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CN116323671A - 具有增加的选择性的多靶向性双特异性抗原结合分子 - Google Patents

具有增加的选择性的多靶向性双特异性抗原结合分子 Download PDF

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CN116323671A CN202180075171.9A CN202180075171A CN116323671A CN 116323671 A CN116323671 A CN 116323671A CN 202180075171 A CN202180075171 A CN 202180075171A CN 116323671 A CN116323671 A CN 116323671A
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Abstract

本发明提供了多靶向性双特异性抗原结合分子，其特征在于包含第一和第二双特异性实体，每个实体包含与靶标结合的结构域、与人和猕猴CD3ε链的细胞外表位结合的第二结构域，其中两个双特异性实体通过间隔物彼此连接，该间隔物将第一和第二双特异性实体间隔开。此外，本发明提供了编码该多靶向性双特异性抗原结合分子的多核苷酸、包含这种多核苷酸的载体、表达构建体的宿主细胞、以及包含其的药物组合物。

Description

具有增加的选择性的多靶向性双特异性抗原结合分子
技术领域
本发明涉及生物技术的产品和方法，特别涉及多靶向性抗原结合分子、其制备及其用途。
背景技术
通过独立于T细胞受体特异性的双特异性分子重定向针对肿瘤细胞的T细胞活性是免疫肿瘤学中逐渐发展的方法(Frankel SR,Baeuerle PA.Targeting T cells totumor cells using bispecific antibodies[使用双特异性抗体将T细胞靶向肿瘤细胞].Curr Opin Chem Biol[化学生物学新见]2013；17:385-92)。这种新的基于蛋白质的药物通常可以同时结合两种不同类型的抗原。它们以几种结构形式为人所知，目前已经探索了癌症免疫疗法和药物递送的应用(Fan,Gaowei；Wang,Zujian；Hao,Mingju；Li,Jinming(2015).“Bispecific antibodies and their applications[双特异性抗体及其应用]”.Journal of Hematology&Oncology[血液学与肿瘤学杂志].8:130)。
可用于免疫肿瘤学的双特异性分子可以是抗原结合多肽如抗体，例如IgG样抗体，即全长双特异性抗体，或不是全长抗原结合分子的非IgG样双特异性抗体。全长双特异性抗体典型地保留具有两个Fab臂和一个Fc区的传统单克隆抗体(mAb)结构，不同的是两个Fab位点结合不同抗原。非全长双特异性抗体可以缺乏整个Fc区。这些包括化学连接的Fab、仅由Fab区组成、以及各种类型的二价和三价单链可变片段(scFv)。还存在模拟两种抗体的可变结构域的融合蛋白。这种形式的一个示例是双特异性T细胞接合器
Figure BDA0004213953400000011
(Yang,Fa；Wen,Weihong；Qin,Weijun(2016).“Bispecific Antibodies as a Development Platformfor New Concepts and Treatment Strategies[双特异性抗体作为新概念和治疗策略的开发平台]”.International Journal of Molecular Sciences[国际分子科学杂志].18(1):48)。
示例性双特异性抗体衍生分子如
Figure BDA0004213953400000021
分子是由两个柔性连接的抗体衍生的结合结构域制备的重组蛋白质构建体。
Figure BDA0004213953400000022
抗原结合分子的一个结合结构域对靶细胞上选择的肿瘤相关表面抗原是特异性的；第二结合结构域对CD3(T细胞上的T细胞受体复合物的亚基)具有特异性。通过其特定设计，
Figure BDA0004213953400000023
抗原结合分子独特地适合于将T细胞与靶细胞瞬时连接，并且同时强有力地激活T细胞对靶细胞的固有溶细胞潜力。以AMG 103和AMG 110开发进入临床的第一代
Figure BDA0004213953400000024
抗原结合分子(参见WO 99/54440和WO 2005/040220)的重要进一步开发是提供在CD3ε链的N末端结合背景独立表位(context independentepitope)的双特异性抗原结合分子(WO 2008/119567)。与该选择的表位结合的
Figure BDA0004213953400000025
抗原结合分子不仅显示出对人和猕猴，或绒毛猴(Callithrix jacchus)、绒顶柽柳猴(Saguinusoedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε链的跨物种特异性，而且由于识别该特异性表位(而不是先前描述的双特异性T细胞接合分子中CD3结合物的表位)而未展示出与对于前一代T细胞接合抗体所观察到的程度相同的T细胞的非特异性激活。T细胞激活的这种减少与患者中较少或减少的T细胞再分布相关，后者被鉴定为副作用的风险，例如，在帕索妥昔单抗(pasotuximab)中。
如WO 2008/119567中所述的基于抗体的分子的特征在于从体内快速清除；因此，虽然它们能够快速到达身体的大部分部位，但它们的体内应用可能受到其在体内的持久性短的限制。另一方面，它们在体内的浓度可以在短时间内进行调整和微调。因为这种小的单链分子的体内半衰期短，所以使用通过连续静脉内输注的长期施用来实现治疗作用。然而，可获得具有更有利的药代动力学特性(包括如WO 2017/134140中所述的更长的半衰期)的双特异性抗原结合分子。增加的半衰期典型地在免疫球蛋白、相对于特别是小尺寸的抗体片段或构建体的体内应用中是有用的，例如为求患者顺应性。
基于抗体的免疫肿瘤学的一个挑战性持续问题是肿瘤逃逸。当免疫系统(即使在通过一些基于抗体的免疫疗法触发或指导的情况下)没有足够的能力根除肿瘤时，发生此类肿瘤逃逸，这些肿瘤携带累积的遗传改变和表观遗传改变，并且使用几种机制赢得免疫编辑过程(Keshavarz-Fathi,Mahsa；Rezaei,Nima(2019)“Vaccines for CancerImmunotherapy[用于癌症免疫疗法的疫苗]”)。通常，已知四种干扰有效抗肿瘤免疫应答的机制：(1)缺陷型肿瘤抗原加工和呈递，(2)激活机制的缺乏，(3)抑制机制和免疫抑制状态，以及(4)抗性肿瘤细胞。尤其是对于第一种机制，肿瘤抗原由于遗传不稳定性、肿瘤突变和从免疫系统逃逸，可能以新形式存在。表位阴性肿瘤细胞保持隐藏并且因此对免疫排斥有抗性。它们是在消除表位阳性肿瘤细胞后开发的，类似于达尔文的自然选择理论。因此，当此类肿瘤细胞由于肿瘤逃逸而不再表达各自的抗原时，针对肿瘤细胞上抗原的基于抗体的免疫疗法变得无效。所述抗原丢失在本文中理解为肿瘤逃逸的驱动力，并且因此可以互换使用。因此，需要提供改善的基于抗体的免疫肿瘤学，其解决了抗原丢失的问题以有效预防肿瘤逃逸。
相对于T细胞接合双特异性分子，广泛应用免疫肿瘤学的可能更紧迫的挑战是合适靶标的可利用性(Bacac等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]；22(13)2016年7月1日)。例如，实体瘤靶标可在肿瘤细胞上过表达，但是在关键组织中的非恶性初生细胞中以较低但显著的水平表达。在自然中，根据Bacac等人，T细胞可以通过相对低亲和力的T细胞受体(TCR)区分高抗原表达细胞和低抗原表达细胞，这些受体仍然可以实现与表达足够高水平的靶抗原的靶细胞高亲合力的结合。因此，非常需要可有利于以上、并且因此将杀死高靶标表达细胞和低靶标表达细胞之间的窗口最大化的T细胞接合双特异性分子。本领域中讨论的一种方法是使用两种抗原的双靶向，这可以使仅表达一种靶抗原或表达低水平的两种靶抗原的正常组织的靶标选择性得到改善。此作用被认为依赖于bsAb与同一细胞上的两个抗原同时结合所介导的亲合力组分。因此相对于双靶向本身，一些多特异性单克隆抗体(mAb)或其他免疫构建体在本领域是已知的。WO 2014/116846教导了多特异性结合蛋白，该多特异性结合蛋白包含与靶细胞抗原特异性地结合的第一结合位点、与免疫细胞上的细胞表面受体特异性地结合的第二结合位点、和与免疫细胞上的细胞表面调节物特异性地结合的第三结合位点。US 2017/0022274披露了包含双特异性抗体的三价T细胞重定向复合物，其中该双特异性抗体具有两个针对肿瘤相关抗原(TAA)的结合位点和一个针对T细胞的结合位点。
然而，如上所述的分子中仅仅双靶向可能不足以实现有效的靶标选择性(Mazor等人,mAbs[单克隆抗体]7:3,461-469；2015年5月/6月)。特别是bsAb结合结构域的配置，即单价相比于二价，是一个关键因素。更重要的是，仅仅提供具有几个价态的双特异性分子可能不会导致临床上合适的治疗方法，还必须考虑在显著免疫学副作用(例如细胞因子释放综合征(CRS))方面的潜在风险谱。因此，尽管到目前为止，基于抗体的免疫疗法在临床前和临床上取得了成功，但仍存在明显的局限性，包括个体与癌症类型之间的差异性反应。剂量限制性毒性可能是基于抗体的免疫疗法功效的限制因素，因此并非所有患者都在可用的安全剂量下对治疗产生应答。因此，还需要减少基于抗体的免疫疗法的剂量限制性毒性以使得此类疗法可用于更多的患有多样化增殖性疾病的患者。
虽然本领域已知不同的多特异性抗体或抗体片段，其中一些寻址T细胞，但在此之前尚未提出以下多靶向性双特异性分子，其通过增加治疗窗口来解决克服T细胞重定向免疫疗法中剂量限制性毒性的需要并且是稳定且随时可用的治疗系统。
发明内容
鉴于上述各种未满足的需求，本发明的目的是提供包含至少一条多肽链的分子，该分子优选是抗原结合分子。本发明的分子进一步优选是双特异性的，例如T细胞接合分子。此外，本发明的分子优选地是多靶向性的，例如它通常能够免疫特异性结合靶细胞上的至少两种抗原，这些抗原通常与一种或多种疾病有关。进一步优选的是，本发明的分子通常能够同时免疫特异性地结合效应细胞上的两种抗原，优选用于治疗所述一种或多种疾病。因此，本发明提供包含至少一个多肽的优选多靶向性双特异性抗原结合分子，其中该分子的特征在于包含至少五个不同的结构实体，即，(i.)结合靶细胞表面抗原(例如第一肿瘤相关抗原，TAA)的第一结构域，(ii.)结合人(和优选非人灵长类，例如猕猴)CD3ε链的细胞外表位的第二结构域，其中第一结合结构域和第二结合结构域一起形成第一双特异性实体，(iii.)将第一双特异性实体与第二双特异性实体连接但也充分隔开的间隔物，该第二双特异性实体包含(iv.)结合相同或优选不同靶细胞表面抗原(例如第二TAA)的第三结构域，和(v.)结合人(和优选非人灵长类，例如猕猴)CD3ε链的细胞外表位的第四结构域。优选地，这些结构域分别按氨基到羧基方向由VH和VL结构域构成，其中柔性但短的肽接头将第一结构域的VL连接到第二结构域的VH以及将第三结构域的VL连接到第四结构域的VH。出人意料地是，本文所述的多靶向性双特异性抗原结合分子通常能够使T细胞在仅表达一种或表达两种通常与特定疾病相关的靶标的细胞的杀伤之间进行区分，从而打开治疗窗口并降低脱靶毒性和副作用的风险。此外，本发明提供了编码多靶向性双特异性抗原结合分子的多核苷酸、包含这种多核苷酸的载体、和表达构建体的宿主细胞、以及包含该抗原结合分子的药物组合物。
在第一方面，在本发明的上下文中设想提供包含至少一条多肽链的分子，其中该分子包含
(i.)第一结合结构域，其优选包含互补位(paratope)，该互补位特异性结合第一靶细胞表面抗原(例如TAA1)，
(ii.)第二结合结构域，其优选包含互补位，该互补位特异性结合人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位，
(iii.)第三结合结构域，其优选包含互补位，该互补位特异性结合第二靶细胞表面抗原(例如TAA2)，和
(iv.)第四结合结构域，其优选包含互补位，该互补位特异性结合人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位，
其中该第一结合结构域和该第二结合结构域形成第一双特异性实体，该第三结合结构域和该第四结合结构域形成第二双特异性实体，并且
其中该分子包含具有至少约5kDa的分子量和/或具有超过50个氨基酸的长度的间隔物实体，其中该间隔物实体将该第一双特异性实体和该第二双特异性实体间隔开至少约
Figure BDA0004213953400000051
的距离，其中指示的距离被理解为该第一双特异性实体和该第二双特异性实体的质心之间的距离，并且该间隔物实体位于该第一双特异性实体和该第二双特异性实体之间。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供分子，该分子是抗原结合分子，优选双特异性抗原结合分子，更优选多靶向性双特异性抗原结合分子。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中结构域排列以氨基到羧基顺序选自由以下组成的组：
(i.)第一和第二结构域、间隔物、第三和第四结构域
(ii.)第一和第二结构域、间隔物、第四和第三结构域
(iii.)第二和第一结构域、间隔物、第三和第四结构域，以及
(iv.)第二和第一结构域、间隔物、第四和第三结构域。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中所述间隔物实体具有至少10kDa，更优选至少15kDa、20kDa或甚至50kDa的分子量，和/或其中所述间隔物实体包含含有超过50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少250个氨基酸，甚至更优选至少500个氨基酸的氨基酸序列。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中所述间隔物实体是刚性分子，其优选折叠成二级结构，优选螺旋结构，和/或三级结构，优选蛋白质结构域结构，最优选球状蛋白质和/或其部分和/或球状蛋白质和/或其部分的组合。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中间隔物实体是球状蛋白质，其中位于N末端的第一个氨基酸的Cα原子和位于C末端的最后一个氨基酸的Cα原子之间的距离间隔至少
Figure BDA0004213953400000061
优选至少
Figure BDA0004213953400000062
更优选至少
Figure BDA0004213953400000063
以便将该第一双特异性实体和该第二双特异性实体有效地间隔开优选至少
Figure BDA0004213953400000064
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中将该第一双特异性实体和该第二双特异性实体有效间隔开的所述间隔物实体选自由以下组成的组：泛素、β2微球蛋白、SAND结构域、绿色荧光蛋白(GFP)、VHH抗体lama结构域、来自Met受体的PSI结构域、来自生腱蛋白的纤连蛋白III型结构域、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4、CD137L胞外域、白介素-2、来自人程序性细胞死亡1配体1(PDL1)的PD-1结合结构域、Tim-3(AS 24-130)、MiniSOG、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)结构域、人血清白蛋白(HSA)或任何前述间隔物实体的衍生物、刚性接头的多聚体、和Fc结构域或其二聚体或三聚体，每个Fc结构域包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2和CH3结构域铰链以及另外的CH2和CH3结构域，其中所述两个多肽单体通过肽接头彼此融合，或其中这两个多肽单体通过非共价CH3-CDH3相互作用和/或共价二硫键连接在一起形成异二聚体。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中所述间隔物实体是至少一个Fc结构域，优选一个结构域或两个或三个共价连接的结构域，其或其中的每个以氨基到羧基的顺序包含：
铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中该间隔物实体中的所述多肽单体中的每一个具有与选自下组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:17-24，其中优选地所述多肽单体中的每一个具有选自SEQID NO:17-24的氨基酸序列。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中间隔物中的CH2结构域包含结构域内半胱氨酸二硫桥。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中该分子是单多肽链。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中该间隔物实体包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:13和15至16和25至34泛素(SEQ ID NO:1081)、β2微球蛋白(SEQ ID NO:1083)、SAND结构域(SEQ ID NO:1084)、绿色荧光蛋白(GFP)(SEQ ID NO:1085)、VHH抗体lama结构域(SEQ ID NO:1086)、来自Met受体的PSI结构域(SEQ ID NO:1087)、来自生腱蛋白的纤连蛋白III型结构域(SEQ ID NO:1088)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(SEQ ID NO:1089)、白介素-4(SEQ ID NO:1090)、CD137L胞外域(SEQ ID NO:1091)、白介素-2(SEQ ID NO:1092)、来自人程序性细胞死亡1配体1(PDL1)的PD-1结合结构域(SEQ ID NO:1093)、Tim-3(AS 24-130)(SEQ ID NO:1094)、MiniSOG(SEQ ID NO:1095)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)结构域(SEQ ID NO:16)、人血清白蛋白(has，SEQ ID NO:15)或其具有至少90％，优选95％或甚至98％序列同一性的氨基酸，优选scFc(SEQ ID NO:25)。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中该分子包含两条多肽链。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供包含两条多肽链的抗原结合分子，其中
(i.)第一多肽链包含第一结构域、第二结构域和优选包含铰链、CH2和CH3结构域的第一多肽单体，以及
(ii.)其中第二多肽链包含第三结构域、第四结构域和优选包含铰链、CH2和CH3结构域的第二多肽单体，
其中这两个多肽单体形成分别使这两个肽单体的CH2和CH3结构域配对的异二聚体，其中该第一肽单体的CH2结构域在该第一双特异性实体的C末端位置连接至所述实体的第一或第二结构域，并且其中该第二肽单体的CH3结构域在该第二双特异性实体的N末端位置连接至所述实体的第三或第四结构域，即，该第二多肽链的N末端在该第二多肽单体的CH2结构域处，并且C末端在该第三或第四结构域处，
其中优选地，该第一和第二多肽单体形成异二聚体，从而连接该第一和第二多肽链。
在所述方面内，还设想第一肽链的第一肽单体是SEQ ID NO 35并且第二肽链的第二肽单体是SEQ ID NO 36，其中这两个肽单体优选地形成异二聚体。
在所述方面内，还设想抗原结合分子的特征在于：
(i)该第一结构域和该第三结构域包含两个抗体衍生的可变结构域，并且该第二结构域和该第四结构域包含两个抗体衍生的可变结构域；
(ii)该第一结构域和该第三结构域包含一个抗体衍生的可变结构域，并且该第二结构域和该第四结构域包含两个抗体衍生的可变结构域；
(iii)该第一结构域和该第三结构域包含两个抗体衍生的可变结构域，并且该第二结构域和该第四结构域包含一个抗体衍生的可变结构域；或者
(iv)该第一结构域包含一个抗体衍生的可变结构域，并且该第三结构域包含一个抗体衍生的可变结构域。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供包含两条多肽链的抗原结合分子，其中
该第一多肽链包含该第一结构域的VH，VH第二结构域，优选包含铰链、CH2和CH3结构域的第一多肽单体，该第三结构域的VH和该第四结构域的VH；并且
该第二多肽链包含该第一结构域的VL，VL第二结构域，优选包含铰链、CH2和CH3结构域的第一多肽单体，该第三结构域的VL和该第四结构域的VL，
其中优选地，该第一和第二多肽单体形成异二聚体，从而连接该第一和第二多肽链。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一、第二、第三和第四结合结构域各自以氨基到羧基的顺序包含VH结构域和VL结构域，其中每个结构域内的VH和VL通过肽接头连接，优选以下柔性接头，该柔性接头包含丝氨酸、谷氨酰胺和/或甘氨酸作为氨基酸结构单元，优选仅丝氨酸(Ser，S)或谷氨酰胺(Gln，Q)和甘氨酸(Gly，G)，更优选(G4S)n或(G4Q)n，甚至更优选SEQ ID NO:1或3。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供肽接头，其中该肽接头包含S(G4X)n和(G4X)n或由其组成，其中X选自由Q、T、N、C、G、A、V、I、L和M组成的组，其中n是选自整数1至20的整数，优选其中n是1、2、3、4、5或6，优选其中X是Q，其中优选该肽接头是(G4X)n，n是3，并且X是Q。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一结合结构域和第二结合结构域以及第三结合结构域和第四结合结构域之间的肽接头优选是柔性接头，其包含丝氨酸、谷氨酰胺和/或甘氨酸或谷氨酸、丙氨酸和赖氨酸作为氨基酸结构单元，优选选自由SEQ ID NO:1至4、6至12和1125组成的组。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一结合结构域或第二结合结构域与间隔物之间的肽接头，和/或第三结合结构域和第四结合结构域与间隔物之间的肽接头分别优选是富含小氨基酸和/或亲水性氨基酸，优选甘氨酸的短接头并且优选是SEQ ID NO:5。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供一抗原结合分子，其中第一靶细胞表面抗原和第二靶细胞表面抗原中的任一个选自由以下组成的组：CS1、BCMA、CDH3、FLT3、CD123、CD20、CD22、EpCAM、MSLN和CLL1。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一靶细胞表面抗原和第二靶细胞表面抗原不同。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一靶细胞表面抗原和第二靶细胞表面抗原相同。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一结合结构域能够结合第一靶细胞表面抗原并且同时第三结合结构域能够结合第二靶细胞表面抗原，优选其中第一靶细胞表面抗原和第二靶细胞表面抗原在同一靶细胞上。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中该第一靶细胞表面抗原和该第二靶细胞表面抗原分别选自由以下组成的组：CS1和BCMA、BCMA和CS1、FLT3和CD123、CD123和FLT3、CD20和CD22、CD22和CD20、EpCAM和MSLN、MSLN和EpCAM、MSLN和CDH3、CDH3和MSLN、FLT3和CLL1、以及CLL1和FLT3。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中该第一靶细胞表面抗原和/或该第二靶细胞表面抗原是人MSLN(选自SEQ ID NO:1181、1182和1183)，并且其中本发明的抗原结合分子的第一和/或第三结合结构域如本文所述通过鼠嵌合序列分析确定结合人MSLN表位簇E1(SEQ ID NO:1175，根据Kabat的aa296-346位置)，但优选不结合人MSLN表位簇E2(SEQ ID NO:1176，根据Kabat的aa 247-384位置)、E3(SEQ ID NO:1177，根据Kabat的aa 385-453位置)、E4(SEQ ID NO:1178，根据Kabat的aa 454-501位置)和/或E5(SEQ ID NO:1179，根据Kabat的aa 502-545位置)。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中该第一靶细胞表面抗原和/或该第二靶细胞表面抗原是人CDH3(SEQ ID NO:1170)，并且其中根据权利要求1所述的抗原结合分子的第一和/或第三结合结构域结合人CDH3表位簇D2B(SEQ ID NO:1171，根据Kabat的aa 253-290位置)、D2C(SEQ ID NO:1172，根据Kabat的aa 291-327位置)、D3A(SEQ ID NO:1173，根据Kabat的aa 328-363位置)和D4B(SEQ ID NO:1174，根据Kabat的aa 476-511位置)，优选D4B(SEQ ID NO:1174，根据Kabat的aa 476-511位置)，如本文所述通过鼠嵌合序列分析确定。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第二和第四结合结构域(CD3结合结构域)均具有(i.)特征在于低于由表面等离子体共振(SPR)测量的约1.2x10-8M的KD值的亲和力，或(ii.)特征在于由SPR测量的约1.2x10-8M的KD值的亲和力。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第二和第四结合结构域(CD3结合结构域)具有特征在于通过SPR测量的约1.0x10-7至5.0x10-6M，优选地约1.0至3.0x10-6M，更优选地由SPR测量的约2.5x10-6M的KD值的亲和力。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第二和第四结合结构域(CD3结合结构域)具有特征在于通过SPR测量的约1.0x10-7至5.0x10-6M，优选地约1.0至3.0x10-6M，更优选地由SPR测量的约2.5x10-6M的KD值的亲和力。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第二和第四结合结构域(CD3结合结构域)各自单独具有比一个包含根据SEQ ID NO 43的VH和根据SEQID NO 44的VL的CD3结合结构域低至少约10倍，优选至少约50倍或更优选至少约100倍的活性(即在单靶向环境中，相比于双靶向环境)。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第二和第四结构域是结合CD3ε链的效应物结合结构域，这些效应物结合结构域包含连接至VL的VH区或由其组成区域，其中
i)该VH区包含：
X1YAX2N的CDR-H1序列，其中X1是K、V、S、G、R、T或I；且X2是M或I；
RIRSKYNNYATYYADX1VKX2的CDR-H2序列，其中X1是S或Q；且X2是D、G、K、S或E；以及
HX1NFGNSYX2SX3X4AY的CDR-H3序列，其中X1是G、R或A；X2是I、L、V或T；X3是Y、W或F；并且X4是W、F或Y；以及
ii)其中该VL区包含：
X1SSTGAVTX2X3X4YX5N的CDR-L1序列，其中X1是G、R或A；X2是S或T；X3是G或S；X4是N或Y；并且X5是P或A；
X1TX2X3X4X5X6的CDR-L2序列；其中X1是G或A；X2是K、D或N；X3是F、M或K；X4是L或R；X5是A、P或V；并且X6是P或S；以及
X1LWYSNX2WV的CDR-L3序列，其中X1是V、A或T；并且X2是R或L；并且
iii)其中i)的VH区和/或ii)的VL区的CDR序列中的一个或多个包含选自以下的一个氨基酸取代或其组合：CDR-H1中的X24V和X24F；
CDR-H2中的D15和X116A；
CDR-H3中的H1、X12E、F4和N6；和
CDR-L3中的X11L和W3。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第二和第四结合结构域包含VH区和VL区，该VH区包含选自SEQ ID NO 37至39、45至47、53至55、61至63、69至71、436至438、1126至1128、1136至1138、1142至1144和1148至1150的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，该VL区包含选自SEQ ID NO 40至42、48至50、56至58、64至66、72至74、439至441、1129至1131、1139至1141、1145至1147、和1151至1153的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，优选61至63和64至66。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第二和第四结合结构域包含选自SEQ ID NO 43、51、59、67、75、442和1132，优选67的VH区。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第二和第四结合结构域包含选自SEQ ID NO 44、52、60、68、76、443和1133，优选68的VL区。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第二和第四结合结构域包含选自SEQ ID NO 43、51、59、67、75、442和1132，优选67的VH区和选自SEQ IDNO 44、52、60、68、76、443和1133，优选68的VL区，其中当VH区是1132并且VL区是1133时，作为scFab结构域的第二和/或第四结合结构域另外包含SEQ ID NO:1134的CH1结构域和SEQID NO:1135的CLK结构域，并且其中VH和VL区通过优选选自SEQ ID NO 1、3和1125的接头彼此连接。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一和/或第三(靶)结合结构域结合CDH3并包含VH区，该VH区包含SEQ ID NO:1154作为CDR-H1，其中X1(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)是S或N，X2是Y或S、X3是P或W，X4是I或M且X5是Y、N或H；SEQ ID NO:1155作为CDR-H2，其中X1是K、V、N或R；X2是A、D、R、Y、S、W或H；X3是Y、S、P、G或T；X4是S、G或K；X5是A、V、D、K、G或T；X6是A、V、D、K、S、G或H；X7是Y、G或E；X8是K、I或N；X9是A、S或N；X10是S、Q或G；X11是S或K；X12是F或V；并且X13是K或Q；以及SEQ ID NO:1156作为CDR-H3，其中X1是F或Q；X2是R、K、S或W；X3是G或D；X4是Y、P或R；X5是R、S、G、N或T；X6是Y、A或H；X7是F、L或M；X8是A或V；X9是Y或V；并且其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域结合CDH3并包含VL区，该VL区包含SEQ ID NO:1158作为CDR-L1，其中X1是K或R，X2是A或S；X3是Q、D、S、G或E；X4是S、D或N；X5是V、L或I；X6是K、Y、S或H；X7是S或N；X8是F、L或M；并且X9是A、N或H；SEQ ID NO:1159作为CDR-L2，其中X1是Y、G、W、N；X2是T或A；X3是S或K；X4是T、N或R；X5是L或R；X6是E、A、V或H；并且X7是S或E；和SEQ ID NO:1160作为CDR-L3，其中X1是Q或V；X2是Q、N或H；X3是F、L、Y、W、N或H；X4是A、D、Y、S或N；X5是Q、R、S、G、W或M；X6是T、Y或F；并且X7是F、Y或L。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一和/或第三(靶)结合结构域结合MSLN并包含VH区，该VH区包含SEQ ID NO:1162作为CDR-H1，其中X1(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)是S、G或D；X2是Y、A、G或F；X3是I、W或M；并且X4是V、S、G、T或H；SEQ ID NO:1163作为CDR-H2，其中X1是A、S、N、W、Y或V；X2是Y、S或N；X3是Y、G、P或S；X4是D、H、S或N；X5是G或S；X6是E、G或S；X7是G、S、N、F、T或Q；X8是S、W、K、D、I或T；X9是Y或N；X10是A或N；X11是A、P、N、D、E、I或Q；X12是D、A、S或K；X13是V、L或F；X14是K或Q；并且X15是G或S；和SEQ ID NO:1164作为CDR-H3，其中X1是D、E或V；X2是R、G或E；X3是Y、A或N；X4是S、Y、V或H；X5是A、P、F、Y或H；X6是R或S；X7是E或G；X8是Y或L；X9是R、Y或L；X10是Y或G；X11是D或Y；X12是R、Y或F；X13是M、S、F、D或Y；X14是A、G、S或T；X15是L、M或F；并且X16是Y、I或V；并且其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域结合MSLN并包含VL区，该VL区包含SEQ ID NO:1166作为CDR-L1，其中X1是A或S；X2是G或S；X3是E或Q；X4是G、S或K；X5是I、L、V或F；X6是R、G或S；X7是D、S、N或T；X8是A、S、K或T；X9是Y或W；X10是V或L；并且X11是Y或A；SEQ ID NO 1167作为CDR-L2，其中X1是A、G或Q；X2是A或S；X3是S或T；X4是G、S、K、I或T；X5是R或L；X6是A、P或Q；并且X7是S或T；和SEQ ID NO 1168作为CDR-L3，其中X1是A或Q；X2是Y、S、A或T；X3是G、E、Y、H或Q；X4是A或S；X5是S、T或F；X6是-、P或T；X7是R、A、L或F；并且X8是V或T。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一和/或第三(靶)结合结构域结合CDH3并包含SEQ ID NO:1157的VH区，其中(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)X1是Q或E；X2是V、L；X3是Q、E；X4是A或G；X5是G或E；X6是V或L；X7是K或V，X8是K或Q，X9是A或G，X10是V或L，X11是K或R，X12是V或L，X13是A或K，X14是Y或F，X15是T或S，X16是T或S，X17是S或N，X18是Y或S，X19是P或W，X20是I或M，X21是Y、N或H，X22是T或A，X23是Q或K，X24是V或M，X25是S或G，X26是K、V、N或R，X27是A、D、R、Y、S、W或H，X28是Y、S、P、Gr或T，X29是S、K、或G，X30是A、V、D、K、或、T，X31是A、-、D、K、S、G、或H，X32是Y、G、或E，X33是K、I、或N，X34是A、S、或N，X35是S、Q、或G，X36是S或K，X37是F或V，X38是Q或K，X39是F或V，X40是I或M，X41是T或S，X42是V、I或R，X43是T、K或N，X44是T、A、S或K，X45是S或N，X46是A、V或L，X47是L或M，X48是Q或E，X49是L或M，X50是S或N，X51是S或R，X52是T或R，X53是A或S，X54是G、D、或E，X55是T或S，X56是T、K、或R，X57是S、Q、W、或R，X58是-、D、或G，X59是Y、P、或R，X60是F、S、G、N或T，X61是Y、A、或H，X62是A、-、或V，X63是F或M，X64是Y或V；X65是T、L或M；和SEQ ID NO 1161的VL区，其中X1是D或E；X2Q或V；X3是L、M；X4是A、S或D；X5是F、S或T；X6是A、S；X7是A、V；X8是P、V、L；X9是D、E；X10是A、V；X11是I、L；X12是T、S、N；X13是K、R；X14是A、S；X15是Q、D、S、G或E；X16是S、D、N；X17是V、I或L；X18是-、K、Y、S或H；X19是S、N；X20是F、L、M；X21是A、N、H；X22是K、Q；X23是A、P、V；X24是K、R；X25是I、V；X26是Y、G、W、N；X27是T、A；X28是S、K；X29是T、N、R；X30是L、R；X31是E、A、V、H；X32是S、E；X33是A、S、V、D；X34是D、E；X35是T、K；X36是S、R；X37是A、S、P；X38是F、V；X39是A、G；X40是T、V；X41是Q、V；X42是Q、N、H；X43是F、L、Y、W、N、H；X44是A、D、Y、S、N；X45是Q、R、S、G、W、M；X46是F、Y、T；X47是F、Y、L；X48是V、L；并且X49是D或E(其中每个位置的所有aa都意味着在替代性“或”中，即使没有明确说明)。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一和/或第三(靶)结合结构域结合MSLN并包含SEQ ID NO:1165的VH区，其中(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)X1是是E、Q；X2是V、L、Q，X3是E、Q；X4是A、G、P；X5是E、G；X6是V、L；X7是V、K；X8是K、Q；X9是G、S；X10是E、A、G、R；X11是S、T；X12是V、L；X13是R、S、K；X14是V、L；X15是S、T；X16是A、K、T；X17是A、V；X18是Y、I、F；X19是S、T；X20是S、F；X21是S、T；X22是D、G、S；X23是Y、G、A、F；X24是I、W、M；X25是G、S、V、T、H；X26是I、V；X27是A、P；X28是M、K、Q；X29是G、C；X30是I、M、V、L；X31是A、G、S；X32是A、S、N、W、Y、V；X33是Y、S、N；X34是Y、G、P、S；X35是D、H、S、N；X36是G、S；X37是E、G、S；X38是G、S、N、F、T、Q；X39是S、K、W、D、I、-、T；X40是Y、N；X41是A、N；X42是A、P、N、E、D、I、Q；X43是D、A、S、K；X44是V、L、F；X45是K、Q；X46是G、S；X47是V、F；X48是I、M；X49是S、T；X50是R、V；X51是N、T；X52是A、S；X53是I、K；X54是S、N；X55是S、T、Q；X56是A、L、F；X57是Y、S、F；X58是L、M；X59是E、K、Q；X60是M、L；X61是S、N；X62是R、S；X63是V、L；X64是R、T；X65是A、S；X66是D、A、E；X67是R、K；X68是D、E、V、L；X69是E、R、G、P；X70是R、A、N、Y；X71是G、S、Y、V、H；X72是A、P、F、D、Y；X73是R、G；X74是M、R、S、D；X75是E、G；X76是Y、L；X77是Y、F；X78是Y、S、F；X79是A、G、S、T、H；X80是L、M、F；X81是Y、I、V；并且X82是L、M、T；以及SEQ ID NO 1169的VL区(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)X1是E、S、D；X2是Y、I、L；X3是E、-、V、T；X4是V、L、M；X5是P、S；X6是G、S；X7是S、T；X8是V、L；X9是A、V、L；X10是P、V；X11是E、Q、D；X12是R、T；X13是A、V；X14是S、T；X15是I、L；X16是S、T；X17是A、S；X18是G、S；X19是E、Q；X20是G、S、K；X21是I、V、L、F；X22是R、G、S；X23是D、S、-；X24是A、S、N、K、T；X25是Y、WM；X26是V、L；X27是Y、A；X28是K、Q；X29是A、S、V；X30是R、V、K；X31是V、L；X32是A、G、Q；X33是A、S；X34是S、T；X35是G、S、K、I、T；X36是R、L；X37是A、P、Q；X38是S、T；X39是I、V；X40是E、S、D；X41是G、N；X42是N、T；X43是D、T；X44是A、F；X45是R、G、S；X46是L、T；X47是E、Q；X48是A、P；X49是E、M；X50是E、F；X51是D、V、T；X52是A、Q；X53是Y、S、A、T；X54是G、E、Y、H、Q；X55是A、S；X56是S、T、F；X57是P、T；X58是R、A、L、F；X59是V、T；X60是P、C；X61是V、L；X62是E、T；X63是I、V；并且X64是L、K(其中每个位置的所有aa都意味着在替代性“或”中，即使没有明确说明)。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一和/或第三(靶)结合结构域包含VH区，该VH区包含选自SEQ ID NO:77至79、86至88、95至97、103至105、111至113、119至121、127至129、135至137、143至145、151至153、159至161、168至170、177至179、185至187、194至196、203至205、212至214、221至223、230至232、238至240、334至336、356至358、365至367、376至378、385至387、和194、432和196的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或如序列表格表50中一起披露的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的任何组合，优选86至88和194、432和196。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一和/或第三(靶)结合结构域包含VL区，该VL区包含选自SEQ ID NO:80至82、89至91、98至100、106至108、114至116、122至124、130至132、138至140、146至148、154至156、162至164、171至173、180至182、188至190、197至199、206至208、215至217、224至226、233至235、241至243、337至339、359至361、368至370、379至381、388至390，优选89至91和197至199的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一和/或第三(靶)结合结构域包含分别针对第一和第三结合结构域选自SEQ ID NO:83、92、101、109、117、125、133、141、149、157、165、174、183、191、200、209、218、227、236、244、340、362、371、382、391和433，优选433和92的VH区。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一和/或第三(靶)结合结构域包含分别针对第一和第三结合结构域选自SEQ ID NO:84、93、102、110、118、126、134、142、150、158、166、175、184、192、201、210、219、228、237、245、341、363、372、383、392，优选200和93的VL区。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其中第一和/或第三(靶)结合结构域包含选自SEQ ID NO:85、94、193、202、211、220、229、364、384、393，优选94和202的通过单一氨基酸交换(E至I)而稳定性增加的VL区。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想提供抗原结合分子，其具有选自由SEQID NO:246至323或330至332、351至355、373至375、394至410和434，优选434组成的组的氨基酸序列。
在第二方面，在本发明的上下文中进一步设想提供一种多核苷酸，该多核苷酸编码本发明的抗原结合分子，优选地选自SEQ ID NO:1070至1072和1074。
在第三方面，在本发明的上下文中还设想提供一种载体，该载体包含本发明的多核苷酸。
在第四方面，在本发明的上下文中进一步设想提供一种宿主细胞，该宿主细胞用本发明的多核苷酸或载体转化或转染。
在第五方面，在本发明的上下文中还设想提供一种用于生产本发明的抗原结合分子的方法，所述方法包括在允许表达该抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞并且从培养物中回收所产生的抗原结合分子。
在第六方面，在本发明的上下文中进一步设想提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的抗原结合分子或根据本发明的方法产生的抗原结合分子。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想该药物组合物在约-20℃下稳定至少四周。
在本发明的上下文中进一步设想提供本发明的抗原结合分子或根据本发明的方法产生的抗原结合分子，用于在预防、治疗或缓解以下疾病中使用，该疾病选自增殖性疾病、肿瘤性疾病、癌症或免疫学障碍。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想疾病优选是急性骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌和结直肠癌(CRC)]。在第七方面，在本发明的上下文中进一步设想提供用于治疗或缓解增殖性疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用包含至少一条多肽链的分子，其中该分子包含
(i.)第一结合结构域，其优选包含与第一靶细胞表面抗原(例如TAA1)特异性结合的互补位，
(ii.)第二结合结构域，其优选包含与人(优选猕猴)CD3ε链的细胞外表位特异性结合的互补位，
(iii.)第三结合结构域，其优选包含与第二靶细胞表面抗原(例如TAA2)特异性结合的互补位，和
(iv.)第四结合结构域，其优选包含与人(优选猕猴)CD3ε链的细胞外表位特异性结合的互补位，
其中该第一结合结构域和该第二结合结构域形成第一双特异性实体，该第三结合结构域和该第四结合结构域形成第二双特异性实体，并且
其中该分子包含具有至少约大于约5kDa的分子量和/或具有超过50个氨基酸的长度的间隔物实体，其中该间隔物实体将该第一双特异性实体和该第二双特异性实体间隔开至少约
Figure BDA0004213953400000181
(该第一双特异性实体和该第二双特异性实体的质心之间的距离)，并且该间隔物实体位于该第一双特异性实体和该第二双特异性实体之间。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想了提供通过提供本文所述形式的多靶向性双特异性抗原结合分子来寻址病理生理组织和一个或多个生理组织上显著共表达的疾病相关靶标的方法，其中该分子寻址(i.)在疾病相关组织和生理组织上均表达的靶标和(ii.)与疾病相关但不在(i.)下的生理组织上表达的另一靶标，其中该方法优选地避免在这样的靶标是MSLN的情况下形成腹内粘连和/或纤维化。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想疾病优选是肿瘤性疾病、癌症或免疫学障碍，包括向有需要的受试者施用本发明的或根据本发明的方法产生的抗原结合分子的步骤，其中疾病优选是急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌和/或结直肠癌。
在所述方面内，在本发明的上下文中还设想TAA1和TAA2优选地选自EpCAM和MSLN、MSLN和EpCAM、MSLN和CDH3、CDH3和MSLN、FLT3和CLL1以及CLL1和FLT3。
在第八方面，在本发明的上下文中还设想提供一种试剂盒，该试剂盒包含本发明的抗原结合分子或根据本发明的方法产生的抗原结合分子、本发明的多核苷酸、本发明的载体、和/或本发明的宿主细胞。
在第九方面，在本发明的上下文中还设想提供包含至少一条多肽链的分子，其中该分子从N末端到C末端包含：
(i.)第一结合结构域，其特异性结合第一靶细胞表面抗原(例如TAA1)，
(ii.)第二结合结构域，其特异性结合第二靶细胞表面抗原(例如TAA2)，
(iii.)间隔物实体，
(iv.)第三结合结构域，其特异性结合人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位，和
(v.)第四结合结构域，其特异性结合人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位，
其中间隔物实体将第二和第三结合结构域隔开超过约
Figure BDA0004213953400000191
附图说明
图1：本发明披露的多靶向性双特异性抗原结合分子的概述。每个分子中的结构域排列如下：A：靶结合结构域x CD3结合结构域x间隔物x靶结合结构域x CD3结合结构域；B：靶结合结构域x CD3结合结构域x间隔物x CD3结合结构域x靶结合结构域；C：靶结合结构域x靶结合结构域x间隔物x CD3结合结构域x CD3结合结构域；D：靶结合结构域x靶结合结构域x CD3结合结构域x CD3结合结构域x间隔物；E:靶结合结构域x靶结合结构域x CD3结合结构域x间隔物xCD3结合结构域；F：靶结合结构域x间隔物x靶结合结构域x CD3结合结构域xCD3结合结构域
图2：图2显示双靶向性CLL1-FLT3双特异性抗原结合分子和单靶向性对照双特异性抗原结合分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHO huCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线和EC50值。效应细胞是未刺激的泛T细胞。b.c.t：低于计算阈值
图3：图3A至H显示EpCAM MSLN T细胞接合器分子和单靶向性对照T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图4：图4A显示EpCAM MSLN T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。图4B显示了EpCAM MSLN T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。图4C显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHOhuCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图5：图5显示了EpCAM MSLN T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图6：图6A显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHO huCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。图6B显示了EpCAM MSLN T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。图6C显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHOhuCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图7：图7显示CLL1-FLT3(图7A)和CDH3-MSLN分别相比于CDH3和MSLN单靶向性(图7G)T细胞接合器分子在48小时后对双阳性CHO huCLL1 huFLT3和GSU Luc CDH3 MSLN靶细胞的细胞毒性曲线，以及24小时后的释放的细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、TNFα和IFNγ(分别是图7B-F和H-L。效应细胞是未刺激的PBMC。
图8：图8显示了MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1对双阳性细胞系HCT 116(WT)和CDH3与MSLN分别敲除(KO)细胞系的细胞毒性曲线和EC50值。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图9：图9显示了MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1分别对双阳性细胞系SW48(WT)和CDH3与MSLN敲除(KO)细胞系的细胞毒性曲线和EC50值。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图10：图10显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHO huCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图11：图11显示了MSLN-CDH3 T细胞接合器分子和单靶向性T细胞接合器分子对原初双阳性GSU细胞相比于靶标敲除的GSU细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图12：图12显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHO huCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线和EC50值。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图13：图13显示了EpCAM-MSLN T细胞接合器分子对双阳性Ovcar8野生型细胞和单阳性Ovcar8 MSLN KO或Ovcar8 EpCAM KO靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图14：图14显示了MSLN-CDH3 T细胞接合细胞毒性测定，效应细胞：人未刺激的T细胞，靶细胞为(A分子1，B分子2)GSU wt、GSU KO CDH3、GSU KO MSLN和(C分子1，D分子2)HCT116wt、HCT 116KO CDH3、HCT 116KO MSLN。
图15：图15显示了来自MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1和2的阳离子交换色谱的UV280迹线的叠加(x和y归一化)。
图16：图16显示了异种移植小鼠模型中具有SEQ ID NO 251的CDH3xMSLN多靶向性双特异性抗原结合分子产生的体内剂量依赖性肿瘤生长抑制。
图17：图17(A-L)显示了具有间隔物G4S、scFc、scFc-scFc、(G4S)10、(EAAAK)10、has、PD1、泛素、SAND、β2微球蛋白和HSP70-1的示例性双特异性抗原结合分子的两个双特异性实体的质心之间随时间(200或400ns)的建模平均距离和最大距离。图17M显示了β2微球蛋白和HSP70-1建模的可视化。图17N和O显示了示例性双特异性抗原结合分子的两个双特异性实体(具有scFc作为间隔物并且分别具有靶结合物MSLN-FOLR1和MSLN-CDH19)的质心之间随时间(200ns)的建模平均距离和最大距离。
图18：图18显示了以根据本发明的形式具有两种高亲和力CD结合物的CD20xCD22多靶向性抗原结合分子的活性增加。
图19：图19显示了示例细胞毒性测定，其中人T细胞与人胃癌细胞系GSU Luc以E:T比率10:1孵育72小时。所得EC50值在相似范围内(分别地，对于MSLN单靶向性分子1(SEQ IDNO:1183)为2.078pM，相比之下对于CDH3-MSLN多靶向性分子2(SEQ ID NO:251)为1.060pM，见图A)。
图20：图20显示了组织病理学载玻片，其被扫描以生成.svs格式的完整载玻片图像(WSI)。使用Aperio eSlide Manager(莱卡生物系统公司(Leica Biosystems),版本12.3.3.5049,
Figure BDA0004213953400000221
2006-2017)查看WSI。使用Snipping Tool(Microsoft Office)从Aperio查看器中抓取单个静止图像并保存为jpg格式。图20A和B显示了用1.5μg/kg单靶向性MSLN双特异性抗原结合分子(SEQ ID NO:1183，分子1)，放大倍数4.4X(A)或用1000g/kg多靶向性CDH3-MSLN双特异性抗原结合分子(SEQ ID NO:251，分子2)，放大倍数8.4X(B)治疗的食蟹猴的肝。(B，C)：用1.5μg/kg分子1，放大倍数4.4X(C)或用1000μg/kg分子2，放大倍数8.4X(D)处理动物的肺。
图21：单链相比于双链MSLN-CDH3 T细胞接合器分子和相应的单靶向性T细胞接合器分子分别对原初双阳性GSU细胞相比于靶标敲除的GSU细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图22：MSLN-CDH3 T细胞接合器分子和单靶向性T细胞接合器分子对原初双阳性GSU细胞相比于靶标敲除的GSU细胞的细胞毒性曲线，其中CD3结合物不同，即I2C、I2M2和I2M而不是I2L。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
图23：图23(A-H)显示了MSLN-CDH3 T细胞接合细胞毒性测定，使用了效应细胞：人经刺激的T细胞和靶细胞：HCT 116wt、HCT 116KO CDH3、HCT 116KO MSLN，其中将CDH3表位簇D4B的选择性差距(selectivity gap)与CDH3表位簇D1B、D2C和D3A进行比较。
图24：图24(A-E)显示了MSLN-CDH3 T细胞接合细胞毒性测定，使用了效应细胞：人经刺激的T细胞和靶细胞：CHO hu CDH3(+)&MSLN(+)、CHO hu CDH3(+)、CHO hu MSLN(+)，其中将MSLN表位簇E1的选择性差距与MSLN表位簇E2/E3进行比较。
图25：人CDH3，以下序列：具有EpCAM的跨膜和细胞质结构域的小鼠CDH3。CDH3蛋白的序列比对显示了每个人序列部分(D1、D2、D3、D4、D5和各自的子部分A、B和C)，其被相应的小鼠序列替代并且两个物种之间的氨基酸不同。
图26：CDH3抗体和在表达全长人CDH3或小鼠CDH3xEpC蛋白或人/小鼠嵌合CDH3xEpC蛋白构建体的经转染CHO细胞上的T细胞接合器K3T的流式细胞术结合分析
图27：MSLN蛋白的序列比对显示了每个人序列表位部分(E1、E2、E3、E4、E5和E6)，其被相应小鼠序列替代并且其中两个物种之间的氨基酸不同。
图28：T细胞接合器K3T和F5Q在表达全长人MSLN蛋白或全长小鼠MSLN蛋白或人/小鼠嵌合MSLN蛋白构建体的经转染CHO细胞上的流式细胞术结合分析
具体实施方式
在本发明的上下文中，提供了包含至少五个不同结构实体的多靶向性双特异性分子，即(i.)结合靶细胞表面抗原(例如第一肿瘤相关抗原，TAA)的第一结构域，(ii.)结合人(优选非人，例如猕猴)CD3ε链的细胞外表位的第二结构域，其中第一结合结构域和第二结合结构域一起形成第一双特异性实体，(iii.)将第一双特异性实体与第二双特异性实体连接但隔开的间隔物，该第二双特异性实体包含(iv.)结合相同或优选不同靶细胞表面抗原(例如第二TAA)的第三结构域，和(v.)结合人，优选非人(例如猕猴)CD3ε链的细胞外表位的第四结构域。本发明形式的分子典型地表现出以来自在靶细胞上共表达的两个靶的亲合力驱动的效力和特异性为特征的优点，这典型地促使不期望的细胞因子释放(和相关的临床相关副作用，例如CRS)减少，同时确保有效的抗肿瘤活性，优选地在实体瘤例如结直肠癌、非小细胞肺癌和胰腺癌中也是这样。
在本发明的上下文中，出人意料的发现是根据本发明的双特异性(T细胞接合)多靶向性分子由于它们的导致有效的相互补充型靶细胞杀伤的特定形式而在靶细胞结合物和效应细胞结合物侧提供双重亲合力效应。这种作用是由以下促进的：特异性靶向一个靶细胞(例如癌细胞)上的两种(不同)抗原的分子形式，并且相比之下，通过显著较少靶向非靶细胞同时介导针对所述靶细胞的有效T细胞应答。由于能够同时寻址两个靶抗原，当选择两个通常与疾病相关的靶细胞有关的TAA时，靶向与疾病相关的靶细胞而不是生理细胞的可能性大大增加。因此，相对于现有的呈T细胞接合的双特异性抗体或抗体衍生的构建体，根据本发明的T细胞接合多靶向性分子(典型地是单链的)提供改善的功效和安全性两者。所述有利特性优选通过以下事实实现，即本发明的多靶向性双特异性分子包含两个双特异性实体，每个实体包含靶标结合结构域和效应物(CD3)结合结构域，它们可以在病理生理环境中起作用而不(例如在空间上)彼此阻碍同时又相互补充。本发明的一个多靶向性双特异性分子内的两个双特异性实体的所述彼此作用是指第一双特异性实体的靶结合结构域(例如第一结构域)和效应物CD3结合结构域(例如第二结构域)可以与其各自的结合配偶体相互作用以在靶细胞和T细胞之间形成溶细胞突触，而不干扰第二双特异性实体的靶结合结构域(例如第三结构域)和效应物结构域(例如第四结构域)的相互作用或不与它们相互作用。然而，为了提供所期望的作用并因此提供治疗功能，优选地，第一和第二双特异性实体的两个靶结合结构域必须接合它们各自的靶标，以便使第一和第二双特异性实体的效应物CD3结合结构域完全参与。此外，出人意料的发现是，两个双特异性实体各个必须通过以特定方式在分子形式上的结构分隔来保留功能，以便受益于实现本文所述的非凡功效和暗示的安全性所需的双重亲合力效应。
作为本文描述的增加的特异性和因此的安全性的另外或替代的次要效应，一旦靶细胞(如癌细胞)经历了抗原损失并且因此很容易从有效的抗肿瘤治疗中逃逸，多靶向性抗原结合分子靶向这样的靶细胞的可能性与单靶向性分子相比大大增加，因为一种有效的针对靶标的抗原保留在经历了抗原逃逸的细胞上。与仅包含一个CD3结合物和/或靶结合物并且不包含两个连接但间隔开的双特异性实体的分子相比，在活性增加方面的所述效果优选在两种CD3结合物(CD3结合结构域，其包含分别由SEQ ID NO 1或3的接头连接的例如SEQID NO 67和68的VH和VL)都具有高亲和力时实现。
鉴于现有技术的教导，基于本发明的上述发现是出人意料的。例如，分别包含多于一个靶结合结构域和效应子结合结构域的抗原结合形式是本领域已知的，例如AdaptirTM形式。然而，这种形式不提供两个单独与各自的靶标和效应子相互作用并同时协同工作的双特异性实体，因此不能在靶标结合物和效应结合物侧达到双重亲合力以有效地为多靶向性分子的优势提供大的选择性差距的效果。根据本发明，两个双特异性实体必须彼此间隔一定距离，优选至少
Figure BDA0004213953400000251
更优选至少60、70、80、90或至少
Figure BDA0004213953400000256
两个双特异性实体之间的指示距离
Figure BDA0004213953400000252
在本发明的上下文中通常分别理解为两个双特异性实体的质心之间的距离。一般而言，空间质量分布(本文是指双特异性实体，其包含与靶细胞表面抗原结合的结合结构域和与人(优选猕猴)CD3ε链的细胞外表位结合的结合结构域，两个结合结构域都优选为scFv形式或可替代地scFab形式并通过肽接头连接)的质心(COM)被理解为分布质量的加权相对位置总和为零的唯一点。距离通常使用普遍接受的建模程序(MD/可视化软件)由分子建模确定，该程序可以鉴定给定输入结构的COM并且是例如PyMOL(PyMOL分子图形系统，版本2.3.3，薛定谔公司(
Figure BDA0004213953400000253
LLC.))，其通常基于来自MD模拟的快照结构的集合。每个原子的质量通常是本领域公知的潜在“力场”的一部分。可替代地和/或另外地，距离可以通过晶体学、低温电子显微镜或核磁共振分析技术来确定。
本发明给出的通过分子建模获得距离的典型方法如下：
1)获得完整的双特异性抗原结合分子的原子结构。结构源可以选自由以下组成的组：
a.分辨率优选低于
Figure BDA0004213953400000254
的蛋白质X射线晶体学，能够看到氨基酸骨架和侧链；
b.分辨率优选低于
Figure BDA0004213953400000255
的低温电子显微镜(cyo-EM)，能够看到氨基酸骨架和侧链；
c.基于单一、高度同源的晶体和/或cro-EM结构的整个分子的计算机模拟同源建模(优选高于60％的序列同一性)；
d.涉及连接2个或更多实验结构的计算机模拟同源建模。结构优选与完整双特异性抗原结合分子中发现的结构域相同或高度同源(优选高于60％的序列同一性)。在缺乏实验接头构象的情况下，优选在明确溶剂分子动力学(MD)模拟中改进模型(模拟长度优选至少100ns，除非更快获得能量收敛)。模拟是使用最先进的软件(例如Schrodinger、Amber、Gromacs、NAMD或等效软件)进行的，其中参数对应于室温和压力。在模拟过程中不施加人为力量(即优选排除诸如准动力学或导向分子动力学之类的方法)。类似地，优选地不对分子施加人工几何限制。
2)鉴定相关分子结构域的质心(COM)。这通常使用所使用的MD软件或可视化工具(如PyMOL或VMD)执行。质心可以定义为最接近真实COM的伪原子或非氢原子。结构域间接头通常不被视为结构域的一部分。
3)使用相同的软件，报告两个COM之间的距离(以
Figure BDA0004213953400000261
为单位，
Figure BDA0004213953400000262
)。如果使用MD模拟来改进同源模型(如1d中所述)，则会报告多个模拟快照的中值距离。为了进一步减少初始模型的潜在不准确度，在计算COM之间的中值距离时和在提取用于可视化MD模拟的快照时，至少要省略模拟的前10％，如果信号显著变化，则优选高达50％。
如果没有另外说明，本发明上下文中的距离
Figure BDA0004213953400000263
是由MD模拟确定的中值距离。
如本文披露的第一和第二双特异性实体之间的优选距离通过两个双特异性实体之间的间隔物实体(简称间隔物)促进，其将两个双特异性实体隔开并使它们保持在分开的位置。间隔物具有一定大小，优选至少大于5kDa，更优选至少约10、15、20、25、30、35、40、45或甚至至少50kDa，从而防止两个分离的双特异性实体的不希望的相互作用。间隔物的分子大小的优选范围是约15至200kDa，优选约15至150kDa，以促进根据本发明的两个双特异性实体的分离并保持分子的高总体活性。通常，过大的间隔物，例如大于约200kDa，可能会影响两个双特异性实体与同一靶细胞上的两个靶表面结构结合的能力，这反过来可能会降低分子对靶细胞的整体活性。因此，就间隔物的分子量而言，典型的最大优选大小为约200kDa，优选约150或120kDa，甚至更优选约100kDa。最大优选大小的典型间隔物是约105.7kDa的如本文披露的双scFc结构域(两个scFc彼此连接形成一个更大的单链间隔物)。通常充分分隔这两个双特异性实体的间隔物的示例大小是约5.3kDa的Met受体的PSI结构域、约8.6kDa的泛素、约10.1kDa的来自生腱蛋白的纤连蛋白III型结构域、约11kDa的SAND结构域、约11.9kDa的β2微球蛋白、约12.2kDa的Tim-3(aa 24-130)、约13.3kDa的MiniSOG、约12.1kDa的SpyCatcher与约1.7kDa的SpyTag缔合优选通过异肽键形成连接在一起以形成约13.8kDa的两链间隔物、约14kDa的VHH抗体lama结构域、约14.4kDa的来自人程序性细胞死亡1配体(PDL1)的PD-1结合域、约14.5kDa的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、约15kDa的白介素-4、约15.4kDa的白介素-2、约17.7kDa的CD137L(4-1BBL；TNFSF9)胞外域、约16.6kDa的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、约26.3kDa的绿色荧光蛋白(GFP)、约52.8kDa的如本文所述的单链Fc区(scFc)(分别具有N和C末端接头(G4S)3情况下约54.6kDa)、约66.5kDa的人血清白蛋白(HSA)(分别具有N和C末端接头(G4S)3情况下约68.3kDa)和约105.7kDa的双scFc(两个scFc相互连接形成一个更大的单链间隔物)(分别具有N和C末端接头(G4S)3情况下约107.5kDa)。通常，间隔物越刚性，所需的中间距离越小，否则对于柔性间隔物而言所述中间距离必须包括安全裕度。
此外，本发明上下文中的优选间隔物，例如球状结构域，通常具有在空间上彼此不太接近的N末端和C末端，以便有效地将根据本发明的两个双特异性实体隔开。在这方面，间隔物通常显示出N末端和C末端之间的距离，该距离显著大于
Figure BDA0004213953400000271
间隔物的N末端和C末端之间的距离低于或约
Figure BDA0004213953400000272
被认为是“接近的”。因此，本发明上下文中的间隔物优选地在位于N末端的第一个氨基酸和位于C末端的最后一个氨基酸的α-碳原子之间的距离至少为
Figure BDA0004213953400000273
更优选地至少
Figure BDA0004213953400000274
甚至更优选至少
Figure BDA0004213953400000275
该距离通常确保第一和第二双特异性实体隔开至少
Figure BDA0004213953400000276
如本文所述。α-碳(α-碳)在本文中被理解为适用于蛋白质和氨基酸的术语。它是分子中羰基碳原子之前的骨架碳。因此，沿典型蛋白质的主链读取将给出-[N-Cα-羰基C]n-等序列(当沿N到C方向读取时)。α-碳是不同的取代基与每个不同的氨基酸相连的地方。也就是说，在α-碳链上悬挂的基团赋予了氨基酸多样性。因此，在本发明的上下文中，即使间隔物的大小至少为5kDa并且长度超过50aa，如果位于N末端的第一个氨基酸的与位于C末端的最后一个氨基酸的α-碳原子之间的距离太近，即如果它只是例如约
Figure BDA0004213953400000277
这样的间隔物是较不优选的。例如，优选的间隔物显示位于N末端的第一个氨基酸的和位于C末端的最后一个氨基酸的α-碳原子之间的典型距离如下：scFc(基于5G4S晶体结构)
Figure BDA0004213953400000281
HSA(基于5VNW晶体结构)：
Figure BDA0004213953400000282
泛素(基于1UBQ晶体结构)：
Figure BDA0004213953400000283
和SAND(基于1OQJ晶体结构)：
Figure BDA0004213953400000284
相比之下，HSP70-1(基于3JXU晶体结构)显示位于N末端的第一个氨基酸的和位于C末端的最后一个氨基酸的α-碳原子之间的仅
Figure BDA0004213953400000285
的距离。同时，HSP70-1在本发明的上下文中仅提供约
Figure BDA0004213953400000286
的第一和第二双特异性实体的COM之间的中值距离，其低于
Figure BDA0004213953400000287
中值距离的阈值，并且显著低于两个双特异性实体的COM之间的典型地约
Figure BDA0004213953400000288
的中值距离(这是通过优选的间隔物(例如scFc、HSA、泛素和SAND)促进的)。其中，优选scFc(SEQ INNO:25)。
可替代地，在本发明的上下文中，非球形但刚性的接头可用作间隔物，其将两个双特异性实体隔开。此类接头包含(PA)25P(SEQ ID NO:1097)和A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQ ID NO:1096)，即使Mw低于5kDa(此处为4.3kDa)和氨基酸长度仅约为或低于50(分别为51和46aa)。然而，这种间隔物通常不如球状结构域优选，球状结构域优选另外地增加半衰期。
正如在本发明的上下文中也考虑的那样，两个双特异性实体之间的间隔物是通常包含超过50个氨基酸的多肽，优选至少约75、100、150、200、250、300、350、400、450或至少500个氨基酸。间隔物的氨基酸长度的优选范围为约100至1500个氨基酸，优选约100至1000个氨基酸，更优选约250至650个氨基酸以促进根据本发明的两个双特异性实体的分离。这是为了优选地保持根据本发明的整个分子的高总体活性(不一定是单个和间隔开的双特异性实体，它们可能单独具有低亲和力(和低活性)以增加对双阳性靶细胞的特异性))，其通常低于20pM，优选低于5pM，更优选低于1pM。通常，过大的间隔物，例如长于约1500个氨基酸，可能会影响两个双特异性实体与同一靶细胞上的两个靶表面结构结合的能力，这反过来可能会降低分子对靶细胞的整体活性。因此，间隔物的典型最大优选长度为约1500个氨基酸，更优选约1000个氨基酸。充分分隔两个双特异性实体的示例氨基酸长度的间隔物是约(ECD 25-167)143aa的PD-1，如本文所述的约484aa(约514aa，分别具有N末端和C末端接头(G4S)3)的scFc，约585aa的HSA(约615aa，分别具有N末端和C末端接头(G4S)3)，以及约968aa的双scFc(约998aa，分别具有N末端和C末端接头(G4S)3)。其他间隔物包括约76个aa的泛素、约90个aa的来自生腱蛋白的纤连蛋白III型结构域、约90或97个aa的SAND结构域、约100个aa的β2微球蛋白、约108个aa的Tim-3(aa 24-130)、约115个aa的MiniSOG、约113个aa的SpyCatcher与约14个aa的SpyTag缔合优选通过异肽键形成连接在一起以形成约127的两链间隔物、约129个aa的VHH抗体lama结构域、约126个aa的来自人程序性细胞死亡1配体(PDL1)的PD-1结合结构域、约127个aa的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、约129个aa的白介素-4、约133个aa的白介素-2、约167个aa的CD137L(4-1BBL；TNFSF9)胞外域和约238个aa的绿色荧光蛋白(GFP)。
优选的间物隔氨基酸序列的组成和排列优选赋予一定的刚性并且不以高柔性为特征。当大于50aa和/或超过5kDa的分子量的间隔物促进根据本发明的分子中两个双特异性实体的质心之间的最大距离(它小于中值距离的200％(或2倍))时，通常存在本发明上下文中的刚性。因此，本发明上下文中优选的刚性间隔物延伸不超过其中值长度的约100％，更优选不超过约80％(各自计算为两个双特异性实体的质心之间的距离)。因此，在本发明的上下文中将两个双特异性实体间隔开约
Figure BDA0004213953400000291
(中值距离)的优选刚性间隔物延伸不超过
Figure BDA0004213953400000292
(最大距离)。例如，具有包含scFc(例如SEQ ID NO:25)作为间隔物的本发明形式的分子的双特异性实体的质心之间的典型中值距离为约
Figure BDA0004213953400000293
然而，在这种情况下的最大距离通常为约
Figure BDA0004213953400000294
即不超过中值距离的约100％或甚至仅约80％。在本发明的上下文中，这种间隔物被认为是刚性的。相比之下，包含(G4S)10(SEQ ID NO:8)作为间隔物的分子(其是没有例如球状结构的线性多肽)显示典型的中值距离约为
Figure BDA0004213953400000295
最大距离约为
Figure BDA0004213953400000296
因此，诸如(G4S)10之类的间隔物显示出高柔性而不是作为根据本发明的有利特征的优选间隔物的刚性。在这点上，间隔物氨基酸序列通常富含脯氨酸而较少富含丝氨酸和甘氨酸。特别设想的是作为折叠多肽的间隔物，例如二级折叠(例如螺旋结构)或三级折叠形成例如三维蛋白质结构域结构，又通过它们的结构确保了一定的刚性，并优选赋予进一步的有利效果，例如作为治疗剂的多靶向性双特异性分子的体内半衰期延长。典型的结构域结构包括具有亲水表面的疏水核。在本发明的上下文中，优选具有球状蛋白质结构的蛋白质作为间隔物。在本发明的上下文中，球状蛋白质被理解为球状(“球样”)蛋白质并且是常见的蛋白质类型之一。本发明上下文中的球状蛋白质的特征在于球蛋白折叠。特别设想了包含Fc结构域或其部分或多个、PD-1或HSA结构域的间隔物。还设想了包含不同球状蛋白质或其部分的组合的间隔物，其甚至更优选地包含Fc受体结合功能以增加根据本发明的分子的半衰期。本文描述的其中两个双特异性实体分隔的格式具有独特的优势。如果对于第一结合结构域寻址只存在一个靶标，那么第一结合结构域“使用”仅第二结构域接合T细胞但不使用第四结构域，可替代地，第三结构域使用第四结构域但不使用第二结构域(或由于间隔物而更低程度地使用)。如果仅存在一个靶标，则本文披露的优选低亲和力CD结合物的Kd阻止有效的T细胞接合。因此，相对于其他(双)靶向性分子，选择性增加。
如果两个靶标都存在，BiTE2会更牢固地与靶细胞结合(通过亲合力增益)并且两个I2L均可用于接合T细胞(也通过亲合力增益)，例如第二结构域与效应T细胞上的CD3结构域结合，并且第三结构域与靶抗原结合形成溶细胞突触的可能性较小并且因此不作为双特异性实体共同作用，否则会导致不太有益的细胞毒活性谱。这具有第一和第四结构域不会留下“无用”的优点，“无用”将意味着无法利用分别通过靶标和效应物结合结构域的双结合产生的双亲合力的全部效果。同样，与靶抗原结合的第一结构域和与效应T细胞上的CD3结构域结合的第四结构域被阻止理论上的相互作用，这最终会使第二和第三结构域无法与它们各自的双特异性实体中的预期“配偶结构域”形成溶细胞突触。
通常，由根据本发明的多靶向性双特异性分子赋予的有利亲合力效应通过分子对双阳性细胞(即携带(i.)两种不同的靶标，其组合在要靶向并与特定疾病相关的细胞类型上过表达，和/或(ii.)一个处于过表达水平的靶标的靶细胞)的活性之间的差异活性因子或“选择性差距”指示。在任一情况下，与仅表达两个靶标中的一个或表达水平低的一个靶标的非靶细胞相比，同时靶向两个(优选不同的)靶标的根据本发明的分子将优选结合这样的靶细胞，因此将诱导更显著的T细胞应答。正如对于本发明的多靶向性双特异性分子所优选的，例如，通过较低的EC50值确定的增加的细胞毒性方面的活性对靶细胞(例如以同时表达两不同靶标或高水平的一个靶标为特征)比对非靶细胞(例如以表达两个靶标中的仅一个或仅低水平的一个靶标为特征)大至少100倍。本发明上下文中的所述选择性差距优选地大于100倍。在本发明的上下文中设想选择性差距(也可以定义为活性差距)至少为250、500、750或甚至1000倍，与各种形式的单靶向性双特异性分子相比，这大大提高了本发明的多靶向性双特异性分子的功效和安全性。
在本发明的上下文中设想的另一方面是由多靶向性抗原结合分子的形式通过低亲和力(优选靶抗原结合物和CD3效应结合物两者)赋予的双重亲合力效应的进一步支持。在本发明的上下文中，优选亲和力低于KD 1.2x10-8的CD3结合物。特别优选的CD3结合物的活性比KD为1.2x10-8的CD3结合物的活性低10倍，更优选低50倍或甚至更优选低100倍。不希望受理论束缚，当具有相对平衡亲和力的两种结合物，即通常两种低亲和力的结合物结合同一靶细胞上的两个靶标时，与具有混合亲和力或通常较高亲和力的结合物(其会触发溶细胞活性(细胞上仅一个靶标被结合的情况下也是如此，该细胞例如会是生理非靶细胞，该生理非靶细胞不应被靶向，以避免脱靶毒性和相关副作用))相比，亲合力效应预计会更加明显。
因此，与靶细胞上的两个(优选不同的)靶标结合以显示显著细胞毒活性的根据本发明的多靶向性双特异性抗原结合分子优选确实比使效应T细胞和靶细胞在一起的单靶向性双特异性抗原结合分子显示出更少的副作用。例如，这可以通过关键细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、TNFa和IFNg的释放显著减少来证明，这些细胞因子是临床阶段副作用的指标。例如，相对于相应的单靶向性双特异性分子，在使用根据本发明的多靶向性双特异性抗原结合分子后，IL-6的释放通常减少。正如本领域所知，白介素6(IL-6)似乎在CRS病理生理学中起关键作用，因为在CRS患者中观察到高度升高的IL-6水平(Shimabukuro-Vornhagen等人Journal for ImmunoTherapy of Cancer[癌症免疫疗法杂志](2018)6:56)。由于CRS是免疫疗法中的严重副作用，因此这种降低表明临床阶段CRS较少。
此外，与靶细胞上的两个(优选不同的)靶标结合以显示显著细胞毒活性的根据本发明的多靶向性双特异性抗原结合分子就毒性组织损伤而言，优选确实比单靶向性双特异性抗原结合分子显示出更少的副作用。出人意料的发现是，如本文所述形式的多特异性分子显示出更高的耐受性，即可以施用比相应的单靶向性双特异性分子更高的剂量而没有临床表现，例如通过组织病理学检查而检查的组织损伤。例如，1.5μg/kg剂量的MSLN单靶向性双特异性抗原结合分子(SEQ ID NO:1183)不能耐受并导致死亡，而0.1μg/kg剂量是耐受的。相反，根据本发明的多靶向性CDH3-MSLN双特异性分子(SEQ ID NO:251)在高达1000μg/kg的剂量是耐受的。单靶向性分子在1.5μg/kg剂量观察到的组织病理学变化通常分别比多靶向性分子在1000μg/kg剂量观察到的那些更严重。在用多靶向性分子处理后，不存在由单靶向性分子引起的粘连或不可逆的纤维化变化。因此，根据本发明的多靶向性分子的耐受性比相应的单靶向性分子高例如600(组织病理学)至例如10.000(耐受剂量)倍，尽管体外对抗肿瘤细胞的效力相等。因此，本发明的多靶向性分子特别适用于以下治疗环境，其中寻址的靶标不仅显著存在于疾病相关(病理生理学)的组织上而且甚至主要存在于生理组织上，然而，生理组织不应被细胞毒性免疫疗法靶向。例如，对于MSLN就是这种情况，它通常在形成以下几个体腔的内衬的间皮细胞中表达：胸膜(肺周围的胸膜腔)、腹膜(腹盆腔，包括肠系膜、网膜、镰状韧带和子宫外膜)和心包膜(围绕心脏)。通过细胞毒性免疫疗法寻址MSLN等靶标存在严重副作用的风险，例如腹内粘连和/或纤维化。腹内粘连在本文中被理解为在腹内器官之间形成的病理性疤痕。在腹膜内炎症存在的情况下会发生粘连，并导致腹膜表面相互粘连。如果疤痕限制器官的自由运动，则粘连会导致问题(Mutsaers S.E.,Prele C.M,Pengelly,S.,Herrick,S.E.Mesothelial cells and peritonealhomeostasis[间皮细胞和腹膜稳态].Fertil Steril[生育和不育]2016,106(5)1018-1024)。纤维化在本文中被理解为导致慢性组织损伤的几种病原学病症的常见病理结果，并且通常被定义为细胞外基质(ECM)组分的过度沉积，随着时间的推移导致疤痕组织形成并最终导致器官功能障碍和衰竭(Maurizio Parola,Massimo Pinzani,Pathophysiology ofOrgan and Tissue Fibrosis[器官和组织纤维化的病理生理学],Molecular Aspects ofMedicine[医学分子方面]2019,(65)1)。因此，本发明还提供了通过提供本文所述形式的多靶向性双特异性抗原结合分子来寻址在病理生理组织和一个或多个生理组织上显著共表达的疾病相关靶标的方法，其中该分子寻址(i.)在疾病相关组织和生理组织上均表达的靶标和(ii.)与疾病相关但不在(i.)下的生理组织上表达的另一靶标，其中该方法优选地避免在这样的靶标是MSLN的情况下形成腹内粘连和/或纤维化。
设想根据本发明的双特异性抗原结合分子与例如食蟹猴肿瘤相关抗原如CDH3、MSLN、CD20、CD22、FLT3、CLL1和EpCAM具有交叉反应性。在本发明的上下文中特别设想两个靶标可以由一个多靶向性双特异性抗原结合分子同时寻址。
可替代地，除了如本文所述的增加选择性的主要优点之外，双靶向性可以减轻当靶向剩余的靶标可以触发足够的残余效应时一个靶标的可接近性的缺乏。示例是(i)可溶性靶标的存在，它会通过结合抗原结合分子而不让剩余分子产生任何治疗效果来“掩盖”靶细胞上的靶标，以及(ii)抗原丢失(降低靶细胞上的靶标表达)作为肿瘤逃逸的驱动因素。
例如，根据本发明的多靶向性抗原结合分子，例如针对作为TAA1的MSLN和作为TAA2的CDH3的构建体适用于治疗、缓解或预防癌症，特别是选自由以下组成的组的癌症：肺癌、头颈癌、原发性或继发性CNS肿瘤、原发性或继发性脑肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、肾上腺皮质癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、SCLC(小细胞肺癌)、子宫内膜癌、宫颈癌、子宫癌、移行细胞癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、肝癌、胆管癌、胆囊癌、肾癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、胃肠道(胃、结直肠、和十二指肠)癌、小肠癌、胆道癌、尿道癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、睾丸癌、皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤、间皮瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性或急性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、纤维肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和软组织肉瘤。
在本发明的上下文中尤其设想多靶向性抗原结合分子优选地寻址两种不同靶细胞表面抗原，由此对其靶细胞非常特异并且因此优选地在其治疗用途中是安全的。已在小鼠模型中在体内证明了抑制肿瘤生长的功效。
本发明上下文中优选的靶细胞表面抗原是MSLN、CDH3、FLT3、CLL1、EpCAM、CD20和CD22。典型地，在本发明的上下文中，靶细胞表面抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。B淋巴细胞抗原CD20或CD20在所有B细胞表面上表达(起始于原B(pro-B)阶段(CD45R+，CD117+)，并且浓度逐渐增加直至成熟)。CD22，或分化簇-22，是属于凝集素的SIGLEC家族的分子。它发现于成熟B细胞的表面，其次是发现于一些未成熟B细胞上。Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)也称为分化抗原簇135(CD135)、受体型酪氨酸蛋白激酶FLT3、或胎肝激酶2(Flk2)。FLT3是细胞因子受体，属于受体酪氨酸激酶III。CD135是细胞因子Flt3配体的受体(FLT3L)。FLT3基因在急性骨髓性白血病(AML)中频繁突变。C型凝集素样受体(CLL1)，也称为CLEC12A或MICL。它在细胞质尾部包含ITIM基序，可以与信号磷酸酶SHP-1和SHP-2相关联。人MICL主要在骨髓细胞(包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、和树突状细胞)中作为单体表达并且与AML相关。间皮素(MSLN)是在间皮细胞中表达并且在几种人肿瘤中过表达的40kDa蛋白质。钙粘素-3(CDH3)，也称为P-钙粘素，是由五个细胞外钙粘素重复、跨膜区和高度保守的胞质尾组成的钙依赖性细胞-细胞粘附糖蛋白。它与一些类型的肿瘤相关。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是上皮中的跨膜糖蛋白介导的Ca2+非依赖性同型细胞-细胞粘附。EpCAM具有致癌潜力并且似乎在肿瘤发生和癌转移中起作用。
此外，在本发明的上下文中，任选地但有利地设想，多靶向性抗原结合分子具有间隔物，优选球状蛋白质结构，例如scFc结构域，这也增加了分子的半衰期并能够静脉内给药，该静脉内给药每周仅施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次或甚至每四周施用一次，或更不频繁地施用。
为了确定针对例如CDH3、MSLN或CD20表位的根据本发明的优选多靶向性抗原结合分子的一个或多个表位，如本文所述的进行定位。具有CD20靶结合物的优选双特异性抗原结合分子针对所有表位簇E1A、E2B和E2C。表位簇在本文中被理解为靶标(如本文所披露的，并按照其根据Kabat的位置来定义)内的一段氨基酸(如本文所披露的，并按照其根据Kabat的位置来定义)，如果人靶标的所述一段氨基酸被鼠靶标的相应一段氨基酸替代，则本文所述的多靶向性双特异性抗原结合分子的整个靶结合物基本上不再与该靶标结合。因此，所述表位簇方法在本文中被理解为鼠嵌合体序列分析。该方法已在Münz等人Cancer CellInternational[国际癌细胞]2010,10:44中进行了描述，并且如在关于CDH3和MSLN的实例中详细描述的那样应用。
优选的表位簇是本文所述的CDH3的D4B和本文所述的MSLN的E1。如实例中所举例说明的，本发明的多靶向性双特异性抗原结合分子的选择性差距(相对于可比较的单靶向性双特异性抗原结合分子)通常甚至更大，因此，更优选地，如果MSLN靶结合物寻址E1表位簇，并且如果CDH3靶结合物寻址D4B表位簇的话。虽然寻址其他表位簇也导致了非常高的选择性差距以及在功效和耐受性/安全性方面的相关优势，但是选择性差距特别高，因此对于包含寻址E1和D4B的靶结合物的分子是优选的。此类分子包含例如具有如下MSLN靶结合物的分子，该靶结合物包含SEQ ID NO774至776的CDR H1-H3和777至779的CDR L1-L3(以及相应的780和781的VH和VL)、SEQ ID NO 782至784的CDR H1-H3和785至787的CDR L1-L3(以及相应的788和789的VH和VL)、SEQ ID NO 806至808的CDR H1-H3和809至811的CDR L1-L3(以及相应的812和813的VH和VL)、SEQ ID NO 838至840的CDR H1-H3和841至843的CDR L1-L3(以及相应的844和845的VH和VL)、SEQ ID NO 862至864的CDR H1-H3和865至867的CDR L1-L3(以及相应的868和869的VH和VL)、SEQ ID NO 894至896的CDR H1-H3和897至899的CDRL1-L3(以及相应的900和901的VH和VL)、SEQ ID NO 950至952的CDR H1-H3和953至955的CDR L1-L3(以及相应的956和957的VH和VL)、SEQ ID NO 1030至1032的CDR H1-H3和1033至1035的CDR L1-L3(以及相应的1036和1037的VH和VL)、或SEQ ID NO 86至88的CDR H1-H3和89至91的CDR L1-L3(以及相应的92的VH和93或94的VL)。结合优选DB4表位簇的CDH3结合物的优选实例包含SEQ ID NO 194、432和196的CDR H1-H3和197至199的CDR L1-L3(以及相应的433和200的VH和VL)。优选结合D4B的优选表位簇的其他靶结合物在本文中被鉴定为例如CH3 15-E11 CC和CH3 24-D7 CC。
特别出人意料的是，根据本发明的多靶向性抗原结合分子能够结合，优选同时结合两个不同的靶标。本文已经证明了可同时结合多个靶标。然而，考虑到靶标之间通常地典型距离，这是出人意料的。例如，CD20包含仅6个氨基酸和47个氨基酸的两个小细胞外结构域。相反，CD22包含具有676aa的、7Ig结构域长的细胞外结构域。然而，即使细胞外尺寸和设置显著不同，根据本发明的多靶向性抗原结合分子可成功地同时寻址TAA CD20和CD22两者，从而实现增加功效和减少毒性的益处。
分别是靶标和CD3结合物的VH和VL的优选“结构单元”以及本文所有披露的优选接头和间隔物(其一起形成多靶向性双特异性抗原结合分子)的示例性一般排列可总结如下：
Figure BDA0004213953400000361
在本发明的上下文中设想，优选的多靶向性抗原结合分子不仅显示出有利的细胞毒性与亲和力的比率，而且另外还显示出足够的稳定性特征，以便有助于配制、储存和施用所述构建体的实际操作。例如，足够的稳定性的特征在于标准制备后的高单体含量(即非聚集的和/或非缔合的天然分子)，例如，如通过制备型尺寸排阻色谱法(SEC)确定的至少65％、更多优选至少70％并且甚至更优选至少75％。另外，例如在浓度为2.5mg/ml下以340nm作为光学吸收测量的浊度应该优选地等于或低于0.025、更优选0.020，例如，以便得出基本上不存在不希望的聚集体的结论。有利地，在应激条件(例如冷冻/解冻)下孵育或在37℃或40℃下孵育之后保持高单体含量。甚至更多的，根据本发明的多靶向性抗原结合分子典型地具有热稳定性，该热稳定性至少与仅具有一个靶结合结构域但另外包含CD3结合结构域和半衰期延长的scFc结构域的双特异性抗原结合分子(即，其在结构上不太复杂)的热稳定性相当或甚至更高。技术人员将期望结构上更复杂的基于蛋白质的分子更不易热降解和其他降解，即热稳定性较差。然而，出人意料的是，情况恰恰相反，根据本发明的多靶向性双特异性抗原结合分子显示与如本文披露的对应单靶向性双特异性抗原结合分子相比，热稳定性更高、储存后单体减少会更少、在三个冷冻解冻循环后单体百分比更高、以及蛋白质同质性更高。
在实施例中，本发明提供了包含所有四个这样的结构域的多靶向性双特异性抗原结合分子。在优选的实施例中，(i.)、(ii.)、(iii.)、和(iv.)中的结构域以N至C方向排列(方形格式，参见图1A)。然而，可替代地，多靶向性双特异性抗原结合分子可以具有按(i)、(ii.)、(iv)和(iii.)顺序排列的结构域(镜像格式，参见图1B)，或以N至C方向(ii.)、(i.)、(iii.)和(iv.)或(ii.)、(i.)、(iv)和(iii.)。出人意料的是，所有排列(其(a.)将两个双特异性实体中的任何一个的靶标和效应结合物分隔开，或(b.)将两个双特异性实体本身靠得太近)都将导致构建体，这些构建体显示出针对以下的降低的能力：就如本文所述的单阳性靶细胞和双阳性靶细胞之间的优选选择性差距而言的亲合力效应(参见图1C至F和K和L(后者呈“V”形和“A”形))。
术语“多肽”在本文中理解为包含至少一个连续的、无支链的氨基酸链的有机聚合物。在本发明的上下文中，同样设想包含超过一个氨基酸链的多肽。多肽氨基酸链典型地包含至少50个氨基酸，优选地至少100、200、300、400或500个氨基酸。在本发明的上下文中还设想，聚合物的氨基酸链与不由氨基酸组成的实体连接。
根据本发明的术语“抗原结合多肽”优选地是与其靶标或抗原免疫特异性地结合的多肽。它典型地包含抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或包含由其衍生的结构域。根据本发明的多肽包含允许免疫特异性靶标结合的抗体最低结构要求。这种最低要求可以例如通过至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)、优选全部六个CDR的存在来定义。本发明的抗原结合分子优选地是T细胞接合多肽，其因此特征可能在于在一个或两个结合结构域中存在三个或六个CDR，并且技术人员知道那些CDR在结合结构域内位于哪里(以什么顺序)。优选地，“抗原结合分子”在本发明的上下文中理解为“抗原结合多肽”。在另一个实施例中，本发明的抗原结合多肽可以是适体。
可替代地，本发明上下文中的分子是抗原结合多肽，该抗原结合多肽对应于“抗体构建体”，其典型地是指其中结构和/或功能是基于抗体(例如全长或完整免疫球蛋白分子)的结构和/或功能的分子。因此，抗原结合分子能够结合其特异性靶标或抗原、和/或从抗体或其片段的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)结构域中提取。此外，与根据本发明的结合配偶体结合的结构域在本文理解为根据本发明的抗原结合分子的结合结构域。典型地，根据本发明的结合结构域包含允许靶标结合的抗体的最低结构要求。这种最小要求可以例如通过至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)，优选全部六个CDR的存在来定义。定义抗体的最小结构要求的替代方法是分别定义特异性靶标结构内的抗体表位、构成表位区(表位簇)的靶蛋白的蛋白结构域或通过参考与所定义抗体的表位竞争的特异性抗体。根据本发明的构建体所基于的抗体包括例如单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、去免疫抗体、人源化抗体和人抗体。
在本发明的上下文中，本发明的多肽以特定的方式与其对应的靶结构结合。优选地，根据本发明的多肽的每个结合结构域包含一个互补位，该结合结构域“特异性地或免疫特异性地”结合其对应的靶结构、“(特异性地或免疫特异性地)识别”其对应的靶结构、或与其对应的靶结构“(特异性地或免疫特异性地)反应”。根据本发明，这意指多肽或其结合结构域分别与靶分子(抗原)和CD3上的给定表位相互作用或(免疫)特异性地相互作用。这种相互作用或结合在特定靶上的表位中比在替代性物质(非靶分子)中更频繁、更快速地发生，具有更长的持续时间、具有更大的亲和力、或者具有这些参数的一些组合。但是，由于不同物种中同源蛋白质之间的序列相似性，(免疫)特异性地结合其靶标(如人靶标)的结合结构域可能与来自不同物种(如，来自非人灵长类动物)的同源靶分子交叉反应。因此，术语“特异性/免疫特异性结合”可以包括结合结构域与多于一种物种中的表位和/或结构相关表位的结合。术语“(免疫)选择地结合”不包括与结构相关表位的结合。
根据本发明的抗原结合分子的结合结构域可以例如包含以上提到的CDR组。优选地，那些CDR包含在抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)的框架中；然而，它不一定两者都包含。例如，Fd片段具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体片段、抗体变体或结合结构域的形式的另外实例包括(1)Fab片段，一种具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab')2片段，一种具有由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(5)具有VH结构域的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-546)；(6)经分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)，后者是优选的(例如，衍生自scFV文库)。根据本发明的抗原结合分子的实施例的实例例如描述于以下中：WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910和WO2015/048272。
另外，在“结合结构域”或“结合……的结构域”的定义内是全长抗体的片段，例如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab')2或“r IgG”(“半抗体”)。根据本发明的抗原结合分子还可以包含修饰的抗体片段，也称为抗体变体，如scFv、二-scFv或双(二)-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链、scFab、Fab2、Fab3、双抗体、单链双抗体、串联双抗体(Tandab)、串联二-scFv、串联三-scFv)、“多抗体”(如三抗体或四抗体)以及仅包含一个可变结构域(可以是VHH、VH或VL，独立于其他V区或结构域特异性地结合抗原或表位)的单结构域抗体，如纳米抗体或单可变结构域抗体。通常，本发明的结合结构域包含促进与其结合配偶体结合的互补位。
如本文使用的，术语“单链Fv”、“单链抗体”或“scFv”是指单多肽链抗体片段，这些抗体片段包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。一般来讲，单链抗体在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，该多肽接头使得其形成所希望的将允许抗原结合的结构。单链抗体详细论述于以下中：Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学],第113卷,Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约,第269-315页(1994)。产生单链抗体的各种方法是已知的，这些方法包括以下中所描述的那些：美国专利号4,694,778和5,260,203；国际专利申请公开号WO 88/01649；Bird(1988)Science[科学]242:423-442；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Ward等人(1989)Nature[自然]334:54454；Skerra等人(1988)Science[科学]242:1038-1041。在具体实施例中，单链抗体还可以是双特异性的、多特异性的、人和/或人源化的和/或合成的。
在本发明的上下文中，互补位理解为作为如本文所述的多肽的一部分并且识别抗原并与其结合的抗原结合位点。互补位典型地是约至少5个氨基酸的小区域。如本文理解的互补位典型地包含抗体衍生的重链(VH)和轻链(VL)序列的部分。根据本发明的分子的各个结合结构域提供了包含一组6个互补决定区(CDR环)(其中每三个分别包含在抗体衍生的VH和VL序列内)的互补位。
此外，术语“抗原结合分子”的定义包括优选地多价(polyvalent/multivalent)构建体，并因此包括双特异性分子，其中双特异性意为其与包含不同抗原结构的两种细胞类型(即靶细胞和效应细胞)特异性地结合。由于本发明的抗原结合分子优选是多靶向的，这些抗原结合分子典型地也是多价(polyvalent/multivalent)分子，即，它们特异性结合两个以上的抗原结构，在本发明的上下文中优选四个不同的结合域，其是两个靶结合结构域和两个CD3结合结构域。术语“多靶向性双特异性抗原结合分子”包括术语“多靶向性双特异性T细胞接合器分子”和“多靶向性双特异性T细胞接合器多肽(MBiTEP)”。优选的“多靶向性双特异性抗原结合分子”是“多靶向性双特异性T细胞接合器分子”或“多靶向性双特异性T细胞接合器多肽(MBiTEP)”。术语“多靶向性双特异性T细胞接合器分子”被理解为包括术语“多靶向性双特异性T细胞接合器多肽”。此外，术语“抗原结合分子”的定义包括包含仅一条多肽链的分子以及由多于一条多肽链组成的分子，这些链可以是相同的(同源二聚体、同源三聚体或同源寡聚体)或不同的(异二聚体、异三聚体或异寡聚体)。包含多于一条多肽链(即，典型地两条链)的此类分子中这些链典型地作为异二聚体经由例如在异Fc实体(其用作本文所述的两个双特异性实体之间的间隔物和半衰期延长的部分)内的带电对结合而彼此附接。以上鉴定的抗原结合分子、例如基于抗体的分子和其变体或衍生物的实例尤其描述于Harlow和Lane,Antibodies a laboratory manual[抗体：实验室手册],CSHL Press[冷泉港实验室出版社](1988)和Using Antibodies:a laboratory manual[使用抗体：实验室手册],CSHL Press[冷泉港实验室出版社](1999)，Kontermann和Dübel,AntibodyEngineering[抗体工程],Springer[施普林格出版社],第2版2010以及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy[用于免疫疗法的重组抗体],CambridgeUniversity Press[剑桥大学出版社]2009。
如本文使用的，术语“双特异性”是指抗原结合分子是“至少双特异性的”，即其寻址两种不同的细胞类型(即靶细胞和效应细胞)，并且至少包含第一结合结构域和第三结合结构域以及第二结合结构域和第四结合结构域，其中至少两个结合结构域与两种抗原或靶标(优选地选自CD20、CD22、FLT3、MSLN、CDH3、CLL1和EpCAM)结合，并且该相同分子的另两个结合结构域与效应细胞(典型地T细胞)上的另一抗原(此处：CD3)结合。因此，根据本发明的抗原结合分子对至少两种不同抗原或靶标具有特异性。例如，两个结构域优选地不结合如本文所述的一种或多种物种的CD3e的细胞外表位。
术语“靶细胞表面抗原”是指由细胞表达的抗原结构，其存在于细胞表面，使得其可接近如本文所述的抗原结合分子。在本发明的上下文中，优选的靶细胞表面抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。其可以是蛋白质，优选地蛋白质的细胞外部分，或碳水化合物结构，优选地蛋白质的碳水化合物结构，如糖蛋白。其优选地是肿瘤抗原。术语本发明的“双特异性抗原结合分子”还涵盖双特异性多靶向性抗原结合分子，如三靶向性抗原结合分子，后者包括三个结合结构域，或者具有多于三种(例如，四种、五种……)特异性的构建体。
在本发明的上下文中优选的是“多靶向性”分子，其在本文中被理解为“通常至少靶向两个靶标(例如TAA)/本发明的分子/靶细胞”。在这点上，多靶向性分子例如抗原结合分子对效应细胞上的两个通常相同的效应物结构(例如CD3，更优选CD3ε(CD3e，在本发明中每当提及“CD3”时就包括在内))和至少两种靶细胞表面抗原具有特异性。所述特异性通过如本文定义的对应结合结构域赋予。通常，“多靶向性”是指对至少两个(优选不同的)靶细胞表面抗原(例如TAA)具有特异性的分子，这赋予根据本发明的多靶向性抗原结合分子的优选特性，即减轻抗原损失和增加选择性，即杀死共表达本发明的分子具有针对其的结合结构域的靶标的靶细胞以及与疾病相关的靶细胞的选择性。因此，本发明分子的治疗窗相对于单靶向性双特异性分子增加，这通常导致更高的药物耐受性，如本文所证明的。
与T细胞接合的抗原结合分子，例如根据本发明的单链多肽优选是双特异性的，其在本文中被理解为通常包含结合至少一种靶抗原的一个结构域和结合CD3的另一个结构域。因此，它不是自然产生的，它的功能与自然产生的产物明显不同。因此，根据本发明的多肽是包含至少两个具有不同特异性的不同结合结构域的人工“杂交”多肽，因此是双特异性的。双特异性抗原结合分子可以通过多种方法(包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接)来产生。参见，例如Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.[临床实验免疫学]79:315-321(1990)。
本发明的抗原结合分子的至少四个结合结构域和可变结构域(VH/VL)典型地包含肽接头(间隔物肽)。根据本发明，术语“肽接头”包含氨基酸序列，本发明的抗原结合分子的一个(可变和/或结合)结构域和另一个(可变和/或结合)结构域的氨基酸序列通过该氨基酸序列彼此连接。第一和第二结合结构域以及第三和第四结构域之间的肽接头(其中第一和第三结构域优选能够同时结合两个靶标，这些两个靶标优选是不同的靶标(例如TAA1和TAA2)，优选在相同细胞上)优选地是柔性的并且长度有限，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸。肽接头也可用于将间隔物与本发明的抗原结合分子的其他结构域融合。这种肽接头的基本技术特征在于它不包含任何聚合活性。合适的肽接头是在美国专利4,751,180和4,935,233或WO 88/09344中描述的那些。肽接头也可用于将其他结构域或模块或区(如半衰期延长的结构域)附接到本发明的抗原结合分子。然而，典型地第一靶结合结构域和第二靶结合结构域之间的接头与在靶结合结构域内连接VH和VL的结合物内接头(intra-binder linker)不同。所述不同在于第一结合结构域和第二结合结构域之间的接头比结合物内接头多一个氨基酸，例如分别是六个和五个氨基酸，如SGGGGS对比GGGGS。这同时出人意料地使如本文所述的特定抗原结合分子形式具有柔韧性和稳定性。如本文所述的两个双特异性实体之间的间隔物(或同义间隔物实体)是接头的一个具体实施例，因为间隔物还起到接头的作用，因为它有助于连接两个双特异性实体以优选构建至少一个连续的包括四个结合结构域或其部分的多肽链。然而，此外，间隔物起到将两个双特异性实体空间隔开的实体的作用。因此，本发明上下文中的间隔物是接头的具体实施例，其与每个末端的两个另外的更短且柔性的接头一起有助于连接(两个不同的双特异性实体的)两个结合结构域，但首先并且最重要的是将它们间隔开，使得两个双特异性实体可以有利地如本文所述那样起作用，例如显示出出人意料的高选择性差距。
本发明的抗原结合分子优选地为“体外生成的抗原结合分子”。此术语是指根据上述定义的抗原结合分子，其中在非免疫细胞选择中生成全部或部分可变区(例如，至少一个CDR)，例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片或可以测试候选序列结合抗原的能力的任何其他方法。因此，这个术语优选地排除仅由动物免疫细胞中的基因组重排产生的序列。“重组抗体”是通过使用重组DNA技术或基因工程制得的抗体。
本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)或抗原结合分子所源自的单克隆抗体是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)以外，构成该群体的单独抗体是相同的。与典型地包括针对不同决定簇(或表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，单克隆抗体针对抗原上的单一抗原侧或决定簇具有高度特异性。除了它们的特异性之外，单克隆抗体还在它们通过杂交瘤培养合成，因此不被其他免疫球蛋白污染方面是有优势的。修饰语“单克隆”指示获自实质上均质的抗体群体的抗体的特征，并且不应理解为要求通过任何特定方法产生抗体。
对于单克隆抗体的制备，可以使用提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。例如，有待使用的单克隆抗体可以通过Koehler等人,Nature[自然],256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法，或可以通过重组DNA方法(参见，例如美国专利号4,816,567)制备。用于产生人单克隆抗体的另外技术的实例包括三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor,Immunology Today[今日免疫学]4(1983),72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症治疗],Alan R.Liss公司(1985),77-96)。
然后可以使用标准方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振分析例如BiacoreTM筛选杂交瘤以鉴定一种或多种产生与指定抗原特异性结合的抗体的杂交瘤。任何形式的相关抗原均可以用作免疫原，例如重组抗原、天然存在形式、其任何变体或片段以及其抗原肽。如在Biacore系统中采用的表面等离子体共振可以用于增加与靶细胞表面抗原的表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas[人抗体杂交瘤]7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]183(1995),7-13)。
另一种制备单克隆抗体的示例性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体展示或核糖体展示文库。噬菌体展示例如描述于以下中：Ladner等人,美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science[科学]228:1315-1317、Clackson等人,Nature[自然],352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222:581-597(1991)。
除了使用展示文库之外，还可以使用相关抗原来免疫非人动物，例如啮齿动物(如小鼠、仓鼠、兔或大鼠)。在一个实施例中，非人动物包括人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可能利用人Ig(免疫球蛋白)基因座的大片段来工程化小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可以产生并选择衍生自具有所希望的特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，例如，XENOMOUSETM、Green等人(1994)Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21、US 2003-0070185、WO 96/34096和WO 96/33735。
单克隆抗体也可以获自非人动物，并且然后使用本领域中已知的重组DNA技术进行修饰，例如人源化、去免疫、呈现嵌合等。修饰的抗原结合分子的实例包括非人抗体的人源化变体，“亲和力成熟”抗体(参见，例如Hawkins等人J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]254,889-896(1992)和Lowman等人,Biochemistry[生物化学]30,10832-10837(1991))和具有改变的一种或多种效应子功能的抗体突变体(参见，例如美国专利5,648,260、Kontermann和Dübel(2010),上述引文和Little(2009),上述引文)。
在免疫学中，亲和力成熟是这样的过程：通过该过程，在免疫应答的过程中B细胞产生与抗原的亲和力增加的抗体。反复暴露于相同的抗原后，宿主会产生亲和力依次更大的抗体。如天然原型一样，体外亲和力成熟是基于突变和选择的原则。体外亲和力成熟已经成功地用于优化抗体、抗原结合分子和抗体片段。使用辐射、化学诱变剂或易错PCR在CDR内引入随机突变。此外，遗传多样性可以通过链改组来增加。使用展示方法(如噬菌体展示)进行两轮或三轮突变和选择通常产生具有在低纳摩尔范围内的亲和力的抗体片段。
抗原结合分子的优选类型的氨基酸取代变异包括取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般来讲，选择用于进一步开发的一种或多种所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改善的生物特性。用于产生此类取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将若干个高变区侧端(例如6-7个侧端)突变以在每个侧端产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体变体以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合物。然后如本文所披露那样筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区侧端，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。可替代地或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定结合结构域与例如人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CDH3、MSLN、CLL1或EpCAM之间的接触点可能是有益的。根据本文阐述的技术，此类接触残基和相邻残基是用于取代的候选者。一旦产生了此类变体，就如本文所述对这组变体进行筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有优异特性的抗体用于进一步的开发。
本发明的单克隆抗体和抗原结合分子具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一个或多条链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:6851-6855(1984))。本文的目的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，这些抗体包含衍生自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。已经描述了多种用于制备嵌合抗体的方法。参见，例如Morrison等人,Proc.Natl.Acad.ScLU.S.A.[美国国家科学院院刊]81:6851,1985；Takeda等人,Nature[自然]314:452,1985；Cabilly等人,美国专利号4,816,567；Boss等人,美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人,EP0171496；EP 0173494；和GB 2177096。
抗体、抗原结合分子、抗体片段或抗体变体还可以通过例如WO 98/52976或WO 00/34317中披露的方法特定地缺失人T细胞表位(称为“去免疫”的方法)来进行修饰。简而言之，可以针对与II类MHC结合的肽分析抗体的重链和轻链可变结构域；这些肽代表潜在的T细胞表位(如WO 98/52976和WO 00/34317中所定义)。为了检测潜在T细胞表位，可以应用称为“肽穿线”的计算机建模方法，并且此外针对VH和VL序列中存在的基序，可以搜索人MHCIl类结合肽的数据库，如WO 98/52976和WO 00/34317中所述。这些基序与18种主要的MHCIl类DR同种异型中的任一种结合，并且因此构成潜在T细胞表位。检测到的潜在T细胞表位可以通过取代可变结构域中的少量氨基酸残基，或者优选通过单个氨基酸取代来消除。典型地，进行保守取代。通常但不排他地，可以使用与人种系抗体序列中的位置共有的氨基酸。人种系序列例如披露于以下中：Tomlinson等人(1992)J.MoI.Biol.[分子生物学杂志]227:776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today[当代免疫]第16(5)卷:237-242；和Tomlinson等人(1995)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]14:14:4628-4638。VBASE目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson,LA.等人MRC Centre forProtein Engineering[MRC蛋白质工程中心],Cambridge,UK[英国剑桥]编译)。这些序列可以用作人序列的来源，例如用于框架区和CDR。也可以使用共有的人框架区，例如如美国专利号6,300,064中所述。
“人源化”抗体、抗原结合分子、其变体或片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)是大多数人序列的抗体或免疫球蛋白，其含有一个或多个源自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分来说，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区(也称为CDR)的残基被来自非人(例如啮齿动物)物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)的具有所希望的特异性、亲和力和能力的高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人类残基替换。此外，如本文使用的，“人源化抗体”还可以包括在受体抗体或供体抗体中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。人源化抗体还可以包含典型地是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。对于更多的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学新见],2:593-596(1992)。
人源化抗体或其片段可以通过用人Fv可变结构域的等效序列替换不直接参与抗原结合的Fv可变结构域的序列来产生。用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法由以下提供：Morrison(1985)Science[科学]229:1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques[生物技术]4:214；以及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；以及US 6,407,213。那些方法包括分离、操纵和表达编码来自重链或轻链中的至少一者的全部或部分免疫球蛋白Fv可变结构域的核酸序列。此类核酸可以获自如上所述的产生针对预定靶的抗体的杂交瘤，以及其他来源。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆到适当的表达载体中。
人源化抗体还可以使用转基因动物(如表达人重链和轻链基因但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因的小鼠)产生。Winter描述了可用于制备本文所述的人源化抗体的示例性CDR移植方法(美国专利号5,225,539)。特定人抗体的全部CDR可以用至少一部分非人CDR替换，或者仅一些CDR可以用非人CDR替换。仅需要替换用于将人源化抗体与预定抗原结合所需的CDR数量。
可以通过引入保守取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化人源化抗体。此类改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的几种技术中的任何一种来制备(例如，Teng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],80:7308-7312,1983；Kozbor等人,Immunology Today[今日免疫学],4:7279,1983；Olsson等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],92:3-16,1982，以及EP 239 400)。
术语“人抗体”、“人抗原结合分子”和“人结合结构域”包括抗体、抗原结合分子和具有抗体区域(如可变区和恒定区)的结合结构域或基本上对应于本领域已知的人种系免疫球蛋白序列的结构域，该人种系免疫球蛋白序列包括例如Kabat等人(1991)(在上述引文中)描述的那些。本发明的人抗体、抗原结合分子或结合结构域可以包括例如在CDR中、并且特别是在CDR3中不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或侧特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体、抗原结合分子或结合结构域可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个被氨基酸残基替代的位置，该氨基酸残基不由人种系免疫球蛋白序列编码。然而，如本文使用的人抗体、抗原结合分子和结合结构域的定义还涵盖“完全人抗体”，这些完全人抗体仅包含非人工和/或遗传改变的人抗体序列，如可通过使用例如Xenomouse技术或系统衍生的那些。优选地，“完全人抗体”不包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基。
在一些实施例中，本发明的抗原结合分子是“分离的”或“基本上纯的”抗原结合分子。在用于描述本文披露的抗原结合分子时，“分离的”或“基本上纯的”意味着抗原结合分子已经从其产生环境的组分鉴定、分离和/或回收。优选地，抗原结合分子不含来自其生产环境的所有其他组分或基本上不与来自其生产环境的所有其他组分相关。其产生环境的污染组分，如由重组转染细胞产生的污染组分，是典型地干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。抗原结合分子可以例如占给定样品中总蛋白质的按重量计至少约5％或至少约50％。应理解，根据情况，分离的蛋白质可以占总蛋白质含量的5％至99.9％(按重量计)。通过使用诱导型启动子或高表达启动子，能以显著更高的浓度制备多肽，以使得它以增加的浓度水平制备。该定义包括在本领域已知的多种生物和/或宿主细胞中产生抗原结合分子。在优选的实施例中，将抗原结合分子(1)纯化至足以通过使用旋转杯测序仪获得至少15个N末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(2)通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色来纯化至均匀。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗原结合分子。
术语“结合结构域”关于本发明表征了(特异性地)结合/相互作用/识别靶分子(抗原)(例如分别为CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、MSLN、或EpCAM和CD3)上的给定靶表位或给定靶侧端的结构域。通常第一和第三或第二和第四结合结构域(例如识别CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、MSLN、或EpCAM)的结构和功能以及优选还有效应子结合结构域(通常是识别CD3的第二和第四或第一和第三结合结构域)的结构和/或功能是基于抗体(例如全长或完整免疫球蛋白分子)的结构和/或功能，和/或是从抗体或其片段的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)结构域中提取。优选地，一种或多种靶细胞表面抗原结合结构域的特征在于三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)的存在。效应(典型地CD3)结合结构域还优选包含允许靶标结合的抗体的最低结构要求。更优选地，第二结合结构域包含至少三个轻链CDR(即VL区的CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个重链CDR(即VH区的CDR1、CDR2和CDR3)。设想第一结合结构域和/或第二结合结构域是通过噬菌体展示或文库筛选方法产生或可获得的，而不是通过将CDR序列从预先存在的(单克隆)抗体移植到支架中产生或可获得的。
根据本发明，结合结构域呈一种或多种多肽的形式。此类多肽可以包括蛋白质部分和非蛋白质部分(例如化学接头或化学交联剂，如戊二醛)。蛋白质(包括其片段、优选生物活性片段和通常具有少于30个氨基酸的肽)包含经由共价肽键彼此偶联的两个或更多个氨基酸(产生氨基酸链)。
如本文使用的，术语“多肽”描述了一组分子，这些分子通常由超过30个氨基酸组成。多肽可以进一步形成多聚体，如二聚体、三聚体和更高级的寡聚物，即由多于一个多肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此，这种多聚体的相应高序结构称为同或异二聚体、同或异三聚体等。异多聚体的实例是抗体分子，其天然存在的形式由两条相同的多肽轻链和两条相同的多肽重链组成。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”也是指天然修饰的肽/多肽/蛋白质，其中修饰是例如通过翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)来实现。当在本文中提及时，“肽”、“多肽”或“蛋白质”也可以是化学修饰的，如聚乙二醇化。此类修饰在本领域中是熟知的并且在下文描述。
优选地，结合CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN和EpCAM中的任一个的结合结构域和/或结合CD3ε的结合结构域是人结合结构域。包含至少一种人结合结构域的抗体和抗原结合分子避免了与具有非人如啮齿动物(例如鼠、大鼠、仓鼠或兔)可变区和/或恒定区的抗体或抗原结合分子相关的一些问题。这种啮齿动物来源的蛋白质的存在可以导致抗体或抗原结合分子的快速清除，或者可以导致患者生成针对抗体或抗原结合分子的免疫应答。为了避免使用啮齿动物衍生的抗体或抗原结合分子，可以通过将人抗体功能引入到啮齿动物中以使啮齿动物产生完全人抗体来产生人或完全人抗体/抗原结合分子。
在酵母人工染色体YAC中克隆和重构兆碱基大小的人基因座并将它们引入到小鼠种系中的能力为阐明非常大或粗略定位的基因座的功能组分以及产生有用的人疾病模型提供了强有力的方法。此外，使用这种技术将小鼠基因座取代为其人等效物可以提供关于人基因产物在发育过程中的表达和调控、其与其他系统的通信以及其参与疾病诱导和进展的独特见解。
这种策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中内源性Ig基因已经失活的小鼠中提供了研究抗体的程序化表达和组装的根本机制以及其在B细胞发育中的作用的机会。此外，这种策略可以为完全人单克隆抗体(mAb)的产生提供理想来源-这是有助于实现抗体疗法在人疾病中的前景的重要里程碑。预期完全人抗体或抗原结合分子将小鼠或小鼠衍生的mAb所固有的免疫原性和变应性应答最小化，并且由此增加施用的抗体/抗原结合分子的功效和安全性。可以预期使用完全人抗体或抗原结合分子在治疗需要重复化合物施用的慢性和复发性人类疾病如炎症、自身免疫和癌症方面提供了显著优势。
实现这一目标的一种方法是用人Ig基因座的大片段工程化小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系，预期这种小鼠在不存在小鼠抗体的情况下将产生大的人抗体组库。大的人Ig片段将保持大的可变基因多样性以及对抗体产生和表达的适当调控。通过利用小鼠机构实现抗体多样化和选择以及缺乏对人蛋白质的免疫耐受性，在这些小鼠品系中再生的人抗体组库应产生针对任何目的抗原(包括人抗原)的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术，可以容易地产生和选择具有所希望特异性的抗原特异性人mAb。结合第一种XenoMouse小鼠品系的产生证明了这个一般策略(参见Green等人Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21(1994))。用含有人重链基因座和κ轻链基因座的分别245kb和190kb大小的种系构型片段的YAC工程化XenoMouse品系，这些种系构型片段含有核心可变区和恒定区序列。证明含有人Ig的YAC与小鼠系统相容以重排和表达抗体，并且能够取代失活的小鼠Ig基因。这通过其诱导B细胞发育、产生完全人抗体的成人样人组库和产生抗原特异性人mAb的能力来证明。这些结果还表明，引入含有更多数量的V基因、额外的调控元件和人Ig恒定区的更大部分的人Ig基因座可以基本上再现作为对感染和免疫的人体液应答的特征的完整组库。Green等人的工作最近扩展到通过分别引入兆碱基大小的人重链基因座和κ轻链基因座的种系构型YAC片段来引入大于大约80％的人抗体组库。参见Mendez等人Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156(1997)和美国专利申请序列号08/759,620。
XenoMouse动物的产生进一步论述和描绘于以下中：美国专利申请序列号07/466,008、序列号07/610,515、序列号07/919,297、序列号07/922,649、序列号08/031,801、序列号08/112,848、序列号08/234,145、序列号08/376,279、序列号08/430,938、序列号08/464,584、序列号08/464,582、序列号08/463,191、序列号08/462,837、序列号08/486,853、序列号08/486,857、序列号08/486,859、序列号08/462,513、序列号08/724,752和序列号08/759,620；和美国专利号6,162,963；6,150,584；6,114,598；6,075,181和5,939,598以及日本专利号3 068 180B2、3 068 506B2、和3 068 507B2。还参见Mendez等人Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156(1997)和Green和Jakobovits J.Exp.Med.[实验医学杂志]188:483-495(1998)、EP 0463 151B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310和WO 03/47336。
在一个可替代的方法中，包括真药物国际公司(GenPharm International,Inc.)的其他公司利用了“微基因座”方法。在微基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的碎片(单独的基因)来模拟外源性Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、mu恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成为用于插入到动物中的构建体。该方法描述于以下中：Surani等人的美国专利号5,545,807和美国专利号5,545,806；5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299、和6,255,458(各自为Lonberg和Kay)、Krimpenfort和Berns的美国专利号5,591,669和6,023.010、Berns等人的美国专利号5,612,205；5,721,367和5,789,215、以及Choi和Dunn的美国专利号5,643,763、以及真药物(GenPharm)国际美国专利申请序列号07/574,748、序列号07/575,962、序列号07/810,279、序列号07/853,408、序列号07/904,068、序列号07/990,860、序列号08/053,131、序列号08/096,762、序列号08/155,301、序列号08/161,739、序列号08/165,699、序列号08/209,741。还参见EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884以及美国专利号5,981,175。进一步参见Taylor等人(1992)、Chen等人(1993)、Tuaillon等人(1993)、Choi等人(1993)、Lonberg等人(1994)、Taylor等人(1994)、和Tuaillon等人(1995)、Fishwild等人(1996)。
Kirin也展示了从通过微细胞融合引入大段染色体或整个染色体的小鼠产生人抗体。参见欧洲专利申请号773 288和843 961。Xenerex Biosciences正在开发用于人抗体的潜在产生的技术。在这种技术中，用人淋巴细胞(例如B和/或T细胞)重构SCID小鼠。然后将小鼠用抗原免疫并且可产生针对抗原的免疫应答。参见美国专利号5,476,996；5,698,767；和5,958,765。
人抗小鼠抗体(HAMA)应答已经导致该行业制备嵌合或其他人源化抗体。然而，预期特别是在抗体的长期或多剂量利用中会观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)应答。因此，期望提供抗原结合分子，其包含针对CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN或EpCAM的人结合结构域和针对CD3ε的人结合结构域，以解决HAMA或HACA应答的问题和/或影响。
术语“与......(特异性)结合”、“(特异性)识别”、“(特异性)针对”和“与......(特异性)反应”意指根据本发明，结合结构域与靶分子(抗原)(此处：分别为CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM、和CD3ε作为效应物)上的给定表位或给定靶侧相互作用或特异性相互作用。
术语“表位”是指结合结构域(如抗体或免疫球蛋白，或抗体或免疫球蛋白的衍生物、片段或变体)特异性结合的抗原上的一侧。“表位”是抗原性的，并且因此术语表位在本文中有时也称为“抗原结构”或“抗原决定簇”。因此，结合结构域是“抗原相互作用侧”。所述结合/相互作用也被理解为定义“特异性识别”。
“表位”可以通过连续的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。“线性表位”是这样的表位，其中氨基酸一级序列包含所识别表位。线性表位典型地在独特的序列中包括至少3个或至少4个、且更通常地至少5个或至少6个或至少7个，例如约8个至约10个氨基酸。
与线性表位相反，“构象表位”是这样的表位，其中构成表位的氨基酸的一级序列不是所识别表位的唯一限定组分(例如，其中氨基酸的一级序列不一定被结合结构域识别的表位)。典型地，构象表位包含相对于线性表位增加数量的氨基酸。关于构象表位的识别，结合结构域识别抗原、优选肽或蛋白质或其片段的三维结构(在本发明的上下文下，一个结合结构域的抗原结构包括于靶细胞表面抗原蛋白质内)。例如，当蛋白质分子折叠以形成三维结构时，形成构象表位的某些氨基酸和/或多肽骨架并置，使得抗体能够识别表位。确定表位构象的方法包括但不限于x射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)光谱学和定点自旋标记和电子顺磁共振(EPR)光谱学。
以下描述了用于表位定位的方法：当人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM蛋白质中的区域(连续氨基酸区段)与其非人和非灵长类动物CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM(例如，小鼠CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM，但也可以想象例如鸡、大鼠、仓鼠、兔等其他动物)的相应区域交换或替换时，预期发生结合结构域的结合降低，除非结合结构域对于所使用的非人、非灵长类动物CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN或EpCAM具有交叉反应性。相比于与人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM蛋白中的对应区域的结合，所述降低优选地为至少10％、20％、30％、40％、或50％，更优选至少60％、70％或80％，并且最优选90％、95％或甚至100％，由此将与人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM蛋白中对应区域的结合设定为100％。设想前述人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM/非人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM嵌合体在CHO细胞中表达。还设想人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM/非人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM嵌合体与不同膜结合蛋白(如EpCAM)的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合。
在表位定位的替代性或另外的方法中，可以生成几种截短形式的人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM细胞外结构域，以确定由结合结构域识别的特异性区域。在这些截短形式中，不同的细胞外CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM结构域/亚结构域或区域从N末端开始逐步缺失。设想截短的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM形式可以在CHO细胞中表达。还设想截短的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM形式可以与不同膜结合蛋白(例如EpCAM)的跨膜结构域和/或细胞质结构域融合。还设想截短的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM形式可以在其N末端涵盖信号肽结构域，例如衍生自小鼠IgG重链信号肽的信号肽。此外设想，截短的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM形式可以在其N末端(在信号肽后)涵盖v5结构域，这允许验证其在细胞表面上的正确表达。预期那些截短的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM形式会发生结合的降低或丧失，这些截短的形式不再包含结合结构域所识别的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM区。结合降低优选地为至少10％、20％、30％、40％、50％；更优选地至少60％、70％、80％，并且最优选地90％、95％或甚至100％，由此将与整个人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM蛋白(或其细胞外区域或结构域)的结合设定为100。
确定CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN或EpCAM的特定残基对抗原接合分子或结合结构域的识别的贡献的另一种方法是丙氨酸扫描(参见，例如MorrisonKL和Weiss GA.Cur Opin Chem Biol.[化学生物学新见]2001年6月；5(3):302-7)，其中待分析的每个残基例如经由定点诱变被丙氨酸替代。丙氨酸的使用是因为其具有非巨大的、化学惰性的甲基官能团，但仍然模仿许多其他氨基酸所具有的二级结构参考。在需要保守突变残基的大小的情形下，有时可以使用巨大的氨基酸(如缬氨酸或亮氨酸)。丙氨酸扫描是一项已经使用了很长一段时间的成熟技术。
结合结构域与表位或包含表位的区之间的相互作用意味着结合结构域对特定蛋白或抗原(此处：分别为CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN或EpCAM和CD3)上的表位/包含表位的区表现出可观的亲和力，并且通常与CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM或CD3以外的蛋白质或抗原不表现出显著反应性。“可观的亲和力”包括以约10-6M(KD)或更强的亲和力结合。优选地，当结合亲和力为约10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M，优选约10-11至10-9M时，结合被认为是特异性的。结合结构域是否与靶标特异性地反应或结合可以尤其通过以下方式容易地测试：比较所述结合结构域与靶蛋白或抗原的反应与所述结合结构域与除CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM或CD3以外的蛋白质或抗原的反应。优选地，本发明的结合结构域实质上或基本上不结合至靶细胞表面抗原CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM或CD3以外的蛋白质或抗原(即，第一结合结构域不能结合至CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM以外的蛋白质，并且第二结合结构域不能结合至CD3以外的蛋白质)。根据本发明的抗原结合分子的设想特征是与其他HLE形式相比具有优异的亲和力特征。因此，这种优异的亲和力表明体内半衰期延长。根据本发明的抗原结合分子的较长半衰期可以减少施用的持续时间和频率，这典型地有助于改善患者依从性。这是特别重要的，因为本发明的抗原结合分子对高度虚弱或甚至多病态癌症患者特别有益。
术语“实质上/基本上不结合”或“不能结合”意味着，本发明的结合结构域不结合作为效应物的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM或CD3以外的蛋白质或抗原，即不显示大于30％，优选地不超过20％，更优选地不超过10％，特别优选地不超过9％、8％、7％、6％或5％的与作为效应物的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM或CD3以外的蛋白质或抗原的反应性，由此将与作为效应物的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CDH3、MSLN、或EpCAM或CD3的结合分别设定为100％。
据信特异性结合是通过结合结构域和抗原的氨基酸序列中的特定基序实现的。因此，由于其一级、二级和/或三级结构以及所述结构的二次修饰，因此实现了结合。抗原相互作用侧端与其特异性抗原的特异性相互作用可以导致所述侧端与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用侧端与其特异性抗原的特异性相互作用可以可替代地或另外地导致信号的引发，例如由于诱导抗原构象的变化、抗原的寡聚化等。
术语“可变”是指抗体或免疫球蛋白结构域表现出其序列可变性并且参与确定特定抗体的特异性和结合亲和力的部分(即“一个或多个可变结构域”)。可变重链(VH)和可变轻链(VL)的配对一起形成单一抗原结合位点。
可变性在整个抗体的可变结构域中并不均匀分布；它集中在重链可变区和轻链可变区中的每一个的子结构域中。这些子结构域被称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的更保守的(即非高变)部分被称为“框架”区(FRM或FR)，并且为三维空间中的六个CDR提供支架以形成抗原结合表面。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，这四个FRM区域主要使用β-折叠构型，通过三个高变区连接，这三个高变区形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FRM紧密靠近在一起，并与来自另一条链的高变区一起有助于抗原结合侧端的形成(参见Kabat等人,上述引文)。
术语“CDR”及其复数“CDR”是指其中三个构成轻链可变区的结合特征(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)并且三个构成重链可变区的结合特征(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的互补决定区。CDR含有大部分负责抗体与抗原特异性相互作用的残基，并且因此有助于抗体分子的功能活性：它们是抗原特异性的主要决定簇。
准确定义的CDR边界和长度受制于不同的分类和编号系统。因此，CDR可以通过Kabat、Chothia、contact或任何其他边界定义(包括本文所述的编号系统)来引用。尽管有不同的边界，但这些系统中的每一者在构成可变序列内所谓的“高变区”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可以相对于相邻框架区在长度和边界区域方面不同。参见，例如Kabat(一种基于跨物种序列变异性的方法)、Chothia(一种基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法)和/或MacCallum(Kabat等人,上述引文；Chothia等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1987,196:901-917；和MacCallum等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,262:732)。表征抗原结合侧端的又另一标准是由牛津大学分子公司(Oxfbrd Molecular)的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。参见例如，Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains[抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析]在：Antibody Engineering Lab Manual[抗体工程实验室手册](编辑：Duebel,S.和Kontermann,R.，Springer-Verlag[施普林格出版社],海德尔堡)。就两种残基鉴定技术定义重叠区而非相同区而言，可以将它们组合以定义杂合CDR。然而，根据所谓的Kabat系统进行编号是优选的。
典型地，CDR形成可以分类为规范结构的环结构。术语“规范结构”是指由抗原结合(CDR)环所使用的主链构象。从比较结构研究中，已经发现六个抗原结合环中的五个仅具有有限的可用构象组库。每个规范结构可以通过多肽骨架的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可具有非常类似的三维结构，但环中大部分具有高氨基酸序列变异性(Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.[分子生物学杂志],1987,196:901；Chothia等人,Nature[自然],1989,342:877；Martin和Thornton,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,263:800)。此外，所使用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类别的构象由环的长度和位于环内以及保守框架内(即，环外)关键位置的氨基酸残基决定。因此，可以基于这些关键氨基酸残基的存在来进行对特定规范类别的分配。
术语“规范结构”还可以包括关于抗体的线性序列的考虑因素，例如，如通过Kabat(Kabat等人,上述引文)编目的。Kabat编号方案(系统)是以一致方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的广泛使用的标准，并且是本发明应用的优选方案，也如本文其他地方所提及。另外的结构考虑因素也可以用于确定抗体的规范结构。例如，Kabat编号未完全反映的那些差异可以通过Chothia等人的编号系统来描述，和/或通过其他技术(例如结晶学和二维或三维计算建模)来揭示。因此，可以将给定的抗体序列置于规范类别中，该类别尤其允许鉴定适当的基础结构(chassis)序列(例如，基于在文库中包括多种规范结构的期望)。文献中描述了抗体氨基酸序列的Kabat编号和如由Chothia等人，上述引文所述的结构考虑因素以及其对解释抗体结构的规范方面的意义。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型在本领域中是熟知的。有关抗体结构的综述，参见Antibodies:A LaboratoryManual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Harlow等人编辑,1988。
轻链的CDR3以及特别是重链的CDR3可以构成轻链可变区和重链可变区内抗原结合中最重要的决定簇。在一些抗原结合分子中，重链CDR3似乎构成抗原与抗体之间主要的接触区域。其中单独改变CDR3的体外选择方案可以用于改变抗体的结合特性或确定哪些残基有助于抗原的结合。因此，CDR3典型地是抗体结合侧端内分子多样性的最大来源。例如，H3可以短至两个氨基酸残基或多于26个氨基酸。
在经典的全长抗体或免疫球蛋白中，每条轻(L)链通过一个共价二硫键与重(H)链连接，而两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接，这取决于H链同种型。最靠近VH的CH结构域通常命名为CH1。恒定(“C”)结构域不直接参与抗原结合，但表现出各种效应子功能，如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体激活。抗体的Fc区包括在重链恒定结构域内，并且例如能够与位于细胞表面的Fc受体相互作用。
组装和体细胞突变后的抗体基因的序列高度改变，并且估计这些改变的基因编码1010种不同抗体分子(Immunoglobulin Genes[免疫球蛋白基因],第2版,Jonio等人编辑,Academic Press[学术出版社],San Diego,CA[加利福尼亚州圣地亚哥],1995)。因此，免疫系统提供了免疫球蛋白组库。术语“组库”是指完全或部分衍生自至少一种编码至少一种免疫球蛋白的序列的至少一种核苷酸序列。一种或多种序列可以通过重链的V、D和J区段以及轻链的V和J区段的体内重排来产生。可替代地，一种或多种序列可以响应于发生重排，例如体外刺激而从细胞产生。可替代地，一种或多种序列的一部分或全部可以通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变和其他方法获得，参见例如美国专利5,565,332。组库可以仅包括一种序列或可以包括多种序列，包括遗传多样性集合中的序列。
术语“Fc部分”或“Fc单体”关于本发明意指包含至少一个具有CH2结构域功能的结构域和至少一个具有免疫球蛋白分子的CH3结构域功能的结构域的多肽。从术语“Fc单体”显而易见，包含那些CH结构域的多肽是“多肽单体”。Fc单体可以是至少包含排除重链的第一恒定区免疫球蛋白结构域(CH1)的免疫球蛋白恒定区的片段，但至少保持一个CH2结构域的功能部分和一个CH3结构域的功能部分的多肽，其中CH2结构域在CH3结构域的氨基末端。在这个定义的优选方面中，Fc单体可以是包含Ig-Fc铰链区、CH2区和CH3区的一部分的多肽恒定区，其中铰链区在CH2结构域的氨基末端。设想本发明的铰链区促进二聚化。例如但不限于，此类Fc多肽分子可以通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白区(当然产生两个Fc多肽的二聚体)获得。在这个定义的另一方面中，Fc单体可以是包含CH2区和CH3区的一部分的多肽区。例如但不限于，此类Fc多肽分子可以通过胃蛋白酶消化免疫球蛋白分子获得。在一个实施例中，Fc单体的多肽序列基本上类似于以下的Fc多肽序列：IgG1 Fc区、IgG2Fc区、IgG3 Fc区、IgG4 Fc区、IgM Fc区、IgA Fc区、IgD Fc区和IgE Fc区。(参见，例如Padlan,MolecularImmunology[分子免疫学],31(3),169-217(1993))。因为免疫球蛋白之间存在一些变化，并且仅为了清楚起见，所以Fc单体是指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个重链恒定区免疫球蛋白结构域。如上所提及，Fc单体还可以包括在这些结构域的N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc单体可以包括J链。对于IgG，Fc部分包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及前两个结构域与CH2之间的铰链。尽管Fc部分的边界可以改变，但包含功能铰链、CH2和CH3结构域的人IgG重链Fc部分的实例可以定义为例如包含残基D231(铰链结构域的残基-对应于下表1中的D234)至CH3结构域的羧基末端的P476，分别地L476(对于IgG4)，其中编号是根据Kabat的编号。经由肽接头彼此融合的两个Fc部分或Fc单体是本发明抗原结合分子的两个双特异性实体之间的间隔物的优选示例，其也可被定义为scFc结构域。
在本发明的一个实施例中，设想如本文披露的scFc结构域，即对应地彼此融合的Fc单体仅包含在抗原结合分子的间隔物中。
根据本发明，可以使用表1中列出的Kabat编号通过类推来鉴定IgG铰链区。与上述一致，设想对于本发明的铰链结构域/区，最低要求包含对应于根据Kabat编号的D231 D234至P243的IgG1序列区段的氨基酸残基。同样设想，本发明的铰链结构域/区包含IgG1铰链序列DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:330)(对应于如下表1所示的区段D234至P243-也设想所述序列的变体，前提是铰链区仍然促进二聚化)或由该IgG1铰链序列组成。在本发明优选的实施例中，抗原结合分子的间隔物中CH2结构域的Kabat位置314处的糖基化位点通过N314X取代去除，其中X是除Q之外的任何氨基酸。所述取代优选为N314G取代。在更优选的实施例中，所述CH2结构域另外包含以下取代(根据Kabat的位置)：V321C和R309C(这些取代在Kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫桥)。
还设想本发明的抗原结合分子的间隔物是以氨基至羧基顺序包含以下或由以下组成的scFc结构域：DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:330)(即铰链)-CH2-CH3-接头-DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:330)(即铰链)-CH2-CH3。在优选的实施例中，上述抗原结合分子的肽接头的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser(SEQ ID NO:7)，或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x为5或更大的整数(例如5、6、7、8等或更大)，优选为6((Gly4Ser)6)。所述构建体可以进一步包含上述取代N314X、优选N314G和/或另外的取代V321C和R309C。在如上文所定义的本发明的抗原结合分子的优选实施例中，设想第二结构域结合人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位。表1：铰链区的氨基酸残基的Kabat编号
Figure BDA0004213953400000591
在本发明的另外实施例中，铰链结构域/区域包含或由以下组成：IgG2亚型铰链序列ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:331)、IgG3亚型铰链序列ELKTPLDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:332)或ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:333)和/或IgG4亚型铰链序列ESKYGPPCPSCP(SEQ IDNO:444)。IgG1亚型铰链序列可以是以下一种EPKSCDKTHTCPPCP(如表1和SEQ ID NO:445中所示)。因此，在本发明的上下文中也设想了这些核心铰链区。
IgG CH2和IgG CD3结构域的位置和序列可以使用表2中列出的Kabat编号通过类推来鉴定：
表2：IgG CH2和CH3区域的氨基酸残基的Kabat编号
Figure BDA0004213953400000601
在本发明的一个实施例中，使第一或两个Fc单体的CH3结构域中粗体强调的氨基酸残基缺失。
间隔物的多肽单体(“Fc部分”或“Fc单体”)彼此融合的肽接头优选包含至少25个氨基酸残基(25、26、27、28、29、30等)。更优选地，这个肽接头包含至少30个氨基酸残基(30、31、32、33、34、35等)。还优选地，接头包含至多40个氨基酸残基、更优选地至多35个氨基酸残基、最优选地恰好30个氨基酸残基。这种肽接头的优选实施例的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser(SEQ ID NO:7)，或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x为5或更大的整数(例如6、7或8)。优选地，整数为6或7，更优选地整数为6。
在使用接头来将第一结构域与第二结构域、和/或第三结构域与第四结构域、和/或第二和第三结构域与间隔物融合的情况下，该接头优选地具有足以确保第一结构域和第二结构域中的每一者均可以彼此独立地保留其差异结合特异性的长度和序列。对于连接本发明的抗原结合分子中至少两个结合结构域(或两个可变结构域)的肽接头，优选那些仅包含少量氨基酸残基例如12个氨基酸残基或更少的肽接头。因此，12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽接头是优选的。设想的具有少于5个氨基酸的肽接头包含4、3、2或1个氨基酸，其中富含Gly的接头是优选的。用于融合第一结构域和第二结构域的肽接头的优选的实施例在SEQ ID NO:1中描绘。用于将第二和第三结构域融合到间隔物的肽接头的优选接头实施例是(Gly)4-接头，也称为G4-接头。
在上述一种“肽接头”的上下文中特别优选的“单一”氨基酸是Gly。因此，所述肽接头可以由单一氨基酸Gly组成。在本发明的优选实施例中，肽接头的特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser(SEQ ID NO:1)，或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x为1或更大的整数(例如2或3)。优选的接头在SEQ ID NO:1至12中描绘。包括不促进二级结构的所述肽接头的特征是本领域中已知的并且描述于例如Dall’Acqua等人(Biochem.[生物化学](1998)37,9266-9273)、Cheadle等人(Mol Immunol[分子免疫学](1992)29,21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB[美国实验生物学联合会会志](1995)9(1),73-80)中。此外不促进任何二级结构的肽接头是优选的。所述结构域彼此的连接可以例如通过基因工程提供，如实例中所述。用于制备融合的且可操作地连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法是本领域中熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor,New York[纽约冷泉港],2001)。
在本发明的抗原结合分子的优选实施例中，第一结构域和第二结构域以选自下组的形式形成抗原结合分子，该组由以下组成：(scFv)2、scFv-单结构域mAb、双抗体和这些形式中的任一种的寡聚物。
根据特别优选的实施例，并如所附实例所记载，本发明的抗原结合分子的第一结构域和第二结构域是“双特异性单链抗原结合分子”、更优选地双特异性“单链Fv”(scFv)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但使用重组方法可以将他们通过合成接头接合，如上文所述，该合成接头使它们能够制得为单条蛋白质链，其中VL和VH区配对以形成单价分子；参见，例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且按照与完整或全长抗体相同的方式评价片段的功能。因此，单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，通常利用约10至约25个氨基酸，优选地约15至20个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔韧性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以连接VH的N末端和VL的C末端，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白质保留了原始免疫球蛋白的特异性。
双特异性单链抗原结合分子在本领域中是已知的并描述于以下中：WO 99/54440；Mack,J.Immunol.[免疫学杂志](1997),158,3965-3970；Mack,PNAS[美国国家科学院院刊],(1995),92,7021-7025；Kufer,Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫治疗],(1997),45,193-197；
Figure BDA0004213953400000621
Blood[血液],(2000),95,6,2098-2103；Brühl,Immunol.[免疫学],(2001),166,2420-2426；Kipriyanov,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],(1999),293,41-56。描述的用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778；Kontermann和Dübel(2010),上述引文和Little(2009),上述引文)可以适用于产生特异性识别一种或多种所选择的靶标的单链抗原结合分子。
二价(bivalent)(也称为双价(divalent))或双特异性单链可变片段(具有形式(scFv)2的二-scFv或双-scFv)可以通过连接两个scFv分子(例如利用如上文所述的接头)来工程化。如果这两个scFv分子具有相同的结合特异性，则所得(scFv)2分子将优选称为二价的(即，对于相同的靶表位具有两个价)。如果两个scFv分子具有不同的结合特异性，则所得(scFv)2分子将优选称为双特异性的。连接可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单条肽链从而产生串联scFv来进行(参见例如，Kufer P.等人,(2004)Trends inBiotechnology[生物技术趋势]22(5):238-244)。另一种可能性是产生具有接头肽的scFv分子，这些接头肽对于两个可变区来说太短以致于不能折叠在一起(例如约五个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体(参见例如，Hollinger,Philipp等人,(1993年7月)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica[美国国家科学院院刊]90(14):6444-8)。
根据本发明，第一结构域、第二结构域或第一结构域和第二结构域可以包含单结构域抗体，分别地单结构域抗体的可变结构域或至少CDR。单结构域抗体仅包含一个(单体)抗体可变结构域，该抗体可变结构域能够独立于其他V区或结构域而选择性结合特定抗原。第一单结构域抗体是从骆驼中发现的重链抗体工程化而来，并且这些被称为VHH片段。软骨鱼类也具有重链抗体(IgNAR)，可以从这些重链抗体中获得称为VNAR片段的单结构域抗体。可替代的方法是将来自常见免疫球蛋白，例如来自人或啮齿动物的二聚体可变结构域分裂成单体，因此获得作为单结构域Ab的VH或VL。尽管对单结构域抗体的大多数研究目前都是基于重链可变结构域，但是也已经显示衍生自轻链的纳米抗体特异性结合靶表位。单结构域抗体的实例是所谓的sdAb、纳米抗体或单可变结构域抗体。
因此，(单结构域mAb)2是由(至少)两种单结构域单克隆抗体构成的单克隆抗原结合分子，这些单结构域单克隆抗体单独地选自包含VH、VL、VHH和VNAR的组。接头优选呈肽接头的形式。类似地，“scFv单结构域mAb”是由如上所述的至少一种单结构域抗体和如上所述的一种scFv分子构成的单克隆抗原结合分子。同样，接头优选呈肽接头的形式。
可以在竞争测定(如竞争性ELISA或基于细胞的竞争测定)中确定抗原结合分子是否竞争与另一给定抗原结合分子的结合。也可以使用抗生物素蛋白偶联的微粒(珠粒)。与抗生物素蛋白涂覆的ELISA板类似，当与生物素化蛋白质反应时，这些珠粒中的每一个都可用作可在其上进行测定的底物。将抗原涂覆在珠粒上，并且然后用第一抗体预涂覆。添加第二抗体并且确定任何另外的结合。用于读出的可能手段包括流式细胞术。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥核心作用的一类淋巴细胞(其本身是一类白细胞)。有若干个T细胞亚组，每个亚组具有不同的功能。T细胞可以通过细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而与其他淋巴细胞(诸如B细胞和NK细胞)区分开。TCR负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原，并且由两种不同的蛋白质链构成。在95％的T细胞中，TCR由阿尔法(α)和贝塔(β)链组成。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC复合物)接合时，T淋巴细胞通过一系列由相关酶、共受体、特化衔接分子和激活或释放的转录因子介导的生物化学事件而被激活。
CD3受体复合物是一种蛋白质复合物，并且由四条链构成。在哺乳动物中，复合物含有CD3γ(伽马)链、CD3δ(德尔塔)链和两条CD3ε(伊普西龙)链。这些链与T细胞受体(TCR)和所谓的ζ(zeta)链缔合以形成T细胞受体CD3复合物并在T淋巴细胞中生成激活信号。CD3γ(伽马)、CD3δ(德尔塔)和CD3ε(伊普西龙)链是含有单一细胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3分子的细胞内尾含有对于TCR的信号传导能力所必需的单一保守基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或简称ITAM。CD3ε分子是多肽，该多肽在人中由位于染色体11上的CD3E基因编码。CD3ε的最优选的表位包括在人CD3ε细胞外结构域的氨基酸残基1-27内。设想根据本发明的抗原结合分子典型地且有利地显示较少的非特异性T细胞激活，这在特异性免疫疗法中是不希望的。这意味着副作用的风险降低。
经由多靶向性、至少双特异性抗原结合分子募集T细胞对靶细胞的重定向裂解涉及溶细胞突触形成以及穿孔素和颗粒酶的递送。接合的T细胞能够连续靶细胞溶解，并且不受干扰肽抗原加工和呈递或克隆T细胞分化的免疫逃逸机制的影响；参见例如，WO 2007/042261。
可以以各种方式测量由本发明的抗原结合分子介导的细胞毒性。效应细胞可以是例如刺激的富集的(人)CD8阳性T细胞或未刺激的(人)外周血单核细胞(PBMC)。如果靶细胞是猕猴起源的或表达的或用第一结构域结合的猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM转染，则效应细胞也应是猕猴起源的，如猕猴T细胞系，例如4119LnPx。靶细胞应该表达CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM，例如人或猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM(的至少细胞外结构域)。靶细胞可以是用CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM，例如人或猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM稳定地或瞬时地转染的细胞系(如CHO)。通常，预计EC50值较低，其中靶细胞系在细胞表面表达较高水平的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM。效应细胞与靶细胞(E:T)比率通常为约10:1，但也可以改变。CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM双特异性抗原结合分子的细胞毒活性可以在51Cr-释放测定(约18小时的孵育时间)或在基于FACS的细胞毒性测定(约48小时的孵育时间)中测量。也可能对测定孵育时间(细胞毒性反应)进行修改。其他测量细胞毒性的方法对本领域技术人员来说是熟知的，并且包括MTT或MTS测定、基于ATP的测定(包括生物发光测定)、磺基罗丹明B(SRB)测定、WST测定、克隆生成测定和ECIS技术。
由本发明的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性抗原结合分子介导的细胞毒活性优选地在基于细胞的细胞毒性测定中测量。其也可以在51Cr-释放测定中测量。该细胞毒活性由EC50值表示，其对应于半数最大有效浓度(诱导在基线与最大值中间的细胞毒性反应的抗原结合分子的浓度)。优选地，CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性抗原结合分子的EC50值≤5000pM或≤4000pM、更优选地≤3000pM或≤2000pM、甚至更优选地≤1000pM或≤500pM、甚至更优选地≤400pM或≤300pM、甚至更优选地≤200pM、甚至更优选地≤100pM、甚至更优选地≤50pM、甚至更优选地≤20pM或≤10pM、以及最优选地≤5pM。
上述给定的EC50值可以在不同的测定中测量。本领域技术人员知道，当使用刺激/富集的CD8+T细胞作为效应细胞时，与未刺激的PBMC相比，可以预期EC50值较低。此外可以预期，与低靶表达大鼠相比，当靶细胞表达大量CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM时EC50值较低。例如，当使用刺激/富集的人CD8+T细胞作为效应细胞(并且使用CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM转染的细胞如CHO细胞或CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM阳性人细胞系作为靶细胞)时，CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性抗原结合分子的EC50值优选地≤1000pM、更优选地≤500pM、甚至更优选地≤250pM、甚至更优选地≤100pM、甚至更优选地≤50pM、甚至更优选地≤10pM、以及最优选地≤5pM。当使用人PBMC作为效应细胞时，CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性抗原结合分子的EC50值优选地≤5000pM或≤4000pM(特别是当靶细胞是CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM人细胞系时)、更优选地≤2000pM(特别是当靶细胞是CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM转染的细胞如CHO细胞时)、更优选地≤1000pM或≤500pM、甚至更优选地≤200pM、甚至更优选地≤150pM、甚至更优选地≤100pM、以及最优选地≤50pM或更低。当使用猕猴T细胞系如LnPx4119作为效应细胞并且使用猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM转染的细胞系如CHO细胞作为靶细胞系时，CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性抗原结合分子的EC50值优选地≤2000pM或≤1500pM、更优选地≤1000pM或≤500pM、甚至更优选地≤300pM或≤250pM、甚至更优选地≤100pM、以及最优选地≤50pM。
优选地，本发明的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性抗原结合分子不诱导/介导裂解或基本上不诱导/介导CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM阴性细胞(例如CHO细胞)的裂解。术语“不诱导裂解”、“基本上不诱导裂解”、“不介导裂解”或“基本上不介导裂解”意指本发明的抗原结合分子诱导或介导CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM阴性细胞不超过30％的裂解、优选地不超过20％、更优选地不超过10％、特别优选地不超过9％、8％、7％、6％或5％，由此CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM阳性人细胞系的裂解设定为100％。这通常适用于浓度高达500nM的抗原结合分子。本领域技术人员知道如何毫不费力地测量细胞溶解。此外，本说明书教导了如何测量细胞溶解的具体说明。
单独CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性抗原结合分子的单体和二聚体同种型之间的细胞毒活性的差异被称为“效力差距(potencygap)”。该效能差距可以例如计算为分子的单体与二聚体形式的EC50值之间的比率。本发明的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性抗原结合分子的效力差距优选地≤5、更优选地≤4、甚至更优选地≤3、甚至更优选地≤2、以及最优选地≤1。
本发明的抗原结合分子的第一、第二、第三和/或第四结合结构域优选地对灵长类动物的哺乳动物目成员具有跨物种特异性。种间特异性CD3结合结构域是例如本文和WO2008/119567中描述的那些。根据一个实施例，第一结合结构域和/或第三结合结构域除了分别结合至人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM和人CD3以外，还将结合至灵长类动物的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM/CD3，这些灵长类动物包括(但不限于)新大陆灵长类动物(如绒毛猴、绒顶柽柳猴或松鼠猴)、旧大陆灵长类动物(如狒狒和猕猴)、长臂猿和非人人亚科。
在本发明的抗原结合分子的一个实施例中，第一结构域与人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM结合并且进一步与猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM，如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM结合，以及更优选地，与在细胞(例如像CHO或293细胞)表面表达的猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM结合。第一结构域对CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM、优选对人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM的亲和力优选地≤100nM或≤50nM、更优选地≤25nM或≤20nM、更优选地≤15nM或≤10nM、甚至更优选地≤5nM、甚至更优选地≤2.5nM或≤2nM、甚至更优选地≤1nM，甚至更优选地≤0.6nM、甚至更优选地≤0.5nM、以及最优选地≤0.4nM。亲和力可以例如在BIAcore测定或Scatchard测定中测量。测定亲和力的其他方法也是本领域技术人员熟知的。第一结构域对猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM的亲和力优选地≤15nM、更优选地≤10nM、甚至更优选地≤5nM、甚至更优选地≤1nM、甚至更优选地≤0.5nM、甚至更优选地≤0.1nM、以及最优选地≤0.05nM或甚至≤0.01nM。
优选地，根据本发明的抗原结合分子对结合猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM对比人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM[ma CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM:hu CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM的亲和力差距(如例如通过表面等离子体共振分析如BiaCoreTM或通过Scatchard分析确定)<100、优选地<20、更优选地<15、进一步优选地<10、甚至更优选地<8、更优选地<6以及最优选地<2。根据本发明的抗原结合分子对结合猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM对比人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM的亲和力差距的优选范围在0.1与20之间、更优选地在0.2与10之间、甚至更优选地在0.3与6之间、甚至更优选地在0.5与3之间或在0.5与2.5之间、以及最优选地在0.5与2之间或在0.6与2之间。
本发明的抗原结合分子的第二和第四结合结构域通常结合人CD3ε和/或猕猴CD3ε。在实现选择性差距的优选实施例中，第二和第四结合结构域，可替代地第一和第三结合结构域进一步结合普通狨、棉冠獠狨或松鼠猴CD3ε。狨毛猴和绒顶柽柳猴两者均是属于狨亚科(Callitrichidae)的新大陆灵长类动物，而松鼠猴是属于悬猴科(Cebidae)的新大陆灵长类动物。所述结合结构域可以优选地选自本文中标识为“I2L”(或同义地“I2L0”)、“I2M”和“I2M2”的序列，更优选地为“I2L”或“I2L0”。
对于本发明的抗原结合分子优选的是，与人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位结合的优选第二和第四结合结构域包含含有选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区：
(a)包含选自SEQ ID NO 40至42、48至50、56至58、64至66、72至74439至441，优选64至66的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:27中所描绘的CDR-L1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:28中所描绘的CDR-L2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:29中所描绘的CDR-L3；
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:117中所描绘的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:118中所描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:119中所描绘的CDR-L3；
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:153中所描绘的CDR-L1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:154中所描绘的CDR-L2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:155中所描绘的CDR-L3；以及
(e)包含SEQ ID NO 420至422的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL区。
在本发明的抗原结合分子的进一步优选的实施例中，与人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位结合的优选第二和第四结合结构域包含含有选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区：
(a)包含选自SEQ ID NO 37至39、45至47、53至55、61至63、69至71和436至438，优选61至63的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:12中所描绘的CDR-H1，如WO 2008/119567的SEQ ID NO:13中所描绘的CDR-H2以及如WO 2008/119567的SEQ ID NO:14中所描绘的CDR-H3；
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:30中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:31中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:32中所描绘的CDR-H3；
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:48中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:49中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:50中所描绘的CDR-H3；
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:66中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:67中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:68中所描绘的CDR-H3；
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:84中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:85中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:86中所描绘的CDR-H3；
(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:102中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:103中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:104中所描绘的CDR-H3；
(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:120中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:121中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:122中所描绘的CDR-H3；
(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:138中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:139中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:140中所描绘的CDR-H3；
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:156中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:157中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:158中所描绘的CDR-H3；
(k)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:174中所描绘的CDR-H1、如WO 2008/119567的SEQ ID NO:175中所描绘的CDR-H2和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:176中所描绘的CDR-H3；以及
(l)包含SEQ ID NO 423至425的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH区。
在本发明的抗原结合分子的优选实施例中，将上述三组VL CDR与第三结合结构域内的上述十组VH CDR组合以形成(30)组，每组包含CDR-L 1-3和CDR-H 1-3。
优选的是，对于本发明的抗原结合分子，与CD3结合的第三结构域包含选自下组的VL区，该组由以下组成：WO 2008/119567的SEQ ID NO:17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179或183中所描绘的或优选地，根据本发明的SEQ IDNO:44、52、60、68和76中所描绘的，优选68。
还优选的是，与CD3结合的第三结构域包含选自下组的VH区，该组由以下组成：WO2008/119567的SEQ ID NO:15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中所描绘的或优选地，根据本发明的SEQ ID NO:SEQ ID NO 43、51、59、67和75中所描绘的，优选67。
更优选地，本发明的抗原结合分子的特征在于结合包含选自下组的VL区和VH区的CD3的优选第二和第四结构域，该组由以下组成：
(a)选自SEQ ID NO 44、52、60、68、76和443的VL区，和选自SEQ ID NO 43、51、59、67、75和442的VH区；
(b)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:17或21中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:15或19中所描绘的VH区；
(c)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:35或39中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:33或37中所描绘的VH区；
(d)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:53或57中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:51或55中所描绘的VH区；
(e)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:71或75中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:69或73中所描绘的VH区；
(f)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:89或93中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:87或91中所描绘的VH区；
(g)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:107或111中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:105或109中所描绘的VH区；
(h)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:125或129中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:123或127中所描绘的VH区；
(i)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:143或147中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:141或145中所描绘的VH区；
(j)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:161或165中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:159或163中所描绘的VH区；以及
(k)如WO 2008/119567的SEQ ID NO:179或183中所描绘的VL区和如WO 2008/119567的SEQ ID NO:177或181中所描绘的VH区。
关于本发明的抗原结合分子还优选的是，与CD3结合的第二结构域和第四结构域包含如SEQ ID NO:68中所描绘的VL区和如SEQ ID NO:67中所描绘的VH区。
根据本发明的抗原结合分子的优选实施例，第一结构域和/或第三结构域具有以下形式：VH区和VL区的对是呈单链抗体(scFv)的形式。VH和VL区以VH-VL或VL-VH的顺序排列。优选的是，VH区位于接头序列的N末端，并且VL区位于接头序列的C末端。
本发明进一步提供了抗原结合分子，其包含或具有选自由以下组成的组的氨基酸序列(完整双特异性抗原结合分子)：673、676、679、682、685、688、691、694、697、700、703、706、709、712、715、718、721、724、727、730、733、736、739、742、745、748、751、754、757、760、763、766、769、772、775、778、781、784、787、790、793、796、799、802、805、808、811、814、817、820、823、826、829、832、835、838、841、844、847、850、853、856、859、862、865、868、871、1437、1440、1443、1446、1449、1452、1455、1458、1461、1464、1467、1470、1473、1476、1479、1482、1485、1488、1499、1667、1670、1673、1676、1679、1682、1685、1688、1691、1694、1697、1700、1703、1706、1709、1712、1715、1718、1721、1724、1727、1730、1733、1736、1739、1742、1745、1748、1751、1754、1757、1760、1763、1766、1769、1772、1775、1778、1781、1784、1787、1790、1793、1796、1799、1802、1805、1808、1811、1814、1817、1820、1823、1826、和1829，优选1437，或具有与所述序列具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
抗原结合分子的共价修饰也包括在本发明的范围内，并且通常但不总是在翻译后进行。例如，通过使抗原结合分子的特定氨基酸残基与能够与选择的侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗原结合分子的几种类型的共价修饰引入分子中。
半胱氨酰残基最常见地与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙酰酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应来衍生出。
组氨酰残基是通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应衍生出，因为这种制剂对组氨酰侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；优选在0.1M二甲胂酸钠中在pH 6.0下进行反应。赖氨酰残基和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。用这些药剂衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的效应。用于衍生含α-氨基的残基的其他适合试剂包括亚氨酸酯，如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；硼氢化氯；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4-戊二酮；以及转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。
精氨酰残基通过与一种或若干种常规试剂(其中苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮)反应而被修饰。由于胍官能团的高pKa，因此精氨酸残基的衍生化要求反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基基团反应。
可以对酪氨酰残基进行特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入到酪氨酰残基中。最常见地，将N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。使用125I或131I碘化酪氨酰残基以制备用于放射免疫测定的标记蛋白质，上述氯胺T法是适合的。
羧基侧基团(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R'—N＝C＝N--R')反应而被选择性地修饰，其中R和R'任选地为不同的烷基基团，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰残基和谷氨酰残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。
用双功能剂衍生化可用于将本发明的抗原结合分子交联到水不溶性载体基质或表面以用于多种方法中。常用的交联剂包括例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，与4-叠氮基水杨酸的酯)、同双官能亚氨酸酯(包括二琥珀酰亚胺酯，如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))、和双官能马来酰亚胺(如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷)。衍生剂如3-[(对叠氮基苯基)二硫代]丙酰亚胺酸甲酯产生能够在光存在下形成交联的可光活化中间体。可替代地，反应性水不溶性基质如溴化氰活化的碳水化合物和反应性底物，如美国专利号3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440所述，用于蛋白质固定。
谷氨酰胺酰残基和天冬酰胺酰残基通常分别脱酰胺成相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残基。可替代地，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一形式都属于本发明的范围。
其他修饰包括对脯氨酸和赖氨酸的羟基化、对丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、对赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties[蛋白质：结构和分子特性],W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],San Francisco[旧金山],1983,第79-86页)、对N末端胺的乙酰化和对任何C末端羧基的酰胺化。
包括在本发明范围内的另一种类型的抗原结合分子的共价修饰包括改变蛋白质的糖基化模式。如本领域中已知的，糖基化模式可以取决于蛋白质的序列(例如，下文论述的特定糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或其中产生蛋白质的宿主细胞或生物体。下面论述特定的表达系统。
多肽的糖基化典型地是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列中的任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
在抗原结合分子中添加糖基化位点通常通过改变氨基酸序列，以使其含有上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)中的一个或多个来实现。还可以通过向起始序列(对于O-连接的糖基化位点)添加或取代为一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来作出改变。为了方便起见，优选通过DNA水平的变化来改变抗原结合分子的氨基酸序列，特别是通过使在预选的碱基处编码多肽的DNA突变，使得生成将翻译为所需氨基酸的密码子。
增加抗原结合分子上的碳水化合物部分的数量的另一种手段是通过将糖苷化学或酶促偶联至蛋白质。这些程序的有利之处在于，它们不需要在具有用于N-连接和O-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。取决于所使用的偶联方式，可将一种或多种糖附接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基基团，(c)游离巯基基团，如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基基团，如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些，(e)芳香族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于WO 87/05330以及Aplin和Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.[CRC生物化学关键评论],第259-306页中。
存在于起始抗原结合分子上的碳水化合物部分的去除可以通过化学或酶促完成。化学去糖基化要求将蛋白质暴露于化合物三氟甲磺酸，或等效化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多数或所有糖裂解，同时使多肽保持完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]259:52和Edge等人,1981,Anal.Biochem.[分析生物化学]118:131描述。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶实现，如由Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.[酶学方法]138:350所述的。可以通过使用化合物衣霉素防止潜在糖基化位点处的糖基化，如由Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]257:3105所述的。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
本文中还考虑了抗原结合分子的其他修饰。例如，抗原结合分子的另一种类型的共价修饰包括以美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中示出的方式将抗原结合分子连接至各种非蛋白质聚合物，包括但不限于各种多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。另外，如本领域已知的，氨基酸取代可以在抗原结合分子内的不同位置进行，例如以便促进聚合物如PEG的添加。
在一些实施例中，本发明的抗原结合分子的共价修饰包括添加一种或多种标记。标记基团可以经由各种长度的间隔臂与抗原结合分子偶联，以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中是已知的并且可以用于进行本发明。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。通常，标记属于多种类别，这取决于将检测它们的测定-以下实例包括但不限于：
a)同位素标记，这些同位素标记可以是放射性同位素或重同位素，如放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)
b)磁性标记(例如磁性颗粒)
c)氧化还原活性部分
d)光学染料(包括但不限于发色团、荧光粉和荧光团)，如荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素荧光粉)、化学发光基团和荧光团，这些荧光团可以是“小分子”氟石或蛋白质氟石
e)酶促基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)
f)生物素化基团
g)由第二报道子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合侧、金属结合结构域、表位标签等)
“荧光标记”意指可以经由其固有的荧光特性检测到的任何分子。适合的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿、二苯乙烯、荧光黄、瀑布蓝J、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC红640、Cy5、Cy5.5、LC红705、俄勒冈绿、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布蓝、瀑布黄和R-藻红蛋白(PE)(俄勒冈州尤金市的分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,OR))、FITC、罗丹明和德克萨斯红(伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce,Rockford,IL))、Cy5、Cy5.5、Cy7(宾夕法尼亚州匹兹堡市的阿默舍姆生命科学公司(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA))。适合的光学染料(包括荧光团)描述于Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook[分子探针手册]中。
合适的蛋白质荧光标记还包括但不限于，绿色荧光蛋白，包括GFP的Renilla、Ptilosarcus、或Aequorea种类(Chalfie等人,1994,Science[科学]263:802-805)、EGFP(Clontech实验室公司，Genbank登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，量子生物技术公司(Quantum Biotechnologies,Inc.)，加拿大魁北克省蒙特利尔市迈松纳夫大道西1801号第8层(邮编：H3H 1J9)(1801de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9)；Stauber,1998,Biotechniques[生物技术]24:462-471；Heim等人,1996,Curr.Biol.[当代生物学]6:178-182)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP，克罗泰克实验室有限公司)、萤光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.[免疫学杂志]150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]85:2603-2607)和海肾(Renilla)(WO 92/15673、WO 95/07463、WO 98/14605、WO 98/26277、WO 99/49019、美国专利号5,292,658；5,418,155；5,683,888；5,741,668；5,777,079；5,804,387；5,874,304；5,876,995；5,925,558)。
本发明的抗原结合分子还可以包含另外的结构域，这些结构域例如有助于分离分子或涉及该分子的适应性药代动力学分布。有助于分离抗原结合分子的结构域可以选自肽基序或辅助性地引入的部分，这些部分可以在分离方法(例如分离柱)中捕获。此类另外的结构域的非限制性实施例包括称为Myc-标签、HAT-标签、HA-标签、TAP-标签、GST-标签、几丁质结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签以及其变体(例如StrepII-标签)和His-标签的肽基序。本文披露的所有抗原结合分子都可以包含His-标签结构域，该His-标签结构域通常称为分子的氨基酸序列中的优选五个、且更优选六个His残基(六组氨酸)的连续His残基重复序列。His标记可以位于例如在抗原结合分子的N末端或C末端，优选地位于C末端。最优选地，六组氨酸标记(HHHHHH)(SEQ ID NO:16)经由肽键与根据本发明的抗原结合分子的C末端连接。另外，PLGA-PEG-PLGA的缀合物体系可以与聚组氨酸标签组合用于缓释应用和改善的药代动力学分布。
还考虑了本文所述的抗原结合分子的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗原结合分子的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗原结合分子的氨基酸序列变体是通过将适当核苷酸变化引入抗原结合分子核酸中或通过肽合成来制备。所有下面描述的氨基酸序列修饰均应产生仍然保留未修饰的亲本分子的所希望生物活性(与CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM和CD3结合)的抗原结合分子。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”典型地是指具有其本领域公认的定义的氨基酸，如选自由以下组成的组的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；蛋氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；以及缬氨酸(Val或V)，尽管可以根据需要使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸。一般来讲，氨基酸可以分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；具有带负电的侧链(例如Asp、Glu)；具有带正电的侧链(例如Arg、His、Lys)；或具有不带电的极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。
氨基酸修饰包括例如抗原结合分子的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入和取代的任何组合以达到最终构建体，条件是最终的构建体具有所希望的特征。氨基酸变化还可能改变抗原结合分子的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置。
例如，可以在每个CDR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5或6个氨基酸(当然，取决于其长度)，而可以在每个FR中插入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸。优选地，抗原结合分子中的氨基酸序列插入物包括与含有上百或更多个残基的多肽的在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基的长度范围内的氨基酸和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。本发明的抗原结合分子的插入变体包括与酶的抗原结合分子的N末端或C末端的融合物或与多肽的融合物。
取代诱变最感兴趣的位点包括(但不限于)重链和/或轻链的CDR，特别是高变区，但也考虑重链和/或轻链的FR改变。取代优选地是如本文所述的保守取代。优选地，可以在CDR中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，而可以在框架区(FR)中取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25个氨基酸，这取决于CDR或FR的长度。例如，如果CDR序列涵盖6个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1个、2个或3个被取代。类似地，如果CDR序列涵盖15个氨基酸，则设想这些氨基酸中的1个、2个、3个、4个、5个或6个被取代。
用于鉴定作为诱变优选位置的抗原结合分子的某些残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells在Science[科学],244:1081-1085(1989)中所述。此处，鉴定抗原结合分子内的残基或靶残基基团(例如带电残基如arg、asp、his、lys和glu)，并将其用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代以影响氨基酸与表位的相互作用。
然后通过在取代位点处或为取代位点引入进一步的或其他变体来精炼那些展示对取代具有功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点或区域是预定的，但突变本身的性质无需预定。例如，为了分析或优化给定位点处突变的性能，可以在靶密码子或区域处实施丙氨酸扫描或随机诱变，并且筛选所表达的抗原结合分子变体以获得所需活性的最优组合。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点进行取代突变的技术是熟知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。使用抗原结合活性(如CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM或CD3结合)的测定进行突变体的筛选。
一般来讲，如果氨基酸在重链和/或轻链的一个或多个或所有CDR中被取代，则优选的是，之后获得的“取代的”序列与“初始”CDR序列至少60％或65％、更优选70％或75％、甚至更优选80％或85％并且特别优选90％或95％相同。这意指该取代取决于CDR的长度与“取代”序列的相同程度。例如，具有5个氨基酸的CDR优选与其取代序列80％相同，以便取代至少一个氨基酸。因此，抗原结合分子的CDR可以与其经取代序列具有不同程度的同一性，例如，CDRL1可以具有80％同一性，而CDRL3可具有90％同一性。
优选的取代(或替代)是保守取代。然而，只要抗原结合分子保留其经由第一结构域与CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM结合并且经由第二结构域与CD3ε结合的能力和/或其CDR与之后取代的序列具有同一性(与“原始”CDR序列至少60％或65％、更优选地70％或75％、甚至更优选地80％或85％并且特别优选地90％或95％相同)，则设想出任何取代(包括非保守取代或来自下表3中列出的“示例性取代”的一个或多个)。
保守取代示于表3中“优选的取代”标题之下。如果此类取代导致生物活性变化，则可以将在表3中命名为“示例性取代”的、或如在下文进一步参考氨基酸类别所述的更多实质性变化引入，并且筛选所希望的特征。
表3：氨基酸取代
原始的 示例性取代 优选取代
Ala(A) val、leu、ile Val
Arg(R) lys、gln、asn Lys
Asn(N) gln、his、asp、lys、arg Gln
Asp(D) glu、asn Glu
Cys(C) ser、ala ser
Gln(Q) asn、glu asn
Glu(E) asp、gln asp
Gly(G) Ala ala
His(H) asn、gln、lys、arg arg
Ile(I) leu、val、met、ala、phe leu
Leu(L) 正亮氨酸、ile、val、met、ala ile
Lys(K) arg、gln、asn arg
Met(M) leu、phe、ile leu
Phe(F) leu、val、ile、ala、tyr tyr
Pro(P) Ala ala
Ser(S) Thr thr
Thr(T) Ser ser
Trp(W) tyr、phe tyr
Tyr(Y) trp、phe、thr、ser phe
Val(V) ile、leu、met、phe、ala leu
本发明的抗原结合分子的生物学特性的实质性修饰是通过以下方式来完成：选择在维持以下的效应方面显著不同的取代：(a)取代区域中的多肽骨架的结构，例如呈片层或螺旋构象；(b)分子在靶位点的电荷或疏水性；或(c)侧链体积。基于共同的侧链特性将天然存在的残基分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；以及(6)芳香族的：trp、tyr、phe。
非保守性取代将需要将这些类别中一类别的成员换成另一类别。任何不参与维持抗原结合分子的适当构象的半胱氨酸残基可以通常被丝氨酸取代，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加至抗体以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段(如Fv片段)的情况下)。
对于氨基酸序列，通过使用本领域已知的标准技术确定序列同一性和/或相似性，包括但不限于，Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.[高级应用数学]2:482的局部序列同一性算法、Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的序列同一性比对算法、Pearson和Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性方法的检索、这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)，威斯康星州麦德逊575科学大道(575Science Drive,Madison,Wis.))、Devereux等人,1984,Nucl.Acid Res.[核酸研究]12:387-395所述的最佳匹配序列程序，优选地使用默认设置，或通过检查。优选地，通过FastDB基于以下参数计算同一性百分比：错配罚分为1；空位罚分为1；空位大小罚分为0.33；以及连接罚分为30，“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis[序列比较和分析的当前方法]”,Macromolecule Sequencing and Synthesis[大分子测序与合成],SelectedMethods and Applications[所选择的方法与应用],第127-149页(1988),Alan R.Liss公司。
有用的算法的实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对从一组相关序列中创建多序列比对。它还可以绘制显示用于创建比对的聚类关系的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle,1987,J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-360的渐进式比对方法的简单化；该方法类似于Higgins和Sharp,1989,CABIOS 5:151-153所述的方法。有用的PILEUP参数包括3.00的默认空位权重、0.10的默认空位长度权重和加权末端空位。
有用的算法的另一实例是BLAST算法，描述于以下中：Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410；Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402；和Karin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:5873-5787。特别有用的BLAST程序是从Altschul等人,1996,Methods inEnzymology[酶学方法]266:460-480获得的WU-BLAST-2程序。WU-BLAST-2使用若干个搜索参数，其中大部分都设定为默认值。将可调整参数设置为以下值：重叠间隔＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且由程序本身根据特定序列的组成和特定数据库的组成来确立，根据该特定数据库来搜索目的序列；然而，可以调整这些值以增加灵敏度。
另外有用的算法是由Altschul等人,1993,Nucl.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402报道的空位BLAST。空位BLAST使用BLOSUM-62取代评分；阈值T参数设定为9；触发非空位扩展的双击方法，对k的空位长度收取10+k的成本；Xu设定为16，并且Xg设定为40(用于数据库搜索阶段)以及67(用于算法的输出阶段)。空位比对由对应于约22比特的评分触发。
一般来讲，各个变体CDR或VH/VL序列之间的氨基酸同源性、相似性或同一性与本文描绘的序列是至少60％，并且更典型地具有至少65％或70％，更优选至少75％或80％，甚至更优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的优选增加的同源性或同一性。以类似的方式，相对于本文鉴定的结合蛋白的核酸序列的“核酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与抗原结合分子的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。具体方法利用设定为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，重叠间隔和重叠分数分别设定为1和0.125。
一般来讲，编码各个变体CDR或VH/VL序列的核苷酸序列与本文描绘的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性是至少60％，并且更典型地具有至少65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％和几乎100％的优选增加的同源性或同一性。因此，“变体CDR”或“变体VH/VL区”是与本发明的亲本CDR/VH/VL具有指定的同源性、相似性或同一性，并且共享生物功能，包括但不限于亲本CDR或VH/VL的特异性和/或活性的至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一个实施例中，根据本发明的抗原结合分子对人种系的同一性百分比≥70％或≥75％，更优选地≥80％或≥85％，甚至更优选地≥90％，并且最优选地≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％或甚至≥96％。与人抗体种系基因产物的同一性被认为是降低治疗期间治疗性蛋白引发患者中针对药物的免疫应答的风险的重要特征。Hwang和Foote(“Immunogenicity of engineered antibodies”[工程化抗体的免疫原性]；Methods[方法]36(2005)3-10)表明药物抗原结合分子的非人类部分的减少导致在治疗期间诱导患者中抗药物抗体的风险降低。通过比较无数临床评价的抗体药物和对应的免疫原性数据，显示以下趋势：抗体的V区的人源化使得蛋白质免疫原性(平均5.1％的患者)比携带未改变的非人V区的抗体(平均23.59％的患者)更低。因此，对于抗原结合分子形式的基于V区的蛋白质治疗剂，期望具有与人序列的更高程度的同一性。出于确定种系同一性的目的，可以使用Vector NTI软件将VL的V区与人种系V区段和J区段(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)的氨基酸序列进行比对并且通过将相同的氨基酸残基除以VL的氨基酸残基总数计算氨基酸序列(以百分比计)。对于VH区段(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)同样适用的，只是由于VH CDR3的高度多样性和缺少现有人种系VH CDR3比对配偶体，因此可以排除VH CDR3。然后可以使用重组技术来增加与人抗体种系基因的序列同一性。
在进一步实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子在标准研究规模条件下，例如在标准的两步纯化工艺中表现出高单体产量。优选地，根据本发明的抗原结合分子的单体产率为≥0.25mg/L上清液、更优选地≥0.5mg/L、甚至更优选地≥1mg/L、以及最优选地≥3mg/L上清液。
同样地，可以确定抗原结合分子的二聚体抗原结合分子同种型的产率，并由此确定单体百分比(即，单体:(单体+二聚体))。单体和二聚体抗原结合分子的生产力和计算的单体百分比可以例如在来自滚瓶中的标准化研究规模生产的培养上清液的SEC纯化步骤中获得。在一个实施例中，抗原结合分子的单体百分比≥80％、更优选地≥85％、甚至更优选地≥90％、以及最优选地≥95％。
在一个实施例中，抗原结合分子的优选血浆稳定性(具有血浆的EC50与无血浆的EC50的比率)≤5或≤4、更优选地≤3.5或≤3、甚至更优选地≤2.5或≤2、以及最优选地≤1.5或≤1。抗原结合分子的血浆稳定性可以通过将构建体在37℃下在人血浆中孵育24小时、之后在51铬释放细胞毒性测定中测定EC50来测试。细胞毒性测定中的效应细胞可以为刺激的富集的人CD8阳性T细胞。靶细胞可以例如是用人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM转染的CHO细胞。效应细胞与靶细胞(E:T)比可以选择为10:1或5:1。用于此目的的人血浆库来源于由EDTA涂覆的注射器收集的健康供体的血液。通过离心去除细胞组分，并且收集上层血浆相并随后汇集。作为对照，在RPMI-1640培养基中的细胞毒性测定之前立即稀释抗原结合分子。血浆稳定性计算为EC50(血浆孵育后)与EC50(对照)的比率。
此外，优选本发明的抗原结合分子的单体到二聚体的低转化率。可以在不同条件下测量转化并且通过高性能尺寸排阻色谱进行分析。例如，抗原结合分子的单体同种型的孵育可以在37℃以及例如100μg/ml或250μg/ml的浓度下在孵育箱中进行7天。在这些条件下，优选本发明的抗原结合分子显示二聚体百分比≤5％、更优选地≤4％、甚至更优选地≤3％、甚至更优选地≤2.5％、甚至更优选地≤2％、甚至更优选地≤1.5％以及最优选地≤1％或≤0.5％或甚至0％。
还优选的是，本发明的双特异性抗原结合分子在多次冷冻/解冻循环后呈现非常低的二聚体转化率。例如，将抗原结合分子单体在例如通用配制缓冲液中调整至浓度为250μg/ml，并且进行三个冷冻/解冻循环(在-80℃下冷冻30min，之后在室温下解冻30min)，之后进行高性能SEC以确定已经转化成二聚体抗原结合分子的最初单体抗原结合分子的百分比。优选地，双特异性抗原结合分子的二聚体百分比≤5％、更优选地≤4％、甚至更优选地≤3％、甚至更优选地≤2.5％、甚至更优选地≤2％、甚至更优选地≤1.5％以及最优选地≤1％或甚至≤0.5％，例如在三次冷冻/解冻循环后。
本发明的双特异性抗原结合分子优选地显示出聚集温度≥45℃或≥50℃、更优选地≥52℃或≥54℃、甚至更优选地≥56℃或≥57℃、以及最优选地≥58℃或≥59℃的有利热稳定性。热稳定性参数可以根据抗体聚集温度如下确定：将浓度为250μg/ml的抗体溶液转移到一次性比色杯中并置于动态光散射(DLS)装置中。将样品以0.5℃/min的加热速率从40℃加热至70℃，恒定获取测量的半径。使用指示蛋白质和聚集物熔融的半径增加来计算抗体的聚集温度。
可替代地，可以通过差示扫描量热法(DSC)确定温度熔融曲线以确定抗原结合分子的固有生物物理学蛋白质稳定性。这些实验使用微凯尔有限公司(MicroCal LLC)(美国马萨诸塞州的北安普顿(Northampton,MA,U.S.A))VP-DSC装置进行。与仅含有配制缓冲液的样品相比，含有抗原结合分子的样品的能量吸收记录为20℃至90℃。例如在SEC运行缓冲液中将抗原结合分子调整至终浓度为250μg/ml。为了记录相应熔融曲线，逐步升高整个样品温度。在每个温度T下，记录样品和配制缓冲剂参考物的能量摄取。将样品的能量摄取Cp(千卡/摩尔/℃)减去参考物的差针对相应温度作图。熔融温度被定义为第一次最大能量摄取时的温度。
还设想本发明的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性抗原结合分子具有≤0.2、优选地≤0.15、更优选地≤0.12、甚至更优选地≤0.1并且最优选地≤0.08的浊度(如在将纯化的单体抗原结合分子浓缩至2.5mg/ml并过夜孵育后通过OD340测量的)。
在进一步实施例中，根据本发明的抗原结合分子在生理或略低的pH下是稳定的，即约pH 7.4至6.0。抗原结合分子在非生理pH例如约pH 6.0下表现得越耐受，从离子交换柱洗脱的抗原结合分子相对于负载蛋白质的总量的回收率越高。从约pH 6.0的离子(例如阳离子)交换柱的抗原结合分子的回收率优选地≥30％、更优选地≥40％、更优选地≥50％、甚至更优选地≥60％、甚至更优选地≥70％、甚至更优选地≥80％、甚至更优选地≥90％、甚至更优选地≥95％、以及最优选地≥99％。
进一步设想本发明的双特异性抗原结合分子显示出治疗功效或抗肿瘤活性。这可以例如在以下晚期人肿瘤异种移植模型的一般化实例中披露的研究中评估：
在研究的第1天，将人靶细胞抗原(此处：CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM)阳性癌细胞系的5×106个细胞皮下注射在雌性NOD/SCID小鼠的右背侧中。当平均肿瘤体积达到约100mm3时，通过将约2×107个细胞注射到动物的腹腔中将体外扩增的人CD3阳性T细胞移植到小鼠中。媒介物对照组1的小鼠不接受效应细胞并用作与媒介物对照组2(接受效应细胞)比较的未移植对照，以监测单独的T细胞对肿瘤生长的影响。当平均肿瘤体积达到约200mm3时，开始使用双特异性抗原结合分子进行治疗。治疗开始当天每个治疗组的平均肿瘤大小与任何其他组均不应有统计学差异(方差分析)。通过静脉内推注注射按0.5mg/kg/天的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN或EpCAM和CD3双特异性抗原结合分子对小鼠进行治疗，持续约15至20天。在研究期间通过卡尺测量肿瘤并且通过肿瘤体积(TV)的组间比较评价进展。通过将TV计算为T/C％＝100×(分析组的中值TV)/(对照组2的中值TV)来确定肿瘤生长抑制T/C[％]。
本领域技术人员知道如何修改或调整该研究的某些参数，例如注射的肿瘤细胞的数量、注射位点、移植的人T细胞的数量、有待施用的双特异性抗原结合分子的量以及时间线，同时仍然获得有意义且可再现的结果。优选地，肿瘤生长抑制T/C[％]≤70或≤60、更优选地≤50或≤40、甚至更优选地≤30或≤20以及最优选地≤10或≤5或甚至≤2.5。肿瘤生长抑制优选接近于100％。
在本发明的抗原结合分子的优选实施例中，抗原结合分子是单链抗原结合分子。
此外，在本发明的抗原结合分子的优选实施例中，所述间隔物以氨基至羧基顺序包含：
铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。
在本发明的一个实施例中，间隔物的所述多肽单体中的每一个具有与选自下组的序列至少90％相同的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:17-24。在本发明的优选实施例中，所述多肽单体中的每一个具有选自SEQ ID NO:17-24的氨基酸序列。
另外，在本发明的一个实施例中，间隔物的一个或优选每个(两个)多肽单体的CH2结构域包含结构域内半胱氨酸二硫桥。如本领域所知，术语“半胱氨酸二硫桥”是指具有一般结构R-S-S-R的官能团。该连接也称为SS键或二硫键，并且通过半胱氨酸残基的两个硫醇基团偶联衍生。对于本发明的抗原结合分子，特别优选将在成熟抗原结合分子中形成半胱氨酸二硫桥的半胱氨酸引入对应于309和321(Kabat编号)的CH2结构域的氨基酸序列。
在本发明的一个实施例中，去除CH2结构域的Kabat位置314中的糖基化位点。优选通过N314X取代实现糖基化位点的去除，其中X是除Q之外的任何氨基酸。所述取代优选为N314G。在更优选的实施例中，所述CH2结构域另外包含以下取代(根据Kabat的位置)：V321C和R309C(这些取代在Kabat位置309和321处引入结构域内半胱氨酸二硫桥)。
假定与本领域中已知的双特异性异Fc抗原结合分子相比本发明的抗原结合分子的优选特征例如可以尤其涉及在CH2结构域中引入上述修饰。因此，对于本发明的构建体优选的是，本发明的抗原结合分子的间隔物中的CH2结构域在Kabat位置309和321处包含结构域内半胱氨酸二硫桥和/或者Kabat位置314处的糖基化位点被去除、优选通过N314G取代去除。
在本发明的进一步优选的实施例中，本发明的抗原结合分子的间隔物中的CH2结构域包含Kabat位置309和321处的结构域内半胱氨酸二硫桥，并且Kabat位置314处的糖基化位点通过N314G取代去除。最优选地，本发明的抗原结合分子的间隔物的多肽单体具有选自由SEQ ID NO:17和18组成的组的氨基酸序列。
在一个实施例中，本发明提供了抗原结合分子，其中：
(i)该第一结构域包含两个抗体可变结构域，并且该第二结构域包含两个抗体可变结构域；
(ii)该第一结构域包含一个抗体可变结构域，并且该第二结构域包含两个抗体可变结构域；
(iii)该第一结构域包含两个抗体可变结构域，并且该第二结构域包含一个抗体可变结构域；或者
(iv)该第一结构域包含一个抗体可变结构域，并且该第二结构域包含一个抗体可变结构域。
因此，第一结构域和第二结构域可以是各自包含两个抗体可变结构域(如VH和VL结构域)的结合结构域。此类包含两个抗体可变结构域的结合结构域的实例在上文进行了描述并且包括例如上文所述的Fv片段、scFv片段或Fab片段。可替代地，这些结合结构域中的一个或两个可以仅包含单个可变结构域。这种单结构域结合结构域的实例在上文进行了描述并且包括例如纳米抗体或仅包含一个可变结构域的单可变结构域抗体，该可变结构域可以是独立于其他V区或结构域特异性地结合抗原或表位的VHH、VH或VL。
在本发明的抗原结合分子的一个优选实施例中，第二和第三结合结构域通过肽接头与间隔物融合。优选的肽接头已在上文描述并且特征在于氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser(SEQ ID NO:7)，或其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x为1或更大的整数(例如2或3)。用于第一结构域和第二结构域与间隔物融合的特别优选的接头在SEQ ID NO:7中描绘。
本发明的抗原结合分子包含第一结构域，该第一结构域与CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM结合，优选地与CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM的一个或多个细胞外结构域(ECD)结合。应理解，在本发明的上下文中，术语“与CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM的细胞外结构域结合，”意味着结合结构域与在靶细胞表面上表达的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM结合。因此，当CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM由天然表达细胞或细胞系表达时和/或由用其转化或(稳定/瞬时)转染的细胞或细胞系表达时，根据本发明的第一结构域优选与CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM结合。在优选实施例中，当CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM在体外结合测定(例如BIAcore或Scatchard)中用作“靶标”或“配体”分子时，第一结合结构域也与CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM结合。“靶细胞”可以是在其表面上表达CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM的任何原核或真核细胞；优选地，靶细胞是作为人体或动物体的一部分的细胞，例如表达特定CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM的癌症或肿瘤细胞。
优选地，第一结合结构域与人CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM/CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM ECD结合。在进一步优选的实施例中，第一结合结构域与猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM/CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM ECD结合。根据最优选的实施例，第一结合结构域与人和猕猴CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM/CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMECD结合。“CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM细胞外结构域”或“CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM ECD”是指基本上不含CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM的跨膜和细胞质结构域的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM区或序列。本领域技术人员应理解，根据本领域常规使用的用于鉴定该疏水结构域类型的标准鉴定针对本发明的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM多肽所鉴定的跨膜结构域。跨膜结构域的确切边界可以改变，但最有可能的是在本文具体提及的结构域的任一末端改变不超过约5个氨基酸。
与CD3结合的优选结合结构域披露于WO 2010/037836和WO 2011/121110中。这些申请中描述的用于CD3的任何结合结构域可以在本发明的上下文中使用。
本发明进一步提供了编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸/核酸分子。多核苷酸是由共价键合在链中的13个或更多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(如cDNA)和RNA(如mRNA)是具有不同生物功能的多核苷酸的实例。核苷酸是充当核酸分子如DNA或RNA的单体或亚单位的有机分子。核酸分子或多核苷酸可以为双链和单链的、线性的和圆形的。它优选包含在载体中，该载体优选包含在宿主细胞中。例如，所述宿主细胞在用本发明的载体或多核苷酸转化或转染后能够表达抗原结合分子。出于此目的，多核苷酸或核酸分子与控制序列可操作地连接。
遗传密码是将遗传物质(核酸)内编码的信息翻译成蛋白质的一组规则。活细胞中的生物解码是通过以由mRNA指定的顺序连接氨基酸的核糖体，使用tRNA分子携带氨基酸并一次读出mRNA三个核苷酸来完成。该密码定义了这些核苷酸三联体的序列(称为密码子)如何指定在蛋白质合成期间接下来将添加哪种氨基酸。除了一些例外，核酸序列中的三核苷酸密码子指定单一氨基酸。因为绝大多数基因都使用完全相同的密码进行编码，所以该特定密码通常称为规范或标准遗传密码。虽然遗传密码决定给定编码区的蛋白质序列，但其他基因组区可能会影响这些蛋白质产生的时间和地点。
此外，本发明提供了载体，该载体包含本发明的多核苷酸/核酸分子。载体是用作将(外来)遗传物质转移到细胞中的媒介物的核酸分子。术语“载体”涵盖但不限于质粒、病毒、粘粒和人造染色体。一般来讲，工程化载体包含复制起点、多克隆位点和选择性标记。载体本身通常是核苷酸序列，该核苷酸序列通常是包含插入物(转基因)和充当载体的“骨架”的更大序列的DNA序列。除转基因插入物和骨架外，现代载体可涵盖其他特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体尤其用于在靶细胞中表达转基因，并且通常具有控制序列。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合侧。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果将前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌前导序列的DNA可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该序列；或者如果核糖体结合侧被定位成使得有助于翻译，则该核糖体结合侧可操作地连接至编码序列。一般来讲，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行接合来完成。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
“转染”是有意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入到靶细胞中的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。转导通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染典型地涉及打开细胞膜中的瞬时孔或“洞”，以允许摄取物质。转染可以使用磷酸钙，通过电穿孔，通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与物质混合以产生脂质体(这些脂质体与细胞膜融合并将其货物存放在内部)来进行。
术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中，以及向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，该基因改变是因通过一个或多个细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传物质(核酸分子)而产生。转化可以通过人为手段来实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态，这可能作为对诸如饥饿等环境条件和细胞密度的时间限制应答而发生。
此外，本发明提供了宿主细胞，该宿主细胞用本发明的多核苷酸/核酸分子或载体转化或转染。如本文使用的，术语“宿主细胞”或“受体细胞”旨在包括可以是或已经是载体、外源核酸分子和编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸的受体；和/或抗原结合分子本身的受体的任何单独细胞或细胞培养物。通过转化、转染等方式将相应物质引入到细胞中。术语“宿主细胞”还旨在包括单细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于天然的、意外的或有意的突变或由于环境影响而在后代中发生，所以这种后代事实上可能与亲本细胞不完全相同(在形态或基因组或全部DNA补体中)，但仍包括在本文所用术语的范围内。适合的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，并且还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，如昆虫细胞和哺乳动物细胞，例如鼠、大鼠、猕猴或人。
本发明的抗原结合分子可以在细菌中产生。表达后，将本发明的抗原结合分子从大肠杆菌细胞糊中以可溶性级分分离，并且可以通过例如亲和色谱法和/或尺寸排除来纯化。最终纯化可以类似于用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法进行。
除了原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)是本发明的抗原结合分子的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、物种和菌株通常是可获得的并且可用于本文中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyce)宿主，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、瓦尔提鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(EP 402 226)；毕赤酵母(EP 183 070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(EP 244234)；粗糙脉孢菌；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)；和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达本发明的糖基化抗原结合分子的合适宿主细胞源自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了来自如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的宿主的许多杆状病毒株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞。用于转染的多种病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且根据本发明，此类病毒可以用作本文的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。可用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见例如Hiatt等人,Nature[自然](1989)342:76-78；Owen等人(1992)Bio/Technology[生物技术]10:790-794；Artsaenko等人(1995)The Plant J[植物杂志]8:745-750；以及Fecker等人(1996)Plant Mol Biol[植物分子生物学]32:979-986。
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7，ATCC CRL1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(293细胞或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.[普通病毒学杂志]36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77:4216(1980))；小鼠塞托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.[生殖生物学]23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,14138065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL5 1)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.YAcad.Sci.[纽约科学院年刊](1982)383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
在进一步实施例中，本发明提供了一种用于生产本发明的抗原结合分子的方法，所述方法包括在允许表达本发明的抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，并从培养物中回收所产生的抗原结合分子。
如本文使用的，术语“培养”是指细胞在适合的条件下在培养基中的体外维持、分化、生长、增殖和/或繁殖。术语“表达”包括涉及产生本发明的抗原结合分子的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
当使用重组技术时，抗原结合分子可以在细胞内、在周质空间中产生或直接分泌到培养基中。若在细胞内产生抗原结合分子，则作为第一个步骤，例如通过离心或超滤来移除宿主细胞或溶解片段的颗粒状碎片。Carter等人,Bio/Technology[生物/技术]10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的程序。简而言之，细胞糊在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下经约30分钟解冻。可以通过离心去除细胞碎片。在将抗体分泌到培养基中的情况下，通常首先使用可商购的蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元对来自此类表达系统的上清液进行浓缩。任何前述步骤中可以包括蛋白酶抑制剂(如PMSF)以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法回收或纯化由宿主细胞制备的本发明的抗原结合分子。取决于有待回收的抗体，也可使用其他用于蛋白质纯化的技术，例如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱法、在肝素上进行的色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上进行的SEPHAROSETM色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。在本发明的抗原结合分子包含CH3结构域的情况下，Bakerbond ABX树脂(新泽西州菲利普斯堡的马林克罗特贝克有限公司(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ))可用于纯化。
亲和色谱法是优选的纯化技术。亲和配体所连接的基质最常为琼脂糖，但其他基质也是可用的。在机械上稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可以实现的更快的流速和更短的处理时间。
此外，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的抗原结合分子或根据本发明的工艺产生的抗原结合分子。对于本发明的药物组合物，优选抗原结合分子的同质性≥80％、更优选地≥81％、≥82％、≥83％、≥84％或≥85％、进一步优选地≥86％、≥87％、≥88％、≥89％或≥90％、更优选地≥91％、≥92％、≥93％、≥94％或≥95％以及最优选地≥96％、≥97％、≥98％或≥99％。
如本文使用的，术语“药物组合物”涉及适合施用给患者，优选人患者的组合物。本发明特别优选的药物组合物优选以治疗有效量包含一种或多种的一个或多个本发明的抗原结合分子。优选地，药物组合物进一步包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的适合配制品。组合物的可接受成分优选在所使用的剂量和浓度下是对接受者无毒性的。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
本发明组合物可以包含药学上可接受的载剂。一般来讲，如本文使用的，“药学上可接受的载剂”意指与药物施用，特别是肠胃外施用相容的任何和所有的水性和非水性溶液、无菌溶液、溶剂、缓冲剂(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液)、水、悬浮液、乳液(如油/水乳液)、各物种型的润湿剂、脂质体、分散介质和包衣。此类介质和药剂在药物组合物中的使用在本领域中是熟知的，并且包含此类载剂的组合物可以通过熟知的常规方法配制。
某些实施例提供了包含本发明的抗原结合分子和另外的一种或多种赋形剂(如本章节和本文其他地方说明性地描述的那些赋形剂)的药物组合物。在这方面，赋形剂在本发明中可用于多种目的，如调整配制品的物理、化学或生物特性，如调整粘度和/或本发明的方法以改善有效性和/或稳定此类配制品和方法，以对抗由于例如在制造、运输、储存、使用前准备、施用和之后过程中发生的压力而导致的降解和腐坏。
在某些实施例中，药物组合物可以含有用于改变、保持或保存组合物的以下方面的目的的配制材料：例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附性或渗透性(参见REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明登氏药学全书],第18"版,(A.R.Genrmo编辑),1990,Mack Publishing Company[马克出版公司])。在此类实施例中，适合的配制物质可以包括但不限于：
·氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、脯氨酸、2-苯丙氨酸，包括带电荷的氨基酸，优选赖氨酸、乙酸赖氨酸、精氨酸、谷氨酸盐和/或组氨酸
·抗微生物剂，例如抗细菌剂和抗真菌剂
·抗氧化剂，例如抗坏血酸、甲硫氨酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠；
·缓冲液、缓冲系统和缓冲剂，用于将组合物保持在生理pH或稍低的pH，优选4.0至6.5的较低pH下；缓冲剂的实例是硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸、琥珀酸盐、磷酸盐和组氨酸；例如约pH 7.0-8.5的Tris缓冲剂；
·非水性溶剂，如丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射用有机酯如油酸乙酯；
·水性载剂包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质；
·生物可降解聚合物，例如聚酯；
·增积剂，例如甘露糖醇或甘氨酸；
·螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；
·等渗剂和吸收延迟剂；
·络合剂，例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精；
·填充剂；
·单糖；二糖；和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；碳水化合物可以是非还原糖，优选海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、山梨醇或木糖醇；
·(低分子量)蛋白质、多肽或蛋白质载剂，例如人或牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，优选地是人来源的；
·着色剂和调味剂；
·含硫还原剂，如谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、[α]-一硫代甘油和硫代硫酸钠
·稀释剂；
·乳化剂；
·亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮
·成盐平衡离子，例如钠；
·防腐剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等；实例是：苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢；
·金属复合物，如Zn-蛋白质复合物；
·溶剂和共溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；
·糖和糖醇，例如海藻糖、蔗糖、八硫酸盐、甘露醇、山梨糖醇或木糖醇水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、肌糖(myoinisitose)、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如肌醇)、聚乙二醇；和多元糖醇；
·悬浮剂；
·表面活性剂或润湿剂，如普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、曲拉通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙星(tyloxapal)；表面活性剂可以是洗涤剂，优选分子量>1.2KD，和/或聚醚，优选分子量>3KD；优选洗涤剂的非限制性实例是吐温20、吐温40、吐温60、吐温80和吐温85；优选聚醚的非限制性实例是PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000和PEG 5000；
·稳定性增强剂，例如蔗糖或山梨糖醇；
·张力增强剂，例如碱金属卤化物，优选地氯化钠或氯化钾；甘露糖醇山梨糖醇；
·肠胃外递送媒介物，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油；
·静脉内递送媒介物，包括流体和营养补充物、电解质补充物(如基于林格氏右旋糖的那些)。
在本发明的上下文中，优选是液体组合物或可以是通过冻干获得的固体组合物或可以是重构的液体组合物的药物组合物包含
(a)抗原结合分子，该抗原结合分子包含至少四个结合结构域，其中：
·第一和第三结构域与靶细胞表面抗原结合并且具有在4至9,5的范围内的等电点(pI)；
·第二和第四结构域与CD3结合；并且具有在8至10、优选地8.5至9.0的范围内的pI；以及
·间隔物，其优选包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域，其中所述两个多肽单体经由肽接头彼此融合；
(b)至少一种缓冲剂；
(c)至少一种糖；以及
(d)至少一种表面活性剂；
并且其中该药物组合物的pH在3.5至6的范围内。
在本发明的上下文中进一步设想，至少一种缓冲剂以5至200mM的浓度范围、更优选地以10至50mM的浓度范围存在。在本发明的上下文中设想至少一种糖选自下组，该组由以下组成：单糖、二糖、环状多糖、糖醇、线性支链葡聚糖或线性非支链葡聚糖。在本发明的上下文中还设想二糖选自下组，该组由以下组成：蔗糖、海藻糖和甘露糖醇、山梨糖醇及其组合。在本发明的上下文中进一步设想糖醇为山梨糖醇。在本发明的上下文中设想至少一种糖以1％至15％(m/V)的浓度范围、优选以9％至12％(m/V)的浓度范围存在。
在本发明的上下文中还设想至少一种表面活性剂选自下组，该组由以下组成：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、泊洛沙姆188、普朗尼克F68、曲拉通X-100、聚氧乙烯(polyoxyethylen)、PEG 3350、PEG 4000及其组合。在本发明的上下文中进一步设想至少一种表面活性剂以0.004％至0.5％(m/V)的浓度范围、优选以0.001％至0.01％(m/V)的范围存在。在本发明的上下文中设想该组合物的pH在4.0至5.0的范围内，优选4.2。在本发明的上下文中还设想该药物组合物具有在150至500mOsm范围内的渗透压。在本发明的上下文中进一步设想该药物组合物进一步包含选自下组的赋形剂，该组由以下组成：一种或多种多元醇和一种或多种氨基酸。在本发明的上下文中，设想所述一种或多种赋形剂以0.1％至15％(w/V)的浓度范围存在。
在本发明的上下文中还设想该药物组合物包含
(a)如上所述的抗原结合分子，
(b)10mM谷氨酸盐或乙酸盐，
(c)9％(m/V)蔗糖或6％(m/V)蔗糖和6％(m/V)羟丙基-β-环糊精，
(d)0.01％(m/V)聚山梨醇酯80
并且其中该液体药物组合物的pH为4.2。
在本发明的上下文中进一步设想该抗原结合分子以0.1至8mg/ml、优选地0.2-2.5mg/ml、更优选地0.25-1.0mg/ml的浓度范围存在。
对于本领域技术人员来说明显的是，例如，药物组合物的不同成分(例如，上文列出的那些)可以具有不同的效应，并且氨基酸可以充当缓冲剂、稳定剂和/或抗氧化剂；甘露醇可以充当膨胀剂和/或张力增强剂；氯化钠可以充当递送媒介物和/或张力增强剂；等。
设想除了本文定义的本发明的多肽之外，本发明的组合物可以包含另外的生物活性剂，这取决于组合物的预期用途。此类药剂可以是作用于胃肠系统的药物、充当细胞抑制剂的药物、预防高尿酸血症的药物、抑制免疫反应的药物(例如皮质类固醇)、调节炎症应答的药物、作用于循环系统的药物和/或本领域中已知的药剂如细胞因子。还设想将本发明的抗原结合分子应用于共疗法中，即与另一种抗癌药物组合。
在某些实施例中，最佳药物组合物可影响本发明的抗原结合分子的物理状态、稳定性、体内释放率及体内清除率。在某些实施例中，药物组合物中的主要媒介物或载剂本质上可以是水性的或非水性的。例如，适合的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。在某些实施例中，本发明的抗原结合分子组合物可以通过将具有所希望纯度的所选组成成分与任选配制品(REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明登氏药学全书]，同上)以冻干饼或水性溶液的形式混合来制备用于储存。此外，在某些实施例中，可以使用合适的赋形剂如蔗糖将本发明的抗原结合分子配制成冻干物。
当考虑肠胃外施用时，用于本发明的治疗组合物可以以包含本发明的所需抗原结合分子的无热原、肠胃外可接受的水性溶液的形式提供于药学上可接受的媒介物中。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无菌蒸馏水，在该无菌蒸馏水中将本发明的抗原结合分子配制成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施例中，该制备可以涉及用可以提供产物(该产物可以经由储库注射来递送)的受控或持续释放的药剂(如可注射微球体、生物可侵蚀颗粒、聚合物化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)配制所希望分子。在某些实施例中，也可以使用透明质酸，该透明质酸具有促进循环持续时间的作用。在某些实施例中，可使用可植入药物递送装置来引入所希望的抗原结合分子。
另外的药物组合物对于本领域技术人员将是明显的，包括涉及将本发明的抗原结合分子制成持续或控制递送/释放配制品的配制品。用于配制各种其他持续或控制递送方式的技术(如脂质体载剂、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒和储库注射)也是本领域技术人员已知的。参见，例如国际专利申请号PCT/US 93/00829，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制剂可以包括呈成型制品(例如膜或微胶囊)形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利号3,773,919及欧洲专利申请公开号EP 058481中所披露)、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers[生物聚合物]2:547-556)、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.[生物医学材料研究杂志]15:167-277以及Langer,1982Chem.Tech.[化学技术]12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开号EP 133,988)。持续释放组合物还可以包括可以通过本领域中已知的若干种方法中的任一种制备的脂质体。参见，例如Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]82:3688-3692；欧洲专利申请公开号EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949。
抗原结合分子也可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合反应包入在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中。此类技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明登氏药学全书],第16版,Oslo,A.编辑,(1980)中。
用于体内施用的药物组合物典型地以无菌制剂提供。灭菌可以通过无菌滤膜过滤完成。当组合物冻干时，可以在冻干和重构之前或之后进行使用该方法的灭菌。用于肠胃外施用的组合物能以冻干形式或于溶液中储存。通常将肠胃外组合物置入具有无菌进入口的容器(例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。
本发明的另一方面包括自缓冲的本发明配制品的抗原结合分子，这些配制品可用作药物组合物，如国际专利申请WO 06138181 A2(PCT/US 2006/022599)中所述。在这方面有用的蛋白质稳定和配制材料和方法，可以获得各种各样的说明，如Arakawa等人,“Solvent interactions in pharmaceutical formulations[药物配制品中的溶剂相互作用],”Pharm Res.[药物研究]8(3):285-91(1991)；Kendrick等人,“Physicalstabilization of proteins in aqueous solution[水性溶液中蛋白质的物理稳定化]”在RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS:THEORY AND PRACTICE[稳定蛋白质配制品的合理设计：理论与实践]中,Carpenter和Manning编辑PharmaceuticalBiotechnology[药物生物技术]13:61-84(2002)和Randolph等人,“Surfactant-proteininteractions[表面活性剂-蛋白质相互作用]”,Pharm Biotechnol.[药物生物技术]13:159-75(2002)，特别参见关于根据本发明的自缓冲蛋白质配制品的相关赋形剂和方法的相关部分，尤其是关于用于兽医和/或人医学用途的蛋白质药物产品和方法。
根据本发明的某些实施例，可以使用盐以例如调整配制品的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白质或其他成分的溶解度和/或物理稳定性。众所周知，离子可以通过与蛋白质表面上的带电荷的残基结合并通过屏蔽蛋白质中的带电荷基团和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过特别地与蛋白质的变性肽键(--CONH)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中的带电荷基团和极性基团的离子相互作用还可以减少分子间静电相互作用，并且从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。
离子种类对蛋白质的作用显著不同。已经开发了多种对可用于配制根据本发明的药物组合物的离子及其对蛋白质的作用的分类评级。一个实例是Hofmeister系列，该系列通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用来对离子和极性非离子溶质进行评级。稳定溶质称为“亲液的”。不稳定溶质称为“离液的”。通常使用高浓度的亲液剂(例如，>1摩尔硫酸铵)以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。通常使用离液剂来使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。
根据本发明的各种实施例，游离氨基酸作为增积剂、稳定剂和抗氧化剂以及其他标准用途可用于本发明配制品的抗原结合分子中。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定配制品中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干以确保正确的饼结构和特性。在液体配制品和冻干配制品两者中，精氨酸均可用于抑制蛋白质聚集。蛋氨酸可用作抗氧化剂。
多元醇包括糖，例如甘露醇、蔗糖和山梨醇以及多元醇，如例如甘油和丙二醇，并且出于本文论述的目的，包括聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是亲液的。它们在液体配制品和冻干配制品两者中是有用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也可用于调整配制品的张力。在本发明的选择实施例中有用的多元醇是甘露醇，甘露醇通常用于确保在冻干配制品中饼的结构稳定性。它确保了饼的结构稳定性。它通常与冻干保护剂(例如蔗糖)一起使用。山梨醇和蔗糖是用于调整张力且作为稳定剂以防止在运输过程中的冷冻-解冻应力或防止在制造过程中制备团块的优选药剂。还原糖(含有游离醛或酮基团)，如葡萄糖和乳糖，可以使表面赖氨酸和精氨酸残基糖基化。因此，它们通常不是根据本发明使用的优选多元醇。此外，在这方面，形成此类反应性物质的糖也不是本发明优选的多元醇，该糖如蔗糖，蔗糖在酸性条件下水解为果糖和葡萄糖并因此产生糖基化。PEG可用于稳定蛋白质并用作冷冻保护剂，并且在这方面可以用于本发明。
本发明的配制品的抗原结合分子的实施例进一步包含表面活性剂。蛋白质分子可易于吸附在表面上，并且变性以及随后在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面处聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且典型地因物理振荡(如在产品运输和处理过程中产生的物理振荡)而加剧。常规使用表面活性剂来防止、最小化或减少表面吸附。在这方面，本发明中有用的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯、以及泊洛沙姆188。表面活性剂也常用于控制蛋白质构象稳定性。在这方面使用表面活性剂是蛋白质特异性的，因为任何给定的表面活性剂典型地会稳定一些蛋白质并使其他蛋白质不稳定。
聚山梨醇酯易于氧化降解，并且通常在供应时含有足够量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链，尤其是甲硫氨酸的氧化。因此，应谨慎使用聚山梨醇酯，并且在使用时应以其最低有效浓度使用。在这方面，聚山梨醇酯例示了赋形剂应以其最低有效浓度使用的一般规则。
本发明的配制品的抗原结合分子的实施例进一步包含一种或多种抗氧化剂。通过保持适当水平的环境氧气和温度并避免暴露于光下，可以在某种程度上防止药物配制品中蛋白质的有害氧化。也可以使用抗氧化赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。在这方面，有用的抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质配制品中的抗氧化剂优选是水溶性的并且在整个产品的储存寿命内保持其活性。在这方面，EDTA是根据本发明的优选的抗氧化剂。抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如，还原剂，如特别是谷胱甘肽，可以破坏分子内二硫键。因此，选择用于本发明的抗氧化剂尤其用于消除或足够降低其本身破坏配制品中的蛋白质的可能性。
根据本发明的配制品可以包含金属离子，这些金属离子是蛋白质辅助因子并且是形成蛋白质配位复合物所必需的，如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子也可以抑制降解蛋白质的一些过程。然而，金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。Ca+2离子(高达100mM)可以增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg+2、Mn+2和Zn+2可以使rhDNase去稳定。类似地，Ca+2和Sr+2可以稳定因子VIII，它可以因Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2去稳定，并且其聚集可以通过Al+3离子增加。
本发明的配制品的抗原结合分子的实施例进一步包含一种或多种防腐剂。当开发涉及从同一容器提取超过一次的多剂量肠胃外配制品时，防腐剂是必需的。其主要功能是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个保质期或使用期限内的产品无菌性。常用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂在小分子肠胃外使用方面有着悠久的历史，但包含防腐剂的蛋白质配制品的开发可能具有挑战性。防腐剂几乎总是对蛋白质具有不稳定效应(聚集)，并且这已成为限制其在多剂量蛋白质配制品中使用的主要因素。迄今为止，大部分蛋白质药物仅配制用于一次性使用。然而，当多剂量配制品是可能时，它们具有使患者方便的附加优势和增加的可销售性。一个良好的实例是人生长激素(hGH)，其中防腐配制品的开发已经导致更方便、多次使用的注射笔展示的商业化。至少四种含有hGH的防腐配制品的此类笔装置目前可在市场上获得。Norditropin(液体，诺和诺德公司(Novo Nordisk))、Nutropin AQ(液体，基因泰克公司(Genentech))和Genotropin(冻干的--双室药筒，法玛西亚普强公司(Pharmacia&Upjohn))含有苯酚，而Somatrope(礼来公司(Eli Lilly))用间-甲酚进行配制。在防腐剂型的配制和开发期间需要考虑若干个方面。必须优化药物产品中有效的防腐剂浓度。这需要以赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性的浓度范围测试剂型中给定的防腐剂。
正如可以预期的那样，含有防腐剂的液体配制品的开发比冻干配制品更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，从而显著最小化相关的稳定性风险。在液体配制品的情况下，应在整个产品保质期(约18至24个月)内保持防腐剂有效性和稳定性。要指出的重要点是，防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终配制品中得到证实。
本文披露的抗原结合分子也可以配制为免疫脂质体。“脂质体”是由各物种型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的小囊泡，该小囊泡可用于将药物递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。含有抗原结合分子的脂质体通过本领域已知的方法制备，例如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],77:4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；以及W0 97/38731中所述。具有延长的循环时间的脂质体披露于美国专利号5,013,556中。特别有用的脂质体可以通过反相蒸发方法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。使脂质体挤出通过具有限定孔径的滤器以产生具有所希望的直径的脂质体。本发明的抗原结合分子的Fab’片段可以与脂质体经由二硫键交换反应缀合，如Martin等人J.Biol.Chem.[生物化学杂志]257:286-288(1982)中所述。化学治疗剂任选地包含在脂质体内。参见Gabizon等人J.National Cancer Inst.[国家癌症研究所杂志]81(19)1484(1989)。
一旦配制了药物组合物，可以将它作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类配制品能以即用形式或以在施用前重构的形式(例如冻干形式)储存。
本文定义的药物组合物的生物活性可以例如通过细胞毒性测定来确定，如以下实例、WO 99/54440或由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫疗法]20(2005),1-12)所述。如本文使用的，“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化NCI应答标准对本发明的药物组合物治疗的应答。使用本发明的药物组合物的疗法的成功或体内功效是指组合物对于其预期用途的有效性，即组合物引起其所希望效应，即耗尽病理细胞(例如肿瘤细胞)的能力。体内功效可以通过已建立的相应疾病实体的标准方法进行监测，这些方法包括但不限于白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选法、骨髓抽吸。另外，可以使用各种疾病特异性临床化学参数和其他建立的标准方法。此外，可以使用计算机辅助断层扫描、X射线、核磁共振断层扫描(例如，用于基于美国国家癌症研究所标准的应答评估[Cheson BD,Horning SJ,Coiffier B,Shipp MA,Fisher RI,Connors JM,Lister TA,VoseJ,Grillo-Lopez A,Hagenbeek A,Cabanillas F,Klippensten D,Hiddemann W,Castellino R,Harris NL,Armitage JO,Carter W,Hoppe R,Canellos GP.Report of aninternational workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin'slymphomas.[标准化非霍奇金淋巴瘤应答标准的国际研讨会报告]NCI赞助的国际工作组(NCI Sponsored International Working Group.)J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]1999年4月；17(4):1244])、正电子发射断层扫描、白细胞计数、差异、荧光激活细胞分选法、骨髓抽吸、淋巴结活检/组织学、以及各种淋巴瘤特异性临床化学参数(例如，乳酸脱氢酶)和其他建立的标准方法。
开发药物(如本发明的药物组合物)的另一主要挑战是药代动力学特性的可预测调节。为此，可以建立候选药物的药代动力学曲线，即影响特定药物治疗给定病状的能力的药代动力学参数的曲线。影响药物治疗某种疾病实体的能力的药物的药代动力学参数包括但不限于：半衰期、分布容量、肝脏首过代谢和血清结合程度。给定药剂的功效可以受到上文提及的每个参数的影响。具有特定FC模式的本发明抗原结合分子的设想特征是它们包括例如药代动力学行为的差异。与“经典”非HLE形式的所述抗原结合分子相比，根据本发明的半衰期延长的靶向抗原结合分子优选地显示出出人意料地增加的体内停留时间。
“半衰期”意指50％的施用药物通过生物工艺(例如代谢、排泄等)消除的时间。“肝脏首过代谢”意指药物在首次与肝脏接触时即在其首次通过肝脏期间代谢的倾向。“分布体积”意指药物在身体各个隔室(例如细胞内和细胞外空间、组织和器官等)中的滞留程度，以及药物在这些隔室内的分布。“血清结合程度”意指药物与血清蛋白(例如白蛋白)相互作用并结合从而导致药物生物活性降低或丧失的倾向。
药代动力学参数还包括对于施用的给定量药物的生物利用度、滞后时间(T滞后)、Tmax、吸收速率、起效时间和/或Cmax。“生物利用度”意指血液隔室中药物的量。“滞后时间”意指药物施用与其在血液或血浆中的检测和可测量性之间的时间延迟。“Tmax”是药物达到最大血液浓度之后的时间，并且“Cmax”是用给定药物获得的最大血液浓度。达到其生物效应所需的药物的血液或组织浓度的时间受到所有参数的影响。显示出跨物种特异性的双特异性抗原结合分子的药代动力学参数也描述在例如Schlereth等人的出版物(CancerImmunol.Immunother.[癌症免疫学与免疫疗法]20(2005),1-12)中，该药代动力学参数可以在如上所述的非黑猩猩灵长类动物的临床前动物实验中确定。
在本发明的优选方面中，药物组合物在约-20℃下稳定至少四周。从附加实例中明显的，本发明的抗原结合分子的质量对比相应现有技术抗原结合分子的质量可以使用不同的系统进行测试。这些测试被理解为与“ICH Harmonised Tripartite Guideline:Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C andSpecifications:Test procedures and Acceptance Criteria for BiotechBiotechnological/Biological Products Q6B[ICH三方协调指南：生物技术/生物产品Q5C的稳定性测试和规格：生物技术/生物产品Q6B的测试程序和验收标准]”一致，并且因此被选择来提供稳定性指示曲线，该曲线提供检测到产品身份、纯度和效力变化的确定性。人们普遍接受术语纯度是相对术语。由于糖基化、脱酰胺或其他异质性的效应，因此生物技术/生物产品的绝对纯度典型地应通过超过一种的方法进行评估，并且所导出的纯度值取决于方法。出于稳定性测试的目的，纯度测试应集中在确定降解产物的方法上。
为了评估包含本发明的抗原结合分子的药物组合物的质量，可以通过例如分析溶液中可溶性聚集体的含量来进行分析(每次尺寸排阻的HMWS)。优选的是，在约-20℃下稳定至少四周的特征在于小于1.5％ HMWS/优选小于1％ HMWS的含量。
作为药物组合物的抗原结合分子的优选配制品可以例如包含如下所述的配制品组分：
·配制品：
磷酸钾、L-精氨酸盐酸盐、海藻糖二水合物、聚山梨醇酯80，在pH 6.0下
在所附的实例4-12中提供了评估在药物组合物形式中的本发明的抗原结合分子的稳定性的其他实例。在那些实例中，针对不同药物配制品中的不同应激条件测试本发明的抗原结合分子的实施例，并将结果与本领域已知的双特异性T细胞接合抗原结合分子的其他半衰期延长(HLE)形式进行比较。一般而言，设想与具有不同HLE形式和不具有任何HLE形式(例如“规范”抗原结合分子)的抗原结合分子相比，具有根据本发明的特定FC模式的抗原结合分子典型地均在广泛范围的应激条件(如温度和光应激)下更稳定。所述温度稳定性可以涉及降低的温度(低于室温，包括冷冻)和升高的温度(高于室温，包括高达或高于体温的温度)两者。如本领域技术人员将认识到的，在临床实践中难以避免的这种改善的关于应激的稳定性使得抗原结合分子更安全，因为在临床实践中将出现较少的降解产物。结果，所述增加的稳定性意味着安全性增加。
一个实施例提供了本发明的抗原结合分子或根据本发明的方法产生的抗原结合分子，用于在与CD20、CD22、FLT3、CLL1、CHD3、MSLN或EpCAM表达或CD20、CD22、FLT3、CLL1、CHD3、MSLN或EpCAM过表达相关的癌症(例如前列腺癌)的预防、治疗或缓解中使用。
本文所述的配制品可在有需要的患者中用作治疗、缓解和/或预防如本文所述的病理医学病状的药物组合物。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。治疗包括将配制品施加或施用于患有疾病/障碍、疾病/障碍的症状或患疾病/障碍的倾向的患者的体内、分离的组织或细胞，目的是治愈、痊愈、缓和、减轻、改变、补救、缓解、改善或影响该疾病，该疾病症状或患该疾病的倾向。
如本文使用的，术语“缓解”是指通过将根据本发明的抗原结合分子施用至有需要的受试者而对具有如下文所指定的疾病的患者的疾病状态的任何改善。这种改善也可以看作是患者疾病进展的减慢或停止。如本文使用的，术语“预防”意指通过向有需要的受试者施用根据本发明的抗原结合分子，避免患有如下文所述的肿瘤或癌症或转移性癌症的患者的发病或复发。
术语“疾病”是指将受益于用本文所述的抗原结合分子或药物组合物治疗的任何病状。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括那些使哺乳动物易患所考虑疾病的病理病状。
“赘生物”是组织的异常生长，通常但不总是形成肿块。当也形成肿块时，通常称之为“肿瘤”。赘生物或肿瘤可以是良性的、潜在恶性的(癌前)、或恶性的。恶性赘生物通常称为癌症。它们通常侵入并破坏周围组织，并可能形成转移，即它们扩散到身体的其他部位、组织或器官。因此，术语“转移性癌症”涵盖转移到原始肿瘤的组织或器官除外的其他组织或器官。淋巴瘤和白血病是淋巴赘生物。出于本发明的目的，它们也涵盖在术语“肿瘤”或“癌症”中。
术语“病毒性疾病”描述了作为受试者病毒感染的结果的疾病。
如本文使用的，术语“免疫学障碍”根据该术语的常见定义描述免疫学障碍，如自体免疫疾病、超敏反应、免疫缺陷。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗或缓解与CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM表达或CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM过表达相关的癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的抗原结合分子或根据本发明的方法产生的抗原结合分子的步骤。CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAMxCD3双特异性单链抗体对于癌症、优选实体瘤、更优选癌和前列腺癌的疗法特别有利。
术语“有需要的受试者”或“需要治疗的那些”包括已经患有障碍的那些以及有待预防障碍的那些。有需要的受试者或“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人及其他哺乳动物受试者。
本发明的抗原结合分子通常以生物利用度和持久性的范围等被设计尤其用于特定的施用途径和方法、特定的施用剂量和频率、特定疾病的特定治疗。组合物的物质优选以对于施用位点可接受的浓度配制。
因此可以根据本发明设计配制品和组合物以通过任何适合的施用途径递送。在本发明的上下文中，施用途径包括但不限于
·局部途径(如表皮、吸入、鼻、眼、耳(auricular/aural)、阴道、黏膜)；
·肠内途径(如口服、胃肠道、舌下、唇下部、经颊、直肠)；以及
·肠胃外途径(例如静脉内、动脉内、骨内、肌内、脑内、脑室内、硬膜外、鞘内、皮下、腹膜内、羊膜外、关节内、心内、真皮内、病灶内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、经皮、鼻内、经粘膜、滑膜内、管腔内)。
本发明的药物组合物和抗原结合分子特别适用于肠胃外施用，例如皮下或静脉内递送，例如通过注射如弹丸注射或通过输注如连续输注。药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述在美国专利号4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；和5,399,163中。
特别地，本发明提供了适合的组合物的不间断施用。作为非限制性实例，可以通过患者佩戴的用于计量治疗剂进入患者体内的流入的小型泵系统来实现不间断或实质上不间断(即连续)的施用。包含本发明的抗原结合分子的药物组合物可以通过使用所述泵系统施用。此类泵系统在本领域中通常是已知的，并且通常依赖于含有要输注的治疗剂的药筒的定期更换。当更换这种泵系统中的药筒时，可能导致原本不间断地流入患者体内的治疗剂的暂时中断。在这种情况下，药筒替换之前的施用阶段和药筒替换之后的施用阶段仍将被认为在药物手段的含义内，并且本发明的方法一起构成这种治疗剂的一次“不间断施用”。
本发明的抗原结合分子的连续或不间断施用可以通过流体递送装置或小型泵系统进行静脉内或皮下施用，该流体递送装置或小型泵系统包括用于将流体驱出储器的流体驱动机构和用于致动驱动机构的致动机构。用于皮下施用的泵系统可以包括用于穿透患者皮肤并将适合的组合物递送到患者体内的针或套管。所述泵系统可以独立于静脉、动脉或血管而直接固定或连接到患者皮肤，从而允许泵系统与患者皮肤直接接触。泵系统可以连接到患者皮肤24小时至数天。泵系统可能尺寸较小，具有小容积的储器。作为非限制性实例，待施用的适合的药物组合物的储器容积可以为0.1至50ml。
连续施用也可以通过佩戴在皮肤上的贴片经皮施用，并且以一定间隔进行更换。本领域技术人员知道适用于该目的的用于药物递送的贴片系统。值得注意的是，经皮施用尤其适合于不间断施用，因为第一用尽的贴片的更换可以有利地与在将新的第二贴片放置在例如紧邻第一用尽的贴片的皮肤表面上的同时并在即将移除第一用尽的贴片之前来完成。不会出现流动中断或电池故障的问题。
如果已将药物组合物冻干，则在施用之前首先将冻干物质在适当液体中重构。可以将冻干物质在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与冷冻干燥前蛋白质所处于的相同配制品中重构。
本发明的组合物可以以合适的剂量施用至受试者，该合适的剂量可以例如通过施用渐增剂量的本发明的抗原结合分子(其显示出对于非黑猩猩灵长类动物例如猕猴的跨物种特异性)的剂量递增研究来确定。如上所述，显示出本文所述的跨物种特异性的本发明的抗原结合分子可有利地以相同形式用于非黑猩猩灵长类动物的临床前试验中以及作为药物用于人类。
术语“有效用量”或“有效剂量”定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以治愈或至少部分阻止已患疾病的患者的疾病及其并发症的量。对此用途有效的量或剂量将取决于有待治疗的病状(适应症)、递送的抗原结合分子、治疗背景和目标、疾病的严重程度、先前疗法、患者的临床病史和对治疗剂的应答、施用途径、患者的体型(体重、体表或器官大小)和/或病状(年龄和一般健康状况)以及患者自体免疫系统的一般状态。
取决于上述因素，典型的剂量范围可以为从约0.1μg/kg至高达约30mg/kg或更高。在具体的实施例中，剂量范围可以为从1.0μg/kg至约20mg/kg，任选地为从10μg/kg至高达约10mg/kg或从100μg/kg至高达约5mg/kg。
治疗有效量的本发明的抗原结合分子优选导致疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率或持续时间增加或预防由于疾病痛苦引起的损伤或残疾。为了治疗与如上所述的CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM表达相关的疾病，治疗有效量的本发明的抗原结合分子(此处：抗CS1、BCMA、CD20、CD22、FLT3、CD123、CLL1、CHD3、MSLN、或EpCAM/抗CD3抗原结合分子)相对于未治疗的患者优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。可以在预测功效的动物模型中评价化合物抑制肿瘤生长的能力。
药物组合物可以作为单独的治疗剂或与另外的疗法(如视需要的抗癌疗法，例如其他蛋白质和非蛋白质药物)组合施用。这些药物可以与包含如本文定义的本发明的抗原结合分子的组合物同时施用，或者在施用所述抗原结合分子之前或之后分别以时间限定的间隔和剂量施用。
如本文所用的术语“有效和无毒剂量”是指耐受剂量的本发明抗原结合分子，其足够高以引起病理细胞耗竭、肿瘤消除、肿瘤缩小或疾病稳定而不具有或本质上不具有主要毒性作用。这种有效且无毒的剂量可以例如通过本领域中描述的剂量递增研究来确定，并且应低于诱导严重不良副作用事件的剂量(剂量限制毒性，DLT)。
如本文使用的，术语“毒性”是指在不良事件或严重不良事件中表现的药物的毒性效应。这些副作用可能是指施用后对药物缺乏全身性耐受性和/或缺乏局部耐受性。毒性还可能包括由药物引起的致畸或致癌作用。
如本文使用的，术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”定义了药物的施用而在施用后未立即诱导严重不良事件(局部耐受性)以及在药物的较长施用时段期间未诱导严重不良事件。例如，可以在治疗和随访期期间以例如有规律的间隔评价“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”。测量包括临床评价，例如器官表现，以及实验室异常的筛选。可以进行临床评价，并且根据NCI-CTC和/或MedDRA标准记录/编码与正常发现的偏差。器官表现可以包括如过敏/免疫学、血液/骨髓、心律失常、凝血等的标准，如例如不良事件的通用术语标准v3.0(CTCAE)中所述的。可以测试的实验室参数包括例如血液学、临床化学、凝血曲线和尿液分析以及其他体液(如血清、血浆、淋巴或脊髓液、液体等)的检查。因此安全性可以通过例如身体检查、成像技术(即超声波、x射线、CT扫描、磁共振成像(MRI)、其他具有技术装置的措施(即心电图术))、生命体征、通过测量实验室参数和记录不良事件来评估。例如，根据本发明的用途和方法中非黑猩猩灵长类动物中的不良事件可以通过组织病理学和/或组织化学方法进行检查。
上述术语也在以下中提及：例如Preclinical safety evaluation ofbiotechnology-derived pharmaceuticals S6[生物技术衍生药物的临床前安全性评价S6]；ICH Harmonised Tripartite Guideline[ICH三方协调指南]；ICH SteeringCommittee meeting on July 16,1997[1997年7月16日的ICH指导委员会会议]。
最后，本发明提供了包含本发明或根据本发明的方法产生的抗原结合分子的试剂盒、本发明的药物组合物、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞。
在本发明的上下文中，术语“试剂盒”意指两种或更多种组分(其中一种对应于本发明的抗原结合分子、药物组合物、载体或宿主细胞)一起包装在容器、接受器或其他中。因此，试剂盒可以被描述为足以实现某一目标的一组产品和/或器具，其可以作为单一单元销售。
该试剂盒可以包含具有任何适当的形状、大小和材料(优选防水，例如塑料或玻璃)的一个或多个器皿(例如小瓶、安瓿、容器、注射器、瓶子、袋子)，该一个或多个器皿含有合适的施用剂量(见上文)的本发明的抗原结合分子或药物组合物。试剂盒可另外包含使用说明书(例如以单页或安装手册的形式)、用于施用本发明的抗原结合分子的装置(如注射器、泵、输注器等)、用于重构本发明的抗原结合分子的装置和/或用于稀释本发明的抗原结合分子的装置。
本发明还提供了用于单剂量施用单元的试剂盒。本发明的试剂盒还可以含有包含干燥/冻干的抗原结合分子的第一器皿和包含水性配制品的第二器皿。在本发明的某些实施例中，提供了含有单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
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应指出的是，除非上下文另有明确指明，否则如本文所用，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数个指示物。因此，例如，对“一种试剂”的提及包括此类不同试剂中的一种或多种，并且对“所述方法”的提及包括提及本领域普通技术人员已知的可以修改或取代本文所述的方法的等效步骤和方法。
除非另外指明，否则在一系列元素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个元素。本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。此类等效物旨在涵盖在本发明中。
术语“和/或”无论在本文何处使用时包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
如本文使用的，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20％内、优选在10％内，并且更优选在5％内。然而，它也包括明确数字，例如约20包括20。
术语“小于”或“大于”包括明确数字。例如，小于20意指小于或等于。类似地，多于或大于分别意指多于或等于/或大于或等于。
贯穿本说明书及其后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”以及变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应当被理解成隐含包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”来取代，或者有时在本文中使用时用术语“具有”取代。
当在本文中使用时，“由……组成(consisting of)”排除了在权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成(consistingessentially of)”并不排除不实质性地影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一者都可以用另外两个术语中的任一者来替换。
应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不打算限制仅由权利要求限定的本发明的范围。
本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入文中。本文没有任何内容应解释为承认本发明无权由于先前发明而早于这些披露内容。通过引用并入的材料在一定程度上与本说明书发生冲突或不一致时，本说明书将替代任何此类材料。
将从以下实例中获得对本发明及其优点的更好理解，这些实例仅用于说明目的。这些实例并不打算以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1：使用未刺激的人PBMC针对多靶向性双特异性抗原结合分子的基于萤光素酶的细胞毒性测定以确定有益的功效差距
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层，血库收集用于输血的血液的副产物)中制备人外周血单核细胞(PBMC)。血沉棕黄层由本地血库提供并且在采血后第二天制备PBMC。在Ficoll密度离心和用达尔伯克氏(Dulbecco’s)PBS(吉博科公司(Gibco))进行大量洗涤之后，经由与红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μMEDTA)一起孵育，从PBMC中除去剩余的红细胞。剩余的淋巴细胞主要包含B和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。将PBMC保持在含有10％ FCS(吉博科公司)的RPMI培养基(吉博科公司)中于37℃/5％ CO2下培养。
CD14+和CD56+细胞的耗尽
为了耗尽CD14+细胞，使用人CD14微珠(美天旎生物技术公司(Milteny Biotec)，MACS，#130-050-201)耗尽NK细胞人CD56微珠(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数并在室温下以300x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于MACS分离缓冲液(60μL/107个细胞)。添加CD14微珠和CD56微珠(20μL/107个细胞)并且在4℃-8℃下孵育15min。用AutoMACS冲洗缓冲液(美天旎公司(Milteny)，#130-091-222)洗涤细胞(1-2mL/107个细胞)。在离心(参见上文)之后，弃去上清液并且将细胞重悬于MACS分离缓冲液(500μL/108个细胞)中。然后使用LS柱(美天旎生物技术公司，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。将PBMC w/oCD14+/CD56+细胞调整至1.2x106个细胞/mL，并且在培养箱中在RPMI完全培养基(即补充有10％ FBS(Bio West公司，#S1810)、1x非必需氨基酸(柏楉有限公司，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(柏楉有限公司，#L1613)、1mM丙酮酸钠(柏楉有限公司，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(柏楉有限公司，#A2213)的RPMI1640(柏楉有限公司，#FG1215))中在37℃下培养直至需要时。
靶细胞制备
将细胞收获，旋下并且在完全RPMI培养基中调整至1.2x105个细胞/mL。使用Nucleocounter NC-250(克莫麦特公司(Chemometec))以及含有吖啶橙和DAPI的溶液18染料(克莫麦特公司)确定细胞的活力。
基于萤光素酶的分析
将此测定设计为在多特异性抗原结合分子的连续稀释液的存在下定量靶细胞的裂解。将等体积的萤光素酶阳性靶细胞和效应细胞(即PBMC w/o CD14+；CD56+细胞)混合，得到10:1的E:T细胞比。将42μL的此悬浮液转移到384孔板的每个孔中。添加8μL相应的多特异性抗原结合分子的连续稀释液和阴性对照抗原结合分子(识别无关靶抗原的基于CD3的抗原结合分子)或RPMI完全培养基(作为另外的阴性对照)。多特异性抗体介导的细胞毒性反应在5％ CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将25μL底物(
Figure BDA0004213953400001131
试剂，普洛麦格公司(Promega))转移到384孔板。仅将活的萤光素酶阳性细胞与底物反应，并且因此产生发光信号。将样品用SPARK酶标仪(帝肯公司(TECAN))测量并且通过Spark Control Magellan软件(帝肯公司(TECAN))分析。
如下计算细胞毒性的百分比：
Figure BDA0004213953400001132
RLU＝相对光单位
阴性对照＝没有多特异性抗原结合分子情况下的细胞
使用GraphPad Prism 7.04软件(图板软件公司(Graph Pad Software)，圣地亚哥)，将细胞毒性的百分比相对于相应的多特异性抗原结合分子浓度绘图。使用四个参数逻辑回归模型来分析剂量反应曲线，用于评价具有固定坡面的S形剂量反应曲线，并计算EC50值。
以下表达单靶标和双靶标的细胞系用于基于萤光素酶的细胞毒性测定：
·GSU-LUC wt(CDH3+和MSLN+)
·GSU-LUC KO CDH3(CDH3-和MSLN+)
·GSU-LUC KO MSLN(CDH3+和MSLN-)
·HCT 116-LUC wt(CDH3+和MSLN+)
·HCT 116-LUC KO CDH3(CDH3-和MSLN+)
·HCT 116-LUC KO MSLN(CDH3+和MSLN-)
表4：针对9种不同测试分子的MSLN-CDH3 T细胞接合细胞毒性测定A)效应细胞：人未刺激的T细胞
靶细胞：GSU wt、GSU KO CDH3、GSU KO MSLN
Figure BDA0004213953400001141
Figure BDA0004213953400001142
Figure BDA0004213953400001143
Figure BDA0004213953400001144
Figure BDA0004213953400001145
Figure BDA0004213953400001151
Figure BDA0004213953400001152
Figure BDA0004213953400001153
Figure BDA0004213953400001154
Figure BDA0004213953400001155
Figure BDA0004213953400001156
Figure BDA0004213953400001157
Figure BDA0004213953400001161
Figure BDA0004213953400001162
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1：MS 15-B12 CC x I2L x G4 x scFc xG4 xCH315-E11 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2：MS 15-B12 CC x I2L x(G4Q)3x scFc x(G4Q)3xCH3 15-E11 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子3：MS 15-B12 CC x I2L x G4 x scFc x G4 xCH315-E11 CC x I2L_GQ
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子4：CH3 15-E11 CC x I2L x(G4S)3x scFc x(G4S)3xMS 15-B12 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子5：CH3 15-E11 CC x I2L x(G4Q)3x scFc x(G4Q)3xMS 15-B12 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子6：CH3 15-E11 CC x I2L x G4 x scFc x G4 x MS15-B12 CC x I2L_GQ
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子7：MS 15-B12 CC x I2M2 x(G4S)3x scFc x(G4S)3xCH3 15-E11 CC x I2M2
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子8：CH3 15-E11 CC x I2M2 x(G4S)3x scFc x(G4S)3x MS 15-B12 CC x I2M2
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子9：MS 15-B12 CC x I2M2 x G4 x scFc x G4 xCH3005-D5 CC x I2M2
MSLN T细胞接合器分子(仅结合MSLN)：MS 5-F11 x I2C0 x scFc
CDH3 T细胞接合器分子(仅结合CDH3)：CH3 G8A 6-B12 x I2C0 x scFc
EGFRvIII T细胞接合器分子(非结合)：EGFRvIII CC x I2C0 x scFc
显示功效差距的详细结果：
表5：原初GSU细胞相比于敲除GSU细胞的EC50值(以pM)和差距
Figure BDA0004213953400001171
Figure BDA0004213953400001181
与对应的GSU k.o细胞(GSU CDH3 k.o和GSU MSLN k.o.)相比，测试的MSLN-CDH3T细胞接合器分子1-9对MSLN和CDH3双阳性GSU wt细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1-9对MSLN和CDH3双阳性GSU wt细胞相比于对应的GSU k.o细胞(GSU CDH3 k.o和GSU MSLN k.o.)显示大于100倍的EC50差距(图A)和表5)。
表6：使用以下细胞系对9种测试分子的功效的概述：
效应细胞：人未刺激的T细胞
靶细胞：HCT 116wt、HCT 116KO CDH3、HCT 116KO MSLN
Figure BDA0004213953400001182
Figure BDA0004213953400001183
Figure BDA0004213953400001184
Figure BDA0004213953400001185
Figure BDA0004213953400001191
Figure BDA0004213953400001192
Figure BDA0004213953400001193
Figure BDA0004213953400001194
Figure BDA0004213953400001195
Figure BDA0004213953400001196
Figure BDA0004213953400001201
Figure BDA0004213953400001202
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1：MS 15-B12 CC x I2L x G4 x scFc xG4 xCH315-E11 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2：MS 15-B12 CC x I2L x(G4Q)3x scFc x(G4Q)3xCH3 15-E11 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子3：MS 15-B12 CC x I2L x G4 x scFc x G4 xCH315-E11 CC x I2L_GQ
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子4：CH3 15-E11 CC x I2L x(G4S)3x scFc x(G4S)3xMS 15-B12 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子5：CH3 15-E11 CC x I2L x(G4Q)3x scFc x(G4Q)3xMS 15-B12 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子6：CH3 15-E11 CC x I2L x G4 x scFc x G4 x MS15-B12 CC x I2L_GQ
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子7：MS 15-B12 CC x I2M2 x(G4S)3x scFc x(G4S)3xCH3 15-E11 CC x I2M2
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子8：CH3 15-E11 CC x I2M2 x(G4S)3x scFc x(G4S)3x MS 15-B12 CC x I2M2
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子9：MS 15-B12 CC x I2M2 x G4 x scFc x G4 xCH3005-D5 CC x I2M2
MSLN T细胞接合器分子(仅结合MSLN)：MS 5-F11 x I2C0 x scFc CDH3 T细胞接合器分子(仅结合CDH3)：CH3 G8A 6-B12 x I2C0 x scFc EGFRvIII T细胞接合器分子(非结合)：EGFRvIII CC x I2C0 x scFc
结果：
表7：原初HCT 116细胞相比于敲除HCT 116细胞的EC50值(以pM)和差距
Figure BDA0004213953400001211
Figure BDA0004213953400001221
与对应的HCT 116k.o细胞(HCT 116CDH3 k.o和HCT 116MSLN k.o.)相比，测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1-9对MSLN和CDH3双阳性HCT 116wt细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1-9对MSLN和CDH3双阳性HCT 116wt细胞相比于对应的HCT 116k.o细胞(HCT 116CDH3 k.o和HCT 116MSLN k.o.)显示大于100倍的EC50差距(图B)和表7)。
表8：使用以下细胞系对分子6的功效的概述：
效应细胞：人未刺激的T细胞
靶细胞：GSU wt、GSU KO CDH3、GSU KO MSLN
测试分子：MSLN-CDH3 T细胞接合器分子6
Figure BDA0004213953400001222
Figure BDA0004213953400001223
Figure BDA0004213953400001224
说明：
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子6：CH3 15-E11 CC x I2L x G4 x scFc x G4 x MS15-B12 CC x I2L_GQ
结果：
表9：原初GSU细胞相比于GSU敲除细胞在使用不同效应物:靶标比率时的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子6EC50值和差距
Figure BDA0004213953400001231
在10:1、1:2和1:1的不同E:T比率时，MSLN-CDH3 T细胞接合器分子6对MSLN和CDH3双阳性GSU wt细胞相比于对应的GSU k.o细胞(GSU CDH3 k.o和GSU MSLN k.o.)显示大于100倍的EC50差距。在较低的E:T比率下，例如1:2和1:1，与在10:1的较高E:T比率下观察到的差距相比，实现了更大的EC50差距(图C)和表9)。
实例2：本发明的多靶向性抗原结合分子的选择性差距
用未刺激的人PBMC进行的基于FACS的细胞毒性测定
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层，血库收集用于输血的血液的副产物)中制备人外周血单核细胞(PBMC)。血沉棕黄层由本地血库提供并且在采血后第二天制备PBMC。在Ficoll密度离心和用达尔伯克氏(Dulbecco’s)PBS(吉博科公司(Gibco))进行大量洗涤之后，经由与红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μMEDTA)一起孵育，从PBMC中除去剩余的红细胞。剩余的淋巴细胞主要包含B和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。将PBMC在含10％FBS(西部生物公司(Bio West)，#S1810)的RPMI培养基(吉博科公司(Gibco))中于37℃/5％ CO2下保持培养。
人T细胞的分离
对于人T细胞的分离，使用泛T细胞分离试剂盒，人(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec),MACS,#130-096-535)去除非靶细胞，即单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞、干细胞、树突细胞、NK细胞、粒细胞或来自PBMC细胞溶液的红细胞。因此，相应数量的PBMC在室温以300x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬在MACS分离缓冲液(杜尔贝科(Dulbecco)PBS(吉博科公司)、100μM EDTA、0.5％ FBS(西部生物公司，#S1810))[40μl缓冲液/1x107个细胞]中。添加泛T细胞生物素-抗体混合物[10μL/1x107个细胞]，并将悬浮液在4℃孵育5min。之后，添加MACS分离缓冲液[30μl缓冲液/1x107个细胞]和抗生物素微珠[20μl/1x107个细胞]，并将细胞悬液在4℃下放置10min。然后将细胞溶液施加到LS柱(美天旎生物技术公司,#130-042-401)在合适的美天旎分离器(MiltenyiSeparator)的磁场中以分离未接触的T细胞，同时磁性标记的非T细胞保留在柱上。柱用MACS分离缓冲液洗涤3次。柱流经物离心(见上文)，弃上清液，细胞重悬于RPMI完全培养基，即RPMI1640(柏楉有限公司(Biochrom AG)，#FG1215)(其补充有10％ FBS(西部生物公司，#S1810)、1x非必需氨基酸(柏楉有限公司，#K0293)、1mM丙酮酸钠(柏楉有限公司，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(柏楉有限公司，#A2213))并在37℃孵育直至需要。
用于基于流式细胞术的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定的靶细胞标记
为了在流式细胞术测定中分析细胞裂解，将荧光膜染料DiOC18(DiO)(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，#V22886)用于将人靶标转染的CHO细胞或癌细胞系(作为靶细胞)并且将它们与效应细胞区分开。简而言之，将细胞收获，用PBS洗涤一次，并且在含有膜染料DiO(5μL/106个细胞)的PBS中调整至106个细胞/mL。在37℃孵育3分钟后，将细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次并直接用于测定。
基于流式细胞术的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定和分析的设置
双特异性T细胞接合器分子的细胞毒活性是通过诱导T细胞介导的靶细胞裂解的能力来确定的。因此，分析了在双特异性T细胞接合器分子和效应细胞系列稀释的情况下人靶细胞的裂解。
DiO标记的靶细胞和效应细胞(即泛T细胞)以10:1的效应细胞与靶细胞(E:T)的比例混合，并与相应双特异性T细胞接合器分子的系列稀释液在96孔板中孵育。板在37℃、5％CO2和95％相对湿度孵育48h。在测定分析当天，将细胞转移到新的96孔板中，并且通过添加终浓度为1μg/mL的碘化丙啶(PI)监测靶细胞膜完整性的丧失。PI是通常被排除在活细胞之外的膜不可透过染料，然而死细胞则通过荧光发射将其吸收并变得可鉴定。
将样品通过在iQue Plus(Intellicyt公司，现在的赛多利斯公司(Sartorius))仪器上的流式细胞术测量，并且通过Forecyt软件(Intellicyt公司)分析。将靶细胞鉴定为DiO阳性细胞。PI阴性靶细胞被分类为活的靶细胞。根据以下公式计算特定细胞裂解对应的细胞毒性的百分比：
Figure BDA0004213953400001251
n＝事件数/孔
在一些实验中，细胞毒性是根据这个公式计算的：
Figure BDA0004213953400001252
Figure BDA0004213953400001253
n＝事件数/孔
使用GraphPad Prism 7.04软件(图板软件公司，圣地亚哥)，将细胞毒性的百分比相对于相应的双特异性T细胞接合器分子浓度绘图。使用具有可变斜率的四个参数逻辑回归模型分析S形剂量应答曲线，并计算EC50值。
以下靶细胞系用于基于FACS的细胞毒性测定：
CHO huMSLN：
用pEFDHFR-MTX1上的人MSLN(以表达人MSLN)和pEFDHFR-MTX2上的虚设序列转染的亲本CHO(DHFR-)细胞
CHO huEpCAM：
用pEFDHFR-MTX2上的人EpCAM(以表达人EpCAM)和pEFDHFR-MTX1上的虚拟序列转染的亲本CHO(DHFR-)细胞
CHO huMSLN huEpCAM：
用pEFDHFR-MTX1上的人MSLN和pEFDHFR-MTX2上的人EpCAM转染的亲本CHO(DHFR-)细胞，以同时表达人MSLN和人EpCAM
CHO huCLL1：
用pEFDHFR上的人CLL1转染的亲本CHO(DHFR-)细胞，以表达人CLL1
CHO huFLT3：
用pEFDHFR上的人FLT3转染的亲本CHO(DHFR-)细胞，以表达人FLT3
CHO huCLL1 huFLT3：
用pEFDHFR-MTX1上的人CLL1和pEFDHFR-MTX2上的人FLT3转染的亲本CHO(DHFR-)细胞，以同时表达人CLL1和人FLT3
SW48 WT：
亲本细胞系，野生型(WT)
SW48 MSLN KO：
亲本细胞系SW48，其中MSLN基因被敲除(KO)
SW48 CDH3 KO：
亲本细胞系SW48，其中CDH3基因被敲除(KO)
体外TDCC测定的细胞因子测量
使用BDTM细胞计数珠阵列人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD生物科学公司(BDBiosciences)，#551809)测量TDCC体外测定过程中的细胞因子释放。因此，用完整的PBMC作为效应细胞建立了两个细胞毒性测定组。24小时后，取出一组测定板的上清液，并根据制造商的方案分析人细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα和IFNγ的水平。48小时后，测量另一组测定的细胞毒活性。
基于萤光素酶的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定和分析的设置
Luc阳性靶细胞和效应细胞(即泛T细胞)以10:1的效应细胞与靶细胞(E:T)的比例混合，并与相应双特异性T细胞接合器分子的系列稀释液在384孔板中孵育。多靶向性抗体介导的细胞毒性反应在5％ CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将25μL底物(
Figure BDA0004213953400001261
试剂，普洛麦格公司(Promega))转移到384孔板。仅将活的萤光素酶阳性细胞与底物反应，并且因此产生发光信号。将样品用SPARK酶标仪(帝肯公司(TECAN))测量并且通过SparkControl Magellan软件(帝肯公司(TECAN))分析。
如下计算细胞毒性的百分比：
Figure BDA0004213953400001271
RLU＝相对光单位
阴性对照＝没有多特异性抗原结合分子情况下的细胞
使用GraphPad Prism 7.04软件(图板软件公司，圣地亚哥)，将细胞毒性的百分比相对于相应的双特异性T细胞接合器分子浓度绘图。使用具有可变斜率的四个参数逻辑回归模型分析S形剂量应答曲线，并计算EC50值。以下靶细胞系用于基于萤光素酶的细胞毒性测定：
HCT 116 LUC WT：
亲本细胞系，野生型(WT)，用萤光素酶转染
HCT 116 LUC MSLN KO：
亲本细胞系HCT 116 LUC，其中MSLN基因被敲除(KO)
HCT 116 LUC CDH3 KO：
亲本细胞系HCT 116 LUC，其中CDH3基因被敲除(KO)
表10：单靶向性分子相比于双靶向性分子对双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001272
Figure BDA0004213953400001273
Figure BDA0004213953400001281
图2显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子和单靶向性对照T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHO huCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线和EC50值。效应细胞是未刺激的泛T细胞。b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001282
表11：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001283
结果：与huCLL1或huFLT3单阳性靶细胞相比，CLL-FLT3 T细胞接合器分子1显示对huCLL1和huFLT3双阳性靶细胞的活性增加(较低的EC50值)。该分子显示对双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞的大于1000倍的EC50选择性差距。CLL-FLT3 T细胞接合器分子1包含两个I2C结合结构域，其中带有二硫桥，二硫桥由scFv框架中Kabat编号后位置44和100处的两个半胱氨酸取代促进(进一步称为I2C cc 44/100或I2C cc)。单靶向性对照T细胞接合器分子对单阳性细胞相比于双阳性细胞具有相当的活性(差异仅2-3倍)。
实例3：不同多靶向性双特异性T细胞接合多肽(MBiTEP)形式的选择性差距
图3：EpCAM MSLN T细胞接合器分子和单靶向性对照T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001291
表12：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001301
结果：从测试的EpCAM MSLN T细胞接合器分子1-6来看，EpCAM MSLN T细胞接合器分子5和6显示在双阳性和单阳性靶细胞之间的选择性差距>100倍。EpCAM MSLN T细胞接合分子5和6在N末端有一个双特异性实体(靶结合结构域和CD3结合结构域)并且在C末端有一个双特异性实体，两者由单链Fc结构域隔开[分别是，在EpCAM MSLN T细胞接合分子5中靶结合结构域x CD3结合结构域xscFc x CD3结合结构域x靶结合结构域，在EpCAM MSLN T细胞接合分子6中靶结合结构域x CD3结合结构域x scFc x靶结合结构域x CD3结合结构域]。单靶向性对照T细胞接合器分子对单阳性细胞相比于双阳性细胞具有相当的活性(差异仅1-2倍)。
实例4在靶结合结构域和CD3结合结构域之间具有不同接头的多靶向性双特异性T细胞接合器多肽的选择性差距
图4A：EpCAM MSLN T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001311
表13：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距
Figure BDA0004213953400001312
结果：EpCAM-MSLN T细胞接合器分子1和2对双阳性CHO huEpCAM和huMSLN靶细胞显示出相当的活性。与CHO huEpCAM或CHO huMSLN单阳性靶细胞相比，这些分子对双阳性靶细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。EpCAM-MSLN T细胞接合器1和2包含相同方向的相同靶结合结构域和CD3结合结构域[靶结合结构域x CD3结合结构域x scFc x CD3结合结构域x靶结合结构域]，但它们的接头序列在靶结合结构域和CD3结合结构域之间不同。对于两种接头变体，双阳性靶细胞与单阳性靶细胞之间的EC50选择性差距大于100倍。
图4B：EpCAM MSLN T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001313
Figure BDA0004213953400001321
表14：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001322
结果：与CHO huEpCAM或CHO huMSLN单阳性靶细胞相比，EpCAM-MSLN T细胞接合器分子1、2、3和4对CHO huEpCAM和huMSLN双阳性靶细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。EpCAM-MSLN T细胞接合器分子1、2和3包含相同方向的相同靶结合结构域和CD3结合结构域[靶结合结构域x CD3结合结构域xscFc x靶结合结构域x CD3结合结构域]，但它们的接头序列在靶结合结构域和CD3结合结构域之间不同。尽管接头长度和序列存在这些差异，但所示的EpCAM-MSLN T细胞接合器分子1、2、3和4显示双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞之间的EC50选择性差距大于100倍。
图4C：CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHO huCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001331
表15：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001332
结果：与CHO huCLL1或CHO huFLT3单阳性靶细胞相比，CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1、2、3和4对CHO huCLL1和huFLT3双阳性靶细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1、2、3和4包含相同方向的相同靶结合结构域和CD3结合结构域[靶结合结构域x CD3结合结构域x scFc x靶结合结构域x CD3结合结构域]，但它们的接头序列在靶结合结构域和CD3结合结构域之间不同。尽管存在这些差异，但双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞之间的EC50选择性差距对于所有分子都是相当的。
实例5：具有分隔两个双特异性实体的不同结构域的多靶向性双特异性T细胞接合器多肽(MBiTEP)的选择性差距
图5：EpCAM MSLN T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001341
表16：双特异性实体之间使用的结构的特征
Figure BDA0004213953400001342
表17：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001351
结果：双阳性和单阳性靶细胞之间的最高选择性差距是通过EpCAM-MSLN T细胞接合器分子1和2实现的。在这些分子中，双特异性实体被50个以上的氨基酸隔开，或者被超过3.2kDa的任意结构隔开，或者被导致计算的距离/空间至少为
Figure BDA0004213953400001353
的任意结构隔开。
实例6：具有不同CD3亲和力/活性(低相比于高)的本发明多靶向性抗原结合分子的选择性差距
图6A显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHO huCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001352
Figure BDA0004213953400001363
表18：与具有KD 1.2E-08M的高亲和力CD3结合结构域I2C相比，CLL1-FLT3 T细胞接合器分子中使用的CD3结合结构域的活性降低
Figure BDA0004213953400001361
表19：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001362
Figure BDA0004213953400001371
结果：与CLL1-FLT3 T细胞接合器分子6、7、8和9相比，CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1、2、3、4和5显示双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞与单阳性CHO huCLL1或huFLT3靶细胞之间的最高选择性差距，其超过1000倍。CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1、2、3、4和5包含两个CD3结合结构域，其活性比具有1.2E-08M的KD的参考CD3结合结构域I2C低约100倍。CLL1-FLT3 T细胞接合器分子6、7和8包含两个CD3结合结构域，其活性比I2C低6-9倍。CLL1-FLT3T细胞接合器分子9包含CD3结合结构域I2C。
图6B显示了EpCAM MSLN T细胞接合器分子对双阳性CHO huEpCAM huMSLN靶细胞和单阳性CHO huEpCAM或CHO huMSLN靶细胞的细胞毒性曲线。
效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001372
Figure BDA0004213953400001381
表20：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距
Figure BDA0004213953400001382
结果：与EpCAM MSLN T细胞接合器分子2相比，EpCAM MSLN T细胞接合器分子1在双阳性和单阳性靶细胞之间显示出更高的EC50选择性差距(针对CHO huEpCAM，与双阳性细胞相比，203倍相比于16倍；针对CHO huMSLN，与双阳性细胞相比，352倍相比于10倍)。EpCAM-MSLN T细胞接合器分子2包含两个高亲和力CD3结合结构域(I2C，KD 1.2E-08M)，EpCAM-MSLN T细胞接合器分子1包含两个CD3结合结构域，其活性比I2C低大约100倍。
图6C显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHO huCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001383
表21：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001391
结果：与CLL1-FLT3 T细胞接合器分子2相比，CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1在双阳性和单阳性靶细胞之间显示出更高的选择性差距。CLL1-FLT3 T细胞接合器分子2包含两个高亲和力CD3结合结构域(I2C，KD 1.2E-08M)，CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1包含两个CD3结合结构域，其活性比I2C低大约100倍。
实施例7具有不同CD3亲和力(低相比于高)的多靶向性双特异性T细胞接合器多肽(MBiTEP)的细胞因子谱
Figure BDA0004213953400001392
表22a：显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞的48小时后EC50值。
在图7中，显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞的48小时后细胞毒性曲线(图7A)和24小时后的释放的细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、TNFα和IFNγ(图7B-F)。IL-4低于检测阈值，因此未显示。效应细胞是未刺激的PBMC。
Figure BDA0004213953400001393
Figure BDA0004213953400001401
表22b：与高亲和力CD3结合结构域I2C相比，CLL1-FLT3 T细胞接合器分子中使用的抗CD3结合结构域的活性降低
Figure BDA0004213953400001402
结果：CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1和3对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞(0.4pM和0.7pM)显示出相当的活性。CLL1-FLT3 T细胞接合器分子2显示出1.9pM的细胞毒活性，分别比分子1和分子3低4.8倍和2.7倍。在所有测试的细胞因子中，在使用CLL1-FLT3T细胞接合器分子2的细胞毒性测定中测得的细胞因子水平高于CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1和3。CLL1-FLT3 T细胞接合器分子2包含两个高亲和力CD3结合结构域(I2C，KD 1.2E-08M)。CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1和3包含两个CD3结合结构域，其活性比I2C低约100倍。因此，作为一个普遍的发现，低亲和力的CD3结合物有助于降低细胞因子释放。
对于CDH3-MSLN T细胞接合器分子的相应细胞毒性和细胞因子释放检查而言，使用了GSU Luc萤光素酶转染的表达CDH3和MSLN的细胞。
使用BDTM细胞计数珠阵列人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD生物科学公司(BDBiosciences)，#551809)测量TDCC体外测定过程中的细胞因子释放。因此，用完整的PBMC作为效应细胞建立了两个细胞毒性测定组。48小时后，取出一组测定板的上清液，并根据制造商的方案分析人细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα和IFNγ的水平。72小时后，测量另一组测定的细胞毒活性。
图7(G-L)：CDH3-/MSLN-和CDH3-MSLN T细胞接合器分子对双阳性GSU Luc细胞的72小时后细胞毒性曲线，以及24小时后的释放细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、TNFα和IFNγ。效应细胞是未刺激的PBMC。
Figure BDA0004213953400001411
Figure BDA0004213953400001412
表22c：显示了CDH3-/MSLN-和CDH3-MSLN T细胞接合器分子对双阳性GSU Luc细胞的72小时后EC50值
结果：CDH3-MSLN T细胞接合器分子对双阳性GSU Luc细胞显示出与MSLN T细胞接合器相当的活性(2.33pM和0.84pM)。CDH3 T细胞接合器显示出细胞毒活性为155.2pM，这分别比其他两种T细胞接合器低67倍和185倍。在所有测试的细胞因子中，在使用多靶向性CDH3-MSLN T细胞接合器分子的细胞毒性测定中测得的细胞因子水平低于CDH3-或MSLN-单靶向性T细胞接合器分子。因此，一般而言，本发明的多靶向(例如CDH3-MSLN)性双特异性(T细胞接合)分子比单独的相应单靶向(分别例如CDH3和MSLN)性双特异性抗原结合分子诱导更少的细胞因子释放。因此，根据本发明的多靶向性分子不太容易诱导细胞因子释放相关的副作用，这些副作用通常是免疫疗法中最重要的副作用之一。
实例8：多靶向性双特异性T细胞接合器分子(MBiTEM)对癌细胞系的选择性差距。
Figure BDA0004213953400001413
在图8中，显示了MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1对双阳性细胞系HCT 116(WT)和CDH3与MSLN分别敲除(KO)细胞系的细胞毒性曲线和EC50值。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001421
表23：双阳性细胞系HCT 116(WT)和CDH3与MSLN分别敲除(KO)细胞系的EC50值和选择性差距；
Figure BDA0004213953400001422
在图9中，显示了MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1对双阳性细胞系SW48(WT)和CDH3与MSLN分别敲除(KO)细胞系的细胞毒性曲线和EC50值。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001423
表24：双阳性细胞系SW48(WT)和CDH3与MSLN分别敲除(KO)细胞系的EC50值和选择性差距；
Figure BDA0004213953400001424
Figure BDA0004213953400001431
结果：测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1对测试的细胞系HCT116和SW48及其相应的敲除显示出双阳性靶细胞和单阳性敲除细胞之间的选择性差距超过100倍。细胞系HCT116经测量在每个细胞表面具有约2350个间皮素表位和约8980个CDH3表位的靶抗原拷贝数水平。细胞系SW48具有约4000个间皮素表位和900个CDH3表位的表面拷贝数。与靶细胞表面MSLN和CDH3表位拷贝数的比率和表达水平无关，测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1对两种细胞系均显示出稳定的选择性差距>100。
实例9
用未刺激的人PBMC进行的基于FACS的细胞毒性测定
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层，血库收集用于输血的血液的副产物)中制备人外周血单核细胞(PBMC)。血沉棕黄层由本地血库提供并且在采血后第二天制备PBMC。在Ficoll密度离心和用达尔伯克氏(Dulbecco’s)PBS(吉博科公司(Gibco))进行大量洗涤之后，经由与红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μMEDTA)一起孵育，从PBMC中除去剩余的红细胞。剩余的淋巴细胞主要包含B和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。将PBMC在含10％FBS(西部生物公司，#S1810)的RPMI培养基(吉博科公司)中于37℃/5％ CO2下保持培养。
人T细胞的分离
对于人T细胞的分离，使用泛T细胞分离试剂盒，人(美天旎生物技术公司,MACS,#130-096-535)去除非靶细胞，即单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞、干细胞、树突细胞、NK细胞、粒细胞或来自PBMC细胞溶液的红细胞。因此，相应数量的PBMC在室温以300xg离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬在MACS分离缓冲液(杜尔贝科(Dulbecco)PBS(吉博科公司)、100μM EDTA、0.5％ FBS(西部生物公司，#S1810))[40μl缓冲液/1x107个细胞]中。添加泛T细胞生物素-抗体混合物[10μL/1x107个细胞]，并将悬浮液在4℃孵育5min。之后，添加MACS分离缓冲液[30μl缓冲液/1x107个细胞]和抗生物素微珠[20μl/1x107个细胞]，并将细胞悬液在4℃下放置10min。然后将细胞溶液施加到LS柱(美天旎生物技术公司,#130-042-401)在合适的美天旎分离器的磁场中以分离未接触的T细胞，同时磁性标记的非T细胞保留在柱上。柱用MACS分离缓冲液洗涤3次。柱流经物离心(见上文)，弃上清液，细胞重悬于RPMI完全培养基，即RPMI1640(柏楉有限公司，#FG1215)(其补充有10％ FBS(西部生物公司，#S1810)、1x非必需氨基酸(柏楉有限公司，#K0293)、1mM丙酮酸钠(柏楉有限公司，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(柏楉有限公司，#A2213))并在37℃孵育直至需要。
用于基于流式细胞术的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定的靶细胞标记
为了在流式细胞术测定中分析细胞裂解，将荧光膜染料DiOC18(DiO)(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，#V22886)用于将人靶标转染的CHO细胞或癌细胞系(作为靶细胞)并且将它们与效应细胞区分开。简而言之，将细胞收获，用PBS洗涤一次，并且在含有膜染料DiO(5μL/106个细胞)的PBS中调整至106个细胞/mL。在37℃孵育3分钟后，将细胞在完全RPMI培养基中洗涤两次并直接用于测定。
基于流式细胞术的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定和分析的设置
本发明的T细胞接合器分子的细胞毒活性是通过诱导T细胞介导的靶细胞裂解的能力来确定的。因此，分析了在双特异性T细胞接合器分子和效应细胞系列稀释的情况下人靶细胞的裂解。
DiO标记的靶细胞和效应细胞(即泛T细胞)以10:1的效应细胞与靶细胞(E:T)的比例混合，并与相应双特异性T细胞接合器分子的系列稀释液在96孔板中孵育。板在37℃、5％CO2和95％相对湿度孵育48h。在测定分析当天，将细胞转移到新的96孔板中，并且通过添加终浓度为1μg/mL的碘化丙啶(PI)监测靶细胞膜完整性的丧失。PI是通常被排除在活细胞之外的膜不可透过染料，然而死细胞则通过荧光发射将其吸收并变得可鉴定。
将样品通过在iQue Plus(Intellicyt公司，现在的赛多利斯公司(Sartorius))仪器上的流式细胞术测量，并且通过Forecyt软件(Intellicyt公司)分析。将靶细胞鉴定为DiO阳性细胞。PI阴性靶细胞被分类为活的靶细胞。根据以下公式计算特定细胞裂解对应的细胞毒性的百分比：
Figure BDA0004213953400001451
n＝事件数/孔
在一些实验中，细胞毒性是根据这个公式计算的：
Figure BDA0004213953400001452
Figure BDA0004213953400001453
n＝事件数/孔
使用GraphPad Prism 7.04软件(图板软件公司，圣地亚哥)，将细胞毒性的百分比相对于相应的双特异性T细胞接合器分子浓度绘图。使用具有可变斜率的四个参数逻辑回归模型分析S形剂量应答曲线，并计算EC50值。
以下靶细胞系用于基于FACS的细胞毒性测定：
·CHO huMSLN：
用pEFDHFR-MTX1上的人MSLN(以表达人MSLN)和pEFDHFR-MTX2上的虚设序列转染的亲本CHO(DHFR-)细胞
·CHO huEpCAM
用pEFDHFR-MTX2上的人EpCAM(以表达人EpCAM)和pEFDHFR-MTX1上的虚拟序列转染的亲本CHO(DHFR-)细胞
·CHO huMSLN huEpCAM
用pEFDHFR-MTX1上的人MSLN和pEFDHFR-MTX2上的人EpCAM转染的亲本CHO(DHFR-)细胞，以同时表达人MSLN和人EpCAM
·CHO huCLL1
用pEFDHFR上的人CLL1转染的亲本CHO(DHFR-)细胞，以表达人CLL1
·CHO huFLT3
用pEFDHFR上的人FLT3转染的亲本CHO(DHFR-)细胞，以表达人FLT3
·CHO huCLL1 huFLT3
用pEFDHFR-MTX1上的人CLL1和pEFDHFR-MTX2上的人FLT3转染的亲本CHO(DHFR-)细胞，以同时表达人CLL1和人FLT3
·SW48 WT
亲本细胞系，野生型(WT)
·SW48 MSLN KO
亲本细胞系SW48，其中MSLN基因被敲除(KO)
·SW48 CDH3 KO
亲本细胞系SW48，其中CDH3基因被敲除(KO)
体外TDCC测定的细胞因子测量
使用BDTM细胞计数珠阵列人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD生物科学公司(BDBiosciences)，#551809)测量TDCC体外测定过程中的细胞因子释放。因此，用完整的PBMC作为效应细胞建立了两个细胞毒性测定组。24小时后，取出一组测定板的上清液，并根据制造商的方案分析人细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα和IFNγ的水平。48小时后，测量另一组测定的细胞毒活性。
基于萤光素酶的T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定和分析的设置
Luc阳性靶细胞和效应细胞(即泛T细胞)以10:1的效应细胞与靶细胞(E:T)的比例混合，并与相应双特异性T细胞接合器分子的系列稀释液在384孔板中孵育。多靶向性双特异性抗原结合分子介导的细胞毒性反应在5％ CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将25μL底物(
Figure BDA0004213953400001461
试剂，普洛麦格公司(Promega))转移到384孔板。仅将活的萤光素酶阳性细胞与底物反应，并且因此产生发光信号。将样品用SPARK酶标仪(帝肯公司(TECAN))测量并且通过Spark Control Magellan软件(帝肯公司(TECAN))分析。
如下计算细胞毒性的百分比：
Figure BDA0004213953400001462
RLU＝相对光单位
阴性对照＝没有多特异性抗原结合分子情况下的细胞
使用GraphPad Prism 7.04软件(图板软件公司，圣地亚哥)，将细胞毒性的百分比相对于相应的双特异性T细胞接合器分子浓度绘图。使用具有可变斜率的四个参数逻辑回归模型分析S形剂量应答曲线，并计算EC50值。
以下靶细胞系用于基于萤光素酶的细胞毒性测定：
·HCT 116LUC WT
亲本细胞系，野生型(WT)，用萤光素酶转染
·HCT 116LUC MSLN KO
亲本细胞系HCT 116LUC，其中MSLN基因被敲除(KO)
·HCT 116LUC CDH3 KO
亲本细胞系HCT 116LUC，其中CDH3基因被敲除(KO)
·GSU LUC WT
亲本细胞系，野生型(wt)，用萤光素酶转染
·GSU LUC MSLN KO
亲本细胞系GSU LUC wt，其中MSLN基因被敲除(KO)
·GSU LUC CDH3 KO
亲本细胞系GSU LUC wt，其中CDH3基因被敲除(KO)
不同多靶向性抗原结合分子的选择性差距
Figure BDA0004213953400001491
表25：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001492
结果：与huCLL1或huFLT3单阳性靶细胞相比，CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1和2显示对huCLL1和huFLT3双阳性靶细胞的活性增加(较低的EC50值)。这些分子显示对双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞的大于100倍的EC50选择性差距。CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1和2都在N末端有一个双特异性实体(一个靶结合结构域和一个CD3结合结构域)并且在C末端有一个双特异性实体，两者由scFc结构域分隔。它们的结构域排列不同，CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1具有以下排列：[靶结合结构域x CD3结合结构域x scFc x靶结合结构域xCD3结合结构域]，CLL1-FLT3 T细胞接合器分子2包含[CD3结合结构域x靶结合结构域xscFc x靶结合结构域x CD3结合结构域]。
实例10：单链多靶向性双特异性T细胞接合器多肽相比于双链多靶向性双特异性T细胞接合器多肽的选择性差距
Figure BDA0004213953400001493
Figure BDA0004213953400001501
与对应的GSU KO细胞(GSU KO CDH3和GSU KO MSLN)相比，测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1和2对MSLN和CDH3双阳性GSU wt细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。这些分子显示对双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞的至少80倍的EC50选择性差距。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1包含一个多靶向性双特异性T细胞接合多肽，而MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2包含具有两个不同(以组合)多靶向性双特异性T细胞接合器多肽的异二聚体。两者都具有[靶结合结构域x CD3结合结构域x间隔物x靶结合结构域x CD3结合结构域]的结构域排列。单靶向性对照T细胞接合器分子对单阳性细胞相比于双阳性细胞具有相当的活性(选择性差距为约1)。
Figure BDA0004213953400001502
Figure BDA0004213953400001511
实例11具有分隔两个双特异性实体的不同间隔物的多靶向性双特异性T细胞接合器多肽(MBiTEP)的选择性差距
图12(A-E)显示了CLL1-FLT3 T细胞接合器分子对双阳性CHO huCLL1 huFLT3靶细胞和单阳性CHO huCLL1或CHO huFLT3靶细胞的细胞毒性曲线和EC50值。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001512
表27：双阳性CHO细胞相比于单阳性CHO细胞的EC50值和选择性差距；b.c.t：低于计算阈值
Figure BDA0004213953400001513
Figure BDA0004213953400001521
结果：CLL1-FLT3 T细胞接合器分子1、2、3、4和5包含相同排列的相同靶结合结构域和CD3结合结构域[靶结合结构域x CD3结合结构域x间隔物x靶结合结构域x CD3结合结构域]，但它们在双特异性实体之间的间隔物结构域不同。用CLL1-FLT3 T细胞接合器分子3、4和5观察到双阳性靶细胞与单阳性靶细胞之间的大于100倍EC50选择性差距，其中双特异性实体被具有超过50个氨基酸和5kDa的间隔物分隔以提供至少约
Figure BDA0004213953400001522
的质心距离。用CLL1-FLT3T细胞接合器分子4观察到对双阳性靶细胞的选择性差距和总体活性的最佳组合，其中双特异性实体被由514个氨基酸或54.7kDa或
Figure BDA0004213953400001523
分隔；CLL1-FLT3T细胞接合器分子3和5(其具有的间隔物分别为615个氨基酸/68.3kDA/
Figure BDA0004213953400001524
和998个氨基酸/107.5kDA/
Figure BDA0004213953400001525
)显示总体活性略有降低，但仍保持大于100倍的选择性差距。
Figure BDA0004213953400001526
表28：双特异性实体之间使用的结构的特征
图13(A-E)显示了EpCAM-MSLN T细胞接合器分子对双阳性Ovcar8野生型细胞和单阳性Ovcar8 MSLN KO或Ovcar8 EpCAM KO靶细胞的细胞毒性曲线。效应细胞是未刺激的泛T细胞。
Figure BDA0004213953400001531
表29：双阳性Ovcar8 WT细胞相比于单阳性Ovcar8 KO细胞的EC50值和选择性差距。
Figure BDA0004213953400001532
Figure BDA0004213953400001541
结果：EpCAM-MSLN T细胞接合器分子1、2、3、4和5包含相同排列的相同靶结合结构域和CD3结合结构域[靶结合结构域x CD3结合结构域x间隔物x靶结合结构域x CD3结合结构域]，但它们在双特异性实体之间的间隔物结构域不同。当比较EpCAM-MSLN T细胞接合器分子1、2、3、4和5时，双阳性靶细胞与单阳性靶细胞之间的选择性差距随着分隔双特异性实体的间隔物的增加而变得更好，其中EpCAM MSLN T细胞接合器分子5的最佳结果>100倍，其中双特异性实体由514个氨基酸/54.7kDa/
Figure BDA0004213953400001542
分隔。
Figure BDA0004213953400001543
表30：双特异性实体之间使用的结构的特征
实例12用未刺激的人PBMC进行的基于萤光素酶的细胞毒性测定
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层，血库收集用于输血的血液的副产物)中制备人外周血单核细胞(PBMC)。血沉棕黄层由本地血库提供并且在采血后第二天制备PBMC。在Ficoll密度离心和用达尔伯克氏(Dulbecco’s)PBS(吉博科公司(Gibco))进行大量洗涤之后，经由与红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μMEDTA)一起孵育，从PBMC中除去剩余的红细胞。剩余的淋巴细胞主要包含B和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。将PBMC保持在含有10％ FCS(吉博科公司)的RPMI培养基(吉博科公司)中于37℃/5％ CO2下培养。
CD14+和CD56+细胞的耗尽
为了耗尽CD14+细胞，使用人CD14微珠(美天旎生物技术公司，MACS，#130-050-201)耗尽NK细胞人CD56微珠(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数并在室温下以300x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于MACS分离缓冲液(60μL/107个细胞)。添加CD14微珠和CD56微珠(20μL/107个细胞)并且在4℃-8℃下孵育15min。用AutoMACS冲洗缓冲液(美天旎公司，#130-091-222)洗涤细胞(1-2mL/107个细胞)。在离心(参见上文)之后，弃去上清液并且将细胞重悬于MACS分离缓冲液(500μL/108个细胞)中。然后使用LS柱(美天旎生物技术公司，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。将PBMC w/o CD14+/CD56+细胞调整至1.2x106个细胞/mL，并且在培养箱中在RPMI完全培养基(即补充有10％FBS(Bio West公司，#S1810)、1x非必需氨基酸(柏楉有限公司，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(柏楉有限公司，#L1613)、1mM丙酮酸钠(柏楉有限公司，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(柏楉有限公司，#A2213)的RPMI1640(柏楉有限公司，#FG1215))中在37℃下培养直至需要时。
靶细胞制备
将细胞收获，旋下并且在完全RPMI培养基中调整至1.2x105个细胞/mL。使用Nucleocounter NC-250(克莫麦特公司(Chemometec))以及含有吖啶橙和DAPI的溶液18染料(克莫麦特公司)确定细胞的活力。
基于萤光素酶的分析
将此测定设计为在多特异性抗体构建体的连续稀释液的存在下定量靶细胞的裂解。将等体积的萤光素酶阳性靶细胞和效应细胞(即PBMC w/o CD14+；CD56+细胞)混合，得到10:1的E:T细胞比。将42μL的此悬浮液转移到384孔板的每个孔中。添加8μL相应的多特异性抗体构建体的连续稀释液和阴性对照抗体构建体(识别无关靶抗原的基于CD3的抗体构建体)或RPMI完全培养基(作为另外的阴性对照)。多特异性抗体介导的细胞毒性反应在5％CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将25μL底物(
Figure BDA0004213953400001561
试剂，普洛麦格公司(Promega))转移到384孔板。仅将活的萤光素酶阳性细胞与底物反应，并且因此产生发光信号。将样品用SPARK酶标仪(帝肯公司(TECAN))测量并且通过Spark Control Magellan软件(帝肯公司(TECAN))分析。
如下计算细胞毒性的百分比：
Figure BDA0004213953400001562
RLU＝相对光单位
阴性对照＝无多特异性抗体构建体的细胞
使用GraphPad Prism 7.04软件(图板软件公司(Graph Pad Software)，圣地亚哥)，将细胞毒性的百分比相对于相应的多特异性抗体构建体浓度绘图。使用四个参数逻辑回归模型来分析剂量反应曲线，用于评价具有固定坡面的S形剂量反应曲线，并计算EC50值。
以下靶细胞系用于基于萤光素酶的细胞毒性测定：
·GSU-LUC wt(CDH3+和MSLN+)
·GSU-LUC KO CDH3(CDH3-和MSLN+)
·GSU-LUC KO MSLN(CDH3+和MSLN-)
·HCT 116-LUC wt(CDH3+和MSLN+)
·HCT 116-LUC KO CDH3(CDH3-和MSLN+)
·HCT 116-LUC KO MSLN(CDH3+和MSLN-)
Figure BDA0004213953400001563
Figure BDA0004213953400001564
Figure BDA0004213953400001571
说明：
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1：CH3 15-E11 CC x I2L x G4 x scFc xG4 x MS15-B12 CC x I2L_(SEQ ID NO 251)
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2：CH3 15-E11 VAG CC x I2L x G4 x scFc x MS15-B12 CC x I2L clipopt ID(SEQ ID NO 434)
结果：
表31：原初GSU细胞相比于敲除GSU细胞的EC50值(以pM)和差距
Figure BDA0004213953400001572
与对应的GSU k.o细胞(GSU CDH3 k.o和GSU MSLN k.o.)相比，测试的MSLN-CDH3T细胞接合器分子1&2对MSLN和CDH3双阳性GSU wt细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1&2对MSLN和CDH3双阳性GSU wt细胞相比于对应的GSU k.o细胞(GSU CDH3 k.o和GSU MSLN k.o.)显示大于100倍的EC50差距(图14A、B)和表31)。
Figure BDA0004213953400001573
Figure BDA0004213953400001581
说明：
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1：CH3 15-E11 CC x I2L x G4 x scFc xG4 x MS15-B12 CC x I2L_(SEQ ID NO 251)
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2：CH3 15-E11 VAG CC x I2L x G4 x scFc x MS15-B12 CC x I2L clipopt ID(SEQ ID NO 434)
结果：
表32：原初HCT 116细胞相比于敲除HCT 116细胞的EC50值(以pM)和差距
Figure BDA0004213953400001582
与对应的HCT 116k.o细胞(HCT 116CDH3 k.o和HCT 116MSLN k.o.)相比，测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1&2对MSLN和CDH3双阳性HCT 116wt细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1&2对MSLN和CDH3双阳性HCT 116wt细胞相比于对应的HCT 116k.o细胞(HCT 116CDH3 k.o和HCT 116MSLN k.o.)显示大于100倍的EC50差距(图14C、D)和表32)。
实例13羟基化分析
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1和2的蛋白水解消化
使用胰蛋白酶(1:20酶/底物比率，罗氏公司(Roche)，#03708969001)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE，1:20酶/底物比，弹性蛋白制品公司(Elastin ProductsCo.)，#SE563)在pH 7.8在过滤装置上进行蛋白水解消化(37℃，胰蛋白酶：1小时，HNE：30分钟)。在消化之前，蛋白质被变性(6M胍，pH 8.3)、还原(DTT)和烷基化(碘乙酸钠)。用8M胍(pH 4.7)淬灭蛋白水解。
LC-MS/MS测量和数据评估
对于LC-MS分析，使用连接到带有电喷雾离子源的Thermo ScientificTMQExactiveTM BioPharma平台的Agilent 1290HPLC系统。使用C18反相柱和梯度洗脱进行分离，流动相A(在水中的0.1％ HCOOH)和B(在90％乙腈中的0.1％ HCOOH)，流速为0.25ml/min。MS数据是使用全扫描正模式产生的。此外，还生成了最强离子的串联质谱(MS/MS)数据。使用内部开发的软件程序自动进行数据评估和肽鉴定。
MS/MS分析
胰蛋白酶肽Q39-K56用于计算MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1中位置K56处的羟基化的相对丰度。将来自MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1的羟基化肽Q39-K(Hyl)56(电荷态2+和3+)的MS面积设为分子以及将未修饰肽Q39-K56(电荷态2+和3+)和羟基化肽Q39-K(Hyl)56(电荷态2+和3+)的总和设为分母。来自MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1和2的y离子和b离子系列胰蛋白酶肽Q39-K56、Q39-K(Hyl)56和Q39-K63用于经修饰的和未修饰的肽的MS/MS验证。
表33：MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1中位置K56处羟基化的相对定量
Figure BDA0004213953400001591
*羧甲基化半胱氨酸：+58.005Da
表34：MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2中的Q39-K63肽
Figure BDA0004213953400001601
*羧甲基化半胱氨酸：+58.005Da
T细胞接合器分子1和2的离子交换色谱
对于CEX-HPLC分析，使用Agilent 1290HPLC。使用阳离子交换色谱柱(YMC有限公司(YMC Co.,Ltd.)，SF00S05-1046WP)进行分离，用流动相A(赛默飞世尔科技公司，085346)和B(赛默飞世尔科技公司，085348)梯度洗脱，流速为1.00ml/min。
结果：
在MSLN-CDH3 T细胞接合分子1中观察到位置K56处的羟基化(相对丰度17.20％，见表33)。将位置56处的赖氨酸(K)替换为丙氨酸(A)，在MSLN-CDH3T细胞接合器分子2中未观察到位置A56处的羟基化(见表34)。使用CEX-HPLC分析，与MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1相比，MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2的所得CEX主峰异质性降低(见图15)。
实例14：本发明分子的理化性质分析
单体双靶向性抗原结合分子的分离与配制及蛋白产率确定
含有表达的双靶向性抗原结合分子的细胞培养上清液(SN)通过离心澄清并使用0.2μM过滤步骤过滤。
通过在
Figure BDA0004213953400001602
Pure 25系统(思拓凡公司(Cytiva)，弗赖堡(Freiburg imBreisgau)，德国)上应用两步纯化过程分离单体蛋白质，产生选定液体体积的单体双靶向性抗原结合分子，然后对该体积进行配制和浓度调整。
表35：两步纯化过程中单体双靶向性抗原结合分子的表达产率
Figure BDA0004213953400001603
Figure BDA0004213953400001611
双靶向性抗原结合分子的表达产率
双靶向性抗原结合分子表面疏水性的评估
分离并配制的经调整至规定蛋白质浓度的双靶向性抗原结合分子单体转移到自动进样器适配样品瓶中，并在
Figure BDA0004213953400001612
Purifier 10FPLC系统(思拓凡公司，弗赖堡，德国)上进行测量。疏水相互作用色谱HIC柱用配制缓冲液平衡，并以恒定的配制缓冲液流速应用规定体积的蛋白质溶液。通过OD280 nm光吸收进行检测。洗脱行为由峰形状分别通过下降信号峰斜率的数学计算确定。与具有更平坦洗脱行为和更低斜率值的构建体相比，更陡的斜率/更高的斜率值表明蛋白质表面的疏水相互作用更小。
表36：双靶向性抗原结合分子的HIC洗脱斜率
Figure BDA0004213953400001613
在HIC柱上注射后分析的双靶向性抗原结合分子的峰斜率
双靶向性抗原结合分子聚集温度的评估
将分离并配制的经调整至规定蛋白质浓度的双靶向性抗原结合分子单体双份吸取到96孔板中，并用石蜡油覆盖。将96孔板转移到动态光散射DLS读取器(DynaPro读板器II，怀亚特(Wyatt)，德恩巴赫(Dernbach)，德国)，其能够在固定温度范围内以定义的速率加热板。测量是在40℃到70℃以规定的升温速率进行的。通过动态光散射确定构建体在温度斜坡上的流体动力学半径进行检测。流体动力学半径开始增加时的温度定义为聚集温度。
表37：双靶向性抗原结合分子的DLS聚集温度
Figure BDA0004213953400001621
双靶向性抗原结合分子的DLS聚集温度
双靶向性抗原结合分子长期储存稳定性的评估
将分离并配制的经调整至规定蛋白质浓度的双靶向性抗原结合分子单体等分并在温度受控的培养箱中在37℃储存一周。
将15cm长的分析型SEC柱连接到UPLC系统(Aquity,沃特斯公司(Waters),埃施博恩(Eschborn),德国)并用合适的洗脱缓冲液平衡。将10μl体积的处理过的双靶向性抗原结合分子单体溶液在恒定流速的洗脱缓冲液下注射，同时检测210nm波长处的吸光度，直到所有蛋白质和配制品成分从柱洗脱。
对作为参考的未处理样品进行相同的程序。
通过比较单体主峰的面积与检测到的所有蛋白质峰的面积来计算单体百分比。
表38：双靶向性抗原结合分子在37℃储存一周后的单体百分比
Figure BDA0004213953400001622
双靶向性抗原结合分子的单体百分比
双靶向性抗原结合分子冻融稳定性的评估
将分离并配制的经调整至规定蛋白质浓度的双靶向性抗原结合分子单体等分并在-80℃/室温冻/融3次，每一步30分钟。
将15cm长的分析型SEC柱连接到UPLC系统(Aquity,沃特斯公司(Waters),埃施博恩(Eschborn),德国)并用合适的洗脱缓冲液平衡。将处理过的10μl体积的双靶向性抗原结合分子单体溶液在恒定流速的洗脱缓冲液下注射，同时检测210nm波长处的吸光度，直到所有蛋白质和配制品成分从柱洗脱。
通过比较单体主峰的面积与检测到的所有蛋白质峰的面积来计算单体百分比。
表39：三个冻/融循环后双靶向性抗原结合分子的单体百分比
Figure BDA0004213953400001631
三个冻/融循环后双靶向性抗原结合分子的单体百分比
双靶向性抗原结合分子电荷异质性的确定
将分析型阳离子交换柱连接到UPLC系统(Aquity,沃特斯公司(Waters),埃施博恩(Eschborn),德国)并用低电导率平衡/结合缓冲液＝缓冲液_A进行平衡。
具有高电导率的适用于蛋白质洗脱的第二缓冲液系统也连接到UPLC系统＝缓冲液_B。
分析程序的检测设置为280nm光波长。
在缓冲液_A缓冲液恒流下注入10μl体积的双靶向性抗原结合分子单体溶液。
在蛋白质结合并从配制缓冲液成分洗出后，以相同的流速应用缓冲液_B梯度，其中缓冲液B从0％线性增加到100％。
通过比较主峰的面积与检测到的所有蛋白质峰的面积来计算主峰百分比。
表40：双靶向性抗原结合分子在分析型阳离子交换色谱中的主峰百分比
Figure BDA0004213953400001641
双靶向性抗原结合分子在分析型阳离子交换色谱中的主峰百分比
实例15：CDH3 MSLN双靶向性抗原结合分子体外亲和力的评估
CDH3 MSLN双靶向性抗原结合分子的基于细胞的亲和力通过非线性回归(一个位点特异性结合)分析确定。将表达人CDH3、cyno CDH3、人MSLN或cyno MSLN的CHO细胞与浓度递减的CDH3 MSLN双靶向性抗原结合分子(针对CDH3细胞系12.5nM，针对MSLN细胞系800nM，步骤1:2，11个步骤)在4℃孵育16h。用Alexa Fluor 488缀合的AffiniPure Fab片段山羊抗人IgG(H+L)检测结合的CDH3MSLN双靶向性抗原结合分子。用DRAQ5、远红色荧光活细胞渗透DNA染料染色已固定细胞，并通过荧光细胞计数检测信号。用GraphPad Prism软件的单位点特异性结合评价工具计算各平衡解离常数(Kd)值。使用Microsoft Excel计算平均Kd值和亲和力差距。
表41：CDH3 MSLN双靶向性抗原结合分子的细胞亲和力
Figure BDA0004213953400001642
CDH3 MSLN双靶向性抗原结合分子对靶转染的CHO细胞的基于细胞的亲和力通过非线性回归(一个位点特异性结合)分析确定。平均Kd值由三个独立的测量值计算。通过将cyno Kd除以人Kd来确定亲和力差距。
结果
基于细胞的亲和力测量显示，CDH3 MSLN双靶向性抗原结合分子1和2对靶转染的表达人CDH3、cyno CDH3、人MSLN或cyno MSLN的CHO细胞具有相当的亲和力。两种分子的亲和力差距也相当。
说明
CDH3 MSLN双靶向性抗原结合分子1：CH3 15-E11 CC x I2L x G4 x scFc x G4xMS 15-B12 CC x I2L_
CDH3 MSLN双靶向性抗原结合分子2：CH3 15-E11 VAG CC x I2L x G4 x scFcxMS 15-B12 CC x I2L clipopt
实例16：CDH3xMSLN双特异性抗原结合分子的体内功效测试。
在晚期人肿瘤异种移植模型中评估了抗肿瘤活性方面的治疗功效。在研究的第1天，将人靶细胞抗原(CDH3xMSLN)阳性癌细胞系的5×106个细胞皮下注射在雌性NOD/SCID小鼠的右背侧中。当平均肿瘤体积达到约100mm3时，通过将约2×107个细胞注射到动物的腹腔中将体外扩增的人CD3阳性T细胞移植到小鼠中。媒介物对照组1的小鼠不接受效应细胞并用作与媒介物对照组2(接受效应细胞)比较的未移植对照，以监测单独的T细胞对肿瘤生长的影响。当平均肿瘤体积达到约200mm3时，开始用SEQ ID NO 251的CDH3xMSLN双特异性抗原结合分子进行治疗。治疗开始当天每个治疗组的平均肿瘤大小与任何其他组均不应有统计学差异(方差分析)。在研究第9、16和24天，通过静脉内推注注射用0.5mg/kg/天的CHD3xMSLN双特异性抗原结合分子对小鼠进行治疗。在研究期间通过卡尺测量肿瘤并且通过肿瘤体积(TV)的组间比较评价进展。通过将TV计算为T/C％＝100×(分析组的中值TV)/(对照组2的中值TV)来确定肿瘤生长抑制T/C[％]。从图16可以明显看出，用0.2mg/kg或2mg/kg CHD3xMSLN双特异性抗原结合分子治疗有效地抑制了体内肿瘤生长。
实例17：根据本发明的多靶向性双特异性抗原结合分子的建模
本发明的多靶向性双特异性抗原结合分子的替代物被建模以测量不同接头/间隔物大小的结构域间距离(3D模型描绘图17A)。起始分子模型基于由结合MSLN的scFv和结合CD3的I2C scFv构成的经典抗MSLN分子的内部结构数据。由于在可用的内部和公共晶体数据中提供最高的同源性和完整性，该结构用于表示所有替代物模型中的N末端分子实体和C末端分子实体。使用薛定谔软件套件(2020-4版，薛定谔
Figure BDA0004213953400001661
纽约，美国)添加缺失的残基和接头。类似地，目的“间隔物”基团(scFc(图17C)、PD1(图17H)、HSA(图17G)、泛素(图17I)、SAND(图17J)、β2微球蛋白(图17K)和HSP70-1(图17L))使用基于最接近的公共PDB结构(PDB代码分别为1HZH、6JJP和5VNW)的薛定谔套件建模，并与2个分子拷贝交联。使用PyMOL(版本2.3.3，薛定谔，纽约，美国)生成测量值和图像。MD的一般方法已经在本发明的一般描述中进行了解释。
表42双特异性实体之间的各个间隔物赋予的中值距离和最大距离
Figure BDA0004213953400001662
所有间隔物长度(即GGGGS单体重复的数量)均基于实验测试的分子的序列。每个同源模型都以扩展构象建立，使N末端I2C(CD3结合物)和C末端MSLN结合物(靶结合物)之间的质心(COM)距离最大化。因此，起始分子构象表明每个分子理论上可以达到的最大COM距离。为了探测这些构象的稳定性，每个模型都进行了200纳秒(在双scFc间隔物的情况下为100ns，由于模拟速度非常慢)明确溶剂MD模拟，其中使用Desmond(薛定谔套件的一个组件)。对所有11个模拟系统的一般观察(对应的间隔物：G4S、scFc、2x scFc、(G4S)10、(EAAAK)10、HSA、PD1、泛素、SAND、β-2微球蛋白、HSP70-1)是scFv COM间距离的减少，表明扩展构象只有(如果有的话)在靶存在的情况下才有可能(N末端和C末端抗原结合分子结构由于相应于稳定的晶体结构构象而在很大程度上保持不变)。对于具有明确二级结构的大间隔物(scFc、2x scFc(图17D)、HSA、PD1)，距离减少小到中等，scFv部分在每次模拟结束时仍保持明显分离(丢弃每个模拟的前半部分后的中值COM距离：分别是101、153、114和
Figure BDA0004213953400001671
)。柔性(G4S)10和(EAAAK)10接头“坍塌”成更紧凑的构象，使scFv部分更紧密地在一起(中值COM距离为48和
Figure BDA00042139534000016710
)。在这2个接头中，(EAAAK)10导致了稍微更稳定的构象，这可能与更高的选择性有关。短G4S接头无法将scFv部分保持分开，并且在整个模拟过程中发现它们强烈相互作用(中值COM距离为
Figure BDA0004213953400001672
但VH CDR3环彼此之间比在任何其他系统中的更近)。泛素作为73aa的间隔物保持第1CD3 scFv和第2MSLN scFv之间的质心中值距离为
Figure BDA0004213953400001673
Figure BDA0004213953400001674
这意味着有效分隔。SAND作为89aa的间隔物保持第1CD3scFv和第2MSLN scFv之间的质心中值距离为
Figure BDA0004213953400001675
β2微球蛋白作为97aa的间隔物保持第1CD3scFv和第2MSLN scFv之间的质心中值距离为
Figure BDA0004213953400001676
即与优选的scFc相当。相比之下，HSP70-1作为378aa的间隔物保持第1CD3scFv和第2MSLN scFv之间的质心中值距离仅为
Figure BDA0004213953400001677
这意味着两个双特异性实体的分隔不足。具有β2微球蛋白(图17M左)和HSP70-1(图17M右)的分子的模拟通过各自的代表性结构可视化，这些结构分别指示存在和不存在间隔物分隔。
如上对于具有两个MSLN靶结合物的分子所示，在本发明的上下文中观察到scFc(SEQ ID NO:25)作为间隔物的良好分隔和scFv迁移率，对于作为靶结合物的MSLN和FOLR1显示第1CD3 scFv和FolR1 scFv之间的质心中值距离为
Figure BDA0004213953400001678
(图17N)，对于作为靶结合物的MSLN和CDH19显示第1CD3 scFv和CDH19 scFv之间的质心中值距离为
Figure BDA0004213953400001679
(图17O)。
实例18根据本发明的多靶向性双特异性抗原结合分子在食蟹猴中的比较性临床安全性研究
在食蟹猴(一种药理学相关物种)的重复剂量毒理学研究中，评估了单靶向性间皮素(MSLN)-靶向性双特异性抗原结合分子(分子1，SEQ ID NO 1183)，其显示体外功效。分子1以0.1、1.5、5/1.5或15μg/kg的剂量通过30分钟静脉内输注(三只动物/性别/组)每周施用一次，持续4周(即在第1、8、15、和22天施用)。5/1.5μg/kg组的动物在第1天接受5μg/kg，从第8天开始接受1.5μg/kg。在给药阶段结束时在第29天或在4周恢复期后在第57天进行计划的尸检。分子1相关的临床和解剖病理变化在不按计划(第3、4或8天)和按计划(第29、57天)安乐死队列之间大体相似，尽管不按计划的安乐死个体中的发生率和严重程度增加。
分子1显示出剂量限制性毒性，在体内具有广泛的组织效应。1.5μg/kg、5μg/kg和15μg/kg的剂量是不耐受的。在第3天或第4天，出于人道原因，对以1.5μg/kg的一只雄性动物、以5μg/kg的3只雄性和2只雌性动物以及以15μg/kg的所有动物实施安乐死。此外，在第1天接受5μg/kg的一个剂量然后在第8天接受1.5μg/kg的单个剂量的一只雌性动物由于临床状况下降在第8天被安乐死。这些动物有严重的临床体征，包括脱水、活动减少、食物消费减少和驼背。按计划安乐死动物中与分子1相关的其他临床体征包括粪便缺乏、呕吐物、食欲降低和平均体重下降。分子1诱导的药理作用表明双特异性T细胞接合器的作用模式，例如(但不限于)急性期应答(以升高的C反应蛋白为代表)、瞬时细胞因子释放、和循环淋巴细胞活化的变化。
在≥1.5μg/kg时，施用分子1会导致多器官炎症，涉及表达间皮素的组织/细胞类型，包括腹部和胸部内脏的间皮细胞衬里的浆膜面以及几种组织的上皮，通常涉及基底层。与间皮细胞衬里的浆膜面相关的炎症和纤维增生/纤维化在一些动物中最终形成内脏粘连。在第29天以1.5μg/kg治疗的几只动物的肝脏和心脏(心包)中粘连在宏观上是明显的，但微观上浆膜纤维增生更为普遍。在器官表面表现出浆膜或被膜变化的组织包括以下(所有命运)：肾、肝、心、脾、肺、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肠系膜、膀胱、卵巢、子宫颈和子宫。显示出上皮变化的组织包括以下(所有命运)：肾、膀胱、食道、子宫颈、附睾、结膜、乳腺、下颌唾液腺、精囊、皮肤、十二指肠、胃、舌头、扁桃体、气管、子宫和阴道。间皮和上皮相关变化与继发性反应性组织变化有关，包括上皮变性/坏死、侵蚀/溃疡、再生、水肿伴纤维蛋白渗出和/或出血。肾小球变化与肾小球系膜轻度增加有关。临床病理变化与全身和组织特异性炎症应答一致。
未经治疗4周后，在0.10和5/1.5μg/kg下，几种组织的轻微微观变化部分恢复；大多数纤维化变化不是完全可逆的。分子1的最高非严重毒性剂量水平(HNSTD)被确定为0.1μg/kg。
为了降低毒性，分子2(SEQ ID NO:251，CH3 15-E11 CC x I2Lopt x G4 x scFcSEFL2 clipopt x G4 x MS 15-B12 CC x I2L_GQ)被开发为多靶向性(CDH3-MSLN)双特异性抗原结合分子，其中还使用了较低亲和力的MSLN结合物。由于根据本发明的多靶向性双特异性分子的两种优选低亲和力结合物的亲合力效应，这种较低亲和力结合物是可能的。则该分子2优选仅在如果两种抗肿瘤靶标如本文一般描述被同时结合的情况下具有活性。分子2对表达两种靶标的人癌细胞系的体外功效与分子1相当。图19显示了示例细胞毒性测定，其中人T细胞与人胃癌细胞系GSU Luc以E:T比率10:1孵育72小时。所得的EC50值在相似的范围内(分别地，对于分子1为2.078pM，相比之下对于分子2为1.060pM，参见图19)。
为了评估分子2是否降低了MSLN定向毒性，在第1、8和15天，通过以剂量1、10、100或1000μg/kg缓慢静脉内推注施用，在雄性食蟹猴中进行了重复剂量毒理学研究。没有死亡，也没有与治疗相关的临床体征，或对体重、食物消费、体温、检眼镜检查或凝血或尿液分析参数的影响。与分子1类似，分子2诱导的药理作用表明双特异性T细胞接合器分子的作用模式，例如(但不限于)急性期应答(以升高的C反应蛋白为代表)、瞬时细胞因子释放、和循环淋巴细胞活化的变化。
以≥10μg/kg施用分子2与轻微的微观变化有关，包括通常最小的或轻微的多器官浆膜单核或混合炎症细胞浸润，这与局灶性/多灶性间皮肥大相关。在以100μg/kg或1000μg/kg给药的2只动物中观察到其他微观变化，例如食道肥大/增生、舌头(粘膜上皮变性)和气管(杯状细胞肥大)中的混合细胞浸润以及与压力相关的胸腺萎缩。
与分子1相比，分子2在1000μg/kg时比分子1在1.5μg/kg时诱导的组织病理学变化严重程度更轻。图20显示了来自用1.5μg/kg分子1处理的动物(A，C)和用1000μg/kg分子2处理的动物(B，D)的肝(图20A、B)和肺(图20C、D)的代表性组织病理学苏木精/伊红染色。给药期结束时在第29天，分子1已诱导明显的包膜纤维增生/纤维化(A)和肝中叶间粘连的形成，在给药期结束时在第16天，分子2仅诱导最小的多灶性间皮肥大和浆膜混合细胞浸润/炎症(B)。在用分子2治疗的任何动物中均未观察到粘连。类似地，虽然分子1诱导了肺胸膜的中度纤维增生/纤维化(D)，但用分子2治疗的动物的肺没有表现出纤维增生/纤维化(D)。
结论
1.5μg/kg的分子1剂量不能耐受并导致死亡，而0.1μg/kg的剂量是耐受的。相反，分子2的耐受剂量高达1000μg/kg。分子1在1.5μg/kg剂量观察到的组织病理学变化通常分别比分子2在1000μg/kg剂量观察到的那些更严重。用分子2治疗后，不存在由分子1引起的粘连或不可逆的纤维化变化。因此，分子2的耐受性比分子1高约600(组织病理学)至10.000(耐受剂量)倍，尽管体外抗肿瘤细胞效力等同。
实例19单链多靶向性双特异性T细胞接合器分子相比于双链多靶向性双特异性T细胞接合器分子的选择性差距
测定物如先前关于本发明的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子的细胞毒性实例中那样准备。
Figure BDA0004213953400001701
与对应的GSU KO细胞(GSU KO CDH3和GSU KO MSLN)相比，测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1和2对MSLN和CDH3双阳性GSU wt细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。这些分子显示对双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞的大于80倍的EC50选择性差距。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1包含一个多靶向性双特异性T细胞接合器多肽链，而MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2包含两个双特异性T细胞接合器多肽链，它们通过异二聚体Fc连接以构建两链式多靶向性双特异性T细胞接合器分子。两者都具有[靶结合结构域x CD3结合结构域x间隔物x靶结合结构域x CD3结合结构域]的结构域排列。单靶向性对照T细胞接合器分子对单阳性细胞相比于双阳性细胞具有相当的活性(选择性差距为约1)。
Figure BDA0004213953400001711
实例20具有不同CD3亲和力的多靶向性双特异性T细胞接合器多肽(MBiTEP)的选择性差距测定物如先前关于本发明的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子的细胞毒性实例中那样准备。
Figure BDA0004213953400001712
Figure BDA0004213953400001721
表44：原初GSU细胞相比于靶标敲除GSU细胞的EC50值和选择性差距。b.c.t.：低于计算阈值(另参见图22)
Figure BDA0004213953400001722
表45：与具有KD 1.2E-08M的高亲和力CD3结合结构域I2C相比，MSLN-CDH3 T细胞接合器分子中使用的CD3结合结构域的活性降低
结果：MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1、2、4、5、6和7显示双阳性GSU wt细胞相比于对应的GSU KO细胞(GSU KO CDH3和GSU KO MSLN)之间的大于10倍的EC50选择性差距，其中MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1和2显示出最佳的选择性差距。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1、2、4和5包含两个相同的CD3结合结构域，其活性比具有1.2E-08M的KD的参考CD3结合结构域I2C低11至100倍。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子6和7中的两个CD3结合结构域不相同，并且仍然显示出GSU wt和对应的GSU KO细胞之间的活性差距，其中对双阳性细胞的EC50值较低。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子3包含两个高亲和力CD3结合结构域I2C并且仅显示对双阳性细胞相比于单阳性细胞的最大活性增加3倍。单靶向性对照T细胞接合器分子对单阳性细胞相比于双阳性细胞具有相当的活性(选择性差距为约1)。
Figure BDA0004213953400001731
实例21：靶向不同CDH3和MSLN表位簇的多靶向性双特异性T细胞接合器的选择性差距
用未刺激的人PBMC进行的基于萤光素酶的测定
效应细胞的分离
通过Ficoll密度梯度离心从富集的淋巴细胞制剂(血沉棕黄层，血库收集用于输血的血液的副产物)中制备人外周血单核细胞(PBMC)。血沉棕黄层由本地血库提供并且在采血后第二天制备PBMC。在Ficoll密度离心和用达尔伯克氏(Dulbecco’s)PBS(吉博科公司(Gibco))进行大量洗涤之后，经由与红细胞裂解缓冲液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μMEDTA)一起孵育，从PBMC中除去剩余的红细胞。剩余的淋巴细胞主要包含B和T淋巴细胞、NK细胞和单核细胞。将PBMC保持在含有10％ FCS(吉博科公司)的RPMI培养基(吉博科公司)中于37℃/5％ CO2下培养。
CD14+和CD56+细胞的耗尽
为了耗尽CD14+细胞，使用人CD14微珠(美天旎生物技术公司，MACS，#130-050-201)耗尽NK细胞人CD56微珠(MACS，#130-050-401)。对PBMC进行计数并在室温下以300x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于MACS分离缓冲液(60μL/107个细胞)。添加CD14微珠和CD56微珠(20μL/107个细胞)并且在4℃-8℃下孵育15min。用AutoMACS冲洗缓冲液(美天旎公司，#130-091-222)洗涤细胞(1-2mL/107个细胞)。在离心(参见上文)之后，弃去上清液并且将细胞重悬于MACS分离缓冲液(500μL/108个细胞)中。然后使用LS柱(美天旎生物技术公司，#130-042-401)分离CD14/CD56阴性细胞。将PBMC w/o CD14+/CD56+细胞调整至1.2x106个细胞/mL，并且在培养箱中在RPMI完全培养基(即补充有10％FBS(Bio West公司，#S1810)、1x非必需氨基酸(柏楉有限公司，#K0293)、10mM Hepes缓冲液(柏楉有限公司，#L1613)、1mM丙酮酸钠(柏楉有限公司，#L0473)和100U/mL青霉素/链霉素(柏楉有限公司，#A2213)的RPMI1640(柏楉有限公司，#FG1215))中在37℃下培养直至需要时。
靶细胞制备
将细胞收获，旋下并且在完全RPMI培养基中调整至1.2x105个细胞/mL。使用Nucleocounter NC-250(克莫麦特公司(Chemometec))以及含有吖啶橙和DAPI的溶液18染料(克莫麦特公司)确定细胞的活力。
基于萤光素酶的分析
将此测定设计为在多特异性抗体构建体的连续稀释液的存在下定量靶细胞的裂解。将等体积的萤光素酶阳性靶细胞和效应细胞(即PBMC w/o CD14+；CD56+细胞)混合，得到10:1的E:T细胞比。将42μL的此悬浮液转移到384孔板的每个孔中。添加8μL相应的多特异性抗体构建体的连续稀释液和阴性对照抗体构建体(识别无关靶抗原的基于CD3的抗体构建体)或RPMI完全培养基(作为另外的阴性对照)。多特异性抗体介导的细胞毒性反应在5％CO2加湿培养箱中进行48小时。然后将25μL底物(
Figure BDA0004213953400001751
试剂，普洛麦格公司(Promega))转移到384孔板。仅将活的萤光素酶阳性细胞与底物反应，并且因此产生发光信号。将样品用SPARK酶标仪(帝肯公司(TECAN))测量并且通过Spark Control Magellan软件(帝肯公司(TECAN))分析。
如下计算细胞毒性的百分比：
Figure BDA0004213953400001752
RLU＝相对光单位
阴性对照＝无多特异性抗体构建体的细胞
使用GraphPad Prism 7.04软件(图板软件公司(Graph Pad Software)，圣地亚哥)，将细胞毒性的百分比相对于相应的多特异性抗体构建体浓度绘图。使用四个参数逻辑回归模型来分析剂量反应曲线，用于评价具有固定坡面的S形剂量反应曲线，并计算EC50值。
以下靶细胞系用于基于萤光素酶的细胞毒性测定：
·HCT 116-LUC wt(CDH3+和MSLN+)
·HCT 116-LUC KO CDH3(CDH3-和MSLN+)
·HCT 116-LUC KO MSLN(CDH3+和MSLN-)
·CHO人CDH3+和MSLN+
·CHO人CDH3+
·CHO人MSLN+
Figure BDA0004213953400001761
表46：靶向对应细胞系上的不同CDH3表位簇的MSLN-CDH3 T细胞接合器的EC50值。
CDH3表位簇分析说明：
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1：CH3 15-E11 CC x I2L x G4 x scFc xG4 x MS15-B12 CC x I2L_GQ
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2：MS 15-B12 CC x I2L x(G4S)3x scFc x(G4S)3xCH3 24-D7 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子3：MS 15-B12 CC x I2L x G4 x scFc x G4 xCH322-A12 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子4：MS 15-B12 CC x I2L x G4 x scFc x G4 xCH3005-D5 CC x I2L
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子5：MS 15-B12 CC x I2L x(G4S)3x scFc x(G4S)3xCH3 26-E5 CC x I2L
阳性对照分子1：MS 5-F11x I2C scFc6
阳性对照分子2：CH3 G8A 6-B12 x I2C0-scFc
阴性对照分子1：EGFRvIII x I2C0 x scFc
结果：
Figure BDA0004213953400001771
表47：原初HCT 116细胞相比于敲除HCT 116细胞的EC50值(以pM)和差距
与对应的HCT 116k.o细胞(HCT 116CDH3 k.o和HCT 116MSLN k.o.)相比，测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子对MSLN和CDH3双阳性HCT 116wt细胞都显示出增加的活性(较低的EC50值)。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1和2对双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞显示了大于约100倍的EC50选择性差距(在两个位点)，因此是优选的(图23)和(表47)。测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子3、4和5对双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞显示了低于100倍的EC50选择性差距(图23)和(表47)。测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1和2含有表位D4B的CDH3结合物。测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子3包含表位D1B的CDH3结合物。测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子4包含表位D2C的CDH3结合物。测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子5包含表位D3A的CDH3结合物。
MSLN表位簇分析说明：
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1：MS 01-G11 CC x 6H10.09 x(G4S)3x scFc x(G4S)3x CH3 005-D5 CC x 6H10.09
MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2：MS R4L CC x I2C CC(44/100)x(G4S)3x scFc x(G4S)3x CH3 R164L CC x I2C CC(44/100)
阳性对照分子1：MS 5-F11x I2C scFc6
阳性对照分子2：CH3 G8A 6-B12 x I2C0-scFc
阴性对照分子1：EGFRvIII x I2C0 x scFc ID:
结果：
Figure BDA0004213953400001781
表48：双阳性人靶CHO细胞相比于单阳性人靶细胞EC50值(以pM)和差距
与对应的人靶单阳性CHO细胞相比，测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1和2对人MSLN和CDH3双阳性CHO细胞显示出增加的活性(较低的EC50值)。MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1对双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞显示了大于100倍的EC50选择性差距(在两个位点)。(图24)和(表48)。测试的MSLN-CDH3T细胞接合器分子2对双阳性靶细胞相比于单阳性靶细胞显示了低于100倍的EC50选择性差距(在一个位点)(图24)和(表48)。测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子1包含表位E1的MSLN结合物。测试的MSLN-CDH3 T细胞接合器分子2包含表位E2/E3的MSLN结合物。虽然分子2显示出良好的选择性，但分子1是优选的。
实例22：Ta细胞接合器与嵌合人/小鼠CDH3蛋白的表位聚簇
构建体的产生
人CDH3蛋白细胞外区被分成五个部分：(1)结构域1，指定为D1，(2)结构域2，指定为D2，(3)结构域3，指定为D3，(4)结构域4，指定为D4和(5)结构域5，指定为D5。表位区域D1、D2、D3、D4和D5进一步被分为三个子部分，指定为D1A、D1B、D1C、D2A、D2B、D2C、D3A、D3B、D3C、D4A、D4B、D4C、D5A、D5B和D5C。
表50：D2B、D2C、D3A和D4B具有人CDH3蛋白的以下氨基酸序列和位置(aa)：
Figure BDA0004213953400001791
人/小鼠嵌合蛋白是通过用来自小鼠CDH3蛋白的相应区域替换人CDH3蛋白的结构域D1、D2、D3、D4、D5或对应子部分来产生。
小鼠CDH3的细胞外结构域和所有嵌合人/小鼠CDH3构建体融合到EpCAM的跨膜和细胞质结构域，其对于此处描述的测定没有意义，以下称为xEpC。图25描述了以上所述的各个构建体的蛋白质序列。将编码全长人CDH3、小鼠CDH3xEpC蛋白或人/小鼠嵌合CDH3xEpC蛋白的脱氧核糖核酸(DNA)序列各自克隆至pEFdhfr载体并且稳定转染至CHO二氢叶酸还原酶阴性(DHFR-)细胞中。上述方法可以应用于结合本发明的CDH3的任何抗原结合分子。
转染
CHO DHFR-细胞根据标准方案用编码人CDH3蛋白、小鼠CDH3xEpC蛋白或嵌合人/小鼠CDH3xEpC蛋白的DNA转染。细胞在具有补充剂的RPMI培养基中生长24小时。24小时后，通过核苷剥夺对表达人CDH3、小鼠CDH3xEpC或嵌合人/小鼠CDH3xEpC蛋白的粘附生长细胞进行选择，并且将细胞在37°下在加湿培养箱中在具有Pen/Strep的海克隆公司(HyClone)培养基中培养。
流式细胞术
为了验证人CDH3蛋白或嵌合人/小鼠CDH3xEpC蛋白在稳定转染的CHO中的表达，用5μg/mL抗人CDH3抗体(R&D系统，克隆104805)和1:100稀释的PE标记的抗小鼠Fcy第二抗体(杰克逊公司(Jackson)115-116-071)孵育细胞。为了验证小鼠CDH3xEpC蛋白在稳定转染的CHO上的表达，将细胞与小鼠交叉反应性抗人CDH3 scFv G7的周质提取物(用PBS 1:6稀释)和1:50稀释的经PE标记的抗FLAG抗体(克隆L5；百进公司(BioLegend)637310)进行孵育。为了评估T细胞接合器SEQ ID NO:434与在转染的细胞上表达的蛋白质的结合，将细胞与5μg/mL的T细胞接合器SEQ ID NO:434孵育。使用1:50稀释的经PE标记的抗人Fcy抗体检测T细胞接合物SEQ ID NO:434的结合。将所有抗体在具有钙(吉博科公司14040-117)和2％ FBS的PBS中稀释并且将所有孵育在4℃进行30分钟。使用具有钙(吉博科公司14040-117)和2％FBS的PBS进行洗涤并且在FACS分析之前也用具有钙(吉博科公司14040-117)和2％ FBS的PBS洗涤最终悬浮缓冲液。使用BD
Figure BDA0004213953400001801
II流式细胞仪检测抗体结合。用BD
Figure BDA0004213953400001802
(v8.1)、
Figure BDA0004213953400001803
和
Figure BDA0004213953400001804
分析平均荧光变化。
分析
通过流式细胞术检测到的信号减少反映了与各种人/小鼠嵌合CDH3蛋白的结合丧失。
结果
图25描述具有着色表位部分的人CDH3和小鼠CDH3xEpC的蛋白质序列的比对。作为一般适用于本发明，CDH3蛋白的细胞外结构域1被指定为D1，随后的结构域2、3、4和5被指定为D2、D3、D4和D5。对于更精细的表位聚簇，细胞外结构域D1、D2、D3、D4和D5被进一步分为子部分A、B和C。对于表位聚簇，产生嵌合人/小鼠CDH3蛋白，其中人CDH3蛋白的区域被小鼠CDH3蛋白的相应区替代。由于T细胞接合器SEQ ID NO:434和抗人CDH3抗体不结合小鼠CDH3蛋白(图26)，可以通过以下来鉴定结合表位区域：系统地用小鼠蛋白质替换人蛋白质的部分(人/小鼠CDH3嵌合体)，并确定哪个嵌合体不再被T细胞接合器SEQ ID NO:434识别。人CDH3、小鼠CDH3xEpC和嵌合人/小鼠CDH3xEpC蛋白在CHO细胞中稳定表达，并且T细胞接合器SEQ ID NO:434、抗人CDH3抗体和小鼠交叉反应性抗人CDH3scFv G7与表面表达的蛋白的结合是通过流式细胞术评估(图26)。
T细胞接合器SEQ ID NO:434与表达全长人CDH3蛋白的细胞结合，表明它识别人细胞外结构域。T细胞接合器SEQ ID NO:434不与表达小鼠CDH3蛋白的细胞结合，表明它不识别小鼠细胞外结构域。当评估与结构域交换蛋白的结合时，T细胞接合器SEQ ID NO:434显示与除D4和D4B之外的所有人/小鼠嵌合CDH3蛋白结合。如果人D4或D4B结构域分别被小鼠D4或D4B结构域替换，则SEQ ID NO:434不识别嵌合蛋白。SEQ ID NO:434的结合不受D1、D2、D3、D5或其各自子部分A、B或C交换的影响。总之，T细胞接合器SEQ ID NO:434显示与表位簇D4B的结合丧失。
实例23
具有嵌合人/小鼠MSLN蛋白的T细胞接合器SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251的表位聚簇
构建体的产生
成熟的人MSLN蛋白细胞外区域分为六个部分(以下称为表位部分)：(1)表位部分1，指定为E1，(2)表位部分2，指定为E2，(3)表位部分3，指定为E3，(4)表位部分4，指定为E4，(5)表位部分5，指定为E5和(6)表位部分6，指定为E6。
表51：E1、E2、E3、E4和E5具有人MSLN蛋白的以下氨基酸序列和位置(aa)：
Figure BDA0004213953400001811
Figure BDA0004213953400001821
人/小鼠嵌合蛋白是通过用来自小鼠MSLN蛋白的相应区域替换人MSLN蛋白的表位部分E1、E2、E3、E4、E5或E6来产生。图1描绘了以上所述的各个构建体的蛋白质序列。将编码全长人、小鼠或人/小鼠嵌合MSLN蛋白的脱氧核糖核酸(DNA)序列各自克隆至pEFdhfr载体并且稳定转染至CHO二氢叶酸还原酶阴性(DHFR-)细胞中。
转染
CHO DHFR-细胞根据标准方案用编码全长人MSLN蛋白、全长小鼠MSLN蛋白或嵌合人/小鼠MSLN蛋白的DNA转染。细胞在具有补充剂的RPMI培养基中生长24小时。24小时后，通过核苷剥夺对表达人MSLN、小鼠MSLN或嵌合人/小鼠MSLN蛋白的粘附生长细胞进行选择，并且将细胞在37°下在加湿培养箱中在具有Pen/Strep的海克隆公司(HyClone)培养基中培养。
流式细胞术
为了验证人MSLN蛋白或嵌合人/小鼠MSLN蛋白在稳定转染的CHO中的表达，将细胞与5μg/mL抗人MSLN抗体(赛默飞世尔公司MA1-26527，克隆1)和1:100稀释的PE标记的抗小鼠Fcy第二抗体(杰克逊公司(Jackson)115-116-071)进行孵育。为了验证小鼠MSLN蛋白在稳定转染的CHO上的表达，将细胞与5μg/mL的小鼠交叉反应性抗人MSLN BiTE R4T和1:50稀释的经PE标记的抗人Fcy抗体(杰克逊公司109-116-098)进行孵育。为了评估T细胞接合器SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251与在转染的细胞上表达的蛋白质的结合，将细胞与5μg/mL的T细胞接合器SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251进行孵育。使用1:50稀释的经PE标记的抗人Fcy抗体检测T细胞接合物SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251的结合。将所有抗体在具有2％FBS的PBS中稀释并且将所有孵育在4℃下进行30分钟。使用具有2％FBS的PBS进行洗涤并且在FACS分析之前也用具有2％ FBS的PBS洗涤最终悬浮缓冲液。使用BD
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II流式细胞仪检测抗体结合。用BD
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(v8.1)、
Figure BDA0004213953400001833
和
Figure BDA0004213953400001834
分析平均荧光变化。
分析
通过流式细胞术检测到的信号减少反映了与各种人/小鼠嵌合MSLN蛋白的结合丧失。
结果
图27描述具有着色表位部分的人MSLN和小鼠MSLN的蛋白质序列的比对。MSLN蛋白的细胞外结构域被分成六个部分，其指定为表位部分。如在本发明的上下文中普遍适用的，MSLN蛋白的表位部分1被指定为E1，表位部分2、3、4、5和6分别被指定为E2、E3、E4、E5和E6。对于表位聚簇，产生嵌合人/小鼠MSLN蛋白，其中人MSLN蛋白的区域被小鼠MSLN蛋白的相应区替代。由于T细胞接合器SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251不结合小鼠MSLN蛋白(图28)，可以通过以下来鉴定结合表位区域：系统地用小鼠蛋白质替换人蛋白质的部分(人/小鼠MSLN嵌合体)，并确定哪个嵌合体不再被T细胞接合器SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251识别。人MSLN、小鼠MSLN和嵌合人/小鼠MSLN蛋白在CHO细胞中稳定表达，并且T细胞接合器SEQ IDNO:434和SEQ ID NO:251和抗人MSLN抗体与表面表达的蛋白的结合通过流式细胞术评估(图28)。T细胞接合器SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251与表达全长人MSLN蛋白的细胞结合，表明它识别人细胞外结构域。T细胞接合器SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251不与表达小鼠MSLN蛋白的细胞结合，表明它不识别小鼠细胞外结构域。当评估与结构域交换蛋白的结合时，T细胞接合器SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251显示与人/小鼠嵌合MSLN蛋白E2、E3、E4、E5和E6的结合。如果将MSLN的人E1表位部分替换为对应的小鼠E1表位部分，则SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251不识别嵌合蛋白。SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251的结合不受E2、E3、E4、E5或E6的人序列与对应小鼠序列的交换的影响。
总之，本发明的代表性T细胞接合器SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:251显示与MSLN表位簇E1的结合丧失。
表53：序列表：为保持可读性，在说明书中可能表示为“G4”、“(G4S)n”、“(G4Q)n”等的接头不一定在具有这种连接的结合结构域的表中表示。不存在此类接头的表示并不意味着表中的分子与包含接头信息的名称下的描述中的相应分子不同。“CC”表示结合结构域内的二硫键，“I2L”、“I2C”、“I2M”和“I2M2”表示CD3结合结构域。靶结合结构域可以缩写为例如“CH3”代表“CDH3”、“CL1”代表“CLL1”、“FL”代表“FLT3”和“MS”代表“MSLN”。
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Claims (60)

1.一种包含至少一条多肽链的分子，其中该分子包含
(i.)第一结合结构域，其优选包含互补位，该互补位特异性结合第一靶细胞表面抗原(例如TAA1)，
(ii.)第二结合结构域，其优选包含互补位，该互补位特异性结合人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位，
(iii.)第三结合结构域，其优选包含互补位，该互补位特异性结合第二靶细胞表面抗原(例如TAA2)，和
(iv.)第四结合结构域，其优选包含互补位，该互补位特异性结合人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位，
其中该第一结合结构域和该第二结合结构域形成第一双特异性实体，该第三结合结构域和该第四结合结构域形成第二双特异性实体，并且
其中该分子包含具有至少约5kDa的分子量和/或具有超过50个氨基酸的长度的间隔物实体，其中该间隔物实体将该第一双特异性实体和该第二双特异性实体间隔开至少约
Figure FDA0004213953390000011
的距离，其中指示的距离被理解为该第一双特异性实体和该第二双特异性实体的质心之间的距离，并且该间隔物实体位于该第一双特异性实体和该第二双特异性实体之间。
2.根据权利要求1所述的分子，其是抗原结合分子，优选是双特异性抗原结合分子，更优选是多靶向性双特异性抗原结合分子。
3.根据权利要求2所述的抗原结合分子，其中以氨基到羧基的顺序，结构域排列选自由以下组成的组：
(i.)第一和第二结构域、间隔物、第三和第四结构域
(ii.)第一和第二结构域、间隔物、第四和第三结构域
(iii.)第二和第一结构域、间隔物、第三和第四结构域，以及
(iv.)第二和第一结构域、间隔物、第四和第三结构域。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中所述间隔物实体具有至少10kDa，更优选至少15kDa、20kDa或甚至50kDa的分子量，和/或其中所述间隔物实体包含含有超过50个氨基酸、优选至少100个氨基酸、更优选至少250个氨基酸、甚至更优选至少500个氨基酸的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中所述间隔物实体是刚性分子，其优选折叠成二级结构，优选螺旋结构，和/或三级结构，优选蛋白质结构域结构，最优选球状蛋白质和/或其部分和/或球状蛋白质和/或其部分的组合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该间隔物实体是球状蛋白质，其中位于N末端的第一个氨基酸的Cα原子和位于C末端的最后一个氨基酸的Cα原子之间的距离间隔至少
Figure FDA0004213953390000021
优选至少
Figure FDA0004213953390000022
更优选至少
Figure FDA0004213953390000023
以便将该第一双特异性实体和该第二双特异性实体有效地间隔开优选至少
Figure FDA0004213953390000024
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中将该第一双特异性实体和该第二双特异性实体充分间隔开的所述间隔物实体选自由以下组成的组：泛素、β2微球蛋白、SAND结构域、绿色荧光蛋白(GFP)、VHH抗体lama结构域、来自Met受体的PSI结构域、来自生腱蛋白的纤连蛋白III型结构域、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4、CD137L胞外域、白介素-2、来自人程序性细胞死亡1配体1(PDL1)的PD-1结合结构域、Tim-3(AS 24-130)、MiniSOG、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)结构域、人血清白蛋白(HSA)或任何前述间隔物实体的衍生物、刚性接头的多聚体、和Fc结构域或其二聚体或三聚体，每个Fc结构域包含两个多肽单体，每个多肽单体包含铰链、CH2和CH3结构域铰链以及另外的CH2和CH3结构域，其中所述两个多肽单体通过肽接头彼此融合，或其中这两个多肽单体通过非共价CH3-CH3相互作用和/或共价二硫键连接在一起形成异二聚体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中所述间隔物实体是至少一个Fc结构域，优选一个结构域或两个或三个共价连接的结构域，该结构域或这些结构域中的每一个以氨基到羧基的顺序包含：
铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该间隔物实体的所述多肽单体中的每一个具有与选自下组的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:17-24，其中优选地所述多肽单体中的每一个具有选自SEQ ID NO:17-24的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该间隔物中的CH2结构域包含结构域内半胱氨酸二硫桥。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该分子是单多肽链。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该间隔物实体包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:13和15至16和25至34泛素(SEQ ID NO:1081)、β2微球蛋白(SEQ ID NO:1083)、SAND结构域(SEQ ID NO:1084)、绿色荧光蛋白(GFP)(SEQ ID NO:1085)、VHH抗体lama结构域(SEQ ID NO:1086)、来自Met受体的PSI结构域(SEQID NO:1087)、来自生腱蛋白的纤连蛋白III型结构域(SEQ ID NO:1088)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(SEQ ID NO:1089)、白介素-4(SEQ ID NO:1090)、CD137L胞外域(SEQ ID NO:1091)、白介素-2(SEQ ID NO:1092)、来自人程序性细胞死亡1配体1(PDL1)的PD-1结合结构域(SEQ ID NO:1093)、Tim-3(AS 24-130)(SEQ ID NO:1094)、MiniSOG(SEQID NO:1095)、程序性细胞死亡蛋白1(PD1)结构域(SEQ ID NO:16)、人血清白蛋白(has，SEQID NO:15)或其具有至少90％优选95％或甚至98％序列同一性的氨基酸，优选scFc(SEQ IDNO:25)。
13.根据前述权利要求1至7中任一项所述的抗原结合分子，其中该分子包含两条多肽链。
14.一种包含两条多肽链的抗原结合分子，其中
(i.)第一多肽链包含与第一靶细胞表面抗原(例如TAA1)特异性结合的第一结合结构域，与人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位特异性结合的第二结合结构域，和优选包含铰链、CH2和CH3结构域的第一多肽单体，并且
(ii.)其中第二多肽链包含与第二靶细胞表面抗原(例如TAA2)特异性结合的第三结合结构域，与人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位特异性结合的第四结合结构域，和优选包含铰链、CH2和CH3结构域的第二多肽单体，
其中这两个多肽单体形成分别使这两个肽单体的CH2和CH3结构域配对的异二聚体，其中该第一肽单体的CH2结构域在该第一双特异性实体的C末端位置连接至所述实体的第一或第二结构域，并且其中该第二肽单体的CH3结构域在该第二双特异性实体的N末端位置连接至所述实体的第三或第四结构域，即，该第二多肽链的N末端在该第二多肽单体的CH2结构域处，并且C末端在该第三或第四结构域处，
其中优选地，该第一和第二多肽单体形成异二聚体，从而连接该第一和第二多肽链。
15.根据权利要求14所述的抗原结合分子，其中该第一肽链的第一肽单体是SEQ ID NO35并且该第二肽链的第二肽单体是SEQ ID NO 36，其中这两个肽单体优选地形成异二聚体。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该抗原结合分子的特征在于
(i)该第一结构域和该第三结构域包含两个抗体衍生的可变结构域，并且该第二结构域和该第四结构域包含两个抗体衍生的可变结构域；
(ii)该第一结构域和该第三结构域包含一个抗体衍生的可变结构域，并且该第二结构域和该第四结构域包含两个抗体衍生的可变结构域；
(iii)该第一结构域和该第三结构域包含两个抗体衍生的可变结构域，并且该第二结构域和该第四结构域包含一个抗体衍生的可变结构域；或者
(iv)该第一结构域包含一个抗体衍生的可变结构域，并且该第三结构域包含一个抗体衍生的可变结构域。
17.根据前述权利要求1至7中任一项所述的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含两条多肽链，其中
该第一多肽链包含该第一结构域的VH，VH第二结构域，优选包含铰链、CH2和CH3结构域的第一多肽单体，该第三结构域的VH和该第四结构域的VH；并且
该第二多肽链包含该第一结构域的VL，VL第二结构域，优选包含铰链、CH2和CH3结构域的第一多肽单体，该第三结构域的VL和该第四结构域的VL，
其中优选地，该第一和第二多肽单体形成异二聚体，从而连接该第一和第二多肽链。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该抗原结合分子，其中该第一、第二、第三和第四结合结构域各自以氨基到羧基的顺序包含VH结构域和VL结构域，其中每个结构域内的VH和VL通过肽接头连接，优选以下柔性接头，该柔性接头包含丝氨酸、谷氨酰胺和/或甘氨酸作为氨基酸结构单元，优选仅丝氨酸(Ser，S)或谷氨酰胺(Gln，Q)和甘氨酸(Gly，G)，更优选(G4S)n或(G4Q)n，甚至更优选SEQ ID NO:1或3。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该肽接头包含S(G4X)n和(G4X)n或由其组成，其中X选自由Q、T、N、C、G、A、V、I、L和M组成的组，并且其中n是选自整数1至20的整数，优选其中n是1、2、3、4、5或6，优选其中X是Q，其中优选该肽接头是(G4X)n，n是3，并且X是Q。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一结合结构域和该第二结合结构域以及该第三结合结构域和该第四结合结构域之间的肽接头优选是柔性接头，该柔性接头包含丝氨酸、谷氨酰胺和/或甘氨酸或谷氨酸、丙氨酸和赖氨酸作为氨基酸结构单元，优选选自由SEQ ID NO:1至4、6至12和1125组成的组。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一结合结构域或该第二结合结构域与该间隔物之间的肽接头，和/或该第三结合结构域和该第四结合结构域与该间隔物之间的肽接头分别优选是富含小氨基酸和/或亲水性氨基酸、优选甘氨酸的短接头并且优选是SEQ ID NO:5。
22.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一靶细胞表面抗原和该第二靶细胞表面抗原中的任一个选自由以下组成的组：CS1、BCMA、CDH3、FLT3、CD123、CD20、CD22、EpCAM、MSLN和CLL1。
23.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一靶细胞表面抗原和该第二靶细胞表面抗原不相同。
24.根据前述权利要求1至22中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一靶细胞表面抗原和该第二靶细胞表面抗原相同。
25.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一结合结构域能够结合该第一靶细胞表面抗原并且同时该第三结合结构域能够结合该第二靶细胞表面抗原，优选其中该第一靶细胞表面抗原和该第二靶细胞表面抗原在同一靶细胞上。
26.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一靶细胞表面抗原和该第二靶细胞表面抗原分别选自由以下组成的组：CS1和BCMA、BCMA和CS1、FLT3和CD123、CD123和FLT3、CD20和CD22、CD22和CD20、EpCAM和MSLN、MSLN和EpCAM、MSLN和CDH3、CDH3和MSLN、FLT3和CLL1、以及CLL1和FLT3。
27.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一靶细胞表面抗原和/或该第二靶细胞表面抗原是人MSLN(选自SEQ ID NO:1181、1182和1183)，并且其中本发明的抗原结合分子的第一和/或第三结合结构域如本文所述通过鼠嵌合序列分析确定结合人MSLN表位簇E1(SEQ ID NO:1175，根据Kabat的aa 296-346位置)，但优选不结合人MSLN表位簇E2(SEQ ID NO:1176，根据Kabat的aa 247-384位置)、E3(SEQ ID NO:1177，根据Kabat的aa 385-453位置)、E4(SEQ ID NO:1178，根据Kabat的aa 454-501位置)和/或E5(SEQ IDNO:1179，根据Kabat的aa 502-545位置)。
28.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一靶细胞表面抗原和/或该第二靶细胞表面抗原是人CDH3(SEQ ID NO:1170)，并且其中根据权利要求1所述的抗原结合分子的第一和/或第三结合结构域结合人CDH3表位簇D2B(SEQ ID NO:1171，根据Kabat的aa 253-290位置)、D2C(SEQ ID NO:1172，根据Kabat的aa 291-327位置)、D3A(SEQID NO:1173，根据Kabat的aa 328-363位置)和D4B(SEQ ID NO:1174，根据Kabat的aa 476-511位置)，优选D4B(SEQ ID NO:1174，根据Kabat的aa 476-511位置)，如本文所述通过鼠嵌合序列分析确定。
29.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第二结合结构域和该第四结合结构域(CD3结合结构域)均具有(i.)特征在于低于由表面等离子体共振(SPR)测量的约1.2x 10-8M的KD值的亲和力，或(ii.)特征在于由SPR测量的约1.2x 10-8M的KD值的亲和力。
30.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第二结合结构域和该第四结合结构域(CD3结合结构域)具有特征在于由SPR测量的约1.0x 10-7至5.0x 10-6M，优选地由SPR测量的约1.0至3.0x 10-6M、更优选约2.5x 10-6M的KD值的亲和力。
31.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第二结合结构域和该第四结合结构域(CD3结合结构域)具有特征在于由SPR测量的约1.0x 10-7至5.0x 10-6M，优选地由SPR测量的约1.0至3.0x 10-6M、更优选约2.5x 10-6M的KD值的亲和力。
32.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第二结合结构域和该第四结合结构域(CD3结合结构域)各自单独具有比一个包含根据SEQ ID NO 43的VH和根据SEQ ID NO 44的VL的CD3结合结构域低至少约10倍、优选至少约50倍或更优选至少约100倍的活性(即在单靶向性环境中，相比于双靶向性环境)。
33.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第二结合结构域和该第四结合结构域包含VH区和VL区，该VH区包含选自SEQ ID NO 37至39、45至47、53至55、61至63、69至71、436至438、1126至1128、1136至1138、1142至1144和1148至1150的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，该VL区包含选自SEQ ID NO 40至42、48至50、56至58、64至66、72至74、439至441、1129至1131、1139至1141、1145至1147、和1151至1153的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，优选61至63和64至66。
34.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第二结合结构域和该第四结合结构域包含选自SEQ ID NO 43、51、59、67、75、442和1132，优选67的VH区。
35.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第二结合结构域和该第四结合结构域包含选自SEQ ID NO 44、52、60、68、76、443和1133，优选68的VL区。
36.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第二结合结构域和该第四结合结构域包含选自SEQ ID NO 43、51、59、67、75442和1132，优选67的VH区和选自SEQID NO 44、52、60、68、和76、443和1133，优选68的VL区，其中当该VH区是1132并且该VL区是1133时，作为scFab结构域的该第二和/或第四结合结构域另外包含SEQ ID NO:1134的CH1结构域和SEQ ID NO:1135的CLK结构域，并且其中该VH和VL区通过优选选自SEQ ID NO 1、和3和1125的接头彼此连接。
37.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域结合CDH3并包含VH区，该VH区包含SEQ ID NO:1154作为CDR-H1，其中X1(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)是S或N，X2是Y或S，X3是P或W，X4是I或M且X5是Y、N或H；SEQ ID NO:1155作为CDR-H2，其中X1是K、V、N或R；X2是A、D、R、Y、S、W或H；X3是Y、S、P、G或T；X4是S、G或K；X5是A、V、D、K、G、或T；X6是A、V、D、K、S、G或H；X7是Y、G、或E；X8是K、I、或N；X9是A、S、或N；X10是S、Q或G；X11是S或K；X12是F或V；并且X13是K或Q；以及SEQ ID NO:1156作为CDR-H3，其中X1是F或Q；X2是R、K、S或W；X3是G或D；X4是Y、P或R；X5是R、S、G、N或T；X6是Y、A或H；X7是F、L或M；X8是A或V；X9是Y或V；并且其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域结合CDH3并包含VL区，该VL区包含SEQ ID NO:1158作为CDR-L1，其中X1是K或R，X2是A或S；X3是Q、D、S、G或E；X4是S、D或N；X5是V、L或I；X6是K、Y、S、或H；X7是S或N；X8是F、L或M；并且X9是A、N或H；SEQ ID NO:1159作为CDR-L2，其中X1是Y、G、W、或N；X2是T或A；X3是S或K；X4是T、N或R；X5是L或R；X6是E、A、V或H；并且X7是S或E；和SEQ ID NO:1160作为CDR-L3，其中X1是Q或V；X2是Q、N或H；X3是F、L、Y、W、N、或H；X4是A、D、Y、S或N；X5是Q、R、S、G、W或M；X6是T、Y或F；并且X7是F、Y或L。
38.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域结合MSLN并包含VH区，该VH区包含SEQ ID NO:1162作为CDR-H1，其中X1(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)是S、G或D；X2是Y、A、G或F；X3是I、W、或M；并且X4是V、S、G、T、或H；SEQ ID NO:1163作为CDR-H2，其中X1是A、S、N、W、Y、或V；X2是Y、S或N；X3是Y、G、P、或S；X4是D、H、S、或N；X5是G或S；X6是E、G或S；X7是G、S、N、F、T或Q；X8是S、W、K、D、I或T；X9是Y或N；X10是A或N；X11是A、P、N、D、E、I或Q；X12是D、A、S或K；X13是V、L、或F；X14是K或Q；并且X15是G或S；以及SEQ ID NO:1164作为CDR-H3，其中X1是D、E或V；X2是R、G、或E；X3是Y、A、或N；X4是S、Y、V、或H；X5是A、P、F、Y或H；X6是R或S；X7是E或G；X8是Y或L；X9是R、Y或L；X10是Y或G；X11是D或Y；X12是R、Y或F；X13是M、S、F、D或Y；X14是A、G、S或T；X15是L、M或F；并且X16是Y、I或V；并且其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域结合MSLN并包含VL区，该VL区包含SEQ ID NO:1166作为CDR-L1，其中X1是A或S；X2是G或S；X3是E或Q；X4是G、S或K；X5是I、L、V或F；X6是R、G或S；X7是D、S、N或T；X8是A、S、K或T；X9是Y或W；X10是V或L；并且X11是Y或A；SEQ ID NO 1167作为CDR-L2，其中X1是A、G或Q；X2是A或S；X3是S或T；X4是G、S、K、I或T；X5是R或L；X6是A、P或Q；并且X7是S或T；和SEQ ID NO 1168作为CDR-L3，其中X1是A或Q；X2是Y、S、A、或T；X3是G、E、Y、H或Q；X4是A或S；X5是S、T或F；X6是P或T；X7是R、A、L或F；并且X8是V或T。
39.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域结合CDH3并包含SEQ ID NO:1157的VH区，其中(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)X1是Q或E；X2是V、L；X3是Q、E；X4是A或G；X5是G或E；X6是V或L；X7是K或V，X8是K或Q，X9是A或G，X10是V或L，X11是K或R，X12是V或L，X13是A或K，X14是Y或F，X15是T或S，X16是T或S，X17是S或N，X18是Y或S，X19是P或W，X20是I或M，X21是Y、N或H，X22是T或A，X23是Q或K，X24是V或M，X25是S或G，X26是K、V、N或R，X27是A、D、R、Y、S、W或H，X28是Y、S、P、Gr或T，X29是S、K、或G，X30是A、V、D、K或T；X31是A、D、K、S、G或H；X32是Y、G、或E，X33是K、I、或N，X34是A、S、或N，X35是S、Q、或G，X36是S或K，X37是F或V，X38是Q或K，X39是F或V，X40是I或M，X41是T或S，X42是V、I或R，X43是T、K或N，X44是T、A、S或K，X45是S或N，X46是A、V或L，X47是L或M，X48是Q或E，X49是L或M，X50是S或N，X51是S或R，X52是T或R，X53是A或S，X54是G、D或E；X55是T或S，X56是T、K、或R，X57是S、Q、W、或R，X58是D、或G，X59是Y、P、或R；X60是F、S、G、N或T，X61是Y、A、或H，X62是A、-、或V，X63是F或M，X64是Y或V；X65是T、L或M；和SEQ ID NO 1161的VL区，其中X1是D或E；X2Q或V；X3是L、M；X4是A、S或D；X5是F、S或T；X6是A或S；X7是A或V；X8是P、V或L；X9是D或E；X10是A或V；X11是I或L；X12是T、S、或N；X13是K或R；X14是A、S；或X15是Q、D、S、G或E；X16是S、D或N；X17是V、I或L；X18是K、Y、S或H；X19是S或N；X20是F、L或M；X21是A、N或H；X22是K或Q；X23是A、P或V；X24是K或R；X25是I或V；X26是Y、G、W或N；X27是T或A；X28是S或K；X29是T、N或R；X30是L或R；X31是E、A、V或H；X32是S或E；X33是A、S、V或D；X34是D或E；X35是T或K；X36是S或R；X37是A、S或P；X38是F或V；X39是A、G；X40是T或V；X41是Q或V；X42是Q、N、H；X43是F、L、Y、W、N或H；X44是A、D、Y、S或N；X45是Q、R、S、G、W或M；X46是F、Y或T；X47是F、Y或L；X48是V或L；并且X49是D或E(其中每个位置的所有aa都优选意味着以替代性“或”的方式，即使没有明确说明)。
40.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域结合MSLN并包含SEQ ID NO:1165的VH区，其中(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)X1是E或Q；X2是V、L或Q；X3是E或Q；X4是A、G或P；X5是E或G；X6是V或L；X7是V或K；X8是K或Q；X9是G或S；X10是E、A、G或R；X11是S或T；X12是V或L；X13是R、S或K；X14是V或L；X15是S或T；X16是A、K或T；X17是A或V；X18是Y、I或F；X19是S或T；X20是S或F；X21是S或T；X22是D、G或S；X23是Y、G、A或F；X24是I、W或M；X25是G、S、V、T或H；X26是I或V；X27是A或P；X28是M、K或Q；X29是G或C；X30是I、M、V或L；X31是A、G或S；X32是A、S、N、W、Y或V；X33是Y、S或N；X34是Y、G、P或S；X35是D、H、S或N；X36是G或S；X37是E、G或S；X38是G、S、N、F、T或Q；X39是S、K、W、D、I或T；X40是Y或N；X41是A或N；X42是A、P、N、E、D、I或Q；X43是D、A、S或K；X44是V、L或F；X45是K、Q；X46是G或S；X47是V或F；X48是I或M；X49是S或T；X50是R或V；X51是N或T；X52是A或S；X53是I或K；X54是S或N；X55是S、T或Q；X56是A、L或F；X57是Y、S或F；X58是L或M；X59是E、K或Q；X60是M或L；X61是S或N；X62是R或S；X63是V或L；X64是R或T；X65是A或S；X66是D、A或E；X67是R或K；X68是D、E、V或L；X69是E、R、G或P；X70是R、A、N或Y；X71是G、S、Y、V或H；X72是A、P、F、D或Y；X73是R或G；X74是M、R、S或D；X75是E或G；X76是Y或L；X77是Y或F；X78是Y、S或F；X79是A、G、S、T或H；X80是L、M或F；X81是Y、I或V；并且X82是L、M或T；以及SEQ ID NO 1169的VL区(“X”后面的数字表示序列表中N到C方向的各个氨基酸序列中“X”的数字顺序)X1是E、S或D；X2是Y、I或L；X3是E、V或T；X4是V、L或M；X5是P或S；X6是G或S；X7是S或T；X8是V或L；X9是A、V或L；X10是P或V；X11是E、Q或D；X12是R或T；X13是A或V；X14是S或T；X15是I或L；X16是S或T；X17是A或S；X18是G或S；X19是E或Q；X20是G、S或K；X21是I、V、L或F；X22是R、G或S；X23是D或S；X24是A、S、N、K或T；X25是Y、W或M；X26是V或L；X27是Y或A；X28是K或Q；X29是A、S或V；X30是R、V或K；X31是V或L；X32是A、G或Q；X33是A或S；X34是S或T；X35是G、S、K、I或T；X36是R或L；X37是A、P或Q；X38是S或T；X39是I或V；X40是E、S或D；X41是G或N；X42是N或T；X43是D或T；X44是A或F；X45是R、G或S；X46是L或T；X47是E或Q；X48是A或P；X49是E或M；X50是E或F；X51是D、V或T；X52是A或Q；X53是Y、S、A或T；X54是G、E、Y、H或Q；X55是A或S；X56是S、T或F；X57是P或T；X58是R、A、L或F；X59是V或T；X60是P或C；X61是V或L；X62是E或T；X63是I或V；并且X64是L或K(其中每个位置的所有aa都优选意味着以替代性“或”的方式，即使没有明确说明)。
41.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域包含VH区，该VH区包含选自以下的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：SEQ ID NO:77至79、86至88、95至97、103至105、111至113、119至121、127至129、135至137、143至145、151至153、159至161、168至170、177至179、185至187、194至196、203至205、212至214、221至223、230至232、238至240、334至336、356至358、365至367、376至378、385至387和194、432和196、446至448、454至456、462至464、470至472、478至480、486至488、494至496、502至504、510至512、518至520、526至528、534至536、542至544、550至552、558至560、566至568、574至576、582至584、590至592、598至600、606至608、614至616、622至624、630至632、638至640、646至648、654至656、662至664、670至672、678至680、686至688、694至696、702至704、710至712、718至720、726至728、734至736、742至744、750至752、758至760、766至768、774至776、782至784、790至792、798至800、806至808、814至816、822至826、830至832、838至840、846至848、854至856、862至864、870至872、878至880、886至888、894至896、902至904、910至912、918至920、926至928、934至936、942至944、950至952、958至960、966至968、974至976、982至984、990至992、998至1000、1006至1008、1014至1016、1022至1024、1030至1032、1038至1040、1046至1048、1054至1056、和1062至1064，或优选地如序列表格表52中一起披露的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的任何组合，对于该第一结合结构域和该第三结合结构域分别优选86至88以及194、432和196，对于该第一结合结构域更优选194、432和196，且对于该第三结合结构域更优选86至88。
42.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域包含VL区，该VL区包含选自以下的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：SEQ ID NO:80至82、89至91、98至100、106至108、114至116、122至124、130至132、138至140、146至148、154至156、162至164、171至173、180至182、188至190、197至199、206至208、215至217、224至226、233至235、241至243、337至339、359至361、368至370、379至381、388至390、449至451、457至459、465至467、473至475、481至483、489至491、497至499、505至507、513至515、521至523、529至531、537至539、545至547、553至555、561至563、569至571、577至579、585至587、593至595、601至603、609至611、617至619、625至627、633至635、641至643、649至651、657至659、665至667、673至675、681至683、689至691、697至699、705至707、713至715、721至723、729至731、737至739、745至747、753至755、761至763、769至771、777至779、785至787、793至795、801至803、809至811、817至819、825至829、833至835、841至843、849至851、857至859、865至867、873至875、881至883、889至891、897至899、905至907、913至915、921至923、929至931、937至939、945至947、953至955、961至963、969至971、977至979、985至987、993至995、1001至1003、1009至1011、1017至1019、1025至1027、1033至1035、1041至1043、1049至1051、1057至1059、和1065至1067，或优选地如序列表格表52中一起披露的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的任何组合，对于该第一结合结构域和该第三结合结构域分别优选89至91以及197至199，对于该第一结合结构域更优选197至199，且对于该第三结合结构域更优选89至91。
43.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域包含选自以下的VH区：SEQ ID NO:83、92、101、109、117、125、133、141、149、157、165、174、183、191、200、209、218、227、236、244、340、362、371、382、391、和433、452、460、468、476、484、492、500、508、516、524、532、540、548、556、564、572、580、588、596、604、612、620、628、636、644、652、660、668、676、684、692、700、708、716、724、732、740、748、756、764、772、780、788、796、804、812、820、828、836、844、852、860、868、876、884、892、900、908、916、924、932、940、948、956、964、972、980、988、996、1004、1012、1020、1028、1036、1044、1052、1060、和1068，或优选地如序列表格表52中一起披露的任何VH，对于该第一结合结构域和该第三结合结构域分别优选433和92，对于该第一结合结构域更优选433，且对于该第三结合结构域更优选92。
44.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一和/或该第三(靶)结合结构域包含选自以下的VL区：SEQ ID NO:84、93、102、110、118、126、134、142、150、158、166、175、184、192、201、210、219、228、237、245、341、363、372、383、392、453、461、469、477、485、493、501、509、517、525、533、541、549、557、565、573、581、589、597、605、613、621、629、637、645、653、661、669、677、685、693、701、709、717、725、733、741、749、757、765、773、781、789、797、805、813、821、829、837、845、853、861、869、877、885、893、901、909、917、925、933、941、949、957、965、973、981、989、997、1005、1013、1021、1029、1037、1045、1053、1061、和1069，或优选地如序列表格表52中一起披露的任何VL，对于该第一结合结构域和该第三结合结构域分别优选200和93，对于该第一结合结构域更优选200，且对于该第三结合结构域更优选93。
45.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中该第一和/或第三(靶)结合结构域包含选自SEQ ID NO:85、94、193、202、211、220、229、364、384、393，优选94和202的通过单一氨基酸交换(E至I)而稳定性增加的VL区。
46.根据前述权利要求中任一项所述的抗原结合分子，其中选自由SEQ ID NO:246至323或330至332、351至355、373至375、394至410、434、1073、1075至1080组成的组的氨基酸序列，或如序列表格表52中披露的任何其他全长多靶向性双特异性抗原结合分子，优选434。
47.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至46中任一项所述的抗原结合分子。
48.一种载体，其包含根据权利要求47所述的多核苷酸。
49.一种宿主细胞，其经根据权利要求47所述的多核苷酸或根据权利要求48所述的载体转化或转染。
50.一种用于产生根据权利要求1至46中任一项所述的抗原结合分子的方法，所述方法包括在允许该抗原结合分子表达的条件下培养本发明的宿主细胞并从培养物中回收产生的抗原结合分子。
51.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至40中任一项所述的或根据权利要求50所述的方法产生的抗原结合分子。
52.根据权利要求51所述的药物组合物，其在约-20℃稳定至少四周。
53.根据权利要求1至46所述的或根据权利要求50的方法产生的抗原结合分子，用于在选自增殖性疾病、肿瘤性疾病、癌症或免疫学障碍的疾病的预防、治疗或缓解中使用。
54.根据权利要求53所述的抗原结合分子，其中该疾病优选是急性骨髓性白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌和结直肠癌(CRC)。
55.一种用于治疗或缓解增殖性疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用包含至少一条多肽链的分子，其中该分子包含
(i.)第一结合结构域，其优选包含与第一靶细胞表面抗原(例如TAA1)特异性结合的互补位，
(ii.)第二结合结构域，其优选包含与人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位特异性结合的互补位，
(iii.)第三结合结构域，其优选包含与第二靶细胞表面抗原(例如TAA2)特异性结合的互补位，和
(iv.)第四结合结构域，其优选包含与人和/或猕猴CD3ε链的细胞外表位特异性结合的互补位，
其中该第一结合结构域和该第二结合结构域形成第一双特异性实体，该第三结合结构域和该第四结合结构域形成第二双特异性实体，并且
其中该分子包含具有至少约大于约5kDa的分子量和/或具有超过50个氨基酸的长度的间隔物实体，其中该间隔物实体将该第一双特异性实体和该第二双特异性实体间隔开至少约
Figure FDA0004213953390000171
(该第一双特异性实体和该第二双特异性实体的质心之间的距离)，并且该间隔物实体位于该第一双特异性实体和该第二双特异性实体之间，
该方法包括向有需要的受试者施用本发明的或根据本发明的方法产生的抗原结合分子的步骤，其中该疾病优选是急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌和/或结直肠癌。
56.根据权利要求55所述的方法，其中该方法包括通过提供本文所述形式的多靶向性双特异性抗原结合分子来寻址在病理生理组织和一个或多个生理组织上显著共表达的疾病相关靶标，其中该分子寻址(i.)在疾病相关组织和生理组织上均表达的靶标和(ii.)与疾病相关但不在(i.)下的生理组织上表达的另一靶标，其中该方法优选地避免在这样的靶标是MSLN的情况下形成腹内粘连和/或纤维化。
57.根据权利要求55所述的方法，其中该疾病是肿瘤性疾病、癌症或免疫学障碍。
58.根据权利要求57所述的方法，其中该疾病优选是急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌和/或结直肠癌。
59.根据权利要求49所述的方法，其中该TAA1和TAA2优选地选自EpCAM和MSLN、MSLN和EpCAM、MSLN和CDH3、CDH3和MSLN、FLT3和CLL1以及CLL1和FLT3。
60.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至46中任一项所述的抗原结合分子或根据权利要求50所述的方法产生的抗原结合分子、根据权利要求47所述的多核苷酸、根据权利要求48所述的载体和/或根据权利要求49所述的宿主细胞。
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