JP2023504016A - Ｃｄ３およびｂｃｍａに対する抗体およびそれらから作製した二重特異性結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

ＣＤ３およびＢ細胞成熟因子タンパク質（ＢＣＭＡ）を認識する高親和性抗体が提供される。ヒト化抗ＣＤ３抗体および抗ＢＣＭＡ抗体に由来する結合部位は、結合親和性の有意な損失なくＦａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン形式に組み込まれ、生じた二重特異性多価結合タンパク質はＣＤ３とＢＣＭＡの両方に同時に結合し得る。このような抗体、その抗原結合部分、および二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、癌の治療に有用である。

Description

本発明は、ＣＤ３を認識する新規抗体、Ｂ細胞成熟抗原(B Cell Maturation Antigen)（ＢＣＭＡ）を認識する新規抗体、ならびにそれらの抗体を用いて作製したＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質およびＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質などの二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３結合タンパク質に関する。抗体および二重特異性結合タンパク質は、免疫疾患および血液癌の治療に有用である。

分化抗原群３(Cluster of Differentiation 3)（ＣＤ３）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される抗原（Ａｇｓ）に結合し、Ｔ細胞機能において重要な役割を果たす。しかしながら、ＴＣＲ自体は細胞内シグナル伝達を行わない。代わりに、ＴＣＲは、分化抗原群３（ＣＤ３）複合体と非共有結合的に会合し、ＣＤ３の免疫受容体チロシン活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)（ＩＴＡＭ）を介して細胞内シグナル伝達を誘発する。ＣＤ３ Ｔ細胞共受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）とＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）の両方を活性化する助けをする。それはタンパク質複合体からなり、４つの異なる鎖で構成されている。哺乳動物では、この複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ３δ鎖（ゼータ鎖）と会合して、Ｔリンパ球に活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３γ、δ、およびε鎖は一緒に、ＴＣＲ複合体を構成する。そして、ＣＤ３の４鎖複体は、１：１：１の化学量論でＣＤ３εγ、ＣＤ３εδ、およびζζ二量体を形成する。

ＣＤ３は、最初は前胸腺細胞の細胞質で発現し、前胸腺細胞は、Ｔ細胞が胸腺で発生する幹細胞である。前胸腺細胞は、一般的な胸腺細胞に分化し、次に髄質胸腺細胞に分化するが、ＣＤ３抗原が細胞膜に移動し始めるにはこの後者の段階である。抗原は、総ての成熟Ｔ細胞の膜に結合して認められ、実質的に他の細胞種には存在しないが、プルキンエ細胞には少量存在していると思われる。

この高い特異性は、Ｔ細胞発達の総ての段階にＣＤ３が存在することと相まって、これを組織切片におけるＴ細胞の有用な免疫組織化学的マーカーとする。抗原は、ほとんど総てのＴ細胞リンパ腫および白血病に存在し続けるため、表面的に類似したＢ細胞および骨髄性腫瘍とそれらを区別するために使用することができる。ＣＤ３ε鎖に対するいくつかの抗体は、おそらくＴ細胞上でのＣＤ３複合体のクラスター化によって、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体を活性化することが示されている。さらに、ＣＤ３と腫瘍特異的抗原の両方を標的とする二重特異性抗体が、Ｔ細胞による腫瘍根絶のリダイレクトのために研究されている。ＣＤ３はＴ細胞の活性化に必要であるため、ＣＤ３を標的とする薬物（多くの場合、モノクローナル抗体）が、１型糖尿病およびその他の自己免疫疾患に対する免疫抑制療法（例えば、オテリキシズマブ）として検討されている。

Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ２６９）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＢＣＭＡ発現はＢ細胞系列に限定されており、主として形質細胞と形質芽細胞で発現し、ナイーブＢ細胞には存在しない。ＢＣＭＡは、２つのリガンド、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＡＬＬ－２、ＣＤ２５６）およびＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ、ＢＬＹＳ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＡＬＬ－１、ＣＤ２５７）に結合する。ＢＣＭＡは、ＡＰＲＩＬに対してＢＡＦＦよりも高い結合親和性を有する。多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞は、高レベルのＢＣＭＡを発現する。リガンドブロッキング活性を備えたＢＣＭＡ標的抗体は、裸のＩｇＧとしても、薬物複合体としても、ＭＭ細胞の細胞毒性を促進する可能性がある。後期成熟Ｂ細胞でのＢＣＭＡの制限された発現によってもまた、これはキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の理想的な補助標的となり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、改変されたＴ細胞特定の細胞タンパク質に標的化するためにキメラ抗原受容体を発現するように遺伝的に操作されたＴ細胞である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｂ細胞癌に対して有望な免疫療法を提供するが、それらの作用機序は十分に理解されておらず、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の副作用は、多くの場合、重度であり、サイトカイン放出症候群（サイトカインストーム）および神経毒性を含む。

ＣＤ３およびＢＣＭＡの役割を理解することもまた、二重特異性Ｔ細胞リダイレクト抗体として知られる関連の免疫療法に至った。ＣＤ３とＢＣＭＡの両方を標的とする二重特異性抗体は、リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）による多発性骨髄腫の治療に有用であろう。

本発明は、ＣＤ３に高い親和性で結合する新規抗体およびＢＣＭＡに高い親和性で結合する新規抗体を提供する。本発明はまた、ＣＤ３とＢＣＭＡの両方と反応性があるＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）を提供する。本発明はまた、ＣＤ３とＢＣＭＡの両方と反応性があるＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性一価非対称タンデムＦａｂ抗体（ＭＡＴ－Ｆａｂ）を提供する。本発明の抗体および二重特異性結合タンパク質は、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体を活性化することができる。本明細書に記載される二重特異性多価結合タンパク質は、リダイレクトされたＴ細胞細胞傷害性による多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞の治療に相乗作用的な組合せ効果を提供するために、ＣＭＡ／ＣＤ３、二重特異性阻害剤として有用である。

本発明はまた、本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体、抗ＢＣＭＡ抗体およびＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質を作製および使用する方法、ならびにサンプルにおいてＣＤ３および／もしくはＢＣＭＡを検出する方法または個体においてＣＤ３活性および／またはＢＣＭＡ活性に関連する障害を治療もしくは予防する方法において使用され得る種々の組成物を作製する方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、第１、第２、および第３のポリペプチド鎖を含んでなり、
前記第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、（ｉ）ＶＬ_Ａ－ＣＬ－ＶＨ_Ｂ－ＣＨ１－Ｆｃ（ここで、ＣＬは、ＶＨ_Ｂに直接融合されている）、または（ｉｉ）ＶＨ_Ｂ－ＣＨ１－ＶＬ_Ａ－ＣＬ－Ｆｃ（ここで、ＣＨ１は、ＶＬ_Ａに直接融合されている）を含んでなり；
前記第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_Ａ－ＣＨ１を含んでなり；かつ
前記第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_Ｂ－ＣＬを含んでなり；
ＶＬは軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは免疫グロブリンＦｃ領域であり、ＡはＣＤ３またはＢＣＭＡのエピトープであり、かつＢはＣＤ３またはＢＣＭＡのエピトープであり、ただし、ＡとＢは異なる、二重特異性Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質を提供する。本発明においては、このようなＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＣＤ３とＢＣＭＡの両方に結合する。

１つのさらなる実施形態において、このようなＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質のＦａｂフラグメントには、抗原標的ＣＤ３またはＢＣＭＡの一方に結合する親抗体に由来するＶＬ_ＡドメインおよびＶＨ_Ａドメインが組み込まれ、かつ抗原標的ＣＤ３およびＢＣＭＡの他方に結合する異なる親抗体に由来するＶＬ_ＢドメインおよびＶＨ_Ｂドメインが組み込まれている。よって、第１の第２および第３のポリペプチド鎖のＶＨ_Ａ－ＣＨ１／ＶＬ_Ａ－ＣＬおよびＶＨ_Ｂ－ＣＨ１／ＶＬ_Ｂ－ＣＬのペアリングから、ＣＤ３およびＢＣＭＡを認識するタンデムＦａｂ部分が得られる。

本発明においては、ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は有利には、第１、第２、および第３のポリペプチド鎖を含んでなり、前記第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬ－ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１－Ｆｃ（ここで、ＣＬは、ＶＨ_ＢＣＭＡに直接融合されている）を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１を含んでなり；かつ前記第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬを含んでなり；ＶＬ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、ＶＬ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変ドメインであり、かつＦｃは免疫グロブリンＦｃ領域である。有利には、第１のポリペプチド鎖において、ドメインＶＬ_ＣＤ３－ＣＬは抗ＣＤ３親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１は抗ＣＤ３親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬは抗ＢＣＭＡ親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１は抗ＢＣＭＡ親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである。

別の実施形態において、ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、有利には第１、第２、および第３のポリペプチド鎖を含んでなってよく、前記第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬ－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－Ｆｃ（ここで、ＣＬは、ＶＨ_ＣＤ３に直接融合されている）を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１を含んでなり；かつ前記第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬを含んでなり；ＶＬ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、ＶＬ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変ドメインであり、かつＦｃは免疫グロブリンＦｃ領域である。有利には、第１のポリペプチド鎖において、ドメインＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬは抗ＢＣＭＡ親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１は抗ＢＣＭＡ親抗体の重鎖可変および重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインＶＬ_ＣＤ３－ＣＬは抗ＣＤ３親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１は抗ＣＤ３親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである。

別の実施形態において、ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、有利には第１、第２、および第３のポリペプチド鎖を含んでなってよく、前記第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬ－Ｆｃ（ここで、ＣＨ１は、ＶＬ_ＣＤ３に直接融合されている）を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬを含んでなり；かつ前記第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１を含んでなり；ＶＬ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、ＶＬ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変ドメインであり、かつＦｃは免疫グロブリンＦｃ領域である。有利には、第１のポリペプチド鎖において、ドメインＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬは抗ＢＣＭＡ親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１は抗ＢＣＭＡ親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインＶＬ_ＣＤ３－ＣＬは抗ＣＤ３親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１は抗ＣＤ３親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである。

別の実施形態において、ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、有利には第１、第２、および第３のポリペプチド鎖を含んでなってよく、前記第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬ－Ｆｃ（ここで、ＣＨ１は、ＶＬ_ＢＣＭＡに直接融合されている）を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬを含んでなり；かつ前記第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１を含んでなり；ＶＬ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、ＶＬ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変ドメインであり、かつＦｃは免疫グロブリンＦｃ領域である。有利には、第１のポリペプチド鎖において、ドメインＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬは抗ＢＣＭＡ親抗体の軽鎖と同じであり、ドメインＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１は抗ＢＣＭＡ親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じであり、ドメインＶＬ_ＣＤ３－ＣＬは抗ＣＤ３親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１は抗ＣＤ３親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインと同じである。

ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖に関する上式において、Ｆｃ領域は、天然または変異型Ｆｃ領域であり得る。特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤに由来するヒトＦｃ領域である。特定の実施形態において、Ｆｃは、以下に示されるものなどの、ＩｇＧ１に由来するヒトＦｃである。

本発明のある実施形態において、本発明のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、それからＦａｂフラグメントの配列が利用されＦＩＴ－Ｉｇ構造に組み込まれた親抗体の１以上の特性を保持する。１つのさらなる実施形態において、ＦＩＴ－Ｉｇは、標的抗原（すなわち、ＣＤ３およびＢＣＭＡ）に対して親抗体の結合親和性に匹敵する結合親和性を保持すると思われ、このことは、ＣＤ３およびＢＣＭＡ抗原標的に対するＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の結合親和性に、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定した場合、それらの個々の標的抗原に対する親抗体の結合親和性と比較して、１０倍を超える違いは無いことを意味する。

１つの実施形態において、本発明のＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質はＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し、配列番号５０のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第１のポリペプチド鎖；配列番号５１のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第２のポリペプチド鎖；および配列番号５２のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第３のポリペプチド鎖から構成される。

別の実施形態において、本発明のＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質はＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し、配列番号５３のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第１のポリペプチド鎖；配列番号５４のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第２のポリペプチド鎖；および配列番号５５のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第３のポリペプチド鎖から構成される。

別の実施形態において、本発明のＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質はＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し、配列番号８０のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第１のポリペプチド鎖；配列番号８１のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第２のポリペプチド鎖；および配列番号８２のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第３のポリペプチド鎖から構成される。

別の実施形態において、本発明のＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質はＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し、配列番号８３のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第１のポリペプチド鎖；配列番号８４のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第２のポリペプチド鎖；および配列番号８５のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第３のポリペプチド鎖から構成される。

別の実施形態において、本発明のＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質はＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し、配列番号８６のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第１のポリペプチド鎖；配列番号８７のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第２のポリペプチド鎖；および配列番号８８のアミノ酸配列を含んでなる、から本質的になる、またはからなる第３のポリペプチド鎖から構成される。

本発明はまた、ヒトＣＤ３と結合し得る新規な抗体を提供し、この抗体の抗原結合ドメインは、以下に定義されるＣＤＲセットの群から選択される６つのＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のセットを含んでなる。

本発明はまた、ヒトＢＣＭＡと結合し得る新規な抗体を提供し、この抗体の抗原結合ドメインは、以下に定義されるＣＤＲセットの群から選択される６つのＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３のセットを含んでなる。

１つの実施形態において、本発明による結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合部位を含んでなる二重特異性多価免疫グロブリン結合タンパク質であり、少なくとも１つの抗原結合部位は、上記のＣＤＲセット１および２から選択されるＣＤＲセットを含んでなり、少なくとも１つの抗原結合部位は、上記のＣＤＲセット３および４から選択されるＣＤＲセットを含んでなる。

ある実施形態において、本発明による抗ＣＤ３抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含んでなり、これら２つの可変ドメインは、以下のＶＨ／ＶＬ対から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。

さらなる実施形態において、本発明による抗ＢＣＭＡ抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含んでなり、これら２つの可変ドメインは、以下のＶＨ／ＶＬ対から選択されるアミノ酸配列を含んでなる。

別の実施形態において、抗ＣＤ３抗体または抗ＢＣＭＡ抗体は、当技術分野で十分に確立された技術によって、同じ標的抗原を認識する誘導体結合タンパク質を作製するために使用可能である。このような誘導体は、例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびジスルフィド結合したＦｖであり得る。

免疫グロブリンのＦａｂフラグメントは、抗体結合部位を形成するように共有結合的に会合された２成分から構成される。これらの２成分はそれぞれ可変ドメイン－定常ドメイン鎖（ＶＨ－ＣＨ１またはＶＬ－ＣＬ）であるため、Ｆａｂの各Ｖ－Ｃ鎖は、Ｆａｂ結合単位の一方の「半分」と記載される場合がある。

本発明の別の側面において、本明細書に記載される抗体または二重特異性結合タンパク質は、ＣＤ３、ＢＣＭＡ、またはその両方の生物学的機能を調節することができる。別の側面において、本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３シグナル伝達を阻害することができる。別の側面において、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡの、そのリガンドＡＰＲＩＬおよび／またはＢＡＦＦとの相互作用を阻害することができ、場合により、本発明による抗ＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡにより媒介される細胞シグナル伝達経路を阻害することができる。

ある実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定した場合、ヒトＣＤ３に対する結合速度定数（ｋ_ｏｎ）が少なくとも１×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１、例えば、少なくとも３．３×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１以上である。

別の実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定した場合、ヒトＣＤ３に対する解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）が５×１０^－３未満である。

別の実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＣＤ３に対する解離定数（Ｋ_Ｄ）が２×１０^－８Ｍ未満、例えば、１．５×１０^－８Ｍ未満である。

ある実施形態において、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定した場合、ヒトＢＣＭＡに対する結合速度定数（ｋ_ｏｎ）が少なくとも４×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１、例えば、少なくとも１×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１、少なくとも２×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１以上である。

別の実施形態において、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定した場合、ヒトＢＣＭＡに対する解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）が５×１０^－３ｓ^－１未満、１×１０^－３ｓ^－１未満、５×１０^－４ｓ^－１未満、２×１０^－５ｓ^－１未満、または１×１０^－５ｓ^－１未満である。

別の実施形態において、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＢＣＭＡに対する解離定数（Ｋ_Ｄ）が２×１０^－８Ｍ未満、１×１０^－９Ｍ未満、または５×１０^－１０Ｍ未満である。

ある実施形態において、本発明によるＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し得る二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定した場合、ヒトＣＤ３に対する結合速度定数（ｋ_ｏｎ）が少なくとも１×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１、例えば、少なくとも２×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１、または少なくとも３×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１以上であり、同じ結合タンパク質のヒトＢＣＭＡに対する結合速度定数（ｋ_ｏｎ）は少なくとも５×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１、例えば、少なくとも６×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１、または少なくとも８×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１以上である。さらなる実施形態において、本明細書に記載されるようにＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し得る二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質のそれぞれ抗ＣＤ３および抗ＢＣＭＡ特異性が由来するヒトＣＤ３に対する結合速度定数（ｋ_ｏｎ）が親抗ＣＤ３抗体のＣＤ３に対するｋ_ｏｎの１０倍を超えない低下であり、かつ親抗ＢＣＭＡ抗体のＢＣＭＡに対するｋ_ｏｎの１０倍を超えない低下である。言い換えれば、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質が保持する、各抗原（ＣＤ３またはＢＣＭＡ）に対する結合速度定数は、親抗体の、各ＣＤ３抗原またはＢＣＭＡ抗原との反応性により示される結合速度定数（ｋ_ｏｎ）より高いか、同じか、または１桁未満の低下である。本明細書に開示されるように、ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は抗原に対して、親抗体により示される各抗原に対するｋ_ｏｎと比較して一方もしくは両方の抗原に対するｋ_ｏｎに改善を示す場合があり、または一方もしくは両方の抗原に対するｋ_ｏｎはそれぞれ親抗体により示されるものと実質的に同じであるか、または、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質により示される一方もしくは両方の抗原に対するｋ_ｏｎが親抗体と比較して低下している場合には、その低下は１０倍を超えない低下であり得る。例えば、ＦＩＴ－Ｉｇの特定の抗原に対するｋ_ｏｎの、親抗体のその抗原に対するｋ_ｏｎと比較した場合の低下は、５０％未満、２５％未満の低下である。二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇにおいて、親抗体のｋ_ｏｎと比較してこのように高いｋ_ｏｎ値が保持されていることは、当技術分野において驚くべき達成である。

ある実施形態において、本発明によるＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し得る二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴またはバイオレイヤー干渉法によって測定した場合、ヒトＣＤ３に対する解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）が１×１０^－２ｓ^－１未満、８×１０^－３ｓ^－１未満、７×１０^－３ｓ^－１未満、例えば、６×１０^－３ｓ^－１未満であり、同じ結合タンパク質のヒトＢＣＭＡに対する解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）は５×１０^－５ｓ^－１未満、４×１０^－５ｓ^－１未満、３×１０^－５ｓ^－１未満、または５×１０^－６ｓ^－１未満、である。

別の実施形態において、本発明によるＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し得る二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＣＤ３に対する解離定数（Ｋ_Ｄ）が５×１０^－８Ｍ未満、３×１０^－８Ｍ未満、２×１０^－８Ｍ未満、または１．７５×１０^－８Ｍ未満であり、同じ結合タンパク質のヒトＢＣＭＡに対する解離定数（Ｋ_Ｄ）は１×１０^－９Ｍ未満、６×１０^－１０Ｍ未満、３×１０^－１０Ｍ未満、１×１０^－１０Ｍ未満、８×１０^－１１Ｍ未満、または６×１０^－１１Ｍ未満である。さらなる実施形態において、本明細書に記載されるＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し得る二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ヒトＣＤ３ に対する解離定数（Ｋ_Ｄ）が、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質のそれぞれ抗ＣＤ３および抗ＢＣＭＡ特異性が由来する親抗ＣＤ３抗体のＣＤ３に対するＫ_Ｄと１０倍を超える違いは無く、親抗ＢＣＭＡ抗体ｉのＢＣＭＡに対するＫ_Ｄと１０倍を超える違いは無い。言い換えれば、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質が保持する、解離定数（Ｋ_Ｄ）により示される各抗原（ＣＤ３またはＢＣＭＡ）に対する親抗体の結合親和性は、親抗体の、それぞれＣＤ３抗原またはＢＣＭＡ抗原との反応性により示されるＫ_Ｄの一桁以内である。

本明細書に開示されるように、ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、親抗体により示される各抗原に対するＫ_Ｄと比較して一方もしくは両方の抗原に対するＫ_Ｄに改善を示す（すなわち、より低いＫ_Ｄ値を有する；より強固に結合する）場合があり、または一方もしくは両方の抗原に対するＫ_Ｄは、それぞれ親抗体により示されるものと実施的に同じであるか、またはＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質により示される一方もしくは両方の抗原に対するＫ_Ｄは、親抗体のＫ_Ｄと比較して低下を示す（すなわち、より高いＫ_Ｄ値を有する、より弱く結合する）場合があるが、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質と親抗体の間でＫ_Ｄに違いがある場合、その違いは１０倍以内の違いである。例えば、ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、一方または両方の抗原に対して、その一方または両方の親抗体により示される各抗原に対するＫ_Ｄと比較してより低いＫ_Ｄを示す（より強固に結合する）。Ｋ_Ｄにおける親抗ＣＤ３抗体および抗ＢＣＭＡ抗体の結合親和性±１０倍の保持は、当技術分野において驚くべき達成である。

本発明はまた、本明細書に記載されるような少なくとも１種類の抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明はまた、少なくとも１種類の抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントおよび薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明はまた、本明細書に記載されるような抗ＣＤ３抗体および抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントの組合せおよび薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明はまた、ＣＤ３およびＢＣＭＡの両方と反応性二重特異性多価免疫グロブリン結合タンパク質を提供し、この結合タンパク質には、本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体および抗ＢＣＭＡ抗体に由来するＶＨ／ＶＬ結合部位が組み込まれている。特に、本発明は、ＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し得る少なくとも１種類のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質または少なくとも１種類のＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質と薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１種類の付加的有効成分をさらに含んでなってもよい。ある実施形態において、このような付加的成分としては、限定するものではないが、治療薬、造影剤、細胞傷害性薬剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤、補助刺激分子遮断薬、接着分子遮断薬、異なる特異性の抗体またはその機能的フラグメント、検出可能な標識またはリポーター；特定のサイトカインに対する作動薬または拮抗薬、麻薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫原、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、刺激薬（例えば、アンフェタミン、カフェインなど）、β作動薬、吸入ステロイド、エピネフリンまたは類似体、サイトカインが挙げられる。

別の実施形態において、医薬組成物は、ＣＤ３媒介シグナル伝達活性および／またはＢＣＭＡ媒介シグナル伝達活性が有害である障害を治療するための少なくとも１種類の付加的治療薬をさらに含んでなる。

さらなる実施形態において、本発明は、本発明の抗ＣＤ３抗体の１以上のアミノ酸配列をコードする単離された核酸またはその抗原結合フラグメント；本発明の抗ＢＣＭＡ抗体の１以上のアミノ酸配列をコードする単離された核酸またはその抗原結合フラグメント；およびＣＤ３とＢＣＭＡの両方と結合し得る二重特異性Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質の１以上のアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。このような核酸は、種々の遺伝学的分析を実施するためまたは本明細書に記載される抗体もしくは結合タンパク質を発現させる、特性評価する、もしくは１以上の特性を改善するためにベクターに挿入され得る。ベクターは、１以上の核酸分子が、ベクターを保有する特定の宿主細胞において抗体または結合タンパク質の発現を可能とする適当な転写配列および／または翻訳配列に機能的に連結されている、本明細書に記載される抗体または結合タンパク質の１以上のアミノ酸配列をコードする１以上の核酸分子を含んでなり得る。本明細書に記載される結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸をクローニングするまたは発現させるためのベクターの例としては、限定するものではないが、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ｐＪＶ、およびｐＢＪ、およびそれらの誘導体が挙げられる。

本発明はまた、本明細書に記載される抗体または結合タンパク質の１以上のアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。本発明において有用な宿主細胞は、原核または真核細胞であり得る。例示的原核生物宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)である。本発明において宿主細胞として有用な真核細胞としては、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞、および真菌細胞が挙げられる。例示的真菌細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を含む酵母細胞である。本発明による宿主細胞として有用な例示的動物細胞としては、限定するものではないが、哺乳動物細胞、鳥類細胞、および昆虫細胞が挙げられる。例示的哺乳動物細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。本発明による宿主細胞として有用な昆虫細胞は、昆虫Ｓｆ９細胞である。

別の側面において、本発明は、抗ＣＤ３抗体またはその機能的フラグメントを生産する方法であって、抗体または機能的フラグメントをコードする発現ベクターを含んでなる宿主細胞を、宿主細胞によるＣＤ３と結合し得る抗体またはフラグメントの発現を生じさせるのに十分な条件下、培養培地中で培養することを含んでなる方法を提供する。別の側面において、本発明は、抗ＢＣＭＡ抗体またはその機能的フラグメントを生産する方法であって、抗体または機能的フラグメントをコードする発現ベクターを含んでなる宿主細胞を、宿主細胞によるＢＣＭＡと結合し得る抗体またはフラグメントの発現を生じさせるのに十分な条件下、培養培地中で培養することを含んでなる方法を提供する。別の側面において、本発明は、ＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し得る二重特異性多価結合タンパク質、具体的には、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を生産する方法であって、結合タンパク質をコードする発現ベクターを含んでなる宿主細胞を、宿主細胞によるＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し得る結合タンパク質の発現を生じさせるのに十分な条件下、培養培地中で培養することを含んでなる方法を提供する。このようにして生産されたタンパク質を単離し、本明細書に記載される種々の組成物および方法において使用することができる。

１つの実施形態において、本発明は、必要とする対象において癌を治療するための方法であって、対象に本明細書に記載されるような抗ＣＤ３抗体またはそのＣＤ３結合フラグメントを投与することを含んでなる方法を提供し、この抗体または結合フラグメントは、ＣＤ３と結合し、ＣＤ３発現細胞においてＣＤ３媒介シグナル伝達を阻害することができる。別の実施形態において、本発明は、必要とする対象において癌を治療するための方法であって、対象に本明細書に記載されるような抗ＢＣＭＡ抗体またはそのＢＣＭＡ結合フラグメントを投与することを含んでなる方法を提供し、この抗体または結合フラグメントは、ＢＣＭＡと結合し、ＢＣＭＡ発現細胞においてＢＣＭＡ媒介シグナル伝達を阻害することができる。別の実施形態において、本発明は、必要とする対象において癌を治療するための方法であって、対象に、本明細書に記載されるようなＣＤ３とＢＣＭＡの両方に結合し得る二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を投与することを含んでなる方法を提供し、この結合タンパク質は、ＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し、ＣＤ３発現細胞においてＣＤ３媒介シグナル伝達を阻害し、かつ、ＢＣＭＡ発現細胞においてＢＣＭＡ媒介シグナル伝達を阻害することができる。

別の実施形態において、本発明は、必要とする対象において自己免疫疾患または癌を治療するための方法を提供し、この結合タンパク質はＣＤ３およびＢＣＭＡと結合することができ、この自己免疫疾患または癌は、自己免疫疾患または典型的に免疫療法に応答する癌である。別の実施形態において、癌は、免疫療法に関連付けられていない癌である。別の実施形態において、癌は、難治性または再発性の悪性腫瘍である癌である。別の実施形態において、結合タンパク質は、腫瘍細胞の増殖または生存を阻害する。別の実施形態において、癌は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、およびその他の新生悪性腫瘍からなる群から選択される。

本明細書に記載される治療方法は、必要とする対象に、完全または部分的ホスホジエステルまたはホスホロチオエート骨格を含んでなるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）などの免疫刺激性アジュバントを投与することをさらに含んでなり得る。例えば、本発明の治療方法において、本発明の抗体またはＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を含んでなる組成物、および治療を必要とする対象に投与される組成物には、免疫刺激性アジュバントを組み込むことができる。別の実施形態において、本発明の治療方法は、治療を必要とする対象に本明細書に記載される抗体またはＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を投与する工程および対象に本発明の抗体またはＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を投与する工程の前、同時、または後に対象に免疫刺激性アジュバントを投与する別の工程を含んでなり得る。

図１は、マイクロプレート上に固定化されているヒトＣＤ３ε／γヘテロ二量体－Ｆｃ融合タンパク質標的に対する試験抗体の結合を示すプロットのコレクションである。新たに単離されたｍＡｂＣＤ３－００１およびｍＡｂＣＤ３－００２の結合活性を参照抗ＣＤ３モノクローナル抗体（「対照α－ＣＤ３ ｍＡｂ」）および陰性対照としての無関係のマウス抗体（「ｍＩｇＧ」）と比較している。 図２は、マイクロプレート上に固定化されているカニクイザルＣＤ３ε／γヘテロ二量体－Ｆｃ融合タンパク質標的に対する試験抗体の結合を示すプロットのコレクションである。新たに単離されたｍＡｂＣＤ３－００１およびｍＡｂＣＤ３－００２の結合活性を参照抗ＣＤ３モノクローナル抗体（「対照α－ＣＤ３ ｍＡｂ」）および陰性対照としての無関係のマウス抗体（「ｍＩｇＧ」）と比較している。 図３は、抗ＣＤ３抗体ｍＡｂＣＤ３－００１（本発明）およびＯＫＴ３（陽性対照）によってｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ヒトＴ細胞の増殖が刺激されたことを示す棒グラフである。 図４は、抗ＣＤ３抗体ｍＡｂＣＤ３－００１（本発明）およびＯＫＴ３（陽性対照）によってｉｎ ｖｉｔｒｏ培養ヒトＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮ－ｇ）の分泌が刺激されたことを示す棒グラフである。 図５Ａ～５Ｈは、ｍＡｂＣＤ３－００１の種々のヒト化ＶＨ変異体および２つのＶＫ変異体（ＥＭ０００６－０１ＶＫ．１またはＥＭ０００６－０１ＶＫ．１Ａ、表２参照）のうちの１つを用いたヒト化抗ＣＤ３抗体構築物の結合活性を比較した蛍光プロットである。これらのプロットは、ＶＨ変異体がＣＤ３結合活性に重要であること、およびＶＬの変更はＪｕｒｋａｔ細胞に対する結合にほとんど効果がなかったことを示す。グラフのパネル５Ａ～５Ｈでのいくつかのプロットの分類は、中間的親和性および低親和性の結合剤との対比によって、ＨｕＥＭ０００６－０１－８およびＨｕＥＭ０００６－０１－１７などの極めて高い親和性のヒト化抗体の識別を可能とした。 図６は、種々の抗ＢＣＭＡ抗体の、ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９においてＢＣＭＡリガンドＢＡＦＦにより誘導されるＮＦ－κＢのリン酸化を阻害する能力を示すグラフである。抗ＢＡＦＦ ｍＡｂおよび無関係の抗ＲＡＣ１マウスＩｇＧをそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。本明細書に記載される新規抗ＢＣＭＡ抗体ｍＡｂＢＣＭＡ－００２およびｍＡｂＢＣＭＡ－００３は、特許文献に記載されている参照抗体（図６にＴＡＢ１およびＴＡＢ２と表示）に比べて勝るとも劣らなかった。詳細は以下の実施例３．３を参照のこと。 図７は、種々の抗ＢＣＭＡ抗体の、ＨＥＫ２９３トランスフェクトＢＣＭＡ発現細胞株ＨＥＫ２９３Ｆ－ＢＣＭＡ－ＮＦ－ｋＢ－ｌｕｃにおいてＢＣＭＡリガンドＢＡＦＦにより誘導されるＮＦ－κＢのリン酸化を阻害する能力を示すグラフである。抗ＢＣＭＡ参照抗体ＴＡＢ１およびＴＡＢ２を比較のための陽性対照として用いた。無関係の抗Ｒｏ１マウスＩｇＧを対照として用いた。 図８は、抗ＢＣＭＡ抗体の、ＢＣＭＡトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞においてＢＣＭＡリガンドＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３）により誘導されるＮＦ－ｋＢ－ルシフェラーゼシグナルを阻害する能力を示すグラフである。 図９は、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に対するＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ Ｆａｂフラグメントの結合を示すグラフである。試験した３つのＦＩＴ－Ｆａｂは同じＢＣＭＡ結合ドメインを有する。実施例４．１、４．２、および４．３を参照のこと。 図１０は、ヒトＴ細胞受容体複合体を発現するようにトランスフェクトしたＣＨＯ細胞（ＣＨＯＫ１／ＣＤ３／ＴＣＲ）に対するＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の結合を示すグラフである（実施例１．１参照）。試験した３つのＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、３種類の異なるヒト化親抗ＣＤ３抗体に由来する異なるＣＤ３結合部位を有する。実施例４．３を参照のこと。 図１１は、ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性ＦＩＴ－ＩｇｓおよびＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｆａｂの、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞と共培養されたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞の活性化をリダイレクトする能力を示すグラフである。比較のために単一特異性抗ＣＤ３ ＩｇＧ（ＨｕＥＭ１００６－０１－２４）およびそのＦａｂフラグメント（ＨｕＥＭ１００６－０１－２４－Ｆａｂ）を試験し、無関係のヒトＩｇＧを陰性対照として用いた。 図１２は、ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性ＦＩＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の、ＮＣＩ－Ｈ９２９と共培養されたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞の活性化をリダイレクトする能力を示すグラフである。抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体と抗ＣＤ３モノクローナル抗体の組合せおよび無関係のＦａｂ（ＦＩＴ１００２－５ａ－Ｆａｂ）を対照として用いた。 図１３は、種々のＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性ＦＩＴ－Ｆａｂの、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に対するＴ細胞細胞傷害性をリダイレクトする能力を示すグラフである。無関係のＦＩＴ－Ｆａｂ（ＦＩＴ１００２－５ａ－Ｆａｂ）、抗ＣＤ３ Ｆａｂ ｍＡｂと抗ＢＣＭＡ ｍＡｂの組合せ（ｃｏｍｂｏ）、参照抗ＢＣＭＡ ｍＡｂ（ＴＡＢ１）単独、抗ＣＤ３ Ｆａｂ単独（ＨｕＥＭ１００６－０１－２４－Ｆａｂ）、および無関係のヒトＩｇＧを対照として用いた。 図１４は、ヒト化ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－ＩｇおよびＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｆａｂが、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ－Ｈ９２９標的細胞を用いずにアッセイが行われる場合に、非標的によりリダイレクトされたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞の限定された活性化を示すことを示すグラフである。抗ＣＤ３ ＩｇＧ（ＨｕＥＭ１００６－０１－２４）、そのＦａｂフラグメント（ＨｕＥＭ１００６－０１－２４－Ｆａｂ）、無関係のＦＩＴ－Ｉｇ（ＦＩＴ１００２－５ａ）、および無関係のヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）を対照として用いた。 図１５は、本発明によるヒト化ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－ＩｇがＮＣＩ－Ｈ９２９腫瘍細胞に対してＴ細胞細胞傷害性をリダイレクトすることができたことを示すグラフである。マウス－ヒトキメラＦＩＴ－Ｉｇ（ＦＩＴ１００６－４ｂ）および無関係のＦＩＴ－Ｉｇ（ＦＩＴ１００２－５ａ）を対照として用いた。 図１６は、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞に対する、上記の２つのＢＣＭＡ／ＣＤ３ヒト化二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の結合活性を示すグラフである。無関係のヒトＩｇＧ抗体（ｈＩｇＧ）を対照として用いた。 図１７は、ＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する、上記の２つのＢＣＭＡ／ＣＤ３ヒト化二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の結合活性を示すグラフである。無関係のヒトＩｇＧ抗体（ｈＩｇＧ）を対照として用いた。 図１８および１９は、ＢＣＭＡ発現標的細胞（図１８）およびＣＤ３発現標的細胞（図１９）に対する結合活性を示し、両方とも２つの代替構成の二重特異性構築物を標的とすることが確認される。 図２０は、ＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇを用いた処置により達成されるヒトＰＢＭＣ移植ＮＰＳＧマウスにおける腫瘍成長の阻害を示す。 図２１は、ＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇを用いた処置により誘導されるＢ細胞枯渇を示す。 図２２は、ＦＩＴ－Ｉｇ処置カニクイザルにおける循環Ｔ細胞の一過性の欠如を示す。

発明の具体的説明

本発明は、新規な抗ＣＤ３抗体、新規な抗ＢＣＭＡ抗体、その抗原結合部分、および多価二重特異性結合タンパク質、例えば、Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）および「一価非対称タンデムＦａｂ二重特異性抗体」または「ＭＡＴ－Ｆａｂ二重特異性抗体」または単に「ＭＡＴ－Ｆａｂ抗体」に関する。本発明の様々な側面は、抗ＣＤ３抗体および抗ＢＣＭＡ抗体および抗体フラグメント、ヒトＣＤ３とヒトＢＣＭＡに結合するＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質、およびＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質、およびそれらの医薬組成物、ならびにそのような抗体、機能的抗体フラグメント、および結合タンパク質を作製するための核酸、組換え発現ベクターおよび宿主細胞に関する。また、ヒトＣＤ３、ヒトＢＣＭＡ、またはその両方を検出するため；ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒトＣＤ３および／またはヒトＢＣＭＡ活性を阻害するため；およびＣＤ３および／またはＢＣＭＡの、それぞれそれらのリガンド、すなわちＴ細胞受容体および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）への結合によって媒介される疾患、特に癌を治療するために、本発明の抗体、機能的抗体フラグメント、および二重特異性結合タンパク質を使用する方法も本発明によって包含される。

本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を持つものとする。これらの用語の意味および範囲は明解である必要があるが、潜在的なあいまいさが生じた場合は、本明細書に示される定義が辞書または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。本明細書では、別段の明記がない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらに、「含む(including)」という用語の使用、ならびに「含む(includes)」および「含まれる(included)」などの他の形式の使用は非限定的である。また、「要素」または「成分」などの用語には、別段の明記がない限り、１つのユニットを含んでなる要素および成分と複数のサブユニットを含んでなる要素および成分の両方を含む。

一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびハイブリダイズに関連して使用される命名法、およびそれらの技術は周知のものであり、当技術分野で一般的に使用されている。本発明の方法および技術は一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って、また、別段の表示がない限り、本明細書中に引用および記述されている様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実施される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様に従って、または野で一般的に達成されているように、または本明細書に記載されているように実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、および医薬品化学・薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は周知のものであり、当業者で一般的に使用されている。標準的技術が化学合成、化学分析、医薬品調製、処方、送達、および患者の治療に使用される。

本発明がより容易に理解される可能性があるため、選択した用語を以下に定義する。

「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のいずれのポリマー鎖も指す。「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、ポリペプチドという用語と互換的に使用され、これもまたアミノ酸のポリマー鎖を指す。「ポリペプチド」という用語は、天然または人工タンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質アミノ酸配列のポリペプチド類似体を含む。「ポリペプチド」という用語は、文脈上別段の矛盾がない限り、それらのフラグメントおよび変異体（変異体のフラグメントを含む）を含む。抗原性ポリペプチドの場合、ポリペプチドのフラグメントは、場合により、ポリペプチドの少なくとも１つの連続エピトープまたは非線形エピトープを含む。少なくとも１つのエピトープフラグメントの正確な境界は、当技術分野の通常の技術を用いて確認することができる。フラグメントは、少なくとも約５個の連続するアミノ酸、例えば、少なくとも約１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５個の連続するアミノ酸、または少なくとも約２０個の連続するアミノ酸を含んでなる。ポリペプチドの変異体は、本明細書に記載されている通りである。

「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源または誘導源のために、その天然状態で付随する天然に会合している成分と会合していないか、同種に由来する他のタンパク質を実質的に含まないか、異種由来の細胞によって発現されるか、または天然には存在しないタンパク質またはポリペプチドである。よって、化学的に合成された、または天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然に会合している成分から「単離」されている。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離により、天然に会合している成分を実質的に含まないようにすることができる。

「回復する」という用語は、ポリペプチドなどの化学種を、例えば、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いる単離によって、天然に会合している成分を実質的に含まないようにする過程を指す。

「生物活性」という用語は、本明細書に記載される抗ＣＤ３抗体または抗ＢＣＭＡ抗体のあらゆる生物学的特性を指す。ＣＤ３抗体の生物学的特性としては、限定するものではないが、ＣＤ３タンパク質への結合が挙げられ；抗ＢＣＭＡ抗体の生物学的特性としては、限定するものではないが、例えば、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、および／またはＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）タンパク質への結合が挙げられる。

抗体、結合タンパク質、またはペプチドの第２の化学種との相互作用に関して、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、その相互作用が第２の化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、一般にタンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識して結合する。ある抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」および抗体を含む反応物中にエピトープＡ（または遊離型の非標識Ａ）を含む分子が存在すると、抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。

「抗体」という用語は、広義には、４つのポリペプチド鎖、すなわち、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖から構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合の特徴を保持するその任意の機能的フラグメント、突然変異体、変異体、もしくは誘導体を指す。このような突然変異体、変異体、または誘導体抗体形式は当技術分野で公知である。それらの非限定実施形態を以下に論じる。

全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される。ＶＨドメインの第１、第２および第３のＣＤＲは一般にＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３として列挙され、同様に、ＶＬドメインの第１、第２および第３のＣＤＲは一般にＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３として列挙される。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。

「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられ、無傷抗体のパパイン消化によって作出できる。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域であってもまたは変異体Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、２つの定常ドメイン、すなわち、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含んでなり、場合により、例えば、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体のＦｃ領域の場合と同様にＣＨ４ドメインを含んでなる。ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、およびＩｇＤ抗体のＦｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＨ３ドメインを含んでなる。対照的に、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体のＦｃ領域はヒンジ領域を欠くが、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインを含んでなる。抗体エフェクター機能を変更するためにＦｃ部分にアミノ酸残基の置換を有する変異体Ｆｃ領域は当技術分野で公知である（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２６０号および同第５，６２４，８２１号参照）。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、貪食作用、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、および抗体および抗原抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。これらのエフェクター機能は治療抗体に望ましい場合もあるが、治療目的によっては不要または有害でさえある場合もある。特定のヒトＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３はそれぞれＦｃγＲｓおよび補体Ｃ１ｑへの結合を介してＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。さらに別の実施形態において、抗体のエフェクター機能が変更されるように、抗体の定常領域、例えば抗体のＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸残基が置換される。免疫グロブリンの２つの同一の重鎖の二量体化は、ＣＨ３ドメインの二量体化によって媒介され、ＣＨ１定常ドメインをＦｃ定常ドメイン（例えば、ＣＨ２およびＣＨ３）に接続するヒンジ領域内のジスルフィド結合によって安定化される。ＩｇＧの抗炎症活性は、ＩｇＧ ＦｃフラグメントのＮ結合グリカンのシアリル化に完全に依存する。適切なＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントが作出できるように抗炎症活性の正確なグリカン要件が決定されており、これにより、効力が大幅に増強された完全組換えシアル化ＩｇＧ１ Ｆｃが生成される（Anthony et al., Science, 320:373-376 (2008)参照）。

抗体の「抗原結合部分」および「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」という用語は互換的に使用され、抗原、すなわち、その部分またはフラグメントが由来する全長抗体と同じ抗原（例えば、ＣＤ３、ＢＣＭＡ）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメントによって遂行され得ることが示されている。このような抗体の実施形態はまた二重特異性、二重の特異性、または２つ以上の異なる抗原（例えば、ＣＤ３と、ＢＣＭＡなどの異なる抗原）に特異的に結合する多重特異性形式であってもよい。抗体の「抗原結合部分」に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含んでなる二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）単一可変ドメインを含んでなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)；ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０５１４４号）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の単離された遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、それらがＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成した単一のタンパク質（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)参照）として作製されることを可能とする合成リンカーによって連結させることができる。このような一本鎖抗体はまた、上記に示される抗体の「抗原結合部分」という用語および等価な用語に含まれるものとする。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も含まれる。ダイアボディは、ＶＨドメインとＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上のこれら２つのドメイン間で対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用しているために別の鎖の相補的ドメインとの対合を余儀なくされて２つの抗原結合部位を作り出している二価の二重特異性抗体である（例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)参照）。このような抗体結合部分は当技術分野で公知である(Kontermann and Duebel編, Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001), p. 790 (ISBN 3-540-41354-5))。さらに、一本鎖抗体にはまた、相補的軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成する１対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含んでなる「直鎖抗体」も含まれる(Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995); and US Patent No. 5,641,870))。

免疫グロブリン定常（Ｃ）ドメインは、重鎖（ＣＨ）または軽鎖（ＣＬ）定常ドメインを指す。マウスおよびヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。

「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を形成する個々の抗体は微量存在する可能性のある天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原決定基（エピトープ）に向けられている。さらに、一般に種々の決定基（エピトープ）に向けられた種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは、抗原上の単一の決定基に向けられる。修飾語の「モノクローナル」は、特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈させるべきでない。

「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含んでもよい。しかしながら、「ヒト抗体」という用語には、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体を含まない。

「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体(Hoogenboom, H.R., Trends Biotechnol., 15: 62-70 (1997); Azzazy and Highsmith, Clin. Biochem., 35: 425-445 (2002); Gavilondo and Larrick, BioTechniques, 29: 128-145 (2000); Hoogenboom and Chames, Immunol. Today, 21: 371-378 (2000))、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Taylor et al., Nucl. Acids Res., 20: 6287-6295 (1992); Kellermann and Green, Curr. Opin. Biotechnol., 13: 593-597 (2002); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)参照）；または他のいずれかの手段により調製、発現、作出もしくは単離された、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作出もしくは単離されたあらゆるヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用する場合には、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）の対象となるので、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来および関連しながら、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然には存在しない可能性のある配列である。

「キメラ抗体」という用語は、ある種の重鎖および軽鎖可変領域配列と別の種の定常領域配列を含んでなる抗体、例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。

「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、ＶＨおよび／またはＶＬの１以上のＣＤＲ領域の配列が別の種のＣＤＲ配列で置換された、重鎖および軽鎖可変領域配列を含んでなる抗体、例えば、ヒトＣＤＲの１以上がマウスＣＤＲ配列で置換された、ヒト重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。

「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス）に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列を含んでなるが、ＶＨ配列および／またはＶＬ配列の少なくとも一部がより「ヒト様」に、すなわち、ヒト生殖細胞系可変配列により類似するように変更された抗体を指す。ヒト化抗体の一種は、ヒトＶＨおよびＶＬフレームワーク配列に非ヒト種（例えば、マウス）由来のＣＤＲ配列が導入されたＣＤＲグラフト抗体である。ヒト化抗体は、対象とする抗原に免疫特異的に結合し、かつ実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域および定常領域と実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる抗体またはその変異体、誘導体、類似体もしくはそのフラグメントである。本明細書で使用する場合、ＣＤＲに関して「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の総てまたは実質的に総てが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のそれに相当し、フレームワーク領域の総てまたは実質的に総てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ）の実質的に総てを含んでなる。ある実施形態において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般にヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を含んでなる。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインおよび／またはヒト化重鎖のみを含む。

ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む免疫グロブリンのいずれのクラス、限定するものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むいずれのアイソタイプから選択されてもよい。ヒト化抗体は、２つ以上のクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含んでなってもよく、当技術分野で周知の技術を用いて処方のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択してもよい。

ヒト化抗体のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域は、親配列に厳密に相当する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲまたはアクセプターフレームワークは、その部位のＣＤＲ残基またはフレームワーク残基がドナー抗体またはコンセンサスフレームワークのいずれにも相当しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失によって変異誘発されてもよい。ある例示的実施形態では、しかしながら、このような突然変異は広範囲ではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が親ＦＲおよびＣＤＲ配列のそれに相当する。ドナー抗体のその位置に見られる同じアミノ酸を復元するための特定のフレームワーク位置での復帰突然変異は、特定のループ構造を保持するため、または標的抗原との接触のためにＣＤＲ配列を適正に配向するために利用される場合が多い。

「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変ドメイン配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれには３つのＣＤＲがあり、これらはＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。「ＣＤＲセット」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原と結合し得る単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、システムごとに異なる方法で定義されている。Ｋａｂａｔ(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987) and (1991))により記載されているシステムは、抗体のいずれの可変領域にも適用可能な明確な残基ナンバリング体系を提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。

当技術分野で認識されている「Ｋａｂａｔナンバリング」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域において他のアミノ酸残基よりも可変である（すなわち、超可変である）アミノ酸残基をナンバリングする体系を指す。Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190: 382-391 (1971);およびKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)参照。

過去２０年間の可変の重鎖および軽鎖領域のアミノ酸配列の大規模な公開データベースの成長と分析により、フレームワーク領域（ＦＲ）と可変領域配列内のＣＤＲ配列との間の典型的な境界の理解に至り、当業者がＫａｂａｔナンバリング、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング、またはその他のシステムに従ってＣＤＲを正確に決定することが可能となった。例えば、Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," In Kontermann and Duebel, 編, Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), 第31章, 432-433頁参照。

「多価結合タンパク質」という用語は、２つ以上の抗原結合部位を含んでなる結合タンパク質を表す。多価結合タンパク質は好ましくは、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般に天然に存在する抗体ではない。「二重特異性結合タンパク質」という用語は、特異性の異なる２つの標的と結合し得る結合タンパク質を指す。本発明の「Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン」（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合部位を含んでなり、一般に、四価結合タンパク質である。ＦＩＴ－Ｉｇは単一特異性、すなわち１つの抗原と結合し得るか、または多重特異性、すなわち２つ以上の抗原と結合し得る。本発明による例示的ＦＩＴ－ＩｇはＣＤ３とＢＣＭＡの両方と結合し、従って、二重特異性である。２つの長い（重）Ｖ－Ｃ－Ｖ－Ｃ－Ｆｃ鎖ポリペプチドと４つの短い（軽）Ｖ－Ｃ鎖ポリペプチドを含んでなるＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、４つのＦａｂ抗原結合部位を呈するヘキサマーを形成する（ＶＬ－ＣＬと対合したＶＨ－ＣＨ１、場合によりＶＨ－ＣＨ１：：ＶＬ－ＣＬと表記）。ＦＩＴ－Ｉｇの各半分は１つの重鎖ポリペプチドと２つの軽鎖ポリペプチドを含んでなり、これらの３鎖のＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＣＬ要素の相補的免疫グロブリン対合は、タンデム配置された２つのＦａｂ構造化抗原結合部位を生じる。本発明において、Ｆａｂ要素を含んでなる免疫グロブリンドメインはドメイン間リンカーを使用せずに重鎖ポリペプチド内で直接融合されることが好ましい。すなわち、長い（重）ポリペプチド鎖のＮ末端Ｖ－Ｃ要素はそのＣ末端で、別のＶ－Ｃ要素のＮ末端に直接融合され、これが次にＣ末端Ｆｃ領域に連結される。二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質では、タンデムＦａｂ要素は、異なる抗原と反応性がある。各Ｆａｂ抗原結合部位は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含んでなり、抗原結合部位当たり合計６つのＣＤＲがある。いくつかの実施形態において、本発明の多価結合タンパク質は、実質的にＣ末端Ｆｃ領域がないＦＩＴ－ＩｇであるＦＩＴ－Ｉｇ Ｆａｂフラグメント（すなわち、ＦＩＴ－Ｆａｂ）である。このようなＦＩＴ－Ｆａｂは、既存のＦＩＴ－ＩｇからＣ末端Ｆｃ領域を除去することによって得ることができるか、または例えば、対応するペプチド鎖をコードする発現ベクターを含んでなる宿主細胞からの発現など、当技術分野で公知のいくつかの技術のいずれかによって生産することができる。

ＦＩＴ－Ｉｇ分子の設計、発現、および特性評価の説明は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１０３０７２号に示されている。このようなＦＩＴ－Ｉｇ分子の例は、重鎖および２つの異なる軽鎖を含んでなる。重鎖は、構造式ＶＬ_Ａ－ＣＬ－ＶＨ_Ｂ－ＣＨ１－Ｆｃ（ここで、ＣＬはＶＨ_Ｂに直接融合されている）またはＶＨ_Ｂ－ＣＨ１－ＶＬ_Ａ－ＣＬ－Ｆｃ（ここで、ＣＨ１はＶＬ_Ａに直接融合されている）を含んでなり、ＶＬ_Ａは、抗原Ａと結合する親抗体に由来する軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_Ｂは抗原Ｂと結合する親抗体に由来する重鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣ末端ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３部分）である。ＦＩＴ－Ｉｇの２つの軽ポリペプチド鎖はそれぞれ式ＶＨ_Ａ－ＣＨ１およびＶＬ_Ｂ－ＣＬを有する。二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇの実施形態では、抗原Ａおよび抗原Ｂは異なる抗原であるか、または同じ抗原の異なるエピトープである。本発明において、ＡおよびＢの一方はＣＤ３であり、他方はＢＣＭＡである。

本明細書で使用する場合、「直接融合される」という用語は、ポリペプチド構造内の２つのドメインの線形接続を指す場合、人工的なポリペプチドリンカーまたはコネクターを使用することなくドメインがペプチド結合によって直接連結されることを意味する。

「活性」という用語は、特異性をもって標的抗原と結合する能力、抗原に対する抗体の親和性、標的抗原の生物活性を中和する能力、標的抗原とその天然受容体の相互作用を阻害する能力などの特性を含む。本発明の例示的抗体および結合タンパク質は、ＣＤ３のそのリガンドとの結合を阻害する能力、ＢＣＭＡのそのリガンドとの結合を阻害する能力、または本明細書に記載される二重特異性結合タンパク質の場合にはその両方を有する。

「ｋ_ｏｎ」（「Ｋｏｎ」、「ｋｏｎ」とも）という用語は、本明細書で使用する場合、当技術分野で公知のように、会合複合体、例えば、抗体／抗原複合体を形成させる結合タンパク質（例えば、抗体）と抗原の会合に関する結合速度定数を指すことを意図する。「ｋ_ｏｎ」はまた、本明細書で互換的に使用されるような用語「会合速度定数」、または「ｋａ」によっても知られる。この値は、以下の式に示すように、抗体のその標的抗原に対する結合速度または抗体と抗原の間の複合体形成速度を示す。
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ－Ａｇ

「ｋ_ｏｆｆ」（「Ｋｏｆｆ」、「ｋｏｆｆ」とも）という用語は、本明細書で使用する場合、当技術分野で公知のように、結合タンパク質（例えば、抗体）の会合複合体（例えば、抗体／抗原複合体）からの解離に関する解離速度定数(off rate constant)、または「解離速度定数(dissociation rate constant)」を指すことを意図する。この値は、以下の式に示すように、抗体のその標的抗原からの解離速度またはＡｂ－Ａｇ複合体の遊離抗体および抗原への経時的な分離を示す。
Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ－Ａｇ

「Ｋ_Ｄ」（「Ｋｄ」とも）という用語は、本明細書で使用する場合、「平衡解離定数」を指すことを意図し、平衡状態での力価測定で、または解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）を会合速度定数（ｋ_ｏｎ）で割ることによって得られる値を指す。会合速度定数（ｋ_ｏｎ）、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）、および平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、抗体と抗原の結合親和性を表すために使用される。会合および解離速度定数を決定するための方法は当技術分野で周知である。蛍光に基づく技術を使用すると、高感度と、平衡状態にある生理学的バッファー中のサンプルを調べる能力が得られる。他の実験アプローチおよびＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用分析）アッセイなどの機器も使用可能である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ａ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ、ウプサラ、スウェーデンから入手可能な機器）。例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＬＬＣ）を使用するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）はもう１つの親和性アッセイ技術である。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ボイシ、アイダホ州）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）アッセイも使用可能である。

「単離された核酸」という用語は、ヒト介入によって、本来一緒に見られるポリヌクレオチドの総てまたは一部と会合されてない；本来連結されていないポリヌクレオチドと機能的に連結されている；またはより長い配列の一部として本来存在しない、（例えば、ゲノムの、ｃＤＮＡの、もしくは合成起源の、またはそれらのいくつかの組合せの）ポリヌクレオチドを意味するものとする。

「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、それが連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子を指すことを意図する。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的ＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。もう１つのタイプのベクターはウイルスベクターであり、付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞で自律的複製能を有する（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへ込み込まれ得るので、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドと互換的に使用することができ、最も慣用されるベクターの形態である。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。

「機能的に連結される」という用語は、記載されている成分が、それらの意図された方法で機能することを可能とする関係にある場合の並置を指す。コード配列に「機能的に連結された」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるような方法で連結される。「機能的に連結された」配列には、対象とする遺伝子に隣接する発現制御配列と、対象とする遺伝子を制御するためにトランスまたは一定の距離で作用する発現制御配列の両方が含まれる。「発現制御配列」という用語は、本明細書で使用する場合、それらが連結されたコード配列の発現およびプロセシングを果たすために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適当な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および所望であれば、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。このような制御配列の性質は宿主生物によって異なり；原核生物では、このような制御配列には一般に、プロモーター、リボゾーム結合部位、および転写終結配列が含まれ；真核生物では、一般に、このような制御配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれる。「制御配列」という用語は、存在が発現とプロセシングに不可欠である成分を含むことを意図し、存在が有利である付加的成分、例えば、リーダー配列またはシグナル配列と融合相手配列を含むこともできる。

「形質転換」は、本明細書で定義する場合、外因性ＤＮＡが宿主細胞に侵入するいずれのプロセスも指す。形質転換は、当技術分野で周知の種々の方法を用いて天然または人工条件下で起こり得る。形質転換は、原核または真核宿主細胞への外来核酸配列の挿入に関して知られているいずれの方法によってもよい。この方法は、形質転換させる宿主細胞に基づいて選択され、限定するものではないが、トランスフェクション、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、および粒子衝撃を含み得る。このような「形質転換」細胞には、挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプラスミドとして、または宿主染色体の一部として複製し得る安定形質転換細胞が含まれる。また、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを限られた時間だけ一時的に発現する細胞も含まれる。

「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、外因性ＤＮＡは導入された細胞を指すことを意図する。ある実施形態において、宿主細胞は、例えば、米国特許第７，２６２，０２８号に記載される宿主細胞など、抗体をコードする２つ以上（例えば、複数）の核酸を含んでなる。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も指すことを意図する。突然変異または環境の影響のいずれかにより、特定の改変が次世代で発生する可能性があるため、そのような後代は、実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用する場合、「宿主細胞」の範囲内になお含まれる。ある実施形態において、宿主細胞には、生命のいずれの界から選択される原核および真核細胞も含まれる。別の実施形態において、真核細胞には、原生生物、真菌、植物および動物細胞が含まれる。別の実施形態において、宿主細胞として、限定するものではないが、原核細胞大腸菌(Escherichia coli)株；哺乳動物細胞株ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＮＳ０、ＳＰ２およびＰＥＲ．Ｃ６；昆虫細胞株Ｓｆ９；ならびに真菌細胞サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。

組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には標準的な技術を使用することができる。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様に従って、または当技術分野で一般に達成されているように、本明細書に記載されるように実施することができる。以上の技術および手順は一般に、当技術分野で周知の従来法に従って、本明細書中に引用および論述されている種々の一般的参照およびより具体的な参照に記載されるように実施することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)参照。

「作動薬」という用語は、本明細書で使用する場合、対象とする分子と接触した際に、分子の特定の活性または機能の大きさに、作動薬の不在下で見られるその活性または機能の大きさと比較して増加を生じる調節剤を指す。「拮抗薬」および「阻害剤」という用語は、本明細書で使用する場合、対象とする分子と接触した際に、分子の特定の活性の大きさに、拮抗薬の不在下で見られるその活性または機能の大きさと比較して低下を生じる調節剤を指す。対象とする特定の拮抗剤には、ヒトＣＤ３およびヒトＢＣＭＡの生物学的または免疫学的活性を遮断または低下させるものが含まれる。

本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、障害またはその１以上の症状の重症度および／または期間を軽減または改善する、障害の進行を予防する、障害の退行を引き起こす、障害に関連する１以上の症状の再発、発症もしくは進行を予防する、障害を検出する、または、別の療法（例えば、予防薬もしくは治療薬）の予防効果もしくは治療効果を増強もしくは改善するために十分な治療の量を指す。

抗ＣＤ３および抗ＢＣＭＡ抗体の生産
本発明の抗ＣＤ３抗体および抗ＢＣＭＡ抗体は、当技術分野で公知の多くの技術のいずれかによって生産してもよい。例えば、宿主細胞からの発現では、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形式は、原核または真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般に使用される種々の技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを含むことを意図する。原核または真核宿主細胞のいずれで本発明の抗体を発現させることも可能であるが、真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞での抗体の発現が好ましく、これはそのような細胞（特に、豊乳動物細胞）は原核細胞よりも適切に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が高いためである。

本発明の組換え抗体を発現させるための例示的哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)に記載されているｄｈｆｒ^－ＣＨＯ細胞を含み、これは例えばKaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)に記載されているようにＤＨＦＲ選択マーカーと併用される）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞で抗体を発現させるのに十分な時間宿主細胞を培養すること、または、宿主細胞が増殖している培養培地中への抗体の分泌によって生産される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培養培地から回収することができる。

宿主細胞はまた、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子などの機能的抗体フラグメントを生産するためにも使用可能である。上記の手順の変形形態は、本発明の範囲内であると理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖のいずれかのＤＮＡをコードする機能的断片で宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましい場合がある。組換えＤＮＡ技術はまた、対象とする抗原に結合するために必要ではない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部または総てを除去するためにも使用することができる。このような末端切断ＤＮＡ分子から発現された分子もまた、本発明の抗体に含まれる。さらに、一方の重鎖および一方の軽鎖が本発明の抗体であり、他方の重鎖および軽鎖が、対象とする抗原以外の抗原に特異的である二機能性抗体は、標準的な化学的架橋法によって本発明の抗体を架橋して第２の抗体を得ることによって生産され得る。

本発明の抗体、またはその抗原結合部分の組換え発現のための例示的システムでは、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってｄｈｆｒ^－ＣＨＯ細胞に導入される。この組換え発現ベクターでは、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子がＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素に機能的に連結されて高レベルの遺伝子転写を駆動するようになっている。組換え発現ベクターはまた、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の、メトトレキサート選択／増幅を用いた選択を可能とするＤＨＦＲ遺伝子も保持する。選択されたトランスフェクト宿主細胞は、抗体の重鎖および軽鎖の発現を可能とするように培養され、無傷抗体が培養培地から回収される。組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、トランスフェクタントを選択肢、宿主細胞を培養し、抗体を培養培地から回収するためには標準的な分子生物学の技術が使用される。は、なおさらに、本発明は、本発明のトランスフェクト宿主細胞を本発明の組換え抗体が生産されるまで好適な培養培地で培養することによる、本発明の組換え抗ＣＤ３抗体または抗ＢＣＭＡ抗体の作製方法も提供する。この方法はさらに、培養培地から組換え抗体を単離することも含んでなる。

ＣＤ３およびＢＣＭＡと結合する二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇの生産
本発明は、ＣＤ３とＢＣＭＡの両方に結合するＦａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン結合タンパク質（ＦＩＴ－Ｉｇ）を提供する。このようなＦＩＴ－Ｉｇ分子の例示的実施形態は、（１）構造式（ｉ）ＶＬ_Ａ－ＣＬ－ＶＨ_Ｂ－ＣＨ１－Ｆｃ（ここで、ＣＬは、ＶＨ_Ｂに直接融合されている）、または構造式（ｉｉ）ＶＨ_Ｂ－ＣＨ１－ＶＬ_Ａ－ＣＬ－Ｆｃ（ここで、ＣＨ１は、ＶＬ_Ａに直接融合されている）のいずれかを含んでなる重ポリペプチド鎖；（２）式ＶＨ_Ａ－ＣＨ１の軽ポリペプチド鎖；および（３）式ＶＬ_Ｂ－ＣＬのもう１つの軽ポリペプチド鎖を含んでなり、ＶＬは軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは免疫グロブリンＦｃ領域であり、ＡはＣＤ３またはＢＣＭＡのエピトープであり、ＢはＣＤ３またはＢＣＭＡのエピトープであり、ただし、ＡとＢは異なる。本発明においては、このようなＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、ＣＤ３とＢＣＭＡの両方に結合する。

好適な宿主細胞で組換え発現させると、ＦＩＴ－Ｉｇの３つの鎖は通常、天然の免疫グロブリンと同様に、６鎖、多価、単量体タンパク質として会合するが、ここで、このような重鎖の２つ（１）、このような軽鎖の２つ（２）、およびこのような軽鎖の２つ（３）は、４つの機能的Ｆａｂ抗原結合部位を呈する６鎖結合タンパク質単量体を形成するように会合する。このようなＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、２つの同一サブユニットを含んでなり、各サブユニットは、１つの重鎖（１）、１つの軽鎖（２）、および１つの軽鎖（３）を含んでなり、これらが一緒にタンデムに配列されたＦａｂ結合部位の対を形成する。このような２つの重鎖サブユニットのＦｃ領域の対合により、合計４つの機能的Ｆａｂ結合単位を有する本発明の６鎖、二重特異性、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質が得られる。

重鎖上でペプチドリンカーを使用して、タンデムに接続されたＦａｂ部分を分離することが可能であるが、本発明による二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇｓの場合、そのようなリンカー配列の省略好ましい。タンデム結合部位を有する多価操作免疫グロブリン形式では、当技術分野において、通常、これらの結合部位を空間的に分離するためにフレキシブルリンカーを使用しない限り、隣接する結合部位が互いに干渉すると理解されていた。しかしながら、本発明のＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇでは、上記の鎖の形式による免疫グロブリンドメインの配置は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞で十分に発現し、適切に組み立て可能で、標的抗原であるＣＤ３およびＢＣＭＡと結合する二重特異性多価免疫グロブリン様結合タンパク質として分泌されるポリペプチド鎖をもたらす。Ｆａｂ結合部位間にリンカー配列がないにもかかわらず、本発明のＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇは、標的抗原に対する結合親和性を保持し、親ｍＡと同等の結合親和性を示す。さらに、結合タンパク質から合成リンカー配列を除くと、哺乳動物の免疫系によって認識される抗原性部位の作成を回避することができ、このようにして、リンカーの除去は、ＦＩＴ－Ｉｇの可能性のある免疫原性を低下させ、天然の抗体同様の循環半減期となり、すなわち、ＦＩＴ－Ｉｇは、免疫オプソニン作用によって急速に除去されることはなく、肝臓に捕捉することもない。

ＦＩＴ－Ｉｇにおける各可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）は、標的抗原、すなわちＣＤ３またはＢＣＭＡの一方と結合する１以上の「親」モノクローナル抗体から得ることができる。ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は有利には、本明細書に開示されるような抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の可変ドメイン配列を用いて作出される。例えば、親抗体はヒト化抗体である。可変ドメインはまた、親和性成熟技術を用いて調製または改良することもできる。

本発明の１つの側面は、ＦＩＴ－Ｉｇ分子において望まされる少なくとも１つまたは複数の特性を有する親抗体の選択に関する。ある実施形態において、これらの抗体特性は、抗原特異性、抗原に対する親和性、効力、生物学的機能、エピトープ認識、安定性、溶解度、生産効率、免疫原性の欠如、薬物動態学、バイオアベイラビリティ、組織交差反応性、およびオーソロガスな抗原結合からなる群から選択される。ＣＤ３およびＢＣＭＡはどちらも細胞表面タンパク質であり、それらの個々のリガンドとの相互作用は、細胞内シグナル伝達経路を印加し、従って、本発明の最適な二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－ＩｇおよびＦＩＴ－Ｆａｂは、ＣＤ３媒介性および／またはＢＣＭＡ媒介性のシグナル伝達を阻害するまたは遮断することができるであろう。

本発明による抗体、それらの機能的フラグメント、および結合タンパク質は、抗体および結合タンパク質を精製するために当技術分野で利用可能な様々な方法および材料を用いて精製することができる（使用を意図して）。このような方法および材料としては、限定するものではないが、意図される使用に許容される純度を得るための、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、または抗体、その機能的フラグメント、または結合タンパク質の特定のリガンドとコンジュゲートされた樹脂、粒子、または膜を使用）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、イオン交換粒子または膜を使用）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」；例えば、疎水性粒子または膜を使用）、限外濾過、ナノフィルトレーション、ダイアフィルトレーション、サイズ排除クロマトグラフィー（「ＳＥＣ」）、低ｐＨ処理（夾雑ウイルスを不活化するため）、およびそれらの組合せが挙げられる。夾雑ウイルスを不活化するための低ｐＨ処理の限定されない例は、本発明の抗体、その機能的フラグメント、または結合タンパク質を含んでなる溶液または懸濁液のｐＨを１８℃～２５℃で６０～７０分間、０．５Ｍリン酸でｐＨ３．５に降下させることを含んでなる。

本発明の抗体および結合タンパク質の使用
ヒトＣＤ３および／またはＢＣＭＡに結合する能力を考えると、本明細書に記載される抗体、その機能的断片、および本明細書に記載される二重特異性多価結合タンパク質は、ＣＤ３もしくはＢＣＭＡ、またはその両方を、例えば、これらの標的抗原の一方または両方を発現する細胞を含む生物学的サンプルにおいて検出するために使用することができる。本発明の抗体、機能的断片、および結合タンパク質は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または免疫組織化学などの従来のイムノアッセイで使用することができる。本発明は、生物学的サンプル中のＣＤ３またはＢＣＭＡを検出するための方法であって、生物学的サンプルを本発明の抗体、その抗原結合部分、または結合タンパク質と接触させ、標的抗原に結合するかどうかを検出し、それによりその生物学的サンプル中の標的の有無を決定することを含む方法を提供する。この抗体、機能的フラグメント、または結合タンパク質は、結合したまたは結合していない抗体／フラグメント／結合タンパク質の検出を容易にするために検出可能な物質で直接または間接的に標識してもよい。好適な検出可能物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリン エステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；好適な放射性物質の例としては、^３Ｈ_、 ^１４Ｃ_、 ^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏ、または^１５３Ｓｍが挙げられる。

本発明の抗体、それらの機能的フラグメント、および結合タンパク質は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でヒトＣＤ３および／またはヒトＢＣＭＡ活性を中和することができる。よって、本発明の抗体、それらの機能的フラグメント、および結合タンパク質は、ヒトＣＤ３活性および／またはヒトＢＣＭＡ活性を阻害するため、例えば、本発明の抗体、その機能的フラグメント、または結合タンパク質が交差反応するＣＤ３またはＢＣＭＡを有するヒト対象、または他の哺乳動物対象において、ＣＤ３発現および／またはＢＣＭＡ発現細胞を含む細胞培養物においてＣＤ３／Ｔ細胞相互作用および／またはＢＣＭＡ／Ｂ細胞相互作用によって媒介される細胞シグナル伝達を阻害するために使用することができる。

別の実施形態において、本発明は、ＣＤ３活性および／またはＢＣＭＡ活性が有害な疾患または障害に罹患している対象を治療するための方法を提供し、このような方法は、対象に本発明の抗体または結合タンパク質を、対象におけるＣＤ３結合および／またはＢＣＭＡ結合により媒介される活性が低減されるような有効量で投与することを含んでなる。

本明細書で使用する場合、「ＣＤ３活性および／またはＢＣＭＡ活性が有害な障害」という用語には、その障害に罹患している対象におけるＣＤ３とＣＤ３リガンドとの相互作用またはＢＣＭＡとＢＣＭＡリガンドとの相互作用がその障害の病態生理学の一因であるか、またはその障害の増悪に寄与する因子である、疾患およびその他の障害が含まれる。よって、ＣＤ３活性および／またはＢＣＭＡ活性が有害な障害は、ＣＤ３活性および／またはＢＣＭＡ活性の阻害がその障害の症状および／または進行を緩和することが期待される障害である。

別の実施形態において、本発明は、必要とする対象において自己免疫疾患または癌を治療するための方法であって、対象にＣＤ３、ＢＣＭＡ、またはＣＤ３およびＢＣＭＡの両方と結合し得る本明細書に記載される抗体、その機能的フラグメント、または結合タンパク質を投与することを含んでなる方法を提供し、自己免疫疾患または癌は免疫療法に応答性のある疾患である。別の実施形態において、本発明の方法は、免疫療法に関連付けられていない自己免疫疾患または癌を治療するために使用される。別の実施形態において、本発明の方法は、難治性または再発性悪性腫瘍である癌を治療するために使用される。別の実施形態において、本発明のＣＤ３抗体またはＢＣＭＡ抗体、その機能的フラグメント、またはＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、腫瘍細胞の増殖または生存を阻害する方法において使用される。

別の実施形態において、本発明は、対象において癌を治療するための方法であって、対象に本明細書に記載されるＣＤ３またはＢＣＭＡに対する抗体、その機能的フラグメント、または本明細書に記載されるＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質、例えば、Ｆａｂｓ－ｉｎ－ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質、またはＭＡＴ－Ｆａｂ結合タンパク質を投与する工程を含んでなる方法を提供し、癌は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、原発骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、および軟骨肉腫）、転移性癌、およびその他の新生悪性腫瘍からなる群のいずれかから選択される。

本発明はまた、本発明の抗体、またはその抗原結合部分、または二重特異性多価結合タンパク質（すなわち、主要有効成分）、または本発明の二重特異性一価結合タンパク質および薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明のタンパク質を含んでなる医薬組成物は、限定するものではないが、障害の診断、検出、もしくは監視；障害もしくはその１以上の症状の治療、管理、もしくは改善；および／または研究において使用するためのものである。特定の実施形態において、組成物は、本発明の１以上の抗体または結合タンパク質を含んでなる。別の実施形態において、医薬組成物は、本発明の１以上の抗体または結合タンパク質、ならびに本発明の抗体または結合タンパク質以外の、ＣＤ３活性および／またはＢＣＭＡ活性が有害な障害を治療するための１以上の予防薬または治療薬を含んでなる。ある実施形態において、これらの予防薬または治療薬は、障害またはその１以上の症状の予防、治療、管理、または改善のために有用であることが知られる、またはそれに使用されていた、または現在使用されている。これらの実施形態によれば、組成物はさらに、担体、希釈剤、または賦形剤を含んでなってもよい。賦形剤は一般に、組成物に主要有効成分以外（すなわち、本発明の抗体、その機能的部分、または結合タンパク質以外）の所望の特徴を提供する任意の化合物または化合物の組合せである。

本発明の抗体（その機能的フラグメントを含む）および結合タンパク質は、対象への投与に好適な医薬組成物に配合することができる。一般に、医薬組成物は、本発明の抗体または結合タンパク質および薬学上許容可能な担体を含んでなる。本明細書で使用する場合、「薬学上許容可能な担体」には、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学上許容可能な担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１以上、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学上許容可能な担体はさらに、組成物中に存在する抗体または結合タンパク質の保存寿命または有効性を高める微量の、湿潤剤または乳化剤、保存剤、またはバッファーなどの補助物質を含んでなる。

本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、限定するものではないが、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内）、経口、鼻腔内（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、腫瘍内、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。特定の実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内、または局所投与に適合された医薬組成物として常法に従って処方される。一般に、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性バッファー中の溶液である。必要であれば、組成物はまた、可溶化剤および注射部位の疼痛を軽減するためにリドカイン（キシロカイン、リグノカイン）などの局所麻酔薬を含んでもよい。

本発明の方法は、注射（例えば、ボーラス注射または持続的注入）による非経口投与のために処方された組成物の投与を含んでなり得る。注射用処方物は、保存剤を添加して単位投与形（例えば、アンプルまたは多用量容器）で提供してもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含有してもよい。あるいは、主要有効成分は、 使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌発熱性物質除去水）で構成するための粉末形態であってもよい。

本発明の方法はさらに、デポ製剤として処方された組成物の投与を含んでなり得る。このような長時間作用処方物は、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与され得る。よって、例えば、組成物は、好適な高分子物質もしくは疎水性物質（例えば、許容可能な油中のエマルション）またはイオン交換樹脂、または難溶性誘導体（例えば、難溶性塩）を用いて処方され得る。

本発明の抗体、その機能的フラグメント、または結合タンパク質はまた、種々の疾患の治療に有用な１以上の付加的治療薬とともに投与することができる。本明細書に記載される抗体、その機能的フラグメント、および結合タンパク質は、単独で、または付加的薬剤、例えば、治療薬と組み合わせて使用することができ、前記付加的薬剤は、その意図される目的のために当業者により選択される。例えば、付加的薬剤は、本発明の抗体または結合タンパク質によって治療される疾患または病態を治療するために有用であると当技術分野で認識される治療薬であり得る。付加的薬剤はまた、有益な属性を付与する薬剤、例えば、組成物の粘度に影響を与える薬剤であり得る。

以上、本発明を詳細に説明してきたが、これは以下の実施例を参照することによってより明確に理解され、これらの実施例は、説明の目的で含まれるに過ぎず、本発明の限定を意図するものではない。

実施例１：抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体の作製
抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体を次のように作製した。
実施例１．１：ヒトＣＤ３抗原による免疫誘導
抗ＣＤ３抗体は、１０個体のＢａｌｂ／ｃおよびＳＪＬ／Ｊマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）の群に交互免疫誘導戦略で免疫誘導を行うことによって得た。４つの異なるＣＤ３免疫原を使用し、これには２つのペプチド（ＣＤ３εフラグメント：ＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣ（配列番号２）およびＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫ（配列番号３）、組換えｈｕＣＤ３εγ／Ｆｃ融合タンパク質（融合タンパク質ヘテロ二量体：第１鎖

および第２鎖

、ならびにヒトＴ細胞受容体複合体を発現させるために全長ヒトＣＤ３γ鎖、ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ζ鎖（ゼータ鎖）、ＴＣＲα鎖、およびＴＣＲβ鎖でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株（ＣＨＯＫ１／ＣＤ３／ＴＣＲ）が含まれた。

実施例１．２：ハイブリドーマの作製
マウスに免疫原のうち１つで、２週間隔で免疫誘導を行い（群によっては初回免疫で使用したものとは異なる免疫原で追加免疫を行った）、２回目の注射の後、週に１回、血清力価をモニタリングした。４～６回の免疫誘導の後に、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞株を作出した。次に、ハイブリドーマ細胞の上清をｈｕＣＤ３／Ｆｃ二量体標的に関してスクリーニングし、無関係のタンパク質／Ｆｃ二量体で対比染色してＣＤ３特異的マウス抗体を生産する細胞株を同定した。陽性ハイブリドーマを、抗体の細胞表面結合を確認するためのＪｕｒｋａｔ細胞標的およびＴＣＲ複合体トランスフェクトＣＨＯ細胞標的に対する細胞結合アッセイで試験した。その後、最後に、確認された細胞結合剤をｃｙｎｏＣＤ３εγ／Ｆｃ融合タンパク質を標的として用いてＥＬＩＳＡによりカニクイザル交差反応性に関して試験し、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼリポーター細胞株を用いて抗ＣＤ３作動活性を特徴付けた。この様式で試験したハイブリドーマのうち２つのみが総てのアッセイで陽性判定されたモノクローナル抗体を生産していた。これらをｍＡｂＣＤ３－００１およびｍＡｂＣＤ３－００２と呼称した。

実施例１．３：重鎖および軽鎖可変領域配列
重鎖および軽鎖可変領域を増幅するために、各ハイブリドーマクローンの全ＲＮＡを５×１０^６を超える細胞から、ＴＲＩｚｏｌ（商標）ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６０１８）を用いて単離した。ｃＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）スーパースクリプト（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号１８０８０）を製造者の説明書に従って使用して合成し、軽および重マウス免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）マウスＩｇプライマーセット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号６９８３１３）を用いて増幅させた。ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲルでの、ＳＹＢ（商標）Ｓａｆｅ ＤＮＡゲルステイン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号Ｓ３３１０２）を用いた電気泳動により分析した。適正なサイズのＤＮＡフラグメントを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲルおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ カタログ番号７４０６０９）を製造者の説明書に従って使用して精製し、個々にｐＭＤ１８－Ｔベクターにサブクローニングした。各形質転換から１５のコロニーを選択し、挿入フラグメントの配列をＤＮＡシーケンシングによって分析した。少なくとも８つのコロニーフラグメントがＶＨおよびＶＬのコンセンサス配列と一致するかどうか配列を確認した。マウスモノクローナル抗体可変領域のタンパク質配列を、配列相同性アラインメントによって分析し、表１に列挙した。Ｋａｂａｔナンバリングに基づいて相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を施した。

実施例１．４：ヒトＣＤ３およびカニクイザルＣＤ３の両方と結合する抗ＣＤ３抗体
単離されたマウス抗ＣＤ３抗体の結合特性を以下のようにＥＬＩＳＡを用いて測定した：ヘテロ二量体ＣＤ３εγ／Ｆｃ融合タンパク質を４℃で一晩、９６ウェルプレート上に１μｇ／ｍＬでコーティングした。プレートを洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）で１回洗浄し、室温で２時間、ＥＬＩＳＡブロッキングバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ中、１％ＢＳＡ）でブロッキングした。次に、抗ＣＤ３抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ０１６８）を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄バッファー中で５回洗浄した。１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色溶液を各ウェルに加えた。発色後、反応を１規定ＨＣｌで停止させ、４５０ｎｍでの吸光度をＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウエアを用いて結合シグナルを抗体濃度に対してプロットし、それに応じてＥＣ５０を計算した。図１および図２に示されるように、ｍＡｂＣＤ３－００２は最高の結合活性を示したが、ｍＡｂＣＤ３－００１は、米国特許第８，２３６，３０８号に報告された可変ドメイン配列を用いて発現させた参照抗ＣＤ３ε抗体と同等の結合ＥＣ５０を有した。

実施例１．５：抗ＣＤ３抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒトＴ細胞を活性化する
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）単核細胞単離培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８５１）を使用することで健常ドナーから取得し、ＣＤ３陰性Ｔ細胞選択キット（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）を用いてＰＢＭＣからＴ細胞を単離した。増殖（ＣＴＧ）およびサイトカイン（ＩＦＮ－γ）生産データを、以下のプロトコールを用いて取得した：１００μｌの試験抗体（ｍＡｂＣＤ３－００１、ＯＫＴ３、または陰性対照ＩｇＧ）を４℃で一晩、ｈｉｇｈ－ｂｉｎｄｉｎｇ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ（商標）、カタログ番号３３６１）上にコーティングした後、ＤＰＢＳで洗浄した。市販のＯＫＴ３抗体を陽性抗ＣＤ３対照として用い、無関係のマウスＩｇＧを陰性対照として使用した。各ウェルについて、１×１０^５Ｔ細胞を２００μｌの培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）添加剤）中に播種し、３７℃で９６時間インキュベートした。増殖は、ＡＴＰにより触媒される定量キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することによって測定した。ＩＦＮ－γは、ＬＡＮＣＥ（登録商標）（Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ Ｃｈｅｌａｔｅ Ｅｘｃｉｔｅ）ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号ＴＲＦ１２１７Ｍ）によって測定した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウエアを用いて分析した。結果を図３および４に示す。細胞増殖およびＩＦＮ－γ生産データは、ｍＡｂＣＤ３－００１がｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＴ細胞を活性化することを示した。

実施例２：抗ＣＤ３抗体のヒト化
実施例２．１：ｍＡｂＣＤ３－００１のヒト化
抗ＣＤ３ ｍＡｂＣＤ３－００１可変領域遺伝子を使用してヒト化ｍＡｂを作出した。このプロセスの最初の工程で、全体として最良に一致するヒト生殖細胞系Ｉｇ Ｖ遺伝子配列を見出すために、ｍＡｂＣＤ３－００１のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列（表１前掲参照）を利用可能なヒトＩｇ Ｖ遺伝子配列データベースと比較した。さらに、ＶＨまたはＶＬのフレームワーク４を、それぞれマウスＶＨ領域およびＶＬ領域との最大相同性を有するヒトフレームワークを見出すために、Ｊ領域データベースと比較した。軽鎖では、最も近いヒトＶ遺伝子一致はＢ３遺伝子（Ｖ－ｂａｓｅデータベース）であり、重鎖では、最も近いヒト一致はＶＨ１－２遺伝子であった。次に、ｍＡｂＣＤ３－００１軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３が、ＣＤＲ－Ｌ３の後のＪＫ４フレームワーク４配列とともにＢ３遺伝子のフレームワーク配列にグラフトされ；ｍＡｂＣＤ３－００１ ＶＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列が、ＣＤＲ－Ｈ３の後のＪＨ６フレームワーク４配列とともにＶＨ１－２のフレームワーク配列にグラフトされたヒト化可変ドメイン配列を設計した。次に、ｍＡｂＣＤ３－００１の３Ｄ Ｆｖモデルを作製し、ＣＤＲ残基まで４Å未満の距離で、かつ、ループ構造またはＶＨ／ＶＬ干渉を補助するのに重要である可能性が最も高かったフレームワーク残基が存在するかどうかを決定するために分析した。ヒト化配列におけるこれらの残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に復帰突然変異させるべきである。Ｑ１Ｅ突然変異は、該当する場合、Ｎ末端ピログルタミン酸塩の形成を排除するために常に含まれた。重鎖の場合、Ｙ２７Ｆ、Ｔ２８Ｓ、Ｖ３７Ｍ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｍ６９ＬおよびＲ７１Ａ（Ｋａｂａｔナンバリング）の潜在的突然変異を特定した。軽鎖の場合、Ｔ５ＳおよびＮ２２Ｔを復帰突然変異として特定した。そのＣＤＲとの相互作用によって判定した場合の各復帰突然変異の重要度の階層によって、最も重要な復帰突然変異が、優先度の高い順にヒト化ＶＨ配列に導入され、その後に他の復帰突然変が連続的設計として導入された。また、ＶＫ ＣＤＲ－Ｌ１配列は、潜在的な脱アミド化サイトであるＮＳパターンを有した。このアスパラギンの脱アミド化性を取り除くために、ＮＳはヒト化κ鎖においてＱＳ、ＮＴ、またはＮＡに変異させた。ヒト化ＶＨおよびＶＬ構築物を表２（下記）に示す。（復帰突然変異したフレームワークアミノ酸残基を二重下線で示し、元の親抗体からのマウスＣＤＲを下線で示す。）

対応するアミノ酸配列設計から逆翻訳されたヒト化ＶＨおよびＶＫ遺伝子をｄｅ ｎｏｖｏ合成し、次いで、ヒトＩｇＧ１およびヒトκ定常ドメイン（それぞれ配列番号２６および配列番号２７）を含むベクターにクローニングした。

ヒトＶＨおよびヒトＶＫの対合は、２７種類のヒト化抗体を作出し、ＨｕＥＭ０００６－０１－１～ＨｕＥＭ０００６－０１－２７と呼称した（表３）。親マウスＶＨ／ＶＬおよびヒト定常配列を有するキメラ抗体（ＨｕＥＭ０００６－０１ｃ）もまた作出し、ヒト化抗体のランク付けのための陽性対照として使用した。総ての組換えヒト化ｍＡｂをＨＥＫ２９３細胞で一過性発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。

実施例２．２：ヒト化抗ＣＤ３抗体は種々のＣＤ３結合活性を示した
種々のヒト化ＶＨおよびＶＫ組合せから、種々のＣＤ３結合親和性を有するヒト化抗ＣＤ３変異体が得られた。ｍＡｂＣＤ３－００１のヒト化変異体の結合活性は、ヒトＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株でフローサイトメトリーによって試験した。ＦＡＣＳバッファー中の５×１０^５のＪｕｒｋａｔ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、各ウェルについて、１００μｌの連続希釈抗体を加え、細胞と混合した。４℃で４０分のインキュベーション後、プレートを数回洗浄して余分な抗体を除去した。次に、二次蛍光色素コンジュゲート抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｈ＆Ｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－６０６－１７０）を加え、細胞とともに室温で２０分間インキュベートした。もう１回遠心分離および洗浄工程を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で読み取るために細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の読み取りを抗体濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウエアで解析した。

図５Ａ～５Ｈに示されるように、ヒト化抗ＣＤ３抗体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上の細胞表面ＣＤ３標的に対して広範囲の親和性を示した。κ鎖の違い（すなわち、ＥＭ０００６－０１ＶＫ．１とＥＭ０００６－０１ＶＫ．１Ａの間の）は結合に有意な影響持つとは思われなかったので、ＶＨ変異体は、明らかにこのＣＤ３結合調節の重要な要素であった。いくつかのヒト化抗体、特に、ＶＨ変異体ＥＭ００６－０１ＶＨ．１Ｈを有するＨｕＥＭ０００６－０１－０８およびＨｕＥＭ０００６－０１－１７（表４および配列番号１８参照）は同等に、親マウスＶＨ領域ＥＭ０００６－０１ＶＨを有するキメラ対照抗体ＨｕＥＭ０００６－０１ｃよりもはるかに高いＣＤ３結合を示した（表４参照）。

実施例３：抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の作製
抗ＢＣＭＡ抗体は、Ｂａｌｂ／ｃまたはＳＪＬマウスを、ヒトＦｃ領域に融合されたヒトＢＣＭＡ（ＥＣＤ）のホモ二量体化によって形成された組換えＢＣＭＡ細胞外ドメイン／Ｆｃ二量体で免疫誘導することによって得た。

マウスに２週間隔で免疫誘導を行い、２回目の注射の後に週に１回、血清力価をモニタリングした。

実施例３．１：ハイブリドーマの作製
４～６回の免疫誘導の後、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞に融合してハイブリドーマ細胞株を形成した。融合生成物を９６ウェルプレートにて、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）を含有する選択培地にウェル当たり１×１０^５脾細胞の密度で播種した。融合から７～１０日後に、肉眼で見えるハイブリドーマコロニーを得た。次に、ハイブリドーマ細胞の上清をスクリーニングし、ＢＣＭＡ特異的マウス抗体を産生する細胞株を同定する選択を行った。５種類の抗ＢＣＭＡ抗体を選択し、配列を決定した。

実施例３．２：重鎖および軽鎖可変領域配列
重鎖および軽鎖可変領域を増幅するために、各ハイブリドーマクローンの全ＲＮＡを、５×１０^６を超える細胞からＴＲＩｚｏｌ（商標）ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６０１８）を用いて単離した。ｃＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）スーパースクリプト（商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号１８０８０）を製造者の説明書に従って使用して合成し、軽および重マウス免疫グロブリン鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標）Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）マウスＩｇプライマーセット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号６９８３１３）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＳＹＢＲ（商標）Ｓａｆｅ ＤＮＡゲルステイン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号Ｓ３３１０２）を用い、１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。適正なサイズのＤＮＡフラグメントを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ゲルおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０６０９）を製造者の説明書に従って使用して精製し、個々にｐＭＤ１８－Ｔベクターにサブクローニングした。各形質転換から１５のコロニーを選択し、挿入フラグメントの配列をＤＮＡシーケンシングによって分析した。少なくとも８コロニーのフラグメントがＶＨおよびＶＬのコンセンサス配列と一致するかどうか、配列を確認した。マウスｍＡｂ可変領域のタンパク質配列を配列相同性アラインメントにより分析した。

実施例３．３：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗ＢＣＭＡ抗体の結合速度
抗ＢＣＭＡ抗体の結合親和性および速度定数は、標準的な手順を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した２５℃での表面プラズモン共鳴によって決定した。簡単に述べれば、ヤギの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体をバイオセンサーチップに直接固定し、抗体サンプルを５μｌ／分の流速で反応マトリックスに注入した。マウス抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ試験抗体を固定化された表面に注入され、固定化された抗Ｆｃ抗体によって捕捉された。次に、ヒトおよびカニクイザルのＢＣＭＡ（ＥＣＤ）／Ｆｃ標的ポリペプチドを、捕捉されたマウス抗ＢＣＭＡＩｇＧ表面に注入した。結合および解離速度定数、ｋ_ｏｎ（Ｍ^－１ｓ^－１）およびｋ_ｏｆｆ（ｓ^－１）をそれぞれ３０μｌ／分の連続流速で決定した。速度定数は、標的ＢＣＭＡ（ＥＣＤ）ポリペプチドの５つの異なる濃度で速度論的結合測定を行うことによって導き出した。次に、抗体と関連する標的タンパク質との間の反応の平衡解離定数Ｋ_Ｄ（Ｍ）を、式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎを使用して反応速度定数から計算した。速度定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析ソフトウエアを使用してデータを処理し、１：１の結合モデルに適合させることによって決定した。結果を表７に示す。

ヒトおよびカニクイザルＢＣＭＡ標的の両方に高い親和性を示す２つの抗ＢＣＭＡ抗体をさらに開発し、分析した。これらの選択された抗ＢＣＭＡモノクローナルｍＡｂＢＣＭＡ－００２およびｍＡｂＢＣＭＡ－００３の可変ドメイン配列を以下の表８に示す。Ｋａｂａｔナンバリングに基づいて相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を施した。

実施例３．４：抗ＢＣＭＡ抗体は種々のＢＣＭＡ遮断活性を示した
モノクローナル抗ＢＭＣＡ抗体の、ヒト骨髄腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９においてＢＣＭＡリガンドＢＡＦＦにより刺激されたＮＦκＢのリン酸化を遮断する能力を、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＮＦκＢ（Ｓｅｒ５３６）細胞アッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ；カタログ番号６４ ＮＦＢＰＥＧ）を用いて評価した。ＮＣＩ－Ｈ９２９ヒト骨髄腫細胞をアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、０．１％ＢＳＡ）中で３７℃にて一晩飢餓状態とした。細胞を洗浄し、再懸濁させ、３８４ウェルマイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号６００８２８０）にウェル当たり２×１０^５細胞で播種した。次に、抗体をウェルに加え、細胞とともに約１０分間３７℃でインキュベートした。抗ＢＡＦＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＦ１２４）を陽性対照として使用し、無関係の抗ＲＡＣ１モノクローナル抗体を陰性対照として使用した。参照抗ＢＣＭＡ抗体ＴＡｂ１およびＴＡｂ２（それぞれ国際公開第ＷＯ２０１２／１６３８０５号のクローンＣＡ８および国際公開第ＷＯ２０１４／１２２１４３号のクローン８３Ａ１０）を比較のために試験した。

次に、組換えＢＡＦＦを５μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに加え、３０分間インキュベートした。キット溶解バッファーを加えて細胞を溶解させ、振盪しながら室温で少なくとも３０分間インキュベートした。次に、細胞溶解液を３８４ウェル小容積マイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号６００８２８０）に移した。製造者の説明書に従ってアッセイキット試薬を調製し、ウェルに加えた。室温で４時間の最後のインキュベーションの後、プレートの６６５ｎｍおよび６２０ｎｍの波長での蛍光を読み取った。阻害パーセンテージを計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウエアを用いて抗体濃度に対してプロットした。図６に示されるように、上記のように単離した選択抗ＢＣＭＡ抗体ｍＡｂＢＣＭＡ－００２およびｍＡｂＢＣＭＡ－００３は、ＢＡＦＦにより誘導されたＮＦ－κＢのリン酸化に対して陰性対照（抗ＲＡＣ）よりも優れた阻害活性を示した。

また、別のリポーター遺伝子に基づく発光アッセイ系も使用して、ＢＣＭＡに対するリガンド結合活性の抗体遮断を特徴付けた。ＢＣＭＡを発現するようにトランスフェクトし、ＮＦ－κＢのリン酸化が誘導された際にルシフェラーゼシグナルを発する安定なＨＥＫ２９３Ｆ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｆ－ＢＣＭＡ－ＮＦ－ｋＢ－ｌｕｃクローン１Ｈ２）を所内で確立し、この発光アッセイに使用した。細胞を採取し、洗浄し、アッセイ培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁させた。次に、細胞を９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９０３）にウェル当たり５×１０^４細胞で播種し、試験抗体：ｍＡｂＢＣＭＡ－００２、ｍＡｂＢＣＭＡ－００３、ＴＡｂ１（抗ＢＣＭＡ）、ＴＡｂ２（抗ＢＣＭＡ）、または無関係のマウスＩｇＧとともにインキュベートした。ＢＣＭＡリガンドとしてのＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３、ＣＤ２８６）加え、抗体溶液とともに１０分間、今日インキュベートした。Ｏｎｅ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）試薬を製造者の説明書に従って調製し、ウェルに加えた。プレートの発光シグナルをＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で読み取った。阻害パーセンテージを計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウエアを用い、抗体濃度に対してプロットした。図７（ＢＡＦＦ遮断）および図８（ＡＰＲＩＬ遮断）に示されるように、ｍＡｂＢＣＭＡ－００２は、活性を示さないか、または弱い遮断活性を示すが、ｍＡｂＢＣＭＡ－００３は、陽性参照抗体ＴＡｂ１およびＴＡｂ２と同様に強いＮＦ－κＢシグナル経路遮断活性を示した。

次に、ｍＡｂＢＣＭＡ－００２およびｍＡｂＢＣＭＡ－００３の結合ドメインを用いて、二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を作製した。

実施例４：ＢＣＭＡ／ＣＤ３ Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）の作製
実施例４．１：ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質（ＦＩＴ－Ｉｇ）の作製
ヒトＣＤ３とヒトＢＣＭＡの両方を認識する二重特異性Ｆａｂｓ－ｉｎ－Ｔａｎｄｅｍ免疫グロブリン（ＦＩＴ－Ｉｇ）結合タンパク質を構築した。ＦＩＴ－Ｉｇ構築物は、国際公開第ＷＯ２０１５／１０３０７２号に記載の一般手順に従い、免疫グロブリンドメイン間の合成リンカー配列の使用をなくすように操作した。

結合ＣＤ３およびＢＣＭＡと結合し得るＦＩＴ－Ｉｇ抗体を生成するために使用したＤＮＡ構築物は、親抗ＣＤ３および抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変ドメインをコードしていた。各ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、以下の構造を有する３つのポリペプチド鎖からなり、
鎖１（長鎖）：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬ－ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１－ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３；
鎖２（第１の短鎖）：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１；
鎖３（第２の短鎖）：ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬ；
ここで、ＶＬ_ＢＣＭＡはＢＣＭＡを認識するモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_ＣＤ３はＣＤ３を認識するモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ_ＣＤ３はＣＤ３を認識するモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_ＢＣＭＡはＢＣＭＡを認識するモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインであり、各ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、各ＣＨ１は第１の重鎖定常ドメインであり、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は抗体Ｃ末端Ｆｃ領域である。

長鎖ベクターを構築するために、ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬ－ＶＨ_ＢＣＭＡセグメントをコードするｃＤＮＡをｄｅ ｎｏｖｏ合成し、ヒトＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３のコード配列を含むベクターの多重クローニング部位（ＭＣＳ）に挿入した。得られたベクターにおいて、ＭＣＳ配列は、総てのドメインフラグメントが適正なリーディングフレーム内にあることを保証するために相同組換えの際に除去された。同様に、第１および第２の短鎖を構築するために、ＶＨ_ＣＤ３およびＶＬ_ＢＣＭＡ構造遺伝子をｄｅ ｎｏｖｏ合成し、それぞれヒトＣＨ１およびＣＬドメインのコードセグメントを含む適当なベクターのＭＣＳに挿入した。

３種類のプラスミドを１：２：１．５比で混合した後、ＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。発現７日後に、細胞培養上清を回収し、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。精製したＦＩＴ－Ｉｇタンパク質の濃度をＡ２８０によって測定し、均質性をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。

新規マウス抗ＢＣＭＡ抗体としてのｍＡｂＢＣＭＡ－００２およびｍＡｂＢＣＭＡ－００３の二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ形式での結合の特徴を調べるために、鎖１および鎖３ポリペプチド（前掲）に使用したＶＨ_ＢＣＭＡおよびＶＬ_ＢＣＭＡドメインは、表８（すなわち、ＶＨでは、配列番号２９または配列番号３１のいずれか、ＶＬでは、配列番号３０または配列番号３２のいずれか）に示されるＶＨおよびＶＬドメインセットであった。鎖１および鎖２（前掲）のＶＨ_ＣＤ３およびＶＬ_ＣＤ３ドメインでは、親抗ＣＤ３抗体は３種類の選択されたヒト化抗ＣＤ３抗体のうちの１つであった：ＨｕＥＭ０００６－０１－２４抗体（ＶＨ＝配列番号１８；ＶＬ＝配列番号２５）、ＨｕＥＭ０００６－０１－２５抗体（ＶＨ＝配列番号１５；ＶＬ＝配列番号２５）、またはＨｕＥＭ０００６－０１－２６抗体（ＶＨ＝配列番号１２；ＶＬ＝配列番号２５）。ＦＩＴ－Ｉｇ構造の定常ドメインＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３およびＣＬでは、ヒト配列、すなわち、配列番号２６および配列番号２７が使用された。以上のポリペプチドドメインをコードするｃＤＮＡ用いてＦＩＴ－Ｉ発現ベクターを構築し、これを用いてＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。各リンカーを含まないＦＩＴ－Ｉｇ構築物の培養物を増殖させ、上記のようにＦＩＴ－Ｉｇを精製した。６種類のＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質に以下の表９に示す名称を与えた。

実施例４．２：ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ Ｆａｂフラグメント結合タンパク質（ＦＩＴ－Ｆａｂ）の作製
全長ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質を消化し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｆａｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４４９８５）を用いて精製した。この過程で、ＦＩＴ－Ｉｇタンパク質のＦｃドメインは、アガロースビーズ上の固定化パパインを用いた酵素的切断によって除去した。次に、ＦＩＴ－Ｉｇ Ｆａｂフラグメント（ＦＩＴ－Ｆａｂ）をプロテインＡクロマトグラフィーのフロースルーから精製した。精製したＦＩＴ－Ｆａｂタンパク質の濃度をＡ２８０によって測定し、均質性をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。

実施例４．３：ＦＩＴ－Ｉｇ二重特異性抗体はＣＤ３標的およびＢＣＭＡ標的の両方への結合を示した
キメラ二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ抗体の結合活性を、ヒトＣＤ３／ＴＣＲ複合体トランスフェクトＣＨＯ細胞株（ＣＨＯＫ１／ＣＤ３／ＴＣＲ細胞）およびＢＣＭＡ発現ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を用いてフローサイトメトリーにより調べた。簡単に述べれば、ＦＡＣＳバッファー中、５×１０^５細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。次に、各ウェルについて、１００μｌの連続希釈ＦＩＴ－Ｉｇ抗体またはＦＩＴ－Ｆａｂ抗体を加え、細胞と混合した。４℃で４０分間のインキュベーションの後、プレートを数回洗浄して余分な抗体を除去した。その後、二次抗体（ヤギ抗ｈｕＩｇＧκ鎖特異的）を加え、細胞とともに室温で２０分間インキュベートした。もう１回遠心分離および洗浄を行った後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターで読み取るために細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。結果を分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウエアを用いてプロットした。結果を図９および１０に示す。

図９に示されるように、二重特異性キメラＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｆａｂ抗体のＦａｂフラグメントを有するＢＣＭＡへの結合活性は、それらが同じＢＣＭＡ結合ドメインからなる場合に同じ結合曲線を正確に示した。図１０に示されるように、キメラＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質は、親モノクローナルヒト化ＣＤ３抗体と同様の結合活性曲線を維持していた（図５Ｂ、５Ｃ参照）。

実施例４．４：キメラＦＩＴ－ＦａｂおよびＦＩＴ－ＩｇはＣＤ３活性化のリダイレクトを示した
ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ抗体およびＦＩＴ－Ｆａｂ抗体によるＣＤ３活性化のリダイレクトを測定するために、共培養したリポーター遺伝子アッセイを使用した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞は、細胞表面ＣＤ３がひと度活性化されると、下流のルシフェラーゼシグナルを惹起する。ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞をＢＣＭＡ発現標的細胞として使用したが、これはＢＣＭＡの結合時に二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体を介してＴ細胞上のＣＤ３／ＴＣＲ複合体を架橋することができる。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞およびＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を洗浄し、アッセイ培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）にそれぞれ再懸濁させた。両細胞種を１：１比にて９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３９０３）にウェル当たり１×１０^５細胞として播種した。ＦＩＴ－Ｉｇ抗体またはＦＩＴ－Ｆａｂ抗体を加え、細胞と混合し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、製造者の説明書に従ってＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）発光アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）試薬を調製し、ウェルに加えた。プレートの発光シグナルを、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて読み取った。結果を図１１および１２に示す。

図１１を参照すると、高い親和性の抗ＢＣＭＡ抗体および抗ＣＤ３抗体の２つ、すなわち、ｍＡｂＢＣＭＡ－００３およびＨｕＥＭ０００６－０１－２４を用いて実施例４．１に記載されるように作製したＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質に関して、Ｔ細胞の活性化を生じるＦＩＴ－Ｉｇ濃度がプロットされている。この図で、ＦＩＴ１００６－４ａは、外部ＣＤ３結合Ｆａｂ結合部位および内部ＢＣＭＡ結合Ｆａｂ結合部位を有するＦＩＴ－Ｉｇであり（前掲；表９参照）；ＦＩＴ１００６－４ｂは、同じアミノ酸配列を使用しているが、逆転した結合ドメイン部分を有する、すなわち、外部ＢＣＭＡ結合Ｆａｂ結合部位と内部ＣＤ３結合Ｆａｂ結合部位を有するＦＩＴ－Ｉｇ構築物であり；ＦＩＴ１００６－４ａ－Ｆａｂは、ＦＩＴ１００６－４ａからパパイン消化によって作製したものである（実施例４．２参照）。これらの結合タンパク質の性能を２つの陰性対照：（ｉ）２つの無関係の抗原標的と反応性のある結合部位を有するＦＩＴ－Ｉｇ（「ＦＩＴ１００２－５ａ」）、および（ｉｉ）無関係の抗原と反応性のあるヒト化ＩｇＧモノクローナル抗体（「ｈＩｇＧ」）と比較した。また、２つの抗ＣＤ３結合タンパク質、すなわち、ヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＨｕＥＭ０００６－０１－２４）およびそれらから作製されたＦａｂフラグメント（ＨｕＥＭ０００６－０１－２４－Ｆａｂ）も試験した。総ての二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３結合タンパク質がＢＣＭＡ発現標的細胞の存在下で、ＢＣＭＡ結合活性を有する単一特異性抗ＣＤ３結合タンパク質に比べて、Ｔ細胞活性化の上昇をもたらしたことが見て取れる。

図１２を参照すると、上記の表９に記載したＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質から調製されたＦＩＴ－Ｆａｂ（ＦＩＴ１００６－３ａ－Ｆａｂ、ＦＩＴ１００６－４ａ－Ｆａｂ、ＦＩＴ１００６－５ａ－Ｆａｂ、ＦＩＴ１００６－６ａ－Ｆａｂ、ＦＩＴ１００６－７ａ－Ｆａｂ、ＦＩＴ１００６－８ａ－Ｆａｂと呼称）に関して、ＢＣＭＡ発現標的細胞の存在下でＴ細胞の活性化を生じる種々の二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｆａｂ結合タンパク質の濃度がプロットされている。これらのＦＩＴ－Ｆａｂの性能を参照抗ＣＤ３ ＦａｂとｍＡｂＢＣＭＡ－００２の組合せ、ＷＯ２０１６／０２０３３２に開示されている抗ＣＤ３および抗ＢＣＭＡ結合領域を使用したＦＩＴ１００６－１ａ－Ｆａｂと呼称する参照ＦＩＴ－Ｆａｂ抗体、および２つの無関係の抗原標的に向けられた親抗体結合部位を用いて調製されたＦＩＴ１００２－５ａ－Ｆａｂと呼称する陰性対照ＦＩＴ－Ｆａｂと比較した。

これらの結果は、ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体は腫瘍細胞の表面上のＢＣＭＡに結合した際に架橋することによってＣＤ３を活性化し得ることを示した。このアッセイでは、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質（図１１）だけでなくＦＩＴ－Ｆａｂ結合タンパク質（図１２）も活性化のリダイレクトを示した。さらに、ＦＩＴ１００６－４ａ－Ｆａｂは、低濃度で驚くべき急激な活性化極性を示した。

実施例４．５：キメラＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－ＦａｂはＴ細胞細胞傷害性のリダイレクトを示した
ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質の腫瘍細胞死滅化の効力を、標的細胞としてのヒト骨髄腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９およびエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を用いたリダイレクトＴ細胞細胞傷害性アッセイで測定した。簡単に述べれば、細胞を採取し、洗浄し、アッセイ培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）で再懸濁させた。ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５９９）にウェル当たり５×１０^４細胞で播種した。市販のＰＢＭＣ単離キット（ＥａｓｙＳｅｐ（商標）、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５１）を用いてヒトＰＢＭＣからＴ細胞を精製し、ウェル当たり２×１０^５細胞に加えた。試験抗体を加え、３７℃で４８時間、細胞混合物とともにインキュベートした。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出は、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１７８０）を用いて測定した。製造者の説明書に従って、ＯＤ４９０読み取り値を得た。標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９最大溶解（１００％）－最小溶解（０％）を正規化の分母として示した。ＬＤＨ放出のパーセンテージを二重特異性抗体の濃度に対してプロットした。図１３に示されるように、抗ＢＣＭＡおよび抗ＣＤ３特異性を有する二重特異性ＦＩＴ－Ｆａｂは、ＮＣＩ－Ｈ９２９腫瘍細胞に対してＴ細胞細胞傷害性のリダイレクトを示したが、単一特異性ヒト化抗ＣＤ３ Ｆａｂ、および抗ＣＤ３ Ｆａｂ（ＨｕＥＭ０００６－０１－２４のＦａｂフラグメント）と抗ＢＣＭＡ ｍＡｂ（ＴＡＢ１）の組合せは細胞傷害活性を示さなかった。

実施例４．５：キメラＦＩＴ－Ｉｇはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて限定された非標的ＣＤ３活性化リダイレクトを示した
非標的ＣＤ３活性化リダイレクトを、標的細胞の不在下でＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃに基づくリポーター遺伝子アッセイを用いて試験した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞を採取し、洗浄し、アッセイ培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁させ、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３９０３）にウェル当たり１×１０^５細胞で播種した。試験抗体を加え、細胞と混合し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、製造者の説明書に従って、ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）発光アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）試薬を調製した。プレートの発光シグナルをＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）Ｌｕｘプレートリーダーを用いて読み取った。結果を図１４に示す。

このアッセイは、二重特異性結合タンパク質、この場合にはＢＣＭＡに対する共標的を発現する細胞が不在であること以外は、上記の実施例４．４で行った試験と同様であった。これらの結果は、二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ抗体（ＦＩＴ１００６－４ａおよびＦＩＴ１００６－４ｂ）およびＦＩＴ１００６－４ａ－Ｆａｂと呼称されるＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｆａｂ（総てヒト化抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＨｕＥＭ０００６－０１－２４と同じＣＤ３結合ドメインを有する）は、ＢＣＭＡ発現標的細胞の不在下で、抗ＣＤ３抗体単独よりもはるかに低い非標的活性化リダイレクトを示した（図１１参照）。

実施例５：ヒト化二重特異性ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の作製
抗ＢＣＭＡモノクローナルｍＡｂＢＣＭＡ－００３は、ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－ＩｇおよびＦＩＴ－Ｆａｂ形式で使用した場合、より高いＢＣＭＡ結合親和性およびより良い細胞死滅化のリダイレクトを示した。よって、ｍＡｂＢＣＭＡ－００３をヒト化および続いてのヒト化二重特異性結合タンパク質の構築における使用のために選択した。

実施例５．１：抗ＢＣＭＡ抗体 ｍＡｂＢＣＭＡ－００３のヒト化
ｍＡｂＢＣＭＡ－００３可変領域遺伝子を用いてヒト化ｍＡｂを作出した。この方法の第１の工程で、全体として最良に一致するヒト生殖細胞系Ｉｇ Ｖ遺伝子配列を見出すために、ｍＡｂＢＣＭＡ－００３のＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列（表８参照、前掲）をヒトＩｇ Ｖ遺伝子配列の利用可能なデータベースと比較した。さらに、ＶＨまたはＶＬのフレームワーク４を、それぞれマウスＶＨ領域およびＶＬ領域との最大相同性を有するヒトフレームワークを見出すために、Ｊ領域データベースと比較した。軽鎖では、最も近いヒトＶ遺伝子一致はＶＫ１－３９（０２）遺伝子であり、重鎖では、最も近いヒト一致はＶＨ１－０３遺伝子であった。次に、ｍＡｂＢＣＭＡ－００３軽鎖のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３が、ＣＤＲ－Ｌ３の後のＪＫ２フレームワーク４配列とともにＶＫ１－３９（０２）遺伝子のフレームワーク配列にグラフトされ；ｍＡｂＢＣＭＡ－００３ ＶＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３配列が、ＣＤＲ－Ｈ３の後のＪＨ６フレームワーク４配列とともにＶＨ１－０３遺伝子のフレームワーク配列にグラフトされたヒト化可変ドメイン配列を設計した。次に、ｍＡｂＢＣＭＡ－００３の３Ｄ Ｆｖモデルを作製し、ＣＤＲ残基まで４Å未満の距離で、かつ、ループ構造またはＶＨ／ＶＬ干渉を補助するのに重要である可能性が最も高かったフレームワーク残基が存在するかどうかを決定するために分析した。ヒト化配列におけるこれらの残基は、親和性／活性を保持するために同じ位置でマウス残基に復帰突然変異させるべきである。Ｑ１Ｅ突然変異は、該当する場合、Ｎ末端ピログルタミン酸塩の形成を排除するために常に含まれた。重鎖の場合、Ｐ３０Ｔ、Ｉ４８Ｍ、Ｋ６６Ｒ、Ａ６７Ｖ、Ｌ６９Ｉ、およびＡ７１Ｒ （Ｋａｂａｔナンバリング）の潜在的突然変異を望ましい復帰突然変異として特定した。軽鎖の場合、Ｖ５８ＩおよびＲ６９Ｔを復帰突然変異として特定した。そのＣＤＲとの相互作用によって判定した場合の各復帰突然変異の重要度の階層によって、最も重要な復帰突然変異が、優先度の高い順にヒト化ＶＨ配列に導入され、その後に他の復帰突然変が連続的設計として導入された。さらに、ＣＤＲ－Ｌ２のＣ末端に生じるＤＧジペプチドは、
潜在的なアスパラギン酸異性化部位を呈し、これは軽鎖変異体では、以下の択一的置換：Ｄ５６Ａ、Ｄ５６Ｅ、Ｄ５６Ｓ、Ｄ５６Ｔ、またはＧ５７Ａによって排除した。ヒト化ＶＨおよびＶＬ設計構築物を表１０（下記）に示す。（復帰突然変異したフレームワークアミノ酸残基を二重下線で示し、元の親抗体からのマウスＣＤＲを下線で示す。）

ヒト化抗ＢＣＭＡ ＶＨおよびＶＬ遺伝子を合成により作製した後、実施例４．１に記載されるように、個々にＦＩＴ－Ｉｇベクターにクローニングし、これはまた抗ＣＤ３モノクローナルＨｕＥＭ０００６－０１－２４由来のＶＨおよびＶＬ遺伝子も含んでいた。ヒト化ＶＨおよびヒト化ＶＬの対合により、下記の表１１の列挙したヒト化ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質が作出された。ｍＡｂＢＣＭＡ－００３の親マウスＶＨ／ＶＬとヒト定常配列を有するキメラ抗体もまた、ヒト化結合タンパク質のランク付けのための陽性対照として作出した。総ての組換えＦＩＴ－Ｉｇは、実施例４．１に記載されるように発現させ、精製した。

ＢＣＭＡ抗原とＣＤ３抗原の両方に結合する能力を有する二重特異性ＦＩＴ－ＩｇおよびＦＩＴ－Ｆａｂ結合タンパク質を、上記の表１１に列挙したヒト化可変ドメインおよび表３に示されるようなヒト定常領域配列（配列番号２６および配列番号２７）をコードするｃＤＮＡを用い、実施例４．１および４．２前掲と同様の方法で構築した。免疫グロブリンドメイン間のリンカーは使用しなかったので、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の完全配列は、表１１および３の配列情報に由来するものであり得る。ＦＩＴ－ＩｇとしてのＦＩＴ１００６－２９ｂ（Ｄ－Ａ）、ＦＩＴ１００６－３１ｂ（Ｄ－Ｔ）、およびＦＩＴ１００６－３５ｂ（Ｄ－Ｔ）に関して、例えば、表１１に開示されている３つの例示的ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は下記の表１２、１３、および１４に示されている。これらのＦＩＴ－Ｉｇは、組み立てられた鎖のＮ末端の位置にＢＣＭＡ結合部位を有し、ＣＤ３結合部位は、Ｆｃ領域に隣接し（Ｎ末端）、ＢＣＭＡ結合部位のＣ末端のＦＩＴ－Ｉｇ構造の内部に位置している。言い換えれば、成分ポリペプチド鎖のドメイン構成は、
鎖１（長鎖）：ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬ－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３；
鎖２（第１の短鎖）：ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１；
鎖３（第２の短鎖）：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬ
であり、ここで、ＶＬ_ＢＣＭＡはＢＣＭＡを認識するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_ＣＤ３はＣＤ３を認識するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインであり、ＶＬ_ＣＤ３はＣＤ３を認識するヒト化モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_ＢＣＭＡはＢＣＭＡを認識するヒト化モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインであり、各ＣＬは軽鎖定常ドメイン（配列番号２７）であり、各ＣＨ１は第１の重鎖定常ドメインであり、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、ＣＨ１からＦｃ領域の末端までのＣ末端重鎖定常領域である（配列番号２６参照）。

実施例５．３：ヒト化ＢＣＭＡ／ＣＤ３のＦＩＴ－Ｉｇの結合速度
ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ抗体の結合親和性および速度定数は、標準的な手順を用い、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した２５℃での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。結果を表１５に示す。

簡単に述べれば、典型的なアミンカップリング法に従ったヘテロ二量体ＣＤ３／Ｆｃ抗原またはＢＣＭＡ／Ｆｃ抗原をバイオセンサーチップに直接固定し、次に、抗体を５μｌ／分の流速で反応マトリックスに注入し、結合応答を記録した。結合速度定数および解離速度定数、それぞれｋ_ｏｎ（Ｍ^－１ｓ^－１）およびｋ_ｏｆｆ（ｓ^－１）は、３０μｌ／分の連続流速流量で決定した。速度定数は、ヒトＣＤ３／Ｆｃタンパク質またはヒトＢＣＭＡ／Ｆｃタンパク質の５つの異なる濃度で速度論的結合測定を行うことによって導き出した。次に、抗体と関連する標的タンパク質との間の反応の平衡解離定数Ｋ_Ｄ（Ｍ）を、式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎを使用して反応速度定数から計算した。下記の表１５に示すように、ヒト化抗ＣＤ３／ヒト化抗ＢＣＭＡＦＩＴ－Ｉｇ抗体の親和性を測定した。

実施例５．４：ヒト化二重特異性ＦＩＴ－ＩｇはＣＤ３活性化および細胞傷害性リダイレクトを示した
ＢＣＭＡ／ＣＤ３ヒト化二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ抗体の腫瘍細胞死滅化の効力を、標的細胞としてのヒト骨髄腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９およびエフェクター細胞としてのヒトＴ細胞を用いたリダイレクトＴ細胞細胞傷害性アッセイで測定した。簡単に述べれば、細胞を採取し、洗浄し、アッセイ培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁させた。ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃３５９９）にウェル当たり５×１０^４細胞で播種した。Ｔ細胞を、市販のキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ＃１７９５１）を用いてヒトＰＢＭＣから精製し、同じプレートにウェル当たり２×１０^５細胞で加えた。次に、ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質を加え、細胞混合物とともにインキュベートした。３７℃で４８時間のインキュベーションの後、ＬＤＨ放出を、アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ１７８０）を用いて測定した。製造者の説明書に従い、ＯＤ４９０の読み取り値を得た。標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９最大溶解（１００％）－最小溶解（０％）を正規化の分母として示した。ＬＤＨ放出のパーセンテージを二重特異性Ａｂの濃度に対してプロットした。この例では、ヒト化ＦＩＴ－Ｉｇは、親キメラＦＩＴ－Ｉｇと同様のＴ細胞細胞傷害性のリダイレクトを示した。結果を図１５に示す。これらの結果は、本発明によるヒト化ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇが、共培養においてＴ細胞細胞傷害性をＮＣＩ－Ｈ９２９腫瘍細胞に対してリダイレクトすることができたことを示した。図１６および１７を参照すると、ＢＣＭＡ発現標的細胞およびＣＤ３発現標的細胞への本発明による２つのＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質の結合が確認される。

外部結合部位がタンデムに配置されたＦａｂ領域のＣＤ３ Ｆａｂ結合部位であり、内部結合部位がＢＣＭＡ Ｆａｂ結合部位である例示的ＢＣＭＡ／ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇ結合タンパク質のうちの２つの別の構成を調製し、ＦＩＴ１００６－３１ａ（Ｄ－Ｔ）およびＦＩＴ１００６－３５ａ（Ｄ－Ｔ）と呼称した。これら２つのＦＩＴ－Ｉｇのポリペプチド鎖の式は、
鎖１（長鎖）：ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬ－ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３；
鎖２（第１の短鎖）：ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１；
鎖３（第２の短鎖）：ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬ
であった。ＦＩＴ１００６－３１ａ（Ｄ－Ｔ）およびＦＩＴ１００６－３５ａ（Ｄ－Ｔ）のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を以下に示す。

これら２つの別の構成のＢＣＭＡ発現細胞およびＣＤ３発現標的細胞に対する結合活性をそれぞれ図１８および図１９に示す。各標的の２つの構成を比較すると、Ｆｃの遠位に配置された対応する結合ドメインは、Ｆｃの近位に配置された同じ結合ドメインよりも比較的高い結合活性を示し、結合に対する構成の特定の影響を示す。しかしながらやはり、これらの結果により、両方の構成が、ＢＣＭＡとＣＤ３の両方に対して望ましい標的結合活性を有することが確認される。

実施例６ ＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇによる処置はヒトＰＢＭＣ移植ＮＰＳＧマウスにおいてＮＣＩ－Ｈ９２９腫瘍の体積を縮小する
抗腫瘍有効性は、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞を欠く免疫不全系統であるＮＰＳＧマウスにおいて評価した。ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（５×１０^６）をＮＰＳＧマウスの右背側の側腹部に皮下注射した。同じ日に、マウスに単回静脈用量の５×１０^６ヒトＰＢＭＣを施した。１１日目に腫瘍サイズ（７０～１４０ｍｍ^３）に基づいて動物を無作為化し、同じ日に処置を開始した。腫瘍成長をノギス測定によって監視した。試験は２５日目に終了し、腫瘍サイズが３０００ｍｍ^３を超えた際にマウスを安楽死させた。マウスを３週間、週１回（ＱＷ×３）、６ｍｇ／ｋｇのＦＩＴ１００６－３１ｂ（Ｄ－Ｔ）またはＦＩＴ１００６－３５ｂ（Ｄ－Ｔ）またはビヒクルで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により処置した。図２０に示されるように、ＦＩＴ－Ｉｇ処置群のマウスは、ビヒクル群に比べて有意な腫瘍成長阻害を示した。特に、ＦＩＴ１００６－３５ｂ（Ｄ－Ｔ）処置群では、腫瘍は完全に根絶された。

実施例７ ＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＦＩＴ－ＩｇはカニクイザルにおいてＢ細胞集団を枯渇させ、限定されたサイトカイン放出特性を示す
カニクイザルＢ細胞は、ヒトよりも高いＢＣＭＡ発現を示すことが報告されている(Seckinger, A. et al., (2017). Target Expression, Generation, Preclinical Activity, and Pharmacokinetics of the BCMA-T Cell Bispecific Antibody EM801 for Multiple Myeloma Treatment. Cancer Cell, 31(3), 396-410)。これらの動物においてＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇの、Ｂ細胞集団を枯渇させる能力を評価するために、カニクイザルにおいてパイロット非ＧＬＰ毒性学および薬理学試験を行った。この試験は、群間で体重が同等の雄ザル１個体および雌ザル１個体からなる３群を有し、群１にはビヒクルを施し群２には０．５ｍｇ／ｋｇ ＦＩＴ１００６－３１ｂ（Ｄ－Ｔ）の単回注射を施し、群３には０．５ｍｇ／ｋｇ ＦＩＴ１００６－３５ｂ（Ｄ－Ｔ）の単回注射を施し、総て１日目にｉ．ｖ．注射により投与した。投与２日前（－１日、ベースライン）、１日目に投与してから２、４、６および２４時間後、ならびに８日目および１５日目に、，前肢または後肢の皮下静脈から血液サンプルを採取した。血液サンプルを細Ｂ胞マーカーおよびＴ細胞マーカーに関してＦＡＣＳにより分析し、各集団の相対パーセンテージ変化を－１日のベースラインレベルと比較することにより決定した。血清サンプルはまた、市販のサイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）キットを用いて、サイトカインレベル（ＩＮＦγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６およびＴＮＦα）についても分析した。

図２１は、最初の投与後時点（投与後２時間）から最後の時点（１５日目）までのＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＦＩＴ－Ｉｇの投与によって生じた循環Ｂ細胞の５０％を超える枯渇を示す。一時的なＢ細胞の枯渇は、２番目と３番目の時点（１日目の２時間と４時間）までにビヒクル群でも見られ、これは、採血スケジュールに関連している可能性がある。しかしながら、ビヒクル群のＢ細胞集団は、投与後６時間までにプラトーに達する迅速な回復を示した。

図２２に示されるように、ＦＩＴ－Ｉｇ処置群の循環Ｔ細胞レベルは、一時的な損失を示し、これは、８日目にビヒクル群のレベルまで回復し、試験が終了するまで維持された。この一時的なＴ細胞の損失は処置時のＴ細胞の活性化および再分布のためであると考えられた。

本発明は、以上に説明した本発明の本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。よって、以上の実施形態は本明細書に記載される発明の限定ではなく例示と見なされる。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって示される。

Claims (21)

1. 以下のようなＣＤＲセット：
   

   

   の群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３の６つのＣＤＲのセットを含んでなる、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合部分。
2. 以下のＶＨ／ＶＬ対：
   

   

   から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含んでなる、請求項１に記載の抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合部分。
3. 請求項１または２に記載の少なくとも１種類の抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学上許容可能な担体を含んでなる、医薬組成物。
4. ＣＤ３媒介活性および／またはＢＣＭＡ媒介活性が有害である疾患または障害を治療するための薬剤の製造のための、請求項１または２に記載の抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合部分の使用。
5. 前記疾患が癌であり、場合により、多発性骨髄腫、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および原発骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、または軟骨肉腫）から選択される、請求項４に記載の使用。
6. 第１、第２および第３のポリペプチド鎖を含んでなる、ＣＤ３とＢＣＭＡの両方に結合し得る結合タンパク質、またはそのＦＩＴ－Ｆａｂフラグメントであって、
   前記第１のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、（ｉ）ＶＬ_Ａ－ＣＬ－ＶＨ_Ｂ－ＣＨ１－Ｆｃ（ここで、ＣＬはＶＨ_Ｂに直接融合されている）、または（ｉｉ）ＶＨ_Ｂ－ＣＨ１－ＶＬ_Ａ－ＣＬ－Ｆｃ（ここで、ＣＨ１はＶＬ_Ａに直接融合されている）を含んでなり；
   前記第２のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_Ａ－ＣＨ１を含んでなり；かつ
   前記第３のポリペプチド鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_Ｂ－ＣＬを含んでなり；
   ＶＬは軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは軽鎖定常ドメインであり、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は重鎖定常ドメインであり、Ｆｃは免疫グロブリンＦｃ領域であり、ＡはＣＤ３またはＢＣＭＡのエピトープであり、かつ、ＢはＣＤ３またはＢＣＭＡのエピトープであり、ただし、ＡとＢは異なる、結合タンパク質またはそのＦＩＴ－Ｆａｂフラグメント。
7. 前記ＶＬ_ＡおよびＶＨ_Ａが抗原標的ＣＤ３またはＢＣＭＡの一方に結合する親抗体に由来する可変ドメインであり、かつＶＬ_ＢおよびＶＨ_Ｂが前記抗原標的ＣＤ３またはＢＣＭＡの他方に結合する異なる親抗体に由来する可変ドメインである、請求項６に記載の結合タンパク質またはＦＩＴ－Ｆａｂフラグメント。
8. 前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬ－ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１－Ｆｃ（ここで、ＣＬは、ＶＨ_ＢＣＭＡに直接融合されている）を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１を含んでなり、かつ前記第３のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬを含んでなるか；
   前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬ－ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－Ｆｃ（ここで、ＣＬは、ＶＨ_ＣＤ３に直接融合されている）を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１を含んでなり、かつ前記第３のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬを含んでなるか；
   前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１－ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬ－Ｆｃ（ここで、ＣＨ１は、ＶＬ_ＣＤ３に直接融合されている）を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_{ＢＣＭＡ－}ＣＬを含んでなり、かつ前記第３のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１を含んでなるか；または
   前記第１のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１－ＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬ－Ｆｃ（ここで、ＣＨ１は、ＶＬ_ＢＣＭＡに直接融合されている）を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＬ_ＣＤ３－ＣＬを含んでなり、かつ前記第３のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシル末端へ向けて、ＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１を含んでなり；
   ＶＬ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＣＬは抗体軽鎖定常ドメインであり、ＶＨ_ＣＤ３は抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメインであり、ＣＨ１は抗体第１重鎖定常ドメインであり、ＶＬ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨ_ＢＣＭＡは抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変ドメインであり、かつＦｃは抗体Ｆｃ領域である、
   請求項７に記載の結合タンパク質またはＦＩＴ－Ｆａｂフラグメント。
9. 前記ドメインＶＬ_ＣＤ３－ＣＬが抗ＣＤ３親抗体の軽鎖と同じであり、前記ドメインＶＨ_ＣＤ３－ＣＨ１が抗ＣＤ３親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖第１定常ドメインと同じであり、ドメインＶＬ_ＢＣＭＡ－ＣＬが抗ＢＣＭＡ親抗体の軽鎖と同じであり、かつドメインＶＨ_ＢＣＭＡ－ＣＨ１が抗ＢＣＭＡ親抗体の重鎖可変ドメインおよび重鎖第１定常ドメインと同じである、請求項８に記載の結合タンパク質またはＦＩＴ－Ｆａｂフラグメント。
10. 前記第１のポリペプチド鎖が配列番号５０のアミノ酸配列を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号５１のアミノ酸配列を含んでなり、かつ前記第３のポリペプチド鎖が配列番号５２のアミノ酸配列を含んでなるか；
    前記第１のポリペプチド鎖が配列番号５３のアミノ酸配列を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号５４のアミノ酸配列を含んでなり、かつ前記第３のポリペプチド鎖が配列番号５５のアミノ酸配列を含んでなるか；
    前記第１のポリペプチド鎖が配列番号８０のアミノ酸配列を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号８１のアミノ酸配列を含んでなり、かつ前記第３のポリペプチド鎖が配列番号８２のアミノ酸配列を含んでなるか；
    前記第１のポリペプチド鎖が配列番号８３のアミノ酸配列を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号８４のアミノ酸配列を含んでなり、かつ前記第３のポリペプチド鎖が配列番号８５のアミノ酸配列を含んでなるか；または
    前記第１のポリペプチド鎖が配列番号８６のアミノ酸配列を含んでなり、前記第２のポリペプチド鎖が配列番号８７のアミノ酸配列を含んでなり、かつ前記第３のポリペプチド鎖が配列番号８８のアミノ酸配列を含んでなる、
    請求項６に記載の結合タンパク質またはＦＩＴ－Ｆａｂフラグメント。
11. 請求項６～１０のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の結合タンパク質またはＦＩＴ－Ｆａｂフラグメント、および薬学上許容可能な担体を含んでなる、医薬組成物。
12. ＣＤ３媒介活性および／またはＢＣＭＡ媒介活性が有害である疾患または障害を治療するための薬剤の製造のための、請求項６～１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質またはＦＩＴ－Ｆａｂフラグメントの使用。
13. 前記疾患が癌であり、場合により、多発性骨髄腫、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および原発骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、または軟骨肉腫）から選択される、請求項１２に記載の使用。
14. ＣＤ３媒介活性および／またはＢＣＭＡ媒介活性が有害である障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項６～１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質またはＦＩＴ－Ｆａｂフラグメントまたはその組合せを投与することを含んでなる、方法。
15. 前記疾患が癌であり、場合により、多発性骨髄腫、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および原発骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、または軟骨肉腫）から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記対象がヒトである、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 以下のようなＣＤＲセット：
    

    

    の群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３の６つのＣＤＲのセットを含んでなる、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合部分。
18. 以下のＶＨ／ＶＬ対：
    

    

    から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよびＶＬドメインを含んでなる、請求項１７に記載の抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合部分。
19. 請求項１７または１８に記載の少なくとも１種類の抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学上許容可能な担体を含んでなる、医薬組成物。
20. ＣＤ３媒介活性および／またはＢＣＭＡ媒介活性が有害である疾患または障害を治療するための薬剤の製造のための、請求項１７または１８に記載の抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合部分の使用。
21. 前記疾患が癌であり、場合により、多発性骨髄腫、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、明細胞癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、および原発骨癌（例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性線維性組織球腫、または軟骨肉腫）から選択される、請求項２０に記載の使用。

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