JP2023512089A

JP2023512089A - 二重特異性第ｖｉｉｉ因子模倣抗体

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Publication number: JP2023512089A
Application number: JP2022546506A
Authority: JP
Inventors: キャスパー・ランバース; ヤコブ・ルンド; グスタフ・ローダー; ビャーネ・グラム・ハンセン; ピア・ジェイ・グライセン; ニコライ・ローレンゼン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2020-01-30
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2023-03-23
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: JP7705406B2; CN115052898A; EP4097141A1; WO2021152066A1

Abstract

本発明は、凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および／またはその活性型形態第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、ならびに第Ｘ因子（ＦＸ）および／またはその活性型形態第Ｘａ因子（ＦＸａ）と結合し、ＦＩＸａによってＦＸ活性を促進することができる二重特異性抗体、ならびに血液凝固障害、例えば、阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａを患う対象者を治療するための方法および組成物に関する。

Description

配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表とともに提出される。配列表の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

血友病ＡおよびＢを有するヒトなどの血液凝固障害を有する患者では、凝固カスケードの様々な工程が、例えば、機能的な凝固因子が欠如しているまたは存在が不十分であることに起因して、機能不全となる。そのような凝固カスケードの一部の機能不全は、不十分な血液凝固および潜在的に生命を脅かす出血、または関節などの内部器官への損傷をもたらす。

一般的に血友病Ａと呼ばれる凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損症は、世界中の約４２０，０００人に影響を及ぼす先天性出血障害であり、そのうち約１０５，０００人が現在診断されている。

血友病Ａを有する患者は、外因性ＦＶＩＩＩなどの凝固因子補充療法を受ける場合がある。従来の治療は、出血エピソードの予防法または要求治療として提供される、補充療法からなる。最近まで、重度の血友病Ａを有する患者に対する予防処置には、血漿由来ＦＶＩＩＩもしくは組み換えＦＶＩＩＩ、またはその長時間作用型変異体のいずれかを用いた、１週間に最大３回の静脈注射が含まれた。

しかしながら、このような患者は、こうした外因性因子に対する中和抗体、いわゆる阻害物質を発生し、以前に効率的だった療法も無効にするリスクがある。有するか、または有しない血友病Ａ患者は、部分的に先天性であり、部分的に後天性である血液凝固障害の非限定的な例である。ＦＶＩＩＩに対する阻害物質が発生した患者は、従来の補充療法で治療することができない。外因性凝固因子は、静脈内にのみ投与される場合があり、これは患者にとってかなりの不便であり、また不快である。

ＦＶＩＩＩ活性の低下または欠如によって引き起こされる不適切なＦＸａ形成およびトロンビン生成の低下は、血友病Ａ患者の出血素因の根底にある理由である。

ＦＸの酵素活性形態ＦＸａへのタンパク質分解変換は、ＦＩＸａおよびその補因子活性型ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）を含む固有のＦＸ活性化複合体によって達成することができる。補因子結合は、ＦＩＸａの酵素活性を約５桁増加させ、非特許文献１によって概説されているように複数のメカニズムを通して生じると考えられている。特に、ＦＶＩＩＩａは、ＦＸに対するタンパク質分解活性を増加させたＦＩＸａの構造を安定化させることがわかっている（非特許文献２）。この観察に基づき、抗体が様々なタンパク質間相互作用を模倣できる多用途の結合タンパク質であることを認識し、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒらは、５２８０個のハイブリドーマ上清のスクリーニングから、リン脂質表面およびカルシウムの存在下で、ただし天然補因子ＦＶＩＩＩａの非存在下で、ＦＩＸａによるＦＸ活性化を促進する能力を特徴とするアゴニスト抗ＦＩＸ（ａ）抗体のスクリーニングを実施し、８８個が、様々な程度のＦＩＸａアゴニスト活性（特許文献１および特許文献２を参照のこと）を示す抗体を産生することがわかった。最近、新薬、エミシズマブ（ＨＥＭＬＩＢＲＡ（登録商標））（ＡＣＥ９１０としても知られる）は、従来の補充療法の因子に対する阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａの皮下予防処置について承認された。エミシズマブは血友病Ａの治療のためにＣｈｕｇａｉＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＲｏｃｈｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたヒト化二重特異性抗ＦＩＸ（ａ）／抗ＦＸ（ａ）モノクローナル抗体である。エミシズマブは、ＦＶＩＩＩ補因子機能（非特許文献３および特許文献３を参照）を模倣するように設計されている。ミリリットル血漿当たり３０～５０μｇのエミシズマブを用いた治療は、デシリットル血漿当たり、少なくとも１０～１５ＩＵの同等の第ＶＩＩＩ因子活性に相当すると推測されている（非特許文献４）。しかしながら、一部の患者は、エミシズマブに対する阻害物質（抗薬剤抗体）を発現し、この化合物による治療は無効であった。

エミシズマブに例示されるような阻害物質の生成に加えて、他の抗体特性も、患者に有効な抗体系の治療を達成するために重要である。特に、非特異的結合の高い傾向を伴う抗体がどのように診療所の安全性の問題につながり得るかが示されている。一部の報告では、高いレベルの非特異的結合は、抗体の循環半減期を数倍低減し、患者にとって無効で面倒な投薬レジメンをもたらした（非特許文献５、および非特許文献６を参照）。

特許文献４および特許文献５はまた、抗ＦＩＸ（ａ）抗ＦＸ（ａ）二重特異性抗体および血友病の治療のための血液凝固促進剤としてのそれらの使用も開示している。

血友病のコミュニティ、特に血液凝固障害を有する対象者には、依然として満たされていない多くの医療ニーズが存在する。本発明は、ＦＶＩＩＩの代わりとなることができ、したがって血液凝固障害、例えば、血友病Ａなどの治療に有用である改善された化合物に関する。

欧州特許第１２２０９２３Ｂ１号欧州特許第１６６０５３６Ｂ１号国際公開第２０１２／０６７１７６号国際公開第２０１８／１４１８６３号国際公開第２０１９／０６５７９５号

Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．（２００８）ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ，６：３１５－３２２ＫｏｌｋｍａｎＪＡ，ＭｅｒｔｅｎｓＫ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：７３９８－７４０５、ＺｏｇｇＴ，ＢｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒＨ（２００９）ＢｉｏｌＣｈｅｍ，３９０：３９１－４００Ｓａｍｐｅｉｅｔａｌ．：（２０１３）ＰＬｏＳＯｎｅ，８，ｅ５７４７９Ｓｈｉｍａｅｔａｌ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２０１６；３７４：２０４４－５３Ｄｏｂｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌｕｍｅ６，ａｒｔ．ｎｏ．：３８６４４（２０１６）Ａｖｅｒｙｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ２０１８，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２，２４４－２５５

本発明は、血液凝固障害を患う患者、特に阻害物質を有する血友病Ａ患者を含む、血友病Ａ患者などの機能的ＦＶＩＩＩを欠く患者において、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の代替物として機能する化合物に関する。

本発明の一態様は、ＦＸａの生成を増強し、それ故に機能的ＦＶＩＩＩを欠く患者の凝固を部分的にまたは完全に回復させることができる化合物に関する。

一態様では、化合物は、抗体またはその抗原結合性断片である。こうした一態様では、化合物は、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片などの多重特異性抗体またはその抗原結合性断片である。

特定の一態様では、本発明は、血友病Ａ患者などの機能的ＦＶＩＩＩを欠く患者のＦＶＩＩＩに対する代替物として機能する抗体またはその抗原結合性断片に関する。

こうした一態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＦＩＸ（ａ）を結合し、かつＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を増大させ、任意にＦＸを結合することができる。

一態様では、本発明は、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を増加させる二重特異性抗体またはその抗原結合性断片を含む、ＦＩＸ（ａ）およびＦＸ（ａ）を結合することができる抗体またはその抗原結合性断片に関する。

一態様では、本発明は、ＦＩＸ（ａ）およびＦＸ（ａ）と結合することができる抗体またはその抗原結合性断片に関し、これは、当技術分野で開示される抗体と比較して改善された特性を有する。こうした一態様では、該抗体またはその抗原結合性断片は、エミシズマブを含む当技術分野の二重特異性抗体と比較して、改善した血液凝固促進特性、および／または例えば、ＤＮＡおよび／またはインスリンとの非特異的結合の低減した傾向、および／または自己会合の低減した傾向を有する。

本発明のさらなる態様は、特定の抗ＦＩＸ（ａ）抗体またはその抗原結合性断片あるいは特定の抗ＦＸ（ａ）抗体またはその抗原結合性断片など、二重特異性抗体の一部である個別成分（中間体）抗体またはその抗原結合性断片に関する。

本発明のさらなる態様は、血液凝固障害、血液凝固障害を伴う疾患、または血液凝固障害によって引き起こされる疾患の予防および／または治療のための本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片を対象とする。一態様では、血液凝固障害は、阻害物質を伴うまたは伴わない血友病、例えば、血友病Ａである。

本発明のなおさらなる態様は、阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａなどの血液凝固障害の予防および／または治療のために該抗体の送達のために製剤化された本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物、ならびにその内容物を有する注射装置に関する。

本発明のさらなる態様は、（ｉ）二重特異性抗体などの、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片および（ｉｉ）使用説明書を含むキットを対象とする。

本発明は、例示的な実施形態の開示から明らかになるさらなる問題も解決し得る。

図１Ａ～図１Ｄは、本明細書に開示される抗ＦＩＸ（ａ）（図１Ａおよび図１Ｂ）および抗ＦＸ（ａ）（図１Ｃおよび図１Ｄ）ＩｇＧ抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを表す配列のアライメントを示す。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列が、最も上の配列で、太字で強調表示され、下線付きであり、それぞれの図における残りの配列を代表するものである。

配列の簡潔な説明
配列番号１～８および１７～８８は、本明細書に記載の抗ＦＩＸ（ａ）および抗ＦＸ（ａ）モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を表す。

配列番号８９は、ヒト凝固第ＩＸ因子のアミノ酸配列を表す。

配列番号９０は、ヒト凝固第Ｘ因子のアミノ酸配列を表す。

配列番号９１は、Ｓ２２８ＰおよびＣ末端リジン切断を含むヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を表す。

配列番号９２は、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ４０５Ｌ、Ｒ４０９Ｋ、およびＣ末端リジン切断を含むヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を表す。

配列番号９３は、ヒトカッパ軽鎖定常領域を表す。

配列番号９４は、Ｆ４０５ＬおよびＣ末端リジン切断を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を表す。

配列番号９５は、Ｋ４０９ＲおよびＣ末端リジン切断を含むヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を表す。

配列番号９～１６は、意図的に省略される。

実施例６の表は、個別（成分）の抗ＦＩＸ（ａ）抗体および抗ＦＸ（ａ）抗体ならびに本発明の二重特異性抗体にリンクしている。

記述
血友病Ａを有するヒトなどの血液凝固障害を有する対象では、凝固カスケードは機能的ＦＶＩＩＩが欠如しているまたは存在が不十分であることに起因して機能不全となる。こうした凝固カスケードの一部の機能不全は、不十分な血液凝固および潜在的に生命を脅かす出血、または関節などの内部器官への損傷をもたらす。本発明は、血液凝固障害を患う患者、特に阻害物質を有する血友病Ａ患者を含む、血友病Ａ患者などの機能的ＦＶＩＩＩを欠く患者において、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の代替物として機能する化合物に関する。一態様では、こうした化合物は、抗体である。

特に、本発明の発明者らは、驚くべきことに高い効力および有効性を有するＦＶＩＩＩ補因子活性を模倣する抗体を特定した。特定の一態様では、本発明は、血友病Ａ患者などの機能的ＦＶＩＩＩを欠く患者のＦＶＩＩＩの代替物として機能する抗体に関する。こうした一態様では、抗体は、凝固第Ｘ因子（ＦＸ）に対する凝固第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）と結合し、その酵素活性を増加させ、任意でＦＸにも結合する。こうした一態様では、本発明の抗体は、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸに結合することができる二重特異性抗体である。

本発明のさらなる態様は、特定の抗ＦＩＸ（ａ）抗体またはその抗原結合性断片あるいは特定の抗ＦＸ（ａ）抗体またはその抗原結合性断片などの、多重特異性抗体の一部である個別の構成成分（中間体）抗体またはその抗原結合性断片に関する。

本発明のさらなる態様は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片、およびその構成成分（中間体）の製造に関する。

本発明のさらなる態様は、ＦＩＸ（ａ）および／またはＦＸ（ａ）への結合について、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体に関する。

本発明のさらなる態様は、本明細書に開示されるように、ＦＩＸ（ａ）および／またはＦＸ（ａ）上で、抗体またはその抗原結合性断片を伴うエピトープ残基を共有する抗体またはその抗原結合性断片に関する。

一態様では、抗体は、ヒト二重特異性抗体またはヒト化二重特異性抗体などのヒト抗体またはヒト化抗体である。

本発明のさらなる態様は、血液凝固障害、血液凝固障害を伴う疾患、または血液凝固障害によって引き起こされる疾患の予防および／または治療のための本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片を対象とする。一態様では、血液凝固障害は阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａである。

凝固第ＩＸ因子
凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン、第Ｘ因子、およびプロテインＣとの構造的類似性を有するビタミンＫ依存性凝固因子である。ＦＩＸは、単鎖酵素前駆体（配列番号８９）として血漿中を循環する。循環する酵素前駆体型は、Ｎ末端γ－カルボキシグルタミン酸が豊富な（Ｇｌａ）ドメイン、２つのＥＧＦドメイン、およびＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む、４つの異なるドメインに分割された４１５個のアミノ酸から成る。ＦＩＸの活性化は、Ａｒｇ１４５およびＡｒｇ１８０での限定的タンパク質分解によって生じ、活性化ペプチドを放出する（配列番号８９の残基１４６～１８０）。したがって、活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）は、配列番号８９の残基１～１４５（軽鎖）および配列番号８９の残基１８１～４１５（重鎖）から構成される。

したがって、循環ＦＩＸ分子は、ＦＩＸ酵素前駆体、および活性型のＦＩＸを含み、これは本明細書では一般に、配列番号１に関してＦＩＸおよびＦＩＸａと呼ばれる。

活性型第ＩＸ因子は、第ＩＸａ因子またはＦＩＸａと呼ばれる。「ＦＩＸ（配列番号１）および／またはその活性型形態（ＦＩＸａ）」という用語は、「ＦＩＸ／ＦＩＸａ」または単に「ＦＩＸ（ａ）」とも呼ばれる場合がある。

ＦＩＸａは、テナーゼ複合体の一部として、凝固中に適切なトロンビン形成をサポートするために必要な第Ｘａ因子のほとんどを生成することにより、止血において重要な役割を果たす、トリプシン様セリンプロテアーゼである。

ＦＩＸは、本明細書では、ヒトＦＩＸのＡｌａ１４８対立遺伝子型に対応する配列番号１によって表される（Ａｎｓｏｎｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．１９８４３：１０５３－１０６０、ＭｃＧｒａｗｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９８５８２：２８４７－２８５１、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９８８４２：５７３－５８０）。本発明では、ＦＩＸは、Ｔ１４８バリアント（ＵｎｉｐｒｏｔＩＤＰ００７４０）などのＦＩＸのすべての天然バリアントを網羅することを意図している。

凝固第Ｘ因子
ＦＸは、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン、ＦＩＸ、およびプロテインＣとの構造的類似性を有するビタミンＫ依存性凝固因子である。ＦＸは、配列番号２の残基１～１３９（軽鎖）および配列番号２の残基１４３～４４８（重鎖）を含む二本鎖酵素前駆体として血漿内を循環する。ヒトＦＸ酵素前駆体は、Ｎ末端ガンマカルボキシグルタミン酸が豊富な（Ｇｌａ）ドメイン（残基１～４５）、２つのＥＧＦドメイン、それぞれＥＧＦ１（残基４６～８２）とＥＧＦ２（残基８５～１２５）、およびＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメイン（残基１９５～４４８）を含む４つの別個のドメインを含む。ＦＸの活性化は、Ａｒｇ１９４での限られたタンパク質分解によって生じ、活性化ペプチドの放出をもたらす（残基１４３～１９４）。したがって、活性化ＦＸ（ＦＸａ）は、配列番号２の残基１～１３９（軽鎖）および配列番号２の残基１９５～４４８（活性化重鎖）から構成される。したがって、循環第Ｘ因子分子は、ＦＸ酵素前駆体、および活性型形態のＦＸを含み、これは本明細書では、配列番号２に関してそれぞれＦＸおよびＦＸａと呼ばれる。本発明では、ＦＸは、ＦＸのすべての天然バリアントを網羅することを意図している。「ＦＸ（配列番号９０）および／またはその活性型形態（ＦＸａ）」という用語は、「ＦＸ／ＦＸａ」または「ＦＸ（ａ）」とも呼ばれる場合がある。

抗体
本明細書において「抗体」という用語は、抗原またはその一部分に結合することができる免疫グロブリン配列に由来するタンパク質を指す。抗体という用語は、任意のクラス（またはアイソタイプ）、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、および／またはＩｇＹの全長抗体を含むが、これらに限定されない。抗体という用語は、二重特異性抗体などの二価である抗体を含むが、これに限定されない。

天然全長抗体は、少なくとも４つのポリペプチド鎖：ジスルフィド結合によって結合される２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含む。いくつかの場合では、天然抗体は、軟骨魚綱に見られるＩｇＮＡＲの場合のように、４つ未満の鎖を含む。特定の薬学的な利益がある免疫グロブリンの１つのクラスはＩｇＧである。ヒトにおいて、ＩｇＧクラスは、それらの重鎖定常領域の配列に基づいて、４つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４へと分割されてもよい。軽鎖は、それらの配列組成物の差異に基づいて、２つのタイプ、カッパ鎖およびラムダ鎖に分けることができる。ＩｇＧ分子は、２つ以上のジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖、および各々がジスルフィド結合によって重鎖に付着した２つの軽鎖で構成されている。ＩｇＧ重鎖は、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）および最大３つの重鎖定常（Ｃ_Ｈ）ドメイン：Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含み得る。軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）および軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含んでもよい。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨｖＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分化することができる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、典型的に３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。超可変領域（ＣＤＲ）を含有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、抗原と相互作用することができる構造を形成する一方で、抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子との結合を媒介し得る。この宿主組織または因子には、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体、および第１の構成成分である、伝統的補体系のＣ１複合体のＣ１ｑなどが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の抗体は、単一Ｂ細胞からまたはＢ細胞のクローン集団によって発現される一連のユニークな重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を表すという意味で、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）であり得る。本発明の抗体は、当業者に公知の様々な方法を使用して生成および精製されてもよい。例えば、抗体はハイブリドーマ細胞から生成されてもよい。抗体は、Ｂ細胞増殖によって生成されてもよい。抗体またはその断片は、哺乳類または微生物の発現系で、またはインビトロ翻訳により組み換え発現されてもよい。抗体またはその断片はまた、例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳類細胞ディスプレイ、またはリボソームもしくはｍＲＮＡディスプレイによって、細胞表面結合分子として組み換え発現されてもよい。

本発明の抗体は、単離されてもよい。「単離抗体」という用語は、それが生成された環境中の他の（別の）構成成分から分離および／もしくは回収されている抗体、ならびに／またはそれが生成された環境中に存在する構成成分の混合物から精製されている抗体を指す。

抗体のある特定の抗原結合性断片は、抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって実施され得ることが示されているため、本発明の文脈において好適であり得る。抗体の「抗原結合性断片」という用語は、本明細書に記載されるように、ＦＩＸ／ＦＩＸａ、ＦＸ／ＦＸａまたは別の標的分子などの抗原に特異的に結合する、またはこれらの抗原を認識する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗原結合性断片の例には、（ただしこれらに限定されない）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ_２、Ｆａｂ’_２、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインの組み合わせ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８８；２４２：４２３－４２６、およびＨｕｓｔｏｎｅｔａｌ．ＰＮＡＳ１９８８；８５：５８７９－５８８３を参照）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（典型的には、Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメイン）、単一Ｖ_Ｈドメインおよび単一Ｖ_Ｌドメインの両方を含む一価分子；ミニボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、カッパボディ（例えば、Ｉｌｌｅｔａｌ（１９９７）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ１０：９４９－５７を参照）；ならびに１つ以上の単離されたＣＤＲまたは機能的なパラトープが含まれ、単離されたＣＤＲまたは抗原結合残基またはポリペプチドは、機能的な抗体断片を形成するように、一緒に会合または連結することができる。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られてもよく、また断片は、インタクト抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされてもよい。

「Ｆａｂ」断片および「Ｆａｂ’_２」断片を含む、抗体の「Ｆａｂ断片」は、抗体の重鎖を接続するヒンジシステイン残基のＮ末端側またはＣ末端側それぞれのヒンジ領域の重鎖の開裂によって、抗体から導き出すことができる。「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、ならびに重鎖の可変ドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインを含む。「Ｆａｂ’_２」断片は、それらのヒンジシステインによって一般に共有結合された一対の「Ｆａｂ」断片を含む。Ｆａｂ’は、形式的には、Ｆａｂ’_２での重鎖を接続するヒンジジスルフィド結合の開裂によって、Ｆａｂ’_２断片から派生する。抗体断片のジスルフィド結合以外の他の化学的結合も当該技術分野で公知である。Ｆａｂ断片は、潜在的に低いアフィニティーで、その抗原に結合する親抗体の能力を保持する。Ｆａｂ’_２断片は二価の結合をすることができるが、Ｆａｂ断片およびＦａｂ’断片は一価でしか結合することができない。一般に、Ｆａｂ断片には、定常Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメイン、すなわちＦｃ受容体とＣ１ｑとの相互作用が発生することになるＦｃ部を欠く。したがって、Ｆａｂ断片は一般にエフェクター機能を欠いている。Ｆａｂ断片は、例えば、Ｆａｂを得るためにパパインを使用するか、またはＦａｂ’_２を得るためにペプシンを使用するかのいずれかの抗体の酵素開裂により、当該技術分野で周知の方法によって生成され得、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’_２を含むＦａｂ断片は、当業者には周知の技法を使用して組み換えで生成され得る。

「Ｆｖ」（断片可変）断片は、完全な抗原認識および結合部位を含有する抗体断片であり、一般に、例えば、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）において、自然に共有結合できることに関連して、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインを含む。この構成では、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。集合的に、６つの超可変領域またはそのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体は、抗体のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９４，ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇａｎｄＭｏｏｒｅｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５を参照されたい。

「単鎖Ｆａｂ」または「ｓｃＦａｂ」抗体は、抗体のＶ_Ｈ、Ｃ_Ｈ１、Ｖ_Ｌ、およびＣ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆａｂポリペプチドは、ｓｃＦａｂが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする、Ｖ_ＨドメインとＣ_Ｌドメインとの間、またはＶ_ＬドメインとＣ_Ｈ１ドメインとの間のいずれかのポリペプチドリンカーをさらに含む（Ｋｏｅｒｂｅｒｅｔａｌ．（２０１５）ＪＭｏｌＢｉｏｌ．４２７：５７６－８６）。

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、ここで断片は、同一のポリペプチド鎖（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）内で軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続されている重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。同一の鎖上の２つの可変ドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、可変ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的にペアリングされ、２つの抗原結合部位を作製する。

「線形抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａｅｔａｌ．（１９９５）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．８：１０５７－１０６２に記載されている抗体を指す。簡潔に述べると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドとともに、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１～Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１）を含有する。線形抗体は、二重特異性または単一特異性とすることができる。

抗体断片は、従来の組み換え技法またはタンパク質エンジニアリング技法を使用して得られる場合があり、断片は、インタクト抗体と同じ様式でＦＩＸおよびその活性型形態、ＦＸまたは別の機能への結合についてスクリーニングすることができる。

本発明の抗体断片は、切頭によって、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の除去によって、作製され得る。また、断片は、１つ以上の内部欠失によって生成され得る。

本発明の抗体は、抗体の断片、もしくは本明細書に開示される抗体のうちのいずれかのバリアントであり得るか、またはそれを含み得る。本発明の抗体は、これらの抗体のうちの１つの抗原結合部分もしくはそのバリアントであり得るか、またはそれを含み得る。例えば、本発明の抗体は、これらの抗体のうちの１つのＦａｂ断片、もしくはそのバリアントであり得るか、またはこれらの抗体のうちの１つに由来する単鎖抗体、もしくはそのバリアントであり得る。また、本発明の抗体は、全長抗体およびその断片の組み合わせであり得る。

本明細書で使用される場合、「単一特異性」抗体という用語は、１つの特定のエピトープと結合することができる抗体（二価抗体を含むがこれらに限定されない）を指す。

本明細書で使用される場合、「二重特異性」抗体という用語は、２つの異なる抗原または同じ抗原上の２つの異なるエピトープと結合することができる抗体を指す。

本明細書で使用される場合、「三重特異性」抗体という用語は、３つの異なる抗原、または同じ抗原上の３つの異なるエピトープ、または２つの異なる抗原上に存在する３つの異なるエピトープと結合することができる抗体を指す。

本明細書で使用される場合、「多重特異性」抗体という用語は、２つ以上の異なる抗原または同じ抗原上の２つ以上の異なるエピトープと結合することができる抗体を指す。したがって、多重特異性抗体は、二重特異性抗体および三重特異性抗体を含む。

全長ＩｇＧ型の二重特異性抗体は、２つの個別ハイブリドーマの融合によって生成され、二重特異性ヘテロ二量体化抗体の断片を含む抗体の混合物を生成する、ハイブリッドクアドローマを形成することができる（ＣｈｅｌｉｕｓＤ．ｅｔａｌ．；ＭＡｂｓ．２０１０Ｍａｙ－Ｊｕｎ；２（３）：３０９－３１９）。別の方法として、二重特異性ヘテロ二量体化抗体は、組み換え技術を使用することにより生成され得る。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ領域の二量体化インターフェースを操作してヘテロ二量体化を促進することによっても達成することができる。この一例は、いわゆるノブインホール変異であり、立体的に嵩高い側鎖（ノブ）が、対向するＦｃ上の立体的に小さい側鎖（ホール）に一致する１つのＦｃに導入され、それによってヘテロ二量体化を促進する立体的相補性を作り出す。操作されたヘテロ二量体化Ｆｃインターフェースの他の方法は、静電相補性、非ＩｇＧヘテロ二量体化ドメインへの融合、またはヘテロ二量化を制御するためのヒトＩｇＧ４の天然Ｆａｂアーム交換現象の利用である。ヘテロ二量体化二重特異性抗体の例は、文献、例えば、（ＫｌｅｉｎＣ，ｅｔａｌ．；ＭＡｂｓ．２０１２Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；４（６）：６５３－６６３）によく説明されている。ヘテロ二量体抗体の軽鎖には、特別な注意を払う必要がある。ＬＣとＨＣとの正しいペアリングは、共通の軽鎖の使用によって達成することができる。この場合も、ＬＣ／ＨＣインターフェースの操作を使用して、ＣｒｏｓｓＭａｂの場合のように、ヘテロ二量体化または軽鎖クロスオーバー操作を促進することができる。適切な変異を含有する２つの個別ＩｇＧからの穏やかな還元条件下での抗体のインビトロ再構築も、二重特異性抗体の生成に使用できる（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，１１０，５１４５－５１５０（２０１３））。また、正しい軽鎖のペアリングを確実にするための、天然Ｆａｂアーム交換方法も報告されている。

多重特異性抗体系分子はまた、文献に記載されるように、ＩｇＧの天然モジュールを組み合わせて多重特異性抗体誘導体および多価抗体誘導体を形成する融合タンパク質として組み換え発現され得る。融合抗体の例は、ＤＶＤ－Ｉｇｓ、ＩｇＧ－ｓｃＦＶ、ダイアボディ、ＤＡＲＴなどである。特定の検出タグまたは精製タグ、半減期延長部分またはその他の構成要素を、融合タンパク質に組み込むことができる。追加的な非ＩｇＧモダリティーも融合タンパク質に組み込まれ得る。Ｆｃヘテロ二量化に基づく二重特異性全長抗体は、ＬＣペアリング法に関わらず、一般的に非対称ＩｇＧと呼ばれる。

一般的に、二重特異性抗体は、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎｅｔａｌ．Ｔｈｅｍａｋｉｎｇｏｆｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍａｂｓ９，１８２－２１２（２０１７））によって概説された様々な分子形式で生成され得る。

多重特異性抗体系分子はまた、文献に記載されるように、個別の全長ＩｇＧの化学結合もしくはカップリング、またはＩｇＧ断片のカップリングによっても生成され、多重特異性抗体誘導体および多価抗体誘導体を形成し得る。例としては、化学的にカップリングされたＦａｂ断片、ＩｇＧ－二量体などがある。特定の検出タグまたは精製タグ、半減期延長分子またはその他の構成要素を、複合体タンパク質に組み込むことができる。追加的な非ＩｇＧポリペプチドも融合タンパク質に組み込まれうる。多重特異性分子は、上述のものを含む組み換え型および化学的方法を組み合わせることによっても生成され得る。

一態様では、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である。こうした抗体は、例えば、適切な抗体ディスプレイまたは免疫化プラットフォーム、または当分野で公知のその他の適切なプラットフォームまたは方法を使用することによって生成することができる。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域の少なくとも一部分および／またはＣＤＲ領域の少なくとも一部が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変ドメインを有する抗体を含むことが意図される。例えば、ヒト抗体は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域との両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変ドメインを有してもよい。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域またはその一部分も、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）。

こうしたヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。こうしたヒトモノクローナル抗体は、遺伝子導入非ヒト動物（例えば、不死化細胞に融合されたヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子セグメントレパートリーを含むゲノムを有する遺伝子導入マウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得る。

ヒト抗体は、ヒト生殖系列配列の選択に基づいて構築された配列ライブラリから単離され得、天然および合成の配列多様性でさらに多様化されている。

ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロでの免疫化に続いて、リンパ球のエプスタイン・バーウイルスでの形質転換によって調製され得る。

ヒト抗体は、当該技術分野で公知の組み換え方法によって産生され得る。

「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の薬剤または抗体との複合体など、ヒト抗体の任意の修飾形態を指す。

本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列（ＣＤＲ領域またはその部分）を含有するヒト／非ヒト抗体を指す。したがって、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの少なくとも超可変領域からの残基が、所望の特異性、アフィニティー、配列組成および機能性を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類など非ヒト種（ドナー抗体）からの抗体の超可変領域からの残基で置換される。一部の事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。こうした修飾の例は、１つ以上のいわゆる逆変異の導入であり、これは典型的にはドナー抗体に由来するアミノ酸残基である。抗体のヒト化は、当業者に公知の組み換え技法を使用して実施され得る（例えば、ＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４８，ＢｅｎｎｙＫ．Ｌｏ編を参照）。軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方に対する適切なヒトレシピエントフレームワークは、例えば、配列または構造的相同性によって特定され得る。あるいは、例えば、構造、生物物理学特性および生化学特性の知識に基づいて、固定レシピエントフレームワークを使用してもよい。レシピエントフレームワークは、生殖系列由来または成熟抗体配列由来とすることができる。ドナー抗体からのＣＤＲ領域は、ＣＤＲ移植によって移すことができる。ＣＤＲ移植ヒト化抗体は、ドナー抗体からのアミノ酸残基の再導入（逆変異）がヒト化抗体の特性に有益な影響を与える重要なフレームワーク位置の特定により、例えば、親和性、機能性、および生物物理学特性をさらに最適化することができる。ドナー抗体由来の逆変異に加えて、ヒト化抗体を、ＣＤＲまたはフレームワーク領域への生殖系列残基の導入、免疫原性エピトープの除去、親和性成熟などによって操作することができる。

さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインを含み、その中ですべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのものと対応し、その中ですべてのまたは実質的にすべてのＦＲ残基がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのその部分も含むことができる。

「ヒト化抗体誘導体」という用語は、抗体と化学的薬剤との複合体、または抗体と別の抗体との複合体など、ヒト化抗体の任意の修飾形態を指す。

「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上の種に由来する抗体の部分を含む抗体を指す。例えば、こうした抗体をコードする遺伝子は、２つの異なる種から生じた、可変ドメインをコードする遺伝子および定常ドメインをコードする遺伝子を含む。例えば、マウスモノクローナル抗体の可変ドメインをコードする遺伝子は、ヒト起源の抗体の定常ドメインをコードする遺伝子と結合され得る。

抗体の断片結晶可能領域（「Ｆｃ領域」／「Ｆｃドメイン」）は、抗体のＣ末端領域であり、これはヒンジおよび定常Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインを含む。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体、ならびに補体系のいくつかのタンパク質と相互作用し得る。Ｆｃ領域は、抗体が免疫系と相互作用することを可能にする。本発明の一態様では、抗体は、とりわけ血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、タンパク質の安定性、および／または抗原依存性細胞障害活性、またはそれらの欠如など、典型的にはその機能特性の１つ以上を変更するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本発明の抗体は、ここでもまた、抗体の機能的特性の１つ以上を変更するために、化学的に修飾されるか（例えば、１つ以上の化学的部分を抗体に取り付けることができる）、またはそのグリコシル化を変更するために修飾され得る。ＩｇＧ１抗体は、ある特定のＦｃガンマ受容体（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａ）への親和性の低下、およびＣ１ｑ介在性補体固定（Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ）の減少がそれぞれ結果として起こる、１つ以上およびおそらくすべての以下の変異を含む、修飾Ｆｃドメインを担持し得る（ＥＵ指標による残基ナンバリング）。あるいは、Ｆｃガンマ受容体結合の変化（減少または増加）をもたらすことが当該技術分野で公知のその他のアミノ酸置換、およびその組み合わせ、および上述との組み合わせが使用され得る。

本発明の抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、例えばＩｇＧ２、例えばＩｇＧ４であり得る。所望であれば、抗体のクラスは、公知の技法によって「スイッチ」されてもよい。例えば、元々ＩｇＭ分子として生成された抗体は、ＩｇＧ抗体にクラススイッチされ得る。クラススイッチング技法は、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４へ、ＩｇＧ２からＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４へ、またはＩｇＧ４からＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２へと、あるＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換するためにも使用され得る。異なるＩｇＧサブクラスからの領域の組み合わせによって、定常領域キメラ分子を生成する抗体の操作を実施することもできる。

一実施形態では、抗体のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化するように、例えば、増加または減少するように修飾される。このアプローチは、例えば、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに説明されている。

定常領域は、抗体を安定化させるように、例えば、半抗体に分離する二価抗体のリスクを低減させるように修飾され得る。例えば、ｌｇＧ４定常領域では、残基Ｓ２２８（ＥＵナンバリング指数およびＫａｂａｔによるＳ２４１による）は、ヒンジにおける重鎖間ジスルフィド架橋形成を安定化するためのプロリン（Ｐ）残基に変異され得る（例えば、Ａｎｇａｌｅｔａｌ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．１９９３；３０：１０５－８を参照）。

抗体またはその断片は、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）の観点から画定され得る。「相補性決定領域」または「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与するアミノ酸残基が位置する抗体の領域を指す。超可変性の領域またはＣＤＲは、抗体可変ドメインのアミノ酸アライメントの最も高い可変性を有する領域として特定することができる。ＫａｂａｔデータベースなどのデータベースをＣＤＲ特定に使用することができ、このＣＤＲは、例えば、軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）および８９～９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインのアミノ酸残基３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）を含むものとして画定される（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．１９９１；ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．９１－３２４２）。あるいは、ＣＤＲを、「超可変ループ」からの残基として画定することができる（軽鎖可変ドメインの残基２６～３３（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、および９１～９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの残基２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）、ＣｈｏｔｈｉａａｎｄＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１－９１７）。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、上述のＫａｂａｔらに説明される方法によって実施される。本明細書において、「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔ残基」、および「Ｋａｂａｔによれば」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのためのこのナンバリングシステムを指す。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク（ＦＲ）もしくはＣＤＲの短縮化、またはそれらへの挿入に対応する、より少ないか、または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲＨ２の残基５２の後のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる、残基５２ａ、５２ｂ、および５２ｃ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる、残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列との相同性領域でのアライメントにより、所与の抗体について決定され得る。

「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書に定義されるように、ＣＤＲ内ではないこれらのＶ_ＨまたはＶ_Ｌアミノ酸残基を指す。

「血液凝固促進抗体」という用語は、例えば、血液凝固のプロセスを加速することによって、および／または１つ以上の凝固因子の酵素活性を増加させることによって、血液凝固を増強する抗体を指す。

「血液凝固促進活性」という用語は、例えば、血液凝固のプロセスを加速することによって、および／または１つ以上の凝固因子の酵素活性を増加させることによって、血液凝固を増強する抗体などの化合物の能力を指す。

二重、三重、および多重特異性抗体を含む血液凝固促進抗体の活性は、当該技術分野で公知の方法によって決定され得る。標準アッセイは、全血－トロンビン生成試験（ＴＧＴ）を含み、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）およびＦＸａ生成アッセイ（例えば、ＷＯ２０１８／１４１８６３を参照）によって凝固時間を測定する。

「ＦＩＸａの酵素活性を刺激する」という用語は、実施例９の方法論を使用して決定されるような刺激を指す。

「抗原」（Ａｇ）という用語は、Ａｇを認識する抗体（Ａｂ）を生成するために、免疫応答性の脊椎動物の免疫化のために使用される分子実体を指す。本明細書において、Ａｇはより広範に称され、かつＡｂによって特異的に認識される標的分子を含むことが一般に意図されており、したがって、Ａｂを生成するために使用される、免疫化プロセス、または、例えば、ファージディスプレイなどの他のプロセスにおいて使用される分子の断片または模倣物を含む。

本発明は、本明細書に開示される特定の配列に１、２、または３個のアミノ酸置換ならびに／または欠失および／もしくは挿入を含み得る本発明の抗体のバリアントまたはその抗原結合性断片を包含する。

一態様では、「置換」バリアントは、同数のアミノ酸を有する１つ以上のアミノ酸の置換を伴う。置換は、同類置換とし得るが、これに限定されない。例えば、アミノ酸は、類似の生化学特性を有するアミノ酸へと置換されてもよく、例えば、塩基性アミノ酸は別の塩基性アミノ酸へと（例えば、リジンからアルギニンへと）置換されてもよく、酸性アミノ酸は別の酸性アミノ酸へと（例えば、グルタミン酸塩からアスパラギン酸塩へと）置換されてもよく、中性アミノ酸は別の中性アミノ酸へと（例えば、トレオニンからセリンへと）置換されてもよく、荷電アミノ酸は別の荷電アミノ酸へと（例えば、グルタミン酸塩からアスパラギン酸塩へと）置換されてもよく、親水性アミノ酸は別の親水性アミノ酸へと（例えば、アスパラギンからグルタミンへと）置換されてもよく、疎水性アミノ酸は別の疎水性アミノ酸へと（例えば、アラニンからバリンへと）置換されてもよく、極性アミノ酸は別の極性アミノ酸へと（例えば、セリンからトレオニンへと）置換されてもよく、芳香族アミノ酸は別の芳香族アミノ酸へと（例えば、フェニルアラニンからトリプトファンへと）置換されてもよく、脂肪族アミノ酸は別の脂肪族アミノ酸へと（例えば、ロイシンからイソロイシンへと）置換されてもよい。

別の態様では、バリアントは、抗体の配列中に存在するアミノ酸の構造的類似体、または本発明のその抗原結合性断片を含む。

「結合親和性」という用語は、本明細書では、２つの分子間、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の非共有相互作用の強度の尺度として使用される。「結合親和性」という用語は、一価の相互作用を説明するために使用される。

２つの分子間、例えば、一価の相互作用による、抗体またはその断片と抗原との間の結合親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定することによって定量化され得る。Ｋ_Ｄは、複合体形成および解離の動態を、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法または等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法によって測定することによって決定することができる。一価の複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋ_ａ（またはｋ_ｏｎ）、および解離速度定数ｋ_ｄ（またはｋ_ｏｆｆ）と呼ばれる。Ｋ_Ｄは、式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａを介して、ｋ_ａおよびｋ_ｄと関連する。

上記の定義に従って、所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較など、異なる分子相互作用に関連する結合親和性は、個別の抗体／抗原複合体のＫ_Ｄ値の比較によって比較され得る。

解離定数の値は、周知の方法によって直接決定することができる。標的に向かう抗体などのリガンドの結合能力を評価するための標準アッセイは、当該技術分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー解析を含む。抗体の結合動態および結合アフィニティーも、ＳＰＲなどの当該技術分野で公知の標準アッセイによって評価することができる。しかしながら、抗体／標的相互作用に対する親和性を測定するためだけでなく、相互作用のための熱力学パラメータを導き出すためにも等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を使用し得ることが好ましい。

標的との抗体の結合が別の抗体などのその標的の別のリガンドによる標的の結合と比較される、競合結合アッセイを行うことができる。

本発明の抗体の、その標的に対するＫ_Ｄは、１０μＭ未満など、９μＭ未満など、８μＭ未満など、７μＭ未満など、６μＭ未満など、５μＭ未満など、４μＭ未満など、３μＭ未満など、２μＭ未満など、１μＭ未満など、０．９μＭ未満など、０．８μＭ未満など、０．７μＭ未満など、０．６μＭ未満など、０．５μＭ未満など、０．４μＭ未満など、０．３μＭ未満など、０．２μＭ未満など、０．１μＭ未満などの、１００μＭ未満であり得る。

こうした一実施形態では、抗体は、１０μＭ未満など、９μＭ未満など、８μＭ未満など、７μＭ未満など、６μＭ未満など、５μＭ未満など、４μＭ未満など、３μＭ未満など、２μＭ未満など、１μＭ未満など、０．９μＭ未満など、０．８μＭ未満など、０．７μＭ未満など、０．６μＭ未満など、０．５μＭ未満など、０．４μＭ未満など、０．３μＭ未満など、０．２μＭ未満など、０．１μＭ未満など、０．０９μＭ未満など、０．０８μＭ未満など、０．０７μＭ未満など、０．０６μＭ未満など、０．０５μＭ未満など、０．０４μＭ未満など、０．０３μＭ未満など、０．０２μＭ未満など、０．０１μＭ未満など、９ｎＭ未満など、８ｎＭ未満など、７ｎＭ未満など、６ｎＭ未満など、５ｎＭ未満など、４ｎＭ未満など、３ｎＭ未満など、２ｎＭ未満など、１ｎＭ未満など、０．５ｎＭ未満などの、１００μＭ未満のＦＸに対するＫ_Ｄを有する抗ＦＸアームを含む二重特異性抗体である。

本明細書に記載されるように、抗体およびその抗体断片は、当該技術分野で公知の他の抗体および抗体断片と組み合わされて、二重特異性、三重特異性、または多重特異性抗体分子を作り出してもよい。ＦＶＩＩＩ補因子機能を模倣する化合物は、ＦＩＸ（ａ）およびＦＸ（ａ）を標的とする抗体を使用して以前に作製されており、いくつかの実施形態では、これは、本明細書に記載のＦＩＸ（ａ）またはＦＸ（ａ）抗体のそれぞれを潜在的に代替し得る。したがって、本発明のＦＩＸ（ａ）およびＦＸ（ａ）を標的とする抗体、特にその抗原結合性断片は、少なくとも１つのＦＩＸ（ａ）および／またはＦＸ（ａ）結合ドメインを含む二重、三重、または多重特異性抗体の一部として個別の構成成分（中間体）分子として別個の興味の対象であることが明らかである。

医薬製剤
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体などの本発明の化合物を含む組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容可能な担体とともに製剤化された、本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物を提供する。

したがって、本発明の１つの目的は、０．２５ｍｇ／ｍｌ～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するこうした抗体を含む医薬製剤を提供することであり、また該製剤は２．０～１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝液系、防腐剤、等張化剤、キレート剤、安定剤、または界面活性剤、ならびにそれらの様々な組み合わせのうちの１つ以上をさらに含んでもよい。医薬組成物に防腐剤、等張剤、キレート剤、安定剤、および界面活性剤を使用することは、当業者には周知である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，１９^ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照されたい。

一実施形態では、医薬製剤は、水性製剤である。こうした製剤は典型的には溶液または懸濁液であるが、コロイド、分散剤、乳濁液、および多相材料も含み得る。用語「水性製剤」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。

別の実施形態では、医薬製剤は、使用前に溶媒および／または希釈剤を加える凍結乾燥製剤である。

さらなる態様では、医薬製剤はこうした抗体の水溶液、およびこの抗体が１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する緩衝液を含み、該製剤は約２．０～約１０．０のｐＨを有する。

一実施形態では、本発明は該組成物の内容物を有する注射装置に関する。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、注射装置の使用および／または注入装置の中への収容が意図されている。一部の実施形態では、注射装置は、使い捨て、事前充填式、ＦｌｅｘＴｏｕｃｈ（登録商標）タイプ（供給元：ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の複数回投与式のペンである。いくつかの実施形態では、注射装置は、単一ショット装置である。

いくつかの実施形態では、注射装置は、複数の所定の用量の薬剤を送達するように構成されたものなどの固定用量装置であり、時として複数の固定用量装置または固定用量、複数ショット装置と呼ばれる。

一実施形態では、本発明の医薬組成物は、２０ゲージ以上の針を有する管を備える注射装置を使用して投与される。

一実施形態では、本明細書の表１による二重特異性抗体は、２０ゲージ以上の針を有する管を備える注射装置を使用して投与される。

一実施形態では、本明細書の表１による二重特異性抗体は、２０～３６ゲージの針を有する管を備える注射装置を使用して投与される。こうした一実施形態では、二重特異性抗体は、ｂｉｍＡｂ１Ａ、ｂｉｍＡｂ２Ａ、ｂｉｍＡｂ３Ａ、ｂｉｍＡｂ４Ａ、ｂｉｍＡｂ５Ａ、ｂｉｍＡｂ６Ａ、ｂｉｍＡｂ７Ａ、ｂｉｍＡｂ８Ａ、ｂｉｍＡｂ１Ｂ、ｂｉｍＡｂ２Ｂ、ｂｉｍＡｂ３Ｂ、ｂｉｍＡｂ４Ｂ、ｂｉｍＡｂ５Ｂ、ｂｉｍＡｂ６Ｂ、ｂｉｍＡｂ７Ｂ、およびｂｉｍＡｂ８Ｂから成るリストから選択される。

投与および用量
抗体などの本発明の化合物は、静脈内、筋肉内、皮下など、非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の抗体は、経口的または局所的などの、非注射経路を介して投与され得る。本発明の抗体は、予防的に投与され得る。本発明の抗体は、（要求に応じて）治療的に投与され得る。

送達される化合物の用量は、１日あたり約０．０１ｍｇ～５００ｍｇの化合物、好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ～２５０ｍｇ、より好ましくは１日当たり約０．５ｍｇ～約２５０ｍｇであってもよく、状態の重症度に応じて、初回量および維持量として、１日、１週間、２週間、または１か月に１回でもよい。また、好適な用量は、特定の化合物について、そのインビボ半減期または平均滞留時間およびその生物活性を含む、その化合物の特性に基づいて調整され得る。例えば、送達される化合物は、一実施形態では１週間に１回、または別の実施形態では１週間おきに１回、または別の実施形態では１ヶ月に１回、かつ該実施形態のいずれかでは、例えば体重１ｋｇ当たり０．００５、０．００７５、０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０７５、０．１、０．１２５、０．１５、０．１７５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｇの用量で投与される可能性がある。

本明細書に開示される化合物を含有する組成物は、予防的な処置のために、そして／または一部の実施形態では治療的な処置のために投与することができる。治療的な用途では、組成物は、上述のような何らかの出血障害などの疾患を患っている対象者に、疾患およびその合併症を治癒、緩和、または部分的に阻止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効量」として定義される。当業者によって理解されるように、この目的のために有効な量は、疾患または傷害の重度、ならびに対象者の体重および全身状態に依存する。

実施形態
本発明は、以下の実施形態によってさらに説明される。
１．配列番号８９による第ＩＸ因子（ＦＩＸ）および／またはその活性型形態（ＦＩＸａ）と結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
２．抗体が、Ｆａｂである、実施形態１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３．抗体またはその抗原結合性断片が、
配列番号２５によって特定される重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号２９によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
配列番号３３によって特定される重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号３７によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
配列番号４１によって特定される重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号４５によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
配列番号４９によって特定される重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号５３によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
配列番号５７によって特定される重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号６１によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
配列番号６５によって特定される重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号６９によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
配列番号７３によって特定される重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号７７によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
配列番号８１によって特定される重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号８５によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、を含む、実施形態１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４．抗体またはその抗原結合性断片が、
配列番号２５によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号２９によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
配列番号３３によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号３７によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
配列番号４１によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号４５によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
配列番号４９によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号５３によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
配列番号５７によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号６１によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
配列番号６５によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号６９によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
配列番号７３によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号７７によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
配列番号８１によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号８５によって特定される軽鎖可変ドメインを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５．ＦＸ（配列番号９０）および／またはその活性型形態（ＦＸａ）と結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
６．抗体が、Ｆａｂである、実施形態５に記載の抗体。
７．抗体またはその抗原結合性断片が、
配列番号１によって特定される重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列および配列番号５によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
または
配列番号１７によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号２１によって特定される軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列を含む、実施形態５または６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８．抗体またはその抗原結合性断片が、
配列番号１によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号５によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
配列番号１７によって特定される重鎖可変ドメイン、および配列番号２１によって特定される軽鎖可変ドメイン、を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９．配列番号８９によるＦＩＸまたはその活性型形態（ＦＩＸａ）、およびＦＸ（配列番号９０）またはその活性型形成（ＦＸａ）と結合することができる、多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１０．抗体が、先行する実施形態１～４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、実施形態９に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１１．抗体が、先行する実施形態５～８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、実施形態９に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１２．抗体が、先行する実施形態１～４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、および先行する実施形態５～８のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態９に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１３．任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号３２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号３２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号３６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号３６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号５２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号５６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号５２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号５６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号６０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号６４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号６０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号６４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号６８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号７２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号６８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号７２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号７６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号７６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、配列番号８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ３配列を含む、実施形態９～１２のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４．任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２６、２７、および２８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号３０、３１、および３２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２６、２７、および２８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号３０、３１、および３２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号３８、３９、および４０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号３８、３９、および４０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号４６、４７、および４８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号４６、４７、および４８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号５０、５１、および５２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号５０、５１、および５２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号５８、５９、および６０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号５８、５９、および６０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６６、６７、および６８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号７０、７１、および７２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６６、６７、および６８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号７０、７１、および７２によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号７８、７９、および８０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号７８、７９、および８０によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号８６、８７、および８８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、または
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号８６、８７、および８８によって特定される抗ＦＩＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体重鎖ＣＤＲ１～３配列、
任意に、１、２、または３個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入を含む、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定される抗ＦＸ（ａ）抗体軽鎖ＣＤＲ１～３配列を含む、実施形態９～１３のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１５．抗体が、ＦＩＸ（ａ）およびＦＸ（ａ）と特異的に結合することができる二重特異性抗体であり、結合ドメインが、
ｍＡｂ１／ｍＡｂＡ、ｍＡｂ２／ｍＡｂＡ、ｍＡｂ３／ｍＡｂＡ、ｍＡｂ４／ｍＡｂＡ、ｍＡｂ５／ｍＡｂＡ、ｍＡｂ６／ｍＡｂＡ、ｍＡｂ７／ｍＡｂＡ、ｍＡｂ８／ｍＡｂＡ、ｍＡｂ１／ｍＡｂＢ、ｍＡｂ２／ｍＡｂＢ、ｍＡｂ３／ｍＡｂＢ、ｍＡｂ４／ｍＡｂＢ、ｍＡｂ５／ｍＡｂＢ、ｍＡｂ６／ｍＡｂＢ、ｍＡｂ７／ｍＡｂＢ、またはｍＡｂ８／ｍＡｂＢから成るｍＡｂ対のものである、実施形態１４に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１６．抗体またはその抗原結合性断片が、血液凝固促進抗体である、実施形態９～１５のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１７．抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を増加することができる、実施形態９～１６のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１８．抗体またはその抗原結合性断片がＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩａを機能的に置換することができる、実施形態９～１７のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１９．抗体またはその抗原結合性断片が、二重特異性抗体である、実施形態９～１８のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
２０．抗体アイソタイプが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはそれらの組み合わせであり、そのような抗体が、ＩｇＧ１Ｆ_Ｃ領域およびＩｇＧ４Ｆ_Ｃ領域を含み、任意に、Ｃ_Ｈ３ドメインに１つまたは２つの置換を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体。
２１．先行する実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片、および任意に１つ以上の薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
２２．阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａなどの血液凝固障害または血液凝固障害の治療に使用するための、実施形態２１に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
２３．応需型または予防処置など、血液凝固障害または血液凝固障害の治療方法で使用するための、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片または組成物。
２４．応需型または予防処置など、阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａの治療に使用するための、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物。
２５．血液凝固障害または血液凝固障害を患う対象者を治療する方法であって、先行する実施形態のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物を該対象者に投与することを含む、方法。
２６．血液凝固障害または血液凝固障害が、血友病Ａまたは阻害物質を伴う血友病Ａである、実施形態２５に記載の方法。
２７．応需型または予防処置など、医薬を必要とする対象者における治療に使用するための医薬の製造のための、実施形態１～２０のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物の使用。
２８．応需型または予防処置など、阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａの治療に使用するための医薬を製造するための、実施形態１～２１のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物の使用。
２９．実施形態１～２０のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を発現する、真核細胞。
３０．実施形態１～２１のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物、および使用説明書を含む、キット。
３１．抗体またはその抗原結合性断片が、血液凝固促進性二重特異性抗体などの多重特異性抗体で使用するための成分（中間体）である、実施形態１～８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３２．抗体またはその抗原結合性断片が、血液凝固促進性二重特異性抗体などの多重特異性抗体の製造に使用するための成分（中間体）である、実施形態１～８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３３．該抗体の血液凝固促進活性が、ＷＯ２０１８／１４１８６３およびＷＯ２０１９／０６５７９５に開示されている多重特異性抗体よりも改善されている、血液凝固促進性二重特異性抗体などである、実施形態９～２０のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
３４．該改善が、ＨＡ－ＰＰＰＴＧＴアッセイ（本明細書の実施例７に記載される）などの、本明細書に開示されるアッセイを使用して決定される、実施形態３３に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
３５．該抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書の実施例７に従うＴＧＴアッセイ（ＨＡ－ＰＰＰ中）において７００ｎＭの化合物濃度で、
ａ）トリガーとして組織因子を使用する場合、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、９５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、もしくは１１０、または
ｂ）トリガーとしてＦＸＩａを使用する場合、少なくとも３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、もしくは３９０の平均ピークトロンビン（ｎＭ）を提供することができる、実施形態９～２０のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
３６．該抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書の実施例８に従って決定される同等のＦＶＩＩＩ活性を有し、エミシズマブ、ならびにＷＯ２０１８／１４１８６３およびＷＯ２０１９／０６５７９５に開示されている多重特異性抗体（これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）よりも改善されている、実施形態９～２０のいずれかに記載の多選択性抗体またはその抗原結合性断片。
３７．抗体アイソタイプが、ＩｇＧ４であり、任意に、１つのＣ_Ｈ３ドメインにおいて１つまたは２つの置換を含む、実施形態９～２０のいずれかに記載の抗体。
３８．実施形態９～２０のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物を含む、注射装置。
３９．該装置が、使い捨ておよび／または事前充填式および／または複数回投与式の装置、例えば、ペンなどである、実施形態３８に記載の注射装置。
４０．該装置が、事前充填式のペンである、実施形態３９に記載の注射装置。
４１．該装置が、複数回投与式のペンである、実施形態３９～４０に記載の注射装置。
４２．該注入装置が２０～３６ゲージの針を有する管を備える、実施形態３８～４１に記載の注射装置。
４３．置換が、保存的置換である、実施形態１３または１４に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体などの多重特異性抗体は、血友病Ａの治療において臨床的に関連性のある用量で該抗体が使用される時、血友病Ａを患う患者に投与されたＦＶＩＩＩ、例えば、組み換えＦＶＩＩＩなどの効果を妨げない。

一実施形態では、血友病Ａを患う患者において、４３．６４μｇ／ｍＬ血漿で存在する場合の本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、デシリットル血漿当たり少なくとも２０～５０、例えば、２０～４０、例えば、２５～３５、例えば、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ＩＵの同等の第ＶＩＩＩ因子活性に対応する。

一実施形態では、血友病Ａを患う患者において、３０μｇ／ｍＬ血漿で存在する場合の本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、デシリットル血漿当たり少なくとも１０～５０、例えば、１５～４０、例えば、１５～３０、例えば、１５～２０、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ＩＵの同等の第ＶＩＩＩ因子活性に対応する。

一実施形態では、血友病Ａを患う患者において、１５μｇ／ｍＬ血漿で存在する場合の本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、デシリットル血漿当たり少なくとも１０～５０、例えば、１５～４０、例えば、１５～３０、例えば、１５～２０、例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ＩＵの同等の第ＶＩＩＩ因子活性に対応する。

一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、当該技術分野の血液凝固促進抗体と比較して免疫原性が低減している。

一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａの予防処置に使用される。

一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる。

一実施形態では、実施例６の表２に列挙される抗ＦＩＸ（ａ）抗体またはその抗原結合性断片は、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる。

本発明の好ましい実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４／カッパ形式を有し、任意に、Ｆｃ定常領域中に１つ以上の置換を含む。

重鎖定常ドメイン領域（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）は、Ｓ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング）置換を有し、かつＣ末端リジンの切断を有する抗ＦＩＸ（ａ）アームヒトＩｇＧ４に対する：

一実施形態では、重鎖定常ドメイン領域（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）は、Ｓ２２８Ｐ置換および２つの追加的な置換（Ｆ４０５ＬおよびＲ４０９Ｋ（ＥＵナンバリング））を有し、Ｃ_Ｈ３ドメイン内で重鎖のヘテロ二量体化（実施例４に記載）を促進し、かつＣ末端リジンの切断を有し、抗ＦＸ（ａ）アームヒトＩｇＧ４に対する：

また、軽鎖定常領域（ＣＬ）はヒトカッパであった：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号９３）。

別の実施形態では、抗体はＳ２２８Ｐ、Ｆ４０５Ｌ、およびＲ４０９Ｋ置換を担持する抗ＦＩＸ（ａ）アームに対する重鎖定常ドメイン領域（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）を有し、かつＳ２２８Ｐ置換を担持する抗ＦＸ（ａ）アームに対する重鎖定常ドメイン領域を有する、およびＣ末端リジン欠失を伴うまたは伴わないＩｇＧ４形式でも発現することができる。

一実施形態では、抗体はまた、ＩｇＧ１／カッパ形式でも発現することができる。その場合、抗ＦＩＸ（ａ）アームの重鎖定常ドメイン領域は、Ｃ末端リジンの切断を伴うヒトＩｇＧ１Ｆ４０５Ｌであった：

また、抗ＦＸ（ａ）アームの重鎖定常ドメイン領域は、Ｃ末端リジンの切断を有するヒトＩｇＧ１Ｋ４０９Ｒである：

抗体はＫ４０９Ｒ置換を担持する抗ＦＩＸ（ａ）アームに対する重鎖定常ドメイン領域（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）、およびＦ４０５Ｌ置換を担持する抗ＦＸ（ａ）アームに対する重鎖定常ドメイン領域を有する、Ｃ末端リジン欠失を伴うまたは伴わないＩｇＧ１形式でも発現することができる。

定常ドメイン領域は、エフェクター機能、半減期またはその他の特性を調節するために、追加的な置換またはその他の修飾をさらに含み得る。

一実施形態では、ＦＩＸ（ａ）およびＦＸ（ａ）と結合することができる二重特異性抗体の効力、例えば、本明細書に開示されるが、これらに限定されないものは、ａ）フィブリン重合阻害剤の存在下で凍結乾燥されたヒト第Ｘ因子、ｂ）ヒト第ＩＸａ因子、ｃ）ヒトトロンビン、ｄ）カルシウム、ｅ）合成リン脂質、ｆ）第Ｘａ因子（ＳＸａ－１１）（ＨｙｐｈｅｎＢｉｏｍｅｄ）および評価される抗ＦＩＸ／抗ＦＸ二重特異性抗体と特異的な発色基質を含む発色性効力アッセイにおいて決定され得る。Ｔｒｉｓ－ＢＳＡなどの好適な緩衝液を任意の希釈に使用することができる。こうしたアッセイでは、ＦＸ活性化のレベルは、二重特異性抗体の効力に依存する。活性型ＦＸ（ＦＸａ）は、発色基質を加水分解し、それによってｐＮＡが放出され、４０５ｎｍでの光分光測定読み取りが可能となる（例えば、ＴｅｃａｎＳｕｎｒｉｓｅＥＬＩＳＡリーダーを使用する）。読み取りはＦＸａ濃度に依存し、したがって試験される二重特異性抗体の効力に比例する。予め決定された効力を伴う二重特異性参照抗体を含むべきである。

本開示はまた、本明細書に記載されるような治療に適した本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片を含むキットも提供する。一部の実施形態では、キットは、（ｉ）本明細書に開示される抗体、例えば二重特異性抗体もしくはその抗原結合性断片、または医薬組成物、または核酸もしくはベクターをコードする抗体、またはそれらの組み合わせ、および（ｉｉ）使用説明書を含む。当業者であれば、本明細書に開示される抗体、二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、医薬組成物、核酸もしくはベクターをコードするもの、またはそれらの組み合わせは、当該技術分野で周知の確立されたキット形式のうちの１つへと容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。

本明細書で引用される刊行物、特許出願および特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が個別にかつ具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

［実施例１］：抗ＦＩＸ（ａ）抗体および抗ＦＸ（ａ）抗体の開発
本明細書に開示されるＦＩＸ（ａ）およびＦＸ（ａ）結合抗体を、様々な抗体開発方法を使用して特定した。多様な抗体のセットを生成するために、マウスおよびウサギの免疫化を実施し、ファージディスプレイおよびＡｄｉｍａｂ酵母抗体発現プラットフォームも利用した。

Ａｄｉｍａｂ酵母抗体プラットフォーム
Ａｄｉｍａｂプラットフォームは、１０^１０の多様性を有する完全ヒトナイーブ型ＩｇＧ１／カッパライブラリを包含する酵母抗体発現系である。抗体選択プロセスは、適用された選択基準をリアルタイムでモニタリングすることができるＭＡＣＳおよびＦＡＣＳ系の方法を使用することを対象とした。選択はＭＡＣＳおよびＦＡＣＳ系であったため、標識化された抗原（例えば、ビオチン）が必要であった。ビオチン標識化された活性部位阻害ｈＦＩＸａ（ＦＩＸａ－ＥＧＲ－ビオチン）、またはｈＦＩＸａの抗体媒介固定化を使用して選択キャンペーンを実施した。バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔｆｏｒｔｅｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、結合のヒットを評価した。

ファージディスプレイ
利用した抗体ファージディスプレイプラットフォームは、専有の完全ヒトＦａｂディスプレイライブラリである。ライブラリは１０^１０のサイズを有し、軽鎖の化学合成だけでなく、ヒト末梢血単核細胞からの重鎖ＣＤＲ３のＰＣＲ増幅を用いて相補された重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を利用する組み合わせアプローチによって構築されている。エピトープ多様性を最大化するために、ビオチン化ＦＩＸａ－ＥＧＲ、ＦＸ、活性部位阻害ＦＸａ、または抗ＦＩＸａ抗体を使用した抗原捕捉を使用したパニングを含む、異なるパニング戦略を実施した。初期ヒットをファージＥＬＩＳＡによって特定した。配列解析後、特有のヒットをクローン化し、ＩｇＧ１抗体として組み換え発現し、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）またはバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔｆｏｒｔｅｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してランク付けした。

インビボプラットフォーム
マウスおよびウサギを、インビボプラットフォームを使用して抗体の生成のために使用した。抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体の生成のために、標準プロトコルを使用して、ヒトＦＩＸａ、ＦＩＸａ－ＥＧＲ、またはＦＩＸを用いてマウスまたはウサギを免疫化した。マウス由来の脾臓細胞を標準技法を使用して骨髄腫細胞と融合させ、そして結果として生じるハイブリドーマ上清を含有する抗体を、ＥＬＩＳＡを使用してＦＩＸａへの結合のためにスクリーニングした。ＦＩＸａ結合ウサギＢ細胞は、無作為にビオチン化されたＦＩＸａ－ＥＧＲ（ストレプトアビジン複合したフルオロフォアによって検出される）を結合する細胞にゲーティングすることによって、ＦＡＣＳを使用してソーティングされた単一細胞であった。ソーティングされたウサギＢ細胞を、ＥＬＩＳＡでＦＩＸａに対するスクリーニングを行う前に、フィーダー細胞および脾細胞からの馴化培地を使用して３８４ｗプレートで７日間培養した。ＦＩＸａ結合抗体ヒットを発現するウサギＢ細胞およびマウスハイブリドーマクローンは、ＶＨ／ＶＬシークエンシングの後、組み換え発現（ウサギまたはハイブリドーマｍＡｂに対する）のために使用するか、またはｍＡｂ産生のためにさらに繁殖（マウスハイブリドーマ）するかのいずれかとした。

抗ＦＸ抗体の生成のために、標準的なプロトコルを使用してマウスおよびウサギをＦＸで免疫化した。ウサギＢ細胞をＦＡＣＳ系の単一細胞ソーティング、および無作為にビオチン化されたＦＸ（ストレプトアビジン複合フルオロフォア（ｆｌｏｕｒｏｐｈｏｒｅ）によって検出された）を用いて単離し、一方で免疫化マウス由来の脾臓細胞を標準ハイブリドーマ発生のために使用した。得られた抗体を生成するＢ細胞またはマウスハイブリドーマクローンを、ＥＬＩＳＡおよびＯｃｔｅｔｆｏｒｔｅｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用してＦＸ結合に対してスクリーニングした。抗体ヒットを発現するウサギＢ細胞またはマウスハイブリドーマクローンは、ＶＨ／ＶＬシークエンシングの後、組み換え発現（ウサギまたはハイブリドーマｍＡｂに対する）のために使用するか、またはｍＡｂ産生のためにさらに繁殖（マウスハイブリドーマ）するかのいずれかとした。

ハイブリドーマ由来抗体のシークエンシング
ハイブリドーマを生成する抗ＦＩＸａおよび抗ＦＸ抗体を配列し、標準技法を使用してＨＥＫ２９３細胞内で発現した。Ｏｃｔｅｔｆｏｒｔｅｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用して、発現抗体を抗原結合について評価した。

総ＲＮＡを抗体生成クローンから抽出し、ＤＮＡ配列をコードする可変ドメイン（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）をＲＴ－ＰＣＲを使用して増幅した。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を決定し、ｐＴＴ系哺乳類発現ベクター（Ｄｕｒｏｃｈｅｒｅｔａｌ（２００２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．３０：Ｅ９）、またはＤＮＡ配列をコードする抗体定常領域を含有するｐｃＤＮＡ３．４哺乳類発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと挿入した。ｐＴＴ／ｐｃＤＮＡ３．４ｍＡｂ発現ベクターについては、それぞれ、Ｖ_ＨおよびＶ_ＬＤＮＡ配列はそれぞれ、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ（Ｃ_Ｈ１Ｃ_Ｈ２Ｃ_Ｈ３、任意に、追加的なアミノ酸置換および欠失、例えばＣ末端リジンのＣ_Ｈ３ドメインの置換および欠失）またはＤＮＡ配列をコードするヒトＣ_Ｌカッパ定常領域を用いて、フレーム内に挿入した。対応するｐＴＴ／ｐｃＤＮＡ３．４Ｆａｂ発現ベクターに対して、Ｖ_ＨＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列をコードするヒトＩｇＧ４Ｃ_Ｈ１を用いてフレーム内に挿入した。

［実施例２］：抗体および抗体Ｆａｂ断片の組み換え発現
抗体および抗体Ｆａｂ断片は、製造元の指示に本質的に従って、ＨＥＫ２９３懸濁細胞（２９３Ｅｘｐｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一過性導入を使用して発現した。２９３Ｅｘｐｉ細胞は典型的には、１％のＰ／Ｓ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１５１４０－１２２）を補充したＥｘｐｉ２９３Ｆ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１４３５１０４）で、３～４日ごとに継代培養した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して２．５～３ｍｉｌｌ／ｍＬの細胞密度で導入した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の各リットルに対して、合計１ｍｇのプラスミドＤＮＡ（Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１（Ｆａｂに対して）またはＶ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３（ｍＡｂに対して）とＬＣプラスミドとを１：１の比で）を、５０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号５１９８５－０２６、希釈Ａ）へと希釈することによって、および２．７ｍＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを５０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（希釈Ｂ）へと希釈することによって、導入を実施した。共導入を産生するＦａｂおよびｍＡｂについては、Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１およびＬＣプラスミド（Ｆａｂ）ならびにＶ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３およびＬＣプラスミド（ｍＡｂ）をそれぞれ１：１の比で使用した。希釈ＡおよびＢを混合し、そして室温で１０～２０分間インキュベートした。この後、トランスフェクション混合物をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に加え、細胞を軌道回転（８５～１２５ｒｐｍ）を備えた加湿インキュベーター中で、３７℃でインキュベートした。導入一日後、導入された細胞に、５ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションエンハンサー１および５０ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションエンハンサー２を補充した。細胞培養上清は、遠心分離によって導入４～５日後に典型的に回収し、その後濾過した。

［実施例３］：Ｆａｂおよび抗体の精製および特徴付け
すべての精製ステップを４℃で実施した。ラボスケールについては、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を緩衝液調製用に使用した。ＳＥ－ＨＰＬＣ解析に使用されたＨＰＬＣシステムは、Ａｇｌｉｅｎｔ１１００であった。凝集およびＬＣ／ＭＳをＱＣについて評価した。

Ｆａｂの捕捉は、１×ＰＢＳ（１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ）、ｐＨ７．４である結合緩衝液を用いたＨｉＴｒａｐＰｒｏｔｅｉｎＧＨＰ親和性クロマトグラフィーで実施した。一段階溶出を０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．８を用いて実施した。最終生成物を、５２ｍＬのＧＥＨｉｐｒｅｐ１６脱塩カラムを介して製剤緩衝液（２５ＭｍＨＥＰＥＳ、１５０ＭｍＮａＣｌ）ｐＨ７．４へと脱塩し、約－８０℃で保存するために遠心限外濾過装置（３０ＫＤＣ．Ｏ．）で濃縮した。

精製したＦａｂの品質を評価するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）解析を実施した。品質標準（例えば、ＳＥ－ＨＰＬＣによる＜９５％単量体）を満たさなかったバッチは、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。ＬＣ／ＭＳを行い、Ｆａｂタンパク質の同一性を検証した。すべてのＦａｂの分子量（ＭＷ）は、それぞれ重鎖および軽鎖の理論的ＭＷと一致することが示された。

抗体の精製および特徴付け
抗体の精製を、タンパク質ＡＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－５４３８－０１）を使用する親和性クロマトグラフィーで実施した。小規模な抗体産生については、タンパク質Ａ系精製を９６ウェルプレート内で実施したが、より大きな産生については、ＡｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１８－１１１２－４１）を使用した。親和性精製工程のために使用される緩衝液系は、１）２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌで構成される平衡緩衝液、２）１０ｍＭのギ酸ｐＨ３．５で構成される溶出緩衝液、および３）０．４Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ９．０で構成されるｐＨ調節緩衝液であった。細胞上清は、予め平衡化されたＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラムをいかなる調節も用いずに直接適用した。カラムをおよそ１０カラム容積の平衡緩衝液で洗浄し、抗体をおよそ２～５カラム容積の溶出緩衝液で均一濃度で溶出した。プールした画分のｐＨは、溶出直後に、記載したｐＨ調節緩衝液を使用して中性に調節した。

精製した抗体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、サイズ排除高圧液体－クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）および液体－クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）解析などの異なる方法を使用して特徴付けした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ解析を、ＮｕＰａｇｅ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２１ＢＯＸ）を使用して実施した。ここで、すべての抗体が、予想される軽鎖および重鎖構成要素を示した。Ａｇｉｌｅｎｔ６２１０計器および脱塩カラムＭａｓｓＰＲＥＰ（Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号ＵＳＲＭ１０００８６５６）における液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法のセットアップを使用して、インタクトな分子質量決定を実施した。使用した緩衝液系は、ＬＣ－ＭＳ等級－Ｈ_２Ｏ中の０．１％ギ酸で構成される平衡緩衝液、およびＬＣ－ＭＳ等級－ＡＣＮ中の０．１％ギ酸で構成される溶出緩衝液であった。Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１１３６５１７７００１）および還元剤（すなわち、メルカプトエタノールまたはＤＴＴ）を用い、および用いずに解析を実施した。すべての抗体が、配列および１つの重鎖Ｎ－グリカンにより、予想されるインタクトな分子質量を示した。純度は、ＳＥ－ＨＰＬＣに基づいて決定した。最終的なタンパク質純度は、ＡｇｉｌｅｎｔＬＣ１１００／１２００システム上で、ＢＩＯＳｅｐ－ＳＥＣ－Ｓ３０００３００×７．８ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号００Ｈ－２１４６－Ｋ０）、ならびに２００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．９、３００ｍＭのＮａｃｌ、および１０％のイソプロパノールで構成されたランニング緩衝液を用いる、ＳＥ－ＨＰＬＣ方法のセットアップに基づいて解析した。ＵＶ２８０および蛍光（Ｅｘ２８０ｎｍ／Ｅｍ３５４ｎｍ）検出器を検出のために使用した。抗体は、抗体のサイズを反映する保持時間を用いて、単一の対称ピークとして溶出した。純度推定値はすべて、異なる抗体に対して９５～９９％であった。最終的なタンパク質濃度を測定するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、抗体の各々に対する特定の吸光係数とともに使用した。

［実施例４］：インビトロアセンブリによって調製した二重特異性抗体
二重特異性抗体を、二重特異性ヒトＩｇＧ１抗体について記載した（Ｌａｂｒｉｊｎｅｔａｌ．ＰＮＡＳ２０１３，ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．５１４５－５１５０）Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）法（Ｇｅｎｍａｂ）による一次抗体および二次抗体のインビトロアセンブリによって、以下に詳述される二重特異性ヒトＩｇＧ４抗体のわずかに修正されたバリアントを使用して生成した。

ＩｇＧ１の場合、一次抗体の重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１Ｋ４０９Ｒ（抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ）であり、二次抗体の重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１Ｆ４０５Ｌ（抗ＦＸ／ＦＸａ）である。ＩｇＧ１は、前述のように、エフェクター機能が低減したＩｇＧ１バリアントであり得る。

ヒトＩｇＧ４の場合、一次抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ（抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ）であり、二次抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４Ｓ２２８ＰＦ４０５Ｌ＋Ｒ４０９Ｋ（抗ＦＸ）である。２つの親抗体を、実施例１～３に記載のように産生した。Ｆａｂアーム交換反応を、７５ｍＭの２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）を使用した還元条件下でＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、３０℃での４時間のインキュベーションで実施した。

［実施例５］：一価（ワンアームド）抗体の調製
従来の単一特異性および二価抗体に関連する潜在的なアビディティー効果を回避するために、例えば、ＦＸａ生成アッセイ（実施例９）において、一価のワンアームド（ＯＡ）抗体形式を、Ｍａｒｔｅｎｓｅｔａｌ．：ＡＮｏｖｅｌＯｎｅ－ＡｒｍｅｄＡｎｔｉ－ｃ－ＭｅｔＡｎｔｉｂｏｄｙＩｎｈｉｂｉｔｓＧｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａＧｒｏｗｔｈＩｎｖｉｖｏ．Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１２，６１４４－６１５２（２００６）に記載されるように使用し、全重鎖、切断型重鎖（Ｆａｂ領域を欠く）、および軽鎖が共発現される。Ｍａｒｔｅｎｓらによって記載された３つの鎖の共発現の代わりに、本発明の一価の抗体を、二重特異性抗体ついて記載のようにＤｕｏｂｏｄｙ（登録商標）の原理を使用して調製した（実施例４）。したがって、一価抗体は、完全な単一特異性抗体および二価抗体と、切断された重鎖二量体（正式には完全な抗体からＦａｂ領域を除去することに由来する）を混合することにより調製され、実施例４に記載されるものと同じ実験条件下で進めることによって鎖を交換することができる。一価抗体の形成には、実施例４に記載されるように、抗体および切断型重鎖二量体が、ヘテロ二量体化を促進するために適切な相補的変異、すなわちヒトＩｇＧ１に対してＦ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、またヒトＩｇＧ４に対してＦ４０５Ｌ＋Ｒ４０９Ｋ／ＷＴを保有することが必要とされる。

ＩｇＧ１サブタイプの一価の抗体の場合、重鎖の切断は、Ｎ末端からＣｙｓ２２０と上部ヒンジＣｙｓ２２６（ＥＵナンバリング）との間の位置までとすることができる。切断型ヒトＩｇＧ１重鎖の特定の例は、残基１～２２０が切断されたものである。

ヒトＩｇＧ４サブタイプの一価抗体の場合、重鎖の切断は、Ｎ末端からＣｙｓ２００と上部ヒンジＣｙｓ２２６（ＥＵナンバリング）との間の位置までとすることができる。切断型ヒトＩｇＧ４重鎖の特定の例は、残基１～２１４が切断されたものである。

［実施例６］：二重特異性抗体（構成成分）ＩＤおよび配列番号の概要

［実施例７］：ヒト血友病Ａ様血小板欠乏血漿のトロンビン生成試験（ＴＧＴ）における二重特異性抗ＦＩＸ（ａ）／ＦＸ（ａ）抗体の活性
二重特異性抗体ｂｉｍＡｂ６Ｂ、ｂｉｍＡｂ５Ｂ、ｂｉｍＡｂ４Ｂ、ｂｉｍＡｂ３Ｂ、ｂｉｍＡｂ２Ｂ、ｂｉｍＡｂ１Ｂ、ｂｉｍＡｂ８Ｂ、ｂｉｍＡｂ７Ｂ、ｂｉｍＡｂ１Ａ、ｂｉｍＡｂ２Ａ、ｂｉｍＡｂ３Ａ、ｂｉｍＡｂ４Ａ、ｂｉｍＡｂ５Ａ、ｂｉｍＡｂ６Ａ、ｂｉｍＡｂ７Ａ、およびｂｉｍＡｂ８Ａの血液凝固促進活性を、ヘムカーら（ＰａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌＨａｅｍｏｓｔＴｈｒｏｍｂ，２００２；３２：２４９－２５３）によって記載された原理に従って、血液凝固促進性合成リン脂質膜の存在下でトロンビン生成を促進するそれらの能力に基づいて決定した。比較のために、エミシズマブ配列同一類似体（ＳＩＡ）を含めた。各二重特異性抗体（試験化合物）を、中和抗ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体（以下、ＨＡ－ＰＰＰと呼ぶ）を補充した正常なヒト血小板欠乏血漿（ＮＨＰ）を使用したトロンビン生成試験（ＴＧＴ）で試験した。

材料および方法：
トロンビン生成試験
ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩポリクローナル抗体（ｐＡｂ、ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．、ＶＴ，ＵＳＡ）を補充したＮＨＰ（健康なボランティアからの）におけるトロンビン生成試験（ＴＧＴ）を、９６ウェルプレート蛍光光度計（ＦｌｕｏｒｏｓｃａｎＡｓｃｅｎｔＦＬ、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用した標準的にキャリブレーションされる自動トロンボグラフィによって実施した。反応混合物は、０．１μｇ／ｍｌの抗ＦＶＩＩＩｐＡｂ、４μｌの試験化合物希釈液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％ＢＳＡで希釈）、１０μｌの１ｐＭ組織因子（ＴＦ、ｐｐｐＬｏｗ、ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから）、または８．３Ｕ／ｍｌヒト第ＸＩａ因子（ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｅａｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＮ，ＵＳＡ）のいずれか、および１０μｌのＦｌｕＣａ基質（ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）とプレインキュベートした３６μｌのＮＨＰを含む。ＴＧＴを、トロンビンキャリブレータ（ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶ，Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してキャリブレーションし、１０μｌのトロンビンキャリブレータを、０．１μｇ／ｍｌの抗ＦＶＩＩＩｐＡｂ、４μｌ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％ＢＳＡ）とプレインキュベートした３６μｌのＮＨＰと混合した。ＴＧＴは、８つの濃度の試験化合物（０．３２、０．９６、２．８８、８．６４、２５．９、７７、２３３、および７００ｎＭ、最終血漿濃度）または追加緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％のＢＳＡ）のみ（ＨＡ対照を表す）で実施した。濃度範囲は、同じストックからのＨＡ－ＰＰＰでの少なくとも３つの独立した実験で試験した。ＴＧＴ中の正常な対照レベルは、ＮＨＰ添加緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％ＢＳＡ）のみを使用して測定した。ＴＧＴを合計６０分間進行させ、ＴＧＴパラメータのピークトロンビン高さ（ｎＭ）をＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェア（ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶ）で解析した。

結果および考察
表４および５は、それぞれ、組織因子およびヒトＦＸＩａを用いたＨＡ－ＰＰＰトリガーで試験した濃度での各二重特異性抗体の測定されたピークトロンビン生成率を示す。データは、すべての試験化合物が、抗体の非存在下で観察されたレベルを超えてトロンビン形成のピークを増加させること、すなわち、血液凝固促進活性を呈することを示す。加えて、ｂｉｍＡｂ６Ｂ、ｂｉｍＡｂ５Ｂ、ｂｉｍＡｂ４Ｂ、ｂｉｍＡｂ３Ｂ、ｂｉｍＡｂ２Ｂ、ｂｉｍＡｂ１Ｂ、ｂｉｍＡｂ８Ｂ、ｂｉｍＡｂ１Ａ、ｂｉｍＡｂ２Ａ、ｂｉｍＡｂ３Ａ、ｂｉｍＡｂ４Ａ、ｂｉｍＡｂ５Ａ、ｂｉｍＡｂ６Ａ、およびｂｉｍＡｂ８Ａはすべて、ｂｉｍＡｂ濃度が８．６４ｎＭを超え、１ｐＭの組織因子トリガーを使用した場合に、エミシズマブＳＩＡで観察されるものよりも高い濃度依存性トロンビン生成率を示し、優れた効力を示す。ｂｉｍＡｂ７Ｂは、２．８８～２３３ｎＭのｂｉｍＡｂの間でエミシズマブＳＩＡよりも優れていた。

さらに、ｂｉｍＡｂ６Ｂ、ｂｉｍＡｂ５Ｂ、ｂｉｍＡｂ４Ｂ、ｂｉｍＡｂ３Ｂ、ｂｉｍＡｂ２Ｂ、ｂｉｍＡｂ１Ｂ、ｂｉｍＡｂ８Ｂ、ｂｉｍＡｂ７Ｂ、ｂｉｍＡｂ１Ａ、ｂｉｍＡｂ２Ａ、ｂｉｍＡｂ３Ａ、ｂｉｍＡｂ４Ａ、ｂｉｍＡｂ５Ａ、ｂｉｍＡｂ６Ａ、ｂｉｍＡｂ７Ａ、およびｂｉｍＡｂ８Ａはすべて、８．３ｍＵ／ｌＬのヒトＦＸＩａで凝固を誘導した場合に、試験したすべての濃度でエミシズマブＳＩＡで観察されるよりも高いトロンビン生成能を示す。

［実施例８］：二重特異性抗体の等価ＦＶＩＩＩ活性
インビトロでのｂｉｍＡｂの等価ＦＶＩＩＩ活性を推定するために、血漿系トロンビン生成アッセイを、ピークトロンビンレベルを使用して、１～１００ＩＵ／ｄＬの組み換えＢドメイン切断型ＦＶＩＩＩの広範な用量応答を可能にするために確立した。組み換えＢドメイン切断型ＦＶＩＩＩに対する用量応答曲線を、同等のＦＶＩＩＩ活性を推定するために、ｂｉｍＡｂからのトロンビン生成を分析するための標準曲線として使用した。

方法：
トロンビン生成を実施例７に記載されるように測定したが、１Ｕ／ｍｌのヒト因子ＸＩａ（ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）をトリガーとして使用した。加えて、ＦＶＩＩＩ標準曲線として、１００ＩＵ／ｄＬから２倍下の組み換えＢドメイン切断型ＦＶＩＩＩ（ＮｏｖｏＥｉｇｈｔ，ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ）の８点希釈系列を含めた。

二重特異性抗体のＦＶＩＩＩ等価活性の決定：
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン８．０．２の非線形分析機能を使用して、組み換えＢドメイン切断型ＦＶＩＩＩの用量応答データを、「［アゴニスト］対応答（３つのパラメータ）」（式１）に適合させた：
式１．ピークトロンビン＝下部＋［ＦＶＩＩＩ］＊（上部－下部）／（ＥＣ５０＋［ＦＶＩＩＩ］）
式中、［ＦＶＩＩＩ］はＩＵ／ｍＬにおけるＦＶＩＩＩ濃度であり、ＥＣ５０は５０％活性をもたらすＦＶＩＩＩの濃度であり、下部および上部は適合のプラトーである。

［ＦＶＩＩＩ］を解くことによって、修正された式（式２）を使用して、特定の二重特異性抗体と同じトロンビンピークを生成するＦＶＩＩＩの濃度を推定することができる：

式中、Ｙは、測定されたピークトロンビンである。

結果：
ＦＶＩＩＩ用量応答曲線の非線形適合は、以下の定数をもたらす：ＥＣ５０＝２０．３±２．７３、上部＝４７６±１８．７、および下部＝－２２．６±１０．１。式２を使用して、等価ＦＶＩＩＩ活性を、実施例６に記載される二重特異性抗体について推定し、以下の表６を参照されたい。

［実施例９］：ＦＸａ生成アッセイにおける一価の抗ＦＩＸ（ａ）抗体の活性
従来のＩｇＧ抗体形式の二価性の結果として生じるあらゆる潜在的なアビディティー効果を回避するために、ＦＸに対するＦＩＸａ酵素活性の抗ＦＩＸ（ａ）抗体の刺激活性が、一価のワンアームド（ＯＡ）抗体形式への再フォーマット後に決定された（実施例５参照）。試験した抗体を以下の表７に列挙した。抗ＦＩＸａ抗体ＡＣＥ９１０の一価ＯＡバージョンを比較のために含めた。

ＯＡ抗体の刺激活性を、ホスファチジルセリン（ＰＳ）：ホスファチジルコリン（ＰＣ）脂質ベシクル（最終濃度５００μＭ、ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ、ＵＳＡ）および血漿由来ＦＩＸａ（最終濃度０．０２５または０．１ｎＭ；ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ、ＵＳＡ））の固定濃度で、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．３＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）で測定した。ＦＩＸａの濃度は、基質ＦＸの１５％未満がＦＸａへと変換されることを確実にするために選択された。一価のＯＡ抗体（表７に列挙される最終濃度）の存在下でのプレインキュベーション後、１００ｎＭの血漿由来ＦＸ（ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ，ＵＳＡ）を添加して、５０μｌの最終反応体積を得て、活性化を室温で２０分間進行させた。次いで反応物を、２５μｌのクエンチ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．３＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を添加することによりクエンチし、そして２５μｌの２ｍＭのＳ－２７６５発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｓｗｅｄｅｎ）をさらに添加し、マイクロプレートリーダーにおける４０５ｎｍでの吸光度測定（ΔＯＤ／分）により発色基質変換を測定することによって、生成されるＦＸａの量を決定した。測定された活性は、同じアッセイ内で測定されたシグナルを減算することによってバックグラウンド活性に対して補正されたが、ＦＩＸａおよび抗体はアッセイ緩衝液で置き換えられ、その後、アッセイ内に存在するＦＩＸａ濃度（［ＦＩＸａ］_{ｔｏｔａｌ}）に従って正規化された。この数字を、抗体の非存在下でのＦＸａ生成の同様に正規化された割合で割ることにより（Ａ_{ＦＩＸａ，ｎｏｒｍ}）、使用される濃度の抗体によるＦＩＸａ活性の刺激倍率を提供する抗体刺激指数が計算された。遊離ＦＩＸａによるＦＸａの生成速度が遅いため、上述のように活性化反応は抗体の非存在下で行われたが、５、１０、または２０ｎＭのＦＩＸａが存在した。次いで、測定された活性をバックグラウンドで減算し、そしてアッセイ内のＦＩＸａ濃度に従って正規化した。刺激指数の計算のためには、遊離ＦＩＸａの３つの正規化された活性の平均を使用した。

刺激指数の決定
要約すると、刺激指数の計算は以下のように説明することができる
式３刺激指数＝（（Ａ_{ＦＩＸａ＋ＯＡ}－Ａ_ｂｃｋｇ）／［ＦＩＸａ］_{ｔｏｔａｌ}）／Ａ_{ＦＩＸａ、ｎｏｒｍ}
式中、Ａ_{ＦＩＸａ＋ＯＡ}は、ＯＡ抗体の存在下で測定される活性であり、Ａ_ｂｃｋｇは、ＦＩＸａおよびＯＡ抗体の非存在下で測定されるバックグラウンド活性であり、［ＦＩＸａ］_{ｔｏｔａｌ}は、アッセイ中のＦＩＸａ濃度であり、Ａ_{ＦＩＸａ、ｎｏｒｍ}は、遊離ＦＩＸａの平均正規化活性である。

ＦＩＸａ飽和の決定
アッセイ中の、ＯＡ抗体で飽和したＦＩＸａの割合を、ＦＩＸａおよびＯＡ抗体の濃度、ならびにそれらの相互作用を支配する平衡解離定数（Ｋ_ｄ）によって決定した。後者は、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）などの当該技術分野で公知の技法によって測定することができる。

ＦＩＸａの飽和に達するまで、ＯＡ抗体の濃度が増加するにつれて刺激指数が増加することになるので、アッセイ中のＯＡ抗体の濃度は、完全なＦＩＸａの飽和における刺激指数を適切な決定を提供するために、アッセイ中のＦＩＸａの少なくとも８０％飽和を確保するように選択するべきである。

平衡状態でＯＡ抗体と結合したＦＩＸａの断片（ｆ_{ＦＩＸａ＋ＯＡ}）は、アッセイ中のＦＩＸａの総濃度（［ＦＩＸａ］_{ｔｏｔａｌ}）およびＯＡ抗体の総濃度（［ＯＡ］_{ｔｏｔａｌ}）、ならびに二次結合方程式を使用するそれらの相互作用に対する平衡解離定数（Ｋ_ｄ）から計算することができ、これはＫｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙｅｔａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２３６９６－２３７０６に記載され、以下の式４および５に詳述され、
［ＦＩＸａ＋ＯＡ］_{ａｓｓａｙ}は、アッセイにおける平衡でのＦＩＸａ－ＯＡ抗体複合体の計算された濃度を表し、
ｆ_{ＦＩＸａ＋ＯＡ}は、アッセイ中での平衡におけるＯＡ抗体と結合しているＦＩＸａの計算された割合を（単位パーセント）表す。

各ＯＡ抗体に対する刺激指数を表７に提供した。ＯＡエミシズマブ抗体では、ＦＩＸａ刺激は８つの異なる抗体濃度において決定し、これにより上記で概説した二次結合方程式を使用して、完全ＦＩＸａ飽和における刺激指数の推定が可能となる。これはまた、１．１μＭのエミシズマブとＦＩＸａとの相互作用の推定平衡解離定数（Ｋ_ｄ）を提供し、これは、Ｋｉｔａｚａｗａｅｔａｌ．（２０１７）ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ，１１７：１３４８－１３５７で報告された１．５２μＭの値と良好に一致する。残りの抗体については、ＦＩＸａ飽和度が未知であり、したがって列挙される刺激指数は、８０％以上のＦＩＸａ飽和度で得られることになる刺激の控えめな推定を表す。試験した抗体について、測定された刺激指数は、ＯＡエミシズマブ抗体について測定されたものよりも高いことが見出された。

［実施例１０］：非特異的結合のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析
低い非特異的結合は、医薬抗体の重要な特徴である。非特異的結合の高い傾向は、インビボでの半減期が損なわれる（Ｈｏｔｚｅｌ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１２＆Ａｖｅｒｙ，Ｌ．Ｂ．，ｍＡｂｓ，２０１８）、および溶解性が低減する（Ｋｏｈｌｉ，Ｎ．，ｍＡｂｓ，２０１５、およびＷｏｌｆＰｅｒｅｚ，Ａ．Ｍ．，ｍＡｂｓ，２０１９）などの問題をもたらし得る。以下の表８に列挙される抗ＦＩＸ（ａ）ｍＡｂの非特異的結合を評価するために、ｍＡｂ－カラム相互作用が溶出の遅延をもたらすＳＥＣ－ＨＰＬＣ法を使用した。したがって、長期間の保持時間は、非特異的結合の尺度である。以前に記載された方法（ＷｏｌｆＰｅｒｅｚ，Ａ．Ｍ．，ｍＡｂｓ，２０１９））、および（Ｄｏｂｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，ＳｃｉＲｅｐ，２０１６；６：３８６４４）に記載された方法に非常に類似する方法を使用した。ＢｉｍＡｂｓ１－８については、実施例４に記載されるように調製したエミシズマブＶＨ／ＶＬＳＩＡと比較して、非特異的結合の減少があり、表８を参照されたい。

材料および方法
サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）分析を、ＨＰＬＣシステム（１２００モデル、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬＳＥＣカラム（５μｍ、７．８×３００ｍｍ；ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて実施した。移動相は、ｐＨ６．８での１２２ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、７８ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭのＮａＣｌ、および４％の２－プロパノールから構成される。各分析を、０．８ｍＬ／分の流速、２８°Ｃのカラム温度で２４分間実行した。１５μｌのタンパク質溶液をカラムに注入して溶出し、２８０ｎｍの吸光度で測定した。データ処理をＡｓｔｒａｖ．７（Ｗｙａｔｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して実施した。

Claims

二重特異性抗体またはその抗原結合性断片であって、
ＦＩＸ（配列番号８９）および／またはその活性型形態（ＦＩＸａ）と結合することができ、かつ
ＦＸ（配列番号９０）および／またはその活性型形態（ＦＸａ）と結合することができ、
前記二重特異性抗体が、
重鎖および軽鎖を含む抗ＦＩＸ（ａ）抗体またはその抗原結合性断片と、
重鎖および軽鎖を含む抗ＦＸ（ａ）抗体またはその抗原結合性断片と、を含み、
ａ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２６、２７、および２８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号３０、３１、および３２によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｂ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２６、２７、および２８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号３０、３１、および３２によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｃ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号３８、３９、および４０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｄ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号３８、３９、および４０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｅ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号４６、４７、および４８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｆ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号４６、４７、および４８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｇ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号５０、５１、および５２によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｈ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号５０、５１、および５２によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｉ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号５８、５９、および６０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｊ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号５８、５９、および６０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｋ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号６６、６７、および６８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号７０、７１、および７２によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｌ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号６６、６７、および６８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号７０、７１、および７２によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｍ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号７８、７９、および８０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｎ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号７８、７９、および８０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｏ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号８６、８７、および８８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号１８、１９、および２０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号２２、２３、および２４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｐ）前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号８６、８７、および８８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記重鎖が、それぞれ、配列番号２、３、および４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、
前記抗ＦＸ（ａ）抗体もしくはその抗原結合性断片の前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６、７、および８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含む、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
前記抗ＦＩＸ（ａ）抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号２５によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号２９によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
ｂ．配列番号３３によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号３７によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
ｃ．配列番号４１によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号４５によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
ｄ．配列番号４９によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号５３によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
ｅ．配列番号５７によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号６１によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
ｆ．配列番号６５によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号６９によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
ｇ．配列番号７３によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号７７によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
ｈ．配列番号８１によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号８５によって特定される軽鎖可変ドメインを含み、
かつ前記抗ＦＸ（ａ）抗体またはその抗原結合性断片が、
ｉ．配列番号１７によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号２１によって特定される軽鎖可変ドメイン、または
ｉｉ．配列番号１によって特定される重鎖可変ドメインおよび配列番号５によって特定される軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
前記二重特異性抗体のアイソタイプが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１または２に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
前記抗体またはその抗原結合性断片が、血液凝固促進抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
前記抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる、請求項１～４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体またはその抗原結合性断片と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
血友病の治療に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物。
阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａの治療に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物。
阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａの予防処置に使用するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物。
阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａを患う対象者を治療する方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物を、前記対象者に投与することを含む、方法。
前記治療が、予防処置である、請求項１０に記載の方法。
阻害物質を伴うまたは伴わない血友病Ａなどの血友病の治療に使用するための医薬を製造するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物の使用。
前記治療が、予防処置である、請求項１２に記載の使用。
抗体またはその抗原結合性断片であって、ＦＩＸ（配列番号８９）および／またはその活性型形態（ＦＩＸａ）と結合することができ、重鎖および軽鎖を含み、
ａ）前記重鎖が、それぞれ、配列番号２６、２７、および２８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、前記軽鎖が、それぞれ、配列番号３０、３１、および３２によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｂ）前記重鎖が、それぞれ、配列番号３４、３５、および３６によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、前記軽鎖が、それぞれ、配列番号３８、３９、および４０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｃ）前記重鎖が、それぞれ、配列番号４２、４３、および４４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、前記軽鎖が、それぞれ、配列番号４６、４７、および４８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｄ）前記重鎖が、それぞれ、配列番号５０、５１、および５２によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、前記軽鎖が、それぞれ、配列番号５４、５５、および５６によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｅ）前記重鎖が、それぞれ、配列番号５８、５９、および６０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、前記軽鎖が、それぞれ、配列番号６２、６３、および６４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｆ）前記重鎖が、それぞれ、配列番号６６、６７、および６８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、前記軽鎖が、それぞれ、配列番号７０、７１、および７２によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｇ）前記重鎖が、それぞれ、配列番号７４、７５、および７６によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、前記軽鎖が、それぞれ、配列番号７８、７９、および８０によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含むか、または
ｈ）前記重鎖が、それぞれ、配列番号８２、８３、および８４によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含み、前記軽鎖が、それぞれ、配列番号８６、８７、および８８によって特定されるＣＤＲ１～３配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片。
前記抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＩＸ（配列番号８９）および／またはその活性型形態（ＦＩＸａ）と結合することができ、かつＦＸ（配列番号９０）および／またはその活性型形態（ＦＸａ）と結合することができる、二重特異性抗体の製造において使用するための中間体である、請求項１４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
前記抗体またはその抗原結合性断片が、血液凝固促進抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１４または１５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
前記抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
キットであって、（ｉ）任意に、注射装置に含まれる、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合性断片、または組成物、および（ｉｉ）使用説明書を含む、キット。