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JP2023508189A - 抗ｃｓｆ１ｒ分子及びその使用 - Google Patents

抗ｃｓｆ１ｒ分子及びその使用 Download PDF

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JP2023508189A
JP2023508189A JP2022539223A JP2022539223A JP2023508189A JP 2023508189 A JP2023508189 A JP 2023508189A JP 2022539223 A JP2022539223 A JP 2022539223A JP 2022539223 A JP2022539223 A JP 2022539223A JP 2023508189 A JP2023508189 A JP 2023508189A
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JP2022539223A
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デュ，ファンヨン
ペイジ ルオ，ピーター
リ，ヤン
リュ，ギゾン
シェ，シャオホン
ダイ，ジョンシ
Original Assignee
アダジーン（スージョウ）リミテッド
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Abstract

【要約】
本開示は、ヒトＣＳＦ－１Ｒに対する抗体、前記抗体の製造方法、前記抗体を含有する医薬組成物、及びその使用に関する。

Description

本開示は、ヒトＣＳＦ－１Ｒに対する抗体、前記抗体の製造方法、前記抗体を含有する医薬組成物、及びその使用に関する。
１９８６年から、ＣＳＦ－１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ，同義語：Ｍ－ＣＳＦ受容体、マクロファージコロニー刺激因子１受容体、ＥＣ ２．７．１０．１、Ｆｍｓ癌原遺伝子、ｃ－ｆｍｓ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０７３３３、ＣＤ１１５）（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０（１９８６）２７７～２８０）が知られている。ＣＳＦ－１Ｒは、増殖因子であり、かつ、ｃ－ｆｍｓ癌原遺伝子によりコードされる（Ｒｏｔｈ，Ｐ．及びＳｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１（１９９２）１４１～６７に記載されている）。
ＣＳＦ－１Ｒは、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子であり、ＣＳＦ－１とも呼ばれる）の受容体であり、かつ、このサイトカインの生物学的作用を媒介する（Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ ４１（１９８５）６６５－６７６）。コロニー刺激因子－１受容体（ｃ－ｆｍｓとも呼ばれる）のクローニングは、最初にＲｏｕｓｓｅｌ，Ｍ．Ｆ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２５（１９８７）５４９－５５２に記載されている。この刊行物において、ＣＳＦ－１Ｒは、タンパク質Ｃ末端テイルの変化に依存した形質転換能を有することが明らかになり、前記変化は、Ｃｂｌに結合することにより、受容体の下方調節を調節する阻害性チロシン９６９リン酸化の喪失を含む（Ｌｅｅ，Ｐ．Ｓ．ら，Ｅｍｂｏ
Ｊ．１８（１９９９）３６１６－３６２８）。
ＣＳＦ－１Ｒは単鎖の、膜貫通受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であり、受容体の細胞外部分における反復Ｉｇドメインによって特徴付けられるＲＴＫを有する免疫グロブリン（Ｉｇ）モチーフのファミリーのメンバーである。細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメインは、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、幹細胞増殖因子受容体（ｃ－Ｋｉｔ）及びｆｉｎｓ様サイトカイン受容体（ＦＬＴ３）を含む他の関連ＲＴＫクラスＩＩＩファミリーにも存在する特有な挿入ドメインを挟む。このファミリーの増殖因子受容体間の構造的相同性にもかかわらず、それらは異なる組織特異的機能を有する。ＣＳＦ－１Ｒは、主に単球系の細胞上及び女性生殖器器官及び胎盤に発現される。さらに、ＣＳＦ－１Ｒの、皮膚のランゲルハンス細胞、平滑筋細胞のサブセット（Ｉｎａｂａ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２）５６９３－５６９９）、Ｂ細胞（Ｂａｋｅｒ，Ａ．Ｈ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８（１９９３）３７１－３７８）及びマイクログリア（Ｓａｗａｄａ，Ｍ．ら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５０９（１９９０）１１９－１２４）において発現することが報告されている。
ＣＳＦ－１Ｒシグナル伝達の主な生物学的作用は、造血前駆細胞のマクロファージ系（破骨細胞を含む）への分化、増殖、遊走及び生存である。ＣＳＦ－１Ｒの活性化は、そのリガンドであるＭ－ＣＳＦによって媒介される。Ｍ－ＣＳＦとＣＳＦ－１Ｒの結合は、ホモ二量体の形成と、チロシンリン酸化によるキナーゼの活性化を誘導する（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（１９９７）４－１０）。更なるシグナル伝達は、それぞれＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＲａｓ／ＭＡＰＫ経路に連結するＰＩ３Ｋ及びＧｒｂ２のｐ８５サブユニットにより媒介される。これらの２つの重要なシグナル伝達経路は、増殖、生存及びアポトーシスを調節することができる。ＣＳＦ－１Ｒのリン酸化細胞内ドメインに結合するその他のシグナル伝達分子は、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＰＬＣｙ及びＣｂｌを含む（Ｂｏｕｒｅｔｔｅ，Ｒ．Ｐ．和Ｒｏｈｒｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
，Ｌ．Ｒ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７（２０００）１５５－１６６）。
ＣＳＦ－１Ｒシグナル伝達は、免疫反応、骨リモデリング及び生殖器系において生理学的作用を有する。Ｍ－ＣＳＦ－１（Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（１９９７）５４－６１）又はＣＳＦ－１Ｒ（Ｄａｉ，Ｘ．Ｍ．ら，Ｂｌｏｏｄ ９９（２００２）１１１－１２０）のノックアウト動物は、骨硬化性、造血性、組織マクロファージ及び生殖器表現型を有することが示されており、これは、相応する細胞タイプにおけるＣＳＦ－１Ｒの役割と一致する。
１つの態様において、本発明は、ヒトＣＳＦ－１Ｒに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、以下の（１）～（１０）を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４１で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１で示されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３９で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、あるいは、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ。
１つの実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合性断片は、以下の（１）～（１０）を含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１で示されるＶＬ、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２で示されるＶＬ、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３で示されるＶＬ、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４で示されるＶＬ、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５で示されるＶＬ、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６で示されるＶＬ、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７で示されるＶＬ、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８で示されるＶＬ、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９で示されるＶＬ、あるいは、
（１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０で示されるＶＬ。
１つの実施形態において、上記配列を含む抗体又は抗原結合性断片は、ヒトＣＳＦ－１Ｒに特異的に結合する。
１つの実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合性断片は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの全長抗体である。
１つの実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合性断片は、Ｓ２４１Ｐ変異を有するＩｇＧ４サブクラスの全長抗体である。
１つの実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ及びダイアボディから選ばれる抗体断片である。
１つの実施形態において、本発明による抗体又は抗原結合性断片は、以下の１種又は複数種の特性を有する。
（１）ヒトＣＳＦ－１Ｒに対して、ＫＤ＜４０ｎＭ、＜３５ｎＭ、＜３０ｎＭ、＜２５ｎＭ、＜２０ｎＭ、＜１５ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜９ｎＭ、＜８ｎＭ、＜７ｎＭ、＜６ｎＭ、＜５ｎＭ、＜４ｎＭ、＜３ｎＭ、＜２ｎＭ、＜１ｎＭの親和性を有し、親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを用いたＳＰＲにより決定される通りである。
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２で示さ
れるＶＬを含む抗体と、ヒトＣＳＦ－１Ｒへの結合を競合する。
（３）サルＣＳＦ－１Ｒに結合する。
（４）マウスＣＳＦ－１Ｒに結合しない。
（５）保存緩衝液（例えば、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．５））中で、８０ｍｇ／ｍＬ超え、９０ｍｇ／ｍＬ超え、１００ｍｇ／ｍＬ超え、１１０ｍｇ／ｍＬ超え、１２０ｍｇ／ｍＬ超え、１３０ｍｇ／ｍＬ超え、又は１３４ｍｇ／ｍＬ超えの溶解度を有し、有意な沈降がない。
（６）保存緩衝液（例えば、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．５））中で、１ｍｇ／ｍｌの溶液に比べて、高濃度下で１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、又は２％未満のＨＭＷを有し、かつ、ΔＨＭＷが１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、又は０．３％未満であり、例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより解析される通りである。
（７）保存緩衝液（例えば、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．５））中で、－８０℃で凍結して室温下で解凍するサイクルを６回行った後でも安定している。
（８）保存緩衝液（例えば、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．５））中で、５０℃で７日経過しても安定している。
（９）ＣＳＦ－１により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化を阻害し、特に、用量依存性の方式で、さらに、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２で示されるＶＬを含む抗体に比べて、程度がより強いか、類似するか、あるいは、より弱い。
（１０）ＩＬ－３４により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化を阻害し、特に、用量依存性の方式で、さらに、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２で示されるＶＬを含む抗体に比べて、程度がより強いか、類似するか、あるいは、より弱い。
（１１）ＣＳＦ－１により誘導される単球増殖を阻害し、特に、用量依存性の方式で、さらに、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２で示されるＶＬを含む抗体に比べて、程度がより強いか、類似するか、あるいは、より弱い。
（１２）ＩＬ－３４により誘導される単球増殖を阻害し、特に、用量依存性の方式で、さらに、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２で示されるＶＬを含む抗体に比べて、程度がより強いか、類似するか、あるいは、より弱い。
（１３）カニクイザル中、ＩｇＧ１の形式で１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で、２００μｇ／ｍＬ超え、２１０μｇ／ｍＬ超え、２２０μｇ／ｍＬ超え、２３０μｇ／ｍＬ超え、２４０μｇ／ｍＬ超え、又は２４５μｇ／ｍＬ超えの平均Ｃｍａｘ、１５０００μｇｈ／ｍＬ超え、１６０００μｇｈ／ｍＬ超え、１７０００μｇｈ／ｍＬ超え、１８０００μｇｈ／ｍＬ超え、１９０００μｇｈ／ｍＬ超え、又は２００００μｇｈ／ｍＬ超えの平均ＡＵＣ０－８６４ｈ、及び／又は５０ｈ超え、６０ｈ超え、７０ｈ超え、８０ｈ超え、９０ｈ超え、又は１００ｈ超えの平均ｔ１／２を有する。
（１４）カニクイザル中、ＩｇＧ１の形式で１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で、末梢血中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球の急速な除去を媒介し、特に、７０％超え、８０％超え、又は９０％超え、特に投与してから第１日～第８日、投与してから第２日～第８日、投与してから第３日～第８日、投与してから第４日～第８日、投与してから第１日～第７日、投与してから第２日～第７日、投与してから第３日～第７日、投与してから第４日～第７日、投与してから第１日～第６日、投与してから第２日～第６日、投与してから第３日～第６日、投与してから第４日～第６日、投与してから第１日～第５日、投与してから第２日～第５日、投与してから第３日～第５日、投与してから第４日～第５日、投与してから第１日～第４日、投与してから第２日～第４日又は投与してから第３日～第４日である、及び／又は
（１５）カニクイザル中、ＩｇＧ１の形式で１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で、血清ＣＳＦ－１レベルの急速な上昇を媒介し、特に投与してから８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３ｈであり、あるいは、投与してから１、２、３又は４日であり、特に投与前のベースラインに比べて、１０倍超え、２０倍超え、３０倍超え、４０倍超え、５０倍超え、６０倍超え、７０倍超え、８０倍超え、９０倍超え、１００倍超え、２００倍超え、３００倍超え、４００倍超え、５００倍超え、６００倍超え、７００倍超え、８００倍超え、９００倍超え、又は１０００倍超えであり、特に投与してから第１日～第１６日、投与してから第１日～第１５日、投与してから第１日～第１４日、投与してから第１日～第１３日、投与してから第１日～第１２日、投与してから第１日～第１１日、投与してから第１日～第１０日、投与してから第１日～第９日、投与してから第１日～第８日、投与してから第２日～第１６日、投与してから第２日～第１５日、投与してから第２日～第１４日、投与してから第２日～第１３日、投与してから第２日～第１２日、投与してから第２日～第１１日、投与してから第２日～第１０日、投与してから第２日～第９日、投与してから第２日～第８日、投与してから第３日～第１６日、投与してから第３日～第１５日、投与してから第３日～第１４日、投与してから第３日～第１３日、投与してから第３日～第１２日、投与してから第３日～第１１日、投与してから第３日～第１０日、投与してから第３日～第９日、投与してから第３日～第８日、投与してから第４日～第１６日、投与してから第４日～第１５日、投与してから第４日～第１４日、投与してから第４日～第１３日、投与してから第４日～第１２日、投与してから第４日～第１１日、投与してから第４日～第１０日、投与してから第４日～第９日、投与してから第４日～第８日、投与してから第５日～第１６日、投与してから第５日～第１５日、投与してから第５日～第１４日、投与してから第５日～第１３日、投与してから第５日～第１２日、投与してから第５日～第１１日、投与してから第５日～第１０日、投与してから第５日～第９日、投与してから第５日～第８日、投与してから第６日～第１６日、投与してから第６日～第１５日、投与してから第６日～第１４日、投与してから第６日～第１３日、投与してから第６日～第１２日、投与してから第６日～第１１日、投与してから第６日～第１０日、投与してから第６日～第９日、投与してから第６日～第８日、投与してから第１日～第７日、投与してから第２日～第６日又は投与してから第３日～第５日であり、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６日持続する。
本発明は、本発明による抗体又は抗原結合性断片を含む、医薬組成物を提供する。
本発明は、本発明による抗体又は抗原結合性断片をコードする、少なくとも１種のポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、本発明による少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種の担体を提供する。
本発明は、本発明による少なくとも１種のポリヌクレオチド又は本発明による少なくとも１種の担体を含む、少なくとも１種の宿主細胞を提供する。
本発明は、本発明による抗体又は抗原結合性断片の製造方法を提供し、当該方法は、本発明による少なくとも１種のポリヌクレオチドの発現に適した条件下で、本発明による少なくとも１種の宿主細胞を培養する工程と、前記抗体抗原結合性断片を任意に回収する工程と、を含む。
本発明は、被験者の疾患、障害又は病症の治療方法を提供し、当該方法は、前記被験者に治療有効量の本発明による抗体又は抗原結合性断片を投与する工程を含む。
本発明は、本発明による抗体又は抗原結合性断片の、疾患、障害又は病症を治療するための薬物の製造への使用を提供する。
図１は、抗体と、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞表面において一過性発現するヒト、サル又はマウスＣＳＦ－１Ｒとの結合を示す。 図１は、抗体と、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞表面において一過性発現するヒト、サル又はマウスＣＳＦ－１Ｒとの結合を示す。 図１は、抗体と、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞表面において一過性発現するヒト、サル又はマウスＣＳＦ－１Ｒとの結合を示す。 図２は、凍結及び解凍のサイクルを６回行い（左図）、あるいは、５０℃で７日保存（右図）した後の抗体の安定性を示す。 図３は、抗体の、ＣＳＦ－１により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化に対する阻害を示す。 図４は、抗体の、ＩＬ－３４により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化に対する阻害を示す。 図５は、抗体の、ＣＳＦ－１により誘導される単球増殖に対する阻害を示す。 図６は、抗体の、ＩＬ－３４により誘導される単球増殖に対する阻害を示す。 図７は、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量後のカニクイザル中の抗体のＰＫ曲線を示す。 図８は、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量後のカニクイザル中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋及びＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球数の変化を示す。 図９は、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量後のカニクイザル中の血清ＣＳＦ－１レベルの変化を示す。
用語「抗体」は、抗体全体、抗体断片、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞エピトープ枯渇抗体、及び本発明による特徴的特性が保持される限りさらに遺伝子組換え抗体を含むがこれらに限定されない様々な形態の抗体を包含する。
「抗体断片」は、完全長抗体の部分、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６～８８頁に記載されている）。さらに、抗体断片は、ＣＳＦ－１Ｒに結合する、すなわちＶＬドメインと一緒に会合することができるＶＨドメイン、又はＣＳＦ－１Ｒに結合する、すなわちＶＨドメインと一緒に会合して機能的抗原結合部位を構築し、これにより特性を提供することができるＶＨドメインの特徴を有する一本鎖ポリペプチドを含む。
用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用されるとき、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を指す。
用語「キメラ抗体」は、通常、組換えＤＮＡ法により調製される、マウス由来の可変領域、すなわち結合領域、及び異なる供給源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部分を含むモノクローナル抗体を指す。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。このようなラット／ヒトキメラ抗体は、ラット免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及びヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメ
ントを含む、発現免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明により包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが元の抗体のクラス又はサブクラスから修飾又は変更されているものである。このような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体の作製方法は、従来の組換えＤＮＡ法及び今や当技術分野でよく知られている遺伝子トランスフェクション法を含む。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１～６８５５頁；ＵＳ ５，２０２，２３８及びＵＳ ５，２０４，２４４参照。
用語「ＣＤＲ移植バリアント」は、本出願内で使用されるとき、通常、組換えＤＮＡ法により調製される、１つの供給源又は種由来の相補性決定領域（ＣＤＲ又は超可変領域）及び異なる供給源又は種由来のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む抗体の可変ドメインを意味する。マウスＣＤＲ及びヒトＦＲを含む可変ドメインのＣＤＲ移植バリアントが好ましい。
用語「Ｔ細胞エピトープ枯渇バリアント」は、本出願内で使用されるとき、ヒトＴ細胞エピトープ（ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する可変ドメイン内のペプチド配列）を除去して免疫原性を除去又は低減するように修飾された抗体の可変ドメインを意味する。この方法により該可変ドメインのアミノ酸側鎖と、ＭＨＣクラスＩＩ結合グローブを有する特異的結合ポケットの間の相互作用が同定される。同定された免疫原性領域は、免疫原性を排除するように変異される。このような方法は一般に、例えばＷＯ９８／５２９７６号パンフレットに記載されている。
用語「ヒト化バリアント」は、本出願内で使用されるとき、非ヒト起源、例えば非ヒト種由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト起源のフレームワーク領域（ＦＲ）から再構成され、ならびに元の非ヒト可変ドメインの結合親和性及び特異性も再構成又は改善するためにさらに修飾されている抗体の可変ドメインを意味する。このようなヒト化バリアントは通常、組換えＤＮＡ法により調製される。親非ヒト可変ドメインの親和性及び特異性の再構成は重要なステップであり、現在種々の方法が使用されている。１つの方法において非ヒトＣＤＲ及びヒトＦＲに変異（いわゆる復帰変異）を導入することが有益かどうかが決定される。このような復帰変異に適した位置は、ヒトフレームワークを選択すること（固定化フレームワークアプローチ；相同性マッチング又はベストフィット）、コンセンサス配列を使用すること、幾つかの異なるヒトｍＡｂからＦＲを選択すること、又は３次元表面で非ヒト残基をヒトｍＡｂにおいて見出される最も一般的な残基と置換すること（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」又は「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」による、例えば配列又は相同性分析により同定することができる。
本発明による抗体にはさらに、「保存的配列修飾」（本発明による抗体の上述の特徴に影響を与えない又は変えないヌクレオチド及びアミノ酸配列修飾）を有するような抗体が含まれる。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ変異誘発などの当技術分野で公知の標準的方法により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。故に、ヒト抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体において予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と好ましくは置換され得る。
アミノ酸置換は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３～３２７頁及びＱｕｅｅｎ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）１００２９～１００３３頁により記載されているような分子モデリングに基づく変異誘発により行うことができる。
ＣＳＦ－１受容体（ＣＳＦ－１Ｒ；別名：Ｍ－ＣＳＦ受容体；マクロファージコロニー刺激因子１受容体、ＥＣ２．７．１０．１、Ｆｍｓ癌原遺伝子、ｃ－ｆｍｓ、Ｓｗｉｓｓ
Ｐｒｏｔ Ｐ０７３３３、ＣＤ１１５）は、１９８６年から知られている（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２０（１９８６）２７７～２８０頁）。ＣＳＦ－１Ｒは増殖因子であり、ｃ－ｆｍｓ癌原遺伝子によりコードされる（例えばＲｏｔｈ，Ｐ．及びＳｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１（１９９２）１４１～６７頁に概説されている）。
ＣＳＦ－１Ｒは、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子、ＣＳＦ－１とも呼ばれる）の受容体であり、このサイトカインの生物学的効果を媒介する（Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ ４１（１９８５）６６５～６７６頁）。コロニー刺激因子－１受容体（ｃ－ｆｍｓとも呼ばれる）のクローニングは、Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｍ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２５（１９８７）５４９～５５２頁で最初に記載された。その刊行物において、ＣＳＦ－１Ｒは、Ｃｂｌを結合しこれにより受容体ダウンレギュレーションを制御する抑制性チロシン９６９リン酸化（Ｌｅｅ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｅｍｂｏ Ｊ．１８（１９９９）３６１６～３６２８頁）の喪失を含む、該タンパク質のＣ末端尾部の変化に依存する形質転換能を有することが示された。
本明細書で使用されるとき、「ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する」は、ヒトＣＳＦ－１Ｒ抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、２５℃で１．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、好ましくは２５℃で１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値である。結合親和性は、表面プラズモン共鳴法（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））などの３５℃での標準的結合アッセイにより決定される。
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群から成り、通常、エピトープは、特異的３次元構造特性、及び特異的電荷特性を有する。立体構造及び非立体構造エピトープは、前者への結合は変性溶媒の存在下で失われるが、後者では失われない点で区別される。好ましくは本発明による抗体は、天然のＣＳＦ－１Ｒに特異的に結合するが、変性ＣＳＦ－１Ｒには特異的に結合しない。
用語「参照抗体と同じエピトープに結合する」は、本明細書で使用されるとき、参照抗体が結合するＣＳＦ－１Ｒ上の同じエピトープに結合する、本発明の抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体を指す。本発明の抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体のエピトープ結合特性は、当技術分野で公知の手法を用いて決定することができる。ＣＳＦ－１Ｒ抗体は、ＣＳＦ－１Ｒへの参照抗体の結合を阻害する試験抗体の能力を決定するためのインビトロ競合的結合阻害アッセイにおいて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により２５℃で測定される。これは、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）により調べることができる。
「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、本明細書で使用されるとき、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖及び重鎖ドメインの各ペアを意味する。可変軽鎖及び重鎖ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、３つの「超可変領域」（すなわち相補性決定領域、ＣＤＲ）に連結された、その配列が広範
に保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域はβシート立体構造をとり、ＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成し得る。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により３次元構造で保持され、他方の鎖からのＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明による抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、したがって本発明のさらなる目的を提供する。
「抗原結合性断片」なる用語は、「抗体の抗原結合部分」なる用語の同義語である。用語「抗体の抗原結合部分」は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書に定義されているような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、抗体の特性を規定する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の標準的定義及び／又は「超可変ループ」からの残基に従って決定される。
用語「核酸」又は「核酸分子」は、本明細書で使用されるとき、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
用語「アミノ酸」は、本出願内で使用されるとき、アラニン（３文字表記：ａｌａ、１文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、ｇｌｙｃｉｎｅ（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む自然発生カルボキシアルファ－アミノ酸の群を意味する。
本発明の１つの実施形態は、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合するヒトＩｇＧ１クラス抗体の重鎖をコードする核酸、及び前記抗体の軽鎖をコードする核酸の配列が発現担体に挿入され、前記担体が真核宿主細胞に挿入され、コードされたタンパク質が発現され、宿主細胞又は上清から回収されることを特徴とする、本発明によるヒトＣＳＦ－１Ｒに対する抗体の作製方法である。
本発明による抗体は、好ましくは組換え手段により作製される。このような方法は、技術水準で広く公知であり、原核及び真核細胞でのタンパク質発現と、その後の抗体ポリペプチドの単離、及び通常は薬学的に許容可能な純度への精製を含む。タンパク質発現に関して、軽鎖及び重鎖又はそれらの断片をコードする核酸が、標準的方法により発現担体に挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞などの適切な原核又は真核宿主細胞で行われ、抗体が細胞から（上清から又は細胞溶解後に）回収される。
抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製される。これらの方法には、天然の供給源からの単離（自然
発生アミノ酸配列バリアントの場合）、又はヒト化抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体の以前に調製されたバリアントバージョンもしくは非バリアントバージョンの、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製が含まれるが、これらに限定されない。
本発明による重鎖及び軽鎖可変ドメインは、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組み合わされて発現担体構築物を形成する。重鎖及び軽鎖発現構築物は、単一の担体に組み合わされ得、宿主細胞にコトランスフェクトされ得、連続的にトランスフェクトされ得、又は個別にトランスフェクトされ得、宿主細胞が次いで融合されて両鎖を発現させる単一の宿主細胞を形成する。
抗体の組換え作製は、技術水準で十分に公知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３～２０２頁；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１～２８２頁；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１～１６１頁；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．、Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（１９９８）８７０～８８０頁の総説に記載されている。
抗体は、細胞全体中に、細胞溶解物中に、又は部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在することができる。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野でよく知られた他の手法を含む標準的手法により、他の細胞成分又は他の混入物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を排除するために行われる。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）参照。
ＮＳ０細胞での発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９～１２３頁；及びＢａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（２００１）２６１～２７０頁により記載されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ、Ｙ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０（２００２）Ｅ９により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３～３８３７頁；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９（１９９２）４２８５～４２８９頁；及びＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７～８７頁により記載されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１～８３頁においてＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．、ならびにＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１～１９９頁においてＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．により記載されている。
原核生物に適した制御配列には、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるならば、コード配列に作動可能に連結されており；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促すように位置するならば、コ
ード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結されている」は、連結されたＤＮＡ配列が隣接していること、ならびに分泌リーダーの場合は、隣接し及びリーディングフレーム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。連結は、便利な制限部位でのライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来の慣例に従って使用される。
モノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として役立つことができる。単離されると、ＤＮＡは発現担体に挿入され得、該担体は次いで、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生するＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を得る。
本明細書で使用されるとき、発現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は互換的に使用され、全てのこのような呼称は子孫を含む。故に、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」は、継代数に関係なく初代対象細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｕｂｊｅｃｔ ｃｅｌｌ）及びこれに由来する培養物を含む。全ての子孫は、故意又は偶発性の変異のため、ＤＮＡ含量において正確には同一でない可能性があることも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は、当業者によく知られた用語であり、抗体のパパイン切断に基づき定義される。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類され、これらの幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。重鎖定常領域に従って、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃ受容体結合に基づきＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分に補体因子Ｃ１ｑが結合することにより開始される。補体系に対する抗体の影響は特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合はＦｃ部分における定められた結合部位により引き起こされる。このような結合部位は技術水準で公知であり、例えばＢｏａｃｋｌｅ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８２（１９７９）７４２～７４３頁、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５～２５６０頁、Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．及びＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７～９１７頁、Ｂｕｒｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８～３４４頁、Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５～１００４頁、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８～４１８４頁、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（２００１）１２１６１～１２１６８頁、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９～３２４頁、欧州特許第０３０７４３４号明細書により記載されている。このような結合部位は、例えばＬ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．のＥＵインデックスによるナンバリング、以下参照）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体が、通常は補体活性化ならびにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すのに対し、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３を結合しない。
１つの実施形態において本発明による抗体は、ヒト起源に由来するＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ヒト起源に由来するＦｃ部分」は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のいずれかのＦｃ部分、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラス由来のＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＬ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラス由来のＦｃ部分、又はヒトＩｇＧ４サブクラス由来の変異Ｆｃ部分（好ましくはＳ２２８Ｐに変異を有する）であるＦｃ部分を意味する。
１つの実施形態において本発明による抗体は、定常鎖がヒト起源のものであることを特徴とする。このような定常鎖は、技術水準で十分に公知であり、例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．により記載されている（例えばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．及びＷｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４～２１８頁参照）。抗体は、マウス起源のものであること、及びＫａｂａｔによるマウス抗体の抗体可変配列フレームを含むことがさらに好ましい。
本発明は、本発明による抗体の治療有効量を患者に投与することを特徴とする、治療を必要としている患者の治療方法を含む。
本発明は、治療のための本発明による抗体の使用を含む。
故に、同じエピトープに結合する本発明による抗体は、ＣＳＦ－１リガンド依存性及びＣＳＦ－１リガンド非依存性細胞における細胞増殖を阻害することができた。特に本発明のＣＳＦ－１Ｒ抗体は、ＣＳＦ－１リガンド依存性及びＣＳＦ－１リガンド非依存性ＣＳＦ１－Ｒ媒介疾患の治療において使用するためのものである。これは、ＣＳＦ－１Ｒ媒介疾患が、ＣＳＦ－１リガンド及びＣＳＦ－１Ｒを通じた対応するシグナル伝達に依存性である、ならびに／又はＣＳＦ－１リガンド及びＣＳＦ－１Ｒを通じた対応するシグナル伝達に非依存性であることを意味する。ＣＳＦ－１Ｒを通じたシグナル伝達は、腫瘍増殖及び転移に関与している可能性がある。
本発明の１つの実施形態は、「ＣＳＦ－１Ｒ媒介疾患」の治療において使用するための本発明のＣＳＦ－１Ｒ抗体、又は「ＣＳＦ－１Ｒ媒介疾患」の治療における医薬品を製造するために使用するための本発明のＣＳＦ－１Ｒ抗体である。
本発明は、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする、疾患、障害又は病症の治療のための抗体を含み、前記抗体は、上述したエピトープ結合特性あるいは上述したアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする。
本発明は、ヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する抗体を含むことを特徴とする抗体の、疾患、障害又は病症の治療への使用、あるいは、抗体の、疾患、障害又は病症の治療のための薬物の製造への使用を含み、前記抗体は、上述したエピトープ結合特性又は代替可能の上述したアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片ことを特徴とする。
もう１つの態様において、本発明は、薬学的に許容可能な担体と一緒に調製される本発明のモノクローナル抗体のうちの１種又は組み合わせあるいはその抗原結合部分、を含有する組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合可能なありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収／再吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、注射又は点滴に適している。
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。当業者により理解されるように、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に応じて変わるであろう。
薬学的に許容可能な担体には、滅菌注射可能溶液又は分散液を調製するための滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び剤の使用は、当技術分野で公知である。水に加えて、担体は、例えば等張緩衝食塩溶液であってもよい。
選択される投与経路にかかわらず、適切な水和物の形態で使用され得る本発明の化合物、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法により薬学的に許容可能な剤形に調製される。
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者に有毒であることなく、特定の患者、組成物、及び投与方法に対する所望の治療反応を達成するのに有効な活性成分の量（有効量）を得るように変えることができる。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定の化合物の排出速度、使用される特定の組成物と併用して使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康及び既往歴、ならびに医学分野で十分に公知の同様の要因を含む、様々な薬物動態要因に依存するであろう。
本発明は、本発明による抗体の、疾患、障害又は病症に罹患している患者を治療するための使用を含む。
本発明は、また、疾患、障害又は病症に罹患している患者の治療方法を含む。
本発明はさらに、薬学的に許容可能な担体と一緒に本発明による抗体の有効量を含む薬学的組成物の製造方法、及びこのような方法のための本発明による抗体の使用を提供する。
本発明は、さらに、疾患、障害又は病症に罹患している患者を治療するための、好ましくは薬学的に許容可能な担体と一緒に医薬品を製造するための有効量での本発明による抗体の使用を提供する。
前記疾患、障害又は病症は、ＣＳＦ－１Ｒ媒介疾患、障害又は病症である。
以下の例及び配列表は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付特許請求の範囲に記載されている。変更は、本発明の趣旨から逸脱することなく記載された手順において行われ得ることが理解される。
Figure 2023508189000001
Figure 2023508189000002
Figure 2023508189000003
Figure 2023508189000004
Figure 2023508189000005
Figure 2023508189000006
実施例
ヒトＣＳＦ－１Ｒに特異的に結合する第１のＦａｂの発見
独占のバクテリオファージライブラリー（一緒に出願される「ダイナミックヒト抗体軽鎖ライブラリー（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」のＰＣＴ国際出願を参照，公開番号：ＷＯ２０１９／０３６８５６，その内容の全てが参照により本明細書に引用される。さらに、一緒に出願される「ダイナミックヒト重鎖抗体ライブラリー（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｖｙ
Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」のＰＣＴ国際出願を参照，公開番号：ＷＯ２０１９／０３６８４２，その内容の全てが参照により本明細書に引用される）を採用して、ヒトＣＳＦ－１Ｒに対して抗原（ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ ＮＰ＿００５２０２）をパンニングする。合計３ラウンドのパンニングを行った。最後のサイクルのパンニングの後、ヒトＣＳＦ－１Ｒを特異的に識別する一次ヒットを同定するシングルコロニー上清ＥＬＩＳＡを実施した。一次ヒット（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｉｔ）は、ＥＬＩＳＡシグナルが少なくともバックグランドシグナルの２倍であるヒットと定義されている。各々の一次ヒットのＶＨ及びＶＬのコード領域をシークエンシングし、大腸菌中で独特なクローニング（Ｆａｂとして）を発現させ、さらに、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６系により精製して親和性測定を実現する。簡単に言えば、ＡＨＣセンサー（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕獲用ディップアンドリードバイオセンサー）を用いてヒトＣＳＦ１Ｒ－Ｆｃ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＳＲ－Ｈ５２５８）を捕獲し、また、それを、キネティクス緩衝液で連続的に希釈した精製Ｆａｂを含有する孔に浸漬した。得られたＦｏｒｔｅＢｉｏデータをデータ収集ソフトウェア７．１で処理し、また、キネティクスデータを１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングした。合計５３つのヒットは、応答シグナルが０．１より高く、Ｒ２＞０．８９４、及び親和性ＫＤ＜４０ｎＭという標準を満たしている。その後、詳しい生物物理及び機能特徴付けを行うために、その中の１２つをヒトＩｇＧ４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６１）、又はＩｇＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７）に形質転換した。
ＩｇＧ形質転換及び発現
選択した一次ヒットの重鎖及び軽鎖のそれぞれを、Ｓ２４１Ｐ変異を有するヒトＩｇＧ４アイソフォームの哺乳動物発現担体中にクローニングした。同様にして、２種類の参照抗体（例えば、ＵＳ８，２０６，７１５に記載されているＴＡＣ２１８８、及びＷＯ２０１３／１３２０４４に記載されているＴＡＣ２２０５）の重鎖及び軽鎖をクローニングした。形質転換したＩｇＧを表１に示す。以上、２種類の参照抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を挙げている。
メーカーの説明に従って、対となる重鎖と軽鎖とを含有するプラスミドをＨＥＫ２９３Ｆ細胞中に一過性トランスフェクションした。上清を収集し、遠心及びろ過により清澄させ、また、標準タンパク質Ａを用いてアフィニティクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＩｇＧを精製した。タンパク質を溶出して中和し、また、緩衝液を２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．５）中に交換し
た。紫外線分光光度法によりタンパク質の濃度を特定し、また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ又はＳＥＣ－ＨＰＬＣによって変性、還元及び非還元条件下でＩｇＧ純度を解析した。
エピトープの特徴付け
ＦｏｒｔｅＢｉｏ特徴付けによって抗体のエピトープを測定した。メーカーの説明に従ってＥＺ－Ｌｉｎｋスルホ－ＮＨＳ－ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃２１５２５）を用いて参照抗体ＴＡＣ２１８８をビオチン化した。その後、ビオチン化した参照抗体ＴＡＣ２１８８を、ＫＢ緩衝液（０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０及び０．１％のＢＳＡが補充されたＰＢＳ緩衝液）で希釈してＳＡセンサー（Ｐａｌｌ，１８５０１９）上に載置した。その後、まずバイオセンサーを、ＫＢ緩衝液中のヒトＣＳＦ１Ｒ－Ｈｉｓ（１００ｎＭ）を含有する孔に浸漬し、次いで、ＫＢ緩衝液中の測定抗体（もう１つの参照抗体を含み、ＴＡＣ２２０５）（１００ｎＭ）を含有する孔に浸漬した。応答の増加より、測定抗体は、ヒトＣＳＦ－１Ｒ上の固定化した抗体に結合するエピトープと異なるエピトープに結合していることが明らかになった。表１に示すように、２種類の参照抗体ＴＡＣ２１８８及びＴＡＣ２２０５が、ＣＳＦ－１Ｒ上の異なるエピトープに結合し、公開されたデータに一致している。面白いことに、測定抗体は、いずれもＴＡＣ２１８８とヒトＣＳＦ－１Ｒへの結合を競合する。
Figure 2023508189000007
結合親和性の特徴付け
メーカーの案内に従ってＢｉａｃｏｒｅTM Ｔ２００機器（ＧＥ，アメリカ）を用いて、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）解析によってヒトＣＳＦ－１Ｒタンパク質に対する抗体の特異的結合親和性及びキネティクスを調べた。アミンカップリングキット（ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ－１０００－５０）の説明に基づいて抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｉ２１３６）をＣＭ５チップ上に固定した。固定化した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を用いて抗体を捕獲した。３０μｌ／ｍｉｎの流速で３００秒にわたって８種類の異なる濃度（０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０、１００
）（ｎＭ）（泳動緩衝液中で希釈）のヒトＣＳＦ－１Ｒ（ヒトＣＳＦ１Ｒ－Ｈｉｓ，Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＳＲ－Ｈ５２２８）を注射し、解離時間が３００秒であった。使用する泳動緩衝液は、０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０であり、ｐＨが７．４であった。各々の場合において、タンパク質を捕獲しなかったブランクフローセルを用いて、相応する対照を行って「バックグランド」引き算を行った。メーカーの案内に従い、Ｂｉａｃｏｒｅ
Ｔ２００評価ソフトウェア（ＧＥ，アメリカ）を用いて結合及び解離曲線を１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングした。表１において挙げたように、抗体は、０．６７ｎＭ（ＴＹ２１３７１）～３５．５ｎＭ（ＴＹ２１３７５）の親和性でヒトＣＳＦ－１Ｒに結合する。
さらに、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞表面上に一過性発現するヒト、サル及びマウスＣＳＦ－１Ｒに対して、抗体の特異性を評価した（図１）。簡単に言えば、バイシストロン性ＩＲＥＳ担体を用いて、全長ヒト、サル（ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ ＸＰ＿０１５３０７６１６）又はマウス（ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ ＮＰ＿００１０３２９４８）ＣＳＦ－１Ｒのプラスミドを発現させてＨＥＫ２９３Ｆ細胞をトランスフェクションした。ＥＧＦＰを用いて、トランスフェクションした細胞を同定した。４０ｈ後、トランスフェクションした細胞を得、その後、それを１％のＰＢＳＡ緩衝液（１×ＰＢＳ中で１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）で１回洗浄した。その後、細胞と各種のＩｇＧ（１種ずつ１００ｎＭ）とを共に室温で１ｈ孵化し、予め冷却した１％のＰＢＳＡ緩衝液で１回洗浄し、また、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(登
録商標) ６４７結合マウス抗ヒトＦｃ抗体と共に氷上で３０ｍｉｎ孵化した。フローサ
イトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ(登録商標) ＣｙｔｏＦｌｅｘ）を用いて解析を行う前に、細胞を１回洗浄した。図１に示すように、全ての抗体も、ヒト及びサルＣＳＦ－１Ｒに結合するが、マウスＣＳＦ－１Ｒに結合しないことを示している。
抗体の開発可能性プロファイル
開発可能性を評価するために、精製したＴＡＣ２１８８、ＴＹ２１３７１、ＴＹ２１３７２及びＴＹ２１４３２を保存緩衝液（２０ｍＭのヒスチジン，ｐＨ５．５）中に交換した。保存緩衝液中で全ての試験（溶解度、加速ストレス条件下での安定性及び示差走査型蛍光法（ＤＳＦ）測定を含む）を行った。全てのＳＥＣ－ＨＰＬＣ解析に対して、ＴＳＫｇｅｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｇ３０００ＳＷｘｌ）を用いた。
溶解度
明らかな沈殿物がない場合、ＴＹ２１３７１、ＴＹ２１３７２及びＴＹ２１４３２を保存緩衝液中で８０ｍｇ／ｍｌ超えとなるように濃縮した（表２）。ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって高分子量（ＨＭＷ）凝集体の存在をさらに解析した。表２に示すように、高濃度下でＨＭＷ凝集体の明らかな増加が見られなかった。
Figure 2023508189000008
加速ストレス条件下での抗体安定性
加速ストレス条件下で抗体の安定性を調べた。図２に示すように、抗体ＴＹ２１３７１、ＴＹ２１３７２及びＴＹ２１４３２は、凍結（－８０℃）及び解凍（室温で）のサイクルを６回行った後でも安定している。抗体ＴＹ２１３７１、ＴＹ２１３７２及びＴＹ２１４３２は、５０℃で７日経過しても安定している。ＴＹ２１３７２を除き、ＨＭＷ凝集体又はＬＭＷ断片がほとんど増加しなかった。
ＣＳＦ－１により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化への阻害
ＣＳＦ－１（ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ ＮＰ＿０００７４８）は、受容体ＣＳＦ－１Ｒを誘導するリン酸化が行う細胞シグナル伝達を活性化することができる。各種の抗ＣＳＦ１Ｒ抗体（ＴＹ２１３７１、ＴＹ２１３７２、ＴＹ２１４３２及び参照抗体ＴＡＣ２１８８を含む）の、ＣＳＦ－１により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化への阻害活性を評価するために、リン酸ＥＬＩＳＡアッセイを行った。簡単に言えば、ヒトＣＳＦ－１Ｒを発現させるプラスミドを用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションしてから４ｈ後、細胞を２×１０４個細胞／ウェルで９６孔プレートに分けて、細胞の粘着及びＣＳＦ－１Ｒ発現を許容するように３７℃で５％のＣＯ２培養箱中で１８ｈ培養した。その後、細胞上清を破棄し、連続的に希釈した測定抗体をプレート中に添加して３７℃で３０ｍｉｎ孵化した。結合しなかった抗体溶液を破棄し、細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦと一緒にさらに５ｍｉｎ孵化した。その後、細胞を直ちにＤＰＢＳで洗浄して溶解した。メーカーの説明に従ってヒトリン酸Ｍ－ＣＳＦＲ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）で細胞溶解物中のＣＦＳ１Ｒリン酸化レベルを解析し、また、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘエライザを用いて４５０ｎｍでのシグナルを測定した。
図３に示すように、参照抗体ＴＡＣ２１８８、及びＴＹ２１３７１とＴＹ２１４３２は、用量依存の方式でＣＳＦ－１刺激後のＣＳＦ－１Ｒリン酸化を阻害することができる。ＴＹ２１３７１は、参照抗体ＴＡＣ２１８８及び他の測定抗体よりもＣＳＦ－１Ｒリン酸化への阻害性が強いことを示している。
ＩＬ－３４により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化への阻害
ＣＳＦ－１Ｒのもう１つのリガンドとして、ＩＬ－３４（ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ ＮＰ＿００１１６６２４３）もＣＳＦ－１Ｒのリン酸化を誘導することにより行うＣＳＦ－１Ｒ媒介の細胞シグナル伝達を活性化することができる。各種の抗ＣＳＦ１Ｒ抗体の、ＩＬ－３４により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化への阻害活性を評価するために、リン酸ＥＬＩＳＡを行った。簡単に言えば、ヒトＣＳＦ－１Ｒを発現させるプラスミドを用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションしてから４ｈ後、細胞を２×１０４個細胞／ウェルで９６孔プレートに分けて、細胞の粘着及びＣＳＦ－１Ｒ発現を許容するように３７℃で５％のＣＯ２培養箱中で１８ｈ培養した。その後、細胞上清を破棄し、連続的に希釈した測定抗体をプレート中に添加して３７℃で３０ｍｉｎ孵化した。結合しなかった抗体溶液を破棄し、細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３４と一緒にさらに５ｍｉｎ孵化した。その後、細胞を直ちにＤＰＢＳで洗浄して溶解した。メーカーの説明に従ってヒトリン酸Ｍ－ＣＳＦＲ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）で細胞溶解物中のＣＦＳ１Ｒリン酸化レベルを解析し、また、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘエライザを用いて４５０ｎｍでのシグナルを測定した。
図４に示すように、ＴＡＣ２１８８は、ＩＬ－３４刺激後のＣＳＦ－１Ｒリン酸化を強く阻害し、ＴＹ２１３７１の効力がやや低く、また、ＴＹ２１４３２又はＴＹ２１３７２は、ＩＬ－３４刺激後のＣＳＦ－１Ｒリン酸化への阻害性が弱い。
ＣＳＦ－１により誘導される単球増殖への阻害
メーカーの説明に基づいてＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ１４陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＣＤ１４陽性単球を単離した。ＲＰＭＩ１６
４０完全培地中で３×１０５個細胞／ｍＬの密度で細胞を作製した。１００μＬの細胞懸濁液を各アッセイ孔に播種し、また、連続的に希釈した抗体と一緒に３７℃で３０ｍｉｎ孵化した。その後、５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ溶液をアッセイ孔中に添加し、また、３７℃、５％のＣＯ２培養箱中で細胞と一緒にさらに５日孵化した。細胞力価Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて単球の増殖を解析した。図５に示すように、参照抗体ＴＡＣ２１８８は、Ｍ－ＣＳＦ刺激後の単球増殖を強く阻害し、ＴＹ２１３７１は、ＴＹ２１３７２及びＴＹ２１４３２よりも良い阻害活性を示している。
ＩＬ－３４により誘導される単球増殖への阻害
メーカーの説明に基づいてＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ１４陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりＣＤ１４陽性単球を単離した。ＲＰＭＩ１６４０完全培地中で１×１０６個細胞／ｍＬの密度で細胞を作製した。５０μＬの細胞懸濁液を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３４を補充した各アッセイ孔中に播種した。単球と、連続的に希釈した抗体とを共に３７℃、５％のＣＯ２培養箱で５日孵化した。細胞力価Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて単球の増殖を解析した。図６に示すように、参照抗体ＴＡＣ２１８８及び測定抗体ＴＹ２１３７１は、いずれもＩＬ－３４刺激後の単球増殖を有効に阻害することができる。ＴＹ２１３７１は、参照抗体ＴＡＣ２１８８よりも強い阻害性を示している。
カニクイザル中の薬物動態学についての研究
１０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入することにより、未処理（ｎａｉｖｅ）のカニクイザル中でＴＹ２２１７９（すなわち、ＴＹ２１３７１のＩｇＧ１形式）及びＴＡＣ２３００（すなわち、ＴＡＣ２１８８のＩｇＧ１形式）の薬物動態学研究を行った。グループごとにオスサル１匹及びメスサル１匹を含むカニクイザル中で各種の薬物を研究した。投与前、投与してから０．２５ｈ、１ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、９６ｈ、１２０ｈ、１６８ｈ、２４０ｈ、３３６ｈ、５０４ｈ、６７２ｈ及び８６４ｈ後に血清サンプルを収集した。ＥＬＩＳＡによりＴＹ２２１７９及びＴＡＣ２３００の血清薬物濃度を解析し、ここで、抗原－Ｆｃ融合物を用いて捕獲を行い、また、ＨＲＰマークした抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異性）抗体を用いて検出を行った。図７に示すように、ＴＹ２２１７９は、参照抗体ＴＡＣ２３００に類似するＰＫ曲線を示している。静脈内注入後に、全てのサル中で全身曝露を得た。ＴＹ２２１７９及びＴＡＣ２３００に対して、それぞれ平均Ｃｍａｘが２４９μｇ／ｍＬ又は２４２μｇ／ｍＬであり、平均ＡＵＣ０－８６４ｈが２００５８μｇｈ／ｍＬ又は１５１０３μｇｈ／ｍＬであり、半減期（ｔ１／２）が５４～１０３ｈ又は７９～８９ｈであった。
カニクイザル中での薬力学的作用
未処理のカニクイザル中でＴＹ２２１７９の薬力学研究を行った。１グループのサルに用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＹ２２１７９又は参照抗体ＴＡＣ２３００を静脈内投与した。グループごとにオスサル１匹及びメスサル１匹を含む。指定時点で収集した全血液サンプルに対してフローサイトメトリーを行い、非古典的ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋及び古典的ＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球を解析した。さらに、異なる時点でＥＬＩＳＡキットを用いてＣＳＦ－１の血清レベルを特定した。図８に示すように、ＴＹ２２１７９及び参照抗体ＴＡＣ２３００のいずれも類似する方式でカニクイザル末梢血中の非古典的ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球の急速な除去を媒介したが、古典的ＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球の急速な除去を媒介しなかった。このような作用は、これらの抗体の作用メカニズムに一致している。投与してから１週間後、これらの単球に対して強烈な反発作用が生じ、これは、ＴＹ２２１７９及び参照抗体レベルの低下のフィードバックメカニズムによる可能性がある。このような反発が短時間であり、かつ、その後、非古典的ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球が正常生理レベルに回復した。図９に示すように、抗体投与してから８ｈ後、血清ＣＳＦ－１レベルが迅速に上昇している。投与してから約１週間後に安定となるまで増加し続けて、この時、
投与前のベースラインと比べて、１０００倍超えのＣＳＦ－１レベルに達した。その後、ＣＳＦ－１レベルが低下し始める傾向にあり、また、投与してから３～４週間後、正常生理レベルに回復した。このようなＣＳＦ－１の増加は、最初から消耗し尽くした後に非古典的単球の回復を促進させる可能性がある。

Claims (15)

  1. ヒトＣＳＦ－１Ｒに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  2. 以下の（１）～（１０）を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
    （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：１１で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ
    ＩＤ ＮＯ：４１で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１で示されるＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、
    （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、
    （９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ、あるいは、
    （１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるＣＤＲ３を含むＶＨと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０で示されるＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で示されるＣＤＲ３を含むＶＬ。
  3. 以下の（１）～（１０）を含む、請求項１に記載の抗体又は抗原結合性断片。
    （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１で示されるＶＬ、
    （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２で示されるＶＬ、
    （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３で示されるＶＬ、
    （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４で示されるＶＬ、
    （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５で示されるＶＬ、
    （６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６で示されるＶＬ、
    （７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７で示されるＶＬ、
    （８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８で示されるＶＬ、
    （９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９で示されるＶＬ、あるいは、
    （１０）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０で示されるＶＬ。
  4. ヒトＣＳＦ－１Ｒに特異的に結合する、請求項２又は３に記載の抗体又は抗原結合性断片。
  5. ＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスの全長抗体である請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片。
  6. Ｓ２４１Ｐ変異を有するＩｇＧ４サブクラスの全長抗体である、請求項５に記載の抗体又は抗原結合性断片。
  7. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ及びダイアボディから選ばれる抗体断片である、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片。
  8. 以下の１種又は複数種の特性を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片。
    （１）ヒトＣＳＦ－１Ｒに対してＫＤ＜４０ｎＭの親和性を有する。
    （２）ヒトＣＳＦ－１Ｒ上の、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１で示されるＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２で示されるＶＬを含む抗体が結合するエピトープと重複するエピトープに結合する。
    （３）サルＣＳＦ－１Ｒに結合する。
    （４）マウスＣＳＦ－１Ｒに結合しない。
    （５）８０ｍｇ／ｍＬより高い溶解度を有する。
    （６）１ｍｇ／ｍｌの溶液に比べて、高濃度下で１０％未満のＨＭＷを有し、かつ、ΔＨＭＷが１％未満である。
    （７）－８０℃で凍結して室温下で解凍するサイクルを６回行った後でも安定している。
    （８）５０℃で７日経過しても安定している。
    （９）ＣＳＦ－１により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化を阻害する。
    （１０）ＩＬ－３４により誘導されるＣＳＦ－１Ｒリン酸化を阻害する。
    （１１）ＣＳＦ－１により誘導される単球増殖を阻害する。
    （１２）ＩＬ－３４により誘導される単球増殖を阻害する。
    （１３）カニクイザル中、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で、２００μｇ／ｍＬ超えの平均Ｃｍａｘ、１５０００μｇｈ／ｍＬ超えの平均ＡＵＣ０－８６４ｈ、及び／又は５０ｈ超えの平均ｔ１／２を有する。
    （１４）カニクイザル中、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で、末梢血中のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球の急速な除去を媒介する、及び／又は
    （１５）カニクイザル中、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で、血清ＣＳＦ－１レベルの急速な上昇を媒介する。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  10. 請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片をコードする、少なくとも１種のポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載の少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種の担体。
  12. 請求項１０に記載の少なくとも１種のポリヌクレオチド又は請求項１１に記載の少なくとも１種の担体を含む、少なくとも１種の宿主細胞。
  13. 請求項１０に記載の少なくとも１種のポリヌクレオチドの発現に適した条件下で請求項１２に記載の少なくとも１種の宿主細胞を培養する工程と、
    前記抗体抗原結合性断片を任意に回収する工程と、
    を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片の製造方法。
  14. 前記被験者に治療有効量の請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片を投与する工程、
    を含む、被験者の疾患、障害又は病症の治療方法。
  15. 請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性断片の、疾患、障害又は病症を治療するための薬物の製造への使用。
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