JP2023506170A

JP2023506170A - 流行性耳下腺炎ウイルスおよび麻疹ウイルスの免疫原およびそれらの使用

Info

Publication number: JP2023506170A
Application number: JP2022535470A
Authority: JP
Inventors: バーニーグラハム; ギヨームスチュワート－ジョーンズ; レベッカジェイ．ルーミス
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2023-02-15
Also published as: KR20220141787A; IL293666A; BR112022011422A2; CN115515628A; CA3164343A1; AU2020402106A1; EP4072581A1; US20230053555A1; WO2021119497A1

Abstract

融合前コンフォメーションで安定化した組換え流行性耳下腺炎（MuV）Fエクトドメイン三量体または融合前コンフォメーションで安定化した組換え麻疹（MeV）Fエクトドメイン三量体を含む免疫原の態様が提供される。また、前記組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体と、1つまたは複数のMuV HNまたはMeV Hエクトドメインとを含むキメラタンパク質を含む免疫原の態様も提供される。また、前記免疫原をコードする核酸およびそれらの生産方法も開示される。本開示の免疫原を対象に投与することによって対象における免疫応答を誘導するための方法も提供される。いくつかの態様において、免疫応答は、対象におけるMuV感染および/またはMeV感染を処置または阻害する。TIFF2023506170000066.tif98128

Description

関連出願の相互参照
本願は、2019年12月11日に出願された米国仮出願第62/946,902号の先の出願日の恩典を主張し、この米国仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

分野
この開示は、流行性耳下腺炎ウイルス（MuV）および麻疹ウイルス（MeV）に対する免疫応答を誘発および検出するための、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、およびそれらの使用方法に関する。

背景
MeVおよびMuVは、感染者からの呼吸器飛沫または感染者との直接接触によって伝達されうる、伝染性が高いパラミクソウイルスである。結果として生じる疾患は、小児における重篤な合併症または死亡につながる場合がある。MeVおよびMuV用の既存のワクチンは弱毒化生ウイルスであり、これらは1歳時と早ければその1ヶ月後に2回の皮下投与として投与される。麻疹、流行性耳下腺炎、および風疹混合ワクチンの2回の投与は、麻疹に対して97％、流行性耳下腺炎に対して88％有効である。麻疹、流行性耳下腺炎、および風疹混合ワクチンの単回投与は、麻疹に対して93％有効であり、流行性耳下腺炎に対して78％有効である。

MeVおよびMuVに対する現在の認可ワクチンが有効であるにもかかわらず、両者の発生率は近年増加している。要因として、ワクチン躊躇によるワクチン接種率の低下と、認可MMRワクチンでは限定的な防御しか得られない分岐株（divergent strain）の循環が挙げられる。

MuVの場合、通常小児期に行われる2回目のMMRワクチン後に、免疫は著しく減衰することが、最近の研究によって示されている。加えて、現在循環しているMuV株では、標準的な流行性耳下腺炎ワクチンにおけるJeryl-Lynn株から離れるように遺伝子型の変動が起きている。米国および欧州において最近再発しているMuV疾患のアウトブレイクに呼応して、予防接種の実施に関する諮問委員会（Advisory Committee on Immunization Practices）は、防御をブーストするために、3回目のMMRワクチン接種を勧告している。しかし、既存の免疫が3回目のMMRワクチン接種を中和して、その有効性を制限する。

概要
本明細書では、融合前コンフォメーションを安定化させるための1つまたは複数の修飾（アミノ酸置換など）を含むプロトマーを含む組換えMuV Fエクトドメイン三量体および組換えMeV Fエクトドメイン三量体が開示される。MuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインに連結された組換えMuV Fエクトドメイン三量体および組換えMeV Fエクトドメイン三量体の態様が、さらに提供される。MuV Fエクトドメイン三量体とMeV Hエクトドメインとの組合せ、またはMeV Fエクトドメイン三量体とMuV HNエクトドメインとの組合せを含む、キメラタンパク質が提供される。そのようなタンパク質の態様は、動物モデルにおいて優れた免疫応答を生じさせることが実証され、例えば対象においてMeVおよび/またはMuVに対する免疫応答を誘発またはブーストするために、使用することができる。

いくつかの態様において、免疫原は、三量体のプロトマーにおける1つまたは複数のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化した組換えMuV Fエクトドメイン三量体を含み、当該アミノ酸置換は、MuV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させるための非天然ジスルフィド結合を形成するシステイン置換を含む。いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、三量体のプロトマーにおけるMuV F位置206および223におけるシステイン置換の間の非天然ジスルフィド結合によって、融合前コンフォメーションで安定化する。いくつかの態様において、三量体のプロトマーは、MuV FエクトドメインのF1/F2フューリン切断部位を除去するための変異を、さらに含む。いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、C末端で、GCN4三量体化ドメインなどの三量体化ドメインに融合される。さらなる態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、MuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインなどの異種タンパク質に連結される。

いくつかの態様において、免疫原は、三量体のプロトマーにおける1つまたは複数のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化した組換えMeV Fエクトドメイン三量体を含み、当該アミノ酸置換は、MeV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させるための非天然ジスルフィド結合を形成するシステイン置換を含む。いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体は、三量体のプロトマーにおけるMeV F位置165および171におけるシステイン置換の間の非天然ジスルフィド結合によって、融合前コンフォメーションで安定化する。いくつかの態様において、三量体のプロトマーは、MeV FエクトドメインのF1/F2フューリン切断部位を除去するための変異を、さらに含む。いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、C末端で、GCN4三量体化ドメインなどの三量体化ドメインに融合される。さらなる態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、MuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインなどの異種タンパク質に連結される。

いくつかの態様では、融合タンパク質の三量体を含む免疫原が提供され、各融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、三量体化ドメインおよび1つまたは複数のMuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインを含む。

いくつかの態様において、免疫原は、MeV Hエクトドメインヘッドの二量体を含む。

本開示のタンパク質をコードする核酸分子も提供され、その核酸分子を含むベクターおよびそれらの生産方法も、同様に提供される。

対象への投与に適した、本開示の免疫原を含む免疫原性組成物も提供され、これは単位剤形に含まれていてもよい。免疫原は、免疫系への提示を容易にするための担体も含有しうる。

対象において免疫応答を誘導するための方法が開示され、有効量の本開示の免疫原、核酸分子、またはベクターを対象に投与することによって対象におけるMuV感染またはMeV感染を阻害または防止する方法も、同様に開示される。

本開示の前記および他の特徴および利点は、添付の図面を参照して以下に記載するいくつかの態様の詳細な説明から、いっそう明白になるだろう。

図1A～1E. ジスルフィド安定化融合前流行性耳下腺炎F三量体の、構造に基づくデザイン（structure-based design）。（図1A）ジスルフィドとGCN4取り付け位置との体系的スクリーニングによる、融合前流行性耳下腺炎F糖タンパク質三量体の、構造に基づくデザイン。これには、収量と、ネガティブ染色EMによって決定された融合後Fコンフォメーションに対する融合前コンフォメーションのパーセンテージとが、どちらも示されている。（図1B）V206C/A223Cと476-GCN4との組合せにより、均一な融合前F三量体が高い収量で観察された（上図）。融合後を下図に示す。（図1C）S200ゲル濾過分析により、グリコシル化および脱グリコシル化融合前F（PreF）、HN、および融合前F-HNの単分散性が示されている。（図1D）融合前流行性耳下腺炎F三量体（SEQ ID NO:11）の2.16Å分解能での結晶構造。プロトマーが示されており、融合後コンフォメーションに移行するために＞5Åのコンフォメーション変化を起こす残基が黒で示されている。F残基476につながれたGCN4三量体化（TD）モチーフが点線で示されている。拡大図では、三量体融合前F構造を安定化させるための変異残基が強調されている。（図1E）D1～3サブ領域と、プロトマーあたり6つのN結合型グリカンの場所とを示す、融合前流行性耳下腺炎三量体の単一プロトマー。図2A～2H. 流行性耳下腺炎とPIV5の融合前Fの構造比較、ならびに流行性耳下腺炎Fおよび流行性耳下腺炎HNの遺伝子型変異の解析。（図2A）流行性耳下腺炎融合前F三量体と近縁のパラミクソウイルスPIV5融合前F三量体との構造の重ね合わせ。類似する全体的トポロジーを示すが（RMSD＝1.68Å）、配列同一性は49％である。（図2B）流行性耳下腺炎preFの頂端ループが「閉じたフタ（closed cap）」アセンブリ状に会合するのに対し、PIV5では、これらのループがばらばらに拡がっており（上図）、流行性耳下腺炎preF頂端を安定化させる残基はT178、T179、およびN181である（下図）。（図2C）流行性耳下腺炎F糖タンパク質は、1プロトマーあたり6つのグリカン、三量体あたり全部で18個のグリカンでグリコシル化されており、そのうち6つのグリカンはコンフォメーション的に可動な領域（黒）にあり、12個のグリカンはコンフォメーション的に変動が少ない領域にあって、実質的なグリカン遮蔽を三量体に与えている。（図2D）流行性耳下腺炎遺伝子型A～Jからの融合糖タンパク質の系統解析。（図2E）流行性耳下腺炎遺伝子型A～Jからのヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ糖タンパク質の系統解析。（図2Fおよび図2G）Jeryl Lynnワクチン株（遺伝子型A、SEQ ID NO:98）と流行性耳下腺炎遺伝子型C（SEQ ID NO:102）、D（SEQ ID NO:103）、F（SEQ ID NO:104）、G（SEQ ID NO:105）およびH（SEQ ID NO:106）からの融合糖タンパク質の配列アラインメント。図２－３の説明を参照。（図2H）融合前F（左図）およびHN（右図）の流行性耳下腺炎遺伝子型変異の構造マッピング。A～J遺伝子型変異（上図）および遺伝子型G対A（Jeryl Lynn（JL））（下図）を示し、残基の相違およびグリカンの相違を示している。図3Aおよび図3B. 流行性耳下腺炎FおよびpreF-HN免疫原変異体についてのデザインおよび免疫処置スキーム。（図3A）CB6F1/Jマウスにおいて、0、3、および10週目の時点に、ポリ（I:C）アジュバントを使って10μg/回で3回の免疫処置を行い、2、5、12、および16週目に血液試料を採取した。（図3B）免疫原のコンフォメーション的および分子的アイデンティティを裏付ける流行性耳下腺炎FおよびpreF-HNタンパク質のネガティブ染色キャラクタリゼーション、ならびにマウスにおける1、2または3回の免疫処置（矢印で示す）後に誘発された、融合後F（左）、融合前F（中央）および融合前F-HN（右）免疫原についての、流行性耳下腺炎中和価、ならびに遺伝子型Gウイルス、Jeryl Lynn遺伝子型Aウイルスおよび遺伝子型HウイルスについてのPRN力価。図4A～4E. 融合前流行性耳下腺炎F-HN免疫原のデザイン、3種の異なる流行性耳下腺炎遺伝子型ウイルスについての中和価の特異性および持続性に関する血清の分析。（図4A）流行性耳下腺炎preF-HN融合タンパク質のネガティブ染色キャラクタリゼーション。preFヘッド、GCN4三量体化ドメイン、および3つのHN頭部の位置が示されている。（図4B）オクテット・バイオインフェロメトリー（Octet Bioinferometry）による、流行性耳下腺炎融合前Fプローブおよび（図4C）HNプローブを使った、免疫処置マウスの結合力価。（図4D）10μgの融合前Fタンパク質をポリ（I:C）と共に3回投与することで免疫処置し、6ヶ月にわたって毎月、血清試料採取と遺伝子型Gウイルス、Jeryl Lynnウイルスおよび遺伝子型Hウイルスに対するPRNT分析とを行った、マウスの持続性分析。（図4E）10μgの融合前F-HNタンパク質をポリ（I:C）と共に3回投与することで免疫処置し、6ヶ月にわたって毎月、血清試料採取と遺伝子型Gウイルス、Jeryl Lynnウイルスおよび遺伝子型Hウイルスに対するPRNT分析とを行った、マウスの持続性分析。図5A～5C. 融合前麻疹Fの、構造に基づくデザイン。（図5A）融合前コンフォメーションを安定化させる融合前安定化麻疹F糖タンパク質変異の、構造に基づくデザイン。（図5B）表示されている非ネイティブジスルフィド結合と、C末端GCN4三量体化ドメインとを含む、麻疹F変異体のネガティブ染色EM分析。（図5C）融合前（MeV F R165C/M171C-486-GCN4、SEQ ID NO:38）および融合後（-486-GCN4を持つネイティブMeV F配列）麻疹F糖タンパク質の免疫原性。図6A～6C. 流行性耳下腺炎pre-F-麻疹Hキメラ免疫原のデザイン。（図6A）麻疹H二量体（左上）、麻疹H三量体（上中央）、流行性耳下腺炎HN三量体（右上）、および麻疹Hを伴う流行性耳下腺炎pre-F（MuV F 206C/223C-476＋GCN4/Fd＋MeV-H、SEQ ID NO:28）（下）のネガティブ染色キャラクタリゼーション。（図6B）麻疹プラーク低減中和価アッセイ（PRNT）。（図6C）流行性耳下腺炎（遺伝子型G）PRNTアッセイ。

配列表
添付の配列表に列挙する核酸配列およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822に既定されるとおり、ヌクレオチド塩基についての標準的な文字略号とアミノ酸についての3文字記号を使って示されている。各配列の一方の鎖だけが示されているが、表示された鎖への言及には相補鎖が含まれると理解される。配列表は、ASCIIテキストファイルとして、2020年12月11日に作成された「Sequence.txt」という名称のファイル（約456kb）の形で提出されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。

構造座標
融合前コンフォメーションで安定化したMuV Fエクトドメイン三量体の結晶構造の原子座標は、2019年12月11日に出願された米国仮出願第62/946,902号のTable 1において具陳されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられると共に、ASCIIテキストファイルとして、2019年12月9日に作成された「Table＿1.txt」という名称のファイル（約555KB）の形で提出されている。

詳細な説明
I. 用語の概要
別段の注記がある場合を除き、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin,Genes X（Jones＆Bartlett Publishers、2009年刊）およびMeyersら編、The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine（16分冊、Wiley-VCH、2008年刊）および他の類似の参考文献に見いだすことができる。本明細書において使用される単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈からそうでないことがわかる場合を除き、単数と複数との両方を指す。例えば「抗原（an antigen）」という用語は、単一のまたは複数の抗原を包含し、「少なくとも1つの抗原」という語句と等価であると見なすことができる。本明細書において使用される「comprises（含む）」という用語は「includes（含む）」を意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに与えられるありとあらゆる塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよびあらゆる分子量または分子質量の値は、別段の表示がある場合を除き、概数であり、説明のために記載されていると理解されるものとする。適切な方法と材料を以下に具体的に説明するが、本明細書記載のものと類似するか等価な数多くの方法および材料を使用することができる。矛盾が生じた場合は、用語の説明を含めて本明細書が優先される。また、材料、方法、および実施例は単なる例示であって、限定を意図していない。さまざまな態様の検討が容易になるように、以下に用語の説明を提供する。

アジュバント: 抗原性を強化するために使用される媒体。いくつかの態様において、アジュバントには、抗原が吸着される無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、または例えば抗原溶液が鉱油中に乳化している油中水型エマルション（フロイド不完全アジュバント）、場合によっては、抗原性をさらに増強するために死滅マイコバクテリアを含めたもの（フロイント完全アジュバント）（抗原の分解を阻害しおよび/またはマクロファージの流入を引き起こす）が含まれる。いくつかの態様において、本開示の免疫原性組成物において使用されるアジュバントは、レシチンとカルボマーホモポリマーとの組合せ（例えばAdvanced BioAdjuvants,LLCから入手できるADJUPLEX（商標）アジュバント、Wegmann,Clin Vaccine Immunol,22（9）:1004-1012,2015も参照されたい）である。本開示の免疫原性組成物において使用するためのさらなるアジュバントとしては、QS21精製植物抽出物、Matrix M、AS01、MF59およびALFQアジュバントが挙げられる。免疫刺激オリゴヌクレオチド（CpGモチーフを含むものなど）もアジュバントとして使用することができる。アジュバントには、共刺激分子などの生物学的分子（「生物学的アジュバント」）も含まれる。例示的なアジュバントとして、IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL、免疫刺激複合体（immune stimulating complex: ISCOM）マトリックス、およびToll様受容体（TLR）アゴニスト、例えばTLR-9アゴニスト、ポリI:C、またはポリICLCが挙げられる。（例えばSingh編,Vaccine Adjuvants and Delivery Systems.Wiley-Interscience,2007を参照されたい）。

投与: 選ばれた経路による対象への組成物の導入。投与は局所的または全身性であることができる。例えば、選ばれた経路が鼻腔内である場合、組成物（例えば本開示の組換えMuV Fエクトドメイン三量体または組換えMeV Fエクトドメイン三量体を含む組成物）は、対象の鼻道にその組成物を導入することによって投与される。例示的な投与経路として、経口、注射（例えば皮下、筋肉内、皮内、腹腔内および静脈内）、舌下、直腸、経皮（例えば外用）、鼻腔内、膣、および吸入経路が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

アミノ酸置換: 1つまたは複数の異なるアミノ酸による、ポリペプチド中のアミノ酸の置き換え。タンパク質配列との関連では、アミノ酸置換を変異ともいう。

抗体: MuVまたはMeV Fタンパク質、その抗原フラグメントまたは抗原の二量体もしくは多量体などといった分析物（抗原）を特異的に結合し認識する免疫グロブリン、その抗原結合フラグメントまたは誘導体。「抗体」という用語は、本明細書では最も広義に使用され、さまざまな抗体構造、例えば限定するわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体フラグメントを、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、包含する。抗体の非限定的な例として、例えば無傷の免疫グロブリン、ならびに抗原に対する結合アフィニティを保っているその変異体およびフラグメントが挙げられる。抗体フラグメントの例として、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）₂、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えばscFv）、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。抗体フラグメントには、全抗体の修飾によって生産される抗原結合フラグメント、または組換えDNA法を使って新規に合成されるものが含まれる（例えばKontermann and Dubel編,Antibody Engineering,Vols.1-2,2^nd Ed.,Springer Press,2010参照）。

担体: 抗原を連結することができる免疫原性分子。担体に連結されると、抗原は、より免疫原性になりうる。担体は、抗原の免疫原性を増加させるように、ならびに/または担体に対する抗体であって診断上、分析上および/もしくは治療上有益なものを誘発するように、選ばれる。有用な担体としてポリマー担体が挙げられ、これは、反応物部分を取り付けることができる1つまたは複数の官能基を含有する天然物（例えば細菌またはウイルスからのタンパク質）、半合成物または合成物であることができる。

保存的変異体: 「保存的」アミノ酸置換は、タンパク質の機能、例えば対象に投与された時に免疫応答を誘導するタンパク質の能力を実質的に左右することも減少させることもない置換である。保存的変異という用語は、無置換親アミノ酸に代わる置換アミノ酸の使用も包含する。さらにまた、コードされている配列中の単一のアミノ酸またはごく一部のアミノ酸（例えば5％未満、いくつかの態様では1％未満）を改変し、付加し、または欠失させる個々の置換、欠失、または付加は、それらの改変が化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらすならば、保存的変異である。

以下の6つのグループは、互いに保存的置換であると見なされるアミノ酸の例である:
1）アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）;
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）;
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）;
4）アルギニン（R）、リジン（K）;
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）;および
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。

非保存的置換は、対象に投与された時に免疫応答を誘導する能力などといった組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体の活性または機能を低減するものである。例えば、あるアミノ酸残基がそのタンパク質の機能にとって不可欠である場合は、そうでなければ保存的な置換であっても、その活性を破壊しうる。このように保存的置換は関心対象のタンパク質の基本的機能を改変しない。

対照: 参照基準。いくつかの態様において、対照は、健常患者から得られる陰性対照試料である。別の態様において、対照は、MuV感染症またはMeV感染症と診断された患者から得られた陽性対照試料である。さらなる別の態様において、対照は、歴史的対照または標準参照値もしくは標準参照値範囲（例えば以前に試験された対照試料、例えば予後またはアウトカムがわかっているMuV患者またはMeV患者の群、またはベースライン値もしくは正常値を表す試料群）である。

試験試料と対照の間の相違は、増加であっても、逆に減少であってもよい。相違は、定性的な相違であっても、定量的相違、例えば統計的有意差であってもよい。いくつかの例において、相違は、対照に対して、少なくとも約5％、例えば少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、少なくとも約250％、少なくとも約300％、少なくとも約350％、少なくとも約400％、少なくとも約500％、または500％超の、増加または減少である。

縮重変異体: 本開示に関して「縮重変異体」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、遺伝暗号の結果として縮重している配列を含むものを指す。天然のアミノ酸は20種類あり、その大半が2つ以上のコドンによって指定されている。したがって、あるペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が不変である限り、すべて含まれる。

有効量: 対象における免疫応答などといった所望の応答を誘発するのに十分な免疫原などの作用物質の量。関心対象の抗原に対する防御免疫応答を得るには、本開示の免疫原の複数回の投与、および/または本開示の免疫原の、プライムブーストプロトコールにおける「プライム」としての投与（この場合、ブースト免疫原はプライム免疫原とは異なりうる）が必要になる場合があることは理解される。したがって、本開示の免疫原の有効量は、対象においてプライミング免疫応答を誘発するのに十分な免疫原の量であることができ、次に、その対象に同じまたは異なる免疫原をブースト接種することで、防御免疫応答を誘発することができる。

一例において、所望の応答は、MuV感染を阻害しまたは低減しまたは防止することである。本方法が有効であるために、MuV感染が完全に排除または低減または防止される必要はない。例えば有効量の作用物質の投与は、MuV感染（例えばMuVによる細胞の感染によって測定されるか、またはMuVに感染した対象の数もしくはパーセンテージによって測定されるもの）を、適切な対照と比較して所望の量だけ、例えば少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、またはさらには少なくとも100％減少させること（検出可能なMuV感染の排除または防止）ができる。

一例において、所望の応答は、MeV感染を阻害しまたは低減しまたは防止することである。本方法が有効であるために、MeV感染が完全に排除または低減または防止される必要はない。例えば有効量の作用物質の投与は、MeV感染（例えばMeVによる細胞の感染によって測定されるか、またはMeVに感染した対象の数もしくはパーセンテージによって測定されるもの）を、適切な対照と比較して所望の量だけ、例えば少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、またはさらには少なくとも100％減少させること（検出可能なMeV感染の排除または防止）ができる。

一例において、所望の応答は、MuV感染とMeV感染との両方を阻害しまたは低減しまたは防止することである。本方法が有効であるために、MuV感染およびMeV感染が完全に排除または低減または防止される必要はない。例えば有効量の作用物質の投与は、MuV感染およびMeV感染（例えばMuVおよび/もしくはMeVによる細胞の感染によって測定されるか、またはMuVおよび/もしくはMeVに感染した対象の数もしくはパーセンテージによって測定されるもの）を、適切な対照と比較して所望の量だけ、例えば少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、またはさらには少なくとも100％減少させること（検出可能なMuVおよび/またはMeV感染の排除または防止）ができる。

発現: 核酸配列の転写または翻訳。例えば遺伝子は、そのDNAがRNAまたはRNAフラグメントに転写され、それがいくつかの例ではプロセシングされてmRNAになるのであれば、発現される。また遺伝子は、そのmRNAがアミノ酸配列、例えばタンパク質またはタンパク質フラグメントに翻訳されるのであれば、発現されうる。ある特定例において、異種遺伝子は、それがRNAに転写されるのであれば、発現される。別の一例において、異種遺伝子は、そのRNAがアミノ酸配列に翻訳されるのであれば、発現される。「発現」という用語は、本明細書では、転写または翻訳のいずれかを表すために使用される。発現の調節には、転写、翻訳、RNAの輸送およびプロセシングの制御、mRNAなどの仲介分子の分解、または特異的タンパク質分子が生産された後の、それらタンパク質分子の活性化、不活化、区画化もしくは分解によるものが含まれうる。

発現制御配列: それに機能的に連結されている異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列は、その発現制御配列が核酸配列の転写と、適宜、翻訳とを制御し調節するのであれば、核酸配列に機能的に連結されている。したがって発現制御配列には、適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（ATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、mRNAの適正な翻訳を可能にするための当該遺伝子の正しい読み枠の維持、および停止コドンを含めることができる。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現に影響を及ぼすことのできる成分を含むものとし、その存在が有益である追加の成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。発現制御配列はプロモーターを含むことができる。

プロモーターは、転写を指示するのに十分な最小配列である。また、細胞タイプ特異的、組織特異的、または外からのシグナルもしくは作用物質による誘導が可能になるように、プロモーター依存的遺伝子発現を制御可能にするのに十分なプロモーター要素も含まれ、そのような要素は遺伝子の5'領域または3'領域に位置しうる。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターはどちらも含まれる（例えばBitter et al.,Methods in Enzymology 153:516-544,1987参照）。例えば細菌系でクローニングする場合は、例えばバクテリオファージラムダのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを使用しうる。一態様において、哺乳動物細胞系でクローニングする場合は、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えばレトロウイルス長末端反復;アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を使用することができる。組換えDNA技法または合成技法によって生産されるプロモーターも、核酸配列の転写に備えて使用することができる。

発現ベクター: 発現させようとするヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクター。発現ベクターは発現にとって十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されるか、またはインビトロ発現系に供給されうる。発現ベクターには、例えば組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば裸のプラスミドまたはリポソームに含まれているプラスミド）およびウイルス（例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野において公知のものはすべて包含される。

GCN4三量体化ドメイン: 三量体構造を自然に形成するロイシンジッパーアミノ酸配列を含む、GCN4タンパク質からの三量体化ドメイン。GCN4三量体化ドメインの態様は、例えばHarbury et al.（1993 Science 262:1401-1407）に記載されている。いくつかの例では、組換えタンパク質が三量体化するように、本開示の組換えタンパク質のアミノ酸配列にGCN4三量体化ドメインを含めることができる。本開示の態様で使用するためのGCN4三量体化ドメイン配列の非限定的な例は、

で与えられる。

異種: 異なる遺伝源に由来する。

宿主細胞: その内部でベクターが増殖でき、その核酸を発現させることができる細胞。細胞は原核細胞または真核細胞でありうる。この用語は、対象宿主細胞の任意の子孫も包含する。複製中に起こる変異が存在しうるので、すべての子孫が親細胞と同一であるとは限らないことは理解される。しかし、「宿主細胞」という用語が使用される場合は、そのような子孫も含まれる。

免疫応答: 刺激に対するB細胞、T細胞または単球などの免疫系の細胞の応答。一態様において、応答は特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。一態様において、免疫応答はT細胞応答、例えばCD4＋応答またはCD8＋応答である。別の一態様において、応答はB細胞応答であり、特異的抗体の生産をもたらす。

免疫原: 動物における免疫応答を誘発することができる化合物、組成物または物質（例えば組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体）。これには、動物に注射されまたは吸収される組成物が含まれる。対象への免疫原の投与は、関心対象の病原体に対する防御免疫につながりうる。

免疫原性組成物: 対象に投与された場合に、MuVまたはMeVに対して測定可能なCTL応答を誘導するか、またはMuVもしくはMeVに対して測定可能なB細胞応答（例えば抗体の生産）を誘導する、本開示の免疫原を含む組成物。これはさらに、プロトマーを発現させるために使用することができる（そしてそれゆえに組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体に対する免疫応答を誘発するために使用することができる）、本開示の組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーをコードする単離された核酸分子およびベクターも指す。インビボ使用の場合、免疫原性組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体中の組換えMuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体または組換えMuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーをコードする核酸分子を含むことになり、アジュバントなどの他の作用物質も含みうる。

疾患の阻害または処置: 例えばMuV感染症またはMeV感染症などの疾患のリスクがある対象における、疾患または病態の完全な発症の阻害。「処置」とは、疾患または病理学的状態の徴候または症状をそれが発症し始めた後に改善する、治療的介入を指す。疾患または病理学的状態に関して「改善する」という用語は、処置の、観察可能な、任意の有益な効果を指す。疾患の阻害には、疾患を防止しまたは疾患のリスクを低減すること、例えばウイルス感染を防止しまたはウイルス感染のリスクを低減することを含めることができる。有益な効果は、例えば罹患しやすい対象における疾患の臨床症状の発生の遅延、疾患の一部または全部の臨床症状の重症度の低減、疾患進行の減速、ウイルス量の低減、対象の総合的健康または福祉の改良によって、またはその特定疾患に特異的な他のパラメータによって、立証することができる。「予防的」処置は、疾患の徴候を呈さないかまたは初期徴候しか呈していない対象に、病理が発症するリスクを減少させる目的で施行される処置である。

単離された: 「単離された」生物学的成分は、その成分を天然に含んでいる他の生物学的成分などといった他の生物学的成分、例えば他の染色体DNAおよび染色体外DNA、RNAならびにタンパク質から、実質的に分離されまたは精製されている。「単離され」ているタンパク質、ペプチド、核酸およびウイルスには、標準的精製方法によって精製されたものが含まれる。「単離された」は絶対的純粋を必要とせず、少なくとも50％単離された、例えば少なくとも75％、80％、90％、95％、98％、99％、またはさらには99.9％単離された、タンパク質、ペプチド、核酸またはウイルス分子も含めることができる。

リンカーおよび連結された: 2つの分子を連結して1つの連続的分子にするために使用することができる二官能性分子。ペプチドリンカーの非限定的な例として、グリシン-セリンペプチドリンカーが挙げられる。第1ポリペプチドと第2ポリペプチドを「連結する」、または互いに「連結された」2つのポリペプチド、または第2ポリペプチドへの「連結」を有する第1ポリペプチドという場合、それは、文脈からそうでないことがわかる場合を除き、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとが連続的なポリペプチド鎖を形成するような形での、ペプチド結合による（例えばペプチドリンカーを介した）共有結合的連結を指す。ペプチドリンカーが関与する場合、第1ポリペプチドと第2ポリペプチドとの共有結合による連結は、ペプチドリンカーのN末端およびC末端への連結であることができる。典型的には、そのような連結は、分子生物学の技法を使って、ペプチドリンカーによって第2ポリペプチドに連結された第1ポリペプチドをコードするDNAを遺伝子操作することによって達成される。

ネイティブなタンパク質、配列またはジスルフィド結合: 選択的変異などによって修飾されていないポリペプチド、配列またはジスルフィド結合。例えば、抗原の抗原性を標的エピトープに集中させるための、またはネイティブタンパク質には見いだされないジスルフィド結合をタンパク質に導入するための、選択的変異。ネイティブタンパク質またはネイティブ配列を、野生型タンパク質または野生型配列ともいう。非ネイティブジスルフィド結合は、ネイティブタンパク質には存在しないジスルフィド結合、例えば遺伝子工学によってタンパク質に1つまたは複数のシステイン残基を導入することによってタンパク質中に形成されるジスルフィド結合である。

麻疹: 麻疹ウイルスが引き起こす感染性疾患。症状は、通常、感染者へのばく露後10～12日で発症し、7～10日間続く。初期症状は、典型的には、熱、咳、鼻水および目の充血を含む。症状の開始後2日または3日で、コプリック斑と呼ばれる小さな白い斑点が口内に形成されうる。通常は顔から始まり、次に身体の残りの部分に拡がる赤く扁平な発疹が、典型的には、症状の開始後3～5日で始まる。よく見られる合併症には、下痢、中耳感染および肺炎が含まれる。これらは、一つには、麻疹が誘導する免疫抑制ゆえに起こる。それほど一般的ではないが発作、失明、または脳の炎症も起こりうる。

麻疹ウイルス: 麻疹疾患を引き起こすパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）モルビリウイルス属（Morbillivirus）の非分節マイナス鎖RNAウイルス。麻疹ウイルスゲノムRNAは、8つのタンパク質、すなわちヌクレオタンパク質（N）、リンタンパク質（P）、Cタンパク質、Vタンパク質、マトリックス（M）タンパク質、融合（F）タンパク質、ヘマグルチニン（H）タンパク質、およびラージ（L）タンパク質のオープンリーディングフレームをコードする6つの連結された転写単位を含有する。MeVには、現在世界的に循環している公知の遺伝型が少なくとも7つあり、それらは遺伝子型A、B、C、D、F、GおよびHと呼ばれている。

MeV融合（F）タンパク質: ウイルス膜と細胞膜の融合を容易にするMeVのエンベロープ糖タンパク質。自然界では、MeVからのFタンパク質は、まずF₀と呼ばれるおよそ550アミノ酸長の単一のポリペプチド前駆体として合成される。F₀は、小胞体への局在化を指示するN末端シグナルペプチドを含み、そのシグナルペプチドは小胞体においてタンパク質分解的に切断される。残りのF₀残基はオリゴマー化して三量体を形成し、細胞プロテアーゼによってタンパク質分解的にプロセシングされて、ジスルフィドで連結された2つのフラグメントF₁およびF₂を生成する。MeV Fの場合、切断部位はおよそ残基113/114の間に位置する。これらのフラグメントのうちの小さい方であるF₂は、F₀前駆体のN末端部分に由来する（およそ残基24～113）。これらのフラグメントのうちの大きい方であるF₁は、F₀前駆体のC末端部分（およそ残基114～550）を含み、これには、細胞外/管腔領域（およそ残基110～486）、ならびに膜貫通領域およびサイトゾル領域（およそ残基487～550）が含まれる。MeV Fタンパク質の細胞外部分はMeV Fエクトドメインであり、これにはF₂タンパク質とF₁エクトドメインとが含まれる。

MeV Fタンパク質はMeV株内で顕著な配列保存を呈する。この保存ゆえに、当業者は、異なるMeV Fタンパク質のアミノ酸位置を容易に比較することができる。MeV Fアミノ酸のナンバリングは、文脈からそうでないことがわかる場合を除き、SEQ ID NO:36（参照により本明細書に組み入れられるNCBIリファレンス配列P35973.1）:

を参照して行われる。

3つのMeV Fプロトマーがオリゴマー化して成熟Fタンパク質となり、それが準安定融合前コンフォメーションをとる。このコンフォメーションは、標的細胞の膜との接触時に、融合後コンフォメーションへのコンフォメーション変化を起こすようにトリガーされる。このコンフォメーション変化は、F₁エクトドメインのN末端に位置する融合ペプチドと呼ばれる疎水性配列を露出させ、それが宿主細胞膜と会合して、ウイルスまたは感染細胞の膜と標的細胞の膜との融合を促進する。

「融合前コンフォメーションで安定化した」MeV Fエクトドメイン三量体は、対応するネイティブMeV F配列と比較すると、対応するネイティブMeV F配列から形成されるMeV Fエクトドメイン三量体との比較で融合前コンフォメーションの保持率を増加させる1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含む。融合前コンフォメーションの「安定化」は、例えばエネルギー的安定化（例えば、融合後オープンコンフォメーションとの比較で融合前コンフォメーションのエネルギーを低減させること）および/または速度論的安定化（例えば融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの移行速度を低減させること）であることができる。加えて、融合前コンフォメーションでのMeV Fエクトドメイン三量体の安定化は、対応するネイティブMeV F配列と比較して、変性に対する耐性の増加を含むことができる。MeV Fエクトドメイン三量体が融合前コンフォメーションにあるかどうかを決定する方法は本明細書において提供され、これにはネガティブ染色電子顕微鏡法および融合前コンフォメーション特異的抗体を使った抗体結合アッセイが含まれる（ただしそれらに限定されるわけではない）。MeV Fタンパク質に関して「pre-F」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化した三量体クラスI融合タンパク質である分子を表す。

MeV F融合前特異的抗体: 融合前コンフォメーションのMeV Fタンパク質に特異的に結合するが、融合後コンフォメーションのMeV Fタンパク質には特異的に結合しない抗体。

MeVヘマグルチニン（H）タンパク質: II型膜タンパク質であって、宿主細胞膜へのMeVの付着を容易にする、MeVエンベロープ糖タンパク質。完全長Hタンパク質は、N末端の細胞質テールおよび膜貫通ドメイン（CTおよびTM、およそアミノ酸1～58）、ならびにストーク領域（およそアミノ酸59～179）とヘッド領域（およそアミノ酸180～617）とを含むエクトドメイン（およそアミノ酸59～617）を有する。例示的なMeV Hタンパク質配列を、本明細書では、SEQ ID NO:49（参照により本明細書に組み入れられるNCBIリファレンス配列AAA56644.1）:

として提供する。

本明細書において使用されるMeV H残基の位置決めは、SEQ ID NO:49として示される配列を参照して行われる。

流行性耳下腺炎: 流行性耳下腺炎ウイルスが引き起こす感染性疾患。流行性耳下腺炎は、唾液腺、典型的には耳下腺の炎症を特徴とする。髄膜炎、脳炎、膵炎、卵巣炎（女性の場合）、睾丸炎（男性の場合）および難聴などといった、流行性耳下腺炎ウイルス感染症の重篤な合併症が起こる場合がある。

流行性耳下腺炎ウイルス（MuV）: 流行性耳下腺炎疾患を引き起こすパラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科ルブラウイルス属（Rubulavirus）の非分節マイナス鎖RNAウイルス。流行性耳下腺炎ウイルスゲノムRNAは、ヌクレオタンパク質（N）、リンタンパク質（P）、Vタンパク質、Iタンパク質、マトリックス（M）タンパク質、融合（F）タンパク質、小疎水性（SH）タンパク質、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）タンパク質、およびラージ（L）タンパク質のためのオープンリーディングフレームをコードする、直列に連結された7つの転写単位を含有する。流行性耳下腺炎ウイルスゲノムの略図を図6に示す。P遺伝子（「V/P/I遺伝子」とも呼ばれる）は、グアニンヌクレオチドの挿入によるRNA編集によって、V、PおよびIタンパク質に対応する3つのmRNA転写産物をもたらす。具体的には、P遺伝子の忠実な転写はVタンパク質を生じ、2つのグアニンヌクレオチドの挿入はPタンパク質をコードするmRNAを生じ、4つのグアニン残基の挿入はIタンパク質をコードするmRNAを生じる。SH遺伝子は、遺伝子型が異なるMuVの間で最も可変的な遺伝子であり、それゆえに一般に遺伝子型判定の根拠として使用される。MuVには、現在世界的に循環している公知の遺伝子型が12あり、それらは遺伝子型A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、LおよびNと呼ばれている。最新のMuVワクチンは遺伝子型A（Jeryl Lynn）、遺伝子型B（占部-AM9）または遺伝子型未確定（Leningrad-Zagreb）のウイルスに基づいている。

MuV融合（F）タンパク質: ウイルス膜と細胞膜の融合を容易にするMuVのエンベロープ糖タンパク質。自然界では、MuVからのFタンパク質は、まずF₀と呼ばれるおよそ538アミノ酸長の単一のポリペプチド前駆体として合成される。F₀は、小胞体への局在化を指示するN末端シグナルペプチドを含み、そのシグナルペプチドは小胞体においてタンパク質分解的に切断される。残りのF₀残基はオリゴマー化して三量体を形成し、細胞プロテアーゼによってタンパク質分解的にプロセシングされて、ジスルフィドで連結された2つのフラグメントF₁およびF₂を生成する。MuV Fの場合、切断部位はおよそ残基103/104の間に位置する。これらのフラグメントのうちの小さい方であるF₂は、F₀前駆体のN末端部分に由来する（およそ残基20～103）。これらのフラグメントのうちの大きい方であるF₁は、F₀前駆体のC末端部分（およそ残基104～538）を含み、これには、細胞外/管腔領域（およそ残基110～483）、ならびに膜貫通領域およびサイトゾル領域（およそ残基484～538）が含まれる。MuV Fタンパク質の細胞外部分はMuV Fエクトドメインであり、これにはF₂タンパク質とF₁エクトドメインとが含まれる。

MuV Fタンパク質はMuV株内で顕著な配列保存を呈する。この保存ゆえに、当業者は、異なるMuV Fタンパク質のアミノ酸位置を容易に比較することができる。MuV Fアミノ酸のナンバリングは、文脈からそうでないことがわかる場合を除き、SEQ ID NO:1（参照により本明細書に組み入れられるNCBIリファレンス配列P09458.1）:

を参照して行われる。

3つのMuV Fプロトマーがオリゴマー化して成熟Fタンパク質となり、それが準安定融合前コンフォメーションをとる。このコンフォメーションは、標的細胞の膜との接触時に、融合後コンフォメーションへのコンフォメーション変化を起こすようにトリガーされる。このコンフォメーション変化は、F₁エクトドメインのN末端に位置する融合ペプチドと呼ばれる疎水性配列を露出させ、それが宿主細胞膜と会合して、ウイルスまたは感染細胞の膜と標的細胞の膜との融合を促進する。

「融合前コンフォメーションで安定化した」MuV Fエクトドメイン三量体は、対応するネイティブMuV F配列と比較すると、対応するネイティブMuV F配列から形成されるMuV Fエクトドメイン三量体との比較で融合前コンフォメーションの保持率を増加させる1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む。融合前コンフォメーションの「安定化」は、例えばエネルギー的安定化（例えば、融合後オープンコンフォメーションとの比較で融合前コンフォメーションのエネルギーを低減させること）および/または速度論的安定化（例えば融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの移行速度を低減させること）であることができる。加えて、融合前コンフォメーションでのMuV Fエクトドメイン三量体の安定化は、対応するネイティブMuV F配列と比較して、変性に対する耐性の増加を含むことができる。MuV Fエクトドメイン三量体が融合前コンフォメーションにあるかどうかを決定する方法は本明細書において提供され、これにはネガティブ染色電子顕微鏡法および融合前コンフォメーション特異的抗体を使った抗体結合アッセイが含まれる（ただしそれらに限定されるわけではない）。MuV Fタンパク質に関して「pre-F」という用語は、1つまたは複数のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化した三量体クラスI融合タンパク質である分子を表す。

MuVヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）タンパク質: II型膜タンパク質であって、宿主細胞膜へのMuVの付着を容易にする、MuVエンベロープ糖タンパク質。完全長MuV HNタンパク質は、N末端細胞質テールおよび膜貫通ドメイン（CTおよびTM、およそアミノ酸1～53）、ならびにストーク領域（およそアミノ酸54～130）とヘッド領域（およそアミノ酸131～582）とを含むエクトドメイン（およそアミノ酸54～582）を有する。例示的なMuV HNタンパク質配列を、本明細書では、SEQ ID NO:50（参照により本明細書に組み入れられるNCBIリファレンス配列AQT03695.1）:

として提供する。

本明細書において使用されるMuV HN残基の位置決めは、SEQ ID NO:50として示される配列を参照して行われる。

MuV F融合前特異的抗体: 融合前コンフォメーションのMuV Fタンパク質に特異的に結合するが、融合後コンフォメーションのMuV Fタンパク質には特異的に結合しない抗体。

核酸分子: ポリマー型のヌクレオチドであり、これは、RNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との両方、cDNA、ゲノムDNA、および合成型、ならびに上記の混合ポリマーを含みうる。ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチドまたはどちらかのタイプのヌクレオチドの修飾型を指す。本明細書において使用される「核酸分子」という用語は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、別段の指定がある場合を除き、通常、少なくとも10塩基長である。この用語は、一本鎖型および二本鎖型のDNAを包含する。ポリヌクレオチドは、天然および/または非天然ヌクレオチド連結によって互いに連結された天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドの一方または両方を含みうる。「cDNA」とはmRNAと相補的であるかまたは同一であって、一本鎖型または二本鎖型の、DNAを指す。「コードする」とは、生物学的プロセスにおいて、所定のヌクレオチド配列（すなわちrRNA、tRNAおよびmRNA）または所定のアミノ酸配列のどちらか一方とそれがもたらす生物学的性質とを有する他のポリマーおよび高分子を合成するためのテンプレートとして役立つという、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどといったポリヌクレオチド中の特定ヌクレオチド配列の固有の性質を指す。

機能的に連結される: 第1核酸配列が第2核酸配列と機能的な関係に配置されているのであれば、第1核酸配列は第2核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすのであれば、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結された核酸配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、同じ読み枠にある。

薬学的に許容される担体: 有用な薬学的に許容される担体は従来どおりである。E.W.MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第19版、1995）には、本開示の免疫原の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。

一般に、担体の性質は、使用される特定の投与方式に依存することになる。例えば非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体を媒体として含む注射可能な流体を含む。固形組成物（例えば散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤型）の場合、従来の非毒性固形担体として、例えば薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。投与される薬学的組成物（免疫原性組成物など）は、生物学的に中立な担体に加えて、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤およびpH緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの微量の非毒性補助物質も含有することができる。対象への投与に適した特定の態様では、担体は無菌であり、および/または所望の免疫応答を誘導するのに適した1つもしくは複数の計量された組成物の用量を含有する単位剤形に、懸濁されもしくは他の方法で含まれうる。処置を目的とするその使用のための薬剤も伴いうる。単位剤形は、例えば、無菌内容物が入っている密封されたバイアル中にあってもよいし、後に溶解して投与するために凍結乾燥されていてもよいし、固形剤または制御放出剤中にあってもよい。

ポリペプチド: アミノ酸の任意の鎖であって、長さまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）は問わない。「ポリペプチド」は、天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマー、ならびに1つまたは複数のアミノ酸残基が非天然アミノ酸、例えば対応する天然アミノ酸の人工的化学ミメティックであるものを含む、アミノ酸ポリマーに適用される。「残基」とは、アミド結合またはアミド結合ミメティックによってポリペプチドに組み入れられたアミノ酸またはアミノ酸ミメティックを指す。ポリペプチドは、アミノ末端（N末端）およびカルボキシ末端（C末端）を有する。「ポリペプチド」はペプチドまたはタンパク質と相互可換的に使用され、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指すために使用される。

プライム-ブーストワクチン接種: 免疫応答を誘導するために対象に第1免疫原性組成物（プライマーワクチン）を投与し、その後、第2免疫原性組成物（ブースターワクチン）を投与することを含む、免疫治療。プライマーワクチンおよび/またはブースターワクチンは、免疫応答の対象となる抗原を発現するベクター（ウイルスベクター、RNAまたはDNAベクターなど）を含む。ブースターワクチンはプライマーワクチン後に対象に投与され、プライマーワクチンの投与とブースターワクチンの投与の間の適切な時間間隔およびそのような時間枠の例は、本明細書において開示される。いくつかの態様では、プライマーワクチン、ブースターワクチン、またはプライマーワクチンとブースターワクチンとの両方が、アジュバントをさらに含む。非限定的な一例において、プライマーワクチンはDNAベースのワクチン（または遺伝子送達に基づく他のワクチン）であり、ブースターワクチンはタンパク質サブユニットまたはタンパク質ナノ粒子に基づくワクチンである。

タンパク質ナノ粒子: 自己集合性で、マルチサブユニットである、タンパク質に基づく多面体状の構造。サブユニットは、それぞれがタンパク質またはポリペプチド（例えばグリコシル化ポリペプチド）および任意で以下の特徴のうちの1つまたは複数で構成される: 核酸、補欠分子族、有機化合物および無機化合物。タンパク質ナノ粒子の非限定的な例として、フェリチンナノ粒子（例えば参照により本明細書に組み入れられるZhang,Y.Int.J.Mol.Sci.,12:5406-5421,2011参照）、エンカプスリンナノ粒子（例えば参照により本明細書に組み入れられるSutter et al.,Nature Struct.and Mol.Biol.,15:939-947,2008参照）、硫黄オキシゲナーゼ/レダクターゼ（SOR）ナノ粒子（例えば参照により本明細書に組み入れられるUrich et al.,Science,311:996-1000,2006参照）、ルマジンシンターゼナノ粒子（例えばZhang et al.,J.Mol.Biol.,306:1099-1114,2001参照）またはピルビン酸デヒドロゲナーゼナノ粒子（例えば参照により本明細書に組み入れられるIzard et al.,PNAS 96:1240-1245,1999参照）が挙げられる。フェリチン、エンカプスリン、SOR、ルマジンシンターゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼは、自己集合して球状タンパク質複合体になる単量体タンパク質であり、この球状タンパク質は、場合により、それぞれ24、60、24、60および60個のタンパク質サブユニットからなる。いくつかの例では、フェリチン、エンカプスリン、SOR、ルマジンシンターゼまたはピルビン酸デヒドロゲナーゼ単量体が組換えMuVまたはMeV Fエクトドメインに連結され、それらが自己集合することで、組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体をその表面に提示するタンパク質ナノ粒子になり、抗原に対する免疫応答を刺激するために、これを対象に投与することができる。

組換え: 組換え核酸分子は、天然ではない配列、例えば1つまたは複数の核酸の置換、欠失または挿入を含む配列を有し、および/または本来であれば分離されている2つの配列セグメントの人工的な組合せによって作られる配列を有するものである。この人工的組合せは、化学合成によって達成するか、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人工的操作によって、例えば遺伝子工学の技法によって、達成することができる。

組換えウイルスは、組換え核酸分子を含むゲノムを含むものである。

組換えタンパク質は、天然でない配列を有するもの、または本来であれば分離されている2つの配列セグメントの人工的組合せによって作られる配列を有するものである。いくつかの態様において、組換えタンパク質は、細菌細胞または真核細胞などの宿主細胞に導入されているか、または組換えウイルスのゲノムに導入されている、異種（例えば組換え）核酸によってコードされる。

配列同一性: アミノ酸配列間の類似性は、配列同一性とも呼ばれる配列間の類似性によって表現される。配列同一性は同一性パーセンテージによって測定されることが多く、パーセンテージが高いほど、2つの配列は類似している。ポリペプチドのホモログ、オルソログまたは変異体は、標準的方法を使ってアライメントした場合、比較的高度の配列同一性を有するだろう。

比較のために配列をアライメントする方法は当技術分野において周知である。さまざまなプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Smith＆Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981、Needleman＆Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970、Pearson＆Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988、Higgins＆Sharp,Gene,73:237-44,1988、Higgins＆Sharp,CABIOS 5:151-3,1989、Corpet et al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988、Huang et al.Computer Appls.In the Biosciences 8,155-65,1992、およびPearson et al.,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994に記載されている。Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990では、配列アラインメント方法とホモロジー計算について、詳細な考察がなされている。

ポリペプチドの変異体は、典型的には、関心対象のアミノ酸配列との全長アラインメントでカウントして、少なくとも約75％、例えば少なくとも約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性の保持を特徴とする。参照配列に対してさらに大きな類似性を持つタンパク質は、この方法によって評価した場合に、例えば少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性など、同一性パーセンテージの増加を示すだろう。配列同一性に関して比較されている配列が配列全体よりも短い場合、ホモログおよび変異体は、典型的には、10～20アミノ酸の短いウインドウにおいて、典型的には少なくとも80％の配列同一性を有し、参照配列に対するそれぞれの類似性に応じて、少なくとも85％または少なくとも90％もしくは95％の配列同一性を有しうる。そのような短いウインドウにおいて配列同一性を決定する方法は、インターネット上のNCBIウェブサイトで利用することができる。

本明細書において、「少なくとも90％の同一性」という場合、それ（または類似の表現）は、指定された参照配列に対して「少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはさらには100％の同一性」を指す。

シグナルペプチド: 新たに合成された分泌タンパク質または膜タンパク質を膜（例えば小胞体膜）に向かわせ、膜を通過させる、短いアミノ酸配列（例えばおよそ18～25アミノ酸長）。シグナルペプチドは、典型的には、ポリペプチドのN末端に位置し、ポリペプチドが膜を横切った後に、シグナルペプチダーゼによって除去される。シグナルペプチド配列は、典型的には、3つの共通する構造上の特徴、すなわちN末端極性塩基性領域（n領域）、疎水性コアおよび親水性c領域）を含有する。例示的なシグナルペプチド配列は、MKAFSVTCLSFAVFSSSIC（SEQ ID NO:2の残基1～19）として示される。

特異的に結合する: 抗体:抗原タンパク質複合体またはタンパク質:タンパク質複合体の形成に関して、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団の存在下で、標的であるタンパク質、ペプチドまたは多糖（例えば糖タンパク質）の存在を決定づける結合反応を指す。したがって、指定された条件下では、特定の抗体またはタンパク質が、標的である特定のタンパク質、ペプチドまたは多糖（例えば病原体の表面に存在する抗原、例えばMuV FまたはMeV Fエクトドメイン三量体の融合前コンフォメーションの膜遠位頂端にある抗原部位）に優先的に結合し、試料中もしくは対象中に存在する他のタンパク質もしくは多糖または同じタンパク質の代替コンフォメーション（例えばMuVまたはMeV Fタンパク質の融合後コンフォメーション）には、有意な量では結合しない。特異的結合は、当技術分野において公知の方法によって決定することができる。第1のタンパク質または抗体は、その相互作用のK_Dが10^-6モル濃度未満、例えば10^-7モル濃度未満、10^-8モル濃度未満、10^-9モル濃度未満、またはさらには10^-10モル濃度未満である場合には、標的タンパク質に特異的に結合する。

可溶性タンパク質: 室温の水性液体中に溶解し、溶解したままであることができるタンパク質。タンパク質の溶解性は、その水系液体におけるタンパク質の濃度、その液体の緩衝条件、その液体中の他の溶質の濃度、例えば塩濃度およびタンパク質濃度、ならびにその液体の温度に依存して変化しうる。いくつかの態様において、可溶性タンパク質は、室温のリン酸緩衝食塩水（pH7.4）に少なくとも0.5mg/mlの濃度まで溶解し、少なくとも48時間は溶解したままであるものである。

対象: 生きている多細胞脊椎生物であり、このカテゴリーにはヒトと非ヒト哺乳動物が含まれる。一例において対象はヒトである。ある特定例において、対象は新生児/新生仔である。さらなる一例では、MuV感染またはMeV感染の阻害を必要としている対象が選択される。例えば対象は、未感染であってMuV感染またはMeV感染のリスクがあるか、または感染して処置を必要としている。

T4フィブリチン三量体化ドメイン: 「フォルドン（foldon）」ドメインとも呼ばれるT4フィブリチン三量体化ドメインは、自然に三量体構造を形成するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、抗原が三量体を形成するように、本開示の組換えタンパク質のアミノ酸配列にT4フィブリチン三量体化ドメインを含めることができる。一例において、T4フィブリチン三量体化ドメインは、

として示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様は、例えば切断のために使用することができるトロンビン切断部位をT4フィブリチン三量体化ドメインの隣に組み入れることなどによって精製タンパク質から切り離すことができるT4フィブリチン三量体化ドメインを含む。

膜貫通ドメイン: 脂質二重層、例えば細胞またはウイルスまたはウイルス様粒子の脂質二重層に挿入される、アミノ酸配列。膜貫通ドメインは抗原を膜に固定するために使用することができる。いくつかの例において、膜貫通ドメインはMuV F膜貫通ドメインである。別の例において、膜貫通ドメインはMeV F膜貫通ドメインである。

～に十分な条件下で: 所望の活性を可能にする任意の環境を表現するために使用される語句。

ワクチン: 感染性疾患または他のタイプの疾患の防止、改善または処置のために投与される、免疫応答を刺激することができる免疫原性材料の調製物。免疫原性材料は、弱毒化微生物または死滅微生物（細菌またはウイルスなど）、または抗原性のタンパク質、ペプチド、またはそれらに由来するDNAを含みうる。ワクチンは、本開示の免疫原（組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体またはそれをコードする核酸分子など）、ウイルス、細胞または1つもしくは複数の細胞構成要素を含みうる。ワクチンは、予防的（防止的または防御的）応答と治療的応答をどちらも誘発しうる。投与の方法はワクチンに応じてさまざまであるが、これには、接種、摂取、吸入または他の投与形式が含まれうる。ワクチンは、免疫応答をブーストするために、アジュバントと共に投与されうる。非限定的な一具体例では、ワクチンが、対照と比較して、MuV感染と関連する症状を防止しおよび/もしくはその重症度を低減し、ならびに/またはウイルス量を減少させる。別の非限定的な具体例では、ワクチンが、対照と比較して、MeV感染と関連する症状を防止しおよび/もしくはその重症度を低減し、ならびに/またはウイルス量を減少させる。

ベクター: 関心対象の抗原のコード配列に機能的に連結されていてコード配列を発現させることができるプロモーターを保持する、DNA分子またはRNA分子を含有する実体。非限定的な例として、裸のまたはパッケージング（脂質および/またはタンパク質）されたDNA、裸のまたはパッケージングされたRNA、複製不能であってもよいウイルスまたは細菌または他の微生物のサブ成分、複製能を有してもよいウイルスまたは細菌または他の微生物が挙げられる。ベクターをコンストラクトという場合もある。組換えDNAベクターは組換えDNAを有するベクターである。ベクターは、それが宿主細胞中で複製することを可能にする、複製起点などの核酸配列を含むことができる。ベクターは、1つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子および当技術分野において公知の他の遺伝要素も含むことができる。ウイルスベクターは、1種または複数種のウイルスに由来する少なくともいくつかの核酸配列を有する組換え核酸ベクターである。

ウイルス様粒子（virus-like particle: VLP）: 数種のウイルスのいずれかに由来する非複製ウイルスシェル。VLPは、一般に、1つまたは複数のウイルスタンパク質、例えば限定するわけではないが、キャプシド、コート、シェル、表面および/もしくはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質、またはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドで構成される。VLPは、適当な発現系におけるタンパク質の組換え発現時に、自発的に形成されうる。特定VLPを生産するための方法は当技術分野において公知である。ウイルスタンパク質の組換え発現後のVLPの存在は、当技術分野において公知の従来技法を使って、例えば電子顕微鏡法、生物物理学的キャラクタリゼーションなどによって、検出することができる。さらにVLPは、公知の技法、例えば密度勾配遠心分離によって単離し、特徴的密度バンド形成によって同定することができる。例えばBaker et al.（1991）Biophys.J.60:1445-1456およびHagensee et al.（1994）J.Virol.68:4503-4505、Vincente,J Invertebr Pathol.,2011、Schneider-Ohrum and Ross,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,354:53073,2012）を参照されたい。

II. 免疫原
A. 組換えMuV Fエクトドメイン三量体
融合前コンフォメーションで安定化するようにネイティブ型から（例えば1つまたは複数のアミノ酸置換の導入によって）修飾された組換えMuV Fエクトドメイン三量体が、本明細書において開示される。実施例で述べるように、本開示のMuV Fエクトドメイン三量体の態様は、最適化された溶解性、安定性、発現および免疫原性を求めて、構造に基づくデザインを複数ラウンド行うことによって選択された。組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、MuVに対する免疫応答を脊椎動物（ヒトなど）において誘導するのに有用である。例示的な態様は、融合前コンフォメーションで安定化していない対応するMuV Fエクトドメイン三量体と比較して、動物モデルにおいて、優れた免疫応答を生じさせることが示される。

いくつかの態様において、免疫原は、MuV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させる1つまたは複数のアミノ酸の置換または欠失を含むプロトマーを含む組換えMuV Fエクトドメイン三量体を含む。

いくつかの態様において、免疫原は、三量体のプロトマーにおける1つまたは複数のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化した組換えMuV Fエクトドメイン三量体を含み、アミノ酸置換はMuV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させるための非天然ジスルフィド結合を形成するシステイン置換を含む。非天然ジスルフィド結合は、ネイティブMuV Fタンパク質には見いだされないものであり、タンパク質工学によって（例えば非天然ジスルフィド結合を形成する1つまたは複数の置換システイン残基を含めることによって）導入される。例えばいくつかの態様において、本開示の組換えMuV Fタンパク質はいずれも、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の非天然ジスルフィド結合のうちのいずれか1つによって、融合前コンフォメーションで安定化しうる。

ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、1つまたは複数のアミノ酸置換によって、ネイティブMuV F配列中に導入することができる。例えばいくつかの態様では、単一のアミノ酸置換により、ネイティブMuV F配列中に存在するシステイン残基とジスルフィド結合を形成するシステインが導入される。あるいは、ジスルフィド結合を形成させるために、2つのシステイン残基をネイティブMuV F配列中に導入することもできる。非天然ジスルフィド結合のシステイン（1つまたは複数）の場所を、当業者は、本開示の、融合前コンフォメーションにあるMuV Fエクトドメイン三量体の構造を使って、決定することができる。

これらのシステインのアミノ酸位置は、典型的には、MuV Fタンパク質三量体の融合前コンフォメーションにおけるジスルフィド結合の形成にとって、十分に近い距離内にある。三次元構造データ（例えば表1に提供されるもの）を使って2つの残基が、ジスルフィド結合形成にとって、互いに十分に近い距離内にあるかどうかを決定する方法は公知である（例えばPeterson et al.,Protein engineering,12:535-548,1999およびDombkowski,Bioinformatics,19:1852-1853,3002（DISULFIDE BY DESIGN（商標）を開示している）参照。これらの参考文献は、それぞれ、参照により本明細書に組み入れられる）。残基は、本明細書において提供される融合前コンフォメーションにあるMuV F三量体の三次元構造に基づいて、手作業で選択することができ、あるいはDISULFIDEBYDESIGN（商標）などのソフトウェアを使用することができる。理論には拘泥しないが、ジスルフィド結合の形成にとって理想的な距離は、一般に、Cα-Cα距離が約5.6Å、Sγ-Sγ距離が約2.02Å、Cβ-Cβ距離が3.5～4.25Åあたりであると考えられている（最適な回転異性体（rotomer）を使用）。ジスルフィド結合を導入するためにシステインの代わりに使用できる三次元構造中の残基を選択する場合に、これらの距離からの変動が包含されることは、当業者には理解されるだろう。例えば、いくつかの態様において、選択された残基は7.0Å未満のCα-Cα距離および/または4.7Å未満のCβ-Cβ距離を有する。いくつかの態様において、選択された残基は2.0～8.0ÅのCα-Cα距離および/または2.0～6.0ÅのCβ-Cβ距離を有する。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MuV F位置86および215におけるシステイン置換（例えばN86CおよびA215C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MuV F位置155および161におけるシステイン置換（例えばK155CおよびL161C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MuV F位置165および231におけるシステイン置換（例えばV165CおよびM231C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MuV F位置206および223におけるシステイン置換（例えばV206CおよびA223C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MuV F位置209および214におけるシステイン置換（例えばP209CおよびP214C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MuV F位置221および255におけるシステイン置換（例えばI221CおよびM255C置換）を含む。

上記の組換えMuV Fタンパク質はいずれも、F1ポリペプチドとF2ポリペプチドの間のプロテアーゼ切断部位を排除して「単鎖」組換えFタンパク質を生成させるための修飾を、さらに含むことができる。例えば、上記組換えMuVタンパク質はいずれも、MuV F位置101～103の欠失およびペプチドリンカーで融合された位置100と104を、含むことができる。この修飾により、F2/F1フューリン切断部位は除去され、融合ペプチドの第1残基（これは疎水性である）も除去された。F2とF1エクトドメインとを融合し、融合前コンフォメーションへのFエクトドメインのフォールディングを可能にする適切なペプチドリンカーは、いずれも使用しうる。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、グリシン、セリンまたはグリシン-セリンペプチドリンカーである。いくつかの態様において、ペプチドリンカーはGly-Gly-Glyリンカーである。

非限定的な一例では、非天然ジスルフィド結合を形成させるためのV206CおよびA223C置換ならびにMuV F位置101～103の欠失およびそれに伴いGly-Gly-Glyペプチドリンカーで融合された位置100と104を持つプロトマーを含む、組換えMuV Fエクトドメイン三量体が提供される。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメインのプロトマーは、融合前コンフォメーションの安定化を増進するために、または他の目的で、例えば溶解性を増大させるか、もしくは不要な免疫応答を低減するために、1つまたは複数のさらなるアミノ酸置換を含むことができる。

上に列挙した非ネイティブジスルフィド結合は、MuV Fエクトドメインの膜遠位部分を融合前コンフォメーションで安定化させる。これらの変異はいずれも、例えばエクトドメインの三量体化を増進するための、MuV Fエクトドメインの膜近位部分（例えばステム）の修飾と組み合わせることができる。

いくつかの態様において、プロトマー中の組換えF₂ポリペプチドのN末端位置はMuV F位置20～30のうちの1つ（例えば位置20）であることができ、F₁エクトドメインのC末端位置はエクトドメインのステム領域からの位置、例えばMuV F位置469～483のうちの1つ（例えば位置476）であることができる。

非限定的な一例では、非天然ジスルフィド結合を形成させるためのV206CおよびA223C置換ならびにMuV F位置101～103の欠失およびそれに伴いGly-Gly-Glyペプチドリンカーで融合された位置100と104を持つ、MuV位置20～476を含むプロトマーを含む、組換えMuV Fエクトドメイン三量体が提供される。

融合前コンフォメーションでの安定化のためのアミノ酸置換を含むMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーの非限定的な例が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:3～8のいずれか1つの残基20～483、SEQ ID NO:11～16、26、もしくは51のいずれか1つの残基20～476、またはSEQ ID NO:19～24のいずれか1つの残基20～469と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含み、ここでプロトマーは、MuV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:3～8のいずれか1つの残基20～483、SEQ ID NO:11～16、26、もしくは51のいずれか1つの残基20～476、またはSEQ ID NO:19～4のいずれか1つの残基20～469を含む。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、例えば組換えサブユニットワクチンとして使用するための可溶性タンパク質複合体である。いくつかのそのような態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、それぞれが、GCN4三量体化ドメインもしくはT4フィブリチン三量体化ドメインまたはその両方などといった三量体化ドメインへのC末端連結を含むことができる。三量体化ドメインは、三量体化と、組換えMuV Fエクトドメイン三量体の膜近位局面の安定化とを促進する。例えば組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端残基（例えば三量体のステム領域の残基）を、三量体化ドメインに直接連結するか、またはペプチドリンカーを介して間接的に三量体化ドメインに連結することができる。例示的なリンカーとしてグリシンおよびグリシン-セリンリンカーが挙げられる。可溶性組換えタンパク質の安定な三量体を促進する外因性多量体化ドメインの非限定的な例としては、GCN4ロイシンジッパー、T4フィブリチン三量体化ドメイン、肺サーファクタントタンパク質（Hoppe et al.1994 FEBS Lett 344:191-195）またはコラーゲン（McAlinden et al.2003 J Biol Chem 278:42200-42207）由来の三量体化モチーフが挙げられ、これらはいずれも、組換えMuV Fエクトドメイン三量体が融合前コンフォメーションを保つ限り、三量体化を促進するために、組換えMuV FエクトドメインのプロトマーのC末端に連結することができる。いくつかの例では組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーをMuV三量体化ドメインに連結することができ、例えば三量体中の各プロトマーは、GCN4三量体化ドメインへのC末端連結、例えばMuV F位置469～483のいずれか1つ、例えばMuV F位置469、MuV F位置476またはMuV F位置483への連結を、含むことができる。具体的な例では、GCN4三量体化ドメインがアミノ酸配列

を含むか、または同アミノ酸配列からなる。具体的な例では、T4フィブリチン三量体化ドメインがアミノ酸配列

を含むか、または同アミノ酸配列からなる。具体的な例では、フィブリチン三量体化ドメインに融合されたGCN4三量体化ドメインがアミノ酸配列

を含むか、同アミノ酸配列からなる。

非限定的な一例では、非天然ジスルフィド結合を形成させるためのV206CおよびA223C置換、MuV F位置101～103の欠失およびそれに伴いGly-Gly-Glyペプチドリンカーで融合された位置100と104、ならびにプロトマーのエクトドメイン中のC末端に連結されたGCN4三量体化ドメインを持つ、MuV位置20～476を含むプロトマーを含む、組換えMuV Fエクトドメイン三量体が提供される。

融合前コンフォメーションでの安定化のためのアミノ酸置換と三量体化ドメインへのC末端連結とを含むMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーの非限定的な例が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:3～8のいずれか1つの残基20～513、SEQ ID NO:11～16、26、もしくは51のいずれか1つの残基20～506、またはSEQ ID NO:19～24のいずれか1つの残基20～499と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含み、ここでプロトマーは、MuV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:3～8のいずれか1つの残基20～513、SEQ ID NO:11～16、26、もしくは51のいずれか1つの残基20～506、またはSEQ ID NO:19～24のいずれか1つの残基20～499を含む。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、例えば弱毒化ウイルスワクチンまたはウイルス様粒子ワクチンにおいて使用するための、膜固定型タンパク質複合体であることができる。膜固定は、例えば膜貫通ドメインおよび任意で細胞質テールへの、例えばMuV Fの膜貫通ドメインおよび細胞質テールへの、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端連結によって達成することができる。いくつかの態様では、組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーを膜貫通ドメインに連結するために、1つまたは複数のペプチドリンカー（例えばgly-serリンカー、例えば10アミノ酸グリシン-セリンペプチドリンカーを使用することができる。本開示の態様で使用するための膜貫通ドメインの非限定的な例としては、

などのMuV F膜貫通ドメインが挙げられる。本開示の態様で使用するための膜貫通ドメインおよび細胞質テールの非限定的な例としては、

などのMuV F膜貫通ドメインおよび細胞質テールが挙げられる。

異なるMuV株からのネイティブMuV Fタンパク質は、そのようなタンパク質をコードする核酸配列および方法と共に公知であり、それらは、組換えMuV Fエクトドメイン三量体を生成させるために、本明細書において提供される説明を使って改変することができる。

組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、誘導体化すること、または別の分子（例えば別のペプチドまたはタンパク質）に連結することができる。一般に、組換えMuV Fエクトドメインは、組換えMuV Fタンパク質の三量体に対する中和抗体への結合が誘導体化またはラベリングによる有害な影響を受けないように、誘導体化される。例えば組換えMuV Fエクトドメインは、1つまたは複数の他の分子実体、例えば担体タンパク質、抗体、異種タンパク質または検出タグに、（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合、その他によって）機能的に連結することができる。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、1つまたは複数のMuV HNエクトドメイン、例えば

として示されるMuV HN配列のエクトドメインヘッドに、融合される。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、1つまたは複数のMuV HNエクトドメインに、例えばMuV HN位置54～130からMuV HN位置582までのいずれか1つ（例えばMuV HN位置54～63からMuV HN位置582まで、例えば位置54～582、61～582、63～582または55～582）のエクトドメインストークおよびエクトドメインヘッドに、融合される。いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、1つまたは複数のMuV HNエクトドメインに、例えばSEQ ID NO:90の残基22～550、SEQ ID NO:91の残基22～543、SEQ ID NO:92の残基22～541、またはSEQ ID NO:93の残基22～549として示される配列のエクトドメインストークおよびエクトドメインヘッドに、融合される。

例えば組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、それぞれが、MuV HNエクトドメインに融合される。融合は直接的融合またはペプチドリンカーを介した融合であることができる。いくつかの態様において、MuV HNエクトドメインは、MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端に、直接的に、またはペプチドリンカーを介して間接的に、融合することができる。いくつかのそのような態様において、MuV HNエクトドメインは、MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端に融合された三量体化ドメイン（例えばGCN4またはT4フィブリチン三量体化ドメイン）のC末端に、直接的に、またはペプチドリンカーを介して間接的に、融合することができる。いくつかのそのような態様において、三量体化ドメインおよびMuV HNエクトドメインに連結されたMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:27の残基20～966として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:27の残基20～966と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、1つまたは複数のMeV Hエクトドメイン、例えば

として示されるH配列のエクトドメインヘッドに、融合される。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、1つまたは複数のMeV Hエクトドメインに、例えばMeV H位置59～179からMeV H位置617までのいずれか1つ（例えばMeV H位置59～67からMeV H位置617までのいずれか1つ、例えば位置59～617、62～617、60～617または67～617）のエクトドメインストークおよびエクトドメインヘッドに、融合される。いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体は、1つまたは複数のMeV Hエクトドメインに、例えばSEQ ID NO:86の残基22～580、SEQ ID NO:87の残基22～577、SEQ ID NO:88の残基22～579、またはSEQ ID NO:89の残基22～572として示される配列のエクトドメインストークおよびエクトドメインヘッドに、融合される。

例えば融合前コンフォメーションで安定化した組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、それぞれが、MeV Hエクトドメインに融合される。融合は直接的融合またはペプチドリンカーを介した融合であることができる。いくつかの態様において、MeV Hエクトドメインは、融合前MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端に、直接的に、またはペプチドリンカーを介して間接的に、融合することができる。いくつかのそのような態様において、MeV Hエクトドメインは、MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端に融合された三量体化ドメイン（例えばGCN4またはT4フィブリチン三量体化ドメイン）のC末端に、直接的に、またはペプチドリンカーを介して間接的に、融合することができる。いくつかのそのような態様において、三量体化ドメインおよびMeV Hエクトドメインに連結されたMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:28の残基21～981もしくはSEQ ID NO:29の残基20～1006として示されるアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO:28の残基21～981もしくはSEQ ID NO:29の残基20～1006と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。

融合前コンフォメーションでの安定化のためのアミノ酸置換を持つMuV Fエクトドメインを含有する配列の非限定的な例を、以下に掲載する。

上記の配列は、N末端シグナルペプチド、MuV FエクトドメインおよびGCN4三量体化ドメインを含む。T4フィブリチン三量体化ドメインなどの代替的三量体化ドメインを使用できることは、理解されるだろう。加えて、上記の配列の多くは、F1サブユニットとF2サブユニットとを分離するネイティブフューリン切断部位を除去するためのGGGリンカーを含む。GSG、GGSまたはSGGなどの代替的グリシンリンカーも使用することができる。加えて、いずれかの配列において、GGGリンカーの代わりにネイティブフューリン切断部位を含めることもできる。N末端シグナルペプチドが細胞内プロセシング中に除去され、精製タンパク質中に存在しないことは、理解されるだろう。加えて、上記の配列のいずれかのMuV Fエクトドメインを完全長MuV Fタンパク質に含めることで、例えばmRNA免疫処置などのための、膜固定型の融合前MuV Fタンパク質を提供することもできる。

MuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインに連結された、融合前コンフォメーションでの安定化のためのアミノ酸置換を持つMuV Fエクトドメインを含有する配列の非限定的な例を、以下に掲載する。

上記の配列は、N末端シグナルペプチドおよびMuV Fエクトドメインを、GCN4三量体化ドメイン、T4フィブリチン三量体化ドメイン、ペプチド切断部位（例えばトロンビン）、HISタグ、Strepタグ、ならびにセグメント間のさまざまなリンカー残基などといった、他のさまざまな要素と組み合わせて含む。精製された形態のこれらのタンパク質は、典型的には、ペプチド切断によって除去されるN末端シグナルペプチドおよびC末端残基を欠く。

B. 組換えMeV Fエクトドメイン三量体
融合前コンフォメーションで安定化するようにネイティブ型から（例えば1つまたは複数のアミノ酸置換の導入によって）修飾された組換えMeV Fエクトドメイン三量体が、本明細書において開示される。実施例で述べるように、本開示のMeV Fエクトドメイン三量体の態様は、最適化された溶解性、安定性、発現および免疫原性を求めて、構造に基づくデザインを複数ラウンド行うことによって選択された。組換えMeV Fエクトドメイン三量体は、MeVに対する免疫応答を脊椎動物（ヒトなど）において誘導するのに有用である。例示的な態様は、融合前コンフォメーションで安定化していない対応するMeV Fエクトドメイン三量体と比較して、動物モデルにおいて、優れた免疫応答を生じさせることが示される。

いくつかの態様において、免疫原は、MeV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させる1つまたは複数のアミノ酸の置換または欠失を含むプロトマーを含む組換えMeV Fエクトドメイン三量体を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置48および284におけるシステイン置換（例えばR48CおよびA284C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置90および225におけるシステイン置換（例えばA90CおよびI225C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置141および270におけるシステイン置換（例えばM141CおよびT270C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置165および171におけるシステイン置換（例えばR165CおよびM171C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置173および245におけるシステイン置換（例えばL173CおよびV245C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置175および241におけるシステイン置換（例えばV175CおよびD241C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置212および236におけるシステイン置換（例えばE212CおよびY236C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置216および233におけるシステイン置換（例えばL216CおよびA233C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置219および224におけるシステイン置換（例えばP219CおよびP224C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置99および117におけるシステイン置換（例えばR99CおよびV117C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置100および117におけるシステイン置換（例えばP100CおよびV117C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置101および117におけるシステイン置換（例えばV101CおよびV117C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置102および117におけるシステイン置換（例えばQ102CおよびV117C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置103および117におけるシステイン置換（例えばS103CおよびV117C置換）を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置165および171（例えばR165CおよびM171C置換）ならびに位置141および270（例えばM141CおよびT270C置換）におけるシステイン置換を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置165および171（例えばR165CおよびM171C置換）ならびに位置212および236（例えばE212CおよびY236C置換）におけるシステイン置換を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために非天然プロトマー内ジスルフィド結合を形成する、MeV F位置165および171（例えばR165CおよびM171C置換）ならびに位置48および284（例えばR48CおよびA284C置換）におけるシステイン置換を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために、MeV F位置175にフェニルアラニン（例えばV175F置換）を含む。このフェニルアラニン置換は、組換えMeV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させるための本開示のシステイン置換のいずれかまたはMeV F位置194におけるプロリン置換と組み合わせることができる。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、融合前コンフォメーションでの安定化のために、MeV F位置194にプロリン置換（例えばS194P置換）を含む。このプロリン置換は、組換えMeV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させるための本開示のシステイン置換のいずれかと組み合わせることができる。

上記の組換えMeV Fタンパク質はいずれも、F1ポリペプチドとF2ポリペプチドの間のプロテアーゼ切断部位を排除して「単鎖」組換えFタンパク質を生成させるための修飾を、さらに含むことができる。例えば、上記組換えMeV Fタンパク質はいずれも、MeV F位置111～113の欠失およびペプチドリンカーで融合された位置110と114を、含むことができる。この修飾により、F2/F1フューリン切断部位は除去され、融合ペプチドの第1残基（これは疎水性である）も除去された。F2とF1エクトドメインとを融合し、融合前コンフォメーションへのFエクトドメインのフォールディングを可能にする適切なペプチドリンカーは、いずれも使用しうる。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、グリシン、セリンまたはグリシン-セリンペプチドリンカーである。いくつかの態様において、ペプチドリンカーはGly-Gly-Glyリンカーである。

非限定的な一例では、非天然ジスルフィド結合を形成させるためのR165CおよびM171C置換ならびにMeV F位置111～113の欠失およびそれに伴いGly-Gly-Glyペプチドリンカーで融合された位置110と114を持つプロトマーを含む、組換えMeV Fエクトドメイン三量体が提供される。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメインのプロトマーは、融合前コンフォメーションの安定化を増進するために、または他の目的で、例えば溶解性を増大させるか、もしくは不要な免疫応答を低減するために、1つまたは複数のさらなるアミノ酸置換を含むことができる。

上に列挙した非ネイティブジスルフィド結合は、MeV Fエクトドメインの膜遠位部分を融合前コンフォメーションで安定化させる。これらの変異はいずれも、例えばエクトドメインの三量体化を増進するための、MeV Fエクトドメインの膜近位部分（例えばステム）の修飾と組み合わせることができる。

いくつかの態様において、プロトマー中の組換えF₂ポリペプチドのN末端位置はMeV F位置24～34のうちの1つ（例えば位置24）であることができ、F₁エクトドメインのC末端位置はエクトドメインのステム領域からの位置、例えばMeV F位置472～486のうちの1つ（例えば位置486）であることができる。

非限定的な一例では、非天然ジスルフィド結合を形成させるためのR165CおよびM171C置換ならびにMeV F位置111～113の欠失およびそれに伴いGly-Gly-Glyペプチドリンカーで融合された位置110と114を持つ、MeV位置24～486を含むプロトマーを含む、組換えMeV Fエクトドメイン三量体が提供される。

融合前コンフォメーションでの安定化のためのアミノ酸置換を含むMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーの非限定的な例が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:37～43または53～55のいずれか1つの残基21～483と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含み、ここでプロトマーは、MeV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:37～43または53～55のいずれか1つの残基21～483を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体は、例えば組換えサブユニットワクチンとして使用するための可溶性タンパク質複合体である。いくつかのそのような態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、それぞれが、GCN4三量体化ドメインもしくはT4フィブリチン三量体化ドメインまたはその両方などといった三量体化ドメインへのC末端連結を含むことができる。三量体化ドメインは、三量体化と、組換えMeV Fエクトドメイン三量体の膜近位局面の安定化とを促進する。例えば組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端残基（例えば三量体のステム領域の残基）を、三量体化ドメインに直接連結するか、またはペプチドリンカーを介して間接的に三量体化ドメインに連結することができる。例示的なリンカーとしてグリシンおよびグリシン-セリンリンカーが挙げられる。可溶性組換えタンパク質の安定な三量体を促進する外因性多量体化ドメインの非限定的な例としては、GCN4ロイシンジッパー、T4フィブリチン三量体化ドメイン、肺サーファクタントタンパク質（Hoppe et al.1994 FEBS Lett 344:191-195）またはコラーゲン（McAlinden et al.2003 J Biol Chem 278:42200-42207）由来の三量体化モチーフが挙げられ、これらはいずれも、組換えMeV Fエクトドメイン三量体が融合前コンフォメーションを保つ限り、三量体化を促進するために、組換えMeV FエクトドメインのプロトマーのC末端に連結することができる。いくつかの例では組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーをMeV三量体化ドメインに連結することができ、例えば三量体中の各プロトマーは、GCN4三量体化ドメインへのC末端連結、例えばMeV F位置472～486のいずれか1つ、例えばMeV F位置486への連結を、含むことができる。具体的な例では、GCN4三量体化ドメインがアミノ酸配列

を含むか、同アミノ酸配列からなる。

非限定的な一例において、非天然ジスルフィド結合を形成させるためのR165CおよびM171C置換、MeV F位置111～113の欠失およびそれに伴いGly-Gly-Glyペプチドリンカーで融合された位置110と114、ならびにプロトマーのエクトドメイン中のC末端に連結されたGCN4三量体化ドメインを持つ、MeV位置24～486を含むプロトマーを含む、組換えMeV Fエクトドメイン三量体が提供される。

融合前コンフォメーションでの安定化のためのアミノ酸置換と三量体化ドメインへのC末端連結とを含むMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーの非限定的な例が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:37～43または53～55のいずれか1つの残基21～513と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含み、ここでプロトマーは、MeV Fエクトドメイン三量体を融合前コンフォメーションで安定化させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:37～43または53～55のいずれか1つの残基21～513を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体は、例えば弱毒化ウイルスワクチンまたはウイルス様粒子ワクチンにおいて使用するための、膜固定型タンパク質複合体であることができる。膜固定は、例えば膜貫通ドメインおよび任意で細胞質テールへの、例えばMeV F膜貫通ドメインおよび細胞質テールへの、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端連結によって達成することができる。いくつかの態様では、組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーを膜貫通ドメインに連結するために、1つまたは複数のペプチドリンカー（例えばgly-serリンカー、例えば10アミノ酸グリシン-セリンペプチドリンカーを使用することができる。本開示の態様で使用するための膜貫通ドメインの非限定的な例としては、

などのMeV F膜貫通ドメインが挙げられる。本開示の態様で使用するための膜貫通ドメインの非限定的な例としては、

などのMeV F膜貫通ドメインが挙げられる。

異なるMeV株からのネイティブMeV Fタンパク質は、そのようなタンパク質をコードする核酸配列および方法と共に公知であり、それらは、組換えMeV Fエクトドメイン三量体を生成させるために、本明細書において提供される説明を使って改変することができる。

組換えMeV Fエクトドメイン三量体は、誘導体化すること、または別の分子（例えば別のペプチドまたはタンパク質）に連結することができる。一般に、組換えMeV Fエクトドメインは、組換えMeV Fタンパク質の三量体に対する交差中和抗体への結合が誘導体化またはラベリングによる有害な影響を受けないように、誘導体化される。例えば組換えMeV Fエクトドメインは、1つまたは複数の他の分子実体、例えば担体タンパク質、抗体、異種タンパク質または検出タグに、（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合、その他によって）機能的に連結することができる。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体は、1つまたは複数のMuV HNエクトドメイン、例えば

として示されるMuV HN配列のエクトドメインに、融合される。

例えば組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、それぞれが、MuV HNエクトドメインに融合される。融合は直接的融合またはペプチドリンカーを介した融合であることができる。いくつかの態様において、MuV HNエクトドメインは、MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端に、直接的に、またはペプチドリンカーを介して間接的に、融合することができる。いくつかのそのような態様において、MuV HNエクトドメインは、MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端に融合された三量体化ドメイン（例えばGCN4またはT4フィブリチン三量体化ドメイン）のC末端に、直接的に、またはペプチドリンカーを介して間接的に、融合することができる。いくつかのそのような態様において、三量体化ドメインおよびMuV HNエクトドメインに連結されたMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:27の残基20～966として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:27の残基20～966と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体は、1つまたは複数のMeV Hエクトドメイン、例えば

として示されるH配列のエクトドメインに、融合される。

例えば組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、それぞれが、MeV Hエクトドメインに融合される。融合は直接的融合またはペプチドリンカーを介した融合であることができる。いくつかの態様において、MeV Hエクトドメインは、MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端に、直接的に、またはペプチドリンカーを介して間接的に、融合することができる。いくつかのそのような態様において、MeV Hエクトドメインは、MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーのC末端に融合された三量体化ドメイン（例えばGCN4またはT4フィブリチン三量体化ドメイン）のC末端に、直接的に、またはペプチドリンカーを介して間接的に、融合することができる。いくつかのそのような態様において、三量体化ドメインおよびMeV Hエクトドメインに連結されたMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:56の残基21～959もしくはSEQ ID NO 57の位置21～973として示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。

融合前コンフォメーションでの安定化のためのアミノ酸置換を持つMeV Fエクトドメインを含有する配列の非限定的な例を、以下に掲載する。

上記の配列は、N末端シグナルペプチド、MeV Fエクトドメイン、およびGCN4三量体化ドメインを含む。T4フィブリチン三量体化ドメインなどの代替的三量体化ドメインを使用できることは、理解されるだろう。加えて、上記の配列の多くは、F1サブユニットとF2サブユニットとを分離するネイティブフューリン切断部位を除去するためのGGGリンカーを含む。GSG、GGSまたはSGGなどの代替的グリシンリンカーも使用することができる。加えて、いずれかの配列において、GGGリンカーの代わりにネイティブフューリン切断部位を含めることもできる。N末端シグナルペプチドが細胞内プロセシング中に除去され、精製タンパク質中に存在しないことは、理解されるだろう。加えて、上記の配列のいずれかのMeV Fエクトドメインを完全長MeV Fタンパク質に含めることで、例えばmRNA免疫処置などのための、膜固定型の融合前MeV Fタンパク質を提供することもできる。

MuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインに連結された、融合前コンフォメーションでの安定化のためのアミノ酸置換を持つMeV Fエクトドメインを含有する配列の非限定的な例を、以下に掲載する。

上記の配列は、N末端シグナルペプチド、MeV Fエクトドメイン、三量体化ドメイン（GCN4および/またはT4フィブリチン）、およびMeV Hエクトドメインヘッド領域またはMuV HNエクトドメインヘッド領域を含む。MeV Fエクトドメイン配列は、F1サブユニットとF2サブユニットとを分離するネイティブフューリン切断部位を除去するためのGGGリンカーを含む。GSG、GGSまたはSGGなどの代替的グリシンリンカーも使用することができる。加えて、いずれかの配列において、GGGリンカーの代わりにネイティブフューリン切断部位を含めることもできる。N末端シグナルペプチドが細胞内プロセシング中に除去され、精製タンパク質中に存在しないことは、理解されるだろう。

C. MuV HNおよびMuV Hの多量体
いくつかの態様では、MuV HNエクトドメインおよび/またはMeV Hエクトドメインの多量体を含む免疫原が提供される。HエクトドメインまたはHNエクトドメインは、エクトドメインヘッドを含むか、またはエクトドメインのストークおよびヘッドを含むことができる。

いくつかの態様において、免疫原は、融合タンパク質の三量体を含み、各融合タンパク質は、1つまたは複数のMuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインと三量体化ドメイン（例えばGCN4三量体化ドメイン、T4フィブリチン三量体化ドメイン、またはT4フィブリチン三量体化ドメインに融合されたGCN4三量体化ドメイン）とを含む。

いくつかの態様において、融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、三量体化ドメイン（例えばGCN4三量体化ドメイン、T4フィブリチン三量体化ドメイン、またはT4フィブリチン三量体化ドメインに融合されたGCN4三量体化ドメイン）および1つまたは複数（例えば1つ、2つまたは3つ）のMuV HNエクトドメインまたはMev Hエクトドメインを含む。三量体化ドメインは相互作用することで三量体を形成する。いくつかの態様では、エクトドメインのフラグメントが含まれ、例えばMuV HNエクトドメインのヘッド領域またはMeV Hエクトドメインのヘッド領域を、三量体化ドメインに、任意でペプチドリンカーによって、融合することができる。いくつかの態様において、三量体中の融合タンパク質は、SEQ ID NO:58の残基24～510もしくはSEQ ID NO:59の残基24～496として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:58の残基25～510もしくはSEQ ID NO:59の残基25～496のいずれか1つと少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの態様において、融合タンパク質は、N末端からC末端に向かって、1つまたは複数（例えば1つ、2つまたは3つ）のMuV HNエクトドメインまたはMev Hエクトドメイン、三量体化ドメイン（例えばGCN4三量体化ドメイン、T4フィブリチン三量体化ドメイン、またはT4フィブリチン三量体化ドメインに融合されたGCN4三量体化ドメイン）、および1つまたは複数（例えば1つ、2つまたは3つ）のMuV HNエクトドメインまたはMev Hエクトドメインを含む。三量体化ドメインは相互作用することで三量体を形成する。いくつかの態様では、エクトドメインのフラグメントが含まれ、例えばMuV HNエクトドメインのヘッド領域またはMeV Hエクトドメインのヘッド領域を、三量体化ドメインに、任意でペプチドリンカーによって、融合することができる。いくつかの態様において、三量体中の融合タンパク質は、SEQ ID NO:82の残基22～950、SEQ ID NO:83の残基25～985、SEQ ID NO:84の残基22～948もしくはSEQ ID NO:85の残基22～981として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:82の残基22～950、SEQ ID NO:83の残基25～985、SEQ ID NO:84の残基22～948もしくはSEQ ID NO:85の残基22～981のいずれか1つと少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの態様において、多量体はMeV Hエクトドメインヘッド領域の二量体である。MeV Hエクトドメインヘッド領域は、哺乳動物細胞中で発現させることができ、生理学的溶液中で自発的に二量体を形成する。次に、この二量体を精製し、免疫原として使用することができる。いくつかの態様において、二量体のサブユニットは、SEQ ID NO:60の残基22～459として示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:60の残基22～459と少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの態様において、多量体は、MeV Hエクトドメインのストーク領域およびヘッド領域の二量体である。MeV Hエクトドメインのストーク領域およびヘッド領域は、哺乳動物細胞中で発現させることができ、生理学的溶液中で自発的に二量体を形成する。次に、この二量体を精製し、免疫原として使用することができる。いくつかの態様において、二量体のサブユニットは、MeV H位置59～197のいずれか1つからMeV H位置617まで（例えばMeV H位置59～67のいずれか1つからMeV H位置617まで、例えば位置59～617、62～617、60～617または67～617）のアミノ酸配列を含むか、または同アミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、二量体のサブユニットは、SEQ ID NO:86の残基22～580、SEQ ID NO:87の残基22～577、SEQ ID NO:88の残基22～579もしくはSEQ ID NO:89の残基22～572として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:86の残基22～580、SEQ ID NO:87の残基22～577、SEQ ID NO:88の残基22～579もしくはSEQ ID NO:89の残基22～572と少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの態様において、多量体はMuV HNエクトドメインヘッド領域の二量体である。いくつかの態様において、二量体のサブユニットは、SEQ ID NO:30として示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:30と少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの態様において、多量体は、MuV Hエクトドメインのストーク領域およびヘッド領域の二量体である。いくつかの態様において、二量体のサブユニットは、MuV H位置54～130のいずれか1つからMuV HN位置582まで（例えばMuV H位置54～63のいずれか1つからMuV HN位置582まで、例えば位置54～582、61～582、63～582または55～582）のアミノ酸配列を含むか、または同アミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、二量体のサブユニットは、SEQ ID NO:90の残基22～550、SEQ ID NO:91の残基22～543、SEQ ID NO:92の残基22～541もしくはSEQ ID NO:93の残基22～549として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:90の残基22～550、SEQ ID NO:91の残基22～543、SEQ ID NO:92の残基22～541もしくはSEQ ID NO:93の残基22～549と少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなる。

D. 追加説明
組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体中のプロトマーは、組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体が融合前コンフォメーションで安定化したままであり、免疫原性を保つ限り、上述したものに加えて、アミノ酸の置換、欠失もしくは挿入、グリコシル化および/または無関係なタンパク質（例えばタンパク質タグ）への共有結合的連結などといった、ネイティブMuV FまたはMeV F配列の修飾を含むことができる。さらに、異種MuV HNエクトドメインもしくはMeV Hエクトドメイン、またはMuV HNエクトドメインもしくはMeV Hエクトドメインの多量体を含む態様において、HNまたはHエクトドメインは、HNまたはHエクトドメインが免疫原性を保つ限り、アミノ酸の置換、欠失もしくは挿入、グリコシル化および/または無関係なタンパク質（例えばタンパク質タグ）への共有結合的連結などといった、ネイティブHNまたはH配列の修飾を含むことができる。配列中のこれらの変異は天然の変異であることができ、または当業者に公知の遺伝子工学の技法を使って工学的に作出することもできる。そのような技法の例は、例えばSambrook et al.（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor,ニューヨーク,2012）およびAusubel et al.（In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons,ニューヨーク,追補（supplement）104,2013までに見いだされ、これらはどちらも参照によりそれぞれの全体が本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体中のプロトマーは、対応するネイティブMuV F配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えばいくつかの態様において、F₂ポリペプチド、F₁エクトドメイン、またはその両方は、ネイティブMuV F配列と比較して、20個まで（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19個まで）のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を含むことができる。

いくつかの態様において、組換えMeV Fエクトドメイン三量体中のプロトマーは、対応するネイティブMeV F配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えばいくつかの態様において、F₂ポリペプチド、F₁エクトドメイン、またはその両方は、ネイティブMeV F配列と比較して、20個まで（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19個まで）のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を含むことができる。

いくつかの態様において、MuV HNエクトドメインは、対応するネイティブMuV HNエクトドメイン配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えばいくつかの態様において、MuV HNエクトドメインは、ネイティブMuV HNエクトドメイン配列と比較して、20個まで（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19個まで）のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を含む。

いくつかの態様において、MeV Hエクトドメインは、対応するネイティブMeV Hエクトドメイン配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えばいくつかの態様において、MeV Hエクトドメインは、ネイティブMeV Hエクトドメイン配列と比較して、20個まで（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18または19個まで）のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を含む。

最も単純な修飾は、1つまたは複数のアミノ酸による類似の生化学的性質を有するアミノ酸の置換、例えば保存的アミノ酸置換を伴う。そのような置換は、結果として生じるタンパク質の活性にごくわずかな影響しか有しない可能性が高い。

いくつかの態様では、組換えMeV Fエクトドメイン三量体またはMuV Fエクトドメイン三量体中のプロトマーを、その一端において、他の無関係な配列（例えば非MuV FもしくはMeV Fタンパク質配列、非ウイルスエンベロープ、または非ウイルスタンパク質配列）と接合させることができる。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくはMeV Fエクトドメイン三量体、またはこれらのプロトマーと異種タンパク質、例えばMuV HNエクトドメインもしくはMeV Hエクトドメインとの融合物は、水性溶液中で可溶である。いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体、MeV Fエクトドメイン三量体、または異種タンパク質、例えばMuV HNエクトドメインもしくはMeV Hエクトドメインとの対応する融合物は、室温（例えば摂氏20～22度）の水性溶液（例えばリン酸緩衝食塩水（pH7.4）または350mM NaCl（pH7.0））に、少なくとも0.5mg/ml（例えば少なくとも1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/mlまたは少なくとも5.0mg/ml）の濃度まで溶解し、少なくとも12時間（例えば少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも1ヶ月間、またはそれより長い期間）は溶解したままである。一態様において、リン酸緩衝食塩水は、pH7.4で、NaCl（137mM）、KCl（2.7mM）、Na₂HPO₄（10mM）、KH₂PO₄（1.8mM）を含む。いくつかの態様において、リン酸緩衝食塩水はCaCl₂（1mM）およびMgCl₂（0.5mM）をさらに含む。当業者は、タンパク質が経時的に溶解状態のままであるかどうかを決定する方法に精通している。例えば、標準的方法を使って水性溶液に溶解しているタンパク質の濃度を経時的に試験することができる。

いくつかの態様において、免疫原は、実質的に融合前コンフォメーションにあって、融合後コンフォメーションのMuV Fエクトドメイン三量体および/またはMeV Fエクトドメイン三量体は限られているか存在しない、可溶性三量体の均一な集団として提供される。MeV Fエクトドメイン三量体またはMuV Fエクトドメイン三量体のコンフォメーションは、例えばネガティブ染色電子顕微鏡法および/または融合前もしくは融合後特異的抗体による特異的結合によって、検出することができる。いくつかの態様において、均一な集団中の組換えMuV Fエクトドメイン三量体またはMeV Fエクトドメイン三量体の少なくとも約95％（例えばMuVまたはMeV Fタンパク質の少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％または99.9％）は、融合前コンフォメーションで安定化している。

いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体またはMeV Fエクトドメイン三量体は、リン酸緩衝食塩水中、50℃で1時間のインキュベーション後に、融合前特異的抗体に対する特異的結合を保っている。いくつかの態様において、組換えMuV Fエクトドメイン三量体またはMeV Fエクトドメイン三量体は、リン酸緩衝食塩水中、4℃で6ヶ月のインキュベーション後に、融合前特異的抗体に対する特異的結合を保っている。

一定の態様では、当技術分野において公知であり容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、本明細書において提供される免疫原を、さらに修飾してもよい。免疫原の誘導体化に適した部分として水溶性ポリマーが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（propropylene）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（prolypropylene）オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造上の利点を有しうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐型であっても非分岐型であってもよい。抗体に取り付けられるポリマーの数はさまざまであってよく、2つ以上のポリマーが取り付けられる場合、それらは同じ分子または異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/またはタイプは、例えば限定するわけではないが、改良または改変しようとする免疫原の特定の性質または機能、その免疫原誘導体が所定の条件下で治療に使用される予定であるかどうかなどといった、考慮事項に基づいて決定することができる。

本明細書において提供される組換えMuV Fエクトドメイン三量体またはMeV Fエクトドメイン三量体またはMuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインを含む配列のいくつかは、プロテアーゼ切断部位（例えばトロンビン部位）、タンパク質タグ（例えばHisタグ、StrepタグII、Aviタグなど）およびシグナルペプチドの配列を含み、そのような配列は、治療的使用のために、組換えMuV Fエクトドメイン三量体またはMeV Fエクトドメイン三量体またはMuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインを含む単離された免疫原からは除去することができる。

E. タンパク質ナノ粒子
いくつかの態様において、本開示の組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくは組換えMeV Fエクトドメイン三量体、またはMuV HNもしくはMeV H多量体、またはそれらのキメラのうちの1つまたは複数を含むタンパク質ナノ粒子が提供される。

いくつかの態様において、タンパク質ナノ粒子は、参照により本明細書に組み入れられるMarcandalli et al.「Induction of potent neutralizing antibody responses by a designed protein nanoparticle vaccine for respiratory syncytial virus」Cell,176（6）:1420-1431,2019記載の二成分自己集合性ナノ粒子プラットフォーム上にディスプレイされたMeV Fエクトドメイン三量体またはMuV Fエクトドメイン三量体を含む。

加えて、ナノ粒子の非限定的な例としては、フェリチンナノ粒子、エンカプスリンナノ粒子、硫黄オキシダーゼ/レダクターゼ（SOR）ナノ粒子、およびルマジンシンターゼナノ粒子が挙げられ、これらは、それぞれ、フェリチンタンパク質、エンカプスリンタンパク質、SORタンパク質およびルマジンシンターゼを含む単量体サブユニットの集合体で構成される。そのようなタンパク質ナノ粒子を構築するには、組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくは組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットを、タンパク質ナノ粒子のサブユニット（例えばフェリチンタンパク質、エンカプスリンタンパク質、SORタンパク質、またはルマジンシンターゼタンパク質）に連結し、細胞中、適当な条件下で発現させる。融合タンパク質は自己集合してナノ粒子になり、精製することができる。

いくつかの態様では、本開示の組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくは組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットを、フェリチンサブユニットに連結することで、フェリチンナノ粒子を構築することができる。フェリチンナノ粒子および免疫処置のための（例えばインフルエンザ抗原に対する免疫処置のための）それらの使用は、当技術分野において開示されている（例えば参照によりその全体が本明細書に組み入れられるKanekiyo et al.,Nature,499:102-106,2013参照）。球状のフェリチンナノ粒子は、およそ17～20kDaの分子量を有するポリペプチドである単量体サブユニットでできている。これらの単量体サブユニットタンパク質は、生産後に自己集合して、球状のフェリチンタンパク質になる。したがって球状のフェリチンは24個の単量体サブユニットタンパク質を含み、432対称性を有するキャプシド様構造を有する。フェリチンナノ粒子を構築する方法は本明細書においてさらに説明される（例えば参照によりその全体が本明細書に組み入れられるZhang,Int.J.Mol.Sci.,12:5406-5421,2011参照）。そのような単量体フェリチンサブユニットの1つのアミノ酸配列の例は、

で表される。

具体例において、フェリチンポリペプチドは大腸菌（E.coli）フェリチン、ピロリ菌（Helicobacter pylori）フェリチン、ヒト軽鎖フェリチン、ウシガエルフェリチン、またはそれらのハイブリッド、例えば大腸菌-ヒトハイブリッドフェリチン、大腸菌-ウシガエルハイブリッドフェリチン、またはヒト-ウシガエルハイブリッドフェリチンである。組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体を含むフェリチンナノ粒子の作製に使用するためのフェリチンポリペプチドの例示的アミノ酸配列およびフェリチンポリペプチドをコードする核酸配列は、GENBANK（登録商標）、例えばアクセッション番号ZP＿03085328、ZP＿06990637、EJB64322.1、AAA35832、NP＿000137 AAA49532、AAA49525、AAA49524およびAAA49523に見いだすことができ、2015年4月10日時点で利用可能なこれらの配列は特に、参照によりそれぞれの全体が本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーは、SEQ ID NO:45として示されるアミノ酸配列と少なくとも80％（例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも97％）同一であるアミノ酸配列を含むフェリチンサブユニットに連結することができる。

いくつかの態様では、本開示の組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくは組換えMuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットを、ルマジンシンターゼンサブユニットに連結することで、ルマジンシンターゼナノ粒子を構築することができる。球状のルマジンシンターゼナノ粒子は、単量体サブユニットでできており、そのようなルマジンシンターゼサブユニットの1つの配列の例は、

として示されるアミノ酸配列として提供される。

いくつかの態様において、本開示の組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくは組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットは、SEQ ID NO:46として示されるアミノ酸配列と少なくとも80％（例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも97％）同一であるアミノ酸配列を含むルマジンシンターゼサブユニットに連結することができる。

いくつかの態様では、本開示の組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくは組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットを、エンカプスリンナノ粒子サブユニットに連結することで、エンカプスリンナノ粒子を構築することができる。球状のエンカプスリンナノ粒子は、単量体サブユニットでできており、そのようなエンカプスリンナノ粒子サブユニットの1つの配列の例は、

として示されるアミノ酸配列として提供される。

いくつかの態様において、本開示の組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくは組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットは、SEQ ID NO:47として示されるアミノ酸配列と少なくとも80％（例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも97％）同一であるアミノ酸配列を含むエンカプスリンサブユニットに連結することができる。

エンカプスリンタンパク質は、リノシン（linocin）様タンパク質とも呼ばれる保存された細菌タンパク質ファミリーであり、酵素をパッケージングするための最小コンパートメントとして機能する大きなタンパク質集合体を形成する。エンカプスリン集合体は、およそ30kDaの分子量を有するポリペプチドである単量体サブユニットでできている。この単量体サブユニットは生産後に自己集合して、60個の、または場合によっては180個の、単量体サブユニットを含む球状のエンカプスリン集合体となる。エンカプスリンナノ粒子を構築する方法はさらに記載されている（例えば参照によりその全体が本明細書に組み入れられるSutter et al.,Nature Struct.and Mol.Biol.,15:939-947,2008参照）。具体的な例では、エンカプスリンポリペプチドが細菌エンカプスリン、例えばテルモトガ・マリティム（Thermotoga maritime）またはパイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）またはロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）またはミキソコッカス・ザンサス（Myxococcus xanthus）のエンカプスリンである。

いくつかの態様において、本開示の組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくは組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットを、硫黄オキシダーゼ/レダクターゼ（SOR）サブユニットに連結することで、組換えSORナノ粒子を構築することができる。いくつかの態様において、SORサブユニットは、

として示されるアミノ酸配列を含むことができる。

いくつかの態様において、本開示の組換えMuV Fエクトドメイン三量体もしくは組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットは、SEQ ID NO:48として示されるアミノ酸配列と少なくとも80％（例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも97％）同一であるアミノ酸配列を含むSORサブユニットに連結することができる。

SORタンパク質は、24サブユニットのタンパク質集合体を形成する微生物タンパク質（例えば好熱好酸性古細菌アシディアヌス・アムビバレンス（Acidianus ambivalens）由来である。SORナノ粒子を構築する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるUrich et al.,Science,311:996-1000,2006に記載されている。SORナノ粒子の作製に使用するためのSORタンパク質のアミノ酸配列の例は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるUrich et al.,Science,311:996-1000,2006に示されている。

生産が目的の場合、ナノ粒子サブユニットに連結された、組換えMuV Fエクトドメインもしくは組換えMeV Fエクトドメイン、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットは、細胞内プロセシング中に切断されるN末端シグナルペプチドを含むことができる。例えば、タンパク質ナノ粒子サブユニットに連結された組換えMuV Fエクトドメインプロトマーまたは組換えMeV Fエクトドメインプロトマーは、例えばネイティブMuVまたはMeV Fシグナルペプチドを含むシグナルペプチドを、そのN末端に含むことができる。

タンパク質ナノ粒子は適当な細胞（例えばHEK293 Freestyle細胞）において発現させることができ、融合タンパク質は、ナノ粒子に自己集合した状態で、細胞から分泌される。ナノ粒子は、公知の技法を使って、例えば二、三の異なるクロマトグラフィー手法、例えばMono Q（アニオン交換）とそれに続くサイズ排除（SUPEROSE（登録商標）6）クロマトグラフィーなどによって、精製することができる。

融合タンパク質が、フェリチン、エンカプスリン、SORまたはルマジンシンターゼタンパク質の単量体サブユニットポリペプチドの完全長配列を含む必要はない。単量体サブユニットポリペプチドの一部分または領域であっても、その部分が、単量体サブユニットが球状のタンパク質へと自己集合するのを指示するアミノ酸配列を含む限り、利用することができる。

II. ポリヌクレオチドおよび発現
本開示の免疫原のいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供される。例えば融合前コンフォメーションで安定化したMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、融合前コンフォメーションで安定化したMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、MuV HNもしくはMeV Hエクトドメインに連結されたこれらのプロトマーのうちの1つのキメラ、または組換えMuVもしくはMeV Fエクトドメインを含有する自己集合性タンパク質ナノ粒子のサブユニットをコードするポリヌクレオチド。これらのポリヌクレオチドは、DNA、cDNAおよびRNA配列を含み、これにはDNA、cDNAおよびRNA配列を含むベクター、例えば免疫処置に使用されるDNAまたはRNAベクターが含まれる。機能的に等価なさまざまな核酸、例えば配列は異なるが同じタンパク質配列をコードする核酸、またはその核酸配列を含むコンジュゲートもしくは融合タンパク質をコードする核酸などを構築するために、遺伝暗号を使用することができる。

完全長MeV Fタンパク質をコードする例示的核酸配列は、SEQ ID NO:94:

として提供される。

完全長MuV Fタンパク質をコードする例示的核酸配列は、SEQ ID NO:95:

として提供される。

完全長MeV Hタンパク質をコードする例示的核酸配列は、SEQ ID NO:96:

として提供される。

完全長MuV HNタンパク質をコードする例示的核酸配列は、SEQ ID NO:97:

として提供される。

これらの例示的核酸配列（または対応するRNA配列）は、本明細書において提供される免疫原のいずれかをコードするように修飾することができる。

いくつかの態様において、核酸分子は、適当な細胞中で発現させた場合に、対応する三量体または多量体へとに自己集合することができるFエクトドメイン三量体のプロトマーまたはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットにプロセシングされる、MuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMeV Fエクトドメイン三量体のプロモーター、またはそのようなプロトマーとMuV HNもしくはMeV Hエクトドメインとのキメラ、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットの前駆体をコードする。例えば核酸分子は、細胞の分泌系に入るためのN末端シグナル配列であって、細胞での組換えFエクトドメインのプロセシング中にタンパク質分解的に切断されるものを含む、MuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMeV Fエクトドメイン三量体のプロモーターをコードすることができる。

いくつかの態様において、核酸分子は、適当な細胞中で発現させた場合に、F₁エクトドメインに連結されたF₂ポリペプチドを含むMuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMeV Fエクトドメイン三量体のプロモーターにプロセシングされる、F₀ポリペプチドをコードし、ここで、組換えF₂-F₁エクトドメインプロトマーは、本明細書記載の融合前安定化修飾のうちのいずれかを含み、任意で、GCN4三量体化ドメインおよび/またはT4フィブリチン三量体化ドメインなどの三量体化ドメインに連結することができる。

いくつかの態様において、核酸分子は、適当な細胞中で発現させた場合に、F₁膜貫通およびサイトゾルテールを含むF₁ポリペプチドに連結されたF₂ポリペプチドを含む、MuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体のプロモーターにプロセシングされる、完全長F₀ポリペプチドをコードし、ここで、組換えF₂-F₁エクトドメインプロトマーは、本明細書記載の融合前安定化修飾のうちのいずれかを含む。

例示的な核酸はクローニング技法によって調製することができる。適当なクローニング技法およびシーケンシング技法の例、ならびに多くのクローニング作業について当業者を手引きするのに十分な手順書は公知である（例えばSambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor,ニューヨーク,2012）およびAusubel et al.（In Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons,ニューヨーク,追補104,2013まで参照）。

核酸は増幅法によって調製することもできる。増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写に基づく増幅系（transcription-based amplification system: TAS）、自己持続性配列複製系（self-sustained sequence replication system:3SR）が挙げられる。多種多様なクローニング方法、宿主細胞およびインビトロ増幅法が当業者には周知である。

MuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーまたはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットをコードするポリヌクレオチドには、ベクター（例えば発現ベクター）に組み入れられるか、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスに組み入れられるか、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み入れられる組換えDNA、または他の配列には依存しない別個の分子（例えばcDNA）として存在する組換えDNAを、含めることができる。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはどちらかのヌクレオチドの修飾型であることができる。この用語は一本鎖型および二本鎖型のDNAを包含する。

MuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMeV Fエクトドメイン三量体のプロモーター、またはそのようなプロトマーとMuV HNもしくはMeV Hエクトドメインとのキメラ、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列は、発現制御配列に機能的に連結させることができる。コード配列に機能的に連結された発現制御配列は、その発現制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートされる。発現制御配列には、例えば適当なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわちATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、mRNAの適正な翻訳を可能にするための当該遺伝子の正しい読み枠の維持、および停止コドンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。

MuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMeV Fエクトドメイン三量体のプロモーター、またはそのようなプロトマーとMuV HNもしくはMeV Hエクトドメインとのキメラ、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットをコードするDNA配列は、適切な宿主細胞へのDNA移入により、インビトロで発現させることができる。細胞は原核細胞または真核細胞でありうる。この用語は、対象宿主細胞の任意の子孫も包含する。複製中に起こる変異が存在しうるので、すべての子孫が親細胞と同一であるとは限らないことは理解される。外来DNAが宿主中に継続的に維持されることを意味する安定な移入の方法は、当技術分野において公知である。

宿主としては、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物である生物を挙げることができる。原核生物中で真核生物配列またはウイルス配列を有するDNA配列を発現させる方法は当技術分野において周知である。適切な宿主細胞の非限定的な例として、細菌、古細菌、昆虫、真菌（例えば酵母）、植物および動物細胞（例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）が挙げられる。有用な例示的細胞として、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、SF9細胞、C129細胞、293細胞、ニューロスポラ（Neurospora）、および不死化された骨髄系およびリンパ系の哺乳動物細胞胞株が挙げられる。培養下の哺乳動物細胞を増殖させるための技法は周知である（例えばHelgason and Miller編,2012,Basic Cell Culture Protocols（Methods in Molecular Biology）,第4版,Humana Press参照）。よく使用される哺乳動物宿主細胞株の例は、VEROおよびHeLa細胞、CHO細胞、ならびにWI38、BHKおよびCOS細胞株であるが、より高い発現量、所望のグリコシル化パターンまたは他の特徴が得られるように設計された細胞などの細胞株を使用してもよい。いくつかの態様において、宿主細胞には、HEK293細胞またはその派生物、例えばGnTI^-/-細胞（ATCC（登録商標）番号CRL-3022）、またはHEK-293F細胞が含まれる。

組換えDNAによる宿主細胞の形質転換は従来の技法によって実行することができる。宿主が原核宿主（限定するわけではないが大腸菌など）であるいくつかの態様では、DNA取込み能を有するコンピテント細胞を、指数増殖期後に収穫した後、CaCl₂で処理した細胞から調製することができる。代替的にMgCl₂またはRbClを使用することもできる。形質転換は、所望であれば、宿主細胞のプロトプラストを形成させてから実施するか、またはエレクトロポレーションによって実施することもできる。

宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈殿法などのDNAトランスフェクション法、マイクロインジェクションなどの従来の機械的手順、エレクトロポレーション、リポソームに封入されたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターを使用することができる。真核細胞は、本開示の抗原をコードするポリヌクレオチド配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能表現型をコードする第2の外来DNA分子とで、共形質転換することもできる。別の方法は、真核生物ウイルスベクター、例えばシミアンウイルス40（SV40）またはウシパピローマウイルスを使って、真核細胞を一過性に感染させまたは形質転換し、タンパク質を発現させることである（例えばViral Expression Vectors,Springer press,Muzyczka編,2011参照）。COS、CHO、HeLaおよび骨髄腫細胞株などの高等真核細胞を含む細胞においてタンパク質を生産するのに役立つプラスミドおよびベクターなどの適当な発現系。

非限定的な一例において、本開示の免疫原は、pVRC8400ベクター（参照により本明細書に組み入れられるBarouch et al.,J.Virol.,79,8828-8834,2005に記載）を使って発現される。

本開示の免疫原をコードする核酸には、その生物学的活性を減じることなく、修飾を加えることができる。そのような修飾は、クローニング、発現または融合タンパク質へのターゲティング分子の組み入れを容易にするために施すことができる。例示的な修飾として、終止コドン、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニン、好都合な位置に制限部位を作り出すためにどちらか一方の末端に配される追加アミノ酸、または精製工程を助けるための追加のアミノ酸（例えばポリHis）が挙げられる。

いくつかの態様において、MuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、またはMeV Fエクトドメイン三量体のプロモーター、またはそのようなプロトマーとMuV HNもしくはMeV Hエクトドメインとのキメラ、またはMuV HNもしくはMeV H多量体のサブユニットをコードする核酸は、例えばRSV Fタンパク質について記載されているように、細胞から細胞培地へと分泌される三量体にプロトマーが自己集合する条件下で、細胞において発現させることができる（例えばPCT公開番号WO2014160463、McLellan et al.,Science,340:1113-1117,2013、McLellan et al.,Science,342:592-598,2013参照。これらの文献はそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）。そのような態様において、プロトマーはタンパク質を分泌系に入らせるリーダー配列（シグナルペプチド）を含有し、シグナルペプチドは切断され、プロトマーは三量体を形成してから、細胞培地に分泌される。培地を遠心分離して、組換えMuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体または組換えMuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体またはそれらのMuV HNもしくはMeV Hエクトドメインとのキメラを上清から精製することができる。

III. ウイルスベクター
本開示の免疫原をコードする核酸分子は、例えば宿主細胞における免疫原の発現のために、または本明細書に開示される対照の免疫処置のために、ウイルスベクターに含めることができる。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、プライム-ブーストワクチン接種の一部として対象に投与される。典型的には、そのようなウイルスベクターは、膜貫通ドメインを含有する免疫原をコードする核酸分子を含む。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、プライム-ブーストワクチン接種において使用するためのプライマーワクチンまたはブースターワクチンなどのワクチンに含まれる。

いくつかの例においてウイルスベクターは複製能を有することができる。例えばウイルスベクターは、ウイルスゲノム中に、宿主細胞におけるウイルス複製を減弱させるが完全には阻止しない変異（例えばプロトマーをコードする核酸の挿入）を有することができる。

いくつかの態様において、ウイルスベクターは気道を介して送達することができる。例えばhPIVベクター、例えばウシパラインフルエンザウイルス（BPIV）ベクター（例えばBPIV1、BPIV2またはBPIV3ベクター）またはヒトhPIVベクター（例えばhPIV3ベクター）、メタニューモウイルス（MPV）ベクター、センダイウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルス（NCDV（ベクター）、流行性耳下腺炎ウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、または他のパラミクソウイルスもしくはニューモウイルスが、本開示の抗原を発現させるために使用される。

開示された抗原の発現には、その他のウイルスベクター、例えばポリオーマ、すなわちSV40（Madzak et al.,1992,J.Gen.Virol.,73:15331536）、アデノウイルス（Berkner,1992,Cur.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-6、Berliner et al.,1988,Bio Techniques,6:616-629、Gorziglia et al.,1992,J.Virol.,66:4407-4412、Quantin et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2581-2584、Rosenfeld et al.,1992,Cell,68:143-155、Wilkinson et al.,1992,Nucl.Acids Res.,20:2233-2239、Stratford-Perricaudet et al.,1990,Hum.Gene Ther.,1:241-256）、ワクシニアウイルス（Mackett et al.,1992,Biotechnology,24:495-499）、アデノ随伴ウイルス（Muzyczka,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:91-123、On et al.,1990,Gene,89:279-282）、HSVおよびEBVおよびCMVを含むヘルペスウイルス（Margolskee,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-90、Johnson et al.,1992,J.Virol.,66:29522965、Fink et al.,1992,Hum.Gene Ther.3:11-19、Breakfield et al.,1987,Mol.Neurobiol.,1:337-371、Fresse et al.,1990,Biochem.Pharmacol.,40:2189-2199）、シンドビスウイルス（H.Herweijer et al.,1995,Human Gene Therapy 6:1161-1167、米国特許第5,091,309号および同第5,2217,879号）、アルファウイルス（S.Schlesinger,1993,Trends Biotechnol.11:18-22、I.Frolov et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11371-11377）、ならびに鳥類（Brandyopadhyay et al.,1984,Mol.Cell Biol.,4:749-754、Petropouplos et al.,1992,J.Virol.,66:3391-3397）、マウス（Miller,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1-24、Miller et al.,1985,Mol.Cell Biol.,5:431-437、Sorge et al.,1984,Mol.Cell Biol.,4:1730-1737、Mann et al.,1985,J.Virol.,54:401-407）およびヒト起源（Page et al.,1990,J.Virol.,64:5370-5276、Buchschalcher et al.,1992,J.Virol.,66:2731-2739）のレトロウイルスも、利用することができる。バキュロウイルス（オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）多核多角体病（multinuclear polyhedrosis）ウイルス;AcMNPV）ベクターも当技術分野において公知であり、商業的供給源（例えばPharMingen（カリフォルニア州サンディエゴ）、Protein Sciences Corp.（コネチカット州メリデン）、Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ））から入手できる。

IV. ウイルス様粒子
いくつかの態様では、本開示の免疫原を含むウイルス様粒子（VLP）が提供される。典型的には、そのようなVLPは、膜貫通ドメインを含有する免疫原、例えばMuV Fの膜貫通ドメインとサイトゾルテールとを含有するプロトマーによる組換えMuV Fエクトドメイン三量体、またはMeV Fの膜貫通ドメインとサイトゾルテールとを含有するプロトマーによる組換えMeV Fエクトドメイン三量体を含む。VLPは、ウイルス複製に必要なウイルス成分を欠くので、著しく弱毒化された複製不能型のウイルスである。しかしVLPは、感染性ウイルス粒子上に発現されるものと類似するポリペプチド（例えば組換えMuVまたはMeV Fエクトドメイン三量体）をディスプレイすることができ、対象に投与された場合に、MuVまたはMeVに対する免疫応答を誘発することができる。例示的なウイルス様粒子およびそれらの生産方法、ならびにVLPを形成することが公知である、ヒトパピローマウイルス、HIV（Kang et al.,Biol.Chem.380:353-64（1999））、セムリキ森林ウイルス（Notka et al.,Biol.Chem.380:341-52（1999））、ヒトポリオーマウイルス（Goldmann et al.,J.Virol.73:4465-9（1999））、ロタウイルス（Jiang et al.,Vaccine 17:1005-13（1999））、パルボウイルス（Casal,Biotechnology and Applied Biochemistry,Vol 29,Part 2,pp 141-150（1999））、イヌパルボウイルス（Hurtado et al.,J.Virol.70:5422-9（1996））、E型肝炎ウイルス（Li et al.,J.Virol.71:7207-13（1997））およびニューカッスル病ウイルスを含む、いくつかのウイルスからのウイルスタンパク質。そのようなVLPの形成は任意の適切な技法によって検出することができる。培地中のVLPを検出するための適切な技法の例としては、例えば電子顕微鏡技法、動的光散乱（DLS）、選択的クロマトグラフィー分離（例えばVLPのイオン交換、疎水性相互作用および/またはサイズ排除クロマトグラフィー分離）および密度勾配遠心分離が挙げられる。

V. 免疫原性組成物
本開示の免疫原（例えば組換えMuV Fエクトドメイン三量体、組換えMeV Fエクトドメイン三量体、またはMuV HNエクトドメインもしくはMeV Hエクトドメインとの対応する融合物、またはMuV HNもしくはMeV H多量体）と、薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物も提供される。そのような組成物は、さまざまな投与様式、例えば筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内、または非経口経路によって、対象に投与することができる。いくつかの態様において、本開示の免疫原のうちの1つまたは複数を含む薬学的組成物は、免疫原性組成物である。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、Remingtons Pharmaceutical Sciences（第19版、Mack Publishing Company、ペンシルベニア州イーストン、1995）などの刊行物に、より詳しく記載されている。

したがって、本明細書記載の免疫原は、生物学的活性を保つのを助けると共に、許容される温度範囲内での貯蔵中の安定性の増加も促進するために、薬学的に許容される担体を使って製剤化することができる。潜在的担体として、生理的平衡培養培地、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルション（例えば油/水または水/油エマルション）、さまざまなタイプの湿潤剤、凍結保護添加剤もしくは安定剤、例えばタンパク質、ペプチドもしくは加水分解物（例えばアルブミン、ゼラチン）、糖類（例えばスクロース、ラクトース、ソルビトール）、アミノ酸（例えばグルタミン酸ナトリウム）、または他の保護剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。結果として得られる水性溶液はそのまま使用するためにパッケージングしてもよいし、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥調製物は、単回投与または複数回投与用に、投与に先立って無菌溶液と混合される。

製剤化された組成物、とりわけ液状組成物は、貯蔵中の分解を防止しまたは最小限に抑えるために、限定するわけではないが有効濃度（通常は≦1％w/v）のベンジルアルコール、フェノール、m-クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベンおよび/またはプロピルパラベンなどといった、静細菌剤を含有しうる。静細菌剤は一部の患者には禁忌である場合もありうるので、凍結乾燥製剤は、そのような成分を含有する溶液中に、またはそのような成分を含有しない溶液中に、再構成することができる。

本開示の免疫原性組成物は、薬学的に許容される媒体として、生理的条件に近づけるために必要な物質、例えばpH調節および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレートおよびオレイン酸トリエタノールアミンを含有することができる。

免疫原性組成物は、任意で、宿主の免疫応答を強化するためのアジュバントを含みうる。水酸化アルミニウム（例えばBrenntag Biosector（デンマーク国コペンハーゲン）から入手可能なALHYDROGEL（登録商標）、およびAmphogel（登録商標）（Wyeth Laboratories、ニュージャージー州マディソン））、フロイントのアジュバント、MPL（商標）（3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA;Corixa、インディアナ州ハミルトン）およびIL-12（Genetics Institute、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、TLRアゴニスト（例えばTLR-9アゴニスト、例えばシチジン-ホスホ-グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド（CpG-ODN）1018）などのアジュバント、およびその他多くの当技術分野において周知の適切なアジュバントを、組成物に含めることができる。適切なアジュバントは、例えばToll様受容体アゴニスト、ミョウバン、AlPO4、アルハイドロゲル、リピドAおよびそれらの誘導体または変異体、油エマルション、サポニン、中性リポソーム、ワクチンとサイトカインとを含有するリポソーム、非イオン性ブロックコポリマー、およびケモカインである。ポリオキシエチレン（POE）とポリキシルプロピレン（polyxylpropylene）（POP）とを含有する非イオン性ブロックポリマー、例えばPOE-POP-POEブロックコポリマー、MPL（商標）（3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA;Corixa、インディアナ州ハミルトン）およびIL-12（Genetics Institute、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を、アジュバントとして使用してもよい（Newman et al.,1998,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15:89-142）。これらのアジュバントは、免疫系を非特異的に刺激し、よって薬学的製品に対する免疫応答を強化するのを助けるという点で、有利である。

いくつかの例において、アジュバント製剤は、無機塩、例えばカルシウム塩またはアルミニウム（ミョウバン）塩、例えばリン酸カルシウム、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである。いくつかの態様において、本開示の免疫原は1つまたは複数のホスホセリン修飾を含み、ミョウバンアジュバントと共に使用される。いくつかの態様において、アジュバントは油と水のエマルション、例えば水中油型エマルション（例えばMF59（Novartis）またはAS03（GlaxoSmithKline）を含む。水中油型エマルションの一例は、水性担体中に、代謝可能な油、例えばスクアレン、トコール、例えばアルファ-トコフェロールなどのトコフェロール、および界面活性剤、例えばトリオレイン酸ソルビタン（Span 85）またはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Tween 80）を含む。

いくつかの例では、本開示の免疫原を、他の作用物質に対する防御応答を誘導する他の薬学的製品（例えばワクチン）と混合することが望ましい場合もありうる。例えば、本明細書記載の組換えMuV Fエクトドメイン三量体、組換えMeV Fエクトドメイン三量体、またはMuV HNエクトドメインもしくはMeV Hエクトドメインとの対応する融合物を含む組成物は、予防接種の実施に関する諮問委員会（ACIP;cdc.gov/vaccines/acip/index.html）が標的年齢群（例えばおよそ1～6ヶ月齢の乳児）について勧告している他のワクチンと同時に（典型的には別々に）または逐次的に投与することができる。したがって、本明細書記載の本開示の免疫原は、例えばB型肝炎（HepB）、ジフテリア、破傷風および百日咳（DTaP）、レンサ球菌（PCV）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）b型（Hib）、ポリオ、インフルエンザおよびロタウイルスに対するワクチンと同時にまたは逐次的に投与されうる。

いくつかの態様において、組成物は無菌組成物として提供することができる。免疫原性組成物は典型的には有効量の本開示の免疫原を含有し、従来の技法によって調製することができる。典型的には、各用量の免疫原性組成物中の免疫原の量は、著しい有害副作用を伴わずに免疫応答を誘導する量として選択される。いくつかの態様において、組成物は、対象における免疫応答の誘導に使用するための、例えば対象におけるMuVおよび/またはMeV感染の阻害に使用するための、単位剤形で提供することができる。単位剤形は、対象に投与するための適切な予め選択された単回投薬量、または2単位以上の予め選択された単位投薬量の区分されたもしくは測定された複数回分、および/または単位用量もしくはその複数回分を投与するための計量機構を含有する。

VI. 免疫応答を誘導する方法
対象においてMuVおよび/またはMeVに対する免疫応答を誘導するために、本開示の免疫原（例えば組換えMuV Fエクトドメイン三量体、組換えMeV Fエクトドメイン三量体、またはMuV HNエクトドメインもしくはMeV Hエクトドメインとの対応する融合物、MuV HNもしくはMeV H多量体、本開示の免疫原をコードする核酸分子（例えばRNA分子）、または免疫原を含むタンパク質ナノ粒子またはウイルス様粒子）を、対象に投与することができる。ある特定例において、対象はヒトである。免疫応答は、防御免疫応答、例えばその後のMuVおよび/またはMeVによる感染を阻害する応答であることができる。免疫応答の誘導は、MuVおよび/またはMeV感染ならびにそれと関連する疾病を処置または阻害するために使用することもできる。

MuVまたはMeVにばく露したためにまたはばく露する可能性があるために、MuVもしくはMeV感染症を有するかまたはMuVもしくはMeV感染症を発症するリスクがある対象を、処置のために選択することができる。本開示の免疫原の投与後に、対象を、MuVおよび/もしくはMeV感染もしくはそれと関連する症状またはその両方についてモニタリングすることができる。

本開示の治療薬および方法による処置が意図される典型的な対象には、ヒトが含まれる。いくつかの態様において、対象は、MuVおよび/またはMeV特異的抗体について血清陰性のヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、MuVおよび/またはMeV特異的抗体について血清陽性のヒト対象であり、免疫原は、対象におけるMeVおよび/またはMuVに対する免疫応答をブーストするために投与される。本開示の方法による処置の対象を同定するには、受け入れられているスクリーニング方法を使って、標的であるまたは疑いのある疾患または病態と関連するリスク因子を決定するか、または対象における既存の疾患または病態の状態を決定する。これらのスクリーニング方法としては、例えば、標的であるまたは疑いのある疾患または病態と関連しうる環境因子、家族因子、職業因子およびその他同様のリスク因子を決定するための従来の精密検査、ならびに診断方法、例えばMuVおよび/またはMeV感染を検出しおよび/または特徴づけるためのさまざまなELISAおよび他のイムノアッセイ法が挙げられる。これらのおよび他の常法により、臨床家は、本開示の方法および免疫原性組成物を使った治療を必要とする患者を選択することができる。これらの方法および原理に従い、組成物を、独立した予防もしくは処置プログラムとして、または他の処置に対する継続管理、補助的処置もしくは協調処置（coordinate treatment）として、本明細書の教示または他の従来法に従って投与することができる。

本開示の免疫原の投与の目的は予防または治療であることができる。予防的に提供する場合は、いかなる症状にも先んじて、例えば感染に先んじて、本免疫原を提供することができる。予防的投与は、その後のいかなる感染も防止しまたは改善するのに役立つ。いくつかの態様において、本方法は、MuVおよび/またはMeV感染を起こすリスクがある対象を選択する工程、および治療有効量の本開示の免疫原をその対象に投与する工程を伴うことができる。免疫原は、ウイルスへのばく露もしくはばく露疑いの後の、または感染症が実際に始まった後の、感染および/または関連する疾患症状の予期される重症度、持続時間または程度が減弱されるように、予期されるMuVおよび/またはMeVへのばく露に先立って提供することができる。本開示の免疫原の（例えばブースト免疫処置としての）予防的使用の恩恵を受ける集団として、入学時の児童（例えば5歳）および高校もしくは大学入学時または軍隊入隊時の青年（例えば15～18歳）が挙げられる。移植レシピエントも再ワクチン接種を受ける必要がある場合があり、またはHIV＋のような免疫無防備状態の小児は、妊婦を含めて、安全でないかもしれない生弱毒化ウイルスではなくタンパク質ワクチンの恩恵を受けるだろう。

治療的に提供される場合、本開示の免疫原は、MuVおよび/またはMeV感染症の症状の発生時もしくは発生後、またはMuVおよび/またはMeV感染症の診断後に提供される。MuVの複製または感染を阻害することによるMuVの処置には、対象におけるMuV感染の徴候または症状を遅延させおよび/または低減することが含まれうる。MeVの複製または感染を阻害することによるMeVの処置には、対象におけるMeV感染の徴候または症状を遅延させおよび/または低減することが含まれうる。いくつかの例において、本明細書に開示される方法を使った処置は、対象の生存期間を延ばす。

いくつかの態様において、本開示の免疫原の対象への投与は、その後、対象が野生型MuVおよび/またはMeVに感染または再感染した時に、疾患症状に対して防御的であり疾患症状を低減する免疫応答の生成を、誘発することができる。天然に循環しているウイルスは感染を引き起こす能力を依然として有しうるが、ワクチン接種の結果として、重篤な症状または生命を脅かす症状の可能性が低減していること、および野生型ウイルスによるその後の感染によって抵抗力の増強が起こりうることは考えられる。ワクチン接種後は、相同な（同じサブグループの）野生型ウイルスをインビトロおよびインビボで中和する能力を有する宿主産生血清および宿主産生分泌抗体が、検出可能なレベルで存在する。多くの場合、宿主抗体は、ワクチンサブグループではない異なるサブグループの野生型ウイルスも中和するだろう。

本明細書記載の免疫原およびその免疫原性組成物は、対象、好ましくはヒトにおいてMuVおよび/またはMeVに対する免疫応答を誘導しまたは強化するのに有効な量で、対象に提供される。本開示の免疫原の実際の投薬量は、適応症および対象特有の状態（例えば対象の年齢、大きさ、健康状態、症状の程度、感受性因子など）、投与の時間および経路、同時に投与される他の薬物または処置、ならびに対象において所望の活性または生物学的応答を誘発するための組成物に特有の薬理などといった因子に依存して、変動するだろう。投薬レジメンは、最適な予防的または治療的応答が得られるように調節することができる。

本開示の免疫原のうちの1つまたは複数を含む免疫原性組成物は、協調（coordinate）（またはプライム-ブースト）ワクチン接種プロトコールまたは組合せ製剤（combinatorial formulation）において使用することができる。一定の態様において、新規な組合せ免疫原性組成物（combinatorial immunogenic composition）および協調免疫処置プロトコール（coordinate immunization protocol）では、それぞれが抗ウイルス免疫応答、例えばMuV Fタンパク質および/またはMeV Fタンパク質に対する免疫応答を誘発することを目指す別々の免疫原または製剤を使用する。抗ウイルス免疫応答を誘発する別々の免疫原性組成物は、1回の免疫処置工程で対象に投与される多価免疫原性組成物として組み合わせるか、またはそれらを、協調（またはプライム-ブースト）免疫処置プロトコールにおいて、別々に（一価免疫原性組成物として）投与することができる。

数回のブーストを行うことができ、各ブーストは異なる本開示の免疫原であることができる。いくつかの例において、ブーストは別のブーストまたはプライムと同じ免疫原であってよい。プライムおよびブーストは、単回投与としてまたは複数回の投与として投与することができ、例えば数日、数週間または数ヶ月にわたって、対象への2回、3回、4回、5回、6回、またはそれより多くの投与を行うことができる。複数回のブースト、例えば1～5回（例えば1、2、3、4または5回のブースト）またはそれより多くのブーストを与えることもできる。一連の逐次的免疫処置では、異なる投薬量を使用することができる。例えば、初回免疫処置では比較的多量とし、次にブーストは比較的少量にする。

いくつかの態様において、ブーストは、プライムの約2、約3～8、もしくは約4週間後に、またはプライムのおよそ数ヶ月後に、投与することができる。いくつかの態様において、ブーストは、プライムの約5、約6、約7、約8、約10、約12、約18、約24ヶ月後、またはその前後に投与することができる。対象の「免疫記憶」を強化するために、定期的な追加ブーストを適当な時点で使用することもできる。選ばれたワクチン接種パラメータ、例えば製剤、用量、レジメンなどの妥当性は、免疫処置プログラムの過程で対象からの血清のアリコートを採取し、抗体価をアッセイすることによって決定することができる。加えて、対象の臨床状態を、所望の効果、例えばMuVおよび/もしくはMeV感染の阻害または疾患状態の改良（例えばウイルス量の低減）などについて、モニタリングすることができる。ワクチン接種が最適未満であることをそのようなモニタリングが示す場合は、対象に免疫原性組成物の追加用量のブースター接種を行うことができ、免疫応答の増強が予想されるように、ワクチン接種パラメータを変更することができる。

いくつかの態様において、プライム-ブースト法は、対象へのDNAプライマーおよびタンパク質ブーストワクチン接種プロトコールを含むことができる。本方法は、核酸分子またはタンパク質の2回以上の投与を含むことができる。

タンパク質治療薬の場合、典型的には、各ヒト用量は、1～1000μgのタンパク質、例えば約1μg～約100μg、例えば約1μg～約50μg、例えば約1μg、約2μg、約5μg、約10μg、約15μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μgまたは約50μgを含むだろう。

免疫原性組成物中に利用される量は、対象の集団（例えば乳児または年長者）に基づいて選択される。特定組成物についての最適量は、対象における抗体価および他の応答の観察を伴う標準的試験によって確認することができる。免疫原性組成物中の有効量の本開示の免疫原、例えば組換えMuVもしくはMeV Fエクトドメイン三量体または組換えMeV Fエクトドメイン三量体またはそのMuV HNもしくはMeV Hエクトドメインとのキメラ、ウイルスベクター、または核酸分子は、免疫応答を誘発するのに単回の投与では有効でないが、例えばプライム-ブースト投与プロトコールで、複数回投与すれば有効である量を含みうることは理解される。

本開示の免疫原を投与すると、対象の免疫系は、典型的には、ウイルスタンパク質に特異的な抗体を生産することによって免疫原性組成物に応答する。そのような応答は免疫学的有効量が対象に送達されたことを意味する。

各特定対象について、具体的投薬レジメンは、個々のニーズと免疫原性組成物の投与を施行しまたは管理する専門家の判断とに応じて、経時的に評価し、調節することができる。投薬量と投与回数は、状況に依存するだろう。例えば、成人/成体または以前のMuVおよび/もしくはMeVの感染または免疫処置によってプライミングされた者では、単回投与が十分なブースターになりうる。ナイーブな対象では、いくつかの例において、少なくとも2回の投与、例えば少なくとも3回の投与が行われるだろう。いくつかの態様では、年1回のブーストが、例えば年1回のインフルエンザワクチン接種と一緒に与えられる。

いくつかの態様において、対象の抗体応答は、有効な投薬量/免疫処置プロトコールの評価との関連において決定されるだろう。大半の例では、対象から得られた血清または血漿中の抗体価を評価すれば十分だろう。ブースター接種を行うかどうかおよび/または個体に投与される治療剤の量を変更するかどうかに関する決定は、少なくとも部分的には、抗体価レベルに基づくことができる。抗体価レベルは、例えば、MuV Fタンパク質および/またはMeV Fタンパク質などを含む抗原に結合する血清中の抗体の濃度を測定する免疫結合アッセイに基づくことができる。

有効投薬量の決定は、典型的には、動物モデル試験とその後のヒト臨床試験に基づき、対象における標的とする疾患の症状または病態の発生または重症度を有意に低減する投与プロトコール、または対象において所望の応答（例えば中和免疫応答）を誘導する投与プロトコールによって、導かれる。この点で適切なモデルには、例えばマウス、ラット、ブタ、ネコ、フェレット、非ヒト霊長類、および当技術分野において公知の他の受け入れられている動物モデル対象が含まれる。あるいは、有効投薬量はインビトロモデル（例えば免疫学的および組織病理学的アッセイ）を使って決定することができる。そのようなモデルを使用すれば、通常の計算および調節だけで、有効量の組成物（例えば所望の免疫応答を誘発しまたは標的とする疾患の1つもしくは複数の症状を緩和するのに有効な量）を投与するのに適当な濃度および用量を決定することができる。代替的態様において、有効量または有効用量の組成物は、治療目的または診断目的で、本明細書に示される疾患または病態と相関する1つまたは複数の選択された生物学的活性を単に阻害または強化するだけでもよい。

感染症を低減しまたは防止するための免疫応答を誘発する免疫原組成物の投与は、そのような感染症を排除することができるが、感染症が測定可能に減少する限り、必ずしも完全に排除するわけではない。例えば有効量の作用物質の投与は、MuVまたはMeV感染症（例えばMuVもしくはMeVによる細胞の感染によって測定されるか、またはMuVもしくはMeVに感染した対象の数もしくはパーセンテージによって測定されるもの）を、所望の量だけ、例えば少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％減少させること、またはさらには少なくとも100％減少させること（殺菌免疫（sterilizing immunity）とも呼ばれ、適切な対照との比較で、検出可能なMuVまたはMeV感染の排除または防止）ができる。

いくつかの態様において、有効量の本発明の免疫原のうちの1つまたは複数の対象への投与は、対象における中和免疫応答を誘導する。中和活性を評価するために、対象の免疫処置後に適当な時点で対象から血清を収集し、凍結し、中和試験のために保存することができる。中和活性をアッセイするための方法には、プラーク低減中和価（PRNT）アッセイ、マイクロ中和アッセイ、フローサイトメトリーベースのアッセイ、シングルサイクル感染（single-cycle infection）アッセイがあるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、血清中和活性は、MuVおよび/またはMeVシュードウイルスのパネルを使ってアッセイすることができる。

核酸投与のための1つのアプローチは、プラスミドDNA、例えば哺乳動物発現プラスミドによる直接免疫処置である。核酸コンストラクトによる免疫処置は当技術分野において周知であり、例えば米国特許第5,643,578号（細胞媒介性応答または体液性応答を誘発するために所望の抗原をコードするDNAを導入することによって脊椎動物を免疫処置する方法が記載されている）ならびに米国特許第5,593,972号および米国特許第5,817,637号（抗原をコードする核酸配列を、発現を可能にする調節配列に、機能的に連結することが記載されている）において教示されている。米国特許第5,880,103号には、免疫原性ペプチドまたは他の抗原をコードする核酸を生物に送達する方法がいくつか記載されている。それらの方法には、核酸（または合成ペプチドそのもの）のリポソーム送達、およびコレステロールとQuil A（商標）（サポニン）とを混合すると自発的に形成される30～40nmのサイズの負に帯電したケージ様構造物である免疫刺激コンストラクト、すなわちISCOM（商標）が含まれる。抗原の送達媒体としてISCOM（商標）を使用することで、トキソプラズマ症およびエプスタイン・バー・ウイルス誘導性腫瘍を含むさまざまな感染の実験モデルにおいて、防御免疫が生成している（Mowat and Donachie,Immunol.Today 12:383,1991）。ISCOM（商標）に封入されたわずか1μgという抗原の用量でも、クラスI媒介性CTL応答を生じることが見いだされている（Takahashi et al.,Nature 344:873,1990）。

いくつかの態様では、対象において本開示の免疫原を発現させるために、プラスミドDNAワクチンが使用される。例えば、MuVまたはMeVのFタンパク質に対する免疫応答を誘発するために、本開示の免疫原をコードする核酸分子を、対象に投与することができる。いくつかの態様では、pVRC8400ベクター（参照により本明細書に組み入れられるBarouch et al.,J.Virol,79,8828-8834,2005に記載されている）など、DNA免疫処置のためのプラスミドベクター上に、核酸分子を含めることができる。

免疫処置に核酸を使用するための別のアプローチでは、弱毒化ウイルス宿主（例えば弱毒化MuVまたはMeVベクター）もしくは弱毒化ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本開示の免疫原を発現させることができる。ペプチドまたはタンパク質を発現させ、それによってCTL応答を誘発するには、組換えワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス（cytogmeglovirus）、パラミクソウイルス、ニューモウイルス、または他のウイルスベクターを使用することができる。例えば、免疫処置プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は米国特許第4,722,848号に記載されている。BCG（Bacillus Calmette Guerin: カルメット・ゲラン菌）は、ペプチドを発現させるための別のベクターになる（Stover,Nature 351:456-460,1991参照）。

別の一例では、RNA免疫処置を使って、例えば脂質封入mRNA免疫処置プラットフォームで、本開示の免疫原を対象に投与することができる（例えばRoth et al.,「A Modified mRNA Vaccine Targeting Immunodominant NS Epitopes Protects Against Dengue Virus Infection in HLA Class I Transgenic Mice」,Frot Immunol.,June 21,2019,Vol.10,Article 1424、Jagger et al.,J Infect Dis,「Protective Efficacy of Nucleic Acid Vaccines Against Transmission of Zika Virus During Pregnancy in Mice」,jiz338,Jul 1,2019、Feldman et al.,「mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses of pandemic potential are immunogenic and well tolerated in healthy adults in phase 1 randomized clinical trials」,Vaccine,37 (25),3326-3334,2019、およびHasset et al.,「Optimization of Lipid Nanoparticles for Intramuscular Administration of mRNA Vaccines」,Mol Ther Nucleic Acids,15:1-11,2019参照。

一態様では、本開示のMuV FまたはMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーをコードする核酸が、細胞中に直接導入される。例えば、標準的方法によって核酸を金マイクロスフェア上に負荷し、それを、Bio-RadのHELIOS（商標）遺伝子銃などのデバイスによって、皮膚中に導入することができる。核酸は、「裸」であって、強いプロモーターの制御下にあるプラスミドからなることができる。典型的には、DNAは筋肉内に注射されるが、他の部位に直接注射することもできる。注射のための投薬量は、通常は、0.5μg/kg前後～約50mg/kg、典型的には約0.005mg/kg～約5mg/kgである（例えば米国特許第5,589,466号参照）。

別の一態様では、本開示の免疫原をコードする核酸を細胞中に直接送達するために、mRNAに基づく免疫処置プロトコールを使用することができる。いくつかの態様において、mRNAに基づく核酸ベースのワクチンは、上述したアプローチの強力な代替手段になりうる。mRNAワクチンは、宿主ゲノムへのDNA組込みに関する安全上の懸念が排除され、宿主細胞の細胞質において直接翻訳されうる。さらにまた、RNAの単純な無細胞インビトロ合成では、ウイルスベクターと関連する製造上の問題が回避される。本開示の免疫原をコードする核酸を送達するために使用することができるRNAベースのワクチン接種の2つの例示的形態として、従来の非増幅mRNA免疫処置（例えばPetsch et al.,「Protective efficacy of in vitro synthesized,specific mRNA vaccines against influenza A virus infection」,Nature biotechnology,30（12）:1210-6,2012参照）、および自己複製mRNA免疫処置（例えばGeall et al.,「Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines」,PNAS,109（36）:14604-14609,2012、Magini et al.,「Self-Amplifying mRNA Vaccines Expressing Multiple Conserved Influenza Antigens Confer Protection against Homologous and Heterosubtypic Viral Challenge」,PLoS One,11（8）:e0161193,2016、およびBrito et al.,「Self-amplifying mRNA vaccines」,Adv Genet.,89:179-233,2015）が挙げられる。

いくつかの態様において、本開示の免疫原をコードするmRNAを含む脂質ナノ粒子は、免疫応答を誘発する方法、例えばWO2017070626、US2019/0192646に記載されている方法、およびmRNA-1273ワクチンについてJackson et al.「An mRNA vaccine against SARS-CoV2-preliminary report」,N.Engl.J.Med.,383（20）:1920-1931,2020に記載されている方法において使用され、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み入れられる。WO2017070626に記載されているように、免疫原をコードするmRNAは、50mol％イオン化可能脂質、10mol％DSPC、38.5mol％コレステロールおよび1.5 mol％（PEG2000DMG）を使って、脂質ナノ粒子に製剤化することができる。さらに、免疫原をコードするmRNAは、5'UTR、3'UTRおよびポリAテールの他に、ウリジンの代わりの1-メチルプソイドウリジンおよび7mG（5'）ppp（5'）N1mpNpキャップ（酵素的）を持つ修飾mRNAであることができる。

一定の態様の特定の特徴を例証するために以下に実施例を提供するが、特許請求の範囲は例示されるこれらの特徴に限定されるべきでない。

実施例1
融合前コンフォメーションで安定化したMuV Fタンパク質およびそのMuV HNエクトドメインとの融合物
この実施例では、1つまたは複数のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化したMuV Fエクトドメイン三量体の態様を例証する。MuV HNエクトドメインに連結されたMuV Fエクトドメイン三量体が、さらに提供される。融合前安定化MuV Fエクトドメイン三量体およびMuV HNエクトドメインとの対応する融合物は、例えば対象におけるMuVに対する中和免疫応答を誘導するのに有用である。

1960年代後半になって流行性耳下腺炎含有ワクチンが導入されるまで、流行性耳下腺炎は、発熱、耳下腺炎ならびにそれほど一般的ではないが、精巣炎、髄膜炎、脳炎および難聴を特徴とする幅広い病的状態を引き起こしていた。麻疹、流行性耳下腺炎および風疹混合ワクチン（MMR）は、流行性耳下腺炎の発生率を世界中で劇的に低減させた。MMRワクチンの2回の投与は流行性耳下腺炎疾患の予防におよそ88％有効であるが、2006年以降、ワクチン接種率の高い集団内で流行性耳下腺炎疾患の症例数が世界中で再び増加しており、米国での罹患個体数は＞30,000である。要因としては、免疫の漸減、有効性の低い抗体応答、およびMMRワクチンに使用されるJeryl Lynn株と循環している野生株との間の抗原の相違などを挙げることができる。近年の米国および欧州におけるアウトブレイクを特徴づける優勢な流行性耳下腺炎遺伝子型は遺伝子型Gになっている。

本明細書に記載するとおり、構造に基づくデザインを使って、融合前コンフォメーションで安定化したMuV F糖タンパク質を工学的に作出した。流行性耳下腺炎融合糖タンパク質の2.16Å分解能での結晶構造により、融合前コンフォメーション安定化の根拠が明らかになる。流行性耳下腺炎融合前安定化F糖タンパク質または遺伝子型G流行性耳下腺炎ヘマグルチニンノイラミニダーゼ（HN）に連結された融合前安定化流行性耳下腺炎F三量体のキメラ融合糖タンパク質から、強力な交差流行性耳下腺炎遺伝子型プラーク低減中和価（PRNT）が、マウスにおいて誘発された。融合前F-HN流行性耳下腺炎キメラは、遺伝子型A、GおよびH流行性耳下腺炎ウイルスに対して、報告されているヒト防御力価より100倍高い、最も高いPRNTを誘発することができた。加えて、流行性耳下腺炎融合前FおよびHNに対するモノクローナル抗体が免疫処置マウスから単離され、それらは、ある幅の効力で、遺伝子型G流行性耳下腺炎ウイルスを中和する能力を有した。これらの融合前F特異的抗体の構造および結合分析により、4つの不連続な中和抗原部位への結合が明らかになった。工学的に作出された免疫原は、新規ワクチンとして、またはブースターワクチンとして、流行性耳下腺炎のワクチン候補である。

結果
ジスルフィド結合および膜近位コイルドコイル安定化が可溶性融合前流行性耳下腺炎F三量体を頑強に安定化し、その生産を可能にする。

C末端GCN4三量体化ドメインに連結されたMuV Fエクトドメインは、細胞内で生産させた場合、融合前コンフォメーションに自発的に移行する三量体を形成する。安定化していない組換えMuV F-GCN4は非常に不安定なので、評価（EM）の時点では分子の100％が融合後コンフォメーションに移行している。タンパク質発現量も安定化なしでは実質的に低減する。したがって、構造に基づくワクチンデザインを使って、MuV Fエクトドメインを融合前コンフォメーションで安定化させる変異を同定すると共に、F1/F2切断部位を排除することで、発現量が増加した「単鎖」MuV Fタンパク質を生産した。

サル融合前パラインフルエンザウイルス5（PIV5）F糖タンパク質の結晶構造（PDB ID 4GIP、4WSG）（Welch,B.D.et al.Proc Natl Acad Sci U S A 109,16672-16677,2012）を使って、DI、DII、DIIIおよびHRBドメインの四元アセンブリ（quaternary assembly）を形成する3つの絡み合った単量体からなる融合前流行性耳下腺炎Fタンパク質のホモロジーモデルを構築した。

MuV Fエクトドメインを融合前コンフォメーションで「ロック（lock）」するために、ジスルフィド結合およびプロリン置換の導入を含む、多重安定化（multiple stabilization）戦略を用いた。システインに変異させるMuV F中の残基の選択は、PIV5融合前F構造（PDB 4WSG）からのホモロジーデザインに基づき、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへと移行する際にコンフォメーション変化を起こすと予測されるであろう残基に基づいた。残基ペアのCベータ原子は、5オングストローム以内であり、ジスルフィド結合の形成が可能であるだろう配向にあることが確認された。全部でおよそ60種の異なる変異体をデザインし、発現させ、精製し、発現レベルについて評価し、ネガティブ染色EMによって融合前コンフォメーションについて評価した。

変異をMuV Fエクトドメイン（MuV F位置469、476または483でのC末端切断に基づく）中に導入し、C末端GCN4三量体化ドメインに連結し、その結果生じた変異体を、上述のようにスクリーニングした。エクトドメインは、F1/F2フューリン切断部位を除去するための変異も含んだ。評価する融合前安定化変異には、非天然ジスルフィド結合を形成するMuV F位置86と215、155と161、163と235、165と231、206と223、209と214、221と255のうちの1つまたは複数におけるシステイン置換、ならびにMuV F位置184のプロリン置換を含めた。関連する配列を以下に示す。図1Aに、成功した最初の融合前安定化変異を要約する。

単鎖融合前安定化MuV Fタンパク質の発現および精製により、無修飾のMuV Fと比較して発現レベルの実質的増加が示された。

図1Aおよび図1Bに図解するとおり、ネガティブ染色EMを使用すれば、融合前コンフォメーションにあるMuV Fエクトドメイン三量体と融合後コンフォメーションにあるものとを識別することができる。

ジスルフィド置換とC末端コイルドコイル-GCN4取り付け位置のマトリックスを作成することにより、タンパク質発現レベルおよび融合前三量体コンフォメーションまたは融合後三量体コンフォメーションをとるタンパク質の比率を、ネガティブ染色EMを使って評価した（図1A）。ジスルフィド結合位置とGCN4取り付け位置の5種の組合せが100％融合前三量体をもたらし、そのような組合せのうちの一つは、Expi293細胞から約4.8mg/Lの高収量タンパク質発現をもたらすことが観察された（V206C-A223Cと476-GCN4）。このデザインのネガティブ染色EM 2D平均（図1B、上図）は融合後流行性耳下腺炎F糖タンパク質三量体（図1B、下図）と対照的であり、パラインフルエンザウイルスFタンパク質コンフォメーションについての先の観察結果と合致した。

2.16Å分解能での融合前流行性耳下腺炎F糖タンパク質三量体の結晶構造により安定化ジスルフィドデザインと多形残基の場所とが明らかになる。融合前安定化流行性耳下腺炎Fタンパク質三量体（MuV F V206C-A223C-GGG-476-GCN4、SEQ ID NO:11）のサイズ排除クロマトグラフィーにより、キフネンシンの存在下で発現させると脱グリコシル化され結晶化させることができる均一ピーク（図1C）が明らかになった。その結晶の3次元座標をここではTable 1として提供する。2.16Å分解能でのX線構造（図1Dおよび図1E）は、融合前PIV5および他のパラミクソウイルス融合前F三量体に類似する全体的アーキテクチャを示したが（Stewart-Jones et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 115,12265-12270,2018、Welch,B.D.et al.Proc Natl Acad Sci U S A 109,16672-16677,2012、Xu K.et al.PLoS Pathog 11（12）e1005322,2015）、これは、側鎖T178、Q179およびN181間の相互作用によって形成される、流行性耳下腺炎融合前F三量体の三量体頂端にあるループN177～S184で構成される「閉じた蓋」構造をとっている（図2Aおよび図2B）。位置N73、N182、N352、N427、N433およびN457にある6つのグリカンからの残りのN-アセチルグルコサミン部分は電子密度で見ることができ、グリコシル化モデルが構築された（図2C）。V206C-A223Cジスルフィドは電子密度によって明確に画定され、Cα-Cα原子間距離は4.8Åであったが、相同な融合後PIV3 F三量体構造［PDB ID 1ZTM］では、Cα-Cα原子は5.8Å離れて位置している。DI～DIIIドメインは、PIV5、PIV3およびnipah融合前F構造で観察されたものと同様に、容積が約20,000Å³と測定される大きな水性の空洞を取り囲み、プロトマーは6,500Å²の界面を覆っていた（Stewart-Jones et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 115,12265-12270,2018、Welch,B.D.et al.Proc Natl Acad Sci U S A 109,16672-16677,2012、Xu K.et al.PLoS Pathog 11（12）:e1005322,2015）。融合前コンフォメーションと融合後コンフォメーションの間でコンフォメーション変化を起こすと考えられる残基（PIV5 pre-F構造［PDB ID 4WSG］およびPIV3 post-F［PDB ID 1ZTM］に基づく）を図1Eに示すが、これらはMuV F残基92～253に対応する。

流行性耳下腺炎FおよびHNの配列同一性は遺伝子型間で比較的高いが（図2A～2C）、融合前流行性耳下腺炎FおよびHNの構造の多型変異をマッピングした（図2D）。すべての遺伝子型について、特に遺伝子型GとJeryl Lynn（遺伝子型A）との間の、融合前Fの変異をマッピングすると、抗体認識のために露出しているタンパク質表面の大部分は保存されており、一方、数多くの可変アミノ酸は、融合前三量体のコア中の水性の空洞内に位置した（図2D、左）。対照的に、流行性耳下腺炎HN二量体構造からは、Jeryl Lynn HNと遺伝子型G HNの間の位置N464にあるグリカン変異を含めて、大半の多形アミノ酸が溶媒にばく露していることが明らかになった（図2D、右）。溶媒に露出した多形残基が融合前FよりもHN上で優勢であることは、Jeryl Lynnワクチンが誘発する体液性免疫に対する遺伝子型Gの抵抗性が、融合前FよりもHNで説明できることを示唆している。

安定化変異の交差株有効性。融合前安定化変異がMuV株横断的にFに対して有効であることを示すために、これらの変異をいくつかの異なるMuV株からのFで試験した。MuV F V206C-A223C-GGG-476-GCN4（SEQ ID NO:11）は、遺伝子型C MuV Fに基づく。これらの融合前安定化変異を遺伝子型A（Jeryl Lynn）MuV Fタンパク質（MuV-JL F 206C-A223C-GGG-476-GCN4（SEQ ID NO:26）および遺伝子型G MuV Fタンパク質（MuV-IL17 F 206C-A223C-GGG-476-GCN4（SEQ ID NO:51）に導入すると、同様に融合前安定化が得られた。さらに、これらの融合前安定化変異を以下のMuV株からのFタンパク質に導入すると、ネガティブ染色EMおよび/または融合前特異的抗体結合による測定で、やはり、融合前安定化がもたらされた: カナダ（占部）、オールバニー（Albany）（遺伝子型A）、星野（遺伝子型B）、インド（遺伝子型C）、オランダ（遺伝子型D）、中国（遺伝子型F）、NethL11（遺伝子型G）、NY14（遺伝子型G）、IA14（遺伝子型G）、MA16（遺伝子型G）、LA17（遺伝子型G）、IL17（遺伝子型G）、バージニア（Virginia）（遺伝子型H）、台湾（遺伝子型J）、台湾（遺伝子型K）、オランダ（遺伝子型L）、MG15（遺伝子型A）。

F-HNキメラ。MuV Fエクトドメイン三量体の免疫原性フットプリント（immunogenic footprint）を増大させるために、MuV HNエクトドメインを三量体の各プロトマーの三量体化ドメインのC末端に遺伝子的に融合させた。フォーマットを図4Aに図解する。対応する配列を以下に示す。ネガティブ染色EMは、Fエクトドメインが融合前コンフォメーションを維持しており、3つのHNエクトドメイン（各Fプロトマーに1つが連結されている）が、三量体化ドメインのC末端側に配置されていることを示す。このデザインはExpi293細胞からのおよそ0.3mg/Lをもたらし、サイズ排除クロマトグラフィー上で単分散性であり、ネガティブ染色EMで予想されるアセンブリを示した（図1Cおよび図4A）。

融合前安定化流行性耳下腺炎Fおよび融合前安定化F-HNキメラ三量体はマウスにおいて高力価中和抗体を誘発する。融合前安定化流行性耳下腺炎Fの中和抗体誘発能を多の流行性耳下腺炎免疫原と比較して評価した。CB6F1/Jマウス10匹の群を、10μgのポリイノシン-ポリシチジン酸（ポリI:C）アジュバントと組み合わされた用量10μgの流行性耳下腺炎糖タンパク質で、0週目、3週目および10週目に免疫処置し、HEp-2細胞の流行性耳下腺炎ウイルス感染を防止する血清の能力を測定した（図3A）。

評価した免疫原は、融合後コンフォメーションのMuV Fエクトドメイン三量体（-476-GCN4を伴うネイティブエクトドメイン）、融合前コンフォメーションのMuV Fエクトドメイン三量体（MuV F V206C-A223C-GGG-476-GCN4、SEQ ID NO:11）、MuV HNエクトドメイン単量体、および三量体のプロトマーがMuV HNエクトドメインに融合している融合前コンフォメーションのMuV Fエクトドメイン三量体（MuV F 206C-223C-GGG-476＋GCN4＋MuV HN＿G（SEQ ID NO:27）である。

マウスを融合前流行性耳下腺炎F含有免疫原（preFまたはpreF-HN）で免疫処置した場合、preFに対する特異的応答が血清中に検出され、融合後免疫処置マウスへの結合のレベルはそれより低かった（図4B）。組換えHN単量体はHN免疫処置マウス血清だけに結合したが、単量体HN免疫処置マウスがほとんど結合を示さなかったのに対し、preF-HN免疫処置マウスからの血清は十分なHN結合レベルを示したことから、HNの多価性が頑強な体液性応答を推進していることが示唆された（図4C）。

融合後F、融合前F、または融合前F-HNのいずれかによる3回の免疫処置による中和抗体価の誘発を分析するために、各免疫処置の2週間後のPRNTを分析した（図3B）。各免疫処置後に中和価の段階的増加が観察されたが、3回目の免疫処置が示した増加は、2回目の免疫処置後よりも、さらにわずかだった。中和抗体は融合後免疫処置でも観察されたが、融合前F免疫原は、2回目および3回目の免疫処置後には、融合後Fよりもそれぞれ3.5倍および2.5倍高い中和を示した（遺伝子型G流行性耳下腺炎ウイルスに対して幾何平均感染量（ID₆₀値）はそれぞれ322および789）。preF-HNキメラ変異体は、3回目の免疫処置後に、融合後Fより12倍高く、融合前Fより5倍高い中和価を誘発し、遺伝子型Gウイルスに対するID₆₀値は3930だった。

次に、組換え免疫原から誘発される交差中和抗体を特徴づけるために、Jeryl Lynnおよび遺伝子型Hウイルスに対するPRNTを評価した。融合後Fおよび融合前Fの場合は、Jeryl Lynnウイルスについて遺伝子型Gウイルスに対するものより高いレベルの中和が観察されたが、融合前F-HNキメラの場合は等価なPRNTが観察された。16週目の時点で、preF群からの血清とpreF-HN群からの血清は、どちらも、遺伝子型Hウイルスに対して頑強なPRNTを示した。これは、これらの組換え免疫原により、数多くの流行性耳下腺炎遺伝子型を交差中和することができる抗体が誘発されうることを示している。これら3種の流行性耳下腺炎ウイルスに対するPRNTの持続性をさらに6ヶ月間モニタリングしたところ、力価の低下はあるものの、3ヶ月後にはID₆₀プラトーが形成され、preF-HNの幾何平均PRNTは、遺伝子型G、Jeryl Lynn、および遺伝子型Hウイルスに対して、それぞれ、およそ640、800、および1700であることがわかった（図4D）。preF免疫原によって遺伝子型G、Jeryl Lynnおよび遺伝子型Hウイルスに対して形成されるID₆₀ PRNTプラトーは、およそ100、660および3153だった（図4E）。全体として、HNに連結された融合前安定化F流行性耳下腺炎は、F単独より高い中和価を与え、両ウイルス表面抗原を単一の免疫原中で化学量論的に組み合わせるためのデザイン戦略を表す。

考察
MMRワクチン接種後の流行性耳下腺炎に対するヒト免疫は、典型的にはJeryl Lynnに対して220前後および遺伝子型Gに対して40前後のPRNTを特徴とする（Rasheed et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 116（38）:19071-19076,2019）。本開示の免疫原について本明細書において提供される結果は、マウスモデルデータがヒトでの応答と相関すると仮定すれば、PNRTによって測定される有効性の増大を与えるようである。

2回ワクチン接種者の間で流行性耳下腺炎のアウトブレイクが起きているので、疾患の発生率と公衆衛生資源への負荷を低減するために、現在の流行性耳下腺炎ワクチンには改良が必要である。アウトブレイク状況下で流行性耳下腺炎にかかるリスクがある個体には、流行性耳下腺炎含有ワクチンの3回目の投与が、予防接種の実施に関する諮問委員会（ACIP）によって勧告されている。弱毒化生MMRの3回目の投与は、約12ヶ月持続する中和価の一時的上昇をもたらした（Fiebelkorn A.P.et al.Open Forum Infect Dis 1（3）:ofu094,2014）。加えて、MMRの3回目の投与後は、MMRの投与を2回受けた個体と比較して、流行性耳下腺炎感染を起こすリスクが78％低減した（Cardemil C.et al,Effectiveness of a Third Dose of MMR Vaccine for Mumps Outbreak Control.N Engl J Med.377（10）:947-956,2017）。本実施例に記載する組換えタンパク質ワクチン候補は、流行性耳下腺炎アウトブレイク状況下でのMMRの投与に代わる代替ワクチンモダリティを提供し、増大した持続性および有効性を提供する。

流行性耳下腺炎ビリオン上の2つのキー中和標的を含む融合前F-HNキメラは、アウトブレイクを引き起こす優勢な流行性耳下腺炎遺伝子型Gおよび他の2つの遺伝子型AおよびHに対する中和応答を含めて、強力な交差遺伝子型中和応答を誘発することができ、世界中の流行性耳下腺炎株に対するユニバーサルワクチン候補に相当する。

配列:

上記の配列は、N末端シグナルペプチド、MuV Fエクトドメイン、GCN4三量体化ドメイン、任意でMuV HNエクトドメイン、トロンビン切断部位、HISタグおよびStrepタグ、ならびにセグメント間のさまざまなリンカー残基を含む。

実施例2
融合前コンフォメーションで安定化したMeV Fタンパク質およびそのMeV HエクトドメインまたはMuV HNエクトドメインとの融合物
本実施例では、1つまたは複数のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化したMeV Fエクトドメイン三量体の態様を例証する。MeV Hエクトドメインに連結されたMeV Fエクトドメイン三量体が、さらに提供される。融合前安定化MeV Fエクトドメイン三量体およびMeV Hエクトドメインとの対応する融合物は、例えば対象におけるMeVに対する中和免疫応答を誘導するのに有用である。

C末端GCN4三量体化ドメインに連結されたMeV Fエクトドメインは、細胞内で生産させた場合、融合前コンフォメーションに自発的に移行する三量体を形成する。安定化していない組換えMeV F-GCN4は非常に不安定なので、評価（EM）の時点では分子の100％が融合後コンフォメーションに移行している。タンパク質発現量も安定化なしでは実質的に低減する。

したがって、構造に基づくワクチンデザインを使って、MeV Fエクトドメインを融合前コンフォメーションで安定化させる変異を同定する（融合前PIV5 F構造PDB ID 4WSGおよびMeV F構造PDB ID 5YXWに基づく）と共に、F1/F2切断部位を排除することで、発現量が増加した「単鎖」MeV Fタンパク質を生産した。MeV Fエクトドメインを融合前コンフォメーションで「ロック」するために、ジスルフィド結合およびプロリン置換の導入を含む、多重安定化戦略を用いた。全部でおよそ40種の異なる変異体をデザインし、発現させ、精製し、発現レベルについて評価し、ネガティブ染色EMによって融合前コンフォメーションについて評価した。

変異をMeV Fエクトドメイン（MeV F位置486でのC末端切断に基づく）中に導入し、C末端GCN4三量体化ドメインに連結し、その結果生じた変異体を、上述のようにスクリーニングした。エクトドメインは、F1/F2フューリン切断部位を除去するための変異も含んだ。評価される融合前安定化変異には、非天然ジスルフィド結合を形成するMeV F位置48と284、90と225、141と270、165と171、173と245、175と241、212と236、216と233、および219と224のうちの1つまたは複数におけるシステイン置換、ならびにMeV F位置194のプロリン置換を含めた。関連する配列を以下に示す。

単鎖融合前安定化MeV Fタンパク質の発現および精製により、無修飾のMeV Fと比較して発現レベルの実質的増加が示された。

図5に図解するとおり、ネガティブEMを使用すれば、融合前コンフォメーションにあるMeV Fエクトドメイン三量体と融合後コンフォメーションにあるものとを識別することができる。また、MeV F R165C-M171C-486-GCN4（SEQ ID NO:38）は、融合前安定化とタンパク質発現量の優れた組合せを示し、S200ゲル濾過により、単分散性タンパク質として精製された。融合前コンフォメーションをさらに確認するために、このコンストラクトおよび他のコンストラクトを電子顕微鏡法で分析した。

融合後コンフォメーションのMeV Fエクトドメイン三量体および融合前コンフォメーションのMeV Fエクトドメイン三量体（MeV F R165C-M171C-486-GCN4（SEQ ID NO:38）を使って、免疫処置アッセイを行った。免疫処置プロトコールは図3Aに示すものに従った。CB6F1/Jマウス10匹の群を、ポリICアジュバント中のタンパク質10μg/回で、0週目および3週目に免疫処置し、免疫処置マウスからの5週目血清の中和価を評価した。免疫血清をMeV中和アッセイで評価したところ（図5C）、MeV F R165C-M171C-486-GCN4（SEQ ID NO:38）で免疫処置された動物からの免疫血清は、融合後MeV Fで免疫処置された動物からの血清よりも200倍高く、防御閾値を上回って、MeVを中和することがわかった。

配列:

上記の配列は、N末端シグナルペプチド、MeV Fエクトドメイン、およびGCN4三量体化ドメイン、ならびにセグメント間のさまざまなリンカー残基を含む。

加えて、MuV HNエクトドメインまたはMeV Hエクトドメインに連結された、融合前コンフォメーションでの安定化のためのアミノ酸置換を持つMeV Fエクトドメインを持つキメラコンストラクトを、以下のようにデザインした。

上記の配列は、N末端シグナルペプチド、MeV Fエクトドメイン、およびGCN4三量体化ドメイン、任意でT4フィブリチン三量体化ドメイン、MeV Hエクトドメイン、ならびにセグメント間のさまざまなリンカー残基を含む。

実施例3
多量体MuV HN、多量体MeV HおよびMuV pre-F-MeV Hキメラ
この実施例では、MeVおよびMuVに対する交差中和免疫応答を誘発するキメラ免疫原を提供するための、MeV Hエクトドメインに連結された組換えMuV pre-Fエクトドメイン三量体の一態様が記載される。加えて、多量体MuV HN および多量体MeV Hも記載される。

MuV Fエクトドメイン三量体の免疫原性フットプリントを増大させるために、MeV Hエクトドメインを、三量体の各プロトマーの三量体化ドメインのC末端に遺伝子的に融合させた。評価されるコンストラクトは、V206C-A223Cを含有するMuV Fエクトドメイン、F1/F2フューリン切断部位を除去するための変異、エクトドメインの位置476に融合された三量体化ドメイン、および三量体化ドメインのC末端に連結されたMeV Hエクトドメインを含んだ。この態様では、三量体化ドメインがGCN4三量体化ドメインとT4フィブリチン三量体化ドメインとの両方を直列に含んだが、これらのドメインのうちの一方を単独で使用することもできる。フォーマットを図6Aに図解する。対応する配列を以下に示す。

精製MuV F 206C-223C-476＋GCN4/Fd＋MeV-H（SEQ ID NO:28）のネガティブ染色EMは、Fエクトドメインが融合前コンフォメーションを維持しており、3つのHエクトドメイン（各Fプロトマーに1つが連結されている）が、三量体化ドメインのC末端側に整列していることを示す（図6A）。ネガティブ染色EMは、このコンストラクトが、実施例1記載のMuV F-MuV HNと類似するコンフォメーションで集合することを示す。

MeV Hエクトドメインヘッド領域またはMuV HNエクトドメインヘッド領域の多量体を含有する追加の免疫原を構築した。

T4フィブリチン三量体化ドメインにヘッド領域のN末端を連結することにより、三量体MuV HNエクトドメインヘッド領域および三量体MeV Hエクトドメインヘッド領域を構築した。配列を以下に掲載する。

哺乳動物細胞中でMeV Hエクトドメインヘッド領域を発現させ、その結果生じたタンパク質複合体を精製することにより、二量体MeV Hを構築した。MeV Hヘッドは生理学的溶液中で二量体化する。MeV Hヘッド領域の配列を以下に掲載する。

ストーク領域とヘッド領域を含む二量体MeV Hは、MeV Hエクトドメインのストーク領域とヘッド領域を哺乳動物細胞中で発現させ、その結果生じたタンパク質複合体を精製することによって構築することができる。MeV Hのストークとヘッドは生理学的溶液中で二量体化する。MeV Hのストーク領域およびヘッド領域の例示的な配列を以下に掲載する。

ストーク領域とヘッド領域を含むMuV HNは、MuV HNエクトドメインのストーク領域とヘッド領域を哺乳動物細胞中で発現させ、その結果生じたタンパク質を精製することによって構築することができる。MuV HNのストーク領域およびヘッド領域の例示的な配列を以下に掲載する。

加えて、キメラ型の三量体MuV HNエクトドメインヘッド領域および三量体MeV Hエクトドメインヘッド領域を、これらの分子をT4フィブリチン三量体化ドメインおよび/またはGCN4三量体化ドメインのN末端およびC末端に連結することによって構築した。配列を以下に掲載する。

MeV Hエクトドメインヘッド二量体（SEQ ID NO:60）、MeV Hエクトドメインヘッド三量体（SEQ ID NO:59）およびMuV HNエクトドメインヘッド三量体（SEQ ID NO:58）をデザインし、発現させ、精製し、ネガティブ染色EMで特徴づけた（図6A参照）。

マウスを精製コンストラクトで免疫処置し、血清をMeVおよびMuV中和についてPRNTで評価した。評価した免疫原は、MeV H二量体または三量体（SEQ ID NO:59または60）、融合前MuV Fエクトドメイン三量体（MuV F V206C-A223C-GGG-476-GCN4、SEQ ID NO:11）、MuV pre-F-MeV Hキメラ（MuV F 206C-223C-476＋GCN4/Fd＋MeV＿H＿3INB-tHS（SEQ ID NO:28）、およびMuV HN三量体（SEQ ID NO:58）であった。

MeV中和について（図6B）、MeV H二量体は平均66,000、MeV H三量体は平均30,000、そして融合前MuV FのC末端上の三量体化Hは平均35,000のPRNT ID₆₀を誘発した。これらの結果は、融合前MeV F三量体による免疫処置で観察された中和価がはるかに低いことを考えると（873のPRNT、図5C参照）、極めて驚くべきことであった。2回のMMRワクチン接種後のヒトPRNT力価は平均でおよそ650である。このMeV H デザインでの極めて高いMeV PRNT価は予想外だった。というのも、最初は（RSVなどの他のパラミクソウイルスと同様に）融合前Fエクトドメイン三量体の方が良い免疫応答を与えると考えていたからである。意外なことに、多量体MeV H免疫原は、極めて良好な免疫原性を示し、融合前安定化MeV Fエクトドメイン三量体よりも最大75倍強力であり、MMRワクチン接種後のヒト応答よりもおよそ100倍高かった。

MuV中和について（図6C）、評価した免疫原のそれぞれは、防御閾値を上回る免疫応答を誘発し、可溶性三量体化MuV HNは、極めて強力な免疫応答を誘発した。これは、可溶性MuV HN単量体によって誘発される応答がごくわずかであることを考えると（図4C）、極めて驚くべきことである。驚いたことに、MuV HNエクトドメイン単量体と三量体MuV HNエクトドメインとの間で、中和効力の13.4倍の増加があった。

タンパク質の生産、分析、および免疫処置は上述のように行った。

記載の態様の要旨から逸脱することなく、記載の方法または組成物の厳密な詳細を改変または変更しうることは、明白だろう。本発明者らは、下記請求項の範囲および要旨に包含されるそのような変更および改変をすべて特許請求する。

Claims

免疫原であって、三量体のプロトマーにおける1つまたは複数のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化した組換え流行性耳下腺炎ウイルス（MuV）Fエクトドメイン三量体を含み、該アミノ酸置換が、該MuV Fエクトドメイン三量体を該融合前コンフォメーションで安定化させるための非天然ジスルフィド結合を形成するシステイン置換を含む、免疫原。
前記システイン置換が、MuV F位置86と215、位置155と161、位置165と231、位置206と223、位置209と214、および位置221と255のうちの1つまたは複数に位置する、請求項1記載の免疫原。
前記組換えMuV Fエクトドメイン三量体が、前記三量体のプロトマーにおけるMuV F位置206および223における前記システイン置換の間の非天然ジスルフィド結合によって、前記融合前コンフォメーションで安定化している、請求項1または請求項2記載の免疫原。
前記システイン置換が、
MuV F位置86および215ではN86CおよびA215C置換であり、
MuV F位置155および161ではK155CおよびL161C置換であり、
MuV F位置165および231ではV165CおよびM231C置換であり、
MuV F位置206および223ではV206CおよびA223C置換であり、
MuV F位置209および214ではP209CおよびP214C置換であり、
MuV F位置221および255ではI221CおよびM255C置換である、
前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
前記組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、MuV F位置20～100を含むかまたはそれからなるF₂タンパク質と、MuV F位置104～469、104～476、もしくは104～483を含むかまたはそれからなるF₁エクトドメインとを含む、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
前記三量体のプロトマーが、MuV FエクトドメインのF1/F2フューリン切断部位と任意でF1エクトドメインの融合ペプチドの第1残基とを除去するための変異をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
前記F1/F2フューリン切断部位と前記融合ペプチドの第1残基とを除去するための前記変異が、MuV F位置101～103の欠失およびそれに伴いペプチドリンカーで融合された位置100と104を含む、請求項6記載の免疫原。
前記ペプチドリンカーがGly-Gly-Glyリンカーである、請求項7記載の免疫原。
前記アミノ酸置換の位置決めが、SEQ ID NO:1として示される参照MuV Fタンパク質配列に従う、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
前記MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、
SEQ ID NO:3～8のいずれか1つの残基20～483、
SEQ ID NO:11～16、26、もしくは51のいずれか1つの残基20～476、または
SEQ ID NO:19～24のいずれか1つの残基20～469
と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含み、
該プロトマーが、該MuV Fエクトドメイン三量体を前記融合前コンフォメーションで安定化させる前記1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、
前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
前記MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、
SEQ ID NO:3～8のいずれか1つの残基20～483、
SEQ ID NO:11～16、26、もしくは51のいずれか1つの残基20～476、または
SEQ ID NO:19～24のいずれか1つの残基20～469
として示されるアミノ酸配列を含むか、または同アミノ酸配列からなる、請求項10記載の免疫原。
前記組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、C末端で三量体化ドメインに融合している、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
前記三量体化ドメインが、GCN4三量体化ドメイン、T4フィブリチン三量体化ドメイン、またはその両方を含む、請求項12記載の免疫原。
前記GCN4三量体化ドメインが

として示されるアミノ酸配列を含み、
前記T4フィブリチン三量体化ドメインが

として示されるアミノ酸配列を含み、
前記GCN4三量体化ドメインとT4フィブリチン三量体化ドメインとの両方を含む三量体化ドメインが

として示されるアミノ酸配列を含む、請求項13記載の免疫原。
前記三量体化ドメインに融合しているMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、
SEQ ID NO:3～8のいずれか1つの残基20～513、
SEQ ID NO:11～16、26、もしくは51のいずれか1つの残基20～506、または
SEQ ID NO:19～24のいずれか1つの残基20～499
と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含み、
該プロトマーが、該MuV Fエクトドメイン三量体を前記融合前コンフォメーションで安定化させる前記1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、
請求項12～14のいずれか一項記載の免疫原。
前記三量体化ドメインに融合している前記MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、
SEQ ID NO:3～8のいずれか1つの残基20～513、
SEQ ID NO:11～16、26、もしくは51のいずれか1つの残基20～506、または
SEQ ID NO:19～24のいずれか1つの残基20～499
として示されるアミノ酸配列を含むか、または同アミノ酸配列からなる、請求項15記載の免疫原。
前記組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが異種タンパク質に連結されている、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
前記異種タンパク質が、MeV Hタンパク質またはMuV HNタンパク質のエクトドメインのヘッドまたはエクトドメインのストークおよびヘッドである、請求項17記載の免疫原。
前記MeV Hタンパク質または前記MuV HNタンパク質のエクトドメインのヘッドまたはエクトドメインのストークおよびヘッドが、C末端で三量体化ドメインに融合しており、該三量体化ドメインが、C末端で前記組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーに融合している、請求項18記載の免疫原。
前記三量体化ドメインおよび前記MeV Hタンパク質のエクトドメインまたは前記MuV HNタンパク質のエクトドメインに連結された前記MuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、SEQ ID NO:27の残基20～966、SEQ ID NO:28の残基21～981、またはSEQ ID NO:29の残基20～1006として示されるアミノ酸配列を含む、請求項19記載の免疫原。
免疫原であって、三量体のプロトマーにおける1つまたは複数のアミノ酸置換によって融合前コンフォメーションで安定化した組換え麻疹ウイルス（MeV）Fエクトドメイン三量体を含み、該アミノ酸置換が、
非天然ジスルフィド結合を形成するMeV F位置48と284、位置90と225、位置141と270、位置165と171、位置173と245、位置175と241、位置212と236、位置216と233、位置219と224、位置99と117、位置100と117、位置101と117、位置102と117、および位置103と117のうちの1つまたは複数におけるシステイン置換、
MeV F位置175におけるフェニルアラニン置換、および
MeV F位置194におけるプロリン置換
のうちの1つまたは複数を含む、免疫原。
前記組換えMeV Fエクトドメイン三量体が、前記三量体のプロトマーにおけるMeV F位置165および171における前記システイン置換の間の非天然ジスルフィド結合によって、前記融合前コンフォメーションで安定化している、請求項21記載の免疫原。
MeV F位置48および284における前記システイン置換がR48CおよびA284C置換であり、
MeV F位置90および225における前記システイン置換がA90CおよびI225C置換であり、
MeV F位置141および270における前記システイン置換がM141CおよびT270C置換であり、
MeV F位置165および171における前記システイン置換がR165CおよびM171C置換であり、
MeV F位置173および245における前記システイン置換がL173CおよびV245C置換であり、
MeV F位置175および241における前記システイン置換がV175CおよびD241C置換であり、
MeV F位置212および236における前記システイン置換がE212CおよびY236C置換であり、
MeV F位置216および233における前記システイン置換がL216CおよびA233C置換であり、
MeV F位置219および224における前記システイン置換がP219CおよびP224C置換であり、
MeV F位置99および117における前記システイン置換がR99C-V117C置換であり、
MeV F位置100および117における前記システイン置換がP100C-V117C置換であり、
MeV F位置101および117における前記システイン置換がV101C-V117C置換であり、
MeV F位置102および117における前記システイン置換がQ102C-V117C置換であり、
MeV F位置103および117における前記システイン置換がS103C-V117C置換であり、
MeV F位置175における前記フェニルアラニン置換がV175F置換であり、
MeV F位置194における前記プロリン置換がS194P置換である、
請求項21または請求項22記載の免疫原。
前記組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、MeV F位置24～110を含むかまたはそれからなるF₂タンパク質と、MeV F位置114～486を含むかまたはそれからなるF₁エクトドメインとを含む、請求項21～23のいずれか一項記載の免疫原。
前記三量体のプロトマーが、MeV FエクトドメインのF1/F2フューリン切断部位と任意でF1エクトドメインの融合ペプチドの第1残基とを除去するための変異をさらに含む、請求項21～24のいずれか一項記載の免疫原。
前記F1/F2フューリン切断部位と融合ペプチドの第1残基とを除去するための変異が、MeV F位置111～113の欠失およびペプチドリンカーで融合された位置110と114を含む、請求項25記載の免疫原。
前記ペプチドリンカーがGly-Gly-Glyリンカーである、請求項26記載の免疫原。
前記アミノ酸置換の位置決めが、SEQ ID NO:36として示される参照MeV Fタンパク質に従う、請求項21～27のいずれか一項記載の免疫原。
前記MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、SEQ ID NO:37～43、53～55、62～68もしくは72～80のいずれか1つの残基21～483、またはSEQ ID NO:70～72のいずれか1つの残基21～490と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含み、
該プロトマーが、前記MeV Fエクトドメイン三量体を前記融合前コンフォメーションで安定化させる前記1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、
請求項21～28のいずれか一項記載の免疫原。
前記MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、SEQ ID NO:37～43、53～55、62～68もしくは72～80のいずれか1つの21～483、またはSEQ ID NO:70～72のいずれか1つの残基21～490として示されるアミノ酸配列を含むか、または同アミノ酸配列からなる、請求項29記載の免疫原。
前記組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、C末端で三量体化ドメインに融合している、請求項21～30のいずれか一項記載の免疫原。
前記三量体化ドメインが、GCN4三量体化ドメイン、T4フィブリチン三量体化ドメイン、またはその両方を含む、請求項31記載の免疫原。
前記GCN4三量体化ドメインが

として示されるアミノ酸配列を含み、
前記T4フィブリチン三量体化ドメインが

として示されるアミノ酸配列を含み、
前記GCN4三量体化ドメインとT4フィブリチン三量体化ドメインとの両方を含む三量体化ドメインが

として示されるアミノ酸配列を含む、請求項32記載の免疫原。
前記三量体化ドメインに融合している前記MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、SEQ ID NO:37～43、53～55、62～68、もしくは72～80のいずれか1つの残基21～513、またはSEQ ID NO:70～72のいずれか1つの残基21～520と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含み、
該プロトマーが、該MeV Fエクトドメイン三量体を前記融合前コンフォメーションで安定化させる前記1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、
請求項31～33のいずれか一項記載の免疫原。
前記三量体化ドメインに融合している前記MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、SEQ ID NO:37～43、53～55、62～68もしくは72～80のいずれか1つの残基21～513またはSEQ ID NO:70～72のいずれか1つの残基21～520として示されるアミノ酸配列を含むか、または同アミノ酸配列からなる、請求項34記載の免疫原。
前記組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが異種タンパク質に連結されている、請求項21～35のいずれか一項記載の免疫原。
前記異種タンパク質が、MeV Hタンパク質またはMuV HNタンパク質のエクトドメインのヘッドまたはエクトドメインのストークおよびヘッドである、請求項36記載の免疫原。
前記MeV Hタンパク質または前記MuV HNタンパク質のエクトドメインのヘッドまたはエクトドメインのストークおよびヘッドが、C末端で三量体化ドメインに融合しており、該三量体化ドメインが、C末端で組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーに融合している、請求項37記載の免疫原。
前記三量体化ドメインおよび前記MeV Hタンパク質または前記MuV HNタンパク質のエクトドメインに連結された前記MeV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、SEQ ID NO:56の残基21～959またはSEQ ID NO 57の残基21～973またはSEQ ID NO:81の残基21～988として示されるアミノ酸配列を含む、請求項38記載の免疫原。
前記組換えMeV Fエクトドメイン三量体または前記組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、1つまたは複数の追加のアミノ酸置換をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
融合タンパク質の三量体であって、各融合タンパク質が、N末端からC末端に向かって、三量体化ドメイン、任意選択のペプチドリンカー、および1コピーもしくは複数コピーのMuV HNエクトドメインのヘッドもしくはMeV Hエクトドメインのヘッドを含むか、またはそれらからなる、三量体、あるいは
融合タンパク質の三量体であって、各融合タンパク質が、N末端からC末端に向かって、1コピーもしくは複数コピーのMuV HNエクトドメインのヘッドもしくはMeV Hエクトドメインのヘッド、任意選択のペプチドリンカー、三量体化ドメイン、任意選択のペプチドリンカー、および1コピーもしくは複数コピーのMuV HNエクトドメインのヘッドもしくはMeV Hエクトドメインのヘッドを含むか、またはそれらからなる三量体、あるいは
融合タンパク質の三量体であって、各融合タンパク質が、N末端からC末端に向かって、1コピーもしくは複数コピーのMuV HNエクトドメインのヘッドもしくはストークおよびヘッド、またはMeV Hエクトドメインのヘッドもしくはストークおよびヘッド、任意選択のペプチドリンカー、三量体化ドメイン、任意選択のペプチドリンカー、および1コピーもしくは複数コピーのMuV HNエクトドメインのヘッドもしくはストークおよびヘッド、またはMeV Hエクトドメインのヘッドもしくはストークおよびヘッドを含むか、またはそれらからなる三量体
を含む、単離された免疫原。
前記MuV HNエクトドメインのヘッドが、SEQ ID NO:58の残基59～510として示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:58の残基59～510と少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなり、
前記MuV HNエクトドメインのストークおよびヘッドが、SEQ ID NO:90の残基22～550、SEQ ID NO:91の残基22～543、SEQ ID NO:92の残基22～541、もしくはSEQ ID NO:93の残基22～549、またはSEQ ID NO:90の残基22～550、SEQ ID NO:91の残基22～543、SEQ ID NO:92の残基22～541、もしくはSEQ ID NO:93の残基22～549と少なくとも90％同一の配列を含み、
前記MeV Hエクトドメインのヘッドが、SEQ ID NO:59の残基59～496として示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:59の残基59～496と少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
前記MeV Hエクトドメインのストークおよびヘッドが、SEQ ID NO:86の残基22～580、SEQ ID NO:87の残基22～577、SEQ ID NO:88の残基22～579、もしくはSEQ ID NO:89の残基22～572、またはSEQ ID NO:86の残基22～580、SEQ ID NO:87の残基22～577、SEQ ID NO:88の残基22～579、もしくはSEQ ID NO:89の残基22～572と少なくとも90％同一の配列を含む、
請求項41記載の免疫原。
前記GCN4三量体化ドメインが

として示されるアミノ酸配列を含み、
前記T4フィブリチン三量体化ドメインが

として示されるアミノ酸配列を含み、
前記GCN4三量体化ドメインとT4フィブリチン三量体化ドメインとの両方を含む三量体化ドメインが

として示されるアミノ酸配列を含む、請求項41または請求項42記載の免疫原。
前記三量体中の融合タンパク質が、SEQ ID NO:58の残基24～510、SEQ ID NO:59の残基24～496、SEQ ID NO:82の残基22～950、SEQ ID NO:83の残基25～985、SEQ ID NO:84の残基22～948、もしくはSEQ ID NO:85の残基22～981、またはSEQ ID NO:58の残基24～510、SEQ ID NO:59の残基24～496、SEQ ID NO:82の残基22～950、SEQ ID NO:83の残基25～985、SEQ ID NO:84の残基22～948、もしくはSEQ ID NO:85の残基22～981のいずれか1つと少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなる、請求項41～43のいずれか一項記載の免疫原。
MeV Hエクトドメインのヘッドの二量体、
MeV Hエクトドメインのストークおよびヘッドの二量体、
MuV HNエクトドメインのヘッドの二量体、または
MuV HNエクトドメインのストークおよびヘッドの二量体
を含む、単離された免疫原。
前記MeV Hエクトドメインのヘッドが、SEQ ID NO:60の残基22～459として示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:60の残基22～459と少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなり、
前記MeV Hエクトドメインのストークおよびヘッドが、SEQ ID NO:86の残基22～580、SEQ ID NO:87の残基22～577、SEQ ID NO:88の残基22～579もしくはSEQ ID NO:89の残基22～572、またはSEQ ID NO:86の残基22～580、SEQ ID NO:87の残基22～577、SEQ ID NO:88の残基22～579もしくはSEQ ID NO:89の残基22～572と少なくとも90％同一の配列を含み、
前記MuV Hエクトドメインのヘッドが、SEQ ID NO:30として示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:30と少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
前記MuV HNエクトドメインのストークおよびヘッドが、SEQ ID NO:90の残基22～550、SEQ ID NO:91の残基22～543、SEQ ID NO:92の残基22～541もしくはSEQ ID NO:93の残基22～549、またはSEQ ID NO:90の残基22～550、SEQ ID NO:91の残基22～543、SEQ ID NO:92の残基22～541もしくはSEQ ID NO:93の残基22～549と少なくとも90％同一の配列を含むか、またはそれからなる、
請求項45記載の免疫原。
異種担体にコンジュゲートしている、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
可溶性である、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
前記組換えMeV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、前記組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマー、前記融合タンパク質の三量体、または前記MeV Hエクトドメインのヘッドの二量体が、ペプチドリンカーによって膜貫通ドメインに融合しているか、または該膜貫通ドメインに直接融合している、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
前記組換えMeV Fエクトドメイン三量体または組換えMuV Fエクトドメイン三量体のプロトマーが、完全長F₁タンパク質を含む、請求項49記載の免疫原。
前記請求項のいずれか一項記載の免疫原を含む、ウイルス様粒子。
前記請求項のいずれか一項記載の免疫原を含む、自己集合性タンパク質ナノ粒子。
前記請求項のいずれか一項記載の免疫原をコードする、核酸分子。
プロモーターに機能的に連結されている、請求項53記載の核酸分子。
請求項54記載の核酸分子を含む、ベクター。
RNAベクターである、請求項55記載のベクター。
免疫原を生産する方法であって、
請求項55～56のいずれか一項記載の核酸分子を宿主細胞で発現させる工程、および
該免疫原を精製する工程
を含む、方法。
請求項57記載の方法によって生産される、免疫原。
請求項1～56および請求項58のいずれか一項記載の免疫原、核酸分子、ベクター、またはウイルス様粒子と、薬学的に許容される担体とを含む、免疫原性組成物。
対象においてMuV F、MeV F、MuV NH、および/またはMeV Hに対する免疫応答を誘発する方法であって、該免疫応答を誘発するために有効量の請求項59記載の免疫原性組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
前記免疫応答が、前記対象におけるMuVおよび/またはMeV感染を阻害する、請求項60記載の方法。
前記対象が、MeVおよび/またはMuVに対する弱毒化生ワクチンによる免疫処置を以前に受けた成体であり、前記投与が、該MuVおよび/またはMeVに対する免疫応答をブーストする、請求項60または請求項61記載の方法。