡＧＣＵＧＵＵＧＣＵＧＡＣＡＡＡＵＧＡＵＣＣＡＵＵＧＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＡＵＧＧＡＧＧＣＡＡＵＧＵＡＵＵＡＡＵＵＡＣＡＧＡＣＡＣＵＵＧＧＡＵＡＡＧＣＡＵＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＵＣＣＡＧＧＣＵＵＵＣＣＡＡＧＧＵＵＡＣＣＡＧＧＵＵＡＣＡＡＵＧＡＡＧＡＣＵＧＣＵＡＡＡＧＵＵＧＣＵＧＣＣＵＣＵＧＡＣＵＧＧＡＣＡＵＵＵＵＵＡＣＡＣＵＧＣＵＵＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＵＧＧＡＵＧＡＵＧＡＡＧＵＣＵＵＵＵＡＵＵＣＵＣＣＵＣＧＡＵＣＡＣＵＡＧＵＧＵＵＣＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＵＧＧＡＣＡＡＵＣＡＵＧＧＣＵＧＵＣＡＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＧＡＣＡＧＡＵＵＡＣＵＣＡＣＣＵＣＡＧＣＵＣＣＡＧＡＡＧＣＣＵＡＡＡＵＵＵＵＧＡＣＵＣＧＡＧＣＵＡＧＵＧＡＣＵＧＡＣＵＡＧＧＡＵＣＵＧＧＵＵＡＣＣＡＣＵＡＡＡＣＣＡＧＣＣＵＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＵＧＧＡＧＵＣＵＣＵＡＡＧＣＵＡＣＡＵＡＡＵＡＣＣＡＡＣＵＵＡＣＡＣＵＵＡＣＡＡＡＡＵＧＵＵＧＵＣＣＣＣＣＡＡＡＡＵＧＵＡＧＣＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣＵＧＣＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＵＵＵＣＵＵＣＡＣＡＵＵＣＵＡＧ

＞ｍＡＲＭ５６４（配列番号２７）
ＵＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＵＡＵＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡＵＣＵＣＡＡＧＣＡＡＵＣＡＡＧＣＡＵＵＣＵＡＣＵＵＣＵＡＵＵＧＣＡＧＣＡＡＵＵＵＡＡＡＵＣＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＵＵＵＵＣＵＧＡＡＡＡＵＵＵＵＣＡＣＣＡＵＵＵＡＣＧＡＡＣＧＡＵＡＧＣＣＡＣＣＡＵＧＣＵＣＵＵＵＡＡＵＣＵＧＣＧＣＡＵＣＵＵＡＣＵＧＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＡＵＵＣＣＧＧＡＡＣＧＧＵＣＡＣＡＡＣＵＵＣＡＵＧＧＵＣＣＧＣＡＡＵＵＵＣＣＧＣＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＣＧＣＵＵＣＡＡＡＡＣＡＡＧＧＵＣＣＡＧＣＵＧＡＡＧＧＧＡＣＧＧＧＡＵＣＵＧＣＵＧＡＣＡＣＵＧＡＡＧＡＡＣＵＵＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＵＧＣＵＧＵＧＧＣＵＣＡＧＣＧＣＡＧＡＣＵＵＧＡＡＧＵＵＣＣＧＧＡＵＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＵＡＣＵＵＧＣＣＣＣＵＧＣＵＧＣＡＡＧＧＡＡＡＧＵＣＧＣＵＧＧＧＡＡＵＧＡＵＵＵＵＵＧＡＧＡＡＧＣＧＧＵＣＡＡＣＵＣＧＣＡＣＣＡＧＡＣＵＣＵＣＣＡＣＣＧＡＡＡＣＵＧＧＵＵＵＣＧＣＡＣＵＧＣＵＵＧＧＣＧＧＧＣＡＣＣＣＵＵＧＣＵＵＣＣＵＧＡＣＧＡＣＵＣＡＧＧＡＣＡＵＣＣＡＣＣＵＣＧＧＣＧＵＧＡＡＣＧＡＡＵＣＧＣＵＡＡＣＣＧＡＵＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＵＧＣＵＵＵＣＵＵＣＣＡＵＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＵＧＣＵＧＧＣＣＡＧＧＧＵＧＵＡＣＡＡＧＣＡＧＵＣＣＧＡＣＣＵＣＧＡＵＡＣＣＵＵＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＧＣＵＵＣＣＡＵＵＣＣＣＡＵＣＡＵＣＡＡＣＧＧＣＣＵＧＡＧＣＧＡＣＣＵＧＵＡＣＣＡＣＣＣＡＡＵＣＣＡＡＡＵＣＣＵＧＧＣＵＧＡＣＵＡＣＣＵＧＡＣＣＣＵＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＵＡＣＡＧＣＡＧＣＣＵＧＡＡＧＧＧＵＣＵＧＡＣＣＣＵＧＵＣＡＵＧＧＡＵＵＧＧＣＧＡＵＧＧＡＡＡＣＡＡＵＡＵＵＣＵＧＣＡＣＵＣＣＡＵＣＡＵＧＡＵＧＵＣＣＧＣＣＧＣＧＡＡＧＵＵＣＧＧＡＡＵＧＣＡＵＣＵＧＣＡＡＧＣＣＧＣＣＡＣＵＣＣＡＡＡＡＧＧＡＵＡＣＧＡＡＣＣＧＧＡＵＧＣＧＵＣＣＧＵＧＡＣＣＡＡＧＵＵＧＧＣＧＧＡＡＣＡＧＵＡＣＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＵＵＣＵＧＣＵＧＡＣＵＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＵＣＧＡＧＧＣＵＧＣＧＣＡＵＧＧＧＧＧＣＡＡＣＧＵＧＣＵＧＡＵＵＡＣＣＧＡＣＡＣＣＵＧＧＡＵＣＵＣＣＡＵＧＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＵＧＣＡＧＧＣＡＵＵＣＣＡＧＧＧＧＵＡＣＣＡＧＧＵＣＡＣＣＡＵＧＡＡＡＡＣＣＧＣＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＧＣＵＵＣＧＧＡＣＵＧＧＡＣＵＵＵＣＣＵＧＣＡＵＵＧＣＣＵＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＵＣＧＡＣＧＡＣＧＡＡＧＵＧＵＵＣＵＡＣＵＣＧＣＣＵＣＧＧＵＣＣＣＵＧＧＵＧＵＵＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＵＧＧＡＣＣＡＵＣＡＵＧＧＣＣＧＵＧＡＵＧＧＵＧＵＣＣＵＵＧＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵＡＵＡＧＣＣＣＧＣＡＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＣＣＵＡＡＧＵＵＣＵＡＧＣＵＣＧＡＧＣＵＡＧＵＧＡＣＵＧＡＣＵＡＧＧＡＵＣＵＧＧＵＵＡＣＣＡＣＵＡＡＡＣＣＡＧＣＣＵＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＵＧＧＡＧＵＣＵＣＵＡＡＧＣＵＡＣＡＵＡＡＵＡＣＣＡＡＣＵＵＡＣＡＣＵＵＡＣＡＡＡＡＵＧＵＵＧＵＣＣＣＣＣＡＡＡＡＵＧＵＡＧＣＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣＵＧＣＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＵＵＵＣＵＵＣＡＣＡＵＵＣＵＡＧ

＞ｍＡＲＭ５６５（配列番号２８）
ＵＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＵＡＵＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡＵＣＵＣＡＡＧＣＡＡＵＣＡＡＧＣＡＵＵＣＵＡＣＵＵＣＵＡＵＵＧＣＡＧＣＡＡＵＵＵＡＡＡＵＣＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＵＵＵＵＣＵＧＡＡＡＡＵＵＵＵＣＡＣＣＡＵＵＵＡＣＧＡＡＣＧＡＵＡＧＣＣＡＣＣＡＵＧＣＵＧＵＵＵＡＡＣＣＵＡＣＧＵＡＵＵＵＵＧＣＵＣＡＡＣＡＡＵＧＣＡＧＣＣＵＵＵＡＧＡＡＡＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＵＵＵＡＵＧＧＵＵＣＧＡＡＡＣＵＵＵＣＧＣＵＧＣＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＵＧＣＡＧＡＡＣＡＡＧＧＵＣＣＡＧＣＵＧＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＡＵＵＵＧＣＵＣＡＣＧＣＵＧＡＡＧＡＡＣＵＵＵＡＣＵＧＧＣＧＡＡＧＡＡＡＵＣＡＡＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＧＵＵＧＵＣＣＧＣＧＧＡＣＣＵＣＡＡＧＵＵＵＣＧＧＡＵＵＡＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＧＡＧＵＡＵＣＵＧＣＣＡＣＵＧＣＵＧＣＡＡＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＵＣＧＧＣＡＵＧＡＵＣＵＵＣＧＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＡＣＵＣＧＧＡＣＣＡＧＧＣＵＧＡＧＵＡＣＣＧＡＡＡＣＵＧＧＣＵＵＣＧＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＵＧＧＡＣＡＵＣＣＡＵＧＵＵＵＵＣＵＧＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＡＣＡＵＵＣＡＵＣＵＧＧＧＣＧＵＧＡＡＣＧＡＧＡＧＵＣＵＧＡＣＧＧＡＣＡＣＡＧＣＵＣＧＣＧＵＵＣＵＧＵＣＣＵＣＵＡＵＧＧＣＵＧＡＵＧＣＧＧＵＧＵＵＧＧＣＣＣＧＧＧＵＣＵＡＵＡＡＧＣＡＧＵＣＣＧＡＵＵＵＧＧＡＣＡＣＣＵＵＧＧＣＵＡＡＧＧＡＡＧＣＵＡＧＣＡＵＡＣＣＧＡＵＵＡＵＣＡＡＵＧＧＧＣＵＧＵＣＣＧＡＣＣＵＧＵＡＵＣＡＣＣＣＵＡＵＵＣＡＡＡＵＣＣＵＧＧＣＣＧＡＣＵＡＣＣＵＣＡＣＡＣＵＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＵＡＵＡＧＣＵＣＡＵＵＧＡＡＧＧＧＡＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＧＣＵＧＧＡＵＡＧＧＧＧＡＣＧＧＡＡＡＣＡＡＣＡＵＣＣＵＡＣＡＵＡＧＣＡＵＵＡＵＧＡＵＧＵＣＣＧＣＵＧＣＣＡＡＧＵＵＵＧＧＣＡＵＧＣＡＵＣＵＵＣＡＡＧＣＣＧＣＣＡＣＧＣＣＡＡＡＧＧＧＵＵＡＵＧＡＧＣＣＣＧＡＣＧＣＧＵＣＡＧＵＧＡＣＡＡＡＧＣＵＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＵＡＣＧＣＵＡＡＧＧＡＧＡＡＵＧＧＵＡＣＣＡＡＡＵＵＡＣＵＧＣＵＧＡＣＵＡＡＵＧＡＵＣＣＡＣＵＧＧＡＧＧＣＵＧＣＡＣＡＵＧＧＣＧＧＣＡＡＵＧＵＡＣＵＧＡＵＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＵＧＧＡＵＣＵＣＧＡＵＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＵＵＣＡＧＧＣＣＵＵＣＣＡＡＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＣＡＣＣＡＵＧＡＡＡＡＣＡＧＣＵＡＡＧＧＵＵＧＣＡＧＣＡＵＣＵＧＡＵＵＧＧＡＣＣＵＵＵＣＵＧＣＡＣＵＧＵＣＵＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＵＧＧＡＣＧＡＵＧＡＡＧＵＡＵＵＣＵＡＵＡＧＣＣＣＡＣＧＧＡＧＵＵＵＧＧＵＧＵＵＣＣＣＵＧＡＧＧＣＵＧＡＡＡＡＵＡＧＧＡＡＧＵＧＧＡＣＡＡＵＵＡＵＧＧＣＣＧＵＡＡＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＵＵＡＡＣＣＧＡＣＵＡＣＵＣＵＣＣＧＣＡＡＣＵＧＣＡＧＡＡＡＣＣＵＡＡＧＵＵＵＵＡＧＣＵＣＧＡＧＣＵＡＧＵＧＡＣＵＧＡＣＵＡＧＧＡＵＣＵＧＧＵＵＡＣＣＡＣＵＡＡＡＣＣＡＧＣＣＵＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＵＧＧＡＧＵＣＵＣＵＡＡＧＣＵＡＣＡＵＡＡＵＡＣＣＡＡＣＵＵＡＣＡＣＵＵＡＣＡＡＡＡＵＧＵＵＧＵＣＣＣＣＣＡＡＡＡＵＧＵＡＧＣＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣＵＧＣＵＣＣＵＡＡＵＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＵＵＵＣＵＵＣＡＣＡＵＵＣＵＡＧ

＞ｍＡＲＭ５６６（配列番号２９）
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＞ｍＡＲＭ５６７（配列番号３０）
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＞ｍＡＲＭ５６８（配列番号３１）
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＞ｍＡＲＭ５６９（配列番号３２）
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＞ｍＡＲＭ５７０（配列番号３３）
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＞ｍＡＲＭ５７１（配列番号３４）
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＞ｍＡＲＭ５７２（配列番号３５）
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＞ｍＡＲＭ５７３（配列番号３６）
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＞ｍＡＲＭ５７４（配列番号３７）
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＞ｍＡＲＭ５７５（配列番号３８）
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＞ｍＡＲＭ７０８（配列番号３９）
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＞ｍＡＲＭ７０９（配列番号４０）
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＞ｍＡＲＭ７１０（配列番号４１）
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＞ｍＡＲＭ７１１（配列番号４２）
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＞ｍＡＲＭ７１２（配列番号４３）
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＞ｍＡＲＭ７１３（配列番号４４）
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＞ｍＡＲＭ７１４（配列番号４５）
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＞ｍＡＲＭ７１５（配列番号４６）
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＞ｍＡＲＭ７１６（配列番号４７）
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＞ｍＡＲＭ７１７（配列番号４８）
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＞ｍＡＲＭ７１８（配列番号４９）
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＞ｍＡＲＭ７１９（配列番号５０）
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＞ｍＡＲＭ７２０（配列番号５１）
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＞ｍＡＲＭ７２１（配列番号５２）
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＞ｍＡＲＭ７２２（配列番号５３）
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＞ｍＡＲＭ７２３（配列番号５４）
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＞ｍＡＲＭ７２４（配列番号５５）
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＞ｍＡＲＭ７２５（配列番号５６）
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＞ｍＡＲＭ７２６（配列番号５７）
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＞ｍＡＲＭ７２８（配列番号５９）
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＞ｍＡＲＭ７２９（配列番号６０）
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＞ｍＡＲＭ１７８７（配列番号６１）
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＞ｍＡＲＭ１７８８（配列番号６２）
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＞ｍＡＲＭ１７８９（配列番号６３）
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＞ｍＡＲＭ１７９０（配列番号６４）
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＞ｍＡＲＭ１７９１（配列番号６５）
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＞ｍＡＲＭ１７９２（配列番号６６）
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＞ｍＡＲＭ１７９３（配列番号６７）
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＞ｍＡＲＭ１７９４（配列番号６８）
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＞ｍＡＲＭ１７９５（配列番号６９）
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＞ｍＡＲＭ１７９６（配列番号７０）
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＞ｍＡＲＭ１８００（配列番号７４）
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＞ｍＡＲＭ１８０１（配列番号７５）
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＞ｍＡＲＭ１８０２（配列番号７６）
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＞ｍＡＲＭ１８０３（配列番号７７）
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＞ｍＡＲＭ１８０４（配列番号７８）
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＞ｍＡＲＭ１８０５（配列番号７９）
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＞ｍＡＲＭ１８０６（配列番号８０）
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＞ｍＡＲＭ１８０８（配列番号８１）
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＞ｍＡＲＭ１８０９（配列番号８２）
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＞ｍＡＲＭ１８１６（配列番号８３）
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＞ｍＡＲＭ１８２２（配列番号８４）
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＞ｍＡＲＭ１８２３（配列番号８５）
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＞ｍＡＲＭ１８４０（配列番号８６）
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＞ｍＡＲＭ１８４１（配列番号８７）
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＞ｍＡＲＭ１８４２（配列番号８８）
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＞ｍＡＲＭ１８４３（配列番号８９）
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＞ｍＡＲＭ１８４４（配列番号９０）
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＞ｍＡＲＭ１８４５（配列番号９１）
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＞ｍＡＲＭ１８４６（配列番号９２）
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＞ｍＡＲＭ１８４７（配列番号９３）
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＞ｍＡＲＭ１８８２（配列番号９４）
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＞ｍＡＲＭ１８８３（配列番号９５）
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＞ｍＡＲＭ１８８４（配列番号９６）
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＞ｍＡＲＭ１８８５（配列番号９７）
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＞ｍＡＲＭ１８８６（配列番号９８）
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＞ｍＡＲＭ１８８７（配列番号９９）
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＞ｍＡＲＭ１８８８（配列番号１００）
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＞ｍＡＲＭ１８８９（配列番号１０１）
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＞ｍＡＲＭ１８９０（配列番号１０２）
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＞ｍＡＲＭ１８９１ （配列番号：１０３）
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＞ｍＡＲＭ１８９８（配列番号１０４）
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＞ｍＡＲＭ１８９９（配列番号１０５）
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＞ｍＡＲＭ１９００（配列番号１０６）
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＞ｍＡＲＭ１９０３（配列番号１０７）
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＞ｍＡＲＭ１９０４（配列番号１０８）
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＞ｍＡＲＭ１９０５（配列番号１０９）
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＞ｍＡＲＭ１９０６（配列番号１１０）
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＞ｍＡＲＭ１９０７（配列番号１１１）
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＞ｍＡＲＭ１９０８ （配列番号：１１２）
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＞ｍＡＲＭ１９１５（配列番号１１３）
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＞ｍＡＲＭ１９１６（配列番号１１４）
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＞ｍＡＲＭ１９１７（配列番号１１５）
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＞ｍＡＲＭ１９１８（配列番号１１６）
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＞ｍＡＲＭ１９１９（配列番号１１７）
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＞ｍＡＲＭ１９２０（配列番号１１８）
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＞ｍＡＲＭ１９２１（配列番号１１９）
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＞ｍＡＲＭ１９２５（配列番号１２０）
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＞ｍＡＲＭ１９２６（配列番号１２１）
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＞ｍＡＲＭ１９２７（配列番号１２２）
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＞ｍＡＲＭ１９２８（配列番号１２３）
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＞ｍＡＲＭ１９２９（配列番号１２４）
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ＡＴ１Ｇ６７０９０＞（配列番号１２５）
ＣＡＣＡＡＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡ

ＡＴ１Ｇ３５７２０＞（配列番号１２６）

ＡＡＣＡＣＵＡＡＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＡＡＡ

ＡＴ５Ｇ４５９００＞（配列番号１２７）
ＣＵＣＡＧＡＡＡＧＡＵＡＡＧＡＵＣＡＧＣＣ

＞ｐＡＲＭ５６３（配列番号１２８）
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＞ｐＡＲＭ５６４（配列番号１２９）
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＞ｐＡＲＭ５６５（配列番号１３０）
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＞ｐＡＲＭ５６８（配列番号１３３）
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＞ｐＡＲＭ５６９（配列番号１３４）
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＞ｐＡＲＭ５７０（配列番号１３５）
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＞ｐＡＲＭ５７１（配列番号１３６）
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＞ｐＡＲＭ５７２（配列番号１３７）
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＞ｐＡＲＭ５７３（配列番号１３８）
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＞ｐＡＲＭ５７４（配列番号１３９）
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＞ｐＡＲＭ５７５（配列番号１４０）
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＞ｐＡＲＭ７０８（配列番号１４１）
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＞ｐＡＲＭ７１３（配列番号１４６）
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＞ｐＡＲＭ７１４（配列番号１４７）
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＞ｐＡＲＭ７１５（配列番号１４８）
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＞ｐＡＲＭ７１６（配列番号１４９）
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＞ｐＡＲＭ７１７（配列番号１５０）
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＞ｐＡＲＭ７１８（配列番号１５１）
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＞ｐＡＲＭ７１９（配列番号１５２）
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＞ｐＡＲＭ７２０（配列番号１５３）
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＞ｐＡＲＭ７２１（配列番号１５４）
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＞ｐＡＲＭ７２３（配列番号１５６）
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＞ｐＡＲＭ７２４（配列番号１５７）
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＞ｐＡＲＭ７２６（配列番号１５９）
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＞ｐＡＲＭ１７８９（配列番号１６５）
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＞ｐＡＲＭ１７９０（配列番号１６６）
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＞ｐＡＲＭ１７９１（配列番号１６７）
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＞ｐＡＲＭ１７９２（配列番号１６８）
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＞ｐＡＲＭ１７９３（配列番号１６９）
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＞ｐＡＲＭ１７９４（配列番号１７０）
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＞ｐＡＲＭ１７９５（配列番号１７１）
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＞ｐＡＲＭ１７９８（配列番号１７４）
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＞ｐＡＲＭ１７９９（配列番号１７５）
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＞ｐＡＲＭ１８００（配列番号１７６）
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＞ｐＡＲＭ１８０１（配列番号１７７）
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＞ｐＡＲＭ１８０２（配列番号１７８）
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＞ｐＡＲＭ１８０３（配列番号１７９）
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＞ｐＡＲＭ１８０４（配列番号１８０）
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＞ｐＡＲＭ１８０５（配列番号１８１）
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＞ｐＡＲＭ１８０６（配列番号１８２）
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＞ｐＡＲＭ１８０８（配列番号１８３）
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＞ｐＡＲＭ１８０９（配列番号１８４）
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＞ｐＡＲＭ１８１６（配列番号１８５）
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＞ｐＡＲＭ１８２２（配列番号１８６）
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＞ｐＡＲＭ１８２３（配列番号１８７）
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＞ｐＡＲＭ１８４０（配列番号１８８）
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＞ｐＡＲＭ１８４１（配列番号１８９）
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＞ｐＡＲＭ１８４２（配列番号１９０）
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＞ｐＡＲＭ１８４３（配列番号１９１）
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＞ｐＡＲＭ１８４４（配列番号１９２）
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＞ｐＡＲＭ１８４５（配列番号１９３）
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＞ｐＡＲＭ１８４６（配列番号１９４）
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＞ｐＡＲＭ１８４７（配列番号１９５）
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＞ｐＡＲＭ１８８７（配列番号２０１）
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＞ｐＡＲＭ１８９９（配列番号２０７）
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＞ｐＡＲＭ１９００（配列番号２０８）
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＞ｐＡＲＭ１９０３（配列番号２０９）
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＞ｐＡＲＭ１９０４（配列番号２１０）
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＞ｐＡＲＭ１９０５（配列番号２１１）
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＞ｐＡＲＭ１９０６（配列番号２１２）
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＞ｐＡＲＭ１９０７（配列番号：２１３）
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＞ｐＡＲＭ１９０８（配列番号２１４）
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＞ｐＡＲＭ１９１５（配列番号２１５）
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＞ｐＡＲＭ１９１６（配列番号２１６）
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＞ｐＡＲＭ１９１７（配列番号２１７）
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＞ｐＡＲＭ１９１８（配列番号２１８）
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＞ｐＡＲＭ１９１９（配列番号２１９）
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＞ｐＡＲＭ１９２０（配列番号２２０）
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＞ｐＡＲＭ１９２１（配列番号２２１）
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＞ｐＡＲＭ１９２５（配列番号２２２）
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＞ｐＡＲＭ１９２６（配列番号２２３）
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＞ｐＡＲＭ１９２７（配列番号２２４）
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＞ｐＡＲＭ１９２８（配列番号２２５）
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＞ｐＡＲＭ１９２９（配列番号２２６）
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＞ｐＡＲＭ２０１６（配列番号２２７）
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＞ｐＡＲＭ２２６０（配列番号２２８）
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＞ｐＡＲＭ２２６２（配列番号２２９）
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ｍＡＲＭ２２６０（配列番号２５１）
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ｍＡＲＭ２２６２（配列番号２５２）
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ｍＡＲＭ２０１６（配列番号２５３）
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コンストラクト１７９９のオープンリーディングフレーム（配列番号２５４）
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コンストラクト１９２１のオープンリーディングフレーム（配列番号２５５）
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コンストラクト２０１６のオープンリーディングフレーム（配列番号２５６）
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コンストラクト２２６０のオープンリーディングフレーム（配列番号２５７）
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コンストラクト２２６２のオープンリーディングフレーム（配列番号２５８）
ＡＵＧＣＵＧＧＵＡＵＵＣＡＡＣＣＵＧＣＧＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＵＵＣＣＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＣＵＵＣＡＵＧＧＵＧＣＧＣＡＡＣＵＵＣＣＧＣＵＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＵＧＣＡＧＡＡＣＣＧＧＧＵＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＧＡＣＣＵＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＡＡＣＵＵＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＧＡＧＡＵＣＣＧＧＵＡＣＡＵＧＣＵＧＵＧＧＣＵＧＡＧＣＧＣＣＧＡＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＣＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＵＡＣＣＵＧＣＣＣＣＵＧＣＵＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＣＵＧＧＧＣＡＵＧＡＵＣＵＵＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＵＧＡＧＣＡＣＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＵＵＣＧＣＣＣＵＧＣＵＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＵＧＣＵＵＣＣＵＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＵＣＣＡＣＣＵＧＧＧＣＧＵＧＡＡＣＧＡＧＡＧＣＣＵＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＵＧＣＵＧＡＧＣＡＧＣＡＵＧＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＵＧＣＵＧＧＣＣＣＧＣＧＵＧＵＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＣＣＵＧＧＡＣＡＣＣＣＵＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＵＣＣＣＣＡＵＣＡＵＣＡＡＣＧＧＣＣＵＧＡＧＣＧＡＣＣＵＧＵＡＣＣＡＣＣＣＣＡＵＣＣＡＧＡＵＣＣＵＧＧＣＣＧＡＣＵＡＣＣＵＧＡＣＣＣＵＧＣＡＧＧＡＧＣＡＣＵＡＣＡＧＣＡＧＣＣＵＧＡＡＧＧＧＣＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＧＣＵＧＧＡＵＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＵＣＣＵＧＣＡＣＡＧＣＡＵＣＡＵＧＡＵＧＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＵＵＣＧＧＣＡＵＧＣＡＣＣＵＧＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵＡＣＧＡＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＵＧＡＣＣＡＡＧＣＵＧＧＣＣＧＡＧＣＡＧＵＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＡＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＵＧＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＧＣＧＧＣＡＡＣＧＵＧＣＵＧＡＵＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＵＧＧＡＵＣＡＧＣＡＵＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＣＵＧＣＡＧＧＣＣＵＵＣＣＡＧＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＵＧＡＣＣＡＵＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＵＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＡＣＵＧＧＡＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＵＧＣＣＵＧＣＣＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＵＧＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＵＧＵＵＣＵＡＣＡＧＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＧＵＵＣＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧＵＧＧＡＣＣＡＵＣＡＵＧＧＣＣＧＵＧＡＵＧＧＵＧＡＧＣＣＵＧＣＵＧＡＣＣＧＡＣＵＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＵＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＵＵＣＵＧＡ

Claims (71)

  1. 組成物であって、
    ａ．オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）活性を有する酵素をコードするｍＲＮＡと、
    ｂ．
    Figure 2023516676000064
     から選択されるイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質製剤と、を含む前記組成物。
  2. 前記ｍＲＮＡが、配列番号３または配列番号４の配列に少なくとも９５％の同一性を有するＯＴＣ酵素をコードする、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ｍＲＮＡが、配列番号３の配列からなるＯＴＣ酵素をコードする、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ｍＲＮＡが、配列番号４の配列からなるＯＴＣ酵素をコードする、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２５４～２５８から選択される配列を有するコード領域を含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２５４の配列を有するコード領域を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２５５の配列を有するコード領域を含む、請求項５に記載の組成物。
  8. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２５６の配列を有するコード領域を含む、請求項５に記載の組成物。
  9. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２５７の配列を有するコード領域を含む、請求項５に記載の組成物。
  10. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２５８の配列を有するコード領域を含む、請求項５に記載の組成物。
  11. 前記ｍＲＮＡが、配列番号６の配列を含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２３または配列番号２４の配列を有するコザック配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  13. 前記ｍＲＮＡが、配列番号１６～２２から選択される配列を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記ｍＲＮＡが、約６０～約１２５個の連続アデニンヌクレオチドを含む、３’ポリ－アデノシン（ポリＡ）テールをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記ｍＲＮＡが５’キャップをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記５’キャップが、式キャップＩＶ
    Figure 2023516676000065
     の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＧｍである、請求項１５に記載の組成物。
    ［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれＯＨであり、Ｒ３はＯＣＨ３であり、ｎは１であり、各Ｌはジエステル結合により結合したホスフェートであり、キャップＩＶのｍＲＮＡは、その５’末端で結合した、前記ＯＴＣ活性を有する酵素をコードする前記ｍＲＮＡである。］
  17. 前記５’キャップが、式キャップＸＩ
    Figure 2023516676000066
     の構造を有するｍ７ＧｐｐｐＡｍｐＧである、請求項１５に記載の組成物。
    ［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４はそれぞれＯＨであり、ｎは１であり、各Ｌはジエステル結合により結合したホスフェートであり、キャップＸＩのｍＲＮＡは、その５’末端で結合した、前記ＯＴＣ活性を有する酵素をコードする前記ｍＲＮＡである。］
  18. 前記ｍＲＮＡが、配列番号１、７３、１１９、及び２５１～２５３から選択される配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記ｍＲＮＡが、配列番号１の配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記ｍＲＮＡが、配列番号７３の配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
  21. 前記ｍＲＮＡが、配列番号１１９の配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
  22. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２５１の配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
  23. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２５２の配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
  24. 前記ｍＲＮＡが、配列番号２５３の配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
  25. 前記ｍＲＮＡのウリジンヌクレオチドの約１％～約１００％が、５－メトキシウリジンまたはＮ１－メチルシュードウリジンである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記ｍＲＮＡの前記ウリジンヌクレオチドの１００％が５－メトキシウリジンである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ｍＲＮＡの前記ウリジンヌクレオチドの１００％がＮ１－メチルシュードウリジンである、請求項２５に記載の組成物。
  28. 前記イオン化可能なカチオン性脂質が
    Figure 2023516676000067
     である、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 前記イオン化可能なカチオン性脂質が
    Figure 2023516676000068
     である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 前記イオン化可能なカチオン性脂質が
    Figure 2023516676000069
     である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の組成物。
  31. 前記脂質製剤が脂質ナノ粒子を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  32. 前記脂質ナノ粒子が、約１００ｎｍ未満の平均粒径を有する、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記脂質ナノ粒子が、約５５ｎｍ～約８５ｎｍの平均粒径を有する、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記脂質ナノ粒子が、前記ｍＲＮＡの少なくとも約５０％を封入する、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の組成物。
  35. 前記脂質ナノ粒子が、前記ｍＲＮＡの少なくとも約８５％を封入する、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記脂質製剤が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）から選択されるヘルパー脂質をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  37. 前記ヘルパー脂質がジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項３６に記載の組成物。
  38. 前記脂質製剤がコレステロールをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  39. 前記脂質製剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  40. 前記ＰＥＧ－脂質複合体がＰＥＧ－ＤＭＧである、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記ＰＥＧ－ＤＭＧがＰＥＧ２０００－ＤＭＧである、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記脂質製剤が、約４８ｍｏｌ％～約６６ｍｏｌ％の前記イオン化可能なカチオン性脂質、約２ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約２５ｍｏｌ％～約４２ｍｏｌ％のコレステロール、及び、約０．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  43. 前記脂質製剤が、約５０ｍｏｌ％～約６１ｍｏｌ％の前記イオン化可能なカチオン性脂質、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約２９ｍｏｌ％～約３８ｍｏｌ％のコレステロール、及び、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む、請求項４２に記載の組成物。
  44. 前記脂質製剤が、約５６ｍｏｌ％～約５８ｍｏｌ％の前記イオン化可能なカチオン性脂質、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、約３１ｍｏｌ％～約３４ｍｏｌ％のコレステロール、及び、約１．２５ｍｏｌ％～約１．７５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－ＤＭＧを含む、請求項４２に記載の組成物。
  45. 前記組成物が、約５０：１～約１０：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  46. 前記組成物が、約４０：１～約２０：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する、請求項４５に記載の組成物。
  47. 前記組成物が、約３５：１～約２５：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する、請求項４５に記載の組成物。
  48. 前記組成物が、約３２：１～約２８：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する、請求項４５に記載の組成物。
  49. 前記組成物が、約３１：１～約２９：１の全脂質：ｍＲＮＡ重量比を有する、請求項４５に記載の組成物。
  50. 前記組成物が、約７．４のｐＨでＨＥＰＥＳ緩衝液を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  51. 前記ＨＥＰＥＳ緩衝液が、約７ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項５０に記載の組成物。
  52. 前記組成物が、約２．０ｍｇ／ｍＬ～約４．０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌをさらに含む、請求項５０または５１に記載の組成物。
  53. 前記組成物が、１種以上の凍結保護剤をさらに含む、請求項５０～５２のいずれか１項に記載の組成物。
  54. 前記１種以上の凍結保護剤が、スクロース、グリセロール、または、スクロースとグリセロールの組み合わせから選択される、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記組成物が、約７０ｍｇ／ｍＬ～約１１０ｍｇ／ｍＬの濃度のスクロースと、約５０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬの濃度のグリセロールの組み合わせを含む、請求項５４に記載の組成物。
  56. 細胞内でのオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素の産生方法であって、前記細胞を、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
  57. 前記細胞が肝細胞である、請求項５６に記載の方法。
  58. オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療方法であって、前記治療を必要とする対象に、治療に有効な量の、請求項１～５５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  59. 前記対象が成人である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記対象が子どもである、請求項５８に記載の方法。
  61. ＯＴＣ活性を有する酵素が、前記対象の肝細胞で産生される、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記投与することが、静脈内投与を含む、請求項５８～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記組成物が、前記対象に、少なくとも１ヶ月に１回投与される、請求項５８～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記組成物が、前記対象に、少なくとも１ヶ月に２回投与される、請求項５８～６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記組成物が前記対象に、前記対象の１ｋｇ当たり約０．２ｍｇのｍＲＮＡ～前記対象の１ｋｇ当たり約１０ｍｇの用量で、投与される、請求項５８～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 哺乳類における、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素の発現方法であって、前記哺乳類に、請求項１～５５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  67. オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療における、請求項１～５５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  68. オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素欠損症を有することが疑われる対象への、治療的介入を施す方法であって、
    （ｉ）前記対象において、ＯＴＣ酵素活性指標のレベルを測定することと、
    （ｉｉ）ＯＴＣ活性指標が不十分なＯＴＣ酵素活性をシグナル伝達する場合に、前記対象に治療的介入を施すことと、を含み、前記治療的介入が、請求項１～５５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  69. 前記対象がヒトの新生児である、請求項６８に記載の方法。
  70. ＯＴＣ酵素活性指標のレベルを測定することが、肝臓生検におけるＯＴＣ酵素レベルを測定すること、前記対象の血液試料における窒素レベルを測定すること、肝臓生検におけるシトルリンレベルを測定すること、及び、前記対象の尿試料におけるオロチン酸を測定することから選択される、請求項６８または６９に記載の方法。
  71. ＯＴＣ欠損症を患うと識別された対象における、ＯＴＣ欠損症の治療方法であって、前記対象に、請求項１～５５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含み、配列番号３または配列番号４の配列を含むＯＴＣ酵素が前記対象で発現する、前記方法。
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