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JP2022539249A - 幹細胞培養及び幹細胞治療用プライム化培地及びプライム化方法 - Google Patents

幹細胞培養及び幹細胞治療用プライム化培地及びプライム化方法 Download PDF

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Abstract

本開示の一態様は、幹細胞の非プライム化集団から、抗炎症表現型を有する幹細胞の単離集団を産生するためのプライム化培地を含んでも良い。該プライム化培地は、無血清培地と、 Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含む。前記機能性活性化剤及び前記少なくとも２種の炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在してもよい。前記抗炎症表現型を有する細胞は、前記非プライム化幹細胞集団と比較して増加した１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌により標識される。本開示の他の一態様は、本開示により生産した幹細胞、当該幹細胞を含む治療用組成物、及び当該幹細胞の使用を含んでも良い。【選択図】図４

Description

本出願は、２０１９年７月５日に出願された米国の仮特許出願番号６２／８７０，８３２及び２０１９年１０月１日に出願された米国の仮特許出願番号６２／９０８，７６２の優先権を主張している。上記の米国仮特許出願らのそれぞれの全ての内容は、引用により本発明のすべての目的に使用するために本明細書に組み込まれる。
本開示は、概ねに幹細胞培養及び幹細胞治療用プライム化培地及びプライム化方法に関し、より具体的には、炎症を選択的に抑制し、且つ免疫を促進するために、離散的で均一な細胞表現型を誘導、活性化又はプライム化することにより、既知の培地及び方法よりも優れた顕著な利点を提供して細胞による治療に用いられるプライム化、活性化又は誘導された幹細胞を産生することを目的とする、新規な幹細胞培養方法及び幹細胞療法、並びに幹細胞用培地組成物に関する。
幹細胞（例えば、間葉系幹細胞又はＭＳＣ）の臨床応用には、適切な品質及び一貫した治療上の利点を有する十分量の細胞を提供できる、且つ再現可能な細胞培養方法及び細胞増殖方法が求められている。異なる培地及び方法により、すでに異なる程度の成功を収めている。しかしながら、安全で一貫して再現可能な治療効果を有する細胞療法に用いられる、プライム化、活性化又は誘導された細胞の収率の向上を確保するために、幹細胞用培地及び幹細胞培養方法に対する更なる改良が必要とされる。
本開示の様々な態様により、より均一で予測可能な、エクスビボで増殖及び誘導、プライム化又は活性化された幹細胞（例えば、間葉系幹細胞又はＭＳＣ）の集団を提供することを目的とし、このような幹細胞集団は、細胞による治療法に使用することができる。本分野では、細胞による治療法に必要とされる、大量の均一で有効な幹細胞を提供するための改良方法が長い間求められている。本開示の様々な態様による利点として、本明細書に開示されるプライム化培地及びプライム化方法によって産生された幹細胞は、幹細胞培養物を、被験者に導入された後に予測可能な方式で機能する、均一で離散的な抗炎症表現型へ誘導、活性化又はプライム化することに用いることができる。
本開示の一態様によれば、種々の成体組織由来の均一なＭＳＣ集団を誘導、活性化又はプライム化するための改良された治療方法、細胞培養方法及び培地を目的とする。誘導又はプライム化されていない一般的なＭＳＣに対する誘導、活性化又はプライム化されたＭＳＣの効果又は治療上の利点はインビトロ及び疾患の前臨床モデルにおいて実証された。
驚くべきことに、幹細胞（例えば、ＭＳＣ）が、特定の成分の組み合わせを有するプライム化培地に暴露されると、特に自己免疫によるＩ型及びＩＩ型インターフェロン経路誘導の後に、免疫細胞活性を特異的に調節し、免疫細胞機能障害を改善するようにプライム化されることを見出した。プライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）は、誘導されたインターフェロン活性化（例えば、プリスタン誘導性全身性エリテマトーデス）マウスモデルとその合併症とのインビボモデルにおいて安全性及び有効性を示す。好ましくは、本発明のプライム化培地に暴露された幹細胞（例えば、ＭＳＣ）は、有効な抗炎症応答を促進し、先天性及び適応性免疫細胞活性を制御し、及び／又はインターフェロンを調節するとともに、血管新生及び組織再生を促進する因子を産生する状態又は表現型を獲得することができる。理論に縛られないが、本発明によるプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を拡大培養及び活性化することにより、上記した効果的な免疫調節作用を示し、そして、Ｉ型（α、β）及びＩＩ型インターフェロン（γ）ならびにそれらの下流エフェクターの産生及び活性、分子への応答、及びその他の炎症性シグナル伝達経路を制御することによって、樹状細胞（ＤＣ）及びＢ細胞を阻害すると認識されている。
少なくとも上記の発見の一部に基づいて、本開示の一態様は、非プライム化幹細胞集団（以下、「非プライム化幹細胞集団」とも称する。）から、抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するためのプライム化培地を含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。機能性活性化剤及び少なくとも２種の炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在してもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞集団と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、プライム化培地と幹細胞とを含む組成物を含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。機能性活性化剤及び少なくとも２種の炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在してもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞集団と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するためのインビトロ方法を含んでもよい。この方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団をプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、インビトロ法によって産生された抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を含んでもよい。この方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団をプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを特徴としてもよい。
本開示のインビトロ方法によって産生された幹細胞は、天然に存在する幹細胞と著しく異なる。その理由として、本開示に係る幹細胞は、抗炎症遺伝子の発現（例えば、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ、又はＩＤＯ）のレベル又は程度が、自然界に存在するもののレベル又は程度よりも著しく高い（例えば、自然界で発見された幹細胞と比較して、本開示の幹細胞の場合には５００００～１５００００倍である）からである。本開示のインビトロ方法によって産生されたプライム化幹細胞（例えばＭＳＣ）における表面マーカーの発現レベル又は程度についても同様であり、ここで、例えばＣＤ１４６は、自然界に存在するレベルよりも著しく高いレベルで発現され、その結果、幹細胞に周皮細胞様表現型を有させることができる。さらに、本開示の方法により産生された幹細胞が暴露天然に存在する幹細胞とは著しく異なるのは、本開示のプライム化培地への暴露により、（本開示の）プライム化幹細胞に構造及び機能上の区別をもたらすことに起因する。前記プライム化培地は、無血清培地（且つ、場合によっては合成培地とするもの）に添加された成分の独特な組み合わせを含み、このような状態は、不特定な分子（例えば、タンパク質、炭水化物、代謝産物など）が大量存在するインビボの炎症状態とは異なる。
本開示の別の一態様は、被験者の全身性炎症性疾患又は障害を治療するための方法を含んでもよい。この方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞を被験者に治療的有効量で投与することを含んでもよい。幹細胞は、投与前にインビトロ法により産生される。この方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団をプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、非プライム化幹細胞集団から抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するためのプライム化培地を含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。機能性活性化剤及び少なくとも４種の炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在してもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞集団と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、プライム化培地及び幹細胞を含む組成物を含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。機能性活性化剤及び少なくとも４種の炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在してもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞集団と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するためのインビトロ方法を含んでもよい。この方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団をプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、インビトロ法によって産生された抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を含んでもよい。この方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団をプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、被験者の全身性炎症性疾患又は障害を治療するための方法を含んでもよい。この方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞を被験者に治療的有効量で投与することを含んでもよい。幹細胞は、投与前にインビトロ法により産生される。この方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団をプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、被験者を対象とする養子免疫療法のための方法を含んでもよい。前記方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞をプライム化、拡大培養し、かつＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性活性を増大させるのに十分な条件で、非プライム化（プライム化されていない）ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を一定時間暴露することを含んでもよい。プライム化されたＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞は、本開示のインビトロ方法により産生されてもよい。インビトロ方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞をプライム化、拡大培養し、かつ、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性活性を、非プライム化ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞と比較して増加させるのに十分な条件下で、非プライム化ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞集団を、プライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。いくつかの場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。他の場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。養子免疫療法の対象とする被験者に、プライム化ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を治療有効量で投与してもよい。
本開示の別の一態様は、薬物発見のための方法を含んでもよい。この方法は、インビトロ方法により産生された抗炎症表現型を有する幹細胞集団を、インビトロで試薬に暴露することによって、増加した抗炎症表現型を有する幹細胞の炎症への影響能力に対する試薬の作用を評価することを含んでもよい。インビトロ方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団をプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。いくつかの場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。他の場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。抗炎症表現型を有する幹細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを特徴としてもよい。
本開示の別の一態様は、インビトロ方法によって産生された抗炎症表現型を有する幹細胞の、炎症性疾患モデルの開発及び研究のための使用を含んでもよい。インビトロ方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団をプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。いくつかの場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。他の場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを特徴としてもよい。
以下、添付図面を参照して説明することにより、当業者に本開示の前述した特徴及び他の特徴を理解させる。
間葉系幹細胞をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に暴露させた後のサイトカイン経路ネットワーク（赤＝アップレギュレーション、緑＝ダウンレギュレーション）を示す模式図である。 間葉系幹細胞をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に暴露させた後の細胞移動経路ネットワーク（図１Ｂ）を示す模式図である。
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理による混合骨髄単離ＭＳＣ培養物中のＣＤ１４６＋ＭＳＣ（２つの異なる健康な骨髄ドナーからのＭＳＣが示されている）の増加を示すフローサイトメトリーデータである。
本開示のプライム化培地の有効性を示す模式図である。ＭＳＣは、ロボットによる細胞培養技術により本開示のプライム化培地を用いて培養された。効能測定手段として、プライム化されたＭＳＣにおけるインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）遺伝子の発現倍数の差をＲＴ－ＰＣＲを用いて検証した。プライム化期間の異なる時点（６時間、１２時間、１８時間、２４時間）で、単離されたＲＮＡをＭＳＣから採取した。関連性のない３つのプライム型ＭＳＣ源（番号２１８３、１４２７の健康ドナーからの第３継代細胞；及び、Ｒｏｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製の継代数が不明な市販のＭＳＣ製品）に対して最大ＩＤＯ遺伝子発現を測定した。条件１はプライム化培地条件を示し、条件２は対照条件である。
ＩＤＯ遺伝子の発現倍数の差及び活性レベル（細胞培地中のＮ－ホルミル－キヌレニン酵素レベル（ｍｃｇ／ｍｌ））が、本開示のプライム化培地に１８時間暴露された後に顕著に増加していることを示す、一連の図である。
ＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した血管周囲ＭＳＣマーカー（ＰＤＧＦＢＰ及びＣＤ１４６）の遺伝子発現倍数の差を示す図（緑＝本開示のプライム化培地へ暴露１８時間暴露後）である。
プライム化されたＭＳＣ（本開示のプライム化培地で１８時間処理後）（ｎ＝７）と非プライム化ＭＳＣ（ｎ＝６）での処理から１週間後のプリスタンマウスモデルにおける腹腔洗浄液中の細胞の選別結果を示している。その結果、処理されたサブセット（プライム化されたもの；プリスタン－ＨＸＢ－３１９）ではＣＤ３＋ＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（青いバー）とＣＤ３＋ＣＤ６９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（赤いバー）が、非プライム化サブセット（プリスタン－ＭＳＣ）や偽手術（プリスタン－偽手術）で未処理のプリスタン注射されたマウスに比べて有意（＊）に増加していることが分かる。
ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）に対する細胞選別実験の結果を示す図である。図７Ａには、非プライム化ＭＳＣ（Ａ）、ＭＳＣを本開示にかかる６成分プライム化培地に暴露すること（Ｂ）、ＭＳＣを本開示にかかる３成分プライム化培地に暴露させてなるもの（Ｃ）、及びＭＳＣを２×の３成分プライム化培地に暴露すること（Ｄ）の結果を示している。 ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する細胞選別実験の結果を示す図である。図７Ｂには、本開示にかかるプライム化培地を用いてＭＳＣをプライム化してから９ヶ月後の腹腔洗浄液ＮＫ細胞のパーセンテージの結果を示しており、また、ＭＳＣ処理は、プライム化培地の用量効果及び腹膜ＮＫ細胞への持続可能な影響を有することを示している。
ＭＳＣをプライム化培地へ暴露することによる、インビボプリスタン誘導ＳＬＥマウスモデルの腹腔洗浄液中の異なるＴ細胞サブセットに対する結果を示している。図８Ａには、ＭＳＣプライム化（図８Ａ中のＯＨＡ）後のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞のパーセンテージ（図には１０倍の値で示されている）の有意な増加を示している。 ＭＳＣをプライム化培地へ暴露することによる、プリスタン誘導ＳＬＥマウスモデルのインビボ腹腔洗浄液中の異なるＴ細胞サブセットに対する結果を示している。図８Ｂには、プライム化されたＭＳＣ（１×１０６細胞）を１回限り注射してから９ヶ月後の、Ｔｈ１７細胞（ＣＤ４＋ＲＯＲγ＋Ｔ細胞）への持続可能な免疫系の調節（腹腔洗浄液中のＴｈ１７細胞のパーセンテージへの抑制）を示している。
インビボプリスタン誘導ＳＬＥマウスモデルの腹腔洗浄液中に、プライム化されたＭＳＣ（図９中のプリスタン－ＨＸＢ－３１９）を投与してから１週間後に、非プライム化ＭＳＣ（図９中のプリスタン－ＭＳＣ）投与の場合と比較して形質細胞様樹状細胞抗原－１＋細胞（ｐＤＣで示されている）が有意に減少したことを示す図である。さらに、細胞をマウス１匹あたり２×１０６の量で使用した場合（プリスタン－ＨＸＢ－３１９２Ｘ）、有意な用量効果が示されている。
プライム化されたＭＳＣの投与による、腹腔洗浄液中のＰＤ－Ｌ１＋（ＣＤ－２７４）細胞（抗炎症及び免疫チェックポイント細胞マーカー）のパーセンテージ（図には１０倍の値で示されている）に対するプラス効果を示す図であり、プリスタン誘導マウスモデルにおける抗炎症作用の証拠を示している。
急性プリスタンマウスモデルにおいて、本開示のプライム化培地で処理されたＭＳＣ（プリスタン－ＨＸＢ－３１９）（１×１０６細胞）の１回限りの注射による、血清中のＩＦＮ－α（左図）及びＩＦＮ－γ（右図）の全身レベルに対する抑制を示す一連の図である。
慢性プリスタンマウスモデル（プリスタン誘導後９ヶ月）において、プリスタン－ＭＳＣ注射（１×１０６又は２×１０６細胞）と比較して、本開示にかかるプライム化培地で処理されたＭＳＣ（プリスタン－ＨＸＢ－３１９；－２Ｘ又は－２．５Ｍ）（１×１０６又は２×１０６又は２．５×１０６細胞）の１回限りの注射による、血清中のＩＦＮ－α（上図）及びＩＦＮ－γ（下図）の全身レベルに対する抑制を示す一連の図である。
本開示にかかるプライム化培地に暴露されたＭＳＣの注射から１週間後の血清炎症性サイトカインレベルを示す一連の図である。
本開示にかかるプライム化培地に暴露されたＭＳＣの注射から１週間後のＩＬ－１０レベルを示す図である。
プリスタンを注射して本開示のプライム化培地（図１５中にＯＨＡで示されている）に暴露されたＭＳＣで処理してから９ヶ月後のＩＬ－１７Ａの血清レベルを示す図である。
二本鎖ＤＮＡ力価の変化を示す図である。注射から９ヶ月後に、本開示にかかるプライム化培地に暴露されたＭＳＣを用いる処理は、より高い用量で、二本鎖ＤＮＡを有意に制御したことを示している（マウス１匹あたり２×又は２５０万細胞以上の場合、用量効果は顕著である；図中のＯＨＡは、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣを示す）。
本開示にかかるプライム化培地に暴露されたＭＳＣの場合、血清中のＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）レベルが低減したことを示す図である。
本開示にかかるプライム化培地を用いて処理されたプリスタン注射マウスにおける慢性糸球体腎炎の病理学的評価スコアを示す図である。
本開示にかかるプライム化培地を用いて処理されたプリスタン注射マウスにおける全体的及び局所的な瘢痕形成の病理学的評価スコアを示す図である。
及び 本開示にかかるプライム化培地の２成分及び３成分のサブセットが変化したものでＭＳＣを処理した後のＩＤＯ発現レベル及び活性を示す一連の図である。
本開示にかかるプライム化培地の２成分及び３成分のサブセットが変化したものでプライム化されたＭＳＣ及び非プライム化ＭＳＣにおける遺伝子発現の倍数差を示す一連の図である。 本開示にかかるプライム化培地の２成分及び３成分のサブセットが変化したものでプライム化されたＭＳＣ及び非プライム化ＭＳＣにおけるＩＬ－６／ＩＬ－８レベルの倍数差を示す一連の図である。
本開示にかかるプライム化培地の２成分及び３成分のサブセットが変化したもので処理されたＭＳＣにおけるＩＬ－１０及びＣＤ２７４の発現を示す図である。
本開示にかかるプライム化培地の２成分及び３成分のサブセットが変化したもので処理されたＭＳＣにおけるＴＬＲ－７及びＴＬＲ－４の発現を示す図である。
ＨＸＢ－３１９及びその３分子のサブセットで処理されたＭＳＣにおけるＩＤＯ及びＣＤ２７４の発現のＲＴ－ＰＣＲ結果が用量依存的であることを示す一連の図である。
ＨＸＢ－３１９とその３成分のサブセットとの、フラクタルカイン抑制、ＡＫＴ及びＣＴＬＡ－４の面での差異を示す図である。
ＨＸＢ－３１９とその３成分のサブセットでプライム化されたＭＳＣにおけるＩＬ－６とＩＬ－８の発現レベルの差を示す図である。
特に明記されていない限り、本明細書に記載の方法及び手段は、通常、当該技術分野でよく知られている従来の方法にしたがって行ってもよく、本明細書全体で引用、議論されている様々な一般的及びより具体的な参照文献に記載されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，第３バージョン，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）；及び「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照してもよい。
定義
明確に理解し、参照を容易にするために、ここで、本明細書全体及び本出願の他の部分において使用される用語のリストを集める。これらの用語のいくつかは、本分野で周知であり、明確のために本明細書で定義されているが、これらの用語のいくつかは、本明細書に特別に使用されており、したがって、本発明を正確に理解するために定義されなければならない。
英語の単数形は、本明細書において、１又は２以上、少なくとも一つを意味する。英語の複数形は、本明細書で使用される場合、一般的に単数の意味も含む。
本明細書で使用される場合、「細胞バンク」という用語は、本開示にかかるプライム化培地で培養された後に、将来の使用のために保管された幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、ＭＳＣ又は多分化能間質細胞）を意味してもよい。このような細胞は、アリコートとして分注保管してもよい。これらは、保管せずにそのまま使用してもよいし、保管後に拡大培養してもよい。これにより、研究、臨床試験又は臨床療法中の投与に有用な「既製の」細胞の提供が可能になるため、便利さをもたらすことができる。これらの細胞株は、薬学的に許容可能な賦形剤中に既に保管されていてもよく、この場合、それらを直接投与してもよいし、又はそれらを保管から解放する際に適切な賦形剤と混合してもよい。細胞は、生存能力を維持するように凍結またはその他の方式で保存してもよい。バンクは、治療対象個体由来の細胞を用いて設立してもよい。或いは、バンクは、同種異体を使用対象とする細胞を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「細胞療法」又は「細胞による療法」という用語は、疾患又は障害（例えば、全身性炎症又は自己炎症）に関連する１つ以上の症状を予防、治療又は改善するために、本開示にかかるヒト又は動物由来の幹細胞（すなわち、本開示にかかるプライム化培地で培養された細胞や、それに接触又は暴露された細胞）を移植することを意味してもよく、上記１つ以上の症状の予防、治療又は改善として、例えば、損傷した組織又は臓器の置換又は修復、免疫反応の調節、炎症症状の軽減などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「修復」という用語は、損傷した組織に関して直接的に使用される場合、直接的なメカニズム（例えば、損傷した組織の再生）及び間接的なメカニズム（例えば、本開示にかかる幹細胞（すなわち、本開示にかかるプライム化培地で培養された細胞、又は、それに接触又は暴露された細胞）によって炎症を緩和した結果、組織を形成することが可能になる）によって、このような損傷を改善することを意味してもよい。
本明細書で使用される場合、「細胞増殖培地」という用語は、ここで説明されている、本開示にかかる幹細胞（すなわち、本開示にかかるプライム化培地で培養された細胞、又はそれに接触又は暴露された細胞）などの細胞の成長を支持するのに適した因子及び栄養素を含む増殖又は拡大培養用水性培地を意味してもよい。初期接種及び培養（例えば、コンフルエント状態になるまで）には、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭなどの標準又は既製の培地を使用してもよい。コンフルエント状態になった後、細胞維持のために、低グルコース無血清ＤＭＥＭなどの支持培地を使用してもよい。応用される細胞培地は、細胞培養分野でよく知られているものであり、全て市販品であってもよい。
「含む」という用語は、特に限定されない限り、対象物が必ず含まれるがその他の含有可能なものについていかなる制限又は排除する意図がない。例えば、「ＸとＹとを含む組成物」は、組成物中に他のいかなる成分が存在するかどうかにかかわらず、ＸとＹとを含有するあらゆる組成物を包含する。同様に、「工程Ｘを含む方法」は、工程Ｘが該方法の唯一の工程であるか、又は複数の工程のうちの１つであるかにかかわらず、そして、その他の工程がいくつ存在するか、工程Ｘがその他の工程に比べてどれほど簡単又は複雑であるかにかかわらず、Ｘが実施されるあらゆる方法を包含する。「含む」と語根「含む」を用いた類似句は、本明細書では「含む」の同義語として用いられており、「含む」と同じ意味を有する。
本明細書で使用される場合、用語「条件培地」又は「ＣＭ」は、本開示にかかる幹細胞（すなわち、本開示にかかるプライム化培地で培養された細胞や、それに接触又は暴露された細胞）を一定の時間培養した培地を意味してもよい。一実施例において、条件培地は、本明細書に開示されるプライム化方法により産生された幹細胞を培養し、次いで培養期間後に上澄み液又は条件培地を採取することにより調製することができる。
本明細書で使用される場合、「合成培地」という用語は、特定の指定因子が添加された細胞培養成長用培地を意味してもよい。この用語はまた、すべての成分がそれらの化学式で表われることが可能であり、且つ既知の濃度で含まれる細胞培養成長用培地を指してもよく、非合成培地とは反対する意味を有する。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の局所的又は全身的効果を提供可能な量を意味してもよい。前記「所望の局所的又は全身的効果」として、例えば、望ましくない状態（例えば、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデスなどの全身性炎症性又は自己炎症性疾患に関連する炎症）を効果的に改善することが挙げられ、本開示で説明される特定の所望の効果を達成することを含む。例えば、有効量は、有益な又は所望の臨床結果を達成するのに十分な量であってもよい。有効量は、１回の施用で一括して全て提供されてもよいし、数回の施用に分けて提供されてもよい。有効と見なされる量は、各被験者の体型、年齢、損傷及び／又は治療対象とする疾患又は損傷、及び損傷又は疾患が発生してからの時間量などの、各被験者の個々の要因に基づいて正確に決定してもよい。当業者にとって、これらの当分野の従来の考慮要因に基づいて所定の被験者に投与される有効量を決定してもよい。「有効用量」という用語は、「有効量」と同じ意味を有してもよい。
本明細書で使用される場合、「有効な経路」という用語は、薬剤（例えば、幹細胞）を体内における所望の区画、システム、又は位置に送達するための経路を意味してもよい。例えば、有効な経路は、有益な又は所望の臨床結果を達成するのに十分な量の薬剤を所望の作用部位において提供するための、薬剤を投与可能な経路であってもよい。
本明細書で使用される場合、「外来添加」という用語は、培養物又は条件培地の文脈において、培養物又は培地中に既に存在している可能性のある任意の化合物又は成長因子を補充するために、化合物、成長因子、分化因子などを培養物又は培地中に添加することを指しても良い。
本明細書で使用される場合、「単離」という用語は、対象細胞が、それとインビボで関連する１つ以上の細胞又は１つ以上の細胞成分と不関連になることを指しても良い。「増量集団」とは、インビボ又は初代培養物中の１つ以上の他の細胞種と比較して、所望の細胞の数が相対的に増加していることを意味してもよい。しかしながら、本明細書で使用される場合、「単離」という用語は、本明細書に記載される細胞のみが存在することを意味しない。一方、「単離」という用語は、本明細書に記載される細胞がその天然組織環境から除去され、且つ、正常組織環境と比較してより高い濃度で存在することを示唆しても良い。したがって、「単離」細胞集団は、本明細書に記載される細胞以外の細胞種をさらに含んでもよく、さらに別の組織成分を含んでもよい。これは、例えば、細胞倍加で表すことも可能である。細胞は、インビトロ又はエクソビボで１０、２０、３０、４０又はこれ以上倍加することで、インビボ又はその元の組織環境（例えば、骨髄、末梢血、胎盤、臍帯、臍帯血、脂肪組織など）における元の量と比較して濃縮されることができる。
本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」又は「ＭＳＣ」という用語は、胚中胚葉に由来する、成体骨髄、末梢血、脂肪、胎盤及び臍帯血などの多くの由来から単離し得る細胞を意味してもよい。ＭＳＣは、筋肉、骨、軟骨、脂肪、腱を含む多くの中胚葉組織に分化することができる。これらの細胞に関する文献が大量にある。例えば、米国特許番号５，４８６，３８９；５，８２７，７３５；５，８１１，０９４；５，７３６，３９６；５，８３７，５３９；５，８３７，６７０；及び５，８２７，７４０を参照すればよい。また、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ・Ｍら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１４３－１４７（１９９９）」も参照可能である。いくつかの場合、ＭＳＣは明らかに健康な被験者（例えば、ヒト被験者）、すなわち、疾患の徴候及び／又は症状がない被験者から由来してもよい。また、当該用語は、「多分化能間質細胞」と置換して使用してもよい。
本明細書で使用される場合、「多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｎｅｎｔ）」又は「多分化能細胞」という用語は、限られた種類の他の特定の細胞種を産生可能な細胞種を指す。多分化能細胞は、１つ以上の胚性細胞の運命に関与しているので、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｎｅｎｔ）細胞と異なり、３種類の胚性細胞系譜のいずれも産生することができず、胚外細胞も産生できない。
「部分的」という用語は、細胞培養物及び／又は細胞集団と組み合わせて使用される場合、ゼロでない量の任意の細胞培養物又は細胞集団を意味してもよく、一個の細胞から細胞培養物又は細胞集団全体までの範囲をカバーすることができる。いくつかの場合、「部分的」という用語は、細胞培養物又は細胞集団の少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、又は少なくとも９５％を意味しても良い。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能」という用語は、合理的な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、他の問題や合併症を引き起こさず、合理的な利益／リスク比を示す、人間及び動物の組織と接触するように使用するのに適した化合物、材料、組成物（例えば、細胞）、及び／又は剤形を指してもよい。
本明細書で使用される場合、細胞の文脈では、「多能性」又は「多分化能（性）」という用語は、３つの胚性細胞系譜のいずれか及び胚外細胞に由来する複数の組織を産生しうる細胞を指しても良い。この用語は、内部細胞塊状態に限られ、いかなる場合にも、発育期間中に形成した、又は周産期から成体期までに存在する、系譜特異的前駆細胞を説明するために使用されない。多能性細胞の状態は天然の状態であるが、当業者に知られている特定の条件下でインビトロで増殖することも可能である。このような培養条件下では、幹細胞の永続的維持又は多能性状態が生じる。多能性細胞の定義のための性質は、その機能的特徴に限られず、遺伝子発現パターンによっても表されるため、多能性細胞の同定は、それらが示すマーカーの染色パターンや定量的な測定によって実現することができる。タンパク質転写因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＮＡＮＯＧの存在は、多能性状態の維持に関与する一組のコア転写因子を表し、これらの因子のダウンレギュレーションは分化の前提条件である。上記３つの転写因子は、いずれも相互作用を示し、それらに転写制御される遺伝子には、多くの重複のものが存在する。さらに、多能性維持を担う転写因子は、通常、その上に存在するいくつかの表面マーカーを用いて同定され、最も一般的な表面マーカーは、ステージ特異的胚抗原３及び４（ＳＳＥＡ３及びＳＳＥＡ４）、ＴＲＡ－１－６１及びＴＲＡ－１－８１である。胚性幹細胞のような多能性細胞はまた、通常の多能性細胞の同定に用いられるアルカリホスファターゼ活性を示すことが可能である。
本明細書で使用される場合、「前駆細胞」という用語は、いかなる場合にも、分化した細胞の直接系譜の祖先を表す正常な細胞状態を指しても良い。定義によれば、前駆細胞は、不可逆的に上記確定的運命を取らなけばならないことではなく、複数の確定的状態に対して多能性であってもよい。したがって、２つ以上の子孫の運命に分化する能力を示す。任意の生命体において発育が進行するにつれて、徐々に能力が失われ、したがって多能性が失われることは、組織や器官の分化と一時的に定義される形成の指標となる。前駆細胞の一例として、ある遺伝子の挿入によって非多能性細胞（通常は成体体細胞）から人工的に誘導された多能性幹細胞の一種である誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「自己更新」という用語は、幹細胞が複製娘幹細胞を産生する能力を指してもよく、前記複製娘幹細胞は、それらを産生した幹細胞と同一の分化能を有する。
本明細書で使用される場合、「拡大培養」、及び「増殖」という用語は、細胞数の増加を実現する過程を意味してもよい。この用語はまた、細胞分裂と細胞死や細胞分化による細胞損失との間のバランスを指しても良い。
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、自己更新する（すなわち、同じ分化能を有する子孫を産生する）ことができ、分化能がより制限された子孫細胞を産生することもできる細胞を指しても良い。本開示の文脈において、幹細胞は、例えば、核移殖、より原始的な幹細胞との融合、特定の転写因子の導入、又は特定の条件下での培養によって脱分化された、より分化した細胞も包含する。例えば、Ｗｉｌｍｕｔら，Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０－８１３（１９９７）；Ｙｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，４１６：５４５－５４８（２００２）；Ｇｕａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，４４０：１１９９－１２０３（２００６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ，１２６：６６３－６７６（２００６）； Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ，４４８：３１３－３１７（２００７）； Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１－８７２（２００７）を参照してもよい。
脱分化はまた、特定の化合物を投与すること、又は脱分化を誘導可能なインビトロ又はインビボの物理的環境に暴露することによって引き起こすことができ、この過程は実質的に多能性の獲得を反映する。幹細胞はまた、奇形がん腫のような異常組織や胚様体（これらは、直接的に内部細胞塊に由来ではないが、到底、胚性組織に由来する点で胚性幹細胞とも見なされる。）などの他の由来から得られたことも可能である。多能性幹細胞状態は、非幹細胞（例えば、誘導多能性幹細胞）に幹細胞の機能に関連する遺伝子を導入することによっても産生することができる。
本明細書で使用される場合、「被験者」という用語は、脊椎動物又は哺乳動物を指しても良い。被験者の例として、家畜、試験動物及びペットが挙げられ、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、及びネズミなどの哺乳動物や、爬虫類、鳥、及び魚であってもよい。「患者」及び「被験者」という用語は、本明細書では同じ意味で使用してもよい。一例では、被験者は哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ又はウシであってもよいが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、細胞培養物又は細胞集団中の細胞について、「実質的に含まれない」という用語は、対象細胞種を、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満の量で、含むことを意味してもよい。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、被験者中に何らかの治療的反応を生じると確認できる試薬（例えば、本開示にかかるプライム化培地で培養された、又はそれに接触や暴露された１種又は複数種の細胞）の量を意味してもよい。本明細書で使用される用語の意味範囲内で治療的に有効な治療としては、それら自体が疾患の結果を改善しなくても、被験者の生活品質を改善する治療であってもよい。このような治療有効量は、当業者にとって容易に決定することができる。したがって、「治療」とは、そのような量を送達することを意味してもよい。そうすると、治療により、全身性炎症性又は自己炎症性疾患などの疾患又は障害のあらゆる病理的症状を予防又は改善することができる。
本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、欠陥、機能障害、疾患、又は他の有害なプロセスを予防、改善、抑制、又は治癒することを含み、前記他の有害なプロセスとして、治療に対して妨害しうるもの、及び／又は治療から生じるものが挙げられる。いくつかの場合、疾患又は障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％軽減される。
本明細書で使用される場合、「予防」、又は「予防的に」とは、疾患又は障害（例えば、全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害）の少なくとも１つの症状を完全に又は部分的に（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％）予防又は抑制することを意味してもよく、或いは、このような症状が現れる頻度は、疾患又は障害の症状を完全に又は部分的に（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％）予防又は抑制することを意味してもよく、あるいは、このような症状が現れる頻度である。
本明細書で使用される場合、本開示のプライム化培地と接触する一つの幹細胞（又は複数の幹細胞）に言及する場合、「誘導」という用語は、プライム化培地との接触に起因する一つの幹細胞（又は複数の幹細胞）の表現型（例えば、表面標識型及び／又は存在及び／又は不存在）及び／又は遺伝子型（例えば、ｍＲＮＡ発現レベル）の変化を指しても良い。
本明細書で使用される場合、「均一誘導」という用語は、幹細胞集団中の少なくとも一部の幹細胞が、本開示のプライム化培地との接触により、幹細胞の表現型及び／又は遺伝子型の１つ以上の変化を得るように誘導されることを意味してもよい。いくつかの場合、実質的に均一な誘導が生じることがある。実質的に均一な誘導は、幹細胞の表現型及び／又は遺伝子型の１つ以上の変化を得るように誘導された大部分の幹細胞（＞５０％）を意味してもよい。あるいは、実質的に相同の誘導は、幹細胞の表現型及び／又は遺伝子型の１つ以上の変化を得るように誘導された大部分の幹細胞、例えば、約５０～５５％、約５５～６０％、約６０～６５％、約６５～７０％、約７０～７５％、約７５～８０％、約８０～８５％、約８５～９０％、約９０～９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の幹細胞を指しても良い。
本明細書で使用される場合、「検証」という用語は、確認と意味してもよい。本開示の文脈において、幹細胞は、所望の機能及び／又は表現型を有する特定の細胞種（例えば、ＭＳＣ）であることが確認できる。これにより、当業者が幹細胞を（治療、バンク設立、薬物スクリーニング等の用途に）使用する際に、当該幹細胞による効能を合理的に期待可能である。したがって、検証とは、所望の活性及び／又は表現型を有することが発見・樹立された幹細胞が、その活性及び／又は表現型を確かに保持していることを確認することを意味してもよい。したがって、検証は、最初の判定とその後の判定とに関する２つのイベントプロセスにおける証明イベントとしてもよい。第２のイベントは、本明細書では「検証」を指しても良い。
本明細書で使用される場合、「既製培地」という用語は、血清含有基礎培地及び他の化合物（例えば、アスコルビン酸、デキサメタゾンなど）を含む培地組成物を意味してもよい。血清は本質的に培地中の不明確な成分である。したがって、異なるロットの血清の異質性のため、市販の「既製の」血清含有培地の正確な組成は不明である。「既製培地」の一例は、１％Ｌ－グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ウシ胎児血清、１００ｎＭ デキサメタゾン、５０μＭ アスコルビン酸－２Ｐ、及び１０ｍＭ β－グリセロリン酸エステルを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改良Ｅａｇｌｅ培地／Ｈａｍ栄養混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２ １：１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
本明細書で使用される場合、「全身性自己免疫疾患又は障害」又は「自己炎症性疾患又は障害」という用語は、被験者の自己細胞、組織及び／又は器官に対する免疫反応によって引き起こされた細胞、組織及び／又は器官の損傷を特徴とする被験者の状態を意味してもよい。本開示によって産生された免疫調節細胞によって治療可能な自己免疫疾患の例示的かつ非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎や精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベフチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、口内炎性皮膚炎、慢性疲労性免疫不全症候群（ＣＦ１ＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグストロース症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、円板状エリテマトーデス、原発性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型又は免疫媒介糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多筋痛症、多筋炎と皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬関節炎、レイノー現象、ライター症候群、結節症、強皮症、進行性全身性強皮症、シェーグレン症候群、Ｇｏｏｄ Ｐａｓｔｕｒｅ症候群、硬直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎（例えば、疱疹状皮膚炎型血管炎）、白斑症、ウェゲナー肉芽腫症、抗糸球体基底膜症、抗リン脂質症候群、神経系自己免疫性疾患、家族性地中海熱、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｅａｔｏｎ筋無力症候群、交感性眼炎、多内分泌症、乾癬などが挙げられる。
一例では、本開示によって治療可能な全身性自己免疫疾患又は自己炎症性疾患は、ＳＬＥ、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、重複症候群（関節リウマチと、ＳＬＥ及び／又はシェーグレン症候群と）、移植片対宿主病、成人又は幼年特発性乾癬関節炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、その他の筋炎、全身性血管炎、ＣＮＳ血管炎、強皮症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、リウマチ性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、幼年関節炎、成人スティール病、全身性強皮症を含んでもよい。
全身性自己免疫疾患又は自己炎症性疾患の他の例としては、単一遺伝子性インターフェロノパチーが挙げられ、単一遺伝子性インターフェロノパチーの場合、遺伝子変異体によりＩ型インターフェロン経路の活性化を引き起こし、これにより複雑なリウマチ疾患を引き起こす。これらの疾患は、不調なＩ型インターフェロン産生の駆動要因に依存する自己免疫－自己炎症スペクトルに基づいくものであると考えられている。これらの疾患は、Ａｉｃａｒｄｉ－Ｇｏｕｔｉｅｒｅｓ症候群（ＡＧＳ）、脂肪異栄養症と発熱を伴う慢性非典型的好中球性皮膚病（ＣＡＮＤＬＥ）、乳児発症性ＳＴＩＮＧ関連血管炎（ＳＡＶＩ）を含む。血管炎及び高インターフェロンレベルに関連する他の疾患としては、脳白質萎縮症を伴う網膜血管障害（ＲＶＣＬ）及びＳｉｎｇｌｅｔｏｎ－Ｍｅｒｔｅｎ症候群が挙げられ、これらの疾患の場合、臨床徴候は慢性炎症に関連すると考えられ、少なくとも一部がＲＩＧ－Ｉの構成的活性化に起因し、Ｉ型インターフェロン活性及びＩＳＧ発現の向上を引き起こす。
本明細書で使用される場合、「免疫調節」という用語は、免疫系の１つ以上の生物学的活性の修飾、増幅、阻害又は低減を意味してもよく、例えば、免疫応答のダウンレギュレーション、免疫応答の増強、及び、サイトカイン像、細胞毒性活性及び抗体産生の変化を介する炎症性状態の変化、ならびに、上記各状況による免疫及び免疫関連細胞への効果とが挙げられが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「細胞集団」という用語は、１を超える任意の数の幹細胞（例えば、ＭＳＣ）を意味してもよいが、好ましくは、少なくとも１×１０３個の細胞、少なくとも１×１０４個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、又は少なくとも１×１０９個の細胞である。いくつかの場合、初期幹細胞集団において、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、又は少なくとも９５％の細胞（細胞個数％）（例えば、ＭＳＣなどの幹細胞）は、未分化幹細胞（例えば、未分化ＭＳＣ）である。
本明細書で使用される場合、用語「有意な発現」又はその同義語である「陽性」及び「＋」は、細胞表面マーカーに関して使用される場合、細胞集団において、２０％超の細胞、好ましくは３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超、又は１００％の細胞が細胞表面マーカーを発現することを意味する。
細胞表面マーカーの発現は、例えば、従来の方法及び装置（例えば、市販の抗体及び当該技術分野で知られている標準プロトコルと共に使用されるＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ ＥＰＩＣＳ ＸＬ ＦＡＣＳシステム）を使用する特定の細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによって確認することができ、前記従来の方法及び装置を使用する場合、フローサイトメトリーにおいて、バックグラウンドシグナルよりも高い特定の細胞表面マーカーのシグナルを示す。バックグラウンドシグナルは、従来のＦＡＣＳ分析において各表面マーカーを検出するために使用される特異的抗体と同じアイソタイプの非特異的抗体によるシグナル強度と定義される。陽性とみなされるマーカーについては、従来の方法及び装置を使用する場合、その観察される特定のシグナルは、バックグラウンドシグナル強度より２０％強く、好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％又はそれ以上強い。さらに、前記細胞表面マーカー（例えば、細胞受容体及び膜貫通タンパク質）に対する市販や既知のモノクローナル抗体を用いて、関連する細胞を同定することができる。
本明細書で使用される場合、「プライム化培地」という用語は、新しい成分や特定の成分を含む細胞培地を指してもよく、前記各成分の組み合わせにより、有効な培養条件下で前記培地と接触している幹細胞（例えば、ＭＳＣ）中に抗炎症表現型を相乗的に誘導する。
本明細書で使用される場合、「Ｉ型インターフェロン経路」という用語は、先天的で適応的免疫の制御を機能する炎症性経路を意味してもよい。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮｓ）（主にＩＦＮ－α及びＩＦＮ－β）はＩ型インターフェロン経路を調節する。Ｉ型ＩＦＮ産生は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）の検出後に誘導される。Ｉ型インターフェロンは、抗原提示とナチュラルキラー細胞機能を促進しながら、炎症誘発経路とサイトカイン産生を阻害するようにバランスよく先天性免疫応答を調節する。Ｉ型インターフェロンはまた、適応性免疫系を活性化することにより、高親和性抗原特異的Ｔ及びＢ細胞応答及び免疫記憶の発達を促進し、自己免疫疾患（例えば、シェーグレン症候群又はＳＬＥ）を引き起こす可能性のある一連のイベントを開始させる。
本明細書で使用される場合、「ＩＩ型インターフェロン経路」という用語は、主にインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）によって調節される炎症性経路を指しても良い。ＩＦＮ－γは遺伝子調節に影響するＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を主に介してシグナルを発する。ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達は、Ｊａｎｕｓファミリーのキナーゼのメンバー（ＪＡＫｓ：ＪＡＫｓ１－３及びＴＹＫ２）及びＳＴＡＴｓ（ＳＴＡＴ５ａ及びＳＴＡＴ５ｂを含むＳＴＡＴｓ１－６）の一連の受容体のリクルートメント及び活性化に関与し、特定の応答因子を介して標的遺伝子の転写を制御する。ＩＦＮ－γは適応性及び先天性免疫において重要な役割を果たすサイトカインである。
本明細書で使用される場合、「Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン経路の機能性活性化剤」という用語は、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン経路の両方を刺激する分子のいずれか又は複数種の分子の組み合わせを意味してもよい。一例では、ＩＤＯの発現レベル及び／又は活性は、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン経路の活性化の指標として使用可能である（例えば、対照値と比較して増加したＩＤＯの発現及び／又は活性は、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン経路の活性化を示し得る）。ＩＤＯの発現及び活性を測定するための方法は、この分野で知られている。
本明細書で使用される場合、「抗炎症表現型」という用語は、遺伝子及びタンパク質の発現に関与する複数の細胞プロセスの集合体を意味してもよく、前記複数の細胞プロセスにより、細胞の特定の形態及び機能的特徴をもたらすことができ、前記細胞の特定の形態及び機能的特徴は、本開示のプライム化培地を用いる培養の結果として、本開示のプライム化培地と接触していない細胞と比較して１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーター又はマーカーの発現及び／又は分泌が増加することを標識又は特徴とする細胞を産生する。
本明細書で使用される場合、「炎症性サイトカイン」という用語は、免疫細胞（例えば、ヘルパー又は細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｈ）、単球、樹状細胞、及びマクロファージ）から分泌され、炎症を刺激するシグナル伝達分子の一種を意味してもよい。
本明細書で使用される場合、「インターフェロン調節性自己免疫疾患」という用語は、１種のインターフェロン又は複数種のインターフェロンの組み合わせが疾患の病因的又は発症機序に積極的に関与し、自己免疫疾患の進行に積極的に作用する自己免疫疾患を意味してもよい。言い換えれば、インターフェロン活性がその疾患の指標である場合、この疾患はインターフェロン調節性自己免疫疾患である。
本明細書で使用される場合、「Ｉ型インターフェロン経路の異常な活性化」という用語は、Ｉ型インターフェロン経路の活性化過程中に一般的に予想される応答とは異なる先天性及び適応性免疫系の応答を意味してもよい。例えば、サイトカインストームなどのＩ型インターフェロン経路の異常な活性化により、過剰な先天性及び適応性免疫応答が生じる可能性がある。
本明細書で使用される場合、「ＩＩ型インターフェロン経路の異常な活性化」という用語は、Ｉ型インターフェロン経路の活性化過程中に一般的に予想される応答とは異なる先天性及び適応性免疫系の応答を意味してもよい。例えば、病原体による誘導がない場合には、過剰な又は有害な先天性及び適応性免疫応答が起こり、終末器官の炎症性変化や損傷を引き起こすことがある。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は、被験者から採取されたＴ細胞を、それにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質を付加するようにインビトロで修飾してから被験者に再投与されるＴ細胞を意味してもよい。被験者への再投与前にＣＡＲ－Ｔ細胞をプライム化するための方法は、本明細書で開示される。
本明細書で使用される場合、「ＣＡＲ－ＮＫ細胞」という用語は、被験者から採取されたＮＫ細胞を、それにＣＡＲタンパク質を付加するようにインビトロで修飾してから被験者に再投与されるＮＫ細胞を意味してもよい。被験者への再投与前にＣＡＲ－ＮＫ細胞をプライム化するための方法は、本明細書で開示される。
本明細書で使用される場合、「免疫調節性メディエーター」という用語は、免疫系の１つ又は複数の成分に影響を与える分子（例えば、細胞によって分泌される分子）を意味してもよい。免疫系成分の例としては、タンパク質（例えば、サイトカイン、インターロイキン、抗体、補体、細胞受容体、リガンド、免疫組織適合性複合体など）、及び免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞などのリンパ球、好中球、マクロファージ／単球）が挙げられる。いくつかの場合、効果は、プラス（例えば、タンパク質レベル及び／又は活性の向上、又は免疫細胞の増殖及び／又は活性の向上）又はマイナス（例えば、タンパク質レベル及び／又は活性の低下、又は免疫細胞の増殖及び／又は活性の低下）であってもよい。免疫調節性メディエーターの非限定的な例としては、ＩＤＯ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ－γを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「細胞毒性活性」という用語は、細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞）が異なる種類の細胞を殺傷する能力を意味してもよく、通常、リンパ球の場合にはポリンを合成することにより前記殺傷を実行する。この能力は、リンパ球と標的細胞とを共培養することにより測定することができる。細胞の細胞毒性活性を確認するための他の測定方法は、当該技術分野で知られている。
本明細書で使用される場合、分子（例えば、免疫調節性メディエーター）の活性及び／又は量の「ダウンレギュレート」又は「ダウンレギュレーション」や、「低下」又は「低減」という用語は、対照値と比較して、分子の活性及び／又は量が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％までダウンレギュレート、低下、又は減少されることを意味してもよい。いくつかの場合、「ダウンレギュレーション」という用語は、完全な阻害を意味してもよい。
本明細書で使用される場合、分子（例えば、免疫調節性メディエーター）の活性及び／又は量の「アップレギュレート」又は「アップレギュレーション」や、「向上」又は「増加」という用語は、対照値と比較して、分子の活性及び／又は量が、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％までアップレギュレート又は増加されることを意味してもよい。
プライム化培地
本開示の一態様においては、非プライム化幹細胞集団から、非プライム化幹細胞集団と比較して抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するためのプライム化培地を含んでもよい。前記プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。機能性活性化剤及び少なくとも２種類の炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在してもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞集団と比較して１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌が向上したことを標識としてもよい。
いくつかの場合、本開示のプライム化培地は、合成培地であってもよい。
プライム化培地は無血清培地であってもよい。本開示のプライム化培地に含有可能な無血清培地の例としては、ＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＤＭＥＭ、及びα－ＭＥＭを含んでもよい。無血清培地は、いかなる種類の動物血清も含まない培地である。無血清培地は、幹細胞の異種汚染の可能性を回避することが好ましい。血清代替物のない培地は、いずれの市販の血清代替物製剤も補充されていない培地である。無血清培地のプライム化培地における含有量（例えば、ｗ／ｖ）が少なくとも約８０～９９％、例えば、約８０～８２％、約８２～８４％、約８４～８６％、約８６～８８％、約８８～９０％、約９０～９２％、約９２～９４％、約９４～９６％、約９６～９８％、又は約９８～９９％となるように、前記無血清培地をプライム化培地中に提供してもよい。
本開示のプライム化培地は、細胞の生存及び汚染防止に必要な他の成分を含んでもよく、このような成分として、例えば、グルコースと、細菌、マイコプラズマ及び真菌による汚染を軽減するための抗菌剤とが挙げられる。したがって、本開示のプライム化培地は、汚染を防止するために１つ以上の抗菌剤又は抗生物質を含んでもよい。通常に使用される抗生物質又は抗真菌化合物は、ペニシリン／ストレプトマイシンの混合物であるが、アンホテリシン（登録商標：アンホテリシンＢ）、アンピシニシリン、ゲンタマイシン、ボレマイシン、ハイドロマイシン、カナマイシン、マイトマイシンなどを含んでもよいが、これらに限定されない。
いくつかの場合、本開示のプライム化培地は、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の１つ又は複数の機能性活性化剤を含んでもよい。一例では、本開示のプライム化培地は、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の１つの機能性活性化剤（例えば、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））のみを含む。いくつかの場合、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤は、ＴＬＲ３などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドを含んでもよい。ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲシグナル伝達を活性化し、且つ炎症反応を誘導することができる任意の分子、化合物又は試薬を含んでもよい。ＴＬＲリガンドは、任意の公知のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ１－ＴＬＲ１０）と結合又は相互作用することにより、ＴＬＲシグナル伝達を活性化することができる。Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤は、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路を刺激又は活性化する合成分子（例えば、ＴＬＲリガンドの合成アナログ）を含んでもよい。いくつかの場合、ＴＬＲリガンドは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、及びインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）を含んでもよい。一例では、ＴＬＲ３受容体はｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）によって誘導されてもよい。別の一例では、ＴＬＲ４受容体はＬＰＳによって誘導されてもよい。
一例では、本開示のプライム化培地は、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤としてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含んでもよい。以下の実施例１で説明するように、驚くべきことに、ヒトＭＳＣ培養物をｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）へ暴露させることにより、ＩＬ－１β産生の増加（これによりＣＣＲ－８活性化を誘導する）をもたらすこと、５つの古典的な経路が活性化され、３つがダウンレギュレートされること、及び、ＣＤ１４６＋／周皮細胞様ＭＳＣの顕著な増殖が発見された。
Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の１つ以上の機能性活性化剤は、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ経路を活性化するのに十分な濃度で、本開示のプライム化培地に含まれる。例えば、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬ～約５００μｇ／ｍＬ、約０．２μｇ／ｍＬ～約４５０μｇ／ｍＬ、約０．３μｇ／ｍＬ～約４００μｇ／ｍＬ、約０．４μｇ／ｍＬ～約３５０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約０．６μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬ、約０．７μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約０．８μｇ／ｍＬ～約１５０μｇ／ｍＬ、約０．９μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、又は約０．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬの濃度でプライム化培地に含まれてもよい。一例では、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、１μｇ／ｍＬの濃度で本開示のプライム化培地に提供されてもよい。
いくつかの場合、本開示のプライム化培地は、少なくとも２種の炎症性サイトカイン、少なくとも３種の炎症性サイトカイン、少なくとも４種の炎症性サイトカイン、少なくとも５種の炎症性サイトカイン、少なくとも６種の炎症性サイトカイン、少なくとも７種の炎症性サイトカイン、少なくとも８種の炎症性サイトカイン、又は８種より多くの炎症性サイトカインを含んでもよい。炎症性サイトカインの非限定的な例としては、ＩＦＮ－α、－β、－γ、ＴＮＦ－α、－β、ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２２、－２３、ＭＩＰ－１α／β、ＭＣＰ－１、ＩＰ－１０、ＴＧＦ－β１、ＳＣＭ－１、及びＩＬ－１７Ａが挙げられる。
少なくとも２種の炎症性サイトカインは、本開示のプライム化培地に接触していない幹細胞と比較して、抗炎症表現型を有する幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の誘導を促進するのに十分な濃度で、本開示のプライム化培地に含まれていてもよい。例えば、少なくとも２種の炎症性サイトカインは、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌの濃度、例えば、約１～１０ｎｇ／ｍｌ、約１０～２０ｎｇ／ｍｌ、約２０～３０ｎｇ／ｍｌ、約３０～４０ｎｇ／ｍｌ、約４０～５０ｎｇ／ｍｌ、約５０～６０ｎｇ／ｍｌ、約６０～７０ｎｇ／ｍｌ、約７０～８０ｎｇ／ｍｌ、約８０～９０ｎｇ／ｍｌ、約９０～１００ｎｇ／ｍｌ、約１００～１２５ｎｇ／ｍｌ、約１２５～１５０ｎｇ／ｍｌ、約１５０～１７５ｎｇ／ｍｌ、又は約１７５～２００ｎｇ／ｍｌの濃度でプライム化培地に含まれてもよい。一例では、本開示のプライム化培地は、ＩＦＮ－γ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＴＮＦ－α（２０ｎｇ／ｍｌ）を含んでもよい。別の一例では、本開示のプライム化培地は、ＩＦＮ－γ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ－α（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ－１７Ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含んでもよい。
いくつかの場合、本開示のプライム化培地は、無血清培地、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤、少なくとも２種の炎症性サイトカイン（例えば、少なくとも４種の炎症性サイトカイン）、及び／又は必須ビタミンのみを含んでもよい。「のみ」とは、本明細書（例えば、実施例１及び２に）に記載されるように、プライム化培地が、プライム化培地の効能（例えば、基本的及び新規な性質）に実質的な影響を及ぼすことが可能な任意の他の免疫調節性メディエーター（例えば、成長因子及びサイトカイン）を含まないことを意味する。しかしながら、「のみ」という用語を使用しても、本出願のプライム化培地の基本的かつ新規な性質に実質的な影響を及ぼさないいくつかの成分を含むことは、依然として許容され、このような成分として、培養中の細胞の生存に必要な物質（例えば、アミノ酸、微量金属、無機塩、炭素エネルギー、緩衝液など）が挙げられる。このような場合、本出願のプライム化培地は、実質的に無血清培地、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤、少なくとも２種の炎症性サイトカイン（例えば、少なくとも４種の炎症性サイトカイン）及び／又は必須ビタミンからなると言える。
本開示の一例では、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤（例えば、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））と、２種の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α）とを含んでもよい。このようなプライム化培地は、本明細書において「４成分プライム化培地」とも称する。いくつかの場合、４成分プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤（例えば、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））と、２種の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α）とのみを含んでもよい。
別の一態様により、本開示のプライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。機能性活性化剤及び少なくとも４種の炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在してもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞集団と比較して１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌が増加していることを標識としてもよい。
いくつかの場合、本開示のプライム化培地は、少なくとも１つの必須ビタミン、及びその分野で知られている他のビタミンを含んでもよく、前記必須ビタミンとして、アスコルビン酸、チアミン、葉酸、及びリボフラビンが挙げられる。少なくとも１つの必須ビタミンは、約５０～３００μＭ、約５０～７５μＭ、約７５～１００μＭ、約１００～１２５μＭ、約１２５～１５０μＭ、約１５０～１７５μＭ、約１７５～２００μＭ、約２００～２２５μＭ、約２２５～２５０μＭ、約２５０～２７５μＭ、又は約２７５～３００μＭの濃度でプライム化培地に存在してもよい。一例では、本開示のプライム化培地は、アスコルビン酸（２００μＭ）を含んでもよい。
本開示の一例では、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤（例えば、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））と、４種の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１７Ａ）と、必須ビタミン（例えば、アスコルビン酸）とを含んでもよい。このようなプライム化培地は、本明細書において「６成分プライム化培地」とも称する。いくつかの場合、６成分プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤（例えば、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））と、４種の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１７Ａ）と、必須ビタミン（例えば、アスコルビン酸）とのみを含んでもよい。
いくつかの場合、本開示のプライム化培地は脱イオン蒸留水にて調製してもよい。本開示のプライム化培地は、汚染を防止するために、使用前に紫外線、加熱、放射線照射又は濾過などの手段により滅菌してもよい。本開示のプライム化培地は、保管又は輸送のために凍結（例えば、－２０℃又は－８０℃で）してもよい。
本開示のプライム化培地は、１×製剤又は濃縮製剤、例えば２×～２５０×濃縮培地製剤であってもよい。１×製剤において、プライム化培地中の各成分は、いずれも細胞誘導に適する濃度である。濃縮製剤において、１つ以上の成分は、細胞誘導のための濃度よりも高い濃度で存在する。本開示のプライム化培地は、塩析又は選択的濾過などの公知の方法を用いて濃縮してもよい。濃縮されたプライム化培地は、水（好ましくは脱イオン及び蒸留された水）又は任意の適宜な溶液（例えば、塩水溶液、水性緩衝液又は培地）で希釈して使用してもよい。
本開示の別の一態様により、プライム化培地と幹細胞（例えば、ＭＳＣ）とを含む組成物を含んでもよい。いくつかの場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含んでもよい。他の場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。機能性活性化剤及び炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在してもよい。抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞集団と比較して、１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌が増加していることを標識としてもよい。
一例では、組成物は、４成分プライム化培地（例えば、４成分プライム化培地のみ）と幹細胞（例えば、ＭＳＣ）とを含んでもよい。
別の一例では、組成物は、６成分プライム化培地（例えば、６成分プライム化培地のみ）と幹細胞（例えば、ＭＳＣ）とを含んでもよい。
培養方法
本開示の別の一態様により、非プライム化幹細胞集団から、非プライム化幹細胞集団と比較して抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するインビトロ方法を含んでもよい。この方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導（例えば、均一な又は実質的に均一な誘導）を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団をプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。いくつかの場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種類の炎症性サイトカインとを含んでもよい。他の場合、プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種類の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含んでもよい。産生された細胞は抗炎症表現型を有してもよく、非プライム化幹細胞と比較して１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを標識としてもよい。
インビトロ方法の一例では、プライム化培地は、４成分プライム化培地（例えば、４成分プライム化培地のみ）を含んでもよい。
インビトロ方法の別の例では、プライム化培地は、６成分プライム化培地（例えば、６成分プライム化培地のみ）を含んでもよい。
いくつかの場合、非プライム化幹細胞集団は、本開示のプライム化培地と接触していない、本開示のプライム化培地に暴露されていない、又は本開示のプライム化培地で培養されていない単離幹細胞集団を含んでもよい。この方法で使用される幹細胞は、自己由来、同種異体由来、又は異種由来であってもよい。あるいは、幹細胞は、商業的な供給源（例えば、樹立された細胞系）から入手してもよい。幹細胞の他の由来も当業者に知られている。一例では、非プライム化幹細胞は、一見健康な被験者（例えば、ヒト）の組織（例えば、脂肪組織、骨髄又は臍帯血）に由来する単離ＭＳＣ集団又は多分化能間質細胞を含む。
非プライム化幹細胞は、当業者が理解できる一般的な細胞培養方法において本開示のプライム化培地を用いて培養してもよい。例えば、非プライム化幹細胞は、被験者から単離されるか、又は商業的な供給源から得られ、適宜な環境条件（例えば、３７℃、湿潤雰囲気、５％ＣＯ２）で、所望の密度で培養容器に接種されてもよい。任意の適宜な細胞培養容器を支持体として細胞培養を行うことができる。様々な材料（例えば、プラスチック、ガラス）から構成された様々な形状及び大きさの細胞培養容器（例えば、フラスコ、シングルウェルプレート又はマルチウェルプレート、シングルウェルディッシュ又はマルチウェルディッシュ、瓶、缶、バイアル、バッグ、バイオリアクター）は当該技術分野で知られている。当業者であれば、適宜な細胞培養容器を容易に選択することができる。
非プライム化幹細胞は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な所望の期間、本開示のプライム化培地と接触するか、本開示のプライム化培地に暴露するか、又は本開示のプライム化培地を用いて培養することができる。所望の期間は、１日間又はそれより短い（例えば、６時間又は１２時間）、約２日間（例えば、１８時間）、２日間、３日間、４日間であってもよく、又は５日間を超えてもよい。
いくつかの場合、非プライム化幹細胞の表現型を検証するために、非プライム化幹細胞をプライム化培地と接触する前にそれを測定する必要がある。例えば、非プライム化幹細胞がＭＳＣを含む場合、ＭＳＣの存在を検証するために、１つ以上の既知の測定を行っても良い。一例では、細胞表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５の存在及びＣＤ３４、ＨＬＡ－ＤＲの非存在に対するフローサイトメトリー評価を用いて、ＭＳＣの存在を検証することができる。
細胞集団（非プライム化幹細胞であるかプライム化された幹細胞であるかを問わない）の同一性を検証する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、いくつかのマーカーの発現は、細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するマーカーのレベルを測定することによって確認することができる。このような過程において、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であってもよい。マーカー遺伝子から産生されたマーカーの発現を定量する方法の１例は、定量ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）である。Ｑ－ＰＣＲの実行方法は当該技術分野でよく知られている。当該技術分野で知られている他の方法も、マーカー遺伝子発現の定量に使用してもよい。例えば、測定対象とするマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いてマーカー遺伝子産物の発現を検出してもよい。マーカー発現の測定には、ブロット転写法や免疫細胞化学などの定性的又は半定量的な技術を用いることができる。また、ＥＬＩＳＡなどの細胞外マーカーの含有量を測定する技術を使用してもよいと理解される。
別の一態様では、本開示の方法によって産生されたプライム化幹細胞（プライム化された幹細胞）は、当業者に知られている技術に従って濃縮、単離、及び／又は精製されてもよい。いくつかの場合、プライム化幹細胞が濃縮、単離、及び／又は精製された細胞集団は、細胞培養物からこのような細胞を単離することによって産生されてもよい。本明細書に記載の方法により産生されたプライム化幹細胞は、このような細胞に特異的なアフィニティータグを用いて濃縮、単離及び／又は精製されてもよい。本開示のプライム化幹細胞に特異的なアフィニティータグの例として、マーカー分子（例えば、ポリペプチド）に特異的な抗体、抗体フラグメント、リガンド、又は他の結合剤が挙げられ、前記マーカー分子は、プライム化幹細胞の細胞表面上には存在する（例えば、ＣＤ１４６）一方、本明細書に記載の方法によって産生される細胞培養物中に見出される他の細胞種上には存在しない（又は実質的に存在しない）。
抗体の調製方法、及び抗体を使用して細胞を単離するための方法は、当業者に知られており、このような方法は、抗体及び本明細書に記載されたプライム化幹細胞と共に使用するために実施されてもよい。１つのプロセスにおいて、プライム化幹細胞により発現されるマーカーに結合可能な抗体を磁気ビーズに付着させた後、細胞間及び培養基板との接着を軽減させるように酵素処理された細胞培養物中のプライム化幹細胞に結合させてもよい。次いで、細胞／抗体／ビーズ複合体を、移動可能な磁場に置くことにより、ビーズに結合したプライム化幹細胞を結合していない細胞と分離させる。プライム化幹細胞が培養物中の他の細胞と物理的に分離された後、抗体との結合を破壊し、細胞を適宜な組織培地に再接種する。必要に応じて、単離された細胞組成物は、親和性に基づく代替的な方法、又はプライム化幹細胞に特異的な同一の又は異なるマーカーを用いるさらなる回数の濃縮によって、さらに精製されてもよい。
必要に応じて、本開示の方法によって産生されたプライム化幹細胞を分離するための任意の工程及び手順は、人工的に実施されてもよい。或いは、このような細胞を単離するプロセスは、例えば、当業者に知られている１つ又は複数の適宜な装置によって促進及び／又は自動化されてもよい。
本明細書に記載の方法により、細胞集団又は細胞培養物においてプライム化幹細胞の含有量は、プライム化又は濃縮されていない細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２～約１０００倍濃縮されることができる。いくつかの場合、プライム化幹細胞は、プライム化又は濃縮されていない細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約５倍～約５００倍濃縮されてもよい。他の場合、プライム化幹細胞は、プライム化又は濃縮されていない細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約１０倍～約２００倍濃縮されてもよい。他の場合、プライム化幹細胞は、プライム化又は濃縮されていない細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２０倍～約１００倍濃縮されてもよい。他の場合、プライム型細胞は、プライム化又は濃縮されていない細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約４０倍～約８０倍濃縮されてもよい。いくつかの場合、プライム化幹細胞は、プライム化又は濃縮されていない細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２倍～約２０倍濃縮されてもよい。
別の一態様により、本明細書に記載の方法によって産生された組成物に関し、前記組成物として、プライム化幹細胞を主要な細胞種として含む細胞培養物又は細胞集団が挙げられる。いくつかの場合、本明細書に記載の方法により産生された細胞培養物及び／又は細胞集団は、少なくとも約９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８９％、少なくとも８８％、少なくとも８７％、少なくとも８６％、少なくとも８５％、少なくとも８４％、少なくとも８３％、少なくとも８２％、少なくとも８１％、少なくとも８０％、少なくとも７９％、少なくとも約７８％、少なくとも７７％、少なくとも７６％、少なくとも７５％、少なくとも７４％、少なくとも７３％、少なくとも７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％、又は少なくとも約５０％のプライム化幹細胞を含む。他の場合、本明細書に記載の方法により産生された細胞培養物又は細胞集団は、少なくとも約５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２４％、少なくとも２３％、少なくとも２２％、少なくとも約２１％、少なくとも２０％、少なくとも１９％、少なくとも１８％、少なくとも１７％、少なくとも１６％、少なくとも１５％、少なくとも１４％、少なくとも１３％、少なくとも１２％、少なくとも１１％、少なくとも１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、又は少なくとも約１％のプライム化幹細胞を含む。いくつかの場合、細胞培養物又は細胞集団中のプライム化幹細胞のパーセンテージは、培養物中の残留細胞に関係なく計算される。
いくつかの場合、本開示のインビトロ方法は、フィーダー細胞層（例えば、通常は分裂することができず、他の細胞の増殖を助けるための細胞外分泌物を提供する細胞層；例えば、線維芽細胞）の存在又は非存在下で実施されてもよい。
なお、本明細書で開示された方法における各工程は、場合によっては、任意の適宜な順序で、又は同時に実行されてもよく、必ずしも記載された順序で実行される必要はない。例えば、上記方法において、プライム化培地を供給する工程の前、後、又は同時に、非プライム化幹細胞集団を供給する工程を行ってもよい。
プライム化細胞（プライム化された細胞）
本開示の別の一態様により、本開示のプライム化培地に接触や暴露するか、又は、本開示のプライム化培地で培養することにより抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を含む。このような細胞（プライム化幹細胞（例えば、プライム型ＭＳＣ）とも称する。）は、非プライム化幹細胞集団と比較して、１つ以上の抗炎症性メディエーター及び／又は独特の表面マーカーの発現及び／又は分泌が増加していることを標識とする。以上のように、本開示のプライム化幹細胞は、天然に存在する幹細胞とは著しく異なり、その原因として、少なくとも、プライム化幹細胞は、不確定な分子（例えば、タンパク質、炭水化物、代謝物など）が多数存在するインビボの炎症状態とは異なる、無血清培地（場合によっては、合成培地）中にユニークな成分の組み合わせを含むプライム化培地に接触や暴露するか、又はこのようなプライム化培地で培養して得られたものであるからである。したがって、驚くべきことに、本開示のプライム化幹細胞は、天然に存在する幹細胞と著しく区別可能でユニークな機能的及び構造的特徴や効果（以下に同定）を有する。
いくつかの場合、本開示は、ＣＤ１４６＋である単離プライム型ＭＳＣ集団（例えば、４成分又は６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。他の場合、本開示は、ＣＤ１４６＋及びＬｅｐ－Ｒ＋である単離プライム型ＭＳＣ集団（例えば、４成分又は６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。他の場合、本開示は、ＣＤ１４６＋、Ｌｅｐ－Ｒ＋、ネスチン＋、及びＳＤＦ－１＋である単離プライム型ＭＳＣ集団（例えば、４成分又は６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。他の場合、本開示は、ＣＤ１４６＋、Ｌｅｐ－Ｒ＋、ネスチン＋、及びＳＤＦ－１＋のうちの少なくとも１つ又はそれらの組み合わせである、単離プライム型ＭＳＣ集団（例えば、４成分又は６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。
いくつかの場合、本開示は、非プライム化幹細胞（例えば、非プライム化ＭＳＣ）と比較してＩＤＯ、ＣＤ２７４、ＣＤ１４６、及び血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲＢ）の発現の向上と、Ｃ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸ３ＣＬ１）の発現の低下とを標識とする抗炎症表現型を有するプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。一例では、プライム型ＭＳＣ（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）は、非プライム化ＭＳＣにおけるＩＤＯ発現より約５０，０００～約１５０，０００倍高いＩＤＯ発現を示す。
いくつかの態様では、プライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、４成分又は６成分プライム化培地を用いて得られたもの）は、免疫細胞及び／又は免疫調節性メディエーターの産生をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることができる。
いくつかの場合、本開示は、非プライム化幹細胞と比較して、細胞傷害性Ｔ細胞の産生を少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、又は少なくとも８倍アップレギュレートするプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。一例では、プライム化ＭＳＣ（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）は、非プライム化ＭＳＣと比較して、細胞傷害性Ｔ細胞の産生を少なくとも６倍アップレギュレートする。
いくつかの場合、本開示は、非プライム化幹細胞と比較して、ＴＨ１細胞の産生を少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍アップレギュレートするプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。一例では、プライム型ＭＳＣ（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）は、少なくとも非プライム化ＭＳＣと比較して、細胞傷害性Ｔ細胞の産生を少なくとも１２倍アップレギュレートする。
いくつかの場合、本開示は、非プライム化幹細胞と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生を少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、又は少なくとも１５倍アップレギュレートするプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。一例では、プライム型ＭＳＣ（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）は、少なくとも非プライム化ＭＳＣと比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生を少なくとも１２倍アップレギュレートする。
いくつかの場合、本開示は、ＮＫ細胞の産生を、非プライム化幹細胞より高くなるようにアップレギュレートするプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。
いくつかの場合、本開示は、Ｔｈ１７細胞の産生を、非プライム化幹細胞より低くなるように抑制するプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい（。
いくつかの場合、本開示は、非プライム化幹細胞と比較して二本鎖ＤＮＡ自己抗体の産生をインビボで抑制するプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。
いくつかの場合、本開示は、非プライム化幹細胞と比較してＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）の産生を抑制するプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。
いくつかの場合、本開示は、非プライム化幹細胞と比較してＩＬ－１７の産生を減少するプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。
なお、プライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団は、前述の構造的及び／又は機能的効果のいずれか一つ又は複数の組み合わせを標識とする抗炎症表現型を有してもよい。
本開示の別の一態様は、幹細胞（例えば、ＭＳＣ）を本開示のプライム化培地で所定時間培養し、又は本開示のプライム化培地に所定時間接触又は暴露し、培養期間後に上清又は条件培地を採取することによって製造された条件培地を含んでもよい。好ましくは、本開示の条件培地は、非プライム化幹細胞から調製された条件培地と比較して、レベルが向上した免疫調節性メディエーター（例えばＩＤＯ）と、プライム化幹細胞からのエクソソームなどの他の成分とを含んでもいよい。
使用
別の一態様では、本明細書では、プライム化幹細胞の単離集団の使用方法、及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地の使用方法が記載されている。一例では、プライム化幹細胞集団、及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地は、医薬組成物を調製するのに有用であり、前記医薬組成物は、例えば、全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害に罹患しているか、又は全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害を発症するリスクがある被験者などの、治療を必要とする被験者に使用可能である。
本明細書に開示されるようなプライム化幹細胞集団、及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地を含む組成物は、臨床治療、研究、開発、及び商業目的における様々な用途を有する。治療を目的とする場合、例えば、全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害（例えば、インターフェロン調節性自己免疫疾患）に罹患しているか、又は全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害を発症するリスクのある被験者を治療するために、本明細書に開示されるようなプライム化幹細胞集団、及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地を投与してもよい。いくつかの場合、本明細書で開示されるようなプライム化幹細胞集団、その細胞膜エクソソーム、及び／又は単離プライム化幹細胞集団から調製された条件培地を被験者に投与するしてもよく、これにより、損傷した又は他の原因で不健康な組織の機能を回復するのに寄与することができるだけでなく、損傷した組織の再構築を促進することもできる。
本明細書に開示されるようなプライ化幹細胞集団及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地は、研究及び開発を目的とする場合、全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害に特異的に関連する疾患モデルの開発及び研究に使用することができる。
本開示の一態様は、全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害に罹患しているか、罹患していると疑われるか、又は全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害を発症するリスクのある被験者の治療方法を含んでもよい。いくつかの場合、全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害は、インターフェロン調節自己免疫疾患であってもよく、このような疾患として、Ｉ型ＩＦＮ介在経路及びＩＩ型ＩＦＮ介在経路の異常活性化により調節されるインターフェロン調節性自己免疫疾患が挙げられる。本開示によって治療可能なインターフェロン調節性自己免疫疾患の非限定的な例としては、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、臓器移植拒絶反応（例えば、移植片対宿主病）、成人又は若年性特発性乾癬関節炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、ＣＮＳ血管炎、強皮症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、及び全身性強皮症が挙げられる。被験者が前述のインターフェロン調節性自己免疫疾患のいずれかに罹患しているか、罹患している疑いがあるか、又は発症するリスクがあるかを判定する方法は、当該技術分野において公知である。
この方法は、プライム化幹細胞、すなわち、非プライム化幹細胞と比較して１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現が増加していることを標識とする抗炎症表現型を有する幹細胞を被験者に治療有効量で投与することを含んでもよい。好ましくは、治療的有効量のプライム化幹細胞の投与により、以下の細胞効果のうちのいずれか一つ又は複数の組み合わせを有してもよい：（１）ＩＤＯ、ＣＤ２７４、ＣＤ１４６及びＰＤＧＦＲＢの発現の増加及びＣＸ３ＣＬ１の発現の減少；（２）細胞傷害性Ｔ細胞の産生の増加；（３）ＴＨ１細胞の産生の増加；（４）ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生の増加；（５）ＮＫ細胞の産生の増加；（６）Ｔｈ１７細胞の産生の抑制；（７）二本鎖ＤＮＡの産生の抑制；（８）ＢＡＦＦの産生の抑制；及び（９）ＩＬ－１７の産生の減少。
本出願の発明者は、驚くべきことに、プライム化幹細胞（例えば、プライム型ＭＳＣ）を一回投与すると、上記のような細胞効果（例えば、細胞効果（１）～（９））が長期間にわたって持続することを発見した。したがって、いくつかの場合、治療有効量のプライム化幹細胞（例えば、プライム型ＭＳＣ）は、１回の用量として被験者に投与されてもよく、その後、細胞効果（１）～（９）のうちのいずれか一つ又は複数の組み合わせが持続可能な期間としては、約１～１２ヶ月、約１～２ヶ月、約１～３ヶ月、約１～４ヶ月、約１～５ヶ月、約１～６ヶ月、約１～７ヶ月、約１～８ヶ月、約１～９ヶ月（例えば、約９ヶ月）、約１～１０ヶ月、約１～１１ヶ月、又は約１年が挙げられるが、これらに制限されない。
一例では、本明細書に記載された方法により、ＳＬＥに罹患している、罹患していると疑われる、又は罹患するリスクのあるヒト被験者を治療することができる。ＳＬＥは、自己免疫疾患の一種であり、細胞性と体液性自己免疫の異常を特徴とする。病原性Ｔ細胞とＢ細胞が自己抗原を認識した結果、免疫反応の過剰と自己抗体の産生を引き起こし、最終的に多系統慢性炎症性疾患を引き起こす。ＳＬＥの臨床所見は、皮膚あるいは関節に影響する軽度の全身性炎症から深刻な臓器損傷（脳、腎臓など）まで、高度の異質性を示している。残念ながら、ＳＬＥの細胞性及び体液性自己免疫に対する統一的で効果的な治療法はまだ存在しない。マルチセンター臨床試験では、細胞性又は体液性免疫系の成分を標的とした療法は、疾患活動性の持続的な緩和を誘導することがまだできない。
好ましくは、ＳＬＥに罹患している、罹患していると疑われる、又は罹患するリスクのあるヒトにプライム化幹細胞を治療有効量で投与してもよい。被験者が全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害に罹患していると疑われるかどうか、又は全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害に罹患しているリスクを有するかどうかを判定するための臨床的方法は、当該分野で知られている。一例では、プライム化幹細胞は、６成分プライム化培地と接触された又はそれで培養されたプライム型ＭＳＣを含んでもよい。プライム化培地は、単独で、又は医薬組成物（以下に記載）として投与されてもよい。好ましくは、投与されたプライム型ＭＳＣは、細胞効果（１）～（９）（上記したもの）のうちのいずれか一つ又は複数お組み合わせを示すことができ、さらに、ＳＬＥにおけるＩ型及びＩＩ型インターフェロン経路の異常調整の原因として知られている免疫細胞に対して正の調節作用を有する。具体的には、本開示のプライム型ＭＳＣは、Ｉ型（－α、－β）及びＩＩ型インターフェロン（－γ）の産生及び活性を制御することによって樹状細胞（ＤＣ）及びＢ細胞を抑制しながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を拡大培養及び活性化することができる。
別の一例では、プライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）は、腎硬化及び炎症を有利に予防又は軽減することができるため、臓器（例えば、腎臓、肝臓、肺）移植手順の前、期間、又は後に、治療有効量のプライム化幹細胞（例えば、プライム型ＭＳＣ）を被験者に投与してもよい。臓器移植の状況において、プライム化幹細胞（例えばＭＳＣ）が様々な方式で使用可能である。得られた臓器の品質は、ドナーの年齢と健康状態、臓器のインビトロでの時間（及び保管条件）、及びレシピエントの特徴により大きく変化する。大量の臓器は、外科医の移植基準（通常、トナー脳死後の虚血時間、又はトナーの体外に取り出されてからレシピエントへ移植する前の転移時間）を満たさないため、廃棄されることになる。これは、明らかに、毎回の廃棄も破壊的な損失であり、特に、非常に短い体外離脱タイムラインを持つ臓器にとって重要である。目前、医師は、内皮の炎症／活性化を減少させ、患者の予後をより良くするために、輸送中に特定の培地カクテル混合物を臓器に灌流する（ドナーとレシピエントとのいずれに対しても体外で行う）。また、幹細胞又は幹細胞副産物の使用を含むカクテル混合物に関する研究が積極的に行われている。遅延された移植片の機能（腎臓）及び虚血による炎症／損傷を減少することに寄与するために、及び／又は寛容性（Ｔｒｅｇ）などを向上させることによって有毒な免疫阻害剤の需要を減少するために、移植時（又は移植直前）のレシピエントに対する療法に関する研究も行われている。好ましくは、プライム化幹細胞（例えばＭＳＣ）は、当分野において大きな潜在能力を有する。その理由として、本開示のプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）は、ＩＦＮ－γ応答を低下させ、制御性Ｔ細胞／寛容性を促進させることができるという知見を見出したからであり、この知見は、臓器利用、臓器健康、及び成功的な臓器移植に寄与するように、様々な方法で利用することができる。
別の一態様では、本開示は、被験者における養子免疫療法に用いられる方法を含んでもよい。養子免疫療法は、被験者から免疫細胞を除去すること、エクスビボで処理すること（すなわち、細胞の活性化、精製及び／又は拡大培養）、及びその後に得られた細胞を同一の被験者へ注入することを含む細胞療法である。養子免疫療法の例としては、ＬＡＫ細胞（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，米国特許番号４，６９０，９１５）、ＴＩＬ細胞（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，米国特許番号５，１２６，１３２）、細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃａｉら、米国特許番号６，２５５，０７３；Ｃｅｌｉｓら、米国特許番号５，８４６，８２７）、拡大培養された腫瘍流入領域リンパ節細胞（Ｔｅｒｍａｎ、米国特許番号６，２５１，３８５）、各種リンパ球製剤（Ｂｅｌｌら、米国特許番号６，１９４，２０７；Ｏｃｈｏａら、米国特許番号５，４４３，９８３；Ｒｉｄｄｅｌｌら、米国特許番号６，０４０，１８０；Ｂａｂｂｉｔｔら、米国特許番号５，７６６，９２０； Ｂｏｌｔｏｎ、米国特許番号６，２０４，０５８）、ＣＤ８＋ＴＩＬ細胞（Ｆｉｇｌｉｎら、（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ １５８： ７４０）、ＩＬ－２の存在下で抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８： ２８５）、ＩＬ－２の存在下で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を用いて共活性化されたＴ細胞（Ｇａｒｌｉｅら（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２２：３３６）、エクスビボで産生しＩＬ－２の存在下で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて拡大培養した抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ Ｔ細胞（Ｏｅｌｋｅら（２０００）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：１９９７）を生産及び使用する方法；及び、ＢＣＧワクチン（ＢＣＧ）と混合され、且つ放射線照射された自己腫瘍細胞を注射することにより被験者に接種してから、７日後に流入領域リンパ節Ｔ細胞を回収し、前記流入領域リンパ節Ｔ細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂで活性化し、その後ＩＬ－２において拡大培養することを含む方法（Ｃｈａｎｇら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １５：７９６）挙げられる。
いくつかの場合、前記方法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を拡大培養してＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性活性を増加させるのに十分な条件下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の非プライム化集団を本開示のプライム化培地と所定時間接触させることを含んでもよい。プライム化されたＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞は、本開示のインビトロ方法（例えば、４成分又は６成分プライム化培地を使用する方法）によって産生してもよい。その後、養子免疫療法を必要とする被験者（例えば、全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害（例えば、ＳＬＥ）に罹患しているか、罹患していると疑われるか、又は全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害（例えば、ＳＬＥ）に罹患するリスクのある被験者）に、プライム化されたＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を治療有効量で投与してもよい。
いくつかの場合、プライム化幹細胞及び／又は単離プライム型細胞集団から調製された条件培地を含む組成物の適切な投与経路は、動脈内投与又は静脈内投与、非経口投与、髄腔内投与、心室内投与、実質内投与、頭蓋内投与、脳槽内投与、線条体内投与、黒質内投与、筋肉内投与、脊柱内投与、皮下投与、経皮投与、肺内投与、鼻腔内投与、直腸投与及び局所（口腔及び舌下を含む）投与を含んでもよい。
単離プライム化幹細胞集団、及び／又は単離プライム型細胞集団から調製された条件培地を含む組成物は、植え込み可能な装置を用いて被験者に投与されてもよい。植え込み可能な装置及び関連技術は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載される組成物を連続的放出又は徐放して送達するのに必要な送達システムとして有用である。また、植え込み可能な装置送達システムは、化合物又は組成物の送達の所定箇所（例えば、局所部位、臓器、骨など）を確定するために使用してもよい（Ｎｅｇｒｉｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２２（６）：５６３（２００１））。本開示のいくつかの態様によれば、代替の送達方法に関する徐放技術も使用可能である。例えば、ポリマー技術、持続放出技術、及びカプセル化技術（例えば、ポリマー、リポソームを使用するもの）に基づく徐放製剤も、本明細書に記載される組成物を送達するために使用することもできる。
いくつかの場合、治療用組成物は、プライム化幹細胞集団を単独で含み、及び／又は、プライム化細胞集団から調製された条件培地を単独で含み、及び／又は、医薬組成物として配合された単離プライム化幹細胞集団及び／又は単離プライム化細胞集団から調製された条件培地を含んでもよい。医薬組成物は、有効量のプライム化幹細胞、及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地の上に、薬学的に受容可能な担体（添加剤）、添加剤、希釈剤又は賦形剤（例えば、無菌塩水、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）又はＩｓｏｌｙｔｅ Ｓ，ｐＨ７．４）を併せて含んでもよい。例えば、本明細書に開示されるプライム化幹細胞の単離集団及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地は、ヒトへの投与のために十分な無菌条件下で調製された等張化賦形剤を含む医薬組成物の形態で提供されてもよい。医薬製剤の一般原理については、Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ＆Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ編集，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６；及び、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ＆Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００を参照してもよい。組成物の細胞賦形剤及び任意の随伴成分の選択は、投与のための経路及び装置に応じて調整される。
被験者に投与するためのプライム化幹細胞を調製するのに有用な薬学的に受容可能な担体は、その分野でよく知られており、例えば、水又は緩衝生理食塩水などの水溶液；又はジオール、グリセリン、油（例えば、オリーブ油）、若しくは注射可能な有機エステルなどの他の溶媒又は媒質を含んでもよい。薬学的に許容可能な担体は、例えば、結合体の吸収を安定化又は増加させるように作用する生理学的に許容される化合物を含んでもよい。このような生理学的に許容される化合物は、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、ショ糖又はデキストラン）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸又はグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定化剤又は賦形剤を含む。
いくつかの場合、プライム化幹細胞の単離集団及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地は、必要に応じて、被験者に投与する前にプライム化幹細胞及び／又は条件培地を再構築又は解凍（凍結していた場合）するなどの所望の目的のための、書面による説明書を収容する適宜な容器で包装されてもよい。
いくつかの場合、全身性炎症性又はそれ自己炎症性の疾患又は障害に関連する少なくとも１つの症状に統計学的に有意で測定可能な変化を生じさせるのに十分な治療有効量のプライム化幹細胞及び／又はプライム化幹細胞から調製された条件培地を被験者に投与してもよい。治療有効量の確定は、完全に当業者の能力の範囲内で実現できるものである。通常、治療有効量は、被験者の病歴、年齢、状態、性別、及び被験者の医学的状態の重症度及びタイプ、ならびに他の薬物活性剤の投与によって変化する。
プライム化幹細胞の単離集団及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地を含む組成物は、一回又は数回に分けて被験者に投与されてもよい。被験者に投与するための組成物は、数回に分けて投与される場合、別の１回の投与から５分間、１０分間、２０分間、６０分間、２時間、３時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間以内に投与されてもよい。組成物が異なる医薬組成物の形式で投与される場合、投与経路は異なってもよい。いくつかの場合、プライム化幹細胞を単独で含む組成物及び／又は医薬組成物としてのプライム化幹細胞を含む組成物を被験者に投与する。他の場合、プライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地を単独で含む組成物、及び／又は医薬組成物としての、プライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地を含む組成物を被験者に投与する。別の一態様では、単離プライム化幹細胞集団から調製された条件培地と混合した単離プライム化幹細胞集団を含む組成物を被験者に投与する。別の一態様では、このような複数の組成物は、実質的に同時に、又は別々に連続して投与されてもよい。
他の場合、プライム化幹細胞の単離集団及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地は、後続の移植／注入のために保管されてもよい。プライム化幹細胞の単離集団及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地は、一部が後続の使用のために保留され、一部が被験者に直ちに適用されるように、２以上のアリコート又は単位に分割されてもよい。また、プライム化幹細胞の全部又は一部の細胞バンクにおける中期～長期の保管も本願の範囲に収まっており、例えば、米国特許公開番号２００３／００５４３３１に開示されており、当該米国特許の内容は、引用により本明細書に組み込まれている。処理終了時に、濃縮されたプライム化幹細胞及び／又は単離プライム化幹細胞集団から調製された条件培地を送達装置（例えば、注射器）に装入して当業者に知られている任意の方法によってレシピエント体内に配置してもよい。
いくつかの場合、被験者に投与するための、単離プライム化幹細胞集団及び／又は単離プライム化幹細胞集団から調製された条件培地を含む組成物は、医薬活性剤（例えば、免疫調節剤）をさらに含んでもよく、このような医薬活性剤として、当分野で知られている全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害を治療するための薬剤が挙げられる。本明細書で使用される場合、「免疫調節剤」という用語は、正常な免疫機能を活性化又は向上させることができる、又は、正常な免疫機能を抑制又は妨害することができる薬剤を含んでもよい。免疫抑制剤としての免疫調節剤の例としては、例えば、Ｔ細胞／Ｂ細胞共刺激経路を抑制する試薬、具体的には、米国特許番号７，０９４，８７４に開示されているＣＴＬＡ４及びＢ７経路を介したＴ細胞及びＢ細胞の結合を妨害する試薬などが挙げられ、前記米国特許は引用により本明細書に組み込まれている。免疫調節剤は、投与経路に適する製剤の形で投与されてもよく、所望の治療効果を達成するのに十分な用量で被験者に投与する。いくつかの場合、治療過程開始直前に測定された実際の体重を使用して投与量を計算してもよい。このように計算された用量については、治療過程開始前にＤｕｂｏｉｓ法により下式で体表面積（ｍ２）を算出する：
ｍ２＝（重量ｋｇ０．４２５×身長ｃｍ０．７２５）×０．００７１８４
プライム化幹細胞の単離集団及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地を含む組成物の投与による毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０及びＥＤ５０を確認するために、細胞培養物又は実験動物に対する標準的な薬学的手順によって測定してもよい。大きな治療指数を示す、プライム化幹細胞の単離集団及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地を含む組成物は好ましい。単離プライム化幹細胞集団及び／又は単離プライム化幹細胞集団から調製された条件培地を含む組成物の量は、いくつかの十分に確立された動物モデルを用いて試験することができる。いくつかの場合、細胞培養アッセイ及び動物モデル研究から得られたデータを用いて、ヒトに適する投与量範囲を制定することができる。このような組成物の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含み、毒性が非常に小さい又は全くない血中濃度範囲内である。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて上記範囲内で変化してもよい。
プライム化幹細胞の単離集団及び／又はプライム化幹細胞の単離集団から調製された条件培地を含む組成物の治療有効用量又は治療有効量はまた、細胞培養アッセイから最初に推定してもよい。あるいは、任意の特定の投与量の効果は、適宜なバイオアッセイによって監視されてもよい。
治療の持続時間及び頻度に関して、熟練した臨床医は、通常、被験者の状態を監視して治療が治療上の利益を生じた時点を確認し、そして、用量を増加又は減少するか、投与頻度を増加又は減少するか、治療を中断又は再開するか、又は治療計画に他の変更を加えるかどうかを決定する。投与計画は、被験者のプライム化幹細胞及び／又はプライム化幹細胞由来の条件培地に対する感受性などの多くの臨床的要因に応じて、週１回から１日１回の頻度で変化してもよい。所望の用量は、１回に限り投与するか、又は、例えば２～４回などのサブ用量に分けて、例えば１日中適宜な間隔又は他の適宜なスケジュールで投与されるように、一定の期間にわたって投与してもよい。このようなサブ用量は、単位剤形として投与することができる。いくつかの場合、投与は長期間にわたって実行し、例えば、数週間又は数か月の期間にわたって１日に１回又は複数回投与する。投与計画の例としては、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月又はそれ以上の期間内に、１日に２回、１日に３回、又は１日に４回以上投与することが挙げられる。
別の一態様では、炎症を抑制するのに有用な遺伝子（例えば、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン経路の機能性活性化剤又は阻害剤をコードする遺伝子、又は抗炎症性メディエーターをコードする遺伝子）を導入するように、本明細書に開示されるプライム化幹細胞集団を遺伝的に改変してもよい。いくつかの場合、生存率の向上、増殖の制御などのために、プライム化幹細胞集団に対して遺伝子組換えを行ってもよい。本明細書に開示されるようなプライム化幹細胞集団は、適宜なベクターによるトランスフェクションや形質導入、相同組換え、又は他の適宜な技術によって、目標とする遺伝子を発現できるように遺伝的に改変されてもよい。一例では、テロメラーゼ触媒成分（ＴＥＲＴ）をコードする遺伝子を用いて、１つ以上のプライム化幹細胞をトランスフェクションしてもよく、このような遺伝子は、通常、内在性プロモーターの作用下で生じるテロメラーゼ発現よりも増加したテロメラーゼ発現を生じうる異種プロモーターに作用される（国際特許出願ＷＯ９８／１４５９２を参照してもよく、この国際特許出願は、引用により本明細書に組み込まれている。）。別の一例では、より高純度のプライム化幹細胞集団を提供するために、選択マーカーが導入される。別の一例では、ベクターを含む上澄み液を用いて８～１６ｈの期間にわたってプライム化幹細胞集団を遺伝的に改変した後、１～２日間増殖培地に交換されてもよい。ピューロマイシン、Ｇ４１８又はブラストサイジンなどの薬物選択剤を使用して、遺伝的に改変されたプライム化幹細胞を選択してから培養してもよい。
本明細書に開示されるプライム化幹細胞への外来遺伝子の導入に有用な多数のベクターが入手可能である。ベクターは、エピソームベクターであってもよく、例えば、プラスミドや、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来ベクターなどが挙げられる一方、ベクターは、相同組換え又はランダムインテグレーションによってプライム化幹細胞ゲノムに組み込まれてもよく、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ－１、ＡＬＶなどのレトロウイルス由来ベクターであってもよい。いくつかの場合、レトロウイルスと適宜なパッケージング細胞系との組み合わせも使用可能であり、ここで、キャプシドタンパク質は、本明細書に開示されるプライム化幹細胞を感染することを機能する。通常、プライム化幹細胞は培地中で少なくとも約２４時間インキュベートされる。いくつかの場合、いくつかの応用分野では、分析前に、プライム化幹細胞を培地中で短期に（例えば２４～７３時間）、又は少なくとも２週間成長させ、ひいては、５週間以上成長させてもよい。一般的なレトロウイルスベクターは「不完全」であり、すなわち、増殖感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。ベクターの複製は、パッケージング細胞系内の成長を必要とする。
レトロウイルスの宿主細胞特異性は、エンベロープタンパク質Ｅｎｖ（Ｐ１２０）によって決定される。エンベロープタンパク質は、パッケージング細胞系から提供される。エンベロープタンパク質は、少なくとも、同種指向性、両種指向性及び異種指向性の３つのタイプがある。同種指向性エンベロープタンパク質でパッケージングされたレトロウイルス、例えばＭＭＬＶは、マウス及びラットのほとんどの細胞種に感染することができる。同種指向性パッケージング細胞系としては、ＢＯＳＣ２３（Ｐｅａｒら（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：８３９２－８３９６）が挙げられる。両種指向性エンベロープタンパク質（例えば４０７０Ａ）を含むレトロウイルスは、ヒト、イヌ、マウスを含むほとんどの哺乳動物細胞種に感染することができる。両種指向性パッケージング細胞系としては、ｐＡＬ２（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ５：４３１－４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ６：２８ ９５－２９０２）ＧＲＩＰ（Ｄａｎｏｓら（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：６４６０－６４６４）が挙げられる。異種指向性エンベロープタンパク質（例えばＡＫＲＥｎｖ）でパッケージングされたレトロウイルスは、マウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞種に感染することができる。いくつかの場合、ベクターは、後続に、例えばＣｒｅ／ｌｏｘなどの組換え酵素系を用いて除去しなければならない遺伝子を含んでもよく、又は、ヘルペスウイルスＴＫ、ＢＣ１－ＸＳなどの選択的毒性を産生可能な遺伝子を含むことによりそれらの発現を破壊した細胞を含んでもよい。
適宜な誘導型プロモーターは、所望のプライム化幹細胞（標的）種（トランスフェクションされた細胞又はその子孫）において活性化される。転写活性化により、転写が標的細胞において基礎レベルと比べて少なくとも約１００倍、より一般的には少なくとも約１０００倍増加していることが期待される。異なる細胞種で誘導される種々のプロモーターが知られている。
別の一態様では、プライム化幹細胞は、潜在的な治療薬のスクリーニングに有用である。潜在的な治療薬を培養物中のプライム化幹細胞に異なる用量で投与してプライム化幹細胞の異なる期間での反応を監視してもよい。プライム化幹細胞の物理的及び／又は機能的特徴は、例えば細胞成長を顕微鏡で観察することにより解明することができる。新たな又は向上したレベルのタンパク質（例えば、酵素、受容体及び他の細胞表面分子）又はアミノ酸の発現の誘導は、そのような分子レベルの変化を同定可能な当該技術分野で知られている任意の技術を用いて分析してもよい。これらの技術としては、このような分子に対する抗体を用いる免疫組織化学的又は生化学的分析技術が挙げられる。このような生化学的分析技術としては、タンパク質アッセイ、酵素アッセイ、受容体結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気泳動アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いるアッセイ、ウェスタンブロット、及び放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。ノーザンブロットなどの核酸分析方法を用いて、これらの分子、又はこれらの分子を合成する酵素をコードするｍＲＮＡのレベルを測定することができる。
プライム化幹細胞の細胞増殖及び機能に対する潜在的な治療薬の影響を試験することにより、プライム化幹細胞に対する潜在的な薬物の副作用をスクリーニングすることもできる。
以下の実施例は、単に例示のため提供され、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１
実施例１では、多種の自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ、シェーグレン症候群、全身性強皮症、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬様関節炎）におけるＩ型及びＩＩ型インターフェロン経路の活性化により誘導される炎症性活性を制御するために、実験を行って「ＨＸＢ－３１９」と称されるＭＳＣプライム化培地を開発した。実施例１で使用される用語「ＨＸＢ－３１９」はまた、実施例１で発見されたＭＳＣプライム化培地で処理又はプライム化されたＭＳＣを指しても良い。
危険シグナル刺激を用いた健康骨髄由来ＭＳＣのインビトロ実験
＜抗炎症反応をもたらすヒトＭＳＣ培養物のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）暴露＞
本発明者らは、標準的な方法を用いて健康ドナーから混在したＭＳＣ集団を単離した後、第２の継代時に、例えばＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（３０ｎｇ／ｍｌ）、リポ多糖（ＬＰＳ）（１０μｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ－α（５０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ－１β（２５ｎｇ／ｍｌ）のような危険シグナルでＭＳＣを一晩（１８時間）処理した。次に、培地を交換してＭＳＣ集団を血清中に静置し、それらを２４時間以内に採取して分泌タンパク質を測定した。タンパク質アレイには、Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈタンパク質アレイを用いる。生体マーカー検出のための経路解析（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）を用いて、組織培地中のプライム化された及び非プライム化ＭＳＣの分泌タンパク質を解析した。本発明者らは、細胞がＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）に暴露された後に活性化された５つの古典的な経路、及びダウンレギュレートされた３つの古典的な経路を同定した。活性化された５つの経路は、下記のとおりである。
（１）マクロファージとＴヘルパー細胞から産生されると知られているサイトカイン産生のアップレギュレーション：ＣＳＦ－２（１６．５倍）、ＩＬ－１３（３．７倍）、ＣＣｌ４（２．８倍）、ＩＬ－１β（２．５倍）、及びＴＮＦ－α（２．１５倍）が増加した一方、ＩＬ－１０（－４．３倍）、ＣＸＣＬ１（－５．４倍）、ＩＬ－３（－１．６倍）が低下した。ＩＬ－１７Ａ、Ｂ、Ｆを調節するサイトカインシグナル伝達経路及びインターフェロンγ経路（ＮＦκＢ複合体、インターフェロンγ、ＩＬ－１７ダイマー及びＩＬ－１７受容体は、併せてこの経路における一連のケモカイン及びサイトカイン、例えばＣＸ３ＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１８及びＩＬ１／ＩＬ６／ＴＮＦ－αを調節する）はダウンレギュレートされた一方、Ｔヘルパー細胞の分化を助けるサイトカインシグナル伝達経路はアップレギュレートされた（ＩＦＮ－γ（１．６倍）、ＩＬ－４（２３倍）、ＩＬ－５（３．１倍）、ＩＬ－６（１．６倍）、ＩＬ－１３（３．７倍）、ＴＧＦ－β（２．３倍）、ＩＬ－１０（－４．３））。
（２）ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理後、細胞運動、造血、免疫細胞輸送経路がダウンレギュレートされた。本発明者らは、本経路解析において、ＳＬＥの発症メカニズムに機能する重要なタンパク質、例えばインターフェロン及びその調節剤、例えばＩＬ－１２、インターフェロンγがダウンレギュレートされたことを見出した。さらに、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化に共に作用する炎症性サイトカインＩＬ－６が顕著に抑制された。
（３）細胞の成長と増殖、結合組織の発達と機能、リンパ組織の構造と発達ネットワーク（図１Ａ）はＣＳＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、及びＬＴＡの顕著な抑制を示した。
（４）ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）処理後、ＭＡＰＫ Ｅｒｋ１／２の活性によるＴＬＲ２／ＴＬＲ４の活性化、及びＦＧＦ、ＦＧＦ６、－４、－７、ＩＬ－１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ及びＣＳＦの活性化に関するネットワーク（図１Ｂ）が抑制された。
（５）ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）でプライム化されたＭＳＣは、ＩＬ－１βの産生を増加させ、ＣＣＲ－８リガンドの活性化を誘導した。ＣＣＲ－８は、免疫抑制の送達に関与するＦｏｘｐ３（＋）Ｔ－調節性細胞がＣＤ４（＋）メモリ細胞中に濃縮されたことを確認するためのバイオマーカーである。
また、ダウンレギュレートされた経路は以下のとおりである。
（１）乾癬において機能するシグナル伝達経路、
（２）アテローム性動脈硬化において機能するシグナル伝達経路、及び
（３）関節炎シグナル伝達経路（ＩＬ－１８が１１倍、ＣＸＣＬ５が１．７倍、及び、ＣＸＣＬ１が５倍ダウンレギュレートされた。）。
したがって、驚くべきことに、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）でのＭＳＣプライム化は、異常に上昇したＩＮＦ－γ関連経路をインビトロ及びインビボで制御し、且つＳＬＥなどの、インターフェロンで調節される自己免疫疾患活動性を制御することができることを発見した。
＜Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）暴露後のＭＳＣ細胞選別実験＞
細胞選別実験には、ヒトＭＳＣ培養物（骨髄単離後には混合集団であると考えられる）のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）暴露により、ＣＤ１４６＋／周皮細胞様ＭＳＣ表現型が有意に増加されたことを示した。我々の観察結果に基づいて、驚くべきことに、ｈＭＳＣは、特定の危険シグナル（例えば、損傷した組織に見られる炎症性サイトカイン）に暴露されると、インビトロでその表面マーカーの構成が変化し、周皮細胞表現型を獲得できることを発見した。
ＭＳＣ混合培養物中の周皮細胞様ＭＳＣは、有効で重要な免疫調節活性を有する。
ＭＳＣの未分画サンプルに含まれる周皮細胞（ＣＤ１４６＋及びＬｅｐ－Ｒ＋細胞表面受容体と定義される）のパーセンテージと、免疫調節作用をインビトロで誘導するために使用される刺激との間に直接的な関係があることを証明する証拠がある。ＭＳＣをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）で刺激したところ、刺激されていないＭＳＣに比べて、ＣＤ１４６＋－ＭＳＣのパーセンテージが有意に増加した。逆に、ＭＳＣをＬＰＳで刺激したところ、ＣＤ１４６＋－ＭＳＣの減少を示した（図２）。
ＨＸＢ－３１９の開発
＜細胞培養＞
本発明者らは、ＨＸＢ－３１９を、従来の臨床試験で一般的に使用されているプライム化されていない初代骨髄由来ＭＳＣと比較することにより、ＨＸＢ－３１９の免疫刺激作用を検証した。
＜ヒト間葉系幹細胞培養物の調製＞
ＨＸＢ－３１９の開発に使用されたｈＭＳＣは、自身のプロトコール（０９－９０－１９５）に基づいて独立管理事業体として設立された造血幹細胞機構から取得された。Ｃａｓｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）では、現在承認されているＩＲＢプロトコール＃０９－９０－１９５に従って、健常者ドナーから骨髄を採取した。ＨＩＰＡＡ規則４５ＣＦＲ§１６４．５１４（ｂ）（２）（ｉ）の実施細則に記載されるように、サンプルは、匿名化されている。本発明者らは、インビトロで５つのドナーＭＳＣを用いて、マウスで実験を行った。
健康ドナー（２１８３細胞系）から得られたヒト骨髄由来の多分化能間質細胞（間葉系幹細胞－ＭＳＣ）をＢｉｏＳｐｈｅｒｉｘ（無菌条件環境、３７℃、湿潤雰囲気、５％ＣＯ２）においてＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ無血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて対数増殖期で培養した。実験では、細胞を飢餓状態にしてＳｔｅｍＰｒｏ基礎培地で４８時間維持した後、摂動基質で処理した。
＜ＲＮＡ抽出及びＰＣＲ分析＞
製造者の取扱書により、ＭａｇＭａｘ ＲＮＡ分離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトータル細胞ｍＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐを用いて２６０／２８０ｎｍでの吸収を測定することにより、採取されたＲＮＡの品質と量を評価した。その後、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡに転写して遺伝子発現解析を行った。５３個の候補遺伝子と３個のハウスキーピング遺伝子を利用して、特注されたオープンアレイ遺伝子チップを構築した。Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉマスターミックスを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行った。転写物の相対発現（ＲＱ）は、２ΔΔＣＴ法を用いて算出された。
＜薬物基質及び実験設計（ＤＯＥ）に基づくプロセス計画＞
Ｄ－最適実験計画はソフトウェア（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ ＭＯＤＤＥ）で生成され、９６ウェルフォーマットによりＦｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ１５０液体処理ロボット（ＴＥＣＡＮ，ＣＨ）上で実行された。
本発明者らは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－α、ＰＤＧＦ－ＢＢ、アスコルビン酸２－リン酸、内皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ－β、ビタミンＤ３という１２種類の因子を選択した。その後、本発明者らは９６回の運行計画、テストアプリケーションを使用して同時テストを準備した。人工的な予備拡大培養と接種に加えてロボット操作も含む完全な細胞培養は、細胞培養条件のプロセス解析技術（ＰＡＴ）（％Ｎ２、％Ｏ２、％ＣＯ２、及び温度制御を提供）を提供するモジュラーＸ－Ｖｉｖｏシステム（Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ、ＮＹ、ＵＳＡ）に包含されている。各実験条件について、Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙ技術（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ＦＬＥＸ１２）を用いて合計５３個のカスタム遺伝子発現データを得た。ＭＯＤＤＥソフトウェアに含まれるＱＰＣＲデータを使用して培養空間の数学的モデリングを行い、前記ＭＯＤＤＥソフトウェアは、分散の最小化とモデルフィッティングのための多変量ツールを使用していた。この過程は、主要な効果及び反応パラメータを同定し、また、ＭＳＣの抗炎症サイトカイン又は血管周皮細胞様遺伝子の発現などの、目標とする遺伝子の増幅のクエリ最適化を可能にした。このプロセスの実施により、本発明者らは、ＩＤＯ、ＣＤ２７４、ＣＤ１４６及びＰＤＧＦＲＢの発現を最大化し、且つＣＸ３ＣＬ１及びＰＤＬ１の発現を最小化する６成分の組み合わせ条件を確定した。
Ｔｒａｉｌｈｅａｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）により一連の複雑な多次元分析を行い、実行した経路分析実験に関与し、且つインターフェロン活性化シグナル伝達経路に重要な役割を有すると発見された遺伝子に基づいて５３個の候補遺伝子標的を分析した。上記５３個の候補遺伝子標的は、ＡＮＧ、ＢＣＬ２、Ｃ３ＡＲ１、Ｃ５ＡＲ１、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＤ２７４、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＳＦ２、ＣＳＰＧ４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＲ４、ＥＮＧ、ＥＮＴＰＤ１、ＨＳＰＡ５、ＩＤＯ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＲＦ３、ＬＡＭＡ４、ＬＥＰＲ、ＬＩＦ、ＭＣＡＭ、ＮＥＳ、ＮＧＦＲ、ＮＴ５Ｅ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＰＢＰ、ＰＴＧＳ１、ＰＴＧＳ２、ＲＧＳ５、ＳＥＭＡ３Ａ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＹ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＴＮＦＡＩＰ６及びＶＥＧＦＡであった。健康ドナーＭＳＣ系由来の骨髄由来間葉系幹細胞において、３種のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＹＷＨＡＺ、ＴＢＰ）に対して下記のサイトカイン及びそれらの濃度で、これらの遺伝子複合体の発現レベルを標準化した：ＴＮＦ－α（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦ－ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮ－γ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１７Ａ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸２リン酸エステル（２００ｕＭ）、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（１μｇ／ｍｌ）、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、及びビタミンＤ３（１０ｎｇ／ｍｌ）。
ＤｏＥ法を用いて、異なる組み合わせと濃度の１２種類のエフェクターを同時に考査する９６種の条件からなる複雑な多次元実験を設計した。健康ドナーから得られた骨髄由来ＭＳＣを９６ウェルプレート（１２，０００細胞／ウェル）に接種し、薬物基質処理から６、１２、１８、２４時間後にｑＰＣＲによる分析を行い、その結果をＭｏｄｄｅソフトウェアプラットフォームに出力してさらに分析した。これにより、５０００以上のデータポイントが生成された。それぞれの反応を統計的回帰モデルにフィッティングし、異なる摂動が遺伝子発現にどのように影響するかを分析した。次に、本発明者らは、ＩＤＯ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＬＥＰＲ、ＩＬ－１０、ＭＣＡＭ（ＣＤ１４６）、ＣＤ２７４（ＰＤＬ－１）の遺伝子発現を最大化し、且つＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカイン活性）を最小化するための最適化条件を抽出した。得られたＭＳＣ集団は、ＭＳＣに特徴的なサイトカインを高レベルで発現したため、それらが異なる細胞種に分化していないことを確保した。上記ＭＳＣに特徴的なサイトカインは、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＮＦＡＩＰ６、及びＣＤ１４６であった。過給後のＭＳＣ集団は、ＴＬＲ－３及びＴＬＲ－４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＧＭＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ３及びＥＮＧをより高いレベルで発現した（表１）。
Figure 2022539249000001
＜市販の骨髄由来ＭＳＣ（例えば、Ｒｏｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）；及び異なる骨髄ドナー）を用いたプライム化技術の検証＞
本発明者らは、上記と同様の方法を用いて、異なる由来の細胞についてプライム化方法を試験した。同じロボット細胞培養技術を用いて、同じ培養条件とプライム化技術（すなわち、ＨＸＢ－３１９）を用いて細胞を培養した。本発明者らは、効能テストとして、ＩＤＯ遺伝子の発現倍数の差異を研究した。本発明者らは、プライム化期間中の複数の時点（６時間、１２時間、１８時間及び２４時間）でＭＳＣからＲＮＡを採取、単離し、３つの非関連性プライム化ＭＳＣ源（番号２１８３、１４２７の健康ドナー、第３継代細胞；及び継代数が未知のＲｏｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ細胞製品）において最大ＩＤＯ遺伝子発現を観察した。条件１はＨＸＢ－３１９条件を表し、条件２は対照条件である（図３）。プライム化ＭＳＣにおけるＩＤＯ遺伝子の発現は、３つの異なる健康ドナー細胞系からのすべてのＭＳＣ源において、一致する倍数増加が確認された（図３）。
以上の実験結果に基づき、驚くべきことに、以下の配合を有するＨＸＢ－３１９を用いて、ＭＳＣを誘導又はプライム化してＩ型及びＩＩ型インターフェロン経路の誘導（例えば自己免疫によるもの）後に抗炎症表現型を得、これによって免疫細胞活性を特異的に調節し、免疫細胞機能障害を改善することが可能であることを見出した：
（１）インターフェロン－γ、１００ｎｇ／ｍｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＢＭＳ３０３））；
（２）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、１μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｒｉｃｈ（９５８２－５ｍｇ）；
（３）腫瘍壊死因子－α、２０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（３００－０１Ａ－５０μｇ））；
（４）インターロイキン１－β、１０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（２００－０１Ｂ－１０μｇ））；
（５）インターロイキン－１７－α、５０ｎｇ／ｍｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（２００－１７））；及び
（６）ＡＳＣ－ＡＣ－２１、２００μＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｒｉｃｈ（Ｌ４５２４－５ＭＧ））。
インビトロ及びインビボ検証実験
＜組織培地におけるインビトロ骨髄ドナーｈＭＳＣ ＩＤＯ遺伝子発現及びキヌレニン酵素活性＞
第３継代以降のＭＳＣを組織培養瓶にトリプリケートで接種した。コンフルエント状態になる後、本発明者らは、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを除去し、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、ＨＸＢ－３１９で１８時間処理した。次に、ＨＸＢ－３１９を洗浄し、無血清ＤＭＥＭを培養プレートに添加し、標準インキュベータにおいてインキュベートした。２４時間後、ＭＳＣを採取し、ＲＮＡを単離した後に、組織培地を採取し、分泌産物を測定した。ここで示される結果は、いずれも少なくとも３つの異なるＭＳＣドナーを使用して重複された。
ＲＴ－ＰＣＲ結果により、未処理のＭＳＣと比較して、ＩＤＯ発現が５０，０００倍上昇し、ＩＤＯ測定ではキヌレニン量（ｍｃｇ／ｍｌ）により測定したＩＤＯ酵素活性が有意に向上したことを示した（図４）。さらに、ＰＤＧＦＢＰやＣＤ１４６などの血管周囲ＭＳＣマーカーは顕著にアップレギュレートされた（図５）。
＜プリスタン誘導されたインターフェロン活性化マウスモデルにおけるＨＸＢ－３１９の有効性＞
概念を証明するために、本発明者らは、実証且つ承認されたマウスモデルを使用し、当該マウスモデルに対して、０．５ｃｃのテトラメチルペンタデカン（プリスタン）を腹腔内に注射した後、４週間にわたってＩ型インターフェロン活性化が誘導された（Ｆｒｅｉｔａｓ，Ｅ．Ｃ．ら，Ｃｌｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２０１７．３６（１１）：ｐ．２４０３－２４１４；Ｇａｒｄｅｔ，Ａ．ら，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１６．１１（１０）：ｐ．ｅ０１６４４２３；及び、Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｈ．Ｂ．ら，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００１．６０（６）：ｐ．２１７３－８０）。
本発明者らは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから１２～１４週齢のＢＡＬＢＣ／ｃｊ雌マウスを取得し、そして、年齢・性別が一致する５７ＢＬ／６マウスを対照群として取得した。本発明者らは２組のマウスを用いて２つの実験を行った。
本発明者らは、プリスタンが注射されたマウスが、インターフェロン活性化の急性期、及びその後のＳＬＥを模擬した自己免疫疾患の活動の慢性期において、ＨＸＢ－３１９に対してどのように反応するかを試験した。Ｉ型インターフェロン活性化は、０．５ｃｃのプリスタンを腹腔内に注射してから４週間にわたって誘導された。その後、インターフェロン応答遺伝子（ＩＲＧ）が活性化され、さらなるインターフェロン活性化から構成される免疫応答プロファイルが大体生成されることが期待された。活性化の経路は、Ｉ型ＩＦＮ－αと－β、ＩＩ型ＩＦＮ－γ、炎症性サイトカインの上昇、ＩＬ－６とＩＬ－１２であった。要するに、上記により、先天免疫系レスポンダー、すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋）及びＮＫ細胞の減耗を引き起こす。
第１群の動物（ＢＡＬＢＣ／ｊマウス１６匹、Ｃ５７ＢＬ／６マウス１１匹）は急性実験に用いられた。本発明者らは、プリスタン注射から約４週間後に、未処理マウスと異なり、これらのマウスをＭＳＣ又はＨＸＢ－３１９ＭＳＣで処理した。処理から１週間後、本発明者らは、急性実験における腹腔洗浄液中の細胞レパートリーを評価した。
簡単に言えば、０日目：Ｉ型ＩＦＮ活性化を誘導するためにプリスタンを注射した；２８日目：ＭＳＣ又はプライム化ＭＳＣ（１×１０６）を４週間内に注射した；３５日目：ＭＳＣ注射から１週間後、すべてのマウスから腹腔洗浄液と末梢血を採取した。
別の１群の動物群２（ＢＡＬＢｃ／ｊ雌６７匹、Ｃ５７ＢＬ／６ ２０匹）は、同じ時点で注射したが、２７０日間（約９ヶ月）後に処分し、プリスタンモデルの慢性的な効果及びＨＸＢ－３１９処理の結果を獲得した。本発明者らは、尿、血液、腹腔洗浄液、及び、腎臓、肝臓、肺、心臓、リンパ節及び脾臓からの組織を採取した。また、脾臓から脾臓細胞を単離し、細胞選別実験も行った。
我々の急性プリスタン注射マウスモデルの研究では、驚くべきことに、目前のヒト臨床試験中に他の群で使用されている、非プライム化ＭＳＣとは異なり、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、ループスマウスモデルにおいて、インターフェロン活性化により調節される炎症を安全、有意に有効、且つ強力に改善可能であることが示された。
＜腹腔洗浄液の細胞選別＞
本発明者らは、腹腔洗浄液を分離し、赤血球を遠心分離して溶解し、４％ｐｆａで固定化した。次に、本発明者らは、２つの独立したチューブに３×１０７個の細胞（樹状細胞ｖｓリンパ球パネル）を等分してフローに使用した（表２参照）。
Figure 2022539249000002
プリスタン誘導マウスモデルにおいて、インターフェロン関連炎症性活性のため、腹腔洗浄液の細胞傷害性Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４－ＣＤ８＋）は正常ＷＴよりも低くなった。驚くべきことに、本発明のプライム化ＭＳＣは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋）の不足を修正しただけでなく、それらの数を７倍（Ｆ＝１０３．８，ｐ＝０．００３）までにアップレギュレートしており、多変量解析によって、非プライム化ＭＳＣ（Ｆ＝３．９，ｐ＝０．１１）と比較して顕著な効果を示した。さらに、Ｔｈ１細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）の数は、多くても４倍まで有意にアップレギュレートされた（ｐ＜０．０５）。これらのデータは、本発明のＨＸＢ－３１９（プライム化ＭＳＣ）治療から１週間後に収集された。さらに、驚くべきことに、インビトロ研究では、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、現在臨床試験中のＭＳＣと比較して５０，０００倍以上のインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を発現することが示された。
ＨＸＢ－３１９によるＭＳＣプライム化は、特定の標的シグナル伝達経路において先天性及び適応性免疫系細胞傷害性細胞を増殖、活性化、及び調節することを証明できる、インビトロ及びインビボの証拠を示している。
Ｔ細胞：ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＰＤ－Ｌ１＋、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋＆ＣＤ２５＋ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞；すべてのＣＤ２５＋細胞は、インビボ細胞選別実験により、同じ細胞のＩＬ－２刺激よりも有意に増殖した（図６）。また、インビトロ実験では、調節能力及び抑制能力を有するＴ細胞サブセット中で、ＣＤ－２５＋が発現されたことが示された。ＣＴＬＡ－４＋Ｔ細胞もインビボ及びインビトロで増殖されており、抗炎症性共刺激性分子である。
細胞表面受容体の発現から、これらの細胞は機能的に活性化されていることがわかった。ＨＸＢ－３１９と共培養したＰＢＭＣでは、ＣＤ－６９＋の発現が著しく高くなり、免疫細胞の活性化が示唆された。ＣＤ６９は、常在性メモリＴ（ＴＲＭ）細胞及びγδＴ細胞などの組織常在性免疫細胞の複数のサブセットで発現されたため、組織保持のマーカーと認識される。ＣＤ６９は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の分化、及びＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２の分泌を調節するものである（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７．４７：９４６－９５３）。ＣＤ５６＋は、ＩＬ－２のないＨＸＢ－３１９共培養環境でも、Ｔ細胞において発現され、活性化が著しく向上された。ＣＤ５６＋Ｔ細胞は、ＣＤ５６－Ｔ細胞と比較して、あまり強く増殖しないが、増強された天然の細胞毒性を示している。ＣＤ５６＋Ｔ細胞は、ＴＣＲ刺激後に、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）及びインターロイキン－１３（ＩＬ－１３）を放出したが、ＩＬ－１０を放出しなかった。向上したＣＤ５６＋Ｔ細胞の割合は、活性化から数時間内にＩＦＮ－γ、ＩＬ－４及びＩＬ－１３を発現した。ＣＤ５６＋Ｔ細胞は、これらの細胞溶解活性及びサイトカイン分泌活性を獲得したため、免疫媒介性疾患に対する免疫療法の潜在的な候補となっている。
ＮＫ細胞：ＨＸＢ－３１９処理の場合、ＣＤ２５＋ＮＫ細胞は、マウス中で数量が著しく増加しており、この点について、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４などのＮＫ細胞の細胞表面マーカーによりインビトロ証明された。図７Ａ－Ｂは、ＨＸＢ－３１９及びその３成分誘導体（以下の実施例２ではＨＸＢ－３１９－３とも称する）に暴露した後のＰＢＭＣに対して行った細胞選別実験の結果を示している（図７Ａにおける符号は、以下のように示している。ＢはＨＸＢ－３１９、ＣはＨＸＢ－３１９－３、及びＤは２×ＨＸＢ－３１９－３である）。ＣＤ－５６はＮＫ細胞のプロトタイプマーカーであり、ＮＫ細胞はＨＸＢ－３１９処理後も顕著に増殖された。図７Ｂは、ＨＸＢ－３１９及びＭＳＣ処理から９ヶ月後に腹腔洗浄液ＮＫ細胞のパーセンテージを示しており、ＨＸＢ－３１９の用量効果及びＨＸＢ－３１９の持続可能な効果を示している。
Ｔｒｅｇｓ：制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）は、Ｔ細胞の特殊なサブ集団であり、免疫応答を抑制する作用を発揮しており、これによってホメオスタシスと自己免疫寛容性を維持する。ＴｒｅｇはＴ細胞増殖とサイトカイン産生を阻害することができ、自己免疫の防止に重要な役割を果たすことを示している。驚くべきことに、ＨＸＢ－３１９（図８ＡのＯＨＡ）処理後のインビボ実験ではＣＤ４＋Ｔｒｅｇは有意に増加した。
Ｔｈ１７細胞（ＲＯＲｇＴ＋）：Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ－１７及びその他の炎症性サイトカインの高分泌により確認されるＴヘルパーリンパ球の特定サブセットである。
驚くべきことに、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、Ｔｈ１７細胞の活性化を制御し、Ｔｈ１７細胞の増殖を有意に抑制しており、上記結果は、ＨＸＢ－３１９（１×１０６個の細胞）を一回に限り注射してから９か月後までＴｈ１７細胞に対する持続可能な免疫系の調節により証明された（図８Ｂ）。
脾臓細胞におけるＴｈ１７発現：群１：ｐ＜０．０１１、Ｆ＝５．０、ＨＸＢ－３１９、１００万のＣＤ８＋ＲＯＲＧＴ＋細胞（Ｔｈ１７細胞）は、健常対照より有意に低く、プリスタン－ＳＬＥマウスよりも数値的に低く、ｐ＜０．０６であった（３．３３未処理ＳＬＥ対照の平均値、ＨＸＢ－３１９では１．３２、変動係数が高い）。一方、慢性実験では、群２：ｐ＜０．０１８、ｆ＝３．８４、ＨＸＢ－３１９、１００万注射アームのＣＤ８＋ＲＯＲＧＴ＋細胞は、プリスタン対照より有意に高くなかった。
形質細胞様樹状細胞ｐＤＣ：ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣのインターフェロン活性化をインビボモデルで試験し、脾臓ｐＤＣの増殖／活性化を抑制することを示した。本発明者らは、骨髄系樹状細胞ｍＤＣについて類似した結果を観察した（表３：慢性モデル群２のＭＳＣ及びＨＸＢ－３１９処理から９カ月後の脾臓細胞選別結果及びその有意性）。
Figure 2022539249000003
形質細胞様樹状細胞はＩ型ＩＦＮの主要な生産者であり、抗原提示を介してＴ細胞応答に直接影響を与え、ＰＤＣＡ－１＋の存在で表される。
ＰＤＣＡ－１は、分子量２９－３３ｋＤのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。主にナイーブ型マウスのＩ型ＩＦＮ産生細胞（ＩＰＣ）で発現されるが、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮｓ－γによる刺激後、ほとんどの細胞種でアップレギュレートされる。終末分化した正常形質細胞様樹状細胞に高度に発現される。
驚くべきことに、プリスタンモデルを２．５×１０６個のプライム化ＭＳＣ（ＨＸＢ－３１９）で処理した場合、通常のＭＳＣ（プライム化されていないもの）１００万個とＨＸＢ－３１９ １００万個で処理した場合に比べて、ＰＤＣＡ－１＋脾細胞と腹腔腔細胞の頻度が著しく低下することがわかった（表３、図９）。ＰＤＣＡ－１＋は形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の細胞マーカーでもあるが、Ｂ細胞にも見られる。主にＩ型ＩＦＮ産生細胞（ＩＰＣｓ）で発現するが、Ｉ型ＩＦＮ及びＩＦＮｓ－γで刺激した後、ほとんどの細胞型でアップレギュレートされる。
ＰＤ－Ｌ１＋細胞（図１０）：ＰＤ－Ｌ１はエフェクターＴ細胞に発現したＰＤ－１と結合し、アポトーシス又は無反応性を誘導することにより自己免疫疾患を予防することにより、免疫調節において重要な役割を果たす。この分子は正常な免疫防御のバランスが必要なチェックポイント分子である。そのレベルは炎症の間低く、自己免疫疾患の治療中に正常化又は増加していることが望ましい。ＰＤ－Ｌ１はＣＤ２７４であることが知られており、抗炎症マーカーと考えられているＨＸＢ－３１９は腹腔洗浄液中のＰＤ－Ｌ１発現細胞率及び脾臓細胞率のカウントに積極的に作用しており（図１０）、抗炎症作用の証拠が示されている。しかし、このレベルは高すぎず、第１群の急性実験では、野生型の未処理マウスと、プリスタン誘導ＨＸＢ－３１９処理マウスの腕の間でＰＤ－Ｌ１レベルには統計的な差はなかった。
群１（急性試験、プリスタン誘導後４週間の細胞処理後１週間）のＣＤ４＋ＰＤＬ１＋細胞はＡＮＯＶＡを用いて差を示し、未処理のＭＳＣは健常対照よりも高い数を示し、ＯＨＡ×１００万（ＨＸＢ－３１９）の１回処理の方が、数量が高かった。
第２群のＣＤ４＋ＰＤＬ１＋細胞（慢性実験、プリスタン誘導後４週間の細胞処理後９カ月）は、ＡＮＯＶＡを用いた差を示し、ＯＨＡ処理ＭＳＣ×１（ＨＸＢ－３１９）×１００万は健康対照より有意に高く、数値的にもＳＬＥ対照マウス（プリスタン偽手術）より高かった（ｐ＜０．０３０、Ｆ＝３．３３）。
＜血清インターフェロンレベル＞
急性プリスタンマウスモデルにおいて、プリスタン誘導マウスのＨＸＢ－３１９（２×１０６個の細胞）でプライム化されたＭＳＣによる１回処理は、驚くべきことに、血清中のＩＦＮ－α（ｐ＜０．０５）とＩＦＮ－γ（ｐ＜０．００１）の全身レベルを阻害した（図１１）。
慢性プリスタンマウスモデルにおいて、プリスタン誘導マウスのＨＸＢ－３１９（１×又は２×１０６個の細胞）でプライム化されたＭＳＣによる１回処理は、驚くべきことに、ＩＦＮ－α（ｐ＜０．０５）及びＩＦＮ－γ（ｐ＜０．００１）の持続的阻害の全身レベルを示した（図１２）。
さらに、驚くべきことに、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣ処理により、急性又は慢性のプリスタン誘導炎症性疾患において、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ経路が活性化する炎症を阻害することに成功したことを見出し、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン活性化経路が制御されている証拠を示した。さらに、ＨＸＢ－３１９の治療後に炎症性サイトカインの量が顕著に改善された。
＜プリスタン慢性感染モデルにおける血清サイトカインのレベルを低下させる検討＞
ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６などのサイトカインは、通常の非プライム化ＭＳＣ処理後に上昇したが、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは炎症性サイトカインの有意な上昇を示さないため、サイトカインストームの増加には問題がなかった（図１３）。図１３－１４では、これらのサイトカインを、非プライム化ＭＳＣとＨＸＢ－３１９プライム化ＭＳＣで処理した１週間後に、プリスタン誘導マウスの血清中で調べた。
＜血清ＩＬ－１７レベル＞
また、マウス血清中のＩＬ－１７Ａの血清レベルは、プリスタン注射から２７０日後にも調べられ、驚くべきことに、非プライム化ＭＳＣとＨＸＢ－３１９（図１５ではＯＨＡ）でプライム化されたＭＳＣで処理したところ、ＨＸＢ－３１９で処理すると、用量依存的にサイトカインのレベルが有意に低下することが示された。
＜二本鎖ＤＮＡの力価変化＞
二本鎖ＤＮＡは、腎炎のマーカーであり、ＳＬＥ腎炎の臨床的改善を表す。ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣ処理は、より高い用量でこのマーカーの顕著な制御を示す。効果は、Ｘ２を使用した後、又はマウス１匹あたり２５０万を超える用量で顕著であった（図１６）。
＜血清ＢＡＦＦ＞
また、慢性試験群においてＢＡＦＦの血清レベルを測定した（図１７）。その結果、Ｂ細胞の活性化を活性化、刺激する分子であり、ＳＬＥにおける主要な治療標的の１つと考えられているＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣを用いてＢＡＦＦレベルを低下させたことが示された。ベリキシマブ（ＦＤＡにより最近承認された薬物）も、Ｂ細胞活性化因子ＢＬｙＳに影響を与えた。
＜ＢＡＬＢ／ｃｊプリスタンの慢性注射実験の病理学的評価及びスコアリング＞
本発明者らは、マウスから取り出した全ての臓器を１０％のＰＢＳを含むホルマリンに固定化した。すべての腎臓生検についてＨ、Ｅ及びＰＡＳ染色を行い、本発明者らは腎臓病理学の独立病理学専門家を雇った（図１８－１９）。先に公表された腎臓病理学スコアは、炎症性細胞と硬化症の数値評価に用いられている（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００９年９月；７６（５）：５３４－４５，Ｅｐｕｂ２００９年７月１日）。驚くべきことに、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、原始的に誘導されたＢａｌｂＣＪヒトＳＬＥマウスモデルにおける糸球体硬化及び全体的な瘢痕形成を改善し、また、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、原始的に誘導されたＢＡＬＢｃｊヒトＳＬＥマウスモデルに見られる皮膚炎を改善することを見出した。
要するに、実施例１で概説した実験により、驚くべきことは、次のことを見出した：
（１）原始的に誘導されたＢＡＬＢｃｊインターフェロン活性化急性モデル及び慢性プリスタン誘導ヒトＳＬＥマウスモデルにおいて、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣによりインターフェロン活性化の血清学的及び細胞学的徴候を改善すること；
（２）ＨＸＢ－３１９－３でプライム化されたＭＳＣはＩＤＯ遺伝子発現よりも有効であり、ＮＫ細胞増幅においても有効であり、インビトロ組織培養ではＨＸＢ－３１９でＭＳＣをプライム化した後、ＩＬ－６及びＩＬ－８の同量の上昇がなかった。したがって、ＨＸＢ－３１９－３でプライム化されたＭＳＣは、多くの自己免疫疾患で観察される重篤な合併症であり、ＳＬＥ活動性疾患を含む、免疫活性化が制御できないマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）でサイトカインストームが観察された場合に使用することができること；
（３）ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、原始的に誘導されたＢＡＬＢｃｊヒトＳＬＥマウスモデルにおける糸球体硬化及び全体的な瘢痕形成を改良し、したがって進行したＳＬＥ腎炎を予防すること；
（４）ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、原始的に誘導されたＢＡＬＢｃｊヒトＳＬＥマウスモデルで観察された皮膚炎を改善し、したがってＳＬＥの皮膚所見を予防すること；
（５）ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、インターフェロン活性化が存在する場合、ＮＫ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増幅及び活性を改善すること；及び
（６）ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣ、又はＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣから単離されたＣＣＭ（ＭＳＣの分泌物及びエクソソームを含む）は、ＣＡＲ－Ｔ及びＣＡＲ－ＮＫ細胞に暴露されると、それらの増幅及び細胞傷害活性を誘導し、それによって効能及び患者の結果の改善に寄与する。ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ、及びさらに設計された変異体、遺伝的変異体、分泌産物、及びエクソソームのような細胞療法製品は、その効力及び寿命を改善するために、ＨＸＢ－３１９によってプライム化されることができる。キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）又はＣＡＲ－ナチュラルキラー細胞は免疫療法であり、化学療法にとって難治性の血液悪性腫瘍に罹患している一部の患者で緩和を誘導することが示されている。ＨＸＢ－３１９は、ＣＡＲ－Ｔ及びＣＡＲ－ＮＫ細胞の抗炎症効果を高めることにより、ＣＡＲ－Ｔ／ＣＡＲ－ＮＫ療法の効果を改善し、患者の治療結果を改善することができる。
実施例２
様々な自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥ、乾燥症、全身性強皮症、移植片対宿主病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬様関節炎）におけるＩ型及びＩＩ型インターフェロン経路の活性化により誘導される炎症性活性を制御するために、実施例２では「ＨＸＢ－３１９－３」と称されるＭＳＣプライム化培地を開発するための実験が行われた。実施例２で使用される用語「ＨＸＢ－３１９－３」はまた、実施例２で発見されたＭＳＣプライム化培地で処理又はプライム化されたＭＳＣを意味することができる。
本発明者らは、実施例１に記載された実験と同様に、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＰＤＧＦＲ、ＭＣＡＭ（ＣＤ１４６）及びＣＤ２７４（ＰＤＬ－１）の遺伝子発現を最大化し、ＣＸ３ＣＬ１（ケモカイン）の発現を最小化するために、異なるサブセットのプライム化培地を（ＨＸＢ－３１９と比較して）試験した。実施例１のように、本発明者らは、ＩＤＯの発現及び活性を最初に評価した。ＡＳＣ－ＡＣ－２１、２００μＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｒｉｃｈ（Ｌ４５２４－５ＭＧ））を全研究群の無血清ＤＭＥＭに加えた。試験された培地成分の異なる組み合わせは図２０Ａ－Ｂに示されている。
本発明者らは、以下の遺伝子（ＣＴＬＡ４、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＡＫＴ、ＩＬ－１７、ＴＬＲ４、ＴＬＲ－７、ＣＸ３ＣＲ３、及びＰＤＧＦ－Ｒ）を用いて、少なくとも５つの異なる骨髄ドナーから単離されたＭＳＣを用いて、ＩＤＯ酵素アッセイ及びＲＴ－ＰＣＲを利用して、ＨＸＢ－３１９－３のインビボ効力を評価した。実施例１で説明したようにＭＳＣを成長、増幅し、ＩＦＮ－γ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１μｇ／ｍｌ）及びＴＮＦ－α（２０ｎｇ／ｍｌ）（総称して「ＨＸＢ－３１９－３」）の４成分を含有する無血清培地で１８時間処理した。１８時間終了時に細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＲＮＡ単離Ｑｉａｇｅｎキットを用いてＲＮＡを単離した。その後、ＲＴ－ＰＣＲを２回繰り返して行い、同時に処理した２組の細胞を無血清培地にて２４時間保持し、ＭＳＣの分泌物をＥＬＩＺＡ用に採取した。キヌレニン活性（ＩＤＯ）における２つのドナーのＭＳＣ応答の結果を図２０Ａ－Ｂに示す。驚くべきことに、ＨＸＢ－３１９－３が最も強力な抗炎症作用と、インビトロにおける抗炎症遺伝子の発現に類似した作用を有することが明らかになった。
本発明者らはまた、、遺伝子標的発現がＨＸＢ－３１９治療群で発現される遺伝子標的発現と類似しているか、又はそれ以上であることを検証するために、研究群で未処理ＭＳＣ：１５（ＨＸＢ－３１９）；１１（ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ）；１２（ＴＮＦ－α＋ＩＮＦ－γ＋ＩＬ－１β）；１４（ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）に対してＲＴ－ＰＣＲを実施した。本発明者らは特に、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＰＤＧＲＦ及びＣＤ２７４（ＰＤＬ－１）と最小化ＣＸ３ＣＬ１との組み合わせに着目した（図２１Ａ－２３）。
本発明者らは、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＰｏｌｙＩ：Ｃの３つの培地成分（ＨＸＢ－３１９－３）が、ＨＸＢ－３１９と同様の抗炎症結果及び遺伝子発現を示すことを見出した後、さらに実験を行った。ＨＸＢ－３１９－３で処理したＭＳＣを用いた場合、ＩＬ－６及びＩＬ－８炎症性サイトカインを上昇させなかった。次に、本発明者らは、ＨＸＢ－３１９－３のインビトロでの用量効果を実証した。本発明者らは、ＩＤＯ測定とＲＴ－ＰＣＲを行った（図２４－２６）。
本開示は、本明細書で提供される特許請求の範囲及び書類によってさらに説明される。
本開示の好ましい実施例を参照して本開示を具体的に示し、説明したが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によってカバーされる本開示の範囲を逸脱することなく、様々な形態及び詳細な変更が可能であることが理解される。前述の明細書において引用されたすべての特許、出版物及び参照文献は、引用により全体として本明細書に組み込まれている。
いくつかの場合、本開示は、Ｔｈ１７細胞の産生を、非プライム化幹細胞より強く抑制するプライム化幹細胞（例えば、ＭＳＣ）の単離集団（例えば、６成分プライム化培地を用いて得られたもの）を含んでもよい。
ＤｏＥ法を用いて、異なる組み合わせと濃度の１２種類のエフェクターを同時に考査する９６種の条件からなる複雑な多次元実験を設計した。健康ドナーから得られた骨髄由来ＭＳＣを９６ウェルプレート（１２，０００細胞／ウェル）に接種し、薬物基質処理から６、１２、１８、２４時間後にｑＰＣＲによる分析を行い、その結果をＭｏｄｄｅソフトウェアプラットフォームに出力してさらに分析した。これにより、５０００以上のデータポイントが生成された。それぞれの反応を統計的回帰モデルにフィッティングし、異なる摂動が遺伝子発現にどのように影響するかを分析した。次に、本発明者らは、ＩＤＯ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＬＥＰＲ、ＩＬ－１０、ＭＣＡＭ（ＣＤ１４６）、ＣＤ２７４（ＰＤＬ－１）の遺伝子発現を最大化し、且つＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカイン活性）を最小化するための最適化条件を抽出した。得られたＭＳＣ集団は、ＭＳＣに特徴的なサイトカインを高レベルで発現したため、それらが異なる細胞種に分化していないことを確保した。上記ＭＳＣに特徴的なサイトカインは、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＮＦＡＩＰ６、及びＣＤ１４６であった。過給後のＭＳＣ集団は、ＴＬＲ－３及びＴＬＲ－４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＧＭＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ３及びＥＮＧをより高いレベルで発現した（表１）。
Figure 2022539249000035
本発明者らは、腹腔洗浄液を分離し、赤血球を遠心分離して溶解し、４％ｐｆａで固定化した。次に、本発明者らは、２つの独立したチューブに３×１０７個の細胞（樹状細胞ｖｓリンパ球パネル）を等分してフローに使用した（表２参照）。
Figure 2022539249000036
形質細胞様樹状細胞ｐＤＣ：ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣのインターフェロン活性化をインビボモデルで試験し、脾臓ｐＤＣの増殖／活性化を抑制することを示した。本発明者らは、骨髄系樹状細胞ｍＤＣについて類似した結果を観察した（表３：慢性モデル群２のＭＳＣ及びＨＸＢ－３１９処理から９カ月後の脾臓細胞選別結果及びその有意性）。
Figure 2022539249000037
ＰＤ－Ｌ１＋細胞（図１０）：ＰＤ－Ｌ１はエフェクターＴ細胞に発現したＰＤ－１と結合し、アポトーシス又は無反応性を誘導することにより自己免疫疾患を予防することにより、免疫調節において重要な役割を果たす。この分子は正常な免疫防御のバランスが必要なチェックポイント分子である。そのレベルは炎症の間低く、自己免疫疾患の治療中に正常化又は増加していることが望ましい。ＰＤ－Ｌ１はＣＤ２７４であることが知られており、抗炎症マーカーと考えられている。ＨＸＢ－３１９は腹腔洗浄液中のＰＤ－Ｌ１発現細胞率及び脾臓細胞率のカウントに積極的に作用しており（図１０）、抗炎症作用の証拠が示されている。しかし、このレベルは高すぎず、第１群の急性実験では、野生型の未処理マウスと、プリスタン誘導ＨＸＢ－３１９処理マウスの腕の間でＰＤ－Ｌ１レベルには統計的な差はなかった。
本発明者らは、マウスから取り出した全ての臓器を１０％のＰＢＳを含むホルマリンに固定化した。すべての腎臓生検についてＨ、Ｅ及びＰＡＳ染色を行い、本発明者らは腎臓病理学の独立病理学専門家を雇った（図１８－１９）。先に公表された腎臓病理学スコアは、炎症性細胞と硬化症の数値評価に用いられている（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，２００９年９月；７６（５）：５３４－４５，Ｅｐｕｂ２００９年７月１日）。驚くべきことに、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、プリスタン誘導されたＢａｌｂＣＪヒトＳＬＥマウスモデルにおける糸球体硬化及び全体的な瘢痕形成を改善し、また、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、プリスタン誘導されたＢＡＬＢｃｊヒトＳＬＥマウスモデルに見られる皮膚炎を改善することを見出した。
（１）プリスタン誘導されたＢＡＬＢｃｊインターフェロン活性化急性モデル及び慢性プリスタン誘導ヒトＳＬＥマウスモデルにおいて、ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣによりインターフェロン活性化の血清学的及び細胞学的徴候を改善すること；
（３）ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、プリスタン誘導されたＢＡＬＢｃｊヒトＳＬＥマウスモデルにおける糸球体硬化及び全体的な瘢痕形成を改良し、したがって進行したＳＬＥ腎炎を予防すること；
（４）ＨＸＢ－３１９でプライム化されたＭＳＣは、プリスタン誘導されたＢＡＬＢｃｊヒトＳＬＥマウスモデルで観察された皮膚炎を改善し、したがってＳＬＥの皮膚所見を予防すること；

Claims (44)

  1. 非プライム化幹細胞集団から抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するためのプライム化培地であって、
    無血清培地と、
    Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、
    少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含み、
    前記機能性活性化剤及び前記少なくとも２種の炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在し、
    前記抗炎症表現型を有する細胞は、前記非プライム化幹細胞集団と比較して増加した１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌により標識される、プライム化培地。
  2. 前記機能性活性化剤は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）及びインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）からなる群から選択されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドである、請求項１に記載のプライム化培地。
  3. 前記少なくとも２種の炎症性サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１７Ａからなる群から選択される、請求項１に記載のプライム化培地。
  4. 前記幹細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は多分化能間質細胞である、請求項１に記載のプライム化培地。
  5. 前記プライム化培地により、前記ＭＳＣを誘導してＣＤ１４６＋及びＬｅｐ－Ｒ＋の表面発現を獲得する周皮細胞様ＭＳＣに変化させる、請求項４に記載のプライム化培地。
  6. 前記ＭＳＣは、同種他家脂肪組織、骨髄、又は臍帯血に由来する、請求項４に記載のプライム化培地。
  7. 前記ＭＳＣはヒト由来である、請求項４に記載のプライム化培地。
  8. 幹細胞をさらに含む、請求項１に記載のプライム化培地。
  9. 合成培地である、請求項１に記載のプライム化培地。
  10. 抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するためのインビトロ方法であって、
    前記インビトロ方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団を、請求項１に記載のプライム化培地と所定時間接触させることを含み、
    前記抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して増加した１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現により標識される、インビトロ方法。
  11. 請求項１０に記載の方法により産生された、抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団。
  12. 被験者の全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害を治療するための方法であって、
    抗炎症表現型を有する幹細胞を前記被験者に治療有効量で投与することを含み、
    前記幹細胞は、投与前に、請求項１０に記載の方法により産生される、方法。
  13. 前記全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害は、インターフェロン調節性自己免疫疾患である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記インターフェロン調節性自己免疫疾患は、Ｉ型ＩＦＮ介在経路及びＩＩ型ＩＦＮ介在経路の異常活性化により調節され、全身性エリテマトーデス、単一遺伝子性インターフェロノパチー、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、重複症候群（関節リウマチとＳＬＥ及び／又はシェーグレン症候群と）、移植片対宿主病、成人又は若年性特発性乾癬関節炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、その他の筋炎、全身性血管炎、ＣＮＳ血管炎、強皮症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、若年性関節炎、成人スティール病、及び全身性強皮症からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 非プライム化幹細胞集団から、抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するためのプライム化培地であって、
    前記プライム化培地は、
    無血清培地と、
    Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、
    少なくとも４種の炎症性サイトカインと、
    必須ビタミンとを含み、
    前記機能性活性化剤及び前記少なくとも４種の炎症性サイトカインは、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な量で存在し、
    抗炎症表現型を有する前記細胞は、前記非プライム化幹細胞集団と比較して増加した１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現及び／又は分泌により標識される、プライム化培地。
  16. 前記機能性活性化剤は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）及びインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）からなる群から選択されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドである、請求項１５に記載のプライム化培地。
  17. 前記少なくとも４種の炎症性サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１７Ａである、請求項１５に記載のプライム化培地。
  18. 前記幹細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項１５に記載のプライム化培地。
  19. 前記プライム化培地により、前記ＭＳＣが誘導されて周皮細胞様ＭＳＣに変化し、ＣＤ１４６＋及びＬｅｐ－Ｒ＋の表面発現を獲得する、請求項１８に記載のプライム化培地。
  20. 前記ＭＳＣは、同種他家脂肪組織、骨髄、又は臍帯血に由来する、請求項１８に記載のプライム化培地。
  21. 前記ＭＳＣはヒト由来である、請求項１８に記載のプライム化培地。
  22. 幹細胞をさらに含む、請求項１５に記載のプライム化培地。
  23. 合成培地である、請求項１５に記載のプライム化培地。
  24. 抗炎症表現型を有する前記細胞は、非プライム化幹細胞と比較して増加したインドールアミン２，３－デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２７４、ＣＤ１４６、及び血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲＢ）の発現と、減少したＣ－Ｘ３－Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸ３ＣＬ１）の発現とにより標識される、請求項１５に記載のプライム化培地。
  25. ＩＤＯ発現は、非プライム化幹細胞のＩＤＯ発現と比較して、約５０，０００～約１５０，０００倍向上した、請求項２４に記載のプライム化培地。
  26. 前記抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、細胞傷害性Ｔ細胞の産生を少なくとも６倍アップレギュレートする、請求項１５に記載のプライム化培地。
  27. 前記抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、ＴＨ１細胞の産生を少なくとも１２倍アップレギュレートする、請求項１５に記載のプライム化培地。
  28. 前記抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生を少なくとも１２倍アップレギュレートする、請求項１５に記載のプライム化培地。
  29. 前記抗炎症表現型を有する細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の産生を非プライム化幹細胞より高くアップレギュレートする、請求項１５に記載のプライム化培地。
  30. 前記抗炎症表現型を有する細胞は、Ｔｈ１７細胞の産生を非プライム化幹細胞より高く抑制する、請求項１５に記載のプライム化培地。
  31. 前記抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、二本鎖ＤＮＡ自己抗体の産生を抑制する、請求項１５に記載のプライム化培地。
  32. 前記抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）の産生を抑制する、請求項１５に記載のプライム化培地。
  33. 前記抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して、ＩＬ－１７の産生を減少する、請求項１５に記載のプライム化培地。
  34. 抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団を産生するためのインビトロ方法であって、
    前記インビトロ方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞の誘導を促進するのに十分な条件下で、非プライム化幹細胞集団を、請求項１５に記載のプライム化培地と所定時間接触させることを含み、
    前記抗炎症表現型を有する細胞は、非プライム化幹細胞と比較して増加した１つ以上の抗炎症性又は免疫調節性メディエーターの発現により標識される、インビトロ方法。
  35. 請求項３４に記載の方法により産生された、抗炎症表現型を有する単離幹細胞集団。
  36. 被験者の全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害を治療するための方法であって、
    前記方法は、抗炎症表現型を有する幹細胞を前記被験者に治療有効量で投与することを含み、
    前記幹細胞は、投与前に、請求項３４に記載の方法により産生される、方法。
  37. 前記全身性炎症性又は自己炎症性の疾患又は障害は、インターフェロン調節性自己免疫疾患である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記インターフェロン調節性自己免疫疾患は、Ｉ型ＩＦＮ介在経路及びＩＩ型ＩＦＮ介在経路の異常活性化により調節され、全身性エリテマトーデス、単一遺伝子性インターフェロノパチー、混合性結合組織病、シェーグレン症候群、重複症候群（関節リウマチとＳＬＥ及び／又はシェーグレン症候群と）、移植片対宿主病、成人又は若年性特発性乾癬関節炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、その他の筋炎、全身性血管炎、ＣＮＳ血管炎、強皮症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、若年性関節炎、成人スティール病、及び全身性強皮症からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 抗炎症表現型を有する幹細胞の治療有効量を１回の用量として投与し、
    下記（１）～（９）から選択される少なくとも１つの細胞効果が、前記被験者中に少なくとも６ヶ月間持続する、請求項３６に記載の方法。
    （１）ＩＤＯ、ＣＤ２７４、ＣＤ１４６及びＰＤＧＦＲＢの発現の増加、及びＣＸ３ＣＬ１の発現の減少；
    （２）細胞傷害性Ｔ細胞の産生の増加；
    （３）ＴＨ１細胞の産生の増加；
    （４）ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生の増加；
    （５）ＮＫ細胞の産生の増加；
    （６）Ｔｈ１７細胞の産生の抑制；
    （７）二本鎖ＤＮＡの産生の抑制；
    （８）ＢＡＦＦの産生の抑制；及び
    （９）ＩＬ－１７の産生の減少。
  40. 抗炎症表現型を有する細胞が投与された後、血清サイトカインのレベルが上昇していない、請求項３６に記載の方法。
  41. 抗炎症表現型を有する細胞が投与された後、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の血清レベルが上昇していない、請求項４０に記載の方法。
  42. 被験者中の養子免疫療法に用いられる方法であって、
    ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞をプライム化及び拡大培養するのに十分で、且つ、ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の非プライム化集団と比較して前記ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の細胞毒性活性を増加させるのに十分な条件下で、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の非プライム化集団をプライム化培地に所定時間暴露することと、
    養子免疫療法を必要とする被験者に、前記プライム化されたＣＡＲ－Ｔ細胞及び／又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を治療有効量で投与することとを含む、方法。
  43. 前記プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも２種の炎症性サイトカインとを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記プライム化培地は、無血清培地と、Ｉ型ＩＦＮ経路及びＩＩ型ＩＦＮ経路の機能性活性化剤と、少なくとも４種の炎症性サイトカインと、必須ビタミンとを含む、請求項４２に記載の方法。
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