JP2022549362A - 一重特異性および多重特異性抗体 - Google Patents

Abstract

本明細書で開示されるのは、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＳＡ、ＣＤ３３、ＬＡＧ３、およびＣＤ１６の１つ以上に対する特異性を有する、一重特異性および多重特異性一本鎖抗体である。【選択図】図１

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年９月２７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／９０７，２７５号、および２０２０年３月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／９８９，３２７号に基づき優先権を主張し、両方の内容全体は参照により全体が本明細書に援用される。

本明細書で開示されるのは、ＣＤ４７、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３に対する特異性を有する一重特異性の重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）、ならびに１つ以上のそれらの抗原に対する特異性を有する、２つ以上のＨＣＡｂ可変ドメインを組み込んだ多価一本鎖抗体である。

いくつかの実施形態は、専ら、または主に、ラクダ抗体のＶＨＨドメインを含む単一ドメイン抗体である。これらの実施形態は、一重特異性かつ１価である。

いくつかの実施形態は、ＨＣＡｂであるか、または従来の抗体の１以上の定常ドメイン、たとえばヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域と融合したＶＨＨドメインを含む。これらの実施形態は一重特異性であるが、通常２価である。他の結合価は、たとえば定常ドメインの選択により可能である。ＩｇＡおよびＩｇＭのＦｃ領域は高い結合価をもたらし得る。

いくつかの実施形態は、一本のアミノ酸鎖に結合した同一の抗原に対する特異性を有する２つのＶＨＨドメインを含む（多価一本鎖抗体）。これらの実施形態も、一重特異性かつ２価である。さらなるＶＨＨドメインを結合させて、高い結合価を得ることができる。

いくつかの実施形態は、２つ（またはそれ以上）のＶＨＨドメインを含み、各ＶＨＨドメインは、一本のアミノ酸鎖に結合した異なる抗原に対する特異性を有する（多価多重特異性一本鎖抗体）。これらの実施形態は多価かつ多特異性である。３つ以上のＶＨＨドメインを含むさらなる実施形態では、２つ以上のＶＨＨドメインが同一の抗原に対する特異性を有してもよく、１つ以上の他のＶＨＨドメインが別の抗原に対する特異性を有してもよい。そのような構造は、特異性よりも高次の結合価を有する。

一重特異性の実施形態の各々は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、またはＬＡＧ３に対する特異性を有する。多重特異性の実施形態の各々は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３の１つ以上に対する特異性を有するが、１つ以上の他の抗原に対する特異性も有してもよい。

いくつかの実施形態は、ＨＳＡおよび１つ以上の他の抗原に対する特異性を有する。これらの実施形態の観点では、ＨＳＡ特異性のドメインは体内での半減期の延長をもたらし、他のドメインは治療効果を提供する。これらの実施形態の別の観点では、ＨＳＡ特異性のドメインは、隣接ドメインの結合活性を部分的に、または完全に阻害し得る。ＨＳＡ特異性のドメインは、たとえば腫瘍等の作用部位に存在するプロテアーゼにより切断される切断可能なリンカーにより結合させることができ、切断により隣接ドメイン阻害が緩和されるようにする。いくつかの多重特異性の実施形態は、三重特異性である。

複数の抗原結合ドメインを含むいくつかの実施形態では、従来のＶＬ－ＶＨ対由来の抗原結合ドメインを、上述の実施形態における１つ以上（しかし全てではない）のＶＨＨドメインの代わりに使用することができる。

特定の抗原に対する特異性を有する本明細書で開示される抗原結合ドメインは、抗原に結合するための手段と呼ばれ得る。

ＣＤ４７過剰発現細胞株に対する抗ＣＤ４７ ＨＣＡｂ Ａ０９－１０ およびＢ６Ｈ１２の結合親和性のフローサイトメトリー解析を示す図である。 ＣＤ４７に対する特性を有する多重特異性抗体１５１１（配列番号１５６）および３３２１（配列番号１５７）の競合ＥＬＩＳＡ結合解析を示す図である。 Ｊｕｒｋａｔ細胞株でフローサイトメトリーを用いたＣＤ４７結合性多重特異性分子１５１１および３３２１の競合結合解析を示す図である。 ＣＤ４７結合性多重特異性分子１５１１および３３２１を用いたヒト赤血球（ＲＢＣ）凝集測定アッセイを示す図である。対照としてＨｕ５Ｆ９を使用した。 １５１１および３３２１のＨＬ－６０およびヒト赤血球への結合を示す図である。 Ｒａｊａ－Ｌｕｃ異種移植マウスにおけるＣＤ４７結合性多重特異性分子１５１１および３３２１の抗腫瘍活性を示す図である。 ＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ細胞での抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ、ＰＬ１４およびＰＬ１６のフローサイトメトリー結合解析を示す。対照としてアテゾリズマブを使用した。 ＰＤ－Ｌ１に対する結合特異性を有する多重特異性分子１５１１、および対照としてアテゾリズマブの細胞ベースの機能アッセイである。 ＰＤ－Ｌ１結合性多重特異性分子１５１８（配列番号１３５）による、Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１マウスにおけるＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍の増殖阻害を示す図である。 ＰＤ－Ｌ１結合性多重特異性分子１５１８（配列番号１３５）による、Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１マウスにおけるＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍の増殖阻害を示す図である。 抗ＨＳＡ ＨＶＶ抗体のＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析を示す図である。 抗ＣＤ３３ ＨＶＶ抗体のＯｃｔｅｔ（登録商標）親和性解析を示す図である。 抗ＣＤ３３ ＨＶＶ抗体のＯｃｔｅｔ（登録商標）親和性解析を示す図である。 抗ＣＤ１６Ａ ＨＶＶ分子ＣＤ１６Ｆ１のＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析を示す図である。 抗ＣＤ１６Ａ ＨＶＶ分子ＣＤ１６Ｅ１１のＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析を示す図である。 ＩｇＧ１ Ｂ６Ｈ１２、および対照としてＩｇＧ４ Ｂ６Ｈ１２を用いたＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ＣＤ１６レポーターアッセイ（ＡＤＣＣ）における多重特異性分子１５１１および３３２１の細胞ベースの機能アッセイを示す図である。 ＨＳＡ結合ドメインおよびＣＤ４７結合ドメインを有する分子の三重特異性分子構成を示す図である。 ＨＳＡ結合ドメインおよびＬＡＧ３結合ドメインを有する分子の三重特異性分子構成を示す図である。 ＨＳＡ結合ドメインおよびＣＤ１６結合ドメインを有する分子の三重特異性分子構成を示す図である。 腫瘍プロテアーゼにより活性化されるｐｒｏ－ＣＤ４７の三重特異性分子構成を示す図である。 腫瘍プロテアーゼにより活性化されるｐｒｏ－ＣＤ４７のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す図である。 ＰＤ－Ｌ１／ｐｒｏ－ＣＤ４７対ＰＤ－Ｌ１／活性型－ＣＤ４７のリアルタイムカイネティクスＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析を示す図である。 多特異性分子の構成を示す図である。Ｍｏｍ＝１価の結合ドメイン、ＢｉＶ＝２つの同一の１価の結合ドメインを含む２価の結合ドメイン。 四重体（四重特異性、図１４Ａ～Ｄ）の構成を示す図である。２つのＶＨＨ３は同一のＶＨＨ、または同一の抗原の異なるエピトープに結合する異なるＶＨＨであり得る。２つのＶＨＨ４は同一のＶＨＨ、または同一の抗原の異なるエピトープに結合する異なるＶＨＨであり得る。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ２は常にＨＳＡ結合ドメインである。いくつかの実施形態では、ＶＨＨ１は、ＣＤ１６ＡアゴニストＶＨＨ等のペイロードである。図１７Ｃおよび１７Ｄは、プロドラッグ構成の四重体を表す。 ＨＬ６０細胞株でのＣＤ４７結合性多重特異性分子１５１８－ＨＳ５（配列番号１７３）および１５１８－ＨＳ５－ＧＳ１５（配列番号１８４）のフローサイトメトリー結合解析を示す図である。 多重特異性分子１５１１のＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析を示す図である。 多重特異性分子３３２１のＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析を示す図である。 抗ＣＤ４７ ＶＨＨ配列のアミノ酸配列アライメントを示す図である。 抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨ配列のアミノ酸配列アライメントを示す図である。 抗ＨＳＡ ＶＨＨ配列のアミノ酸配列アライメントを示す図である。 抗ＣＤ３３ ＶＨＨ配列のアミノ酸配列アライメントを示す図である。 抗ＬＡＧ３ ＶＨＨ配列のアミノ酸配列アライメントを示す図である。 抗ＣＤ１６Ａ ＶＨＨ配列のアミノ酸配列アライメントを示す図である。

本明細書で開示されるのは、ＣＤ４７，ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３に対する特異性を有する一重特異性の重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）、またはその可変ドメイン（ＶＨＨ単一ドメイン抗体［ｓｄＡｂ］という）、および１つ以上のそれらの抗原に対する特異性を有する、２つ以上のＨＣＡｂの可変ドメインを組み込んだ多価一本鎖抗体（ＭＶＳＣＡ）である。

いくつかの実施形態では、ＭＶＳＣＡは、同一の抗原に対する特異性を有する２つ以上のＨＣＡｂ可変ドメインを含む。つまり、ＭＶＳＣＡは多価であるが抗原に関しては一重特異性である。これらのいくつかの実施形態では、ＭＶＳＣＡは、同一のＨＣＡｂ可変ドメインの２回以上の反復、またはそれぞれが同一のエピトープに対する特異性を有する複数のＨＣＡｂ可変ドメインを含む。つまり、それらは多価であるが、エピトープに関しては単一特異性である。そのようなＭＶＳＣＡは、抗原モノマー上の単一の部位にのみ結合するが、モノマーの複数コピーにクロスリンクすることができる。別のこれらの実施形態では、ＭＶＳＣＡは、それぞれが同一の抗原の異なるエピトープに対する特異性を有する２つ以上のＨＣＡｂ可変ドメインを含む。つまり、これらは多価であるが、エピトープに関しては多特異性である。そのようなＭＶＳＣＡは、抗原モノマーの複数の部位に結合するか、または複数コピーの抗原モノマーにクロスリンクする。

いくつかの実施形態では、ＭＶＳＣＡは、異なる抗原に対する特異性を有する２つ以上のＨＣＡｂ可変ドメインを含み、それらは多価かつ抗原に関して多特異性である。さらなる実施形態では、ＭＶＳＣＡは、複数のＨＣＡｂ可変ドメインを含み、さらなる可変ドメインは第１のＨＣＡｂ可変ドメインと同一である場合、さらなるＨＣＡｂ可変ドメインは第１の可変ドメインと異なるが同一の抗原上の異なるエピトープに対する特異性を有する場合、または更なるＨＣＡｂ可変ドメインは第１のＨＣＡｂ可変ドメインと異なるが異なる抗体に対する特異性を有する場合が、任意に組み合わされる。

２つ以上のＨＣＡｂ可変ドメインを含むＭＶＳＣＡは、ＨＣＡｂ定常ドメインをさらに含み得る。たとえば、Ｃ末端のＨＣＡｂ可変ドメインが、元のＨＣＡｂ定常ドメインとの結合を維持することができる。あるいは、Ｃ末端のＨＣＡｂ可変ドメインが、さらなる従来の抗体、たとえばヒトＩｇＧ抗体等のヒト抗体の定常ドメインまたはＦｃ領域と結合することができる。いくつかの実施形態では、定常ドメインまたは全Ｆｃ領域は、当業者にはよく知られているように、特定の機能性を付与し得る。別の実施形態では、２つ以上のＨＣＡｂ可変ドメインを含むＭＶＳＣＡは、ＨＣＡｂ定常ドメインをさらに含み、ＨＣＡｂ定常ドメインは、ＨＣＡｂ可変ドメインのＣ末端に位置する代わりに、またはそれに加えて、ＨＣＡｂ可変ドメインの間またはＮ末端に位置する。

（抗原）
インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）としても知られているＣＤ４７（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４７）は、５０ＫＤａの膜貫通型タンパク質であり、ヒトにおいてＣＤ４７遺伝子にコードされている。ＣＤ４７はイムノグロブリンスーパーファミリーに属し、膜インテグリンとパートナーであり、さらにトロンボスポンジン－１（ＴＳＰ－１）およびシグナル制御タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）のリガンドに結合する。トロンボスポンジン－１は、血管発生および血管新生に役割を有する分泌型糖タンパク質であり、後者において、ＴＳＰ１－ＣＤ４７相互作用は、血管細胞での一酸化窒素シグナル伝達を多段階で阻害する。ＴＳＰ－１のＣＤ４７への結合は、細胞の移動および接着、細胞増殖またはアポトーシスを含むいくつかの基本的な細胞機能に影響し、血管新生および炎症の制御に役割がある。シグナル制御タンパク質アルファは、骨髄系細胞に存在する膜貫通型受容体である。ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用は双方向性のシグナル伝達をもたらし、ファゴサイトーシスの阻害、細胞間融合の刺激、Ｔ細胞の活性化を含むさまざまな細胞間反応をもたらす。ＣＤ４７は、免疫系のマクロファージに対する「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」シグナルとして機能し、それによりいくつかの癌の治療ターゲットとなる可能性がある。

ＣＤ２７９とも呼ばれるプログラム細胞死１（ＰＤ－１）は、ヒトにおいてＰＤＣＤ１遺伝子にコードされているＩ型膜タンパク質である。これには２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２がある。ＣＤ２７４またはＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）とも呼ばれるＰＤ－Ｌ１は、ヒトにおいてＣＤ２７４遺伝子にコードされている４０ｋＤａのＩ型膜貫通型タンパク質である。ＰＤ－Ｌ１は活性型Ｔ細胞の表面上で発現し、ＰＤ－Ｌ１は、樹状細胞およびマクロファージ等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現する。また、ＰＤ－Ｌ１は、乳癌、肺癌、膀胱癌、頭頚部癌、および他の癌を含むいくつかの腫瘍で過剰発現する。ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２がＰＤ－１に結合すると、阻害シグナルがＴ細胞に送られ、サイトカイン産生を減少させ、Ｔ細胞増殖を抑制する。

ＰＤ－１経路はＴ細胞疲弊の重要な免疫抑制メディエーターである。ＰＤ－１は、感染症に対する炎症反応において、自己免疫を制限するために末梢で既に活性化されたＴ細胞の活性を制限する機能を有する。この経路の遮断は、Ｔ細胞の活性化、拡大、およびエフェクター機能の強化をもたらし得る。そのように、ＰＤ－１はＴ細胞応答を負に制御する。ＰＤ－１は、慢性疾患状態でのＴ細胞疲弊のマーカーとして同定され、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断はＴ細胞の機能を部分的に回復させることが示された（Ｓａｋｕｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＪＥＭ， ２０７：２１８７－２１９４， ２０１０）。ＰＤ－１経路を阻害することによる持続性感染症および癌の治療のための方法および組成物は、国際公開第２００６／１３３３９６号に開示されている。ＰＤ－Ｌ１に対するヒトモノクローナル抗体は、国際公開第２００７／００５８７４号、米国特許出願公開第２０１１／２０９２３０号、米国特許第８，２１７，１４９号、および国際公開第２０１４／０５５８９７号に記載されている。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、ヒト血清中で最も多いタンパク質であり、ヒト血清の約半分を構成する。アルブミンは、ホルモン、脂肪酸、および他の化合物の運搬、ｐＨの緩衝し、膠質浸透圧の維持等の機能を有する。アルブミンは肝臓でプレプロアルブミンとして合成され、これは初期のタンパク質が粗面小胞体から放出される前に除去されるＮ末端タンパク質を有する。生成物であるプロアルブミンは、次にゴルジ小胞で切断されて分泌型アルブミンを生成する。血清半減期はおおよそ２０日間である。アルブミンの長い血清半減期は、腎臓を介した除去を妨げるその大きさと、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用により達成される。抗アルブミンｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）への融合は、抗腫瘍一本鎖抗体の半減期を１～２時間からおおよそ１０日間に増加させるために使用されている。

ＣＤ３３またはシグレック－３（シアル酸結合ｌｇ様レクチン３、ＳＩＧＬＥＣ３、ＳＩＧＬＥＣ－３、ｇｐ６７、ｐ６７）は、骨髄系細胞で発現する膜貫通型受容体である。これは通常骨髄特異的であると考えられているが、一部のリンパ系細胞でも見られ得る。これはシアル酸と結合するので、レクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーの一員である。この受容体の細胞外部分は、２つのイムノグロブリンドメイン（一方はＩｇＶドメイン、一方はＩｇＣ２ドメイン）を含むため、ＣＤ３３はイムノグロブリンスーパーファミリーに位置づけられる。ＣＤ３３の細胞内の部分は、細胞活性の抑制に関連する免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。ＣＤ３３の標的化により治療することができる疾患には、限定されないが、アルツハイマー病、ならびに黄斑浮腫（たとえば糖尿病黄斑浮腫）および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）（たとえば乾燥型ＡＭＤおよび湿潤型ＡＭＤ）等の網膜症が含まれる。

ＣＤ３３は、急性骨髄性白血病の患者を治療するための抗体薬物複合体であるゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の標的である。また、ＣＤ３３は、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社により、同社のＡＤＣ技術を利用して開発された新規の抗体薬物複合体であるバダスツキシマブタリリン（ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ）の標的でもある。

５０３アミノ酸の膜貫通型タンパク質であるリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）は、エフェクターＴ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の細胞表面上で見られるチェックポイント受容体タンパク質であり、Ｔ細胞の応答、活性化、および増殖を調節する機能を有する。ＬＡＧ３はイムノグロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの一員である。ＭＨＣクラスＩＩ分子へのＬＡＧ３の結合は、ＬＡＧ３発現細胞への負のシグナルの送達をもたらし、抗原依存的なＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の応答をダウンレギュレートする。ＬＡＧ３は、Ｔ細胞の増殖能、サイトカイン産生能、および標的細胞の溶解能を負に制御し、これはＴ細胞の「疲弊」と呼ばれる。ＬＡＧ３は腫瘍免疫および感染性免疫において重要な役割を有すため、免疫治療の理想的な標的である。モノクローナル抗体を含むアンタゴニストでのＬＡＧ３の遮断は、癌および慢性ウイルス感染症の治療において研究されている。

ＦｃγＲＩＩＩとしても知られるＣＤ１６は、ナチュラルキラー細胞、好中球、単球、およびマクロファージの表面上で見られる分化誘導分子の集団である。Ｆｃ受容体として同定されたＣＤ１６は、分離した遺伝子によりコードされる２つの形態：膜貫通型タンパク質であるＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、およびＧＰＩアンカー型タンパク質であるＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）で存在し、シグナル伝達に関与する。ＮＫ細胞による溶解のトリガーとなる膜受容体として最もよく研究されているＣＤ１６は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与するイムノグロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）の分子である。これは、ＣＤ１６を指向する抗体を用いて、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別により特定の免疫細胞の集団を分離するために使用され得る。これらの受容体はＩｇＧ抗体のＦｃ部位に結合し、その後ヒトＮＫ細胞における抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化する。ＣＤ１６はヒト単球によるＡＤＣＣプロセスに必要である。ヒトにおいて、ＣＤ１６を発現する単球は、特定の抗体の存在下で様々なＡＤＣＣ特性を有し、初代白血病細胞、癌細胞株、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞を殺すことができる。さらに、ＣＤ１６は、一部のウイルス感染細胞および癌細胞を、抗体なしで直接殺傷することができる。ＩｇＧ抗体の保存された部分等のリガンドに結合した後、ヒトＮＫ細胞のＣＤ１６は、ＩＬ－２－Ｒ（ＣＤ２５）等の表面活性化分子、ならびにＩＦＮ－ガンマおよびＴＮＦ等の炎症性サイトカインの遺伝子の転写を誘導する。このＣＤ１６誘導のＮＫ細胞におけるサイトカインｍＲＮＡの発現は、様々なサイトカインの転写を調節するシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）感受性因子である活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴｐ）により仲介される。特定のサイトカイン遺伝子の発現は、ＣｓＡ感受性かつカルシウム依存的な作用機構でアップレギュレートされる。

ＣＤ１６は、ワクチン接種後のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の早期活性化に重大な役割がある。さらに、ＣＤ１６のダウンレギュレーションは、Ｔ細胞および抗体依存性シグナル伝達経路の両方において、ＮＫ細胞応答を緩和し、免疫恒常性を維持する可能性を示す。正常な健康な個体では、免疫複合体によるＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）のクロスリンクは、ＮＫ細胞において抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する。しかし、この経路は、免疫治療により癌細胞または疾患細胞において標的化され得る。インフルエンザワクチン接種後、ＣＤ１６のダウンレギュレーションは、インフルエンザ特異的な血漿抗体の有意なアップレギュレーションと関連し、ＮＫ細胞の脱顆粒と正の相関を示す。

ＣＤ１６はヒト免疫細胞の異なるサブセットを確実に同定するためのさらなるマーカーとしてよく使用される。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ３３等の他のいくつかのＣＤ分子は、ヒト骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）のマーカーとして伝統的に使用されている。しかし、これらのマーカーは、ＮＫ細胞および骨髄系由来の他のすべての細胞でも発現しているので、ＣＤ１４およびＣＤ１５等の他のマーカーが必要である。好中球ではＣＤ１４は低く、ＣＤ１５は高く、単球ではＣＤ１４は高く、ＣＤ１５は低い。これらの２つのマーカーは、好中球と単球を区別するためには十分である一方、好酸球は好中球と同様にＣＤ１５を発現する。したがって、ＣＤ１６は、好中球を同定するためのさらなるマーカーとして使用される。成熟好中球ではＣＤ１６は高く、好酸球と単球の両方でＣＤ１６は低い。ＣＤ１６は、この２種類の顆粒球の区別を可能にする。さらに、ＣＤ１６の発現は、好中球発生の異なる段階間で異なる。分化能を有する好中球前駆細胞ではＣＤ１６は低く、後骨髄球、桿状核球、および成熟好中球でそれぞれＣＤ１６の発現が増加する。

好中球での発現により、ＣＤ１６は癌免疫治療における標的となる可能性がある。乳癌、膀胱癌、および他の固形癌の腫瘍細胞で発現するヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を識別するＦｃ最適化モノクローナル抗体であるマルゲツキシマブは、ＣＤ１６ＢよりもＣＤ１６Ａを標的とする。さらに、ＣＤ１６は、抗体を標的とした癌治療において役割を果たす可能性がある。抗ＣＤ１９／ＣＤ１６等の二重特異性の抗体断片は、国体治療薬の癌細胞への標的化を可能にする。抗ＣＤ１９／ＣＤ１６二重特異性抗体は、Ｂ細胞リンパ腫に対するナチュラルキラー細胞の応答を強化することが示された。さらに、ＦａｓＬまたはＴＲＡＩＬ等の外因性因子の腫瘍細胞表面への標的化は、細胞死受容体のトリガーとなり、自己分泌と傍分泌の両方のプロセスによりアポトーシスを誘導する。

（抗体）
抗体、および疾患の治療のためのそれらの使用は、当該分野でよく知られている。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原結合部位を含む１以上のポリペプチド鎖を含む、単量体または多量体タンパク質を意味する。抗体は、抗原に特異的に結合し、抗原の生体活性を調節することができる。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、「全長抗体」および「抗体断片」を含み得る。本明細書で使用される場合、「結合部位」または「抗原結合部位」という用語は、リガンドが実際に結合する抗体分子の領域を意味する。「抗原結合部位」という用語は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか、または重鎖のみの抗体の場合は、抗体重鎖可変領域を含む。

抗体は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的識別を特に意味する。天然の抗体は、たとえば、一重特異性である。本明細書で使用される場合、「一重特異性」という用語は、各々が同一の抗原の同一のエピトープに結合する結合部位を１つ以上有する抗体を意味する。本明細書で開示される一重特異性抗体は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、またはＬＡＧ３に特異的である。いくつかの実施形態では、一重特異性抗体は、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）である。別の実施形態では、一重特異性抗体は、１つ以上のタンパク質ドメイン、たとえばヒトＦｃ領域と融合したＶＨＨドメインを含む。さらに別の実施形態では、一重特異性抗体は、唯一の完全なタンパク質ドメインとしてＶＨＨを含む、すなわち単一ドメイン抗体である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、Ｈｉｓタグ等の短いペプチドをさらに含み得る。「ＶＨＨドメイン」および「ＨＣＡｂ可変ドメイン」という用語は、同じ意味で使用される。ＶＨＨドメインは、特定の標的（ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、またはＬＡＧ３）と結合するための手段として言及され得る。ＶＨＨドメインを含む、またはＶＨＨドメインを含むように構成される、本明細書で開示される様々な抗体の構造、構成、または構築はいずれも、指示標的を結合するための手段を備える抗体ということができる。いくつかの実施形態は、１つ以上の特定の抗体の構造、構成、または構築を特に含み得る。他の実施形態は、１つ以上の特定の抗体の構造、構成、または構築が特に除外される。

本明細書で使用される場合、「に対する特異性を有する抗体」「を識別する抗体」「に対する親和性を有する抗体」「に対する結合部位を有する抗体」、および同様の構成は、同じ意味で使用される。

「多重特異性抗体」は、２以上の抗原結合特異性を有する抗体を意味する。本明細書で開示される多重特異性抗体は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３の少なくとも２つに特異的であるか、または上述の少なくとも１つの特異性と、少なくとも１つの第２の特異性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される多重特異性抗体は、抗原に結合できるドメインを２つ、３つ、４つ、またはそれ以上含み得る。さらに、多重特異性抗体は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３の少なくとも１つ、および少なくとも１つの第２の抗原に対する特異性を有する限り、同一の抗原結合配列の少なくとも２のコピーを含むか、または同一の抗原上の異なるエピトープに対する特異性を有する２つの抗原結合配列（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体（ＭＶＳＣＡ）は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３の少なくとも２つに対する特性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される多重特異性抗体は、一本鎖抗体である。したがって、いくつかの多重特異性抗体は、第１標的と結合するための手段、および第２標的と結合するための手段等を備える抗体として言及され得る。

「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体を意味する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される二重特異性抗体は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３のうちの２つに特異的である。二重特異性抗体の抗原結合部分をコードするアミノ酸配列は、様々な構成で連結することができる。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の抗体結合部分をコードするアミノ酸配列は、本明細書で開示されるようなリンカーで連結される。

「三重特異性抗体」は、３つの異なる抗原結合特異性を有する抗体を意味する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される三重特異性抗体は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３のうちの３つに特異的である。三重特異性抗体の抗原結合部分をコードするアミノ酸配列は、様々な構成で連結することができる。いくつかの実施形態では、三重特異性抗体の抗体結合部分をコードするアミノ酸配列は、本明細書で開示されるようなリンカーで連結される。いくつかの実施形態では、２つのリンカーが使用され、これらは同じであっても異なっていてもよい。

「四重特異性抗体」は、４つの異なる抗原結合特異性を有する抗体を意味する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される四重特異性抗体は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３のうちの４つに特異的である。四重特異性抗体の抗原結合部分をコードするアミノ酸配列は、様々な構成で連結することができる。いくつかの実施形態では、四重特異性抗体の抗体結合部分をコードするアミノ酸配列は、本明細書で開示されるようなリンカーで連結される。いくつかの実施形態では、２つのリンカーが使用され、これらは同じであっても異なっていてもよい。

本明細書で使用される場合、「結合価」という用語は、抗体分子中の特定の数の結合部位の存在を意味する。したがって、「二価」、「三価」、「四価」、「五価」、「六価」、「七価」、および「八価」は、それぞれ抗体分子中の２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、６つの結合部位、７つの結合部位、および８つの結合部位の存在を意味する。本明細書で開示される二重特異性抗体は「二価」である。本明細書で開示される三重特異性抗体は「三価」である。本明細書で開示される四重特異性抗体は「四価」である。しかし、一重特異性多価抗体、たとえば、二価、三価、および四価抗体は、本開示の範囲内であり、それらは複数の抗原結合部位が同一の抗原と結合する。一重特異性の二価よび三価（またはより高い結合価）の抗体の抗原結合部位は、抗原の同一のエピトープか、異なるエピトープかのいずれかに結合することができる。同様に、複数の一重特異性結合部位と、１つ以上の他の特異性の結合部位を組み合わせることにより、多重特異性よりも結合価が高い抗体、たとえば三価の二重特異性抗体を構築することができる。

本明細書の「全長抗体」は、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味し、可変領域および定常領域を含む。たとえば、ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳類では、ＩｇＧクラスの全長抗体は四量体であり、２つの同一な、２つのイムノグロブリン鎖の対からなり、各対は１つの軽鎖および１つの重鎖を有し、各軽鎖はイムノグロブリンドメインＶＬおよびＣＬを備え、各重鎖はイムノグロブリンドメインＨＶ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を備える。一部の哺乳類では、たとえばラクダおよびラマでは、ＩｇＧ抗体は２つの重鎖のみ（ＨＣＡｂ）から構成することもでき、各重鎖はＦｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）に結合した可変ドメインを含む。

四量体の抗体は、通常、２つの同一なポリペプチド鎖の対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（通常約２５ｋＤａの分子量を有する）および１つの「重」鎖（通常約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。軽鎖および重鎖の各々は、可変領域および定常領域と呼ばれる２つの異なる領域でできている。イムノグロブリンのＩｇＧクラスでは、重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３の順で連結された４つのイムノグロブリンドメインで構成され、それぞれ重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、重鎖定常ドメイン３といわれる（ＶＨ－Ｃγ１－Ｃγ２－Ｃγ３として言及される場合もあり、それぞれ重鎖可変ドメイン、定常ガンマ１ドメイン、定常ガンマ２ドメイン、定常ガンマ３ドメインといわれる）。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端までＶＬ－ＣＬの順で連結された２つのイムノグロブリンドメインで構成され、それぞれ軽鎖可変ドメイン、軽鎖定常ドメインといわれる。定常領域は配列の多様性が少なく、多数の天然のタンパク質の結合に応答して重要な生化学的事象を引き起こすことができる。

抗体の可変領域は、その分子の抗原結合決定基を含み、したがって、標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。可変領域は、同じクラスの他の抗体と配列が最も異なるため、そう命名された。可変領域では、重鎖および軽鎖の各Ｖドメインで３つのループが集まって抗原結合部位を形成する。各ループは相補性決定領域といわれており（以下、本明細書では「ＣＤＲ」という）、アミノ酸配列の差異が最も顕著である。重鎖および軽鎖に３つずつ、全部で６つのＣＤＲがあり、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３である。可変領域のＣＤＲの外側は、フレームワーク（ＦＲ）領域といわれる。ＣＤＲほどの多様性ではないが、異なる抗体間のＦＲ領域では配列のばらつきがある。全体として、抗体のこの特徴的な構造は、安定した足場（ＦＲ領域）を提供し、その上で実質的な抗原結合の多様性（ＣＤＲ）を免疫系で探索して、幅広い抗原に対する特異性を獲得することができる。

イムノグロブリン遺伝子座をコードする遺伝子は、「Ｄ」および「Ｊ］と命名された短いヌクレオチド配列とともに複数のＶ領域を含み、ＶＨの多様性を生じさせるのは、Ｖ、Ｄ、およびＪヌクレオチド配列の組み合わせである。

抗体は、定常領域によって遺伝的に決定される、アイソタイプともいわれるクラスに分類される。ヒト定常軽鎖は、カッパ（Ｃκ）およびラムダ（Ｃλ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、またはイプシロン（ε）に分類され、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプが定義される。ＩｇＧクラスは、治療目的で最も一般的に使用される。ヒトでは、このクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラスを含む。マウスでは、このクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３サブクラスを含む。ＩｇＭは、限定されないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２サブクラスを有する。ＩｇＡは、限定されないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むいくつかのサブクラスを有する。したがって、本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、定常領域の化学的および抗原的特徴により定義されるイムノグロブリンのクラスまたはサブクラスを意味する。既知のヒトイムノグロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥである。開示されたＨＣＡｂ抗体、二重特異性および多特異性抗体は、上述のアイソタイプの全て、または一部を含み得る。

また、本開示の範囲には、限定されないが、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１ドメインを含むＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ１およびＣＨ１ドメインを含むＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖ断片、（ｉｖ）単一の可変領域を含むｄＡｂ断片、（ｖ）分離したＣＤＲ領域、（ｖｉ）連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）_２断片、（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を含む抗体断片が含まれ、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインが結合して抗原結合部位を構成することを可能にするペプチドリンカーにより連結される。３つの異なる特異性を有し、切断可能、または切断不可能なリンカーにより連結された可変領域を含む三価または４価の抗体断片も開示される。ある実施形態では、抗体は、組換えＤＮＡ技術により製造される。さらなる実施形態では、抗体は、天然に存在する抗体を酵素により、または化学的に切断することにより製造される。

本明細書で使用される場合、「一本鎖抗体」は、リンカーペプチドにより一般的に連結された、抗体の抗原結合部分（すなわち可変領域）の融合タンパク質をいう。本明細書で開示されるのは、多価の一重または多重特異性一本鎖抗体である。一重特異性多価抗体は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３の少なくとも１つに対する特異性を有する。多重特異性一本鎖抗体は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３の少なくとも１つに対する特異性と、少なくとも１つのさらなる特異性を有する。いくつかの実施形態では、多重特異性一本鎖抗体は、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３の少なくとも２つに対する特異性を有する。

本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体は、ヒトのフレームワーク領域（ＦＲ）および１つ以上の非ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体を意味する。ＣＤＲを提供する非ヒトは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒトイムノグロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。ある実施形態では、ヒト化は、主にドナーＣＤＲをアクセプター（ヒト）のＶＬまたはＶＨフレームワークにグラフトすることによる。この方法は、「ＣＤＲグラフト」と言われる。最初のグラフト構造で失われた親和性を取り戻すために、選択されたアクセプターのフレームワーク残基を対応するドナー残基に「逆変異」することが必要な場合がある。最適なヒト化抗体は、イムノグロブリン定常領域、典型的にはヒトイムノグロブリンのそれの少なくとも一部を含み、典型的にはヒトＦｃ領域を含むことが多いであろう。ヒト化、または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を減少させる他の方法は、リサーフェシング法を含み得る。ある実施形態では、選択ベースの方法は、抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟させるために、すなわち、その標的抗原に対する可変領域の親和性を増加させるために採用され得る。他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部のみのグラフトを含んでもよく、限定されないが、ＣＤＲ移植に関して開示しているすべてについて参照により本明細書に援用される米国特許第６，７９７，４９２号に記載の方法が含まれる。構造ベースの方法は、たとえば、ヒト化および親和性成熟に関するすべての開示が参照により本明細書に援用される米国特許第７，１１７，０９６号に記載されているように、ヒト化および親和性成熟させるために採用することができる。

本明細書の様々な実施形態では、抗体は重鎖のみの抗体（ＨＣａｂ）である。ラクダ類（ラクダ、ヒトコブラクダ、およびラマ）は、従来の重鎖および軽鎖の抗体（１つの抗体中に２つの軽鎖および２つの重鎖）に加え、二本鎖抗体（可変重鎖のみを含む）を含む。二量体抗体は、ＶＨＨ遺伝子と呼ばれるＶＨセグメントの異なるセットによりコードされる。ＶＨおよびＶＨＨはゲノム中に散剤している（すなわち、お互いの間に混在する）。ＶＨおよびＶＨＨのｃＤＮＡで同一のＤセグメントが同定されたことは、ＶＨおよびＶＨＨでのＤセグメントの共用を示唆している。天然のＶＨＨを含む抗体は、重鎖の定常領域のＣＨ１ドメイン全体が欠損している。ＣＨ１ドメインをコードするエクソンはゲノム中に存在するが、ＣＨ１エクソンの５’側の機能的スプライシング受容配列の欠損のために切り出される。その結果、ＶＤＪ領域はＣＨ２エクソン上にスプライシングされる。ＶＨＨがそのような定常領域（ＣＨ２、ＣＨ３）に組み換えられる場合、半抗体が軽鎖/重鎖対ではなく一本鎖である抗体が生成される（すなわち、軽鎖との相互作用のない２つの重鎖の抗体）。抗原の結合は従来の抗体で見られるものとは異なるが、同様の方法、すなわち、可変領域の超変異およびそのような高親和性抗体を発現する細胞の選択で、高い親和性が達成される。

例示的な実施形態では、開示されたＨＣＡｂは、内因性のマウス抗体発現が排除され、ラクダ科の遺伝子導入が行われたトランスジェニックマウスに免疫することにより産生される。ＨＣＡｂマウスは、米国特許第８，８８３，１５０号、米国特許第８，９２１，５２４号、米国特許第８，９２１，５２２号、米国特許第８，５０７，７４８号、米国特許第８，５０２，０１４号、米国特許公開第２０１４／０３５６９０８号、米国特許公開第２０１４／００３３３３５号、米国特許公開第２０１４／００３７６１６号、米国特許公開第２０１４／０３５６９０８号、米国特許公開第２０１３／０３４４０５７号、米国特許公開第２０１３／０３２３２３５号、米国特許公開第２０１１／０１１８４４４号、および米国特許公開第２００９／０３０７７８７号で開示されており、これらの全ては、重鎖のみの抗体、およびそのトランスジェニックマウスでの産生について開示されているものについて、参照により本明細書に援用される。ＨＣＡｂを免疫し、得られた脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを形成する。

他の実施形態では、ＨＣＡｂは所望の抗原でラマを免疫し、得られた抗原結合抗体のＶＨＨ領域をコードする配列を単離することにより製造された。ある実施形態では、ＶＨＨは、ファージディスプレイライブラリーを使用して単離された。たとえば、国際公開第９１／１７２７１号、国際公開第９２／０１０４７号、および国際公開第９２／０６２０４号（これらの各々は、ファージライブラリーの作成の記載について、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。

また、本明細書で開示されるのは、２つ以上の抗原結合ドメインが単一の融合タンパク質に結合している多重特異性または多価の抗体である。多特異性抗体は、（ｉ）多特異性Ｆｖ断片、（ｉｉ）第２の特異性を有する第２のＶＨドメインに結合した（またはそれに融合した）第１の特異性の重鎖、（ｉｉｉ）第２の特異性を有する第２のＶＨドメインに結合した第１の特異性を有する四量体モノクローナル抗体であって、第２のＶＨドメインは第１のＶＨドメインと結合している、（ｉｖ）第２の特異性を有する第２のＶＨドメインと結合した第１の特異性のＦａｂ断片（ＶＨ－ＣＨ１／ＶＬ－ＣＬ）を含む多くの形態をとることができる。例示的なＦａｂ断片には、第２の特異性を有する第２のＶＨ配列が、第１のＶＨドメインのＣ末端もしくはＮ末端、または第１ＣＨ１もしくは第１ＣＬドメインのＣ末端もしくはＮ末端に結合したものを含む。さらなる実施形態では、第２および／または第３の特異性（またはそれ以上）を有するＶＨ配列は、第１のＶＨドメインのＣ末端もしくはＮ末端、または第１ＣＨ１もしくは第１ＣＬドメインのＣ末端もしくはＮ末端に結合（または融合）し得る。様々な実施形態では、任意のこれらの構成は、本明細書で開示されるＨＣＡｂ可変ドメインを少なくとも１つ含み得る。

多重特異性または多価の抗体は、特定の抗原結合ドメイン（ＶＨまたはＶＨＨ等）と他の抗原結合ドメインを連結するリンカー配列を含んでもよく、それはアミノ酸配列が適切に折りたたまれて所望の３次元構造および抗原結合プロファイルを作り出すのを可能にする。一般的に、リンカー配列は、適切に折りたたまれるためにドメイン間の十分な空間と柔軟性を提供する短いアミノ酸配列であろう。また、リンカーは、各ドメインの標的への結合を促進するために、立体障害を引き起こし得る。適切なリンカーには、限定されないが、表１５のリンカー（配列番号１００～１１９）、ＥＰＫＳＣＤ（配列番号２２４）、およびＡＳＴＫＧＰ（配列番号２２５）が含まれる。さらなるリンカーが当業者に知られるであろう。

また、本開示の範囲には、本明細書で開示される一重特異性または多重特異性抗体のアミノ酸配列バリアントが含まれる。アミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするＤＮＡに適切なヌクレオチドの変更を導入するか、またはペプチド合成により調製される。そのようなバリアントには、たとえば欠失型、および／または本明細書の実施例の抗体のアミノ酸配列への残基の挿入および／または置換を含む。最終的な構造が所望の特性を保持する限り、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせにより最終的な構造に到達する。また、アミノ酸の変化も、グリコシル化部位の数または位置の変化等のヒト化抗体またはバリアント抗体の翻訳後プロセス変化させ得る。

抗体の変異誘発に好適な位置の特定の残基または領域を同定する有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異」と呼ばれる。１つの残基または標的残基の群が同定され（たとえば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕ等の荷電残基）、非荷電のアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置き換えられて、アミノ酸と抗原の相互作用に影響する。置換に対して機能的な感受性を示すそれらのアミノ酸の位置は、その後、置換部位に、さらなる、または他の変異体を導入することにより改良される。したがって、アミノ酸配列の変異を導入するための部位は予め決定されるが、突然変異の性質そのものは、予め決定される必要はない。たとえば、所与の部位での突然変異の性能を解析するために、アラニンスキャンまたはランダム突然変異誘発が標的コドンまたは領域で行われ、発現した抗体バリアントが所望の活性についてスクリーニングされる。

アミノ酸配列の挿入には、１残基から、１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ末端および／またはカルボキシル末端への融合、および１つまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する本明細書で開示される抗体、またはエピトープタグと融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体のＮ末端またはＣ末端に、抗体の血清半減期を増大させる酵素またはポリペプチドの融合が含まれる。

バリアントの別の型は、１アミノ酸置換バリアントである。これらのバリアントは、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に別の残基が挿入される。置換変異誘発のための最も重要な部位は高頻度可変領域であるが、ＦＲの改変も考えられる。保守的置換を、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１の「例示的置換」に示す、またはアミノ酸クラスに関連してさらに以下に説明されるような、より実質的な変更を導入して、産生物をスクリーニングする。

抗体の生物学的特性の実質的な修正は、（ａ）置換箇所にけるポリペプチド骨格の構造、たとえば、シートまたはらせん構造、（ｂ）標的部位における分子の電化または疎水性、または（ｃ）側鎖の大部分、を維持する効果が顕著に異なる置換を選択することにより遂行される。天然に存在する残基は、共通する側鎖の特性に基づいて、グループに分類される。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ

非保守的置換は、これらのクラスのメンバーを他のクラスと交換することを意味する。

分子の酸化安定性を改善し、異常なクロスリンクを防止すために、１重特異性または多重特異性抗体の適切な構造の維持に関与しない任意のシステイン残基も、一般的にはセリンで置換してもよい。逆に、安定性を改善するために抗体にシステイン結合をふかしてもよい（特に、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）。

別の型の置換バリアントは、親抗体（たとえば、ヒト化抗体またはラクダ科抗体）の１つ以上の高頻度可変領域の残基を置換することを含む。一般的に、さらなる発展のために選択された得られたバリアントは、それらが生成された親抗体に比べて改善された生物学的特性を有するであろう。そのような置換バリアントを生成するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。手短にいうと、いくつかの高頻度可変領域（たとえば６～７部位）は、各部位においてすべての可能なアミノ残基を生成するように変異する。このように生成された抗体バリアントは、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として一価の様式で提示される。ファージディスプレイバリアントは、その後、本明細書に開示されるようなそれらの生物学的活性（たとえば結合親和性）によりスクリーニングされる。修正のための高頻度可変領域の候補を同定するために、アラニンスキャニング突然変異を行い、抗原結合に大きく寄与している高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、または加えて、抗原－抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体と抗原の間の接触点を同定することが有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述される技術による置換のための候補である。そのようなバリアントが生成されると、バリアントのパネルは、本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体は、さらなる開発のために選択され得る。

抗体のアミノ酸バリアントの別の型は、抗体のオリジナルのグリコシル化パターンを変更する。変更は、抗体中にみられる１つ以上の炭水化物部位を削除し、かつ／または抗体ちゅうに存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。

抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ－結合型またはＯ－結合型のいずれかである。Ｎ－結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合をいう。アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニンで、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるのトリペプチド配列は、炭水化物部分をアスパラギン側鎖に酵素的に結合するための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のいずれかのトリペプチド配列の存在により、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ－結合型グリコシル化は、糖であるＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸への結合をいい、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンも使用され得るが、最も一般的にはセリンまたはスレオニンである。

抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が１つ以上の上述のトリペプチド配列を含むように変化することにより、都合よく行われる（Ｎ－結合型グリコシル化部位について）。この変化は１つ以上のセリンまたはスレオニン残基をオリジナルの抗体の配列に付加することにより、または置換することによって作り出されてもよい（Ｏ－結合型グリコシル化部位）。

一重特異性または多重特異性抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当該分野で知られる様々な方法により調製される。これらの方法には、限定されないが、天然資源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列バリアントの場合）、または、本明細書に開示される抗体の先に調製された変異体または非変異体のオリゴヌクレオチドを介した（または部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲによる突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発が含まれる。

一重特異性抗体または多重特異性抗体の他の修飾が熟慮される。たとえば、疾患の治療における抗体の有効性を高めるために、エフェクター機能に関して抗体を修飾するのが望ましいかもしれない。たとえば、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入して、この領域において鎖間のジスルフィド結合形成を可能にし得る。このように生成された二量体抗体は、内部能力が改善され、かつ／または補体仲介性の細胞死および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強し得る。また、抗腫瘍活性が増強された二量体抗体は、ヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて調製し得る。あるいは、２つのＦｃ領域を有し、それにより補体溶解能とＡＤＣＣ能を向上させ得る抗体を設計することができる。

他の実施形態では、抗体を予め標的化するために「受容体」（ストレプトアビジン等）と結合させてもよく、抗体－受容体コンジュゲートは患者に投与され、続いてクリア剤を用いて結合していないコンジュゲートを循環から除去し、その後、細胞傷害剤（たとえば放射性核種）と結合させた「リガンド」（たとえばアビジン）を投与する。

また、一重特異性または多重特異性抗体の共有結合修飾も、本開示の範囲内である。これらは、場合により、化学合成により、または酵素的もしくは化学的な抗体の切断により作られる。抗体の共有結合修飾の他の類型は、抗体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入される。例示的なポリペプチドの共有結合修飾は、米国特許第５，５３４，６１５号に記載されており、ポリペプチドの共有結合修飾に関する開示のすべてについて参照により本明細書に援用される。抗体の共有結合修飾の例示的な類型は、抗体を様々な非蛋白質ポリマーのうちの１つ、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンに、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号、または米国特許第４，１７９，３３７号に記載の方法で連結することを含む。

本明細書で開示される一重特異性または多重特異性抗体は、組換え手段により製造され得る。したがって、本明細書で開示されるのは、抗体をコードする核酸、抗体をコードする核酸を含む発現ベクター、および抗体をコードする核酸を含む細胞である。組換え体製造の方法は、当該分野で広く知られており、原核および真核細胞におけるタンパク質の発現、それに続く抗体の単離、および通常は、薬学的に許容される純度のための精製を含む。前述のような宿主細胞における抗体の発現のために、抗体配列をコードする核酸は、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母または大腸菌細胞等の適切な原核または真核宿主細胞において行われ、抗体は細胞（溶解後の上清または細胞）から回収される。組換え発現タンパク質は、使用する発現系、およびタンパク質が細胞質中で発現するか分泌されるかに応じて、Ｎ末端に開始メチオニン（またはホルミルメチオニン）またはシグナル配列が必要であることが理解される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるタンパク質配列は、そのようなＮ末端がアミノ酸で修飾される。いくつかの実施形態では、そのようなＮ末端配列は、完全な成熟した配列から切断され（全部または一部）るが、他の実施形態ではそれらは保持される。

したがって、本明細書で開示されるある実施形態は、ａ）抗体をコードする核酸分子を含む少なくとも1つの発現ベクターで宿主細胞を形質転換すること、ｂ）抗体分子の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、およびｃ）培養物から前記抗体分子を回収すること、を含む、一重特異性または多重特異性抗体の調整方法を含む。

抗体は、たとえば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー等の従来のイムノグロブリン精製手順により培養液から適切に分離される。

本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」という表現は、同じ意味で使用され、全てのそのような名称には子孫細胞が含まれる。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」には、最初の対象細胞、および多数の形質転換なしにそれに由来する培養物が含まれる。また、意図的な、または意図しない突然変異のために、すべての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一でない可能性があることも理解される。元の形質転換細胞についてスクリーニングされたものと同じの機能または生物学的活性を有する変異体の子孫も含まれる。異なる名称が意図されている場合は、文脈から明らかであろう。

本明細書で使用される場合、「形質転換」という用語は、縮細胞中へのベクター／核酸の移動のプロセスをいう。宿主細胞として細胞壁障壁がない細胞が用いられる場合、たとえばリン酸カルシウム沈殿法によりトランスフェクションを行うことができる。しかし、たとえば核酸注入による、またはプロトプラスト融合によるＤＮＡを細胞に導入するための他の方法も使用し得る。原核細胞または堅固な細胞壁構造を含む細胞が使用される場合、たとえば、トランスフェクションの方法の１つは塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。

本明細書で使用される場合、「発現」は、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡ（転写産物ともいう）が続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。転写産物およびコードされるポリペプチドは、まとめて遺伝子産物という。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来である場合、真核細胞内での発現には、ｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。

「ベクター」は特に自己複製する核酸分子であり、挿入された核酸分子を宿主細胞内および／または宿主細胞間に移行させる。この用語には、主にＤＮＡやＲＮＡを細胞に挿入する（たとえば染色体統合）機能のベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡを複製する機能のベクターの複製、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳の機能の発現ベクターが含まれる。また、上述の機能の２つ以上を提供するベクターも含まれる。

「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されると、ポリペプチドに転写および翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」は、大抵は、所望の発現産物を得るために機能し得る発現ベクターを含む適切な宿主細胞をいう。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、本明細書で開示される抗体を産生するために設計された任意の細胞系を意味する。ある実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞が宿主細胞として使用される。

原核生物に適切な制御配列には、たとえば、プロモーター、さらなるオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞では、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれたとき、「作動可能に連結」される。たとえば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合、コーディング配列に作動可能に連結され、または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進する部位にある場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列は隣接しており、分泌リーダーの場合は隣接しており、かつリーディングフレーム内にある。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、便利な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位がない場合、従来の方法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。

また、本明細書で開示されるのは、抗体の製造のための核酸および組換え技術を含む、一重特異性または多重特異性抗体をコードする単離された核酸、ベクター、および宿主細胞である。

抗体の組換え産物のために、それをコードする核酸は単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製ベクターに挿入され得る。いくつかの実施形態では、抗体製造に関して開示しているすべてについて参照により本明細書に援用される米国特許第５，２０４，２４４号に記載されているように、相同組換えにより製造され得る。抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を用いて（たとえば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）シークエンスされる。多くのベクターは入手可能である。ベクターの構成要素は、一般的に、限定されないが、たとえばタンパク質発現関して開示しているすべてについて参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，６１５号に記載されているように、１つ以上の以下の物：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー配列、プロモーター、および転写終結配列を含む。

本明細書においてベクターにＤＮＡをクローニングまたは発現させるための適切な宿主細胞は、原核細胞、酵母、または上述の高等真核細胞である。この目的のために適切な原核生物には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌等の真正細菌、たとえば、大腸菌等のエスケリキア属、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ等のサルモネラ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ等のセラチア属、および赤痢菌属等の腸内細菌科、ならびにＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等のバシラス綱、緑膿菌等のシュードモナス属、およびストレプトマイセス属が含まれる。１つの例示的な大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）等の他の株も適切である。これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものである。

原核生物に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物が、一重特異性または多重特異性抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適切である。下等真核宿主微生物の中では出芽酵母または通常のパン酵母が最もよく使用されている。しかし、分裂酵母；たとえばＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２、４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６、０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４、１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６、５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６、９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、ａｎｄＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ等のクルイウェロマイセス属宿主、ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ等のＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属；およびたとえば、アカパンカビ属、アオカビ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、ならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎおよびＡ．ｎｉｇｅｒ等のコウジカビ属等の糸状菌等の他の多くの属、種、および下部が通常入手可能であり、本明細書に有用である。

グリコシル化された一重特異性または多重特異性抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物由来であり、植物細胞および昆虫細胞等の非脊椎動物由来の細胞を含む。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（幼虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ミバエ）、Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉなどの宿主からの多数のバキュロウイルスの株および変異体、並びに対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の様々なウイルス株、たとえば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクション用のウイルスが公知であり、そのようなウイルスは、本発明による本明細書のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。また、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。

しかし、脊椎動物の細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖が日常的な手順になっている。有用な哺乳類宿主細胞株は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎児腎臓細胞（浮遊培養での増殖のためにサブクローン化された２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト胚細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。

宿主細胞は、一重特異性または多重特異性抗体を製造するために上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーター誘導のために修正された従来の栄養培地で培養され、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。

一重特異性または多重特異性抗体を製造するための宿主細胞は、様々な培地で培養され得る。ハムＦ１０（ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。さらに、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、米国特許第５，１２２，４６９号、国際公開第９０／０３４３０号、国際公開第８７／００１９５、または米国再発行特許第３０，９８５号は、宿主細胞の培養培地として使用され得る。必要であれば、これらの任意の培地にホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジン等）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＡＭＹＣＩＮ（登録商標）等）、微量元素（通常、最終濃度がマイクロモーラーの範囲で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を追加してもよい。その他の必要な補助物質も、当業者に知られているような適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で従来から使用されてきたものであり、当業者に明らかであろう。

組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に産生されるか、または直接培地内に分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、最初の段階として、宿主細胞または溶解した断片のいずれかである特定のデブリは、たとえば遠心分離または限外濾過により除去される。

細胞から調製された抗体組成物は、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され、アフィニティークロマトグラフィーは好適な精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、抗体中に存在するイムノグロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプによる。プロテインＡはＦｃ領域を有さない抗体を精製するために使用することができるが、プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖ベースの抗体を精製するために使用することができる。プロテインＧは、マウスの全てのアイソタイプ、およびヒトγ３に有用である。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用できる。コントロールドポアグラス （ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成することができるよりも早い流速および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂が精製に有用である。また、本明細書で開示される抗体および抗体断片は、ヒスチジンタグをつけて合成され、金属アフィニティークロマトグラフィーによりアフィニティ精製され得る。

イオン交換カラムによる分取、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）のクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）のクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿等のタンパク質精製のための他の技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。

任意の予備精製ステップに続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合物を、約２．５～４．５の間のｐＨの溶出バッファーを用いた低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよく、好ましくは低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩）で行う。

また、本明細書で開示されるのは、腫瘍内微小環境で切断され得る多重特異性一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、腫瘍標的化ドメイン（腫瘍抗原結合ドメイン等）または他の機能的ドメイン（体内半減期を延長することができる抗ＨＳＡドメイン等）は、多重特異性一本鎖抗体が腫瘍に到達すると、治療効果をもたらす他のドメインを放出するためにリンカーで切断される。腫瘍内微小環境には、本明細書で開示されるリンカーを切断することができる多数のプロテアーゼが含まれる。腫瘍プロテアーゼの非限定的な例には、限定されないが、マトリックスメタロプロティナーゼ（たとえば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１２、およびＭＭＰ１４）、ＡＤＡＭ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ、たとえば、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７）、カリクレイン関連ペプチダーゼ（たとえば、ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、およびＫＬＫ６）、カテプシン（たとえば、ＣＴＳ－Ｂ、ＣＴＳ－Ｌ、およびＣＴＳ－Ｓ）、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、ヘプシン（ＨＰＮ）、マトリプターゼ、レグメイン、またはジペプチジルペプチダーゼ（たとえば、ＤＤＰ４）が含まれる。

（抗体組成物）
また、本明細書で開示されるのは、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、またはＬＡＧ３等に対する特異性を有する一重特異性または多重特異性抗体を含む医薬組成物である。また、開示されるのは、医薬組成物の製造のための本明細書で開示される抗体の使用である。また、開示されるのは、様々な疾患および障害の治療のための、開示される抗体、および抗体を含む医薬組成物の使用方法である。

医薬組成物は、ヒトにおける疾患の治療を意図したものであり、かつそれに適したものである。すなわち、全体として有益な効果を提供し、有益な効果の提供とは無関係の毒性または他の望ましくない効果を引き起こす成分または混入物を含まない。医薬組成物は、１種以上の活性剤を含み、活性剤または組成物全体の投与性、溶解性、吸収性もしくは生物学的利用能、およびまたは安定性等を補助するために溶媒、緩衝液、希釈剤、担体、および他の添加剤をさらに含み得る。

また、本明細書で開示される一重特異性または多重特異性抗体は、リポソーム中に製剤化されてもよい。抗体を含むリポソームは、米国特許第４，４８５，０４５号、米国特許第４，５４４，５４５号、および米国特許第５，０１３，５５６号に記載されているような、当該分野で知られる方法により調製される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物で、逆相蒸発法により生成される。リポソームは、定められた孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径のリポソームが得られる。抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド相互変換反応によりリポソームに結合し得る。

本明細書で使用される場合、「医薬担体」には、生理的適合性がある、任意の、およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤が含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、眼内、硝子体内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（たとえば、注射または注入による）に適している。いくつかの実施形態では、担体は水性である。

本明細書で開示される組成物は、当該分野で知られる様々な方法により投与することができる。当業者に明らかであるように、投与の経路および／または方法は、所望の結果に応じて変化するであろう。開示される抗体を特定の投与経路により投与するために、不活性化を防止するための物質と抗体を関連付けるか、またはそれと抗体を共投与することが必要であり得る。たとえば、抗体は、適切な担体、たとえば、リポソーム、または希釈剤中で対象に投与され得る。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝液が含まれる。薬学的に許容される担体には、滅菌された注入可能な溶液または分散剤を即時調製するための滅菌水性溶液または分散剤、および滅菌粉末が含まれる。薬学的活性物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で知られている。

本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口で投与される」という句は、大抵は注入による、経腸投与および局所投与以外の投与方法を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、眼内、硝子体内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内への注射および点滴を含む。

これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤、分散剤等の添加剤も含み得る。微生物の存在防止は、前述の滅菌手順と、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の様々な抗菌剤および抗カビ剤の含有との両方によって確保され得る。また、糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物中に含有させるのが望ましいこともある。さらに、注入可能な組成物形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅らせる薬剤の含有によりもたらされ得る。

いくつかの実施形態では、抗体を含む医薬組成物は、凍結乾燥ケーキである。凍結乾燥ケーキは、充填剤、緩衝液および／もしくは塩、または本明細書に記載されたような他の添加剤をさらに含み得る。凍結乾燥組成物は、患者への投与のために、滅菌水または水性緩衝液の添加により再構成される。

選択された投与経路にかかわらず、適切な水和物の形態で使用し得る開示される抗体、および／または抗体を含む医薬組成物は、当業者に知られる従来の方法により薬学的に許容される剤形に製剤化される。

医薬組成物中の活性成分の実際の用量は、特定の患者、組成物、および投与方法について、所望の治療反応を達成するのに効果的であり、患者に毒性がない量の活性成分を得るために様々であり得る。選択される用量レベルは、採用された本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、採用された特定の組成物の排出率、治療期間、採用された特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬剤、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、症状、一般的な健康状態および過去の病歴、医療分野でよく知られる他の要因を含む様々な薬物動態要因に基づくであろう。

（開示されるＭＶＳＣＡおよびそれらの構成抗体ドメイン、およびリンカーの機能）
（抗ＨＳＡ ＨＶＶ）
ＭＶＳＣＡ中の抗ＨＳＡドメインの主な機能は、ＨＳＡに結合し、それにより体内でのＭＶＳＣＡの半減期を延長することである。抗ＨＳＡドメインが含まれることにより、数時間だけの半減期を１週間超に延長することができる。ほとんどの場合、この目的のためには１つの抗ＨＳＡドメインで十分である。したがって、抗ＨＳＡドメインは、ＭＶＳＣＡの半減期を延長する手段を構成する。

ＨＳＡとの結合により、抗ＨＳＡドメインは、隣接する結合ドメインの部分的または完全な遮断を仲介することができ、その活性（有効親和性）を阻害または調節することができる。遮断が実質的に完全であるか部分的であるかは、２つのドメインの間のリンカーの長さに依存し、リンカーが短いほど抗原の結合をより完全に遮断する。部分的な遮断は、ＶＨＨの抗原に対する見かけのまたは有効な親和性の低下として観察されることがよくある。場合によっては、部分的な遮断は、ＶＨＨの特異性の増加として観察されるが、これは、ドメインがより高い親和性を持つ抗原とは結合し続けるが、より低い親和性の抗原には有意な結合を示さないためである。したがって、抗ＨＳＡドメインは、隣接する結合ドメインの結合活性を阻害する手段を構成する。

また、遮断は可逆的であり得る。抗ＨＳＡドメインを、ＭＶＳＣＡの末端部位に配置して切断可能なリンカーを結合させることにより、抗ＨＳＡドメインを除去することができ、隣接する結合ドメインの完全な結合活性が回復する。そのような抗体構造は、効果的なプロドラッグである。たとえば、所望の作用部位にみられるプロテアーゼによりリンカーが切断される場合、ＭＶＳＣＡは隣接する結合部位が不活性な状態で体内を巡るが、作用部位（たとえば腫瘍）に到達するとリンカーが切断され、抗ＨＳＡドメインが放出され、隣接する結合ドメインの結合活性の抑制が解かれる。したがって、抗ＨＳＡドメインは、切断可能なリンカーと対になっている場合、ＭＶＳＣＡまたは多重特異性抗体中の隣接する結合ドメインの結合活性を可逆的に阻害する手段を構成する。

（抗ＣＤ４７）
抗ＣＤ４７ドメインの機能は、腫瘍細胞上のＣＤ４７の「私を食べないで」シグナルを阻害して、マクロファージに貪食されるようにすることである。ＣＤ４７は広範に発現しており、抗ＣＤ４７活性は、正常な健康な細胞への実質的な結合がある場合、問題となり得る。これは、いくつかの方法で避けることができる。CＤ４７には複数の構造が存在し、腫瘍細胞で一般的に見られる構造は、例えばＲＢＣで見られるものとは異なる。実施例１に示すように、本明細書で開示されるＶＨＨは、腫瘍細胞上で発現するＣＤ４７に結合するが、ＲＢＣで発現するものには結合しない。また、ＭＶＳＣＡが血流に取り込まれて標的への到達を妨げないように、ＲＢＣとの結合を避けることも重要である。

ＭＶＳＣＡのＣＤ４７への望ましくない、または有害な稀有号を避ける別の方法は、上述のように、ＣＤ４７への結合を減少させる、または妨害するような方法で、抗ＨＳＡドメインの隣接した場所に配置することにより達成され得る。別の結合ドメインを介してＭＶＳＣＡが腫瘍細胞に結合し、局所的なプロテアーゼにより抗ＨＳＡドメインが切断されて放出されると、抗ＣＤ４７ドメインはＣＤ４７に結合でき、マクロファージとのファゴサイトーシス阻害相互作用を妨害する。

したがって、抗ＣＤ４７ドメインは、ファゴサイトーシスの阻害を減少させる手段を構成する。

（抗ＣＤ１６）
抗ＣＤ１６ドメインの機能は、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性をアップレギュレートすることである。ＣＤ１６Ｂは広く組織に分布しているが、ＣＤ１６ＡはＮＫ細胞で特異的に発現する。ＣＤ１６Ａに特異的な抗体は、所望の標的であるＮＫ細胞にのみ結合するため、好適である。しかし、ＣＤ１６ＡとＣＤ１６Ｂの両方に結合する抗体、およびＣＤ１６にのみ結合する抗体は、両方ともＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を促進することができるアゴニストである。

ＣＤ１６は、通常、抗体のＦｃ部分と相互作用する。ＮＫ細胞のＣＤ１６Ａが抗体のＦｃ部分と結合すると、ＮＫ細胞の細胞溶解活性は、抗体の可変ドメインが結合した細胞または微生物に対して向けられる。しかし、複数のＦｃ配列および複数の型のＦｃ受容体があり、Ｆｃ領域により仲介される可能性のある複数の効果をもたらす。Ｆｃ領域に代えて抗ＣＤ１６ドメインを用いることにより、ＭＶＳＣＡは、他の特異性の標的に対してＮＫを介したＡＤＣＣを特異的にリクルートすることができる。したがって、抗ＣＤ１６ドメインは、ＮＫを介したＡＤＣＣをリクルートする手段を構成する。

（抗ＰＤ－Ｌ１）
抗ＰＤ－Ｌ１ドメインは、免疫チェックポイント阻害剤と抗腫瘍抗原抗体の両方として機能する。抗ＰＤ－Ｌ１ドメインは、ＰＤ－１結合アンタゴニストとしてはたらく。ＰＤ－１（たとえばＴ細胞上の）との結合からＰＤ－Ｌ１（たとえば腫瘍細胞上の）を遮断することにより、抗ＰＤ－Ｌ１ドメインは、関連する免疫チェックポイントを阻害し、Ｔ細胞を介した免疫応答の発生を解放する。抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いたＰＤ－１の遮断は、よく知られた癌の治療法である。したがって、抗ＰＤ－Ｌ１ドメインは、ＰＤ－１を遮断する手段、またはＰＤ－１免疫チェックポイントを解除する手段を構成する。

抗腫瘍抗原抗体としての抗ＰＤ－Ｌ１ドメインは、ＭＶＳＣＡの腫瘍細胞との結合を仲介することができる。ＭＶＳＣＡが抗ＣＤ１６ドメインも含む場合、ＮＫを介したＡＤＣＣが促進される。抗ＣＤ４７ドメインも含むＭＶＳＣＡでは、マクロファージを介したファゴサイトーシスが促進される。腫瘍細胞への多価結合は、結合親和性およびＡＤＣＣを改善する。これは、複数コピーの抗ＰＤ－Ｌ１ドメイン、および／または他の腫瘍抗原を標的とする１つ以上の結合ドメインを有することにより達成される。したがって、抗ＰＤ－Ｌ１ドメインは、腫瘍細胞に結合する手段、腫瘍抗原に結合する手段、またはＰＤ－Ｌ１腫瘍抗原に結合する手段を構成する。

（抗ＬＡＧ３）
抗ＬＡＧ３ドメインは、免疫チェックポイント阻害剤として機能する。抗ＬＡＧ３ドメインは、ＬＡＧ３のクラスＩＩ ＭＨＣタンパク質への結合のアンタゴニストとして機能する。Ｔ細胞上のＬＡＧ３を腫瘍細胞上のクラスＩＩ ＭＨＣの結合から遮断することにより、抗ＬＡＧ３ドメインは、関連する免疫チェックポイントを阻害し、Ｔ細胞を介した免疫応答の発生を解放する。したがって、抗ＬＡＧ３ドメインは、ＬＡＧ３免疫チェックポイントを解除する手段を構成する。

（抗ＣＤ３３）
ＣＤ３３は、抗ＣＤ３３ドメインは、２つの方法で使用され得る。骨髄系細胞および一部のリンパ球で発現し、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）等の一部の血液癌で発現するため、腫瘍抗原である。腫瘍抗原抗体としての抗ＣＤ３３ドメインは、ＭＶＳＣＡの腫瘍細胞への結合を仲介することができる。ＭＶＳＣＡが抗ＣＤ１６ドメインも含む場合、ＮＫを介したＡＤＣＣが促進される。抗ＣＤ４７ドメインも含むＭＶＳＣＡでは、マクロファージを介したファゴサイトーシスが促進される。腫瘍細胞への多価結合は、結合親和性およびＡＤＣＣを改善する。これは、複数コピーの抗ＣＤ３３ドメイン、および／または他の腫瘍抗原を標的とする１つ以上の結合ドメインを有することにより達成される。したがって、抗ＣＤ３３ドメインは、腫瘍細胞に結合する手段、腫瘍抗原に結合する手段、またはＣＤ３３腫瘍抗原に結合する手段を構成する。

さらに、たとえば、β－アミロイドまたは他の糖脂質沈着タンパク質において、ＣＤ３３がシアル酸残基と結合する場合、阻害シグナル伝達カスケードが貪食活性の阻害をもたらす。抗ＣＤ３３ドメインを備える抗体はＣＤ３３刺激のアンタゴニストとして機能し、それにより貪食活性を促進し、アルツハイマー病を治療するために除去する。また、乾燥型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）等の網膜疾患では不溶性の沈着物があり、ミクログリアのファゴサイトーシスにより除去され得る。したがって、抗ＣＤ３３ドメインを備える抗体は、乾燥型ＡＭＤおよび他の網膜疾患の治療にも有用であり得る。したがって、抗ＣＤ３３ドメインは、貪食活性を促進する手段（ＣＤ３３を発現する細胞において）、β－アミロイドの除去を促進する手段、または不溶性の沈着物を除去する手段を構成する。

アルツハイマー病および網膜疾患の治療に適したＭＶＳＣＡは、好ましくは、ＣＤ３３について２価であり、半減期を改善するために抗ＨＳＡドメインを含む。これらは、ヒト血液脳関門をまたいだ移動を促進するためのＦＣ５ナノボディドメイン（Ｒｉｓｓｉｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ． Ｃｅｌｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８：３４４， ２０１４）をさらに含む。

（リンカー）
多くの実施形態では、個々の結合ドメインは互いに直接結合していないが、それらの間に挟まれた短いアミノ酸配列であるリンカーを有する。リンカーの例を表１５に示す。リンカーの長さおよび配列は、ＭＶＳＣＡの発現レベルおよび構造、および連結されたドメインの結合親和性に重大な絵影響を及ぼし得る。長さを調節できるリンカーＬ２およびＬ４（表１５を参照）を使用して、これらのパラメータを考慮してＭＶＳＣＡを最適化することができる。リンカーＬ１、Ｌ２、およびＬ４は、切断不可能なリンカー手段、柔軟なリンカー手段、または柔軟で切断不可能なリンカー手段と称し得る。

同じＶＨＨドメインの２コピーがＭＶＳＣＡ内で互いに近接して配置されると、互いに有害な相互作用をすることが多い。これは、２つのコピーの間に比較的短くて曲がらないリンカーを挟むことにより回避することができる。いくつかの実施形態では、短くて曲がらないリンカーは、配列ＡＡＡを有する（表１５のＬ３を参照）。そのようなリンカーは、短くて曲がらないリンカー手段、または切断不可能な短くて曲がらないリンカー手段と称し得る。

抗ＨＳＡドメイン－ＨＳＡ複合体が、隣接する結合ドメインの結合活性に関するプロドラッグを生成するために使用される場合、２つのドメインの間に切断可能なリンカーが挟まれるべきである。Ｌ１１＊３～Ｌ１１＊１８（表１５を参照）は、ＭＶＳＣＡの発現レベルおよび構造、連結ドメインの結合親和性、および切断の観点からＭＶＳＣＡを最適化するために使用できる、種々の長さおよび種々のプロテアーゼによる切断に対する感受性を有する切断可能リンカーの例である。リンカーＬ１１＊３～Ｌ１１＊１８は、切断可能なリンカー手段、柔軟なリンカー手段、または柔軟で切断可能なリンカー手段と称し得る。

（ＭＶＳＣＡ）
本明細書に記載される結合ドメインおよびリンカーは、組み合わせられ、特定の疾患の治療に適合する多機能ＭＶＳＣＡを作り出すことができる。それらは、他の結合ドメインをさらに組み合わせられてもよい。また、ＭＶＳＣＡは、各構成タイプの結合ドメインに関連する様々な機能を実現するための手段を含み、かつ／または、それらの関連する機能を実現するためのリンカー手段を含むとも言える。例示的な構造は、すぐ下で簡単に説明する。

ＨＳＡ／ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１：この構造は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍の治療に適しており、ファゴサイトーシスを促進し、ＰＤ－１免疫チェックポイントを解除し、体内での半減期を延長するであろう。様々な実施形態では、ＭＶＳＣＡは、抗ＣＤ－４７および／または抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメインについて２価であり得る。使用されるリンカー次第で、抗ＨＳＡドメイン（一旦ＨＳＡが結合すると）がＣＤ４７との結合を阻害するかしないかであり、阻害がある場合は切断可能なリンカーを切断することで回復させることが可能である。いくつかの実施形態では、結合ドメインは異なる順序で配列されているが、抗ＨＳＡドメインは、切断される場合には、末端位置にあるべきである。構成部分の１つ以上の機能の実現手段としてのこの構成のＭＶＳＣＡの説明に加え、ＭＶＳＣＡはＰＤ－Ｌ１発現腫瘍のファゴサイトーシスを促進する（かつＰＤ－１免疫チェックポイントを解除する）ための手段ともいえる。この構造のいくつかの実施形態を実施例７に示す。

ＨＳＡ／ＬＡＧ３／ＰＤ－Ｌ１：この構造は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍の治療に適しており、ＬＡＧ３およびＰＤ－１免疫チェックポイントを解除し、体内での半減期を延長するであろう。様々な実施形態では、ＭＶＳＣＡは、抗ＬＡＧ３および／または抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメインについて２価であり得る。いくつかの実施形態では、結合ドメインは異なる順序で配列されている。構成部分の１つ以上の機能の実現手段としてのこの構成のＭＶＳＣＡの説明に加え、Ｔエフェクター細胞をＭＶＳＣＡはＰＤ－Ｌ１発現腫瘍にリクルートする（かつＬＡＧ３およびＰＤ－１免疫チェックポイントを解除する）ための手段ともいえる。この構造のいくつかの実施形態を実施例７に示す。

ＣＤ１６Ａ／ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１：この構造は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍の治療に適しており、ファゴサイトーシスを促進し、ＮＫ細胞をリクルートしてＡＤＣＣを仲介し、ＰＤ－１免疫チェックポイントを解除し、体内での半減期を延長するであろう。様々な実施形態では、ＭＶＳＣＡは、抗ＣＤ－４７および／または抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメインについて２価であり得る。いくつかの実施形態では、結合ドメインは異なる順序で配列されているが、抗ＨＳＡドメインは、切断される場合には、末端位置に配置されるべきである。使用されるリンカー次第で、抗ＨＳＡドメイン（一旦ＨＳＡが結合すると）がＣＤ４７との結合を阻害するかしないかであり、阻害がある場合は切断可能なリンカーを切断することで回復させることが可能である。構成部分の１つ以上の機能の実現手段としてのこの構成のＭＶＳＣＡの説明に加え、ＭＶＳＣＡは、ファゴサイトーシスを促進し、ＮＫを介したＡＤＣＣをＰＤ－Ｌ１発現腫瘍にリクルートする（かつＰＤ－１免疫チェックポイントを解除する）ための手段ともいえる。この構造のいくつかの実施形態を実施例８に示す。

ＣＤ１６Ａ／ＣＤ４７／ＣＤ３３：この構造は、ＣＤ３３を発現する腫瘍の治療に適しており、ファゴサイトーシスを促進し、ＮＫ細胞をリクルートしてＡＤＣＣを仲介し、体内での半減期を延長するであろう。様々な実施形態では、ＭＶＳＣＡは、抗ＣＤ－４７および／または抗ＣＤ３３結合ドメインについて２価であり得る。いくつかの実施形態では、結合ドメインは異なる順序で配列されているが、抗ＨＳＡドメインは、切断される場合には、末端位置に配置されるべきである。使用されるリンカー次第で、抗ＨＳＡドメイン（一旦ＨＳＡが結合すると）がＣＤ４７との結合を阻害するかしないかであり、阻害がある場合は切断可能なリンカーを切断することで回復させることが可能である。構成部分の１つ以上の機能の実現手段としてのこの構成のＭＶＳＣＡの説明に加え、ＭＶＳＣＡは、ファゴサイトーシスを促進し、ＮＫを介したＡＤＣＣをＣＤ３３発現腫瘍にリクルートするための手段ともいえる。この構造のいくつかの実施形態を実施例８に示す。

二価抗ＣＤ３３ＭＶＳＣＡ：これらの構造は、たとえばミクログリア細胞によるファゴサイトーシスの阻害を遮断することにより、不溶性物質の沈着に関連する疾患の治療に適している。そのような疾患には、アルツハイマー病および乾燥型ＡＭＤが含まれる。ＨＳＡ／ＣＤ３３／ＣＤ３３構造は、循環半減期を延長するであろう。ＦＣ５／ＣＤ３３／ＣＤ３３構造は、血液脳関門を通過するであろう。ＦＣ５／ＣＤ３３／ＣＤ３３／ＨＡＳ構造は、循環半減期を延長し、かつ血液脳関門を通過するであろう。単純なＣＤ３３／ＣＤ３３構造は、眼または脳への局所注入に適しており、この場合、循環半減期の延長または血液脳関門を通過する能力は無視できるほど重要である。いくつかの実施形態では、結合ドメインは異なる順序で配列されている。構成部分の１つ以上の機能の実現手段としてのこの構成のＭＶＳＣＡの説明に加え、ＭＶＳＣＡは、不溶性沈着物の（ミクログリアによる）ファゴサイトーシスを促進するための手段ともいえる。この構造のいくつかの実施形態を実施例９に示す。

（開示された抗体の使用）
開示された抗体は医療に有用である。「治療」「治療する」等の用語は、疾患、病状、または障害を治療、改善、安定化、または予防することを意図して、患者を医療管理することをいう。この用語には、積極的治療、すなわち疾患、病状、または障害の改善を特に目的とした治療、および原因治療、すなわち疾患、病状、または障害に関連する原因を取り除くことを目的とした治療も含まれる。さらに、この用語には、緩和治療、すなわち疾患、病状、または障害の治癒よりも症状の緩和のための治療、予防治療、すなわち関連する疾患、病状、または障害の発生を最小限にする、または部分的もしくは完全に阻害することを目的とした治療、および補助的治療、すなわち関連する疾患、病状、または障害の改善を目的とした他の特定の治療の補助として採用される治療が含まれる。

また、診断および画像化における本明細書で開示される抗体の使用も企図される。

さらに、「治療する」または「治療」という用語は、ヒトまたは他の動物における疾患またはその観点の診断、緩和、または予防を含む任意の種類の治療行為、またはヒトまたは他の動物の身体の任意の構造または任意の機能に影響する行為を広く含む。治療行為には、本明細書に記載される医薬、剤形、および医薬組成物の、特に本明細書で開示される様々な方法による、医療専門家、患者自身、または任意の他者による患者への投与が含まれる。治療行為には、医師、医師の助手、診療看護師等の医療専門家の命令、指示、および助言が含まれ、それらは他の医療専門家または患者自身を含む任意の他者により実行される。これには、たとえば、最終的に患者が適切な治療を受け得るように、癌の診断および病期分類などの診断手順を受けるために患者への指示、または実行するための臨床検査機関への指示が含まれる。いくつかの実施形態では、治療行為の命令、指示、および助言の側面は、保険会社または薬局給付管理会社などによって行われ得るように、医薬品の保険適用を承認する、代替医薬品の適用を拒否する、医薬品処方箋に医薬品を含める、または代替医薬品を除外する、または医薬品を使用する金銭的インセンティブを提供する等、特定の医薬品またはその組み合わせが状態の治療のために選ばれることを奨励、誘導または義務付け、その医薬品が実際に使われることを含むこともできる。いくつかの実施形態では、治療行為には、病院、診療所、健康維持組織、医療行為または医師グループなどによって確立され得るような方針または診療基準によって、ある状態の治療のために特定の医薬品が選択され、その医薬品が実際に使用されることを奨励、誘導、または義務付けることも含むことができる。そのような命令、指示、助言はすべて、その指示に従うことを条件として、治療の利益を受けるとみなされる。場合によっては、そのような命令、指示、および助言を順守することで、患者が金銭的利益を受けることもある。場合によっては、そのような命令、指示、および助言を順守することで、医療専門家が金銭的利益を受けることもある。

開示された一重特異性のＨＣＡｂ、ならびにＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、およびＬＡＧ３に対する特異性を有する多価一本鎖抗体は、癌の治療に有用である。各抗体は、抗体が備える抗原結合特異性に基づき、特定のクラスの癌を治療するために設計される。

本開示は、有効量の本明細書で開示される抗体、または前記抗体を含む医薬組成物を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。

開示された方法により治療することができる癌の例には、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨肉腫、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳癌、気管支腺腫／気管支カルチノイド、カルチノイド腫瘍、膵島細胞癌、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、大腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、子宮内膜癌、上衣腫、卵巣上皮癌、食道癌、ユーイングの腫瘍ファミリー、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞癌、頸部扁平上皮癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、軟部肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、頸部扁平上皮癌、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、絨毛性腫瘍、尿道癌、子宮癌、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍が含まれる。

癌治療の有効性は、典型的には、「寛解」という用語で測定される。寛解をモニターする技術は、限定されないが、
・一部のリンパ節を含むしこりまたは腫瘍は、身体検査により外部から感じ、測定することができる
・一部の内部癌腫瘍は、Ｘ線またはＣＴスキャンで表示され、定規で測定できる
・臓器機能を測定するものを含む血液検査を実施できる
・特定の癌に対して腫瘍マーカー試験を行うことができる
等の癌の診断のために使用される試験と同様である。

用いられる試験に関わらず、血液検査、細胞計数、腫瘍マーカー試験のいずれであっても、結果を前の同じ試験と比較できるように、一定の間隔で繰り返される。

癌治療の寛解はいくつかの状態で定義される。
・完全寛解－すべての癌または腫瘍が消失し、疾患の痕跡がない。腫瘍マーカー（適用できる場合）の発現レベルは、正常の範囲に下がり得る。
・部分寛解－癌が何割か小さくなったが、疾患は残存している。腫瘍マーカー（適用できる場合）のレベルは下がっている（または腫瘍負担の減少を示すものとして、腫瘍マーカーに基づいて増加している）が、疾患の痕跡が残っている。
・安定疾患－癌は増殖も縮小もしておらず、疾患の量に変化がない。腫瘍マーカー（適用できる場合）に有意な変化がない。
・疾患の進行－癌が増殖し、治療前よりも疾患が悪化している。腫瘍マーカー（適用できる場合）試験は、腫瘍マーカーが増えたことを示す。

癌治療の有効性の他の尺度には、全生存期間（診断から、または評価対象の治療開始から、任意の原因による死亡までの時間）、無癌生存期間（完全寛解後に癌が検出されなくなるまでの期間の長さ）、および無進行生存期間（疾患安定、または部分寛解後の腫瘍増殖の再開が検出されない期間の長さ）が含まれる。

腫瘍サイズ（腫瘍負担）に関して固形癌治療寛解を評価する２つ基準方法、ＷＨＯ基準およびＲＥＣＩＳＴ基準がある。これらの方法は、固形腫瘍を測定し、現在の腫瘍と過去の測定値を比較するか、または将来の測定値との変化を比較して、治療方針を変更する。ＷＨＯ法では、固形腫瘍の長軸および短軸を測定し、それらの２つの測定値の積を算出する。複数の固形腫瘍がある場合は、全ての積を加算する。ＲＥＣＩＳＴ法では、長軸のみを測定する。複数の固形腫瘍がある場合は、全ての長軸の測定値を加算する。ただし、リンパ節は、長軸に代えて短軸を測定する。

本開示は、本明細書で開示される抗体を、そのような治療を必要とする患者に投与することを含む、眼の障害を治療する方法を提供する。眼の障害の例には、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、たとえば湿潤型ＡＭＤおよび乾燥型ＡＭＤ、または黄斑浮腫、たとえば糖尿病性黄斑浮腫が含まれる。いくつかの実施形態では、眼の障害は、網膜障害である。

また、本開示は、限定されないが、アルツハイマー病、レヴィー小体病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、白質ジストロフィー、進行性核上性麻痺、神経炎症、炎症性脱髄疾患、認知症、または神経障害を含む神経変性疾患を治療する方法も提供する。ある実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病である。

以下の実施例、配列表、および図面は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に規定される。

（特定の実施形態のリスト）
以下の実施形態のリストは、本明細書で説明される、幅、組み合わせおよびサブ組み合わせ、発明のクラス等に関する様々な実施形態の例示であるが、本明細書でサポートするすべての実施形態の網羅的な列挙を意図したものではない。

実施形態１．
ＣＤ４７に対する抗原結合特異性を有する可変重鎖（ＶＨＨ）ドメイン。

実施形態２．
配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列を有する、実施形態１のＶＨＨドメイン。

実施形態３．
ＰＤ－Ｌ１に対する抗原結合特異性を有する可変重鎖（ＶＨＨ）ドメイン。

実施形態４．
配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列を有する、実施形態３のＶＨＨドメイン。

実施形態５．
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する抗原結合特異性を有する可変重鎖（ＶＨＨ）ドメイン。

実施形態６．
配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列を有する、実施形態５のＶＨＨドメイン。

実施形態７．
ＣＤ３３に対する抗原結合特異性を有する可変重鎖（ＶＨＨ）ドメイン。

実施形態８．
配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列を有する、実施形態７のＶＨＨドメイン。

実施形態９．
ＬＡＧ３に対する抗原結合特異性を有する可変重鎖（ＶＨＨ）ドメイン。

実施形態１０．
配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列を有する、実施形態９のＶＨＨドメイン。

実施形態１１．
ＣＤ１６に対する抗原結合特異性を有する可変重鎖（ＶＨＨ）ドメイン。

実施形態１２．
配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列を有する、実施形態１１のＶＨＨドメイン。

実施形態１３．
実施形態１～１２のいずれか１つのＶＨＨドメインを含む、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）。

実施形態１４．
１つ以上の定常ドメイン、および、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、またはＬＡＧ３に結合する手段を含む、抗体。

実施形態１５．
１つ以上の実施形態１～１２のＶＨＨドメイン、または、ＣＤ４７、ＨＳＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３３、ＣＤ１６、もしくはＬＡＧ３に結合する手段を含む、多重特異性抗体。

実施形態１６．
１つ以上のさらなる抗体結合ドメインをさらに含む、実施形態１５の多重特異性抗体。

実施形態１７．
さらなる抗体結合ドメインは、ＦＣ５（配列番号２２２）を含む、実施形態１６の多重特異性抗体。

実施形態１８．
さらなる抗体結合ドメインは、ＦｖまたはＦａｂを含む、実施形態１６の多重特異性抗体。

実施形態１９．
多重特異性一本鎖抗体（ＭＶＳＣＡ）である、実施形態１５～１７のいずれか１つの多重特異性抗体。

実施形態２０．
２、３、４、５、または６つの抗体結合ドメインを含む、実施形態１９のＭＶＳＣＡ。

実施形態２１．
１、２、３、または４つの抗体結合特異性を有する、実施形態２０のＭＶＳＣＡ。

実施形態２２．
ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態２３．
ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態２４．
ＨＳＡ、ＬＡＧ３、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態２５．
ＨＳＡ、ＬＡＧ３、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態２６．
ＣＤ１６、ＨＳＡ、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態２７．
ＣＤ１６、ＨＳＡ、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態２８．
ＣＤ１６、ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態２９．
ＣＤ１６、ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～２１のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態３０．
ＣＤ１６、好ましくはＣＤ１６Ａを認識する抗体結合ドメインを含む、実施形態１４～２１、または２６～２９のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態３１．
同一の特異性を有する２つの隣接する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～３０のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態３２．
同一の特異性を有する２つの隣接する抗体結合ドメインは、それらの間に挟まれた短くて曲がらないリンカー手段を有する、実施形態３１のＭＶＳＣＡ。

実施形態３３．
短くて曲がらないリンカー手段は、アミノ酸配列ＡＡＡ（配列番号１０２）からなる、実施形態３１のＭＶＳＣＡ。

実施形態３４．
２つの隣接する抗体結合ドメインは、ＣＤ３３と結合する、実施形態３１～３３のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態３５．
ＨＳＡを認識する抗体結合ドメインをさらに含む、実施形態３４のＭＶＳＣＡ。

実施形態３６．
ＦＣ５をさらに含む、実施形態３４または３５のＭＶＳＣＡ。

実施形態３７．
２つの隣接する抗体結合ドメインは、ＰＤ－Ｌ１と結合する、実施形態３１～３３のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態３８．
２つの隣接する抗体結合ドメインは、ＬＡＧ３と結合する、実施形態３１～３３のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態３９．
２つの隣接する抗体結合ドメインは、ＣＤ１６と結合する、実施形態３１～３３のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態４０．
２つの隣接する抗体結合ドメインは、ＣＤ４７と結合する、実施形態３１～３３のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態４１．
隣接する抗体結合ドメインの間にリンカーを含む、実施形態１９～３０のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態４２．
同一でない抗原結合ドメインの間に挟まれたリンカーは、Ｌ１（配列番号１００）、Ｌ２（配列番号１０１）、またはＬ４（配列番号１０３）である、実施形態４１のＭＶＳＣＡ。

実施形態４３．
同一でない抗原結合ドメインの間に挟まれた、柔軟で切断不可能なリンカー手段を含む、実施形態１９～３０のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態４４．
ＨＳＡと結合する、Ｎ末端またはＣ末端に位置する抗体結合ドメインを含む、実施形態１９～３０のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態４５．
ＨＳＡと結合すると、ＨＳＡと結合する抗体結合ドメインと隣接する抗体結合ドメインは、その抗原との結合が阻害される、実施形態４４のＭＶＳＣＡ。

実施形態４６．
ＨＳＡと結合する抗体結合ドメインと隣接する抗体結合ドメインは、ＣＤ４７を認識する、実施形態４５のＭＶＳＣＡ。

実施形態４７．
切断可能なリンカーが、ＨＳＡと結合する抗体結合ドメインとそれに隣接する抗体結合ドメインの間に挟まれ、切断可能なリンカーは、Ｌ１１＊３（配列番号：１０４）、Ｌ１１＊４（配列番号：１０５）、Ｌ１１＊５（配列番号：１０６）、Ｌ１１＊６（配列番号：１０７）、Ｌ１１＊７（配列番号：１０８）、Ｌ１１＊８（配列番号：１０９）、Ｌ１１＊９（配列番号：１１０）、Ｌ１１＊１０（配列番号：１１１）、Ｌ１１＊１１（配列番号：１１２）、Ｌ１１＊１２（配列番号：１１３）、Ｌ１１＊１３（配列番号：１１４）、Ｌ１１＊１４（配列番号：１１５）、Ｌ１１＊１５（配列番号：１１６）、Ｌ１１＊１６（配列番号：１１７）、Ｌ１１＊１７（配列番号：１１８）、またはＬ１１＊１８（配列番号：１１９）である、実施形態４５または４６のＭＶＳＣＡ。

実施形態４８．
切断可能なリンカー手段が、ＨＳＡと結合する抗体結合ドメインと、それに隣接する抗体結合ドメインの間に挟まれる、実施形態４５または４６のＭＶＳＣＡ。

実施形態４９．
すべての抗体結合ドメインがＶＨＨドメインである、実施形態１９～４８のいずれか１つのＭＶＳＣＡ。

実施形態５０．
実施形態１～４９のいずれか１つのＶＨＨドメインまたは抗体を含む、医薬組成物。

実施形態５１．
ＨＳＡに結合する手段、多重特異性抗体またはＭＶＳＣＡの体内半減期を延長する手段、隣接する結合ドメインの結合活性を可逆的に阻害する手段を含む、医薬組成物。

実施形態５２．
ＣＤに結合する手段、またはファゴサイトーシスの阻害を減少させる手段を含む、医薬組成物。

実施形態５３．
ＣＤ１６もしくはＣＤ１６Ａに結合する手段、またはＮＫを介したＡＤＣＣをリクルートする手段を含む、医薬組成物。

実施形態５４．
ＰＤ－Ｌ１に結合する手段、ＰＤ－Ｌ１腫瘍抗原に結合する手段、ＰＤ－１遮断の手段、またはＰＤ－１免疫チェックポイントを解除する手段を含む、医薬組成物。

実施形態５５．
腫瘍抗原に結合する手段、ＰＤ－Ｌ１腫瘍抗原に結合する手段、またはＣＤ３３腫瘍抗原に結合する手段を含む、医薬組成物。

実施形態５６．
ＬＡＧ３に結合する手段、またはＬＡＧ３免疫チェックポイントを解除する手段を含む、医薬組成物。

実施形態５７．
免疫チェックポイントを解除する手段、ＰＤ－１免疫チェックポイントを解除する手段、またはＬＡＧ３免疫チェックポイントを解除する手段を含む、医薬組成物。

実施形態５８．
ＣＤ３３に結合する手段、ＣＤ３３腫瘍抗原に結合する手段、β－アミロイドの除去を促進する手段、または不溶性の沈着物を除去する手段を含む、医薬組成物。

実施形態５９．
ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍のファゴサイトーシスを促進する手段を含む、医薬組成物。

実施形態６０．
ＴエフェクターをＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍にリクルートする手段を含む、医薬組成物。

実施形態６１．
ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍のファゴサイトーシスを促進する手段、およびＮＫを介したＡＣＤＤを、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍にリクルートする手段を含む、医薬組成物。

実施形態６２．
ＣＤ３３を発現する腫瘍のファゴサイトーシスを促進する手段、およびＮＫを介したＡＣＤＤを、ＣＤ３３を発現する腫瘍にリクルートする手段を含む、医薬組成物。

実施形態６３．
実施形態１～４８のいずれか１つの抗体、または実施形態４９～６１のいずれか１つの医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。

実施形態６４．
実施形態７～８、１３～２１、３４～３６、もしくは４８～４９のいずれか１つの抗体であって、ＣＤ３３結合ドメインを含む抗体または実施形態５８の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、アルツハイマー病または網膜疾患を治療する方法。

実施形態６５．
抗体は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、またはＣＤ１６を認識する抗体結合ドメインを含まない、実施形態６４の方法。

実施形態６６．
網膜疾患は乾燥型ＡＭＤである、実施形態６４または６５の方法。

実施形態６３～６６の各々について、治療における使用、医薬の製造における使用のための組成物、治療における組成物の使用、および医薬の製造における組成物の使用についての対応する実施形態がある。

（実施例）
（実施例１）
抗ＣＤ４７ＨＣＡｂ抗体
免疫付与したラマからの抗ＣＤ４７ＨＣＡｂ抗体の単離

（免疫付与）
標準プロトコールに従い、２匹のラマに、Ａｂｃｏｒｅ Ｉｎｃ（ラモーナ、ＣＡ）で免疫付与した。組換えヒトＣＤ４７（細胞外ドメイン１９－１３９、配列番号１）を、完全フロイントアジュバント（０日目）、または不完全フロイントアジュバント（免疫後）（Ｄｉｆｃｏ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した。ラマ１匹あたり５０μｇ／回を隔週で、６回皮下注射した。４５日目に、組換えＣＤ４７タンパク質で免疫されたラマから血清を採取し、ｈＣＤ４７に対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡでは、９６穴マキシソーププレート（Ｎｕｎｃ）を１００ｎｇ／ウェルのｈＣＤ４７でコーティングした。ブロッキングし、希釈した血清サンプルを加えた後、抗ＣＤ４７抗体の存在は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ラマＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて示された。

配列番号１ ヒトＣＤ４７の細胞外ドメイン（１９－１３９、Ｑ０８７２２）
ＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶＳＷＦＳＰ

（ファージライブラリーの構築および選択）
末梢血単核細胞は、製造者の取り扱い説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、組換えＣＤ４７タンパク質で免疫付与されたラマの４５日目の血液サンプルから調製された。全ＲＮＡを、製造者の取り扱い説明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて末梢血単核細胞から抽出し、ＲＴ－ＰＣＲの出発材料として使用して、ＶＨＨをコードする遺伝子断片を増幅した。これらの断片をファージミドベクターにクローニングし、ヘルパーファージを感染した後に、遺伝子－ｌｌｌ融合タンパク質としてＶＨＨをファージ粒子表面に表示する組換えファージ粒子を製造できるようにした。ファージは標準的な方法により調製し、フィルター滅菌の後、さらなる使用のために４℃で保存した。

ＣＤ４７結合ファージの選択のために、ビオチン化ＣＤ４７をファージライブラリーとインキュベートし、その後ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に捕捉された。完璧に洗浄後、結合したファージを１ｍｇ／ｍｌのトリプシンで溶出した。選択出力物を大腸菌ＴＧ１細胞内にレスキューした。コロニーを拾い、ＢＡＴＪ，Ｉｎｃ（サンディエゴ、ＣＡ）でシークエンスした。

ＣＤ４７結合ＶＨＨをコードするｃＤＮＡは、Ａｔｕｍ（ニューアーク、ＣＡ）でＣ末端にヒスチジンタグをつけて合成され、ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクションされ、ＩＭＡＣクロマトグラフィーによりポジティブなＶＨＨを精製した。

免疫付与したラマのファージライブラリーのＣＤ４７結合ファージコロニーをシークエンスし、各ＶＨＨについて以下（表２）にリストするアミノ酸配列を決定した。以下のアミノ酸配列に基づくｃＤＮＡ配列をヒトＦｃと融合し、ｐＪ６０７発現ベクターで合成した。この発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトし、組換え抗ＣＤ４７ＨＣＡｂ抗体を製造した。発現した抗ＣＤ４７ＨＣＡｂを、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムにより精製した。

Ａ０９－１０ ＶＨＨをＩＧＨＶ３－２３ヒト生殖細胞系列配列に基づきヒト化した。

表２のＶＨＨは、ＣＤ４７に結合する手段を構成する。

（抗ＣＤ４７ＨＣＡｂ分子のＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析）

ヒトＣＤ４７（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と抗ＣＤ４７ＶＨＨの結合動態を測定するために、ラベルフリー技術であるＢｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）を使用した。Ａｎｔｉ－Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ ｃａｐｔｕｒｅ（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサーチップ（ＦｏｒｔeＢｉｏ（登録商標））を装着したＯｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫ^ｅでアフィニティ測定を行った。１×ＰＢＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ＰＢＳ ｐＨ７．２）中で、３０℃でアッセイを行った。１０００ｒｐｍでサンプルを撹拌した。解析の前に、センサーを１５分間湿らせた。精製した抗ＣＤ４７ＶＨＨのＨＩＳ１Ｋセンサーチップとの結合能を試験した。２０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４７ＶＨＨを用いてチップをロードした。３００秒間のローディングにより、１．８～２ｎｍの捕捉レベルが得られた。結合解析のために、ヒトＣＤ４７抗原を、１×ＰＢＳ中で１００、１５０、２５０、３５０ｎＭの濃度に希釈して調製した。解離をモニターするために、会合を開始し、２００秒間モニターした後、チップを１×ＰＢＳバッファー（Ｇｉｂｃｏ、ＰＢＳ ｐＨ７．２）に移した。実験を通じてセンサーデータを収集し、処理し、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）データ解析ソフトウェア７（ＦｏｒｔeＢｉｏR）を用いて解析した。

抗ＣＤ４７ＨＣＡｂの結合親和性のＯｃｔｅｔ（登録商標）動態解析を表３に示す。ＨＣＡｂｓ Ａ０９－０４、Ａ０９－０６、Ａ０９－０８、およびＡ０９－１０はｐＭ結合親和性を示す。

（ＣＤ４７過剰発現ＣＨＯ細胞株に対する抗ＣＤ４７ＨＣＡｂの結合親和性のフローサイトメトリー解析）

氷温のＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）中の１×１０^６細胞／ｍｌのＣＤ４７過剰発現ＣＨＯ細胞を、１００ｎＭ～０．００１２８ｎＭの範囲の濃度の抗ＣＤ４７ＨＣＡｂと共に、または対照としてＢ６Ｈ１２抗ＣＤ４７抗体と共にインキュベートし、４５分間氷上でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、製造者の取り扱い説明書に従ってヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ，ＦＩＴＣ結合抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加え、その後、４℃で３０分間インキュベートした。データはＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ＨＴシステムを用いて取得した。

上述のフローサイトメトリー法に従い、抗ＣＤ４７ ＨＣＡｂに対する結合親和性を、図１に示すように、ＥＣ_５０として測定した。

（抗ＣＤ４７ドメインを有する多重特異性分子の競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイ）

競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイを行って、ＣＤ４７結合多重特異性分子１５１１（配列番号１５６、ＣＤ１６Ｆ－Ｌ１－ＨＳＡ－Ｌ１－ＣＤ４７－Ｌ３－ＣＤ４７－Ｌ１－ＰＤＬ１－Ｌ３－ＰＤＬ１）および３３２１（配列番号１５９、ＣＤ１６Ｆ－Ｌ１－ＨＳＡ－Ｌ１－ＣＤ４７－Ｌ１－ＣＤ３３－Ｌ３－ＣＤ３３）をスクリーニングし、両者は、ＣＤ４７抗原とその受容体ＳＩＰＰαの結合を競合的に遮断する抗ＣＤ４７ＶＨＨ Ａ０９－１０を含む。多重特異性抗体は、その結合ドメイン（たとえばＣＤ４７）、および結合ドメインを分離するリンカー（たとえば、表１５で特定されるＬ１）により特定される。９６穴プレート上に、１ウェルあたり１００ｎｇのＣＤ４７－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）がコーティングされ、１０ｎＭのビオチン化ヒトＳＩＲＰαと、多重特異性の分子１５１１および３３２１が異なる濃度でプレインキュベートされ、その後ＨＲＰ結合ストレプトアビジンが添加される。多重特異性分子１５１１および３３２１は、ＣＤ４７と、その受容体ＳＩＲＰαとの結合を、図２に示すように、ＥＣ５０で競合的に遮断する。

（抗ＣＤ４７ドメインを有する多重特異性分子の競合フローサイトメトリー結合解析）

競合フローサイトメトリーアッセイを行い、多重特異性分子１５１１および３３２１が、自然にＣＤ４７を発現する細胞上でＣＤ４７抗原とその受容体ＳＩＲＰαの結合を遮断することを確認した。氷温のＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）中の１×１０^６細胞／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１００ｎＭ～０．００１２８ｎＭの範囲の濃度の１５１１または３３２１とともにインキュベートし、氷上で４５分間インキュベートし、その後２５ｎＭのＳＩＲＰα－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加してさらに４５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ヤギ抗ヒトＶＨＨ ＦＩＴＣ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造者の取り扱い説明書に従って添加し、その後４℃で３０分間インキュベートした。データはＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ＨＴシステムを用いて取得した。多重特異性分子１５１１および３３２１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面で、ＣＤ４７とその受容体ＳＩＲＰαの結合を、図３に示すように、ＥＣ５０で競合的に遮断する。

（抗ＣＤ４７ドメインを有する多重特異性分子のヒトＲＢＣ血球凝集アッセイ）

ヒト血液サンプルは、健康なドナーから提供された。全血を３０００ｒｐｍ（１８００ｒｃｆ）で５分間遠心分離し、血清およびバフィーコートを除去した。赤血球を、赤血球のおおよそ２倍量の通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に再懸濁し、チューブを転倒混和した。赤血球を２０００ｒｐｍで２０分間さらに遠心分離し、赤血球を通常の生理食塩水と混合して、６％（ｖ／ｖ）の細胞懸濁液を得た。次に赤血球を９６穴丸底プレートに加え、異なる量の抗体（０～１００μｇ／ｍｌ）と混合した。プレートを３７℃で２時間インキュベートした。Ｈｕ５Ｆ９抗ＣＤ４７対照抗体とは異なり、多重特異性分子１５１１および３３２１は、図４に示すように、ＲＢＣ血球凝集を誘導しなかった。

フローサイトメトリー結合アッセイを行い、抗ＣＤ４７ＶＨＨを含む多重特異性分子１５１１および３３２１が、ＣＤ４７をネイティブに発現する腫瘍細胞表面に選択的に結合できるが、ＲＢＣ細胞表面ＣＤ４７には結合できないことを確認した。氷温のＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）中の１×１０^６細胞／ｍｌのＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ）または１０％の洗浄ヒトＲＢＣ細胞（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）を、５００ｎＭ～０．００１２８ｎＭの濃度範囲の１５１１または３３２１と、氷上で４５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ヤギ抗ヒトＶＨＨ ＦＩＴＣ結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、製造者の取り扱い説明書に従って加え、その後４℃で３０分間インキュベートした。データはＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ＨＴシステムを用いて取得した。多重特異性分子１５１１および３３２１は、図４Ｂに示すように、ＥＣ_５０でＣＤ４７をネイティブに発現する腫瘍細胞表面に選択的に結合したが、ＲＢＣ細胞には結合しなかった。

（抗ＣＤ４７ドメインを有する多重特異性分子の抗腫瘍活性）

１Ｅ６ Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞をＮＳＧマウスに静脈内接種した。マウスは、１０ｍｇ／ｋｇの多重特異性分子３３２１、またはＰＢＳ対照のＩＶ注射で毎日治療された。治療開始（０日目）、実験中盤の３日目、実験終了時（７日目）のＲａｊｉ腫瘍の代表的な生物発光画像。多重特異性分子３３２１は、図５に示すように、ヒト白血病から異種移植されたマウスを保護した。

（実施例２）
（抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ抗体）
（免疫付与したラマからの抗ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＡｂ抗体の単離）

標準的なプロトコールに従い、２匹のラマにＡｂｃｏｒｅ Ｉｎｃで免疫付与した。組換えヒトＰＤ－Ｌ１（細胞外ドメイン１９－２３８、配列番号３０）を完全フロイントアジュバント（０日目）、または不完全フロイントアジュバント（免疫後）と混合した。ラマ１匹あたり５０μｇ／回を隔週で、６回皮下注射した。４５日目に、組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質で免疫されたラマから血清を採取し、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体価をＥＬＩＳＡで測定した。ＥＬＩＳＡでは、９６穴マキシソーププレートを１００ｎｇ／ウェルのＰＤ－Ｌ１でコーティングした。ブロッキングし、希釈した血清サンプルを加えた後、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の存在は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ラマＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて示された。

配列番号３０ ヒトＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメイン（１９－２３８、Ｑ９ＮＺＱ７）
ＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲ

末梢血単核細胞は、製造者の取り扱い説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ＋を用いて、組換えＰＤ－Ｌ１で免疫されたラマの４５日目の血液サンプルから調製された。全ＲＮＡを、製造者の取り扱い説明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔを用いて末梢血単核細胞から抽出し、ＲＴ－ＰＣＲの出発材料として使用して、ＶＨＨをコードする遺伝子断片を増幅した。これらの断片をファージミドベクターに組換えし、ヘルパーファージを感染した後に、遺伝子－ｌｌｌ融合タンパク質としてＶＨＨをファージ粒子表面に表示する組換えファージ粒子を製造できるようにした。ファージは標準的な方法により製造し、フィルター滅菌の後、さらなる使用のために４℃で保存した。

ＰＤ－Ｌ１結合ＶＨＨの選択のために、ビオチン化ＰＤ－Ｌ１をファージライブラリーとインキュベートし、その後ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓに捕捉された。完璧に洗浄後、結合したファージを１ｍｇ／ｍｌのトリプシンで溶出した。選択出力物を大腸菌ＴＧ１細胞内にレスキューした。コロニーを拾い、ＢＡＴＪ，Ｉｎｃでシークエンスした。

ＰＤ－Ｌ１結合ＶＨＨをコードするｃＤＮＡは、Ｃ末端にヒスチジンタグをつけて合成され、ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクションされ、ＩＭＡＣクロマトグラフィーによりポジティブなＶＨＨを精製した。

免疫付与したラマのファージライブラリーのＰＤ－Ｌ１結合ファージコロニーをシークエンスした。各ＶＨＨについてアミノ酸配列を以下（表４）にリスト化した。以下のアミノ酸配列に基づくｃＤＮＡ配列をヒトＦｃと融合し、ｐＪ６０７発現ベクターで合成した。この発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトし、組換え抗ＰＤ－Ｌ１ＨＣＡｂ抗体を製造した。発現した抗ＰＤ－Ｌ１ＨＣＡｂ抗体を、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムにより精製した。２匹のラマのＶＨＨ、ＰＬ１４およびＰＬ１６をＩＧＨＶ３－２３ヒト生殖細胞系列配列に基づきヒト化した。

表４のＶＨＨは、ＰＤ－Ｌ１に結合する手段を構成する。

（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）キネティック結合解析）

実施例１と同様にＯｃｔｅｔ（登録商標）キネティック結合解析を実施した。手短にいうと、精製した抗ＰＤ－Ｌ１ＶＨＨのＨＩＳ１Ｋセンサーチップとの結合能を試験した。２０μｇ／ｍｌの抗ＰＤ－Ｌ１ＶＨＨを用いてチップをロードした。３００秒間のローディングにより、１．８～２ｎｍの捕捉レベルが得られた。結合解析のために、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原を、１×ＰＢＳ中で１００、１５０、２５０、３５０ｎＭの濃度に希釈して調製した。解離をモニターするために、会合を開始し、２００秒間モニターした後、チップをＰＤ－Ｌ１タンパク質を含まない１×ＰＢＳバッファーに移した。

抗ＣＤ４７ＨＣＡｂの結合親和性のＯｃｔｅｔ（登録商標）キネティック解析を表５に示す。解析により、ＰＬ１４、ＰＬ１６、ＰＬ１７はｐＭの結合親和性を示すことが示された。

（抗ＰＤ－Ｌ１ＨＣＡｂのフローサイトメトリー結合解析）

氷温のＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）中の１×１０^６細胞／ｍｌのＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ細胞を、１００ｎＭ～０．００１２８ｎＭの範囲の抗ＰＤ－Ｌ１ＨＣＡｂと共にインキュベートし、４５分間氷上でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ結合抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加え、その後、４℃で３０分間インキュベートした。データはＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ＨＴシステムを用いて取得した。ＰＤ－Ｌ１過剰発現ＣＨＯ細胞のＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１ＨＣＡｂの結合親和性を、図６に示すように、ＥＣ_５０として測定した。

（ＰＤ－Ｌ１結合ドメインを有する多重特異性分子の細胞ベースの機能アッセイ）

ＰＤ－Ｌ１を発現するＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、９６穴プレートに１ウェルあたり１００Ｋで播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。次に、多重特異性分子１５１１および対照抗体であるアテゾリズマブを１００ｎＭから開始して、１：３に段階希釈し、２５μｌ／ウェルで細胞ウェルに添加した。最後に、ＰＤ－１エフェクター細胞（ＰＤ－１およびルシフェラーゼを発現する細胞）を加え、３７℃で６時間インキュベートした。６時間後、７５μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェエラーゼアッセイ試薬を加え、ＶＩＣＴＯＲマルチプレートリーダーを用いて発光を測定した。データ解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで行った。

細胞ベースの機能データは、多重特異性分子１５１１および対照抗体アテゾリズマブが、図７に示すように、ＥＣ５０でＰＤ－Ｌ１活性を完全に遮断したことを示した。

（ＰＤ－Ｌ１結合ドメインを有する多重特異性分子の抗腫瘍活性）

マウス大腸癌ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ；５×１０^５）ホモＢ－ｈＰＤ－Ｌ１マウス（メス、６週齢、ｎ＝６）の皮下に植え付けた。腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に達した時点でマウスをグループ分けし、その時点で、図８Ａに示す用量およびスケジュールで、多重特異性分子１５１８（配列番号１５７、ＣＤ１６Ｆ－Ｌ１－ＨＳＡ－Ｌ１－ＣＤ４７－Ｌ３－ＣＤ４７－Ｌ１－ＰＤＬ１－Ｌ３－ＰＤＬ１）で治療した。治療期間中の体重の変化を図８Ｂに示す。図８Ａに示すように、多重特異性分子１５１８Ａ１は、Ｂ－ｈＰＤ－Ｌ１マウスにおいて腫瘍の成長を制御する効果があった。値は、平均値±ＳＥＭとして表す。

（実施例３）
（抗ＨＳＡ ＨＣＡｂ抗体）
（抗ＨＳＡ抗体の単離）

実施例１と同様に、Ａｂｃｏｒｅ Ｉｎｃで、完全フロイントアジュバント（０日目）、または不完全フロイントアジュバント（免疫後）と混合した組換えヒトＨＳＡ（配列番号３９）でラマに免疫付与した。

ヒト血清アルブミン（配列番号３９）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ

抗ＨＳＡ ＶＨＨの選択のために、ビオチン化ＨＳＡをファージライブラリーとインキュベートし、その後ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に捕捉された。完璧に洗浄後、結合したファージを１ｍｇ／ｍｌのトリプシンで溶出した。選択出力物を大腸菌ＴＧ１細胞内にレスキューした。コロニーを拾い、ＢＡＴＪ，Ｉｎｃ（サンディエゴ、カリフォルニア）でシークエンスした。

ＨＳＡ特異的なＶＨＨをコードするｃＤＮＡは、Ｃ末端にヒスチジンタグをつけて合成され、ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクションされ、ＩＭＡＣクロマトグラフィーによりポジティブなＶＨＨを精製した。

ラマのファージライブラリーのＨＳＡ結合ファージコロニーをシークエンスし、各ＶＨＨについてアミノ酸配列を以下（表６）にリスト化した。以下のアミノ酸配列に基づくｃＤＮＡ配列をｐＪ６０７発現ベクター内で合成した。この発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトし、Ｃ末端にヒスチジンタグを有する組換え単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を製造した。発現したｓｄＡｂを、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰにより精製した。

２つのラマＶＨＨ、ＨＳ５およびＨＳ１０を、ＩＧＨＶ３－２３ヒト生殖細胞系列配列に基づきヒト化した。

ＶＨＨは、ＨＳＡに結合する手段を構成する。

（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）キネティック結合解析）

実施例１と同様にＯｃｔｅｔ（登録商標）キネティック結合解析を実施し、結果を表７および図９に示す。ＨＳ５、ＨＳ６、ＨＳ１２、およびＨＳ２７クローンはＨＳＡへの親和性を示す。種を超えた活性を確認し、表８に示した。

（実施例４）
（抗ＣＤ３３ＨＣＡｂ抗体）
（ＣＤ３３ＶＨＨ抗体の単離）

実施例１と同様に、Ａｂｃｏｒｅ Ｉｎｃで、完全フロイントアジュバント（０日目）、または不完全フロイントアジュバント（免疫後）と混合した組換えヒトＣＤ３３（配列番号４９）でラマに免疫し、ファージライブラリーを調製した。

ヒトＣＤ３３（配列番号４９、Ｐ２０１３８、１８－２５９）
ＤＰＮＦＷＬＱＶＱＥＳＶＴＶＱＥＧＬＣＶＬＶＰＣＴＦＦＨＰＩＰＹＹＤＫＮＳＰＶＨＧＹＷＦＲＥＧＡＩＩＳＲＤＳＰＶＡＴＮＫＬＤＱＥＶＱＥＥＴＱＧＲＦＲＬＬＧＤＰＳＲＮＮＣＳＬＳＩＶＤＡＲＲＲＤＮＧＳＹＦＦＲＭＥＲＧＳＴＫＹＳＹＫＳＰＱＬＳＶＨＶＴＤＬＴＨＲＰＫＩＬＩＰＧＴＬＥＰＧＨＳＫＮＬＴＣＳＶＳＷＡＣＥＱＧＴＰＰＩＦＳＷＬＳＡＡＰＴＳＬＧＰＲＴＴＨＳＳＶＬＩＩＴＰＲＰＱＤＨＧＴＮＬＴＣＱＶＫＦＡＧＡＧＶＴＴＥＲＴＩＱＬＮＶＴＹＶＰＱＮＰＴＴＧＩＦＰＧＤＧＳＧＫＱＥＴＲＡＧＶＶＨ

抗ＣＤ３３ＶＨＨの選択のために、ビオチン化ＣＤ３３をファージライブラリーとインキュベートし、その後ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓに捕捉された。完璧に洗浄後、結合したファージを１ｍｇ／ｍｌのトリプシンで溶出した。選択出力物を大腸菌ＴＧ１細胞内にレスキューした。コロニーを拾い、ＢＡＴＪ，Ｉｎｃでシークエンスした。

ＣＤ３３結合ＶＨＨをコードするｃＤＮＡは、Ｃ末端にヒスチジンタグをつけて合成され、ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクションされ、ＩＭＡＣクロマトグラフィーによりポジティブなＶＨＨを精製した。

免疫付与したラマのファージライブラリーのＣＤ３３結合ファージコロニーをシークエンスし、各ＶＨＨについてアミノ酸配列を以下（表９）にリスト化した。以下のアミノ酸配列に基づくｃＤＮＡ配列をヒトＦｃと融合し、ｐＪ６０７発現ベクターで合成した。この発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトし、組換え抗ＣＤ３３ＨＣＡｂ抗体を製造した。発現した抗ＣＤ３３ＨＣＡｂ抗体を、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムにより精製した。

ラマＶＨＨの１つである３３－１４を、ＩＧＨＶ３－２３ヒト生殖細胞系列に基づきヒト化した。

表９のＶＨＨは、ＣＤ３３に結合する手段を構成する。

実施例１と同様にＯｃｔｅｔ（登録商標）キネティック結合解析を実施し、Ｋ_Ｄの結果を図１０および表１０に示す。

（実施例５）
（抗ＬＡＧ３ＶＨＨ）
（抗ＬＡＧ３ＶＨＨ抗体の単離）

標準的なプロトコールに従い、ラマにＡｂｃｏｒｅ Ｉｎｃで免疫付与した。組換えヒトＬＡＧ３（細胞外ドメイン１９－２３８、配列番号７９）を完全フロイントアジュバント（０日目）、または不完全フロイントアジュバント（免疫後）と混合した。ラマ１匹あたり５０μｇ／回を隔週で、６回皮下注射した。４５日目に、組換えヒトＬＡＧ３タンパク質で免疫されたラマから血清を採取し、ヒトＬＡＧ３に対する抗体価をＥＬＩＳＡで決定した。ＥＬＩＳＡでは、９６穴マキシソーププレートを１００ｎｇ／ウェルのＬＡＧ３でコーティングした。ブロッキングし、希釈した血清サンプルを加えた後、抗ＬＡＧ３１抗体の存在は、ＥＬＩＳＡによって抗血清の抗体価が決定された抗体を用いて示された。９６穴マキシソーププレートを１００ｎｇ／ウェルのｈＬＡＧ３でコーティングした。ブロッキングし、希釈した血清サンプルを加えた後、抗ＬＡＧ３１抗体の存在は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ラマＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて示された。

ヒトＬＡＧ３の細胞外ドメイン（配列番号７９、Ｐ１８６２７、２３－４５０）
ＶＰＶＶＷＡＱＥＧＡＰＡＱＬＰＣＳＰＴＩＰＬＱＤＬＳＬＬＲＲＡＧＶＴＷＱＨＱＰＤＳＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳＷＧＰＲＰＲＲＹＴＶＬＳＶＧＰＧＧＬＲＳＧＲＬＰＬＱＰＲＶＱＬＤＥＲＧＲＱＲＧＤＦＳＬＷＬＲＰＡＲＲＡＤＡＧＥＹＲＡＡＶＨＬＲＤＲＡＬＳＣＲＬＲＬＲＬＧＱＡＳＭＴＡＳＰＰＧＳＬＲＡＳＤＷＶＩＬＮＣＳＦＳＲＰＤＲＰＡＳＶＨＷＦＲＮＲＧＱＧＲＶＰＶＲＥＳＰＨＨＨＬＡＥＳＦＬＦＬＰＱＶＳＰＭＤＳＧＰＷＧＣＩＬＴＹＲＤＧＦＮＶＳＩＭＹＮＬＴＶＬＧＬＥＰＰＴＰＬＴＶＹＡＧＡＧＳＲＶＧＬＰＣＲＬＰＡＧＶＧＴＲＳＦＬＴＡＫＷＴＰＰＧＧＧＰＤＬＬＶＴＧＤＮＧＤＦＴＬＲＬＥＤＶＳＱＡＱＡＧＴＹＴＣＨＩＨＬＱＥＱＱＬＮＡＴＶＴＬＡＩＩＴＶＴＰＫＳＦＧＳＰＧＳＬＧＫＬＬＣＥＶＴＰＶＳＧＱＥＲＦＶＷＳＳＬＤＴＰＳＱＲＳＦＳＧＰＷＬＥＡＱＥＡＱＬＬＳＱＰＷＱＣＱＬＹＱＧＥＲＬＬＧＡＡＶＹＦＴＥＬＳＳＰＧＡＱＲＳＧＲＡＰＧＡＬＰＡＧＨＬ

実施例１～４と同様にファージライブラリーを調製した。ＬＡＧ３結合ＶＨＨをコードするｃＤＮＡは、Ｃ末端にヒスチジンタグをつけて合成され、ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクションされ、ＩＭＡＣクロマトグラフィーによりＬＡＧ３結合ＶＨＨを精製した。

免疫付与したラマのファージライブラリーのＬＡＧ３結合ファージコロニーをシークエンスし、各ＶＨＨについてアミノ酸配列を以下（表１１）にリスト化した。以下のアミノ酸配列に基づくｃＤＮＡ配列をヒトＦｃと融合し、ｐＪ６０７発現ベクターで合成した。この発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトし、組換え抗ＬＡＧ３ＨＣＡｂ抗体を製造した。発現した抗ＬＡＧ３ＨＣＡｂ抗体を、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムにより精製した。

ラマＶＨＨの１つであるＬＧ９を、ＩＧＨＶ３－２３ヒト生殖細胞系列に基づきヒト化した。

表１１のＶＨＨは、ＬＡＧ３に結合する手段を構成する。

実施例１～４と同様に抗ＬＡＧ３ＶＨＨのＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析を実施し、結果を表１２に示す。

（実施例６）
（抗ＣＤ１６ＶＨＨ）
（抗ＣＤ１６ＶＨＨ抗体の単離）

標準的なプロトコールに従い、ラマにＡｂｃｏｒｅ Ｉｎｃで免疫付与した。組換えヒトＣＤ１６Ａ（配列番号９４）を完全フロイントアジュバント（０日目）、または不完全フロイントアジュバント（免疫後）と混合した。ラマ１匹あたり５０μｇ／回を隔週で、６回皮下注射した。４５日目に、免疫されたラマから血清を採取し、抗体価をＥＬＩＳＡで決定した。ＥＬＩＳＡでは、９６穴マキシソーププレートを１００ｎｇ／ウェルの抗原でコーティングした。ブロッキングし、希釈した血清サンプルを加えた後、特異的な抗体の存在は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ラマＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて示された。

ヒトＣＤ１６Ａ（配列番号９４）
ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＦＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＳＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ

ヒトＣＤ１６Ｂ（配列番号９５）
ＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＳＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＮＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＤＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＨＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＳＴＩＳＳＦＳＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩ

実施例１と同様にファージライブラリーを調製した。ＣＤ１６Ａ結合ＶＨＨをコードするｃＤＮＡは、Ｃ末端にヒスチジンタグをつけて合成され、ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクションされ、ＩＭＡＣクロマトグラフィーによりＣＤ１６Ａ結合ＶＨＨを精製した。

免疫付与したラマのファージライブラリーのＣＤ１６Ａ結合ファージコロニーをシークエンスし、各ＶＨＨについてアミノ酸配列を以下（表１３）にリスト化した。以下のアミノ酸配列に基づくｃＤＮＡ配列をヒトＦｃと融合し、ｐＪ６０７発現ベクターで合成した。この発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞株にトランスフェクトし、組換え抗ＣＤ１６ＨＣＡｂ抗体を製造した。発現した抗ＣＤ１６ＨＣＡｂ抗体を、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムにより精製した。

ラマＶＨＨの１つであるＣＤ１６Ｆ１を、ＩＧＨＶ３－２３ヒト生殖細胞系列に基づきヒト化した。

表１３のＶＨＨは、ＣＤ１６に結合する手段を構成する。

実施例１と同様に抗ＣＤ１６ＶＨＨのＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析を実施し、結果を表１４および図１１に示す。

ＣＤ１６－Ｆ１はＣＤ１６Ａに対し選択的である一方、ＣＤ１６－Ｅ１１はＣＤ１６ＡとＣＤ１６Ｂの両方に結合する。

ＣＤ１６Ｆ１とＣＤ１６Ｅ１１は両方とも抗ＣＤ１６ＶＨＨ抗体のアゴニストであり、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ－ＣＤ１６ ＡＤＣＣレポーターアッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）においてＣＤ１６Ａを活性化させた。

多重特異性分子１５１１、３３２１（抗ＣＤ１６Ａ ＶＨＨ ＣＤ１６Ｆ１を含む）、ならびに、対照抗ＣＤ４７抗体、Ｂ６Ｈ１２ ＩｇＧ１およびＢ６Ｈ１２ ＩｇＧ４の機能アッセイを、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ－ＣＤ１６レポーターアッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて行い、結果を図１２に示す。データは、ＣＤ１６Ｆ１が強力なＣＤ１６Ａアゴニストであることを示した。

（実施例７）
（三重特異性一本鎖抗体（ＨＳＡ／ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１またはＨＳＡ／ＬＡＧ３／ＰＤ－Ｌ１））
三重特異性一本鎖抗体を構築するために、抗ＨＳＡ、抗ＣＤ４７、および抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＣＤ３３ ＶＨＨ配列、または抗ＨＳＡ、抗ＬＡＧ３、および抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＣＤ３３ ＶＨＨ配列を、組換えＤＮＡ技術により、６通りの異なる様式でリンカーにより融合させた（図１３）。図１３は、例示的な三重特異性分子、抗ＨＳＡ／ＣＤ４７／ＰＤ－Ｌ１、抗ＨＳＡ／ＣＤ４７／ＣＤ３３、および抗ＨＳＡ／ＬＡＧ３／ＰＤ－Ｌ１、抗ＨＳＡ／ＬＡＧ３７／ＣＤ３３抗体の構造を示す。例示的な切断不可能な、および切断可能なリンカー配列を、表１５に示す。これらは、リンカー手段、またはタンパク質ドメインを連結する手段を構成する。これらの手段は、切断可能または切断不可能としてさらに特徴づけられる。例示的な三重特異性分子のアミノ酸配列を表１６に示す。表１６および１７において、リンカー配列に下線が付されている。

ＨＳＡに結合する抗ＨＳＡドメインは、体内でのＭＶＳＣＡの半減期を延長することができる。また、他のドメインの活性を阻害することもでき、場合によっては全身に分布するＭＶＳＣＡにとって望ましいこともあるが、ＭＶＳＣＡが、作用が意図される部位、たとえば腫瘍にある場合は望ましくない。したがって、好ましくは作用が意図される部位で切断されうる切断可能なリンカーにより、抗ＨＳＡドメインと他の抗原結合ドメインが連結される。このように、ＭＶＳＣＡはプロドラッグとして働くことができる。ＨＳＡ ＶＨＨとＣＤ４７ ＶＨＨまたはＬＡＧ３ ＶＨＨの間に使用されるプロテアーゼで切断可能な配列を含むリンカー、およびＣＤ４７ ＶＨＨとＰＤ－Ｌ１を連結またはＬＡＧ３ ＶＨＨとＰＤ－Ｌ１を連結するために使用される他のリンカーを有するようなＭＶＳＣＡを図１３および表９に示す。図１４Ｂは図１４Ａの抗体のプロテアーゼ消化後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す。

（プロテアーゼ解析）

（１）ＭＭＰ－９活性アッセイ
組換えヒトＭＭＰ－９（ｒｈＭＭＰ－９、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をアッセイバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ－３５、ｐＨ７．５）中で１００μｇ／ｍｌに希釈した。その後、ｒｈＭＭＰ－９は、ＡＰＭＡ（ρ－アミノフェニル水銀酢酸塩、Ｓｉｇｍａ）を終濃度１ｍＭになるように添加し、３７℃で２４時間インキュベートすることにより活性化される。活性化したｒｈＭＭＰ－９を、アッセイバッファー中の等量の２０μＭの抗体で滴定し、室温で１時間インキュベートする。得られた消化基質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析する。

（２）ｕ－プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ、ウロキナーゼ）活性アッセイ
基質をアッセイバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．５）中で２００μＭに希釈し、アッセイバッファー中の等量の組換えヒトｕ－プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｈｕＰＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で滴定した。反応混合物を室温で１～２時間インキュベートし、得られた消化基質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した。

（３）マトリプターゼ活性アッセイ
基質をアッセイバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中で２００μＭに希釈し、アッセイバッファー中の等量の組換えヒトマトリプターゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で滴定した。反応混合物を室温で１～２時間インキュベートし、得られた消化基質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＥＳ－ＰＡＧＥ）。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）の仕様書に従って変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。手短にいうと、７．５μＬのタンパク質サンプル（３μｇタンパク質）を２．５μＬの４×ＬＤＳサンプルローディングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、７０℃で１０分間加熱する。その後、サンプルを、プレキャストのＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ１．０ｍｍミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードする。その後、５μＬのプレ染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥスタンダード（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を各ゲルランにロードする。定電圧（２００Ｖ）を用いて、１×ＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の溶液中で、染料フロントが６０ｍｍゲルの端に到達するまで約４５分間室温で電気泳動を行う。ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色する。

図１５は、１０ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ存在下でのＰＤ－Ｌ１／ｐｒｏ－ＣＤ４７（ＨＳＡ－ＣＤ４７－ＰＤ－Ｌ１抗体）対ＰＤ－Ｌ１／活性型ＣＤ４７（ＨＳＡ結合ドメインが切断された同一の抗体）のリアルタイムでのキネティック結合解析を示す。ＰＤ－Ｌ１／ｐｒｏ－ＣＤ４７は、全く、またはほとんどＣＤ４７と結合しないが、ＰＤ－Ｌ１／活性型ＣＤ４７はＣＤ４７とのロバストな結合を示した。このアッセイにおいて、ＰＤ－Ｌ１結合に違いまたは影響はない。

（実施例８）
（ＣＤ１６Ａ／ＨＳＡ／ＣＤ４７／（ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ３３）を含む多重特異性分子
多重特異性分子を構築するために、抗ＣＤ１６Ａ、抗ＨＳＡ、抗ＣＤ４７、および抗ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ３３ ＶＨＨ配列を、組換えＤＮＡ技術により、８通りの異なる様式でリンカーにより融合させた。図１６は、抗ＣＤ１６Ａ、抗ＨＳＡ、抗ＣＤ４７、および抗ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ３３ ＶＨＨの例示的な多重特異性分子の構造を示す。例示的な多重特異性分子のアミノ酸配列を以下に示す（表１７）。

図１７Ａは、ＶＨＨ２とＶＨＨ３の間のリンカー、Ｇ_４ＳＧ_３Ｓ（Ｌ１、配列番号１００）対（Ｇ_４Ｓ）_３（Ｌ４、配列番号１０３）の長さを、ＨＬ６０細胞でのフローサイトメトリー結合アッセイで比較したものである。ＨＬ６０細胞はＣＤ４７を発現するが、ＰＤ－Ｌ１を発現しないため、１５１８－ＨＳ５（配列番号１７３）および１５１８－ＨＳ５－ＧＳ１５（配列番号１８４）の結合は、ＨＬ６０細胞表面で２つの分子が１つのＣＤ４７に結合していることを示した。（Ｇ_４Ｓ）_３（ＧＳ１５は１５アミノ酸のリンカー）のような長いリンカー対Ｇ_４ＳＧ_３Ｓ（９アミノ酸）はＣＤ４７の結合を改善し、ＥＣ５０は８．４対２６ｎＭであった。

実施例８と同様に多重特異性分子のＯｃｔｅｔ（登録商標）結合解析を実施し、結果を図１７および１８に示す。

（実施例９）
（アルツハイマー病および網膜疾患の治療のための抗ＣＤ３３ドメインを含むＭＶＳＣＡ）

表１８の４つのＭＶＳＣＡの各々は、リンカーＬ３（配列ＡＡＡ；配列番号１０２）により結合された抗ＣＤ３３対を含む。表１８の最初のものは、ｈＨＳ５－Ｌ１－Ｈ３３－１４－Ｌ３－Ｈ３３－１４であり、体内半減期を増加させるためにＮ末端抗ＨＳＡドメインを含む。表１８の２番目のものは、ＦＣ５－Ｌ１－Ｈ３３－１４－Ｌ３－Ｈ３３－１４であり、血液脳関門の通過を促進するためにＮ末端ＦＣ５ナノボディドメインを含む。表１８の３番目のものは、ＦＣ５－Ｌ１－Ｈ３３－１４－Ｌ３－Ｈ３３－１４－Ｌ１－ｈＨＳ５であり、血液脳関門の通過を促進するためにＮ末端ＦＣ５ナノボディドメイン、および体内半減期を増加させるためにＣ末端抗ＨＳＡドメインを含む。これらの構成は、一般的に、全身投与、たとえば静脈内もしくは皮下注射、または注入に適している。表１８の４番目のものは、Ｈ３３－１４－Ｌ３－Ｈ３３１４であり、ＣＤ３３のみに対する特異性を有する二価の一重特異性ＭＶＳＣＡである。このより小さいサイズにより、脳または眼への局所注射により適している。

ＦＣ５ナノボディドメインのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＱＡＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＤＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＫＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号２２２）である。

（実施例１０）
（複数配列のアライメント）
図２１～２６は、本明細書で開示されるＶＨＨ配列の各特異性についてのＣｌｕｓｔａｌ Ｏ（１．２．４）による複数配列のアライメントであり、同一の、保存された、および高度可変位置を容易に確認することが可能である。アライメントの各位置の下には、記号が表示されており、アラインメントされた配列間で、アスタリスクは同一性を、コロンは保存性が高いことを、ピリオドは保存性が低いことを、スペースは保存性がほぼないことをそれぞれ示している。

特に明記しない限り、明細書および特許請求の範囲で使用される成分量、分子量、反応条件などの量を表すすべての数字は、すべての事例において、「約」という用語によって加減されると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は、１０～１５％以内、好ましくは５～１０％以内を意味する。したがって、反対に示されない限り、本明細書および添付する特許請求の範囲に示す数値パラメータは、本発明によって得られようとする所望の特性に応じて変動し得る近似値である。少なくとも、等価物としての適用を特許請求の範囲に限定しようとするものではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め手段を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例で示す数値は、可能な限り正確に報告されている。ただし、いかなる数値にも、それぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生じる誤差が本質的に含まれている。

本発明を説明する文脈で（特に以下の請求項の文脈で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および類似の言及は、別段の記載がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内に含まれるそれぞれの個別の値を個々に言及するための略記法として機能することを意図している。本明細書で別段の記載がない限り、個々の値は、本明細書で個々に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別段の記載がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供されるあらゆる全ての実施例、または例示的な言語（例えば、「のような」）の使用は、本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、別途請求項に記載された発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の記載は、本発明の実施に不可欠な、請求項以外の要素を示すものと解釈されるべきではない。

本明細書に開示した本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループの構成要素は、個別に、またはグループの他の構成要素または本明細書で見られる他の要素との任意の組み合わせで参照され、主張され得る。利便性や特許性の理由から、グループの１以上の構成要素が、グループに含まれるか、またはグループから削除されることが予想される。そのような包含または削除が発生した場合、本明細書は変更されたグループを含むものと見なされ、添付の特許請求の範囲で使用されるマーカッシュグループのすべての記載を満たす。

本明細書では、発明者が知る本発明を実施するための最良の形態を含む、本発明のいくつかの実施形態について説明する。もちろん、これらの説明された実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者に明らかであろう。発明者は、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待し、発明者は、本明細書に具体的に記載した以外の方法で本発明を実施することを意図している。したがって、本発明は、適用される法律によって許可されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題の変更および同等物の一切を含む。さらに、考えうるあらゆる変形をした上述の要素の組み合わせは、本明細書に別段の記載がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。

本明細書に開示された実施形態のいくつかは、「からなる」または「本質的にからなる」という文言の使用により、特許請求の範囲においてさらに限定され得る。請求項中で使用される場合、出願時ものであれ、補正によって追加されたものであれ、「からなる」という移行句は、請求項で指定されていない要素、ステップ、または成分を除外する。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲を、特定の材料またはステップ、および基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響しないものに限定する。そのようにクレームされた本発明の実施形態は、本明細書において本質的または明示的に記載され、可能になる。

さらに、本明細書全体を通じて、多数の特許および印刷刊行物を参照している。上記の各引用文献および印刷刊行物は、その全体が、個別に本明細書に援用される。

最後に、本明細書に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものであることを理解すべきである。採用され得る他の変更は、本発明の範囲内である。したがって、限定ではなく実施例として、本発明の代替構成を本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明は、示され、記載されたとおりに正確に限定されるものではない。

（付記）
（付記１）
（ａ）ＣＤ４７であって、ＶＨＨドメインは配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列を有する、ＣＤ４７、
（ｂ）ＰＤ－Ｌ１であって、ＶＨＨドメインは配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列を有する、ＰＤ－Ｌ１、
（ｃ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であって、ＶＨＨドメインは配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列を有する、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、
（ｄ）ＣＤ３３であって、ＶＨＨドメインは配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列を有する、ＣＤ３３、
（ｅ）ＬＡＧ３であって、ＶＨＨドメインは配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列を有する、ＬＡＧ３、または、
（ｆ）ＣＤ１６であって、ＶＨＨドメインは配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列を有する、ＣＤ１６、
の１つに対する抗原結合特異性を有する、可変重鎖（ＶＨＨ）ドメイン。

（付記２）
付記１に記載のＶＨＨドメインを含む、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）。

（付記３）
第１の結合特異性を有する抗体結合ドメイン、および前記第１の結合特異性とは異なる第２の結合特異性を有する第２の抗体結合ドメインを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の結合特異性は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＳＡ、ＣＤ３３、ＬＡＧ３、またはＣＤ１６に対する特異性を有し、
（ａ）前記ＣＤ４７結合特異性は、配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｂ）前記ＰＤ－Ｌ１結合特異性は、配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｃ）前記ＨＳＡ結合特異性は、配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｄ）前記ＣＤ３３結合特異性は、配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｅ）前記ＬＡＧ３結合特異性は、配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｆ）前記ＣＤ１６結合特異性は、配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列により表される、
多重特異性抗体。

（付記４）
前記第２の抗体結合ドメインは、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＳＡ、ＣＤ３３、ＬＡＧ３、またはＣＤ１６に対する特異性を有し、
（ａ）前記ＣＤ４７結合特異性は、配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｂ）前記ＰＤ－Ｌ１結合特異性は、配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｃ）前記ＨＳＡ結合特異性は、配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｄ）前記ＣＤ３３結合特異性は、配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｅ）前記ＬＡＧ３結合特異性は、配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｆ）前記ＣＤ１６結合特異性は、配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列により表される、
付記３に記載の多重特異性抗体。

（付記５）
１～５つのさらなる抗体結合ドメインをさらに含む多重特異性抗体であって、
前記さらなる抗体結合ドメインの各々は、個別にＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＳＡ、ＣＤ３３、ＬＡＧ３、またはＣＤ１６に対する特異性を有し、
（ａ）前記ＣＤ４７結合特異性は、配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｂ）前記ＰＤ－Ｌ１結合特異性は、配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｃ）前記ＨＳＡ結合特異性は、配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｄ）前記ＣＤ３３結合特異性は、配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｅ）前記ＬＡＧ３結合特異性は、配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｆ）前記ＣＤ１６結合特異性は、配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列により表される、
付記３に記載の多重特異性抗体。

（付記６）
１～４つのさらなる抗体結合ドメインをさらに含む多重特異性抗体であって、
前記さらなる抗体結合ドメインの各々は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＳＡ、ＣＤ３３、ＬＡＧ３、またはＣＤ１６に対する特異性を有し、
（ａ）前記ＣＤ４７結合特異性は、配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｂ）前記ＰＤ－Ｌ１結合特異性は、配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｃ）前記ＨＳＡ結合特異性は、配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｄ）前記ＣＤ３３結合特異性は、配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｅ）前記ＬＡＧ３結合特異性は、配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列により表され、
（ｆ）前記ＣＤ１６結合特異性は、配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列により表される、
付記４に記載の多重特異性抗体。

（付記７）
多重特異性一本鎖抗体（ＭＶＳＣＡ）である、付記３～６のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記８）
リンカーＬ１（配列番号１００）、リンカーＬ２（配列番号１０１）、またはリンカーＬ４（配列番号１０３）が、非同一の抗体結合ドメインの１つ以上のペアの間に挟まれている、付記３～７のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記９）
同一の特異性を有する抗体結合ドメインの少なくとも１つのペアを含む、付記３～８のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記１０）
同一の特異性を有する抗体結合ドメインの前記少なくとも１つのペアは、互いに隣接し、かつそれらの間にリンカーＬ３（配列番号１０２）が挟まれている、付記９に記載の多重特異性抗体。

（付記１１）
ＮまたはＣ末端に位置する、ＨＳＡに対する特異性を有する抗体結合ドメインであって、それに隣接する抗体結合ドメインとの間に切断可能なリンカーが挟まれている、抗体結合ドメイン含む、付記３～１０のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記１２）
前記切断可能なリンカーは、Ｌ１１＊３（配列番号１０４）、Ｌ１１＊４（配列番号１０５）、Ｌ１１＊５（配列番号１０６）、Ｌ１１＊６（配列番号１０７）、Ｌ１１＊７（配列番号１０８）、Ｌ１１＊８（配列番号１０９）、Ｌ１１＊９（配列番号１１０）、Ｌ１１＊１０（配列番号１１１）、Ｌ１１＊１１（配列番号１１２）、Ｌ１１＊１２（配列番号１１３）、Ｌ１１＊１３（配列番号１１４）、Ｌ１１＊１４（配列番号１１５）、Ｌ１１＊１５（配列番号１１６）、Ｌ１１＊１６（配列番号１１７）、Ｌ１１＊１７（配列番号１１８）、またはＬ１１＊１８（配列番号１１９）である、付記１１に記載の多重特異性抗体。

（付記１３）
すべての前記抗体結合ドメインがＶＨＨドメインである、付記３～１２のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記１４）
ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、付記３～１３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記１５）
ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、付記３～１３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記１６）
ＨＳＡ、ＬＡＧ３、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、付記３～１３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記１７）
ＨＳＡ、ＬＡＧ３、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、付記３～１３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記１８）
ＣＤ１６、ＨＳＡ、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、付記３～１３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記１９）
ＣＤ１６、ＨＳＡ、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、付記３～１３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記２０）
ＣＤ１６、ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、付記３～１３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記２１）
ＣＤ１６、ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、付記３～１３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

（付記２２）
ＣＤ３３に対する特異性を有する抗体結合ドメインのペアを含む、多重特異性抗体。

（付記２３）
ＨＳＡ、ＦＣ５ナノボディ（配列番号２２２）、または両方に対する特異性を有する抗体結合ドメインをさらに含む、付記２２に記載の多重特異性抗体。

（付記２４）
付記１に記載のＶＨＨドメイン、付記２に記載のＨＣＡｂ、または付記３～２１のいずれか１つに記載の多重特異性抗体を含む、医薬組成物。

（付記２５）
付記２４に記載の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。

（付記２６）
付記２２または２３に記載の多重特異性抗体を含む、医薬組成物。

（付記２７）
付記２４に記載の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、アルツハイマー病または網膜疾患を治療する方法。

（付記２８）
前記網膜疾患は、乾燥型加齢黄斑変性である、付記２７に記載の方法。

Claims (28)

1. （ａ）ＣＤ４７であって、ＶＨＨドメインは配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列を有する、ＣＤ４７、
   （ｂ）ＰＤ－Ｌ１であって、ＶＨＨドメインは配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列を有する、ＰＤ－Ｌ１、
   （ｃ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であって、ＶＨＨドメインは配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列を有する、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、
   （ｄ）ＣＤ３３であって、ＶＨＨドメインは配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列を有する、ＣＤ３３、
   （ｅ）ＬＡＧ３であって、ＶＨＨドメインは配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列を有する、ＬＡＧ３、または、
   （ｆ）ＣＤ１６であって、ＶＨＨドメインは配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列を有する、ＣＤ１６、
   の１つに対する抗原結合特異性を有する、可変重鎖（ＶＨＨ）ドメイン。
2. 請求項１に記載のＶＨＨドメインを含む、重鎖のみの抗体（ＨＣＡｂ）。
3. 第１の結合特異性を有する抗体結合ドメイン、および前記第１の結合特異性とは異なる第２の結合特異性を有する第２の抗体結合ドメインを含む多重特異性抗体であって、
   前記第１の結合特異性は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＳＡ、ＣＤ３３、ＬＡＧ３、またはＣＤ１６に対する特異性を有し、
   （ａ）前記ＣＤ４７結合特異性は、配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｂ）前記ＰＤ－Ｌ１結合特異性は、配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｃ）前記ＨＳＡ結合特異性は、配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｄ）前記ＣＤ３３結合特異性は、配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｅ）前記ＬＡＧ３結合特異性は、配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｆ）前記ＣＤ１６結合特異性は、配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列により表される、
   多重特異性抗体。
4. 前記第２の抗体結合ドメインは、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＳＡ、ＣＤ３３、ＬＡＧ３、またはＣＤ１６に対する特異性を有し、
   （ａ）前記ＣＤ４７結合特異性は、配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｂ）前記ＰＤ－Ｌ１結合特異性は、配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｃ）前記ＨＳＡ結合特異性は、配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｄ）前記ＣＤ３３結合特異性は、配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｅ）前記ＬＡＧ３結合特異性は、配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｆ）前記ＣＤ１６結合特異性は、配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列により表される、
   請求項３に記載の多重特異性抗体。
5. １～５つのさらなる抗体結合ドメインをさらに含む多重特異性抗体であって、
   前記さらなる抗体結合ドメインの各々は、個別にＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＳＡ、ＣＤ３３、ＬＡＧ３、またはＣＤ１６に対する特異性を有し、
   （ａ）前記ＣＤ４７結合特異性は、配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｂ）前記ＰＤ－Ｌ１結合特異性は、配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｃ）前記ＨＳＡ結合特異性は、配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｄ）前記ＣＤ３３結合特異性は、配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｅ）前記ＬＡＧ３結合特異性は、配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｆ）前記ＣＤ１６結合特異性は、配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列により表される、
   請求項３に記載の多重特異性抗体。
6. １～４つのさらなる抗体結合ドメインをさらに含む多重特異性抗体であって、
   前記さらなる抗体結合ドメインの各々は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＳＡ、ＣＤ３３、ＬＡＧ３、またはＣＤ１６に対する特異性を有し、
   （ａ）前記ＣＤ４７結合特異性は、配列番号２～２９または２２３の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｂ）前記ＰＤ－Ｌ１結合特異性は、配列番号３１～３８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｃ）前記ＨＳＡ結合特異性は、配列番号４０～４８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｄ）前記ＣＤ３３結合特異性は、配列番号５０～７８の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｅ）前記ＬＡＧ３結合特異性は、配列番号８０～９３の１つのアミノ酸配列により表され、
   （ｆ）前記ＣＤ１６結合特異性は、配列番号９６～９９の１つのアミノ酸配列により表される、
   請求項４に記載の多重特異性抗体。
7. 多重特異性一本鎖抗体（ＭＶＳＣＡ）である、請求項３～６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
8. リンカーＬ１（配列番号１００）、リンカーＬ２（配列番号１０１）、またはリンカーＬ４（配列番号１０３）が、非同一の抗体結合ドメインの１つ以上のペアの間に挟まれている、請求項３～７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
9. 同一の特異性を有する抗体結合ドメインの少なくとも１つのペアを含む、請求項３～８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
10. 同一の特異性を有する抗体結合ドメインの前記少なくとも１つのペアは、互いに隣接し、かつそれらの間にリンカーＬ３（配列番号１０２）が挟まれている、請求項９に記載の多重特異性抗体。
11. ＮまたはＣ末端に位置する、ＨＳＡに対する特異性を有する抗体結合ドメインであって、それに隣接する抗体結合ドメインとの間に切断可能なリンカーが挟まれている、抗体結合ドメイン含む、請求項３～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
12. 前記切断可能なリンカーは、Ｌ１１＊３（配列番号１０４）、Ｌ１１＊４（配列番号１０５）、Ｌ１１＊５（配列番号１０６）、Ｌ１１＊６（配列番号１０７）、Ｌ１１＊７（配列番号１０８）、Ｌ１１＊８（配列番号１０９）、Ｌ１１＊９（配列番号１１０）、Ｌ１１＊１０（配列番号１１１）、Ｌ１１＊１１（配列番号１１２）、Ｌ１１＊１２（配列番号１１３）、Ｌ１１＊１３（配列番号１１４）、Ｌ１１＊１４（配列番号１１５）、Ｌ１１＊１５（配列番号１１６）、Ｌ１１＊１６（配列番号１１７）、Ｌ１１＊１７（配列番号１１８）、またはＬ１１＊１８（配列番号１１９）である、請求項１１に記載の多重特異性抗体。
13. すべての前記抗体結合ドメインがＶＨＨドメインである、請求項３～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
14. ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、請求項３～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
15. ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、請求項３～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
16. ＨＳＡ、ＬＡＧ３、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、請求項３～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
17. ＨＳＡ、ＬＡＧ３、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、請求項３～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
18. ＣＤ１６、ＨＳＡ、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、請求項３～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
19. ＣＤ１６、ＨＳＡ、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、請求項３～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
20. ＣＤ１６、ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＰＤ－Ｌ１を認識する抗体結合ドメインを含む、請求項３～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
21. ＣＤ１６、ＨＳＡ、ＣＤ４７、およびＣＤ３３を認識する抗体結合ドメインを含む、請求項３～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
22. ＣＤ３３に対する特異性を有する抗体結合ドメインのペアを含む、多重特異性抗体。
23. ＨＳＡ、ＦＣ５ナノボディ（配列番号２２２）、または両方に対する特異性を有する抗体結合ドメインをさらに含む、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
24. 請求項１に記載のＶＨＨドメイン、請求項２に記載のＨＣＡｂ、または請求項３～２１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を含む、医薬組成物。
25. 請求項２４に記載の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
26. 請求項２２または２３に記載の多重特異性抗体を含む、医薬組成物。
27. 請求項２４に記載の医薬組成物を、治療を必要とする患者に投与することを含む、アルツハイマー病または網膜疾患を治療する方法。
28. 前記網膜疾患は、乾燥型加齢黄斑変性である、請求項２７に記載の方法。

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