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JP2022535708A - 核酸、薬物組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 - Google Patents

核酸、薬物組成物及び複合体ならびに調製方法と使用 Download PDF

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JP2022535708A
JP2022535708A JP2021569341A JP2021569341A JP2022535708A JP 2022535708 A JP2022535708 A JP 2022535708A JP 2021569341 A JP2021569341 A JP 2021569341A JP 2021569341 A JP2021569341 A JP 2021569341A JP 2022535708 A JP2022535708 A JP 2022535708A
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Abstract

Figure 2022535708000001
補体タンパク５（Ｃ５）遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む薬物組成物と複合体を提供する。ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉを含み、ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩを含み、ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。さらに、ｓｉＲＮＡ及びその薬物組成物と複合体を、補体媒介の関連疾患、例えば重症筋無力症（ＭＧ）の治療及び／又は予防に用いる方法を提供する。
【選択図】図１Ｃ

Description

本開示は、補体タンパク５（Ｃ５）遺伝子発現を抑制できる核酸、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体に関する。本開示は、さらに、当該核酸、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の調製方法と使用に関する。
重症筋無力症（ＭＧ）は、主にアセチルコリン受容体抗体（ＡｃｈＲ－Ａｂ）によって媒介され、細胞性免疫に依存し、補体が関与する後天性自己免疫疾患であって、神経筋接合部のシナプス後膜上のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）が影響を受ける疾患である。
補体タンパク（Ｃ５）は、重症筋無力症を治療するキーターゲットポイントの一つである。ＡｃｈＲ－Ａｂは補体の関与によりＡｃｈＲに結合し、ＡｃｈＲが補体媒介の細胞膜溶解作用によって大量に破壊され、シナプス後膜におけるアセチルコリンの伝達障害を引き起こし、筋力低下が発生する。研究によると、薬物と補体タンパクＣ５とを特異的に結合させることで、Ｃ５のＣ５ａとＣ５ｂへの開裂を阻害し、さらに膜侵襲複合体の形成を阻害し、膜侵襲複合体の神経筋接合部に対する破壊及びその後の炎症促進因子の産生を遮断し、免疫抑制作用を発揮して、重症筋無力症を治療することが明らかになっている。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）というメカニズムに基づき、関心対象の目的遺伝子の発現を配列特異的に抑制又は遮断し、疾患を治療する目的を達成することができる。ｍＲＮＡレベルでＣ５遺伝子発現を抑制し、補体タンパクの生成を遮断することにより、体の正常免疫機能を維持するとともに、異常免疫反応の発生を抑制することを実現することが出来れば、間違いなく最も理想的な治療手段となるであろう。
Ｃ５遺伝子発現を抑制し、重症筋無力症を治療するｓｉＲＮＡ薬物の開発において、適切なｓｉＲＮＡ及びその修飾ならびに有効な送達系は、キー技術である。
本開示の発明者は、本開示により提供される以下のようなｓｉＲＮＡ複合体によって、Ｃ５遺伝子の発現を特異的に抑制し、肝臓を特異的に標的し、肝臓におけるＣ５遺伝子の発現を抑制し、重症筋無力症の治療又は予防を実現できることを、意外にも見出した。また、発明者はさらに、活性の高いｓｉＲＮＡ及び薬物組成物を発明した。
いくつかの実施形態において、本開示は、式（３０８）に示される構造を有するｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
Figure 2022535708000002
 式中、ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり、ｍ１、ｍ２又はｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
Figure 2022535708000003
 式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、
ＮｕはｓｉＲＮＡであり、当該ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、以下のｉ）～ｖｉ）から選択される１つである。
ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＵＵＣＡＵＵＣＡＵＡＣＡＧＡＣＡＡＺ１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ２ＵＵＧＵＣＵＧＵＡＵＧＡＡＵＧＡＡＧ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚ１はＡであり、Ｚ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１に対応するヌクレオチドＺ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２に対応するヌクレオチドＺ４が含まれ、前記Ｚ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＵＡＣＡＧＵＵＵＡＧＡＡＧＡＵＵＵＺ５－３’（配列番号６１）、
５’－Ｚ６ＡＡＡＵＣＵＵＣＵＡＡＡＣＵＧＵＡＧ－３’（配列番号６２）
ただし、Ｚ５はＡであり、Ｚ６はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ５に対応するヌクレオチドＺ７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ６に対応するヌクレオチドＺ８が含まれ、前記Ｚ８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＧＧＡＡＧＧＵＵＡＣＣＧＡＧＣＡＡＵＺ９－３’（配列番号１２１）、
５’－Ｚ１０ＡＵＵＧＣＵＣＧＧＵＡＡＣＣＵＵＣＣ－３’（配列番号１２２）
ただし、Ｚ９はＡであり、Ｚ１０はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ９に対応するヌクレオチドＺ１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１０に対応するヌクレオチドＺ１２が含まれ、前記Ｚ１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＵＵＺ１３－３’（配列番号１８１）、
５’－Ｚ１４ＡＡＵＵＣＵＧＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵ－３’（配列番号１８２）
ただし、Ｚ１３はＡであり、Ｚ１４はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１３に対応するヌクレオチドＺ１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１４に対応するヌクレオチドＺ１６が含まれ、前記Ｚ１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣＵＧＣＡＡＺ１７－３’（配列番号２４１）、
５’－Ｚ１８ＵＵＧＣＡＧＣＧＵＵＣＵＵＣＵＵＧＧ－３’（配列番号２４２）
ただし、Ｚ１７はＡであり、Ｚ１８はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１７に対応するヌクレオチドＺ１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１８に対応するヌクレオチドＺ２０が含まれ、前記Ｚ２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’－ＣＣＡＧＵＡＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＺ２１－３’（配列番号３０１）、
５’－Ｚ２２ＵＵＣＵＧＧＣＵＵＧＣＵＵＡＣＵＧＧ－３’（配列番号３０２）
ただし、Ｚ２１はＡであり、Ｚ２２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ２１に対応するヌクレオチドＺ２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２２に対応するヌクレオチドＺ２４が含まれ、前記Ｚ２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、ここで１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ１は独立して、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、ここで、１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択されるいずれか１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
Figure 2022535708000004
は、基が共有結合的に結合する部位を表し、Ｍ１は標的基を表す。
いくつかの実施形態において、本開示は、Ｃ５遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡを提供する。前記ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、上記のｉ）～ｖｉ）から選択される１つである。
いくつかの実施形態において、本開示は、上記本開示のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、重症筋無力症の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を重症筋無力症に罹患している被験体に投与することを含む重症筋無力症の治療及び／又は予防方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を肝細胞と接触させることを含む、前記肝細胞におけるＣ５遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を含むキットを提供する。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、安定性に優れ、Ｃ５ ｍＲＮＡ抑制活性が高く、オフターゲット効果が低減されており、及び／又は重症筋無力症状を顕著に治療又は緩和することができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体外細胞実験で優れた標的ｍＲＮＡ抑制活性を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、肝細胞において少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標的ｍＲＮＡ抑制率を示す。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ＨｅｐＧ２細胞において高い抑制活性を示し、Ｃ５ ｍＲＮＡに対するＩＣ５０が１．４９４～９．６８８ｎＭである。いくつかの実施形態において、蛍光標識付きの本開示のｓｉＲＮＡ複合体をＣ５７マウスに皮下注射し、マウスのリアルタイム蛍光イメージングを行い、臓器での蛍光の分布状況を観察し、４８ｈでマウスを死亡させ臓器解剖を行ったところ、ｓｉＲＮＡ複合体がほとんど肝臓に集中することを見出し、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体が効果的にｓｉＲＮＡを肝臓に特異的に送達することができることが示され、肝臓における標的ｍＲＮＡの発現を特異的に抑制できることを示唆している。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内での安定性がより高く及び／又は活性がより高い。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の標的ｍＲＮＡ発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＣ５ ｍＲＮＡ発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内Ｃ５ ｍＲＮＡ発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内Ｃ５ ｍＲＮＡ発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のヒト被験体における肝内Ｃ５ ｍＲＮＡ発現抑制率を示す。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は顕著なオフターゲット効果を示していない。オフターゲット効果とは、例えば非標的遺伝子の正常発現に対する抑制であってもよい。オフターゲット遺伝子発現の結合／抑制は、オンターゲット遺伝子効果よりも５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％低くなると、当該オフターゲット効果は顕著ではないと見なされる。
このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体は、Ｃ５ ｍＲＮＡの発現を抑制し、重症筋無力症状を効果的に治療及び／又は予防することができ、応用において明るい見通しを有している。
本開示の他の特徴と利点については、後述する発明を実施するための形態部分において詳しく説明する。
順に、異なる複合体１～８をトランスフェクションした後、ＨｅｐＧ２細胞におけるＣ５ ｍＲＮＡの相対発現レベルに従ってフィッティングされた用量－効果曲線である。 Ｃ５７マウスに５ｍｌ／ｋｇの１×ＰＢＳ、３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５－ｓｉＲＮＡ１又は３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５－複合体１を投与してから４８ｈ後のマウス体内の各臓器の蛍光イメージング画像である。 Ｃ５７マウスに５ｍｌ／ｋｇの１×ＰＢＳ、３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５－ｓｉＲＮＡ２又は３ｍｇ／ｋｇのＣｙ５－複合体２を投与してから４８ｈ後のマウス体内の各臓器の蛍光イメージング画像である。
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、本開示の範囲を制限するためのものではないと理解すべきである。
本開示において、Ｃ５ ｍＲＮＡとは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ５７７２９．１に示される配列を有するｍＲＮＡを指す。さらに、特に説明がない限り、本開示において用いられる用語「標的遺伝子」とは、上記Ｃ５ ｍＲＮＡを転写できる遺伝子を指し、用語「標的ｍＲＮＡ」とは、上記Ｃ５ ｍＲＮＡを指す。
＜定義＞
文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａは、ヌクレオチドの塩基配列を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字ＶＰは、当該組合せ文字ＶＰの右側に隣接する１つのヌクレオチドがビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、組合せ文字Ｐｓは、当該組合せ文字Ｐｓの右側に隣接する１つのヌクレオチドがチオリン酸エステル修飾ヌクレオチドであることを表し、大文字Ｐは、当該文字Ｐの右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’－リン酸ヌクレオチドであることを表す。
文脈において、前記「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。「ヌクレオチドアナログ」とは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指し、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチドがある。前記「メトキシ修飾ヌクレオチド」とは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
本明細書の文脈において、「相補」又は「逆相補」という用語は、互換的に使用されてもよく、当業者に周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基のそれぞれと他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であるアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｃ）は、常にピリミジン塩基であるシトシン（Ｇ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的である、またその相補鎖の配列から当該鎖の配列を推定できると考えられる。これに応じて、「ミスマッチ」は、本分野では、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しないことを意味する。
文脈において、特に説明がない限り、「基本的に逆相補的」とは、関連する２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「実質的に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、「完全に逆相補的」とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチが存在しないことを指す。
文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列に「ヌクレオチド差異」が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化したことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであるとき、前者の同じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつかの実施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はその等価物を用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。
文脈において、特に本開示のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを含む組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体におけるヌクレオチドの種類と順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレオシドホスホルアミダイトモノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓということもある）を指す。ホスホルアミダイト固相合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合することを指し、これに応じて、「複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらに、「ｓｉＲＮＡ複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の化学部分がｓｉＲＮＡに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。以下の文章では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を単に「複合体」ともいうことがある。ｓｉＲＮＡ複合体は、文脈により、複数のｓｉＲＮＡ複合体の総称、又はある化学式に示されるｓｉＲＮＡ複合体であると理解される。本開示の文脈において、「複合分子」は、反応させることによりｓｉＲＮＡに複合され、最終的に本開示のｓｉＲＮＡ複合体を形成することができる特定の化合物であると理解すべきである。
本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに当該記載が事象又は状況が発生した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換され」た「アルキル」は、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。１又は複数の置換基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及び／又は本質的に不安定ないかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されないと、当業者に理解される。
本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖を指し、前記特定の数は、通常１～２０個の炭素原子、例えば、１～１０個の炭素原子、１～８個又は１～６個の炭素原子である。例えば、Ｃ１－Ｃ６アルキルは、１～６個の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基に言及する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。したがって、例えば、「ブチル」は、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ－ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ－プロピル及びイソプロピルを含む。アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素－炭素二重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から１つの水素分子を除去することにより得られる。当該基は、二重結合のシス又はトランス配置にあってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと、プロパ－１－エン－１－イル、プロパ－１－エン－２－イル、プロパ－２－エン－１－イル（アリル）、プロパ－２－エン－２－イル等のプロペニルと、ブタ－１－エン－１－イル、ブタ－１－エン－２－イル、２－メチルプロパ－１－エン－１－イル、ブタ－２－エン－１－イル、ブタ－２－エン－２－イル、ブタ－１，３－ジエン－１－イル、ブタ－１，３－ジエン－２－イル等のブテニルとを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルケニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～１０個、２～８個又は２～６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニルのサブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素－炭素三重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から２つの水素分子を除去することにより得られる。典型的なアルキニルとしては、エチニルと、プロパ－１－イン－１－イル、プロパ－２－イン－１－イル等のプロピニルと、ブタ－１－イン－１－イル、ブタ－１－イン－３－イル、ブタ－３－イン－１－イル等のブチニルとを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルキニルは、２～２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２～１０、２～８又は２～６個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセットであり、アルキニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、２－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２－ヘキシルオキシ、３－ヘキシルオキシ、３－メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常１～１０個、１～８個、１～６個、又は１～４個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、芳香族単環式又は多環式炭化水素環系から誘導される、環炭素原子から水素原子を除去して形成された基を指す。前記芳香族単環式又は多環式炭化水素環系は、水素原子及び６～１８個の炭素原子のみを含有し、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状、非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオレニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールのサブセットであり、アリールと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン置換基」又は「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を含む。
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が１又は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２－フルオロエチル又はペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
「複素環基」とは、２～１２個の炭素原子と、窒素、酸素又は硫黄から選択される１～６個のヘテロ原子とを含む、安定した３～１８員非芳香族環状基を指す。明細書において特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋環系を含んでもよい。複素環基におけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。複素環基は、一部飽和又は完全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル［１，３］ジスルホニル（ｔｈｉｅｎｙｌ［１，３］ｄｉｔｈｉａｎｙｌ）、デカヒドロイソキノリニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒドロイソインドール、２－オキサピペラジニル、２－オキサピペリジル、２－オキサピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリスルホニル（ｔｒｉｔｈｉａｎｙｌ）、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル（ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、チアモルホリニル（ｔｈｉａｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）、１－オキソチオモルホリニル（１－ｏｘｏ－ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）及び１，１－ジオキソチオモルホリニル（１，１－ｄｉｏｘｏ－ｔｈｉｏｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）を含むが、これらに限定されない。
「ヘテロアリール」とは、２個～１７個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１～６個のヘテロ原子とを含む、３～１８員芳香環ラジカルから誘導される基を指す。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であってもよく、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状非局在化（４ｎ＋２）π－電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環又は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。ヘテロアリールは、環中の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合される。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、１，３－ベンゾジオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル（ｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｄｉｏｘｅｐｉｎｙｌ）、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジニル（ｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｏｘａｚｉｎｙｌ）、１，４－ベンゾジオキサン（１，４－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｎｙｌ）、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｙｌ）、ベンゾジオキシニル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎｙｌ）、ベンゾピラニル、ベンゾピロニル、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２－ａ］ピリジル、カルバゾリル、シンノリル（ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル（５，６－ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｈ］ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｙｌ）、５，６－ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリニル（５，６ ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｈ］ｃｉｎｎｏｌｉｎｙｌ）、６，７－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２－ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ［３，２－ｃ］ピリジル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０－ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル（ｉｎｄａｚｏｌｙｌ）、インドール、イソインドール、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル（ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｙｌ）、イソオキサゾリル、５，８－メタノ－５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル（５，８－ｍｅｔｈａｎｏ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｙｌ）、ナフチリジニル（ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｙｌ）、１，６－ナフチリジノニル（１，６－ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｏｎｙｌ）、オキサジアゾリル、２－オキソアゼピニル（２－ｏｘｏａｚｅｐｉｎｙｌ）、オキサゾリル、オキシラニル（ｏｘｉｒａｎｙｌ）、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロベンゾ［Ｈ］キナゾリニル、１－フェニル－１Ｈ－ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｙｌ）、プテリジニル（ｐｔｅｒｉｄｉｎｙｌ）、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピリジル、ピリド［３，２－ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４－ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニル、キノキサリニル（ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｙｌ）、キノリル、テトラヒドロキノリル、５，６，７，８－テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７，８－テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８－テトラヒドロピリド［４，５－ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３－ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２－ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３－ｃ］プリジニル（ｔｈｉｅｎｏ［２，３－ｃ］ｐｒｉｄｉｎｙｌ）及びチオフェニル（ｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ／ｔｈｉｅｎｙｌ）を含むが、これらに限定されない。
本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は、化学官能基を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質的に損傷することなく分子中の当該官能基に付加する、及びそれから除去することができる。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２２２３～２３１１、及びＧｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，２ｄ ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１に開示されており、引用により、上記文献は、それぞれ全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９－フェニルキサンテン－９－イル（Ｐｉｘｙｌ）又は９－（ｐ－メトキシフェニル）キサンテン－９－イル（Ｍｏｘ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Ｔｒ（トリチル）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）又はＴＭＴｒ（４，４’，４’’－トリメトキシトリチル）を含む。
「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本開示の被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット又は任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「治療」とは、有益又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、被験体が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１又は複数の生理的症状を根絶又は改善することにより、被験体に改善が観察されて得られる。
本明細書で用いられる場合、「予防」とは、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されない。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行われていないかもしれないが、ｓｉＲＮＡ複合体又は組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある被験体に投与、又は疾患の１又は複数の病理学的症状が報告された被験体に投与することができる。
＜ｓｉＲＮＡ＞
ある局面では、本開示は、Ｃ５遺伝子発現を抑制できる６つのｓｉＲＮＡを提供する。
本開示のｓｉＲＮＡは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここで説明を省略する。
本開示のｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖とアンチセンス鎖の長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９～２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが１９～２６ヌクレオチドである。このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が１９／１９、１９／２０、１９／２１、１９／２２、１９／２３、１９／２４、１９／２５、１９／２６、２０／２０、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２０／２４、２０／２５、２０／２６、２１／２０、２１／２１、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２１／２５、２１／２６、２２／２０、２２／２１、２２／２２、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２２／２６、２３／２０、２３／２１、２３／２２、２３／２３、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は１９／２１、２１／２３又は２３／２５である。
＜第１のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第１のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第１のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第１のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＣＵＵＣＡＵＵＣＡＵＡＣＡＧＡＣＡＡＺ１－３’（配列番号１）、
５’－Ｚ２ＵＵＧＵＣＵＧＵＡＵＧＡＡＵＧＡＡＧ－３’（配列番号２）
ただし、Ｚ１はＡであり、Ｚ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１に対応するヌクレオチドＺ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２に対応するヌクレオチドＺ４が含まれ、前記Ｚ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
文脈において、「位置が対応する」とは、ヌクレオチド配列の同一端から、ヌクレオチド配列において同じ位置にあることを指す。例えば、ヌクレオチド配列Ｉの３’端の１番目のヌクレオチドは、位置が配列番号１の３’端の１番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ４の位置での差異を含み、Ｚ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ４の位置での差異であり、Ｚ４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ３は、Ｚ４と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチがないことを指す。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＣＵＵＣＡＵＵＣＡＵＡＣＡＧＡＣＡＡＺ３－３’（配列番号３）、
５’－Ｚ４ＵＵＧＵＣＵＧＵＡＵＧＡＡＵＧＡＡＧ－３’（配列番号４）
ただし、前記Ｚ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ４は、Ｚ３と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ３はＡであり、Ｚ４はＵである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶとは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＣＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＧＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵＣＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＧＡＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＡＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第２のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第２のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第２のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第２のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＣＵＡＣＡＧＵＵＵＡＧＡＡＧＡＵＵＵＺ５－３’（配列番号６１）、
５’－Ｚ６ＡＡＡＵＣＵＵＣＵＡＡＡＣＵＧＵＡＧ－３’（配列番号６２）
ただし、Ｚ５はＡであり、Ｚ６はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ５に対応するヌクレオチドＺ７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ６に対応するヌクレオチドＺ８が含まれ、前記Ｚ８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ８の位置での差異を含み、Ｚ８がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ８の位置での差異であり、Ｚ８がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ７は、Ｚ８と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＣＵＡＣＡＧＵＵＵＡＧＡＡＧＡＵＵＵＺ７－３’（配列番号６３）、
５’－Ｚ８ＡＡＡＵＣＵＵＣＵＡＡＡＣＵＧＵＡＧ－３’（配列番号６４）
ただし、前記Ｚ８は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ７は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ８は、Ｚ７と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ７はＡであり、Ｚ８はＵである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶとは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号６１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＵＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＡＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＵＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＡＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第３のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第３のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第３のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第３のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＧＧＡＡＧＧＵＵＡＣＣＧＡＧＣＡＡＵＺ９－３’（配列番号１２１）、
５’－Ｚ１０ＡＵＵＧＣＵＣＧＧＵＡＡＣＣＵＵＣＣ－３’（配列番号１２２）
ただし、Ｚ９はＡであり、Ｚ１０はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ９に対応するヌクレオチドＺ１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１０に対応するヌクレオチドＺ１２が含まれ、前記Ｚ１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ１２の位置での差異を含み、Ｚ１２がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ１２の位置での差異であり、Ｚ１２がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ１１は、Ｚ１２と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＧＧＡＡＧＧＵＵＡＣＣＧＡＧＣＡＡＵＺ１１－３’（配列番号１２３）、
５’－Ｚ１２ＡＵＵＧＣＵＣＧＧＵＡＡＣＣＵＵＣＣ－３’（配列番号１２４）
ただし、前記Ｚ１２は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１１は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１２は、Ｚ１１と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ１１はＡであり、Ｚ１２はＵである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶとは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵＧＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第４のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第４のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第４のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第４のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＵＵＺ１３－３’（配列番号１８１）、
５’－Ｚ１４ＡＡＵＵＣＵＧＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵ－３’（配列番号１８２）
ただし、Ｚ１３はＡであり、Ｚ１４はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１３に対応するヌクレオチドＺ１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１４に対応するヌクレオチドＺ１６が含まれ、前記Ｚ１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ１６の位置での差異を含み、Ｚ１６がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ１６の位置での差異であり、Ｚ１６がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ１５は、Ｚ１６と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＵＵＺ１５－３’（配列番号１８３）、
５’－Ｚ１６ＡＡＵＵＣＵＧＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵ－３’（配列番号１８４）
ただし、前記Ｚ１６は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１５は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１６は、Ｚ１５と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ１５はＡであり、Ｚ１６はＵである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶとは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第５のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第５のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第５のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第５のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣＵＧＣＡＡＺ１７－３’（配列番号２４１）、
５’－Ｚ１８ＵＵＧＣＡＧＣＧＵＵＣＵＵＣＵＵＧＧ－３’（配列番号２４２）
ただし、Ｚ１７はＡであり、Ｚ１８はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１７に対応するヌクレオチドＺ１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１８に対応するヌクレオチドＺ２０が含まれ、前記Ｚ２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ２０の位置での差異を含み、Ｚ２０がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ２０の位置での差異であり、Ｚ２０がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ１９は、Ｚ２０と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２４３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２４４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣＵＧＣＡＡＺ１９－３’（配列番号２４３）、
５’－Ｚ２０ＵＵＧＣＡＧＣＧＵＵＣＵＵＣＵＵＧＧ－３’（配列番号２４４）
ただし、前記Ｚ２０は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１９は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ２０は、Ｚ１９と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ１９はＡであり、Ｚ２０はＵである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶとは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＣＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
＜第６のｓｉＲＮＡ＞
本開示によれば、前記ｓｉＲＮＡは、第６のｓｉＲＮＡであってもよい。
前記第６のｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記第６のｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下である。
５’－ＣＣＡＧＵＡＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＺ２１－３’（配列番号３０１）、
５’－Ｚ２２ＵＵＣＵＧＧＣＵＵＧＣＵＵＡＣＵＧＧ－３’（配列番号３０２）
ただし、Ｚ２１はＡであり、Ｚ２２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ２１に対応するヌクレオチドＺ２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２２に対応するヌクレオチドＺ２４が含まれ、前記Ｚ２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ２４の位置での差異を含み、Ｚ２４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ２４の位置での差異であり、Ｚ２４がＡ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ２３は、Ｚ２４と相補的なヌクレオチドである。上記ヌクレオチド差異を有するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡ抑制能力が高く、これらのｓｉＲＮＡも、本開示の保護範囲内にある。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩは、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３０３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号３０４に示されるヌクレオチド配列である。
５’－ＣＣＡＧＵＡＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＺ２３－３’（配列番号３０３）、
５’－Ｚ２４ＵＵＣＵＧＧＣＵＵＧＣＵＵＡＣＵＧＧ－３’（配列番号３０４）
ただし、前記Ｚ２４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ２３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ２４は、Ｚ２３と相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、Ｚ２３はＡであり、Ｚ２４はＵである。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶとは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩが前記ヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶが前記ヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶと二段目のヌクレオチド配列とは、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、当該二段目のヌクレオチド配列とは、標的ｍＲＮＡにおける配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列の５’末端に隣接し、長さが前記ヌクレオチド配列ＩＶと等しいヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＡＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵＵＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＡＡＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基配列がＵＡであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
ｓｉＲＮＡのオーバーハング末端と修飾
以下に、ヌクレオチド配列Ｖ、核酸配列、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド修飾、及び修飾配列の説明は、上記の第１～第６のｓｉＲＮＡのいずれか１つに適用可能である。即ち、特に明記されていない場合、以下のｓｉＲＮＡの説明は、第１のｓｉＲＮＡ、第２のｓｉＲＮＡ、第３のｓｉＲＮＡ、第４のｓｉＲＮＡ、第５のｓｉＲＮＡ及び第６のｓｉＲＮＡを１つずつ説明したものと見なされるべきである。例えば、特定のｓｉＲＮＡが指定されていない場合、「前記ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含む」とは、「第１のｓｉＲＮＡ、第２のｓｉＲＮＡ、第３のｓｉＲＮＡ、第４のｓｉＲＮＡ、第５のｓｉＲＮＡ又は第６のｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含む」ことを意味する。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖とアンチセンス鎖は、長さが異なり、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’突出端(オーバーハング末端)を構成する。これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が１９／２０、１９／２１、１９／２２、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｖは、長さが２ヌクレオチドであり、これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が１９／２１、２１／２３又は２３／２５であってもよい。
前記ヌクレオチド配列Ｖにおける各ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってもよく、合成しやすく合成コストを節約するために、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド（ｄＴｄＴ）又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチド（ＵＵ）であり、或いは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの親和力を向上させるために、ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である。したがって、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比は１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示のｓｉＲＮＡはより高いｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。
標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドとは、５’末端で標的ｍＲＮＡの三段目のヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指し、当該三段目のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列ＩＩと実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列であるか、又はヌクレオチド配列ＩＩ及びヌクレオチド配列ＩＶから構成されるヌクレオチド配列と実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であるヌクレオチド配列である。
いくつかの実施形態において、前記第１のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＣＵＵＣＡＵＵＣＡＵＡＣＡＧＡＣＡＡＺ３－３’（配列番号５）、
５’－Ｚ４ＵＵＧＵＣＵＧＵＡＵＧＡＡＵＧＡＡＧＡＧ－３’（配列番号６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＣＵＣＵＵＣＡＵＵＣＡＵＡＣＡＧＡＣＡＡＺ３－３’（配列番号７）、
５’－Ｚ４ＵＵＧＵＣＵＧＵＡＵＧＡＡＵＧＡＡＧＡＧＡＡ－３’（配列番号８）
ただし、前記Ｚ４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ４は、Ｚ３と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第２のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＣＵＡＣＡＧＵＵＵＡＧＡＡＧＡＵＵＵＺ７－３’（配列番号６５）、
５’－Ｚ８ＡＡＡＵＣＵＵＣＵＡＡＡＣＵＧＵＡＧＵＡ－３’（配列番号６６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号６８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＵＡＣＵＡＣＡＧＵＵＵＡＧＡＡＧＡＵＵＵＺ７－３’（配列番号６７）、
５’－Ｚ８ＡＡＡＵＣＵＵＣＵＡＡＡＣＵＧＵＡＧＵＡＵＧ－３’（配列番号６８）
ただし、前記Ｚ８は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ７は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ８は、Ｚ７と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第３のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＧＡＡＧＧＵＵＡＣＣＧＡＧＣＡＡＵＺ１１－３’（配列番号１２５）、
５’－Ｚ１２ＡＵＵＧＣＵＣＧＧＵＡＡＣＣＵＵＣＣＣＵ－３’（配列番号１２６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＧＧＧＡＡＧＧＵＵＡＣＣＧＡＧＣＡＡＵＺ１１－３’（配列番号１２７）、
５’－Ｚ１２ＡＵＵＧＣＵＣＧＧＵＡＡＣＣＵＵＣＣＣＵＧＧ－３’（配列番号１２８）
ただし、前記Ｚ１２は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１１は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１２は、Ｚ１１と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第４のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＵＵＺ１５－３’（配列番号１８５）、
５’－Ｚ１６ＡＡＵＵＣＵＧＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵＣＣ－３’（配列番号１８６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＧＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＵＵＺ１５－３’（配列番号１８７）、
５’－Ｚ１６ＡＡＵＵＣＵＧＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵＣＣＵＧ－３’（配列番号１８８）
ただし、前記Ｚ１６は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１５は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ１６は、Ｚ１５と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第５のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣＵＧＣＡＡＺ１９－３’（配列番号２４５）、
５’－Ｚ２０ＵＵＧＣＡＧＣＧＵＵＣＵＵＣＵＵＧＧＣＣ－３’（配列番号２４６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号２４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号２４８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣＵＧＣＡＡＺ１９－３’（配列番号２４７）、
５’－Ｚ２０ＵＵＧＣＡＧＣＧＵＵＣＵＵＣＵＵＧＧＣＣＵＧ－３’（配列番号２４８）
ただし、前記Ｚ２０は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ１９は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ２０は、Ｚ１９と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記第６のｓｉＲＮＡに対して、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３０５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号３０６に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＣＣＡＧＵＡＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＺ２３－３’（配列番号３０５）、
５’－Ｚ２４ＵＵＣＵＧＧＣＵＵＧＣＵＵＡＣＵＧＧＵＡ－３’（配列番号３０６）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３０７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号３０８に示されるヌクレオチド配列を含む。
５’－ＵＡＣＣＡＧＵＡＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＺ２３－３’（配列番号３０７）、
５’－Ｚ２４ＵＵＣＵＧＧＣＵＵＧＣＵＵＡＣＵＧＧＵＡＡＣ－３’（配列番号３０８）
ただし、前記Ｚ２４は、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、Ｚ２３は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ２４は、Ｚ２３と相補的なヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに記載されているｓｉＣ５ａ１、ｓｉＣ５ａ２、ｓｉＣ５ｂ１、ｓｉＣ５ｂ２、ｓｉＣ５ｃ１、ｓｉＣ５ｃ２、ｓｉＣ５ｄ１、ｓｉＣ５ｄ２、ｓｉＣ５ｅ１、ｓｉＣ５ｅ２、ｓｉＣ５ｆ１又はｓｉＣ５ｆ２である。
前述したように、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの一部又は全部は、修飾ヌクレオチドであり、ヌクレオチド基上のこれらの修飾により、本開示のｓｉＲＮＡがＣ５遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることはない。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。本開示の文脈において、用いられる用語「修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、或いは、修飾された塩基を有するヌクレオチドを指す。前記修飾ヌクレオチドにより、ｓｉＲＮＡが遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることはない。例えば、Ｊ．Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｇ．Ｆ． Ｄｅｌｅａｖｅｙ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ． Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ： ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２００８，１３（１９－２０）： ８４２－５５に開示された修飾ヌクレオチドを選択してもよい。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又は前記アンチセンス鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基及び／又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基及び／又は修飾基を有するリボース基である。
いくつかの実施形態において、前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖におけるヌクレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
本開示の発明者は、驚くべきことに、本開示に記載されたｓｉＲＮＡにより、動物実験において血漿中安定性と遺伝子サイレンシング効率の高度なバランスが取られていることを見出した。
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの少なくとも第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの少なくとも第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、前記ヌクレオチド配列Ｉにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
本開示の文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換された、以下の式（７）に示される構造を有するヌクレオチドを指す。「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド、又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである。
これらのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチドは、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。
いくつかの実施形態において、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（８）に示される２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、例えば、式（９）に示される２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態において、２’－アミノ（２’－ＮＨ２）修飾ヌクレオチドは式（１０）に示される。いくつかの実施形態において、２’－デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は式（１１）に示される。
Figure 2022535708000005
ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド又は非環式ヌクレオチドであってもよい。
架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＢＮＡ）とは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’－エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボースの２’－、４’－位に導入して２’，４’－ＢＮＡヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＢＮＡは、式（１２）に示されるＬＮＡ、式（１３）に示されるＥＮＡ、式（１４）に示されるｃＥＴ ＢＮＡ等であってもよい。
Figure 2022535708000006
非環式ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖環が開環されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、非環式ヌクレオチドは、式（１５）に示されるアンロックド核酸（ＵＮＡ）、又は式（１６）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）であってもよい。
Figure 2022535708000007
上記式（１５）及び式（１６）において、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ－アルキル）から選択される。
イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化した化合物を指す。いくつかの実施形態において、イソヌクレオチドは、式（１７）又は（１８）に示される、塩基がリボース環の１’－位から２’－位又は３’－位に移行した化合物であってもよい。
Figure 2022535708000008
上記式（１７）～式（１８）の化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はＴ等の塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素基から選択される。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、文脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「２’－フルオロ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「２’－フルオロリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドの２’－ヒドロキシ基がフッ素で置換された、式（７）に示される構造を有する化合物を指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」、「２’－メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチド」及び「２’－メトキシリボース基を有するヌクレオチド」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドのリボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換された、式（８）に示される構造を有する化合物を指す。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに記載されているｓｉＣ５ａ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ２又はｓｉＣ５ｆ２－Ｍ３のいずれか１つである。
上記修飾を有するｓｉＲＮＡは、コストが低いだけでなく、血中のリボヌクレアーゼで核酸を切断しにくくすることができ、これにより、核酸の安定性を向上させ、核酸のヌクレアーゼ加水分解耐性という特性をより高めている。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸－糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である。
Figure 2022535708000009
このような修飾により、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親和力を維持することができる。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せからなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに記載されているｓｉＣ５ａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ２Ｓ又はｓｉＣ５ｆ２－Ｍ３Ｓのいずれか１つである。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。
慣用の前記５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、当業者に公知であり、例えば、５’－リン酸ヌクレオチドは、以下の構造を有してもよい。
Figure 2022535708000010
また、例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ Ｋｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｋ． Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）： ２３８～４８には、以下の４種類の５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが開示されている。
Figure 2022535708000011
 式中、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ、フッ素から選択され、Ｂａｓｅは塩基を表し、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される。
いくつかの実施形態において、５’－リン酸ヌクレオチドは、式（２）に示される、５’－リン酸修飾を含むヌクレオチドであり、５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（３）に示される、ビニルリン酸エステル（５’－（Ｅ）－ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ－ＶＰ）修飾を含むヌクレオチドであり、又は、式（５）に示される、チオリン酸エステル修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに記載されているｓｉＣ５ａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ２ＳＰ１又はｓｉＣ５ｆ２－Ｍ３ＳＰ１のいずれか１つである。
本開示の発明者は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡの血漿とリソソーム安定性が顕著に向上しているだけでなく、標的ｍＲＮＡ抑制活性が高いことを意外にも見出した。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、本分野における通常のｓｉＲＮＡ調製方法（例えば、固相合成方法及び液相合成方法）により得ることができる。ここで、固相合成は、既に商用カスタマイズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができ、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。
＜薬物組成物＞
本開示は、活性成分として上述したｓｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
前記薬学的に許容可能な担体は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられる担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えば、Ｆｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ （ＰＡＭＡＭ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ－又はＬ－乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ－ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（アミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体の１又は複数があるが、これらに限定されない。
前記薬物組成物におけるｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体の含有量に対して特段の要件はないが、各成分の通常の含有量であってもよい。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比が、１：（１～５００）であってもよい。いくつかの実施形態においては、上記重量比が１：（１～５０）である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物には、薬学的に許容できる他の添加剤が含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよい。例えば、前記薬学的に許容できる他の添加剤は、ｐＨ緩衝液、保護剤及び浸透圧調節剤の少なくとも１種を含んでもよい。
前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．５～８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ） ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｂｕｆｆｅｒ）及び／又はｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよく、例えば、ｐＨ５．５～８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。
前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース及びグルコースの少なくとも１種であってもよい。前記薬物組成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は０．０１～３０重量％であってもよい。
前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸透圧調節剤の含有量は、前記薬物組成物の浸透圧が２００～７００ミリオスモル／キログラム（ｍＯｓｍ／ｋｇ）となるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有量を容易に決定することができる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射液等の液体製剤であってもよく、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合し、液体製剤としてもよい。前記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いることができるが、これらに限定されず、噴霧により肺に投与、或いは、噴霧により肺を通して他の臓器組織（例えば、肝臓）に投与することもできるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、静脈注射投与に用いられる。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、リポソーム製剤の形式であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂質及び／又はＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）脂質を含む。ここで、前記有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａ（引用によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその薬学的に許容できる塩又は誘導体、補助脂質及びＰＥＧ化脂質からそれぞれ選択される１種又は複数種であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、ＣＮ１０３３８０１１３Ａに記載された式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。
Figure 2022535708000012
 式中、
Ｘ１０１又はＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ－Ａ又はＣ－Ａであり、Ａは水素又はＣ１－Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ１０１又はＺ１０１はそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ－ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６又はＲ１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
ｘが１～１０の整数であり、
ｎが１～３の整数であり、ｍが０～２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。
Figure 2022535708000013
 式中、ｇ、ｅ又はｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）における窒素原子を表す。
いくつかの実施形態において、Ｒ１０３はポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ１０３はケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ１０１及びＲ１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アルキル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３～約２０個の炭素原子、例えば、８～約１８個の炭素原子、及び０～４個の二重結合、例えば、０～２個の二重結合を有する。
いくつかの実施形態において、ｎとｍのそれぞれが独立して１又は３の値である場合、Ｒ１０３は、下記式（２０４）～式（２１３）のいずれか１つであってもよい。
Figure 2022535708000014
式（２０４）～式（２１３）において、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１～６の整数であり、各「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊はＲ１０３と式（２０１）における窒素原子との結合可能点を示し、任意の＊位置上の各Ｈは、式（２０１）における窒素原子と結合するために置換されてもよい。
式（２０１）に示される化合物は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａの記載により調製されてもよい。
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。
Figure 2022535708000015
前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は、１，２－ジパルミトアミド－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）］－２０００（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）］－２０００）である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質、前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７～８０）：（１９．７～８０）：（０．３～５０）であり、例えば、（５０～７０）：（２０～４０）：（３～２０）であってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物粒子は、約３０ｎｍ～約２００ｎｍの平均径を有し、一般に約４０ｎｍ～約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソーム粒子の平均径は約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ又は約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又は１６０ｎｍである。
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物において、ｓｉＲＮＡと全脂質（例えば有機アミン、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質）の重量比（重量／重量比）は、約１：１～約１：５０、約１：１～約１：３０、約１：３～約１：２０、約１：４～約１：１８、約１：５～約１：１７、約１：５～約１：１５、約１：５～約１：１２、約１：６～約１：１２又は約１：６～約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示のｓｉＲＮＡと全脂質の重量比は約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７又は１：１８である。
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、市販時に各成分が独立して存在してもよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡと上記薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来のｓｉＲＮＡの代わりに本開示により提供されるｓｉＲＮＡを用いればよい。いくつかの実施形態において、以下の方法に従い調製されてもよい。
有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２～２５ｍｇ／ｍＬ、例えば、８～１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、薬学的に許容できるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００など、室温付近で液体であるアルコールから選択される１種又は複数種であり、例えばエタノールであってもよい。
本開示により提供されるｓｉＲＮＡを緩衝塩溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡ水溶液を得る。緩衝塩溶液の濃度が０．０５～０．５Ｍであり、例えば、０．１～０．２Ｍであってもよく、緩衝塩溶液のｐＨを４．０～５．５に調節し、例えば、５．０～５．２であってもよく、緩衝塩溶液の用量は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２～０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン酸塩から選択される１種又は複数種であり、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリウムであってよい。
脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を混合した後、得られた生成物を４０～６０℃で少なくとも２分間、例えば、５～３０分間培養し、培養したリポソーム製剤を得る。脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液の体積比は１：（２～５）である。
培養したリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去し、除菌し、本開示により提供される薬物組成物を得る。その物理化学的パラメーターは、ｐＨが６．５～８であり、封入効率が８０％以上であり、粒子径が４０～２００ｎｍであり、多分散指数が０．３０以下であり、浸透圧が２５０～４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。例えば、物理化学的パラメーターは、ｐＨが７．２～７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０～１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。
ここで、濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後又は同時に行われてもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過して除菌してもよい。
ｓｉＲＮＡ複合体
本開示は、上記ｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
一般的には、前記複合基は、薬学的に許容できる少なくとも１つの標的基及び任意のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基は順に結合されている。いくつかの実施形態において、前記標的基は１～６個である。いくつかの実施形態において、前記標的基は２～４個である。前記ｓｉＲＮＡ分子は、前記複合基に非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複合基に共有結合的に複合されてもよい。ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端にある。
いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’－位のヒドロキシ基又は塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、前記複合基は、３’－位のヒドロキシ基に結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’－５’リン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、ｓｉＲＮＡ鎖の末端に結合される場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、ｓｉＲＮＡの内部配列に結合される場合、通常リボース糖環或いは塩基に結合される。各種の結合方法については、Ｍｕｔｈｉａｈ Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ．ａｌ． ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｒｏｂｕｓｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１０ （５）： １１８１～７．を参照することができる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との間が酸不安定又は還元可能な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、これらの化学結合が分解され、ｓｉＲＮＡが遊離状態になることができる。分解できない複合方法については、複合基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され、複合によるｓｉＲＮＡ活性への影響をできるだけ低下させることができる。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられるリガンド、例えば、ＷＯ２００９０８２６０７Ａ２に記載された各種のリガンドであってもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、コレステロール、胆汁酸、ビタミン（例えば、トコフェロール）、鎖長が異なる脂質分子等の親油性分子と、ポリエチレングリコール等のポリマーと、膜透過性ペプチド等のポリペプチドと、アプタマーと、抗体と、量子ドットと、ラクトース、ポリラクトース、マンノース、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の糖類と、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）と、アシアロ糖タンパク質、アシアロ糖残基、リポタンパク（例えば、高密度リポタンパク、低密度リポタンパク等）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、成長因子、トランスフェリン等の肝実質細胞に発現する受容体リガンド等の標的分子又はその誘導体により形成されたリガンドから選択される１種又は複数種であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記各リガンドは、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、哺乳動物の肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、ヒト肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合できるリガンドである。これらのリガンドの種類は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合されるｓｉＲＮＡの標的細胞への送達を媒介する。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合するいずれか１種のリガンドであってもよい。いくつかの実施形態において、各リガンドは、独立してアシアロ糖タンパク質、例えば、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、ＡＳＯＲ）又はアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ、ＡＳＦ）である。いくつかの実施形態において、前記リガンドは、糖又は糖の誘導体である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドはいずれも糖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、単糖、多糖、修飾単糖、修飾多糖又は糖誘導体である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの前記リガンドは、単糖、二糖又は三糖であってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも独立して多糖、修飾多糖、単糖、修飾単糖、多糖誘導体又は単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、リガンドのそれぞれ又は少なくとも１つは、グルコース及びその誘導体、マンナン及びその誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各前記リガンドは、Ｄ－マンノピラノース、Ｌ－マンノピラノース、Ｄ－アラビノース、Ｄ－キシロフラノース、Ｌ－キシロフラノース、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－ガラクトース、α－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－マンノピラノース、β－Ｄ－マンノピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニルガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブチリルガラクトサミン、Ｎ－イソブチリルガラクトサミン、２－アミノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－１－カルボキシエチル］－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノース、２－デオキシ－２－メチルアミノ－Ｌ－グルコピラノース、４，６－ジデオキシ－４－ホルムアミド－２，３－ジ－Ｏ－メチル－Ｄ－マンノピラノース、２－デオキシ－２－スルホアミノ－Ｄ－グルコピラノース、Ｎ－グリコリル－α－ノイラミン酸、５－チオ－β－Ｄ－グルコピラノース、メチル２，３，４－トリス－Ｏ－アセチル－１－チオ－６－Ｏ－トリチル－α－Ｄ－グルコピラノシド、４－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－１，５－ジチオ－α－Ｄ－グルコヘプトピラノシド、２，５－アンヒドロ－Ｄ－アロニトリル、リボース、Ｄ－リボース、Ｄ－４－チオリボース、Ｌ－リボース又はＬ－４－チオリボースから独立して選択されてもよい。前記リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの記載を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体における、薬学的に許容できる標的基は、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンであってもよく、ガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子は、１価、２価、３価、４価であってもよい。ここでいう１価、２価、３価、４価は、それぞれｓｉＲＮＡ分子と、標的基としてのガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子を含む複合基から形成されたｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ分子とガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３又は１：４であることを指すと理解すべきである。いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基はＮ－アセチルガラクトサミンである。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ－アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価又は４価である。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ－アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ－アセチルガラクトサミン分子は３価である。
標的基は、適切なリンカーを介してｓｉＲＮＡ分子に結合されてもよく、当業者は、標的基の具体的な種類により適切なリンカーを選択することができる。これらのリンカー、標的基の種類及びｓｉＲＮＡへの結合方法については、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２の開示内容を参照してもよく、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０１）に示される構造であってもよい。
Figure 2022535708000016
 式中、
ｋは１～３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合される。
Figure 2022535708000017
 ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ－アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素基を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合される。
Figure 2022535708000018
 ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２～４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してアミド結合により前記ＬＢ部に結合される。
いくつかの実施形態において、ｎ＝３であり、ＬＣがトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく４価のリンカー基である場合、リンカーとしての－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－によりＮ－アセチルガラクトサミン分子とｓｉＲＮＡ分子を結合して形成されたｓｉＲＮＡ複合体は、その構造が以下の式（３０４）に示される。
Figure 2022535708000019
 式中、二重螺旋構造はｓｉＲＮＡを表す。
同様に、ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、リンカー－（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン－ＬＢ－により３個のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子に共有結合的に複合され、ｓｉＲＮＡ分子とＧａｌＮＡｃ分子とのモル比が１：３である、構造が以下の式（３０５）に示されるｓｉＲＮＡ複合体（以下、（ＧａｌＮＡｃ）３－ｓｉＲＮＡともいう）を得る。
Figure 2022535708000020
 式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ－アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０６）に示される構造であってもよい。
Figure 2022535708000021
 式中、
ｌは０～３の整数であり、
＊は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
＃は、リンカーにおいてリン酸エステル結合によりｓｉＲＮＡに結合される部位を表す。
いくつかの実施形態において、ｌ＝２である場合、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０７）に示される構造を有する。
Figure 2022535708000022
 式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
上記ｓｉＲＮＡ複合体は、従来技術において既に詳しく記載された方法により合成されてもよい。例えば、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２には、複数種のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法が詳しく記載されている。当業者によく知られている方法により、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得る。例えば、ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１には、式（３０５）に示される構造の調製方法が記載されており、Ｒａｊｅｅｖらは、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１５，１６，９０３－９０８に式（３０７）に示される構造の調製方法を記載した。
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０８）に示される構造を有する。
Figure 2022535708000023
 式中、
ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり、
各ｍ１、ｍ２又はｍ３は独立して、２～１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
Figure 2022535708000024
 式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは本開示のｓｉＲＮＡである。
Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、ここで、１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ１は独立して、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、ここで、１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよい。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、（Ａ１）～（Ａ２６）の基又はその任意の結合の組合せからなる群から選択されてもよく、（Ａ１）～（Ａ２６）の構造と定義は以下のとおりである。
Figure 2022535708000025
 式中、各ｊ１は独立して１～２０の整数であり、各ｊ２は独立して１～２０の整数であり、
各Ｒ’は独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基であり、
各Ｒａは、式（Ａ２７）～（Ａ４５）に示される基又はその任意の結合の組合せからなる群から選択される。
Figure 2022535708000026
 各Ｒｂは独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基であり、
Figure 2022535708000027
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
便宜上、Ｌ１は、線形アルキレン基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。
Ｍ１は、標的基を表し、その定義と選択可能な範囲は上記標的基と同じである。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドから独立して選択される１つである。
Ｍ１が哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドである場合、いくつかの実施形態において、ｎ１は、１～３の整数であってもよく、ｎ３は、０～４の整数であってもよく、前記ｓｉＲＮＡ複合体におけるＭ１標的基の個数が少なくとも２であることを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２であり、これにより、Ｍ１標的基の個数が少なくとも３であり、Ｍ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、さらに前記ｓｉＲＮＡ複合体がエンドサイトーシス（細胞内取込み）作用により細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分かるように、Ｍ１標的基の個数が３個以上である場合、Ｍ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形態において、ｎ１は１～２の整数であり、ｎ３は０～１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２～３である。
いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２又はｍ３は、それぞれ独立して２～１０の整数から選択される場合、複数のＭ１標的基間の空間位置をＭ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に適合させることができる。本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体をより簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２又はｍ３は、それぞれ独立して２～５の整数であり、いくつかの実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５が、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシ基からそれぞれ独立して選択される１つである場合、いずれも本開示のｓｉＲＮＡ複合体の性質を変化させることなく、本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、それぞれ独立してＨ、メチル基又はエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、いずれもＨである。
Ｒ３は、式Ａ５９に示される構造の基であり、ここで、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、調製原料の入手しやすさを考慮し、いくつかの実施形態において、Ｅ１はＯＨ又はＳＨである。
Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮ原子とＡ５９との結合を実現するために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が結合された炭素原子とＮ原子が互いに結合している鎖状構造を指す。したがって、Ｒ２は、適当な方法でＡ５９基を窒素含有骨格上のＮ原子に結合することができる任意のリンカー基であってもよい。いくつかの実施形態において、固相合成プロセスにより式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を調製する場合に、Ｒ２基には、窒素含有骨格上のＮ原子に結合される部位及びＲ３におけるＰ原子に結合される部位がともに含まれる必要がある。いくつかの実施形態において、Ｒ２における前記窒素含有骨格上のＮ原子に結合される部位は、Ｎ原子とアミド結合を形成し、前記Ｒ３上のＰ原子に結合される部位は、Ｐ原子とリン酸エステル結合を形成し、いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’であってもよい。
Figure 2022535708000028
 式中、
Figure 2022535708000029
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
ｑ２の値の範囲は、１～１０の整数であってもよく、いくつかの実施形態において、ｑ２は１～５の整数である。
Ｌ１は、Ｍ１標的基と窒素含有骨格上のＮを結合し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供するという役割を果たす。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、式Ａ１～Ａ２６の基から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３～２５個の原子、３～２０個の原子、４～１５個の原子又は５～１２個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個の原子である。
いくつかの実施形態において、ｊ１は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ１は３～５の整数である。いくつかの実施形態において、ｊ２は２～１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ２は３～５の整数である。Ｒ’はＣ１－Ｃ４アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つである。Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、いくつかの実施形態において、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ１－Ｃ５アルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである。いくつかの実施形態において、式Ａ１～Ａ２６においてそれぞれｊ１、ｊ２、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂを選択することにより、Ｍ１標的基と窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現し、Ｍ１標的基間の空間位置をＭ１標的基と肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合にさらに適合させる。
いくつかの実施形態において、当該ｓｉＲＮＡ複合体は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する。
Figure 2022535708000030
Figure 2022535708000031
Figure 2022535708000032
Figure 2022535708000033
Figure 2022535708000034
Figure 2022535708000035
Figure 2022535708000036
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡ配列における任意の可能な位置に結合されてもよく、例えば、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合されてもよく、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の端部に結合される。前記端部とは、前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を放出し、Ｃ５ ｍＲＮＡがタンパク質を翻訳する過程を遮断し、補体タンパクＣ５の遺伝子発現を抑制することができる。
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド上の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子に結合され（このとき、Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡに含まれるリン酸基のＰ原子と見なすこともできる）、或いは、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖における１つのヌクレオチドの２’－ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合される。
本開示の発明者は、本開示のｓｉＲＮＡ複合体が、血漿中安定性が顕著に向上し、オフターゲット効果が低減され、高いＣ５ ｍＲＮＡサイレンシング活性をさらに示すことを、意外にも見出した。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、表１ａ～１ｆに示されるｓｉＲＮＡの１つであってもよい。これらのｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ複合体は、より高いＣ５ ｍＲＮＡサイレンシング活性を示す。
Figure 2022535708000037
Figure 2022535708000038
Figure 2022535708000039
Figure 2022535708000040
Figure 2022535708000041
Figure 2022535708000042
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体において、各隣接するヌクレオチド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合により結合され、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、負電荷を帯び、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基（Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐ）として存在してもよく、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基における水素イオンは、一部又は全部がカチオンで置換されてもよい。前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アンモニウムイオンＮＨ４ ＋、有機アンモニウムカチオンの１つであってもよい。溶解性の向上を考慮し、１つの実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択される１種又は複数種である。アルカリ金属イオンは、Ｋ＋及び／又はＮａ＋であってもよく、第３級アミンにより形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン、及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンであってもよい。したがって、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、少なくとも一部が塩として存在してもよい。１つの態様において、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナトリウムイオンに結合され、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体は、ナトリウム塩又は部分ナトリウム塩として存在する。
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方法により調製されてもよい。
＜式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を調製してもよい。
いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、以下の方法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行うことを含み、前記ｓｉＲＮＡは、上記本開示のｓｉＲＮＡである。
また、当該方法は、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分子とも呼ばれる。
Figure 2022535708000043
 式中、
Ｒ４は、式（３０８）に示される化合物におけるＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合可能な基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、共有結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合可能な基である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、反応を経てリン酸ジエステル結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡの任意の官能基に複合可能な基であり、
各Ｓ１は、独立してＭ１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ－基で置換された基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｍ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
Ｒ４は、窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４には、Ｒ２リンカー基又は保護されたＲ２リンカー基、及び反応させることによりｓｉＲＮＡとＡ５９に示される構造を形成することができる官能基が含まれる。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡ又はヌクレオシドモノマー上の基と亜リン酸エステルを形成することができる第１の官能基と、ヒドロキシ基又はアミノ基と反応させて共有結合を形成することができる第２の官能基又は前記共有結合により結合された固相担体とを含む。いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボキシ基又はカルボン酸塩である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、共有結合を介して分子の他の部分に結合される固相担体であり、前記共有結合は、ヒドロキシ基又はアミノ基により形成されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹脂である。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基、－ＯＲｋ又は式（Ｃ３）に示される基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を含む。
Figure 2022535708000044
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 2022535708000045
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、式（Ｃ３）に示されるように、ホスホルアミダイト基を含み、当該ホスホルアミダイト基は、ヌクレオチド上の任意位置のヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリング反応させて亜リン酸エステルを形成し、酸化又は硫化されて式Ａ５９に示されるリン酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、複合分子をｓｉＲＮＡに複合することができる。この場合、前記第２の官能基が存在しなくても、式（３２１）の化合物は、ヌクレオチドに複合することができ、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の取得に影響することはない。この場合に、ホスホルアミダイト固相合成等の方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得た後、式（３２１）の化合物と、ヌクレオチド配列において末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基を反応させ、後の酸化又は硫化過程においてリン酸ジエステル結合による結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、式（３２１）の化合物をｓｉＲＮＡに複合させる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、固相担体と反応できる基を含み、前記反応により固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホスホルアミダイトを含む。前記第２の官能基がカルボキシ基又はカルボン酸塩を含む場合、式（３２１）の化合物と固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基又はアミノ基をエステル化反応又はアミド化反応させ、カルボン酸エステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。前記第２の官能基がホスホルアミダイト官能基を含む場合、式（３２１）の化合物と汎用の固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基をカップリング反応させ、酸化されてリン酸ジエステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。その後、上記固相担体が結合された生成物を出発とし、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。ホスホルアミダイト固相合成過程において、前記第１の官能基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件下でヌクレオシドモノマーにおけるホスホルアミダイト基とカップリングさせる。
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示されるように、カルボン酸エステル結合により結合された固相担体又はアミド結合により結合された固相担体、又はリン酸エステル結合により結合された固相担体を含む。この場合、出発として固相担体の代わりに式（３２１）の化合物を用い、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。
いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、－ＣＯＯ－Ｍ＋で表されてもよく、ここで、Ｍ＋はカチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ４ ＋、有機アンモニウムカチオンから選択される１つである。１つの実施形態において、前記金属イオンは、アルカリ金属イオンから選択される１つであり、例えば、Ｋ＋又はＮａ＋である。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行うことを考慮して、いくつかの実施形態において、有機アンモニウムイオンは、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を含む。
Figure 2022535708000046
 式中、ｑ１は１～４の整数であり、ｑ２は１～１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
Figure 2022535708000047
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。いくつかの実施形態において、ｑ１は１又は２である。いくつかの実施形態において、ｑ２は１～５の整数である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される構造を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４－メトキシトリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’－ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，４’’－トリメトキシトリチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態において、Ｒｋは、ＤＭＴｒ、即ち、４，４’－ビスメトキシトリチル（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。
Ｌ１の定義は、前述したとおりである。
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｍ１標的基を窒素含有骨格上のＮ原子に結合し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供するために用いられる。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、式（Ａ１）～式（Ａ２６）のいずれか１つ又はその組合せを含む。
上記記載により、当業者であれば容易に理解できるように、本分野で公知のホスホルアミダイト固相合成方法と比較して、上記第１の官能基及び任意の第２の官能基により、複合分子がヌクレオチド配列の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列の端部、ヌクレオチド配列の末端に結合された、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。これに応じて、特に説明がない限り、以下にｓｉＲＮＡ複合体及び／又は複合分子の調製に関する記載において、「脱保護」、「カップリング」、「キャッピング」、「酸化」、「硫化」等の反応に言及する場合、本分野で公知のホスホルアミダイト核酸の固相合成方法に係る反応条件と試薬もまた同様にこれらの反応に適用されると理解すべきである。例示的な反応条件と試薬は、以下に詳細に説明する。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１において少なくとも１つの活性ヒドロキシ基がヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１に存在する活性ヒドロキシ基が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、当業者に既知のあらゆるヒドロキシ保護基を、Ｍ１における活性ヒドロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態において、保護されたヒドロキシ基は、式ＹＣＯＯ－で表されてもよく、各Ｙは、独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基及びＣ６－Ｃ１０アリール基からなる群から選択され、前記Ｃ１－Ｃ１０アルキル基及びＣ６－Ｃ１０アリール基は、１又は複数の置換基で任意に置換され、前記置換基は、ハロゲン及びＣ１－Ｃ６アルキル基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、各Ｙは、独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１－Ｃ６アルキルフェニル基からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、それぞれ独立して式Ａ４６～Ａ５４からなる群から選択される。
Figure 2022535708000048
いくつかの実施形態において、Ｓ１は式Ａ４９又はＡ５０である。
いくつかの実施形態において、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
前述したように、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、ｓｉＲＮＡの他方の鎖を合成し（例えば、上記工程で、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成した場合、固相合成方法に従いｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成することをさらに含み、その逆も同様である）、センス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、かつ、アニールを行う工程をさらに含む。具体的には、単離工程において、ヌクレオチド配列及び／又は複合分子に結合される固相担体が切断されるとともに、必要な保護基が除去され（この場合、式（３２１）の化合物における各Ｓ１基が、対応するＭ１標的基に変換される）、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖（又はアンチセンス鎖）及び対応するアンチセンス鎖（又はセンス鎖）が得られ、センス鎖とアンチセンス鎖をアニールして二本鎖ＲＮＡ構造を形成し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得る。
いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’端の１番目のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２１）に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、所望のセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、式（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基を含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる化合物であり、１番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式（３２１）の化合物を脱保護し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、複合基が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程；ホスホルアミダイト固相合成の条件で、アンチセンス鎖又はセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、核酸のアンチセンス鎖又はセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製してセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
いくつかの実施形態において、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、当該二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、センス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程；カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ４にホスホルアミダイト基である第１の官能基が含まれる式（３２１）の化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させ、保護基を除去して固相担体から切断し、それぞれ単離精製し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の３’末端に結合され、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、
（１）式（３２１）の化合物（式（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基ＯＲｋを含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる化合物である）におけるヒドロキシ保護基Ｒｋを除去し、カップリング反応条件及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
（２）当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’の方向に、ホスホルアミダイト固相合成方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成すること、
（４）ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることを含む。
工程（１）において、上記式（３２１）の化合物における保護基Ｒｋを除去する方法は、脱保護条件で、式（３２１）の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、いくつかの実施形態では５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態ではジクロロ酢酸である。脱保護試薬と式（３２１）の化合物とのモル比は１０：１～１０００：１であり、いくつかの実施形態では５０：１～５００：１である。
前記カップリング反応条件とカップリング試薬は、上記カップリング反応に適した任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件は、反応温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃である。式（３２１）の化合物とヌクレオシドモノマーとのモル比は１：１～１：５０であり、いくつかの実施形態では１：２～１：５である。式（３２１）の化合物とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態では１：３～１：１０であり、反応時間は２００～３０００秒、いくつかの実施形態では５００～１５００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態では５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態では無水アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３～５０Ｌ／ｍｏｌ、いくつかの実施形態では５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製された複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’－５’の方向に、ｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖ＳＳを合成する。この場合、複合基は、得られたセンス鎖の３’末端に結合される。
工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件は、ヌクレオシドモノマーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応の条件、酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬の種類と用量を含み、本分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。
例えば、いくつかの実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成では、以下の条件を用いてもよい。
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、いくつかの実施形態では５０～１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態ではジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比は２：１～１００：１であってもよく、いくつかの実施形態では３：１～５０：１である。
カップリング反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比は１：１～１：５０であってもよく、いくつかの実施形態では１：５～１：１５であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：１００、いくつかの実施形態では１：５０～１：８０であり、反応時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
キャッピング反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒、いくつかの実施形態では１０～１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１：１００～１００：１、いくつかの実施形態では１：１０～１０：１である。キャッピング試薬として等モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる場合、酢酸無水物、Ｎ－メチルイミダゾール、固相担体に結合される核酸配列のモル比は１：１：１０～１０：１０：１であってもよく、いくつかの実施形態では１：１：２～２：２：１である。
酸化反応の条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が１～１００秒、いくつかの実施形態では５～５０秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態ではヨウ素である（いくつかの実施形態ではヨウ素水として提供する）。酸化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は、１：１～１００：１であってもよく、いくつかの実施形態では５：１～５０：１である。いくつかの実施形態では、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行われる。硫化反応条件は、温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が５０～２０００秒、いくつかの実施形態では１００～１０００秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態ではキサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１０：１～１０００：１であり、いくつかの実施形態では１０：１～５００：１である。いくつかの実施形態では、前記硫化反応は、アセトニトリル：ピリジン＝１：３～３：１の混合溶剤で行われる。
全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前に、当該方法は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去するには、ｓｉＲＮＡ合成において通常の切断と脱保護方法により行われてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６～Ａ５４基の保護基ＹＣＯＯ－をヒドロキシ基に変換させ、Ｓ１基を対応するＭ１基に変換させ、式（３０８）に示される複合体を生成する。ここで、前記濃アンモニア水は、２５～３０重量％のアンモニア水であってもよく、濃アンモニア水の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ～０．８ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。
合成されたヌクレオチド配列に少なくとも１つの２’－ＴＢＤＭＳ保護がある場合、前記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩と接触させることにより、当該２’－ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。この場合、得られた目的とするｓｉＲＮＡ配列における対応するヌクレオチドには、遊離の２’－ヒドロキシ基を有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ～１．０ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。このように式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマトグラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製を完了し、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩することができる。
このように得られた式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体において、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、基本的にナトリウムイオンに結合されており、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体は、基本的にナトリウム塩として存在する。よく知られたイオン交換方法により、水素イオン及び／又は他のカチオンで前記ナトリウムイオンを置換し、他の形式の式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。前記カチオンは、前述したとおりである。
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御することができる。このような検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を測定することができる。
アニール方法も、当業者によく知られているものである。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（ＳＳ鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０～９５℃に加熱し、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このように式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
前記複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等により合成された式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の特徴を明らかにし、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、目的設計の式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体であるとともに、合成されたｓｉＲＮＡの配列が、所望のｓｉＲＮＡの配列、例えば表１ａ～１ｆに示される配列の１つであると確認することもできる。
式（３２１）に示される化合物は、有機溶剤において、エステル化反応条件下及び塩基とエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
Figure 2022535708000049
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりであり、
Ｒ６は、式（３２１）におけるＲ４を提供する基である。いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。
Figure 2022535708000050
 式中、Ｒｉは、窒素含有骨格上のＮ原子との結合を実現できる、ＲｋＯと結合して１つの遊離ヒドロキシ基が結合されている任意の基であり、Ｒｋはヒドロキシ保護基である。この場合、Ｒ４にヒドロキシ保護基としての第１の官能基と第２の官能基が含まれ、前記第２の官能基が式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
前記エステル化反応条件は、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が８～４８時間であり、いくつかの実施形態において、前記エステル化反応条件は、反応温度が１０～４０℃であり、反応時間が２０～３０時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種を含む。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、いくつかの実施形態において、コハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例えば、当該触媒は、４－ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、前記塩基は、例えば、第３級アミンであってもよい。いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミンと式（３１３）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～１０：１である。
前記イオン交換作用は、式（３２１）の化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の形式に変換することであり、イオン交換方法は、当業者に公知である。適切なイオン交換溶液と交換条件を用いて、Ｍ＋カチオンを有する複合分子を得ることができるが、ここでは詳しい説明を省略する。いくつかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用いて行われ、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度は０．２～０．８Ｍであり、いくつかの実施形態においては、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度は０．４～０．６Ｍであり、式（３１３）の化合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量は３～６Ｌ／ｍｏｌであり、更なる実施形態においては４～５Ｌ／ｍｏｌである。
任意の適切な単離方法によって、反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３２１）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出すること、又は、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、縮合反応条件下で、有機溶剤において、縮合剤、縮合触媒及び第３級アミンの存在下で、上記イオン交換反応により得られた生成物を、さらにアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ１’）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
前記固相担体は、ｓｉＲＮＡの固相合成に用いられる担体の１つであり、そのうちのいくつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ官能基を含む固相担体から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、前記固相担体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。いくつかの実施形態において、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径１００～４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２～０．５ｍｍｏｌ／ｇというパラメーターを有する。前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は１０～４００μｍｏｌ化合物／グラムの固相担体（μｍｏｌ／ｇ）である。いくつかの実施形態において、前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比は５０～２００μｍｏｌ／ｇである。
前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は２０～２００Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５０～１００Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ－ｏｘｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰｙＢｏｐ）、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（３－（Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）－１，２，３－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎ－４（３Ｈ）－ｏｎｅ、ＤＥＰＢＴ）及び／又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（Ｏ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であってもよく、いくつかの実施形態において、前記縮合剤は、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルである。前記縮合剤と式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、他の実施形態において１：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン及び／又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミンと式（３２１）に示される化合物とのモル比は１：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、１：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、キャッピング反応条件下で、有機溶剤において、得られた縮合生成物をキャッピング試薬及びアシル化触媒と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含んでもよい。前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるために、まだ完全に反応していないあらゆる活性反応官能基を除去することである。前記キャッピング反応の条件は、反応温度が０～５０℃、いくつかの実施形態では１５～３５℃であり、反応時間が１～１０ｈ、いくつかの実施形態では３～６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、ｓｉＲＮＡ固相合成に用いられるキャッピング試薬を用いてもよい。
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬１（ｃａｐ１）及びキャッピング試薬２（ｃａｐ２）からなり、キャッピング試薬１は、Ｎ－メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比は１：１０～１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３～１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ－メチルイミダゾールとの体積比は１：１～１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１～７：１である。前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物である。いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積比が１：１～１：１０であり、更なる実施形態において１：２～１：６である。
いくつかの実施形態において、前記Ｎ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比は５ｍｌ／ｇ～５０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態では１５ｍｌ／ｇ～３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物のアセトニトリル溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比は０．５ｍｌ／ｇ～１０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態では１ｍｌ／ｇ～５ｍｌ／ｇである。
いくつかの実施形態において、キャッピング試薬としては、等モル量の酢酸無水物とＮ－メチルイミダゾールを用いる。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は１０～５０Ｌ／ｍｏｌ、いくつかの実施形態では５～３０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、エステル化縮合又はアミド化縮合に使用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、４－ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と式（３２１）に示される化合物との質量比は０．００１：１～１：１であり、いくつかの実施形態では０．０１：１～０．１：１である。
いくつかの実施形態において、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することにより、式（３２１）の化合物を得ることができる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノールから選択され、いくつかの実施形態において、アセトニトリルである。
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶剤において、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３１３）に示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ３）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、カップリング反応条件は、温度が０～５０℃であってもよく、例えば１５～３５℃である。式（３１３）の化合物とホスホルジアミダイトとのモル比は１：１～１：５０であってもよく、例えば１：５～１：１５であり、式（３１３）の化合物とカップリング試薬とのモル比は１：１～１：１００であってもよく、例えば１：５０～１：８０である。反応時間は２００～３０００秒であってもよく、例えば５００～１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）（２－シアノエトキシ）ホスフィンを用いてもよく、市販品を購入してもよく、又は本分野で公知の方法により合成されてもよい。カップリング試薬は、１Ｈ－テトラゾール、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾール、５－ベンジルチオ１Ｈ－テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、例えば、５－エチルチオ１Ｈ－テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、例えば無水アセトニトリルである。いくつかの実施形態において、式（３１３）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、例えば、５～２０Ｌ／ｍｏｌであってもよい。当該カップリング反応を行うことにより、式（３１３）の化合物におけるヒドロキシ基とホスホルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、カップリング反応条件下で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離して得られた生成物を、さらにヒドロキシ基含有固相担体と接触させる工程をさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）の化合物を得る。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ３’）に示される構造を有する式（３２１）の化合物が得られる。
いくつかの実施形態において、前記固相担体は、本分野で公知の核酸固相合成に使用できる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ３００ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、構造が式Ｂ８０に示される）であってもよい。
Figure 2022535708000051
脱保護反応は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件は、温度が０～５０℃、例えば１５～３５℃であり、反応時間が３０～３００秒、例えば５０～１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固定相における－ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１～１００：１であり、例えば３：１～５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、次のカップリング反応を行いやすくする。
カップリング反応条件及びカップリング試薬の選択は、以上のとおりである。当該カップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルアミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件は、温度が０～５０℃、例えば１５～３５℃であり、反応時間が５～５００秒、例えば１０～１００秒であり、前記キャッピング反応をキャッピング試薬の存在下で行う。キャッピング試薬の選択と用量は、以上のとおりである。
酸化反応の条件は、温度が０～５０℃、例えば１５～３５℃であってもよく、反応時間が１～１００秒、例えば５～５０秒であってもよく、酸化試薬は、例えばヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態ではヨウ素水として提供する）。いくつかの実施形態では、酸化試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１：１～１００：１であり、例えば、５：１～５０：１であってもよい。いくつかの実施形態では、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１～１：１：３の混合溶剤で行われる。
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式Ｂ７又はＢ８の基の１つである。
Figure 2022535708000052
 式中、ｑ２、Ｒｋの定義は、前述したとおりである。
この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下及びアミド化反応縮合剤と第３級アミンの存在下で、式（３１４）に示される化合物を式（Ａ－１）に示される化合物又は式（Ａ－２）の化合物と接触させ、その後単離する、という調製方法により得ることができる。
Figure 2022535708000053
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
前記アミド化反応条件は、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が１～４８時間であってもよく、いくつかの実施形態では、前記アミド化反応条件は、反応温度が１０～４０℃、反応時間が２～１６時間である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール類溶剤、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記アルコール類溶剤は、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール、プロパノールの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、エタノールである。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランである。前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１４）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、更なる実施形態において３～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩（４－（４，６－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルであり、更なる実施形態において、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３１４）に示される化合物とのモル比が１：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１～５：１である。
いくつかの実施形態において、前記第３級アミンは、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、更なる実施形態において、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミンと式（３１４）に示される化合物とのモル比が３：１～２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１～１０：１である。
いくつかの実施形態において、式（Ａ－１）及び式（Ａ－２）の化合物は、任意の適当な方法により調製されてもよい。例えば、ＲｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応させて式（Ａ－１）の化合物を調製することができる。同様に、３－アミノ－１，２－プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒＣｌと反応させて式（Ａ－２）の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭素原子数４～１３、いくつかの実施形態において４～８の環状酸無水物であってもよい。当業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ－２）の化合物におけるｑ２の異なる値に対応しており、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場合、ｑ２＝１であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ２＝２であり、類推してもよい。
いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３－アミノ－１，２－プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（３１３）の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、これらの変形は、式（３１３）の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当業者が上記方法により容易に実現するものである。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１３）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出すること、及び、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３１３）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
いくつかの実施形態において、式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級アミンの存在下で、縮合反応条件下で、式（３２０）に示される化合物を式（３１６）に示される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
Figure 2022535708000054
 式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
式（３１６）化合物としては、例えば、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１４，１３６，１６９５８－１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、或いは、式（３１６）化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、米国特許ＵＳ ８，１０６，０２２ Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６）の化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件は、反応温度が０～１００℃であり、反応時間が０．１～２４時間であり、いくつかの実施形態では、反応温度が１０～４０℃であり、反応時間が０．５～１６時間である。
所望の生成物である式（３１４）の化合物の構造を考慮すると、前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３２０）に示される化合物とのモル比は、式（３２０）におけるｎ１とｎ３の和に基づいて決定されるべきである。いくつかの実施形態において、例えば、ｎ１＋ｎ３＝３の場合、反応が完全であり、過剰ではないことを確保するために、式（３１６）に示される化合物と前記式（３２０）に示される化合物とのモル比が３：１～３．５：１であってもよく、いくつかの実施形態において、３．０１：１～３．１５：１である。
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であり、前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２－ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３２０）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量は３～５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５～２０Ｌ／ｍｏｌである。
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル、４－（４，６－ジメトキシトリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリン塩酸塩又は１－ヒドロキシベンゾトリアゾールの１種又は複数種であり、更なる実施形態において、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物であり、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステルと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールが等モル量で使用される。前記全アミド化反応縮合剤と式（３１６）に示される化合物とのモル比は１：１～３：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１．０５：１～１．５：１である。
前記第３級アミンは、Ｎ－メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであってもよく、いくつかの実施形態において、Ｎ－メチルモルホリンであり、前記第３級アミンと式（３１６）に示される化合物とのモル比は２：１～１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２：１～５：１である。
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１４）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００～３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５～１００：７で勾配溶出すること、及び、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１～１：０．１で勾配溶出することという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接除去して式（３１４）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
式（３２０）化合物は、市販品として購入して、又は、当業者により既知の方法を用いて得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、各Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５がいずれもＨである場合、式（３２０）化合物は、アルファ・エイサー社から市販品として購入することができる。
本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、薬学的に許容できる他の添加剤と併用してもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよく、詳細は、上述した本開示の薬物組成物に関する記載を参照のこと。
＜本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の使用＞
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、重症筋無力症の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用を提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む重症筋無力症の予防及び／又は治療方法を提供する。
本開示のｓｉＲＮＡ活性成分を、それを必要とする被験体に投与することにより、ＲＮＡ干渉のメカニズムによって重症筋無力症を予防及び／又は治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体は、重症筋無力症の予防及び／又は治療に用いられ、又は重症筋無力症の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることができる。
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化して所望の効果を生じさせる方法又は経路により、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を被験体の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により、被験体の体循環よりも多くのｓｉＲＮＡ複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体が被験体の基本的な体循環に送達される。本開示が重症筋無力症の予防及び／又は治療手段を提供できるようにすることを考慮すると、いくつかの実施形態において、薬物を肝臓に送達することができる投与方法を採用する。
本分野で既知の任意の適切な経路で被験体に投与することができ、前記経路としては、経口投与又は胃腸外経路、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口腔内投与と舌下投与を含む）を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、半年又は１年に１回又は複数回であってもよい。
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に被験体の年齢、体重及び性別により決定してもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ５０（５０％の群体を死亡させる用量）、ＥＤ５０（定量的反応において、５０％の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％の実験対象に陽性反応が発生する場合の用量を指す）又はＩＣ５０（定量的反応が半分抑制される時の阻害剤／薬物の濃度）を測定してもよい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいて、ヒト用量の範囲を得ることができる。
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ、薬物組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６～１２週齢、体重１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して、ｓｉＲＮＡの量として、（ｉ）ｓｉＲＮＡ複合体について、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態では０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態では０．０５～２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、さらにいくつかの実施形態においては０．１～１５ｍｇ／ｋｇ体重であり、さらにいくつかの実施形態においては０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物について、そのｓｉＲＮＡ用量は０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、いくつかの実施形態では０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態では０．０５～５ｍｇ／ｋｇ体重であり、いくつかの実施形態では０．１～３ｍｇ／ｋｇ体重である。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を肝細胞と接触させ、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を前記肝細胞に導入し、ＲＮＡ干渉のメカニズムによって肝細胞におけるＣ５遺伝子の発現を抑制する目的を達成することを含む、前記肝細胞におけるＣ５遺伝子の発現の抑制方法を提供する。前記肝細胞は、ＳＭＭＣ－７７２１、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７等の肝がん細胞系又は単離した初代肝細胞から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ＨｅｐＧ２肝がん細胞である。
本開示により提供される方法により細胞におけるＣ５遺伝子の発現を抑制する。提供される修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡ用量は、一般的に、標的遺伝子の発現を低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ～１μＭ、又は０．０１ｎＭ～１００ｎＭ、又は０．０５ｎＭ～５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ～約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達経路（局所か全身か）等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
＜キット＞
本開示は、本開示の修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及びｓｉＲＮＡ複合体の少なくとも１種の有効量を含むキットを提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、容器で修飾ｓｉＲＮＡを提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、薬学的に許容できる賦形剤を提供する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等が含まれてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、本明細書に記載された修飾ｓｉＲＮＡを提供する容器とは別の容器で少なくとも１種の他の治療剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットは、修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合するための説明書を含んでもよい。
本開示のキットにおいて、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体、及び／又は薬学的に許容できる添加剤は、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記薬物組成物、及び／又はｓｉＲＮＡ複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供することができる。
以下に実施例により本開示をさらに説明するが、本開示は、これによって何ら制限されない。
特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を参照して行われる。
本開示により合成されたＣ５遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体又は陰性対照であるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ複合体で細胞をトランスフェクションした場合、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、具体的な操作については、メーカーにより提供される説明書を参照のこと。
別に説明がない限り、以下で提供される試薬割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として計算される。
実験データは、いずれも
Figure 2022535708000055
 で表され、データ分析では、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ５．０統計分析ソフトウェアを採用した。
（調製例１）複合体１の調製
本調製例で、複合体１（即ち、Ｌ１０－ｓｉＣ５ａ１Ｍ１ＳＰ）を合成した。当該複合体に複合されたｓｉＲＮＡは、表３における複合体１に対応するセンス鎖とアンチセンス鎖配列を有する。
（１－１）Ｌ－１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｌ－１０化合物を合成した。
Figure 2022535708000056
（１－１－１）複合末端セグメントＧＡＬ－５の合成
Figure 2022535708000057
（１－１－１ａ）ＧＡＬ－２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ－１（Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：１７７２－０３－８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ－２を得た。
（１－１－１ｂ）ＧＡＬ－３の合成
工程（１－１－１ａ）で得られたＧＡＬ－２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を２１３ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴及び窒素保護条件で、２４．０ｇのトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ、ＣＡＳ番号：２７６０７－７７－８、マックリン社から購入、１０８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。
反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタンにより１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状製品ＧＡＬ－３を得た。
（１－１－１ｃ）ＧＡＬ－４の合成
工程（１－１－１ｂ）で得られたＧＡＬ－３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３６ｍｌの無水１，２－ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、９．０ｇの５－ヘキセン－１－オール（ＣＡＳ番号：８２１－４１－０、Ａｄａｍａｓ－ｂｅｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴及び窒素保護下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、３００ｍｌのジクロロエタンで水相を１回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ－４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
（１－１－１ｄ）ＧＡＬ－５の合成
工程（１－１－１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ－４（１４．９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：７７９０－２８－５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８－６７－０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで、１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨てた。固形クエン酸で水相のｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで、１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．８５ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ－５を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ １２．０１ （ｂｒ，１Ｈ），７．８３ （ｄ，Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ，１Ｈ），５．２１ （ｄ，Ｊ ＝ ３．２ Ｈｚ，１Ｈ），４．９６ （ｄｄ，Ｊ ＝ １１．２，３．２ Ｈｚ，１Ｈ），４．４９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ，１Ｈ），４．０７ー３．９５ （ｍ，３Ｈ），３．９２ー３．８５ （ｍ，１Ｈ），３．７４ー３．６７ （ｍ，１Ｈ），３．４８ー３．３９ （ｍ，１Ｈ），２．２０ （ｔ，Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ，２Ｈ），２．１１ （ｓ，３Ｈ），２．００ （ｓ，３Ｈ），１．９０ （ｓ，３Ｈ），１．７７ （ｓ，３Ｈ），１．５５ー１．４５ （ｍ，４Ｈ）．
（１－１－２）Ｌ－８の合成
Figure 2022535708000058
Ｊ－０（９．８８６ｇ、５２．５ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）と工程（１－１－１）で得られたＧＡＬ－５（７２．８１９ｇ、１６２．７５ｍｍｏｌ、複数のロットの製品を組み合わせた）を５２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、４４．７８２ｇ、３４６．５０ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（ＰｙＢＯＰ、９０．１５８ｇ、１７３．２５ｍｍｏｌ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、２３．４１０ｇ、１７３．２５ｍｍｏｌ）を加え、室温で４ｈ反応させ、２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム及び２００ｍｌの飽和食塩水を加えて洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり１００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：２５～１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３８．８ｇの純粋なＬ－８を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ ７．８４ （ｄ，Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ，３Ｈ），７．２７ー７．２３ （ｍ，１Ｈ），７．１３ー７．１８ （ｍ，１Ｈ），５．２２ （ｄ，Ｊ ＝ ３．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．９７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １１．３，３．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．４８ （ｄ，Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ，３Ｈ），４．０９ー３．９８ （ｍ，９Ｈ），３．８８ （ｄｄ，Ｊ ＝ １９．３，９．３ Ｈｚ，３Ｈ），３．７５ー３．６６ （ｍ，３Ｈ），３．４４ー３．３８ （ｍ，３Ｈ），３．１７ー３．３０ （ｍ，４Ｈ），３．１０ー２．９７ （ｍ，４Ｈ），２．３５ー２．２０ （ｍ，６Ｈ），２．１５ー２．０８ （ｍ，９Ｈ），２．０７ー１．９８ （ｍ，１３Ｈ），１．９４ー１．８７ （ｍ，９Ｈ），１．８１ー１．７４ （ｍ，９Ｈ），１．６５ー１．４２ （ｍ，１８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０、［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。
（１－１－３ａ）Ａ－１の合成
Figure 2022535708000059
ＤＭＴｒＣｌ（４，４’－ビスメトキシトリチルクロリド、１０１．６５ｇ、３００ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ－グリセリン酸カルシウム水和物（２８．６３ｇ、１００ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２０ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を乾燥まで減圧濃縮し、残りを５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐＨ＝７～８）で、１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００～３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５～１：１：１：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、６００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１回洗浄し、水相を２００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩減圧し、５０．７ｇの白色固形製品Ａ－１を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ７．４６ （ｄｄｄ，Ｊ ＝ ６．５，２．３，１．１ Ｈｚ，１Ｈ），７．４０ー７．２８ （ｍ，７Ｈ），６．８９ー６．８１ （ｍ，４Ｈ），４．８４ （ｄ，Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．３６ー４．２４ （ｍ，１Ｈ），４．２９ （ｓ，６Ｈ），３．９２ （ｄｄ，Ｊ ＝ １２．４，７．０ Ｈｚ，１Ｈ），３．６７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １２．３，７．０ Ｈｚ，１Ｈ），２．５２ （ｑ，Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ，６Ｈ），１．０３ （ｔ，Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ，９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ２３Ｏ６、［Ｍ－Ｈ］－、理論値：４０７．１５、実測値：４０６．９２。
（１－１－３ｂ）Ｌ－７の合成
Figure 2022535708000060
工程（１－１－２）で得られたＬ－８（４０ｇ、２７．０９ｍｍｏｌ、複数のロットの製品を組み合わせた）と工程（１－１－３ａ）で得られたＡ－１（４１．４１８ｇ、８１．２７ｍｍｏｌ）とを混合し、２７１ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３－ジエトキシホスホリル－１，２，３－ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）（２４．３１８ｇ、８１．３７ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（２１．００７ｇ、１６２．５４ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１．５ｈ攪拌反応させ、８００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、１５０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相を５０ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、粗製品を得た。カラム精製には、２ｋｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２００ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５～１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して４０．４ｇの純粋なＬ－７を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ７．９０ー７．７８ （ｍ，４Ｈ），７．７５ー７．６４ （ｍ，１Ｈ），７．３８ー７．１８ （ｍ，９Ｈ），６．９１ー６．８３ （ｍ，４Ｈ），５．２５ー５．１０ （ｍ，４Ｈ），４．９７ （ｄｄ，Ｊ ＝ １１．２，３．２ Ｈｚ，３Ｈ），４．４８ー４．３０ （ｍ，４Ｈ），４．０２ （ｓ，９Ｈ），３．９３ー３．８４ （ｍ，３Ｈ），３．７６ー３．６６ （ｍ，９Ｈ），３．４５ー３．３５ （ｍ，３Ｈ），３．２４ー２．９８ （ｍ，１０Ｈ），２．３０ー２．２０ （ｍ，２Ｈ），２．１１ー１．８８ （ｍ，３１Ｈ），１．８０ー１．４０ （ｍ，２８Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９０Ｈ１２８Ｎ７Ｏ３５、［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。
（１－１－４）Ｌ－９の合成
Figure 2022535708000061
工程（１－１－３ｂ）で得られたＬ－７（４０ｇ、２１．４２４７ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（４．２８８ｇ、４２．８４９４ｍｍｏｌ）及び４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、５．２３５ｇ、４２．８４９４ｍｍｏｌ）を混合して２１５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１３．８４５ｇ、１０７．１２３５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌し、８００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで、１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１ｋｇの２００～３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８～１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３１．０ｇの純粋なＬ－９複合分子を得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ） δ ８．５８ （ｄ，Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ，１Ｈ），７．９４ー７．８２ （ｍ，３Ｈ），７．４１ー７．２９ （ｍ，５Ｈ），７．２２ （ｄ，Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ，５Ｈ），６．８９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ，４Ｈ），５．４９ー５．３７ （ｍ，１Ｈ），５．２１ （ｄ，Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ，３Ｈ），４．９７ （ｄ，Ｊ ＝ １１．１ Ｈｚ，３Ｈ），４．４９ （ｄ，Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ，３Ｈ），４．０２ （ｓ，９Ｈ），３．８８ （ｄｄ，Ｊ ＝ １９．４，９．４ Ｈｚ，３Ｈ），３．７７ー３．６５ （ｍ，９Ｈ），３．５０ー３．３９ （ｍ，６Ｈ），３．１１ー２．９０ （ｍ，５Ｈ），２．６１ー２．５４ （ｍ，４Ｈ），２．４７ー２．４１ （ｍ，２Ｈ），２．２６ー２．１７ （ｍ，２Ｈ），２．１５ー１．９５ （ｍ，２２Ｈ），１．９２ー１．８４ （ｍ，９Ｈ），１．８０ー１．７０ （ｍ，１０Ｈ），１．６５ー１．３５ （ｍ，１７Ｈ），１．３１ー１．１９ （ｍ，４Ｈ），０．９６ （ｔ，Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ，９Ｈ）． ＭＳ ｍ／ｚ：Ｃ９４Ｈ１３２Ｎ７Ｏ３８、［Ｍ－ＤＭＴｒ］＋、理論値：１６６４．７２、実測値：１６６５．０３。
（１－１－５）Ｌ－１０化合物の合成
Figure 2022535708000062
この工程において、Ｌ－９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ－１０化合物を調製した。
工程（１－１－４）で得られたＬ－９複合分子（２２．７５１ｇ、１１ｍｍｏｌ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／エステル（ＨＢＴＵ、６．２５７ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、２．８４３ｇ、２２ｍｍｏｌ）を混合し、９００ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、室温で５分間攪拌し、反応液にアミノメチル樹脂（８８ｇ、１００～２００メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購入）を加え、２５℃で、シェーカーで反応を行い、回転数１５０回転／分間、１８ｈ反応させた後に濾過し、ケーキをＤＣＭで、１回あたり３００ｍｌで２回リンスし、アセトニトリルで、１回あたり３００ｍｌで３回リンスし、真空油ポンプで１８ｈ乾燥させ、その後表２に示す配合割合に従い原料（ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリル）を加えてキャッピング反応を行った。２５℃で、シェーカーに静置し、回転数１５０回転／分間で５ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキをアセトニトリルで、１回あたり３００ｍｌで３回リンスし、乾燥まで溶剤を減圧蒸発させ、真空油ポンプで一晩減圧乾燥させ、１０２ｇ、担持量９０．８μｍｏｌ／ｇのＬ－１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ－９複合分子）を得た。
Figure 2022535708000063
 ここで、ＣａｐＡとＣａｐＢは、キャッピング試薬溶液であり、ＣａｐＡは、２０体積％のＮ－メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液であり、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が３：５であり、ＣａｐＢは、２０体積％酢酸無水物のアセトニトリル溶液である。
（１－２）複合体１のセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ－１０化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’－５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合し、表３における複合体１のセンス鎖ＳＳを合成した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。合成条件は、以下のように規定した。
ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各脱保護反応の条件は同じであり、即ち温度が２５℃、反応時間は７０秒とした。脱保護試薬は、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体における４，４’－ジメトキシトリチル保護基とのモル比は５：１である。
各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１０、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：６５、反応時間は６００秒とした。カップリング試薬は、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（５－（Ｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）－１Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｅ、ＥＴＴ）の０．５Ｍアセトニトリル溶液である。
各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃、反応時間は１５秒とした。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐＡとＣａｐＢの混合溶液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物：Ｎ－メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１である。
各酸化反応の条件は同じであり、温度が２５℃、反応時間は１５秒とし、酸化試薬は濃度０．０５Ｍのヨウ素水である。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は３０：１である。反応はテトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。
各硫化反応の条件は同じであり、温度が２５℃、反応時間は３００秒とし、硫化試薬はキサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比は１２０：１である。反応はアセトニトリル：ピリジン＝１：１の混合溶剤で行った。
最後のヌクレオシドモノマーの結合が完了した後、順に固相担体に結合される核酸配列に対して切断、脱保護、精製、脱塩を行い、その後、凍結乾燥してセンス鎖を得た。
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量は０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、残りの担体を濾過除去し、上清を乾燥まで真空濃縮した。
精製と脱塩の条件は以下のとおりである。分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完了した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０～５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）であり、脱イオン水で溶出した。
検出方法は以下のとおりである。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）を用いて上記センス鎖の純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析した。実測値は理論値に一致しており、３’末端にＬ－９複合分子が複合されたセンス鎖ＳＳが合成されたことを示した。
（１－３）複合体１のアンチセンス鎖の合成
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、表３における複合体１のアンチセンス鎖ＡＳを合成した。アンチセンス鎖に対しては、５’－末端の１番目のヌクレオチドに５’－リン酸を有するので、固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する過程において、アンチセンス鎖の最後のヌクレオシドモノマーを結合した後、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行ってＣＰＲ－Ｉモノマー（蘇州吉瑪、番号Ｃａｔ＃１３－２６０１－ＸＸ）をアンチセンス鎖の５’末端に結合し、５’－リン酸エステル修飾を形成したこと以外は、固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩の条件は、センス鎖の合成と同じとした。
Figure 2022535708000064
当該結合において用いられた脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応の条件、切断と脱保護、精製と脱塩の条件は、センス鎖の合成と同じである。その後、凍結乾燥してアンチセンス鎖を得た。イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）によりアンチセンス鎖の純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により分子量を分析した。その結果、実測値が理論値に一致しており、目的配列を有するアンチセンス鎖ＡＳが合成されたことを示した。
（１－４）複合体１の合成
センス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、４０ｍｇ／ｍＬの溶液を得、等モル比で混合し、５０℃で１５ｍｉｎ加熱し、室温で冷却した後、アニールを行った生成物を得、凍結乾燥させて、凍結乾燥粉末を得た。超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水装置、抵抗率１８．２ＭΩ＊ｃｍ（２５℃））を用いて複合体を濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるまで希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。実測値が理論値と一致しており、合成された複合体１が、Ｌ－９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。その構造は、式（４０３）に示され、複合されたｓｉＲＮＡ配列は、表３に示される複合体１（即ち、Ｌ１０－ｓｉＣ５ａ１Ｍ１ＳＰ）に対応する配列であった。
（調製例２）複合体２～８の調製
センス鎖とアンチセンス鎖の配列が、それぞれ表３に示される複合体２、複合体３、複合体４、複合体５又は複合体６に複合されたｓｉＲＮＡに対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の配列となるように合成したこと以外は、調製例１と同じ方法により、表３に示される複合体２～６を合成し、分子量検出を行った。それにより、それぞれ複合体２～６を得た。
センス鎖とアンチセンス鎖配列が、それぞれ表３に示される複合体７又は複合体８に複合されたｓｉＲＮＡに対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の配列となるように合成したこと以外は、調製例１と同じ方法により、表３に示される複合体７～８を合成し、分子量検出を行った。ただし、複合体７と複合体８のアンチセンス鎖は、複合体１のアンチセンス鎖と比較すると、５’－末端の１番目のヌクレオチドに５’－リン酸を有していない。したがって、固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する過程において、アンチセンス鎖の最後のヌクレオシドモノマーを結合した後、ＣＰＲ－Ｉモノマーを結合する必要がない。それにより、それぞれ複合体７～８を得た。
表３に複合体番号及びｓｉＲＮＡ配列組成を示した。
Figure 2022535708000065
(調製例３)ｓｉＲＮＡ配列の合成
下記の２点以外は、調製例１と同じ方法により、表４ａに示されるｓｉＲＮＡ１を合成した。
１）センス鎖に対しては、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させた。
２）アンチセンス鎖に対しては、ｓｉＲＮＡ１の配列が複合体１に複合されたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖配列と比べて、ｓｉＲＮＡ１の５’－末端の１番目のヌクレオチドに５’－リン酸がない。したがって、固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する過程において、アンチセンス鎖の最後のヌクレオシドモノマーを結合した後、ＣＰＲ－Ｉモノマーを結合する必要はない。
それにより、ｓｉＲＮＡ１を得た。
ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の配列が、それぞれ表４ａに示されるｓｉＲＮＡ２、ｓｉＲＮＡ３、ｓｉＲＮＡ４、ｓｉＲＮＡ５又はｓｉＲＮＡ６に対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の配列となるように合成したこと以外は、ｓｉＲＮＡ１の調製と同じ方法により、ｓｉＲＮＡ２～６を合成した。それにより、それぞれｓｉＲＮＡ２～６を得た。
表４ａにｓｉＲＮＡ番号及びｓｉＲＮＡ配列組成を示した。
Figure 2022535708000066
(調製例４)Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡ複合体及びＣｙ５標識ｓｉＲＮＡの合成
（４－１）Ｃｙ５－複合体１及びＣｙ５－複合体２の合成
調製例１と同じ方法により、表４ｂに示されるＣｙ５－複合体１を合成し、分子量検出を行ったが、以下の点が異なる。センス鎖とアンチセンス鎖の配列が、それぞれ表４ｂに示されるＣｙ５－複合体１に複合されたｓｉＲＮＡに対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の配列となるように合成した。ただし、（１）Ｃｙ５－複合体１に複合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端にＣｙ５蛍光基が共有結合的に結合されているため、調製例１の工程（１－２）に記載の固相ホスホルアミダイト法によりセンス鎖を調製する過程では、センス鎖の最後のヌクレオシドモノマーを結合した後、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行って、Ｃｙ５ホスホルアミダイトモノマー（上海兆維科技発展有限公司から購入、番号ＯＰ－０５７）をセンス鎖の５’末端に結合する必要がある。（２）Ｃｙ５－複合体１に複合されたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドに５’－リン酸がないため、調製例１の工程（１－３）に記載の固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する過程では、アンチセンス鎖の最後のヌクレオシドモノマーを結合した後、ＣＰＲ－Ｉモノマーを結合する必要がない。
Figure 2022535708000067
 Ｃｙ５ホスホルアミダイトモノマーをセンス鎖の５’末端に結合する過程において、用いられた脱保護、カップリング、キャッピング、酸化反応の条件は、１）脱保護反応時間を３００秒間まで延長したこと、２）Ｃｙ５カップリング反応時間を９００秒間まで延長したこと以外は、調製例１の工程（１－２）センス鎖の合成と同じである。
その後、以下の条件でセンス鎖に対して切断と脱保護を行った。合成された、担体が結合されたヌクレオチド配列をＡＭＡ溶液（４０ｗｔ％メチルアミン水溶液と２５ｗｔ％アンモニア水の体積比１：１の混合溶液）に加え、ＡＭＡ溶液の使用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、２５℃、水浴で２ｈ反応させ、残りの担体を濾過除去し、上清を乾燥まで真空濃縮した。センス鎖の精製と脱塩条件は、調製例１の工程（１－２）センス鎖の合成での精製と脱塩条件と同じである。その後、凍結乾燥し、Ｃｙ５－複合体１のセンス鎖を得た。
それにより、Ｃｙ５－複合体１が得られ、当該ｓｉＲＮＡ複合体は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端にＣｙ５蛍光基が共有結合的に結合され、表４ｂに示されるＣｙ５－複合体１に対応するセンス鎖とアンチセンス鎖配列を有する。
センス鎖とアンチセンス鎖配列が、それぞれ表４ｂに示されるＣｙ５－複合体２に複合されたｓｉＲＮＡに対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の配列となるように合成したこと以外は、Ｃｙ５－複合体１の調製と同じ方法によりＣｙ５－複合体２を調製し、分子量検出を行った。それによりＣｙ５－複合体２を得た。
（４－２）Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡ１とＣｙ５－ｓｉＲＮＡ２の合成
汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ ｌｏａｄｅｄ ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させたこと以外は、Ｃｙ５－複合体１の調製と同じ方法によりＣｙ５－ｓｉＲＮＡ１を調製し、分子量検出を行った。それによりＣｙ５－ｓｉＲＮＡ１を得た。
センス鎖とアンチセンス鎖配列が、それぞれ表４ｂに示されるＣｙ５－ｓｉＲＮＡ２に対応するセンス鎖とアンチセンス鎖の配列となるように合成したこと以外は、Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡ１の調製と同じ方法によりＣｙ５－ｓｉＲＮＡ２を調製し、分子量検出を行った。それによりＣｙ５－ｓｉＲＮＡ２を得た。
表４ｂにはＣｙ５－複合体１、Ｃｙ５－複合体２、Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡ１及びＣｙ５－ｓｉＲＮＡ２の番号とｓｉＲＮＡ配列が示された。
Figure 2022535708000068
(実験例１)ｓｉＲＮＡ複合体によるＨｅｐＧ２細胞におけるＣ５ ｍＲＮＡに対するＩＣ５０の測定
１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＲＭＢＩＯ公司）及び０．２体積％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ＨｙＣｌｏｎｅ社）を含むＨ－ＤＭＥＭ完全培地（ＨｙＣｌｏｎｅ社）でＨｅｐＧ２細胞（南京科佰生物科技有限公司から購入）を３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有細胞インキュベーターにおいて培養した。
ＨｅｐＧ２細胞を７×１０４細胞／ウェルで２４ウェルプレートに接種し、１６ｈ後に細胞成長密度が７０～８０％になったとき、培養ウェル中のＨ－ＤＭＥＭ完全培地を全て吸引除去し、１ウェルごとにＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）５００μｌを加えて培養を１．５ｈ継続した。
ＤＥＰＣ処理水により、複合体１、複合体２、複合体３、複合体４、複合体５、複合体６、複合体７及び複合体８から、濃度が２０μＭ、５μＭ、１．２５μＭ、０．３１３μＭ、０．０７８１μＭ、０．０１９５μＭ及び０．００４９μＭ（ｓｉＲＮＡの量として）である計７種の複合体希釈標準溶液をそれぞれ作製した。
各複合体に対して、それぞれＡ１～Ａ７溶液を作製し、各Ａ１～Ａ７溶液は、上記７種の濃度の複合体希釈標準溶液３μｌ及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地５０μｌを順に含む。
各複合体に対して、それぞれＢ溶液を作製し、各Ｂ溶液は、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ２０００を１μｌ及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を５０μｌ含む。
各複合体に対して、１つのＢ溶液と１つのＡ１～Ａ７溶液とを順に混合し、それぞれ室温で２０ｍｉｎ培養し、トランスフェクション複合体Ｘ１～Ｘ７を得た。各トランスフェクション複合体を２つ作製した。
１つのＢ溶液と５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地とを混合し、室温で２０ｍｉｎ培養し、トランスフェクション複合体Ｘ８を得た。当該トランスフェクション複合体を４つ作製した。
上記培養ＨｅｐＧ２細胞の培養ウェルに、仕込み量１００μｌ／ウェルで各複合体に対応するトランスフェクション複合体Ｘ１～Ｘ７をそれぞれ加え、均一に混合し、各複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡとして）がそれぞれ１００ｎＭ、２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１．５６ｎＭ、０．３９１ｎＭ、０．０９８ｎＭ及び０．０２４ｎＭであるトランスフェクション混合物を得た。濃度が同じ２つのトランスフェクション複合体Ｘ１～Ｘ７をそれぞれ異なる２つの培養ウェルに加え、複合体を含むトランスフェクション混合物を得、試験群１～７とした。
別の４つの培養ウェルに、仕込み量１００μｌ／ウェルで１つのトランスフェクション複合体Ｘ８をそれぞれ加え、複合体を含まないトランスフェクション混合物を得、対照群とした。
上記の複合体を含むトランスフェクション混合物と複合体を含まないトランスフェクション混合物を培養ウェルで細胞とともに４ｈ培養した後、１ウェルごとに２０％ＦＢＳ含有Ｈ－ＤＭＥＭ完全培地１ｍｌを追加した。２４ウェルプレートを５％ＣＯ２／９５％空気含有細胞インキュベーターに入れて細胞を２４ｈ継続培養した。
その後、ＲＮＡＶｚｏｌ（Ｖｉｇｏｒｏｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（北京）有限公司から購入、番号Ｎ００２）を用い、説明書における全ＲＮＡ抽出の操作工程に従って各ウェルの細胞における全ＲＮＡを抽出した。
各ウェルの細胞に対して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写のテンプレートとし、逆転写キットＧｏｌｄｅｎｓｔａｒＴＭ ＲＴ６ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（北京ケイ科新業生物技術有限公司から購入、番号ＴＳＫ３０１Ｍ）より提供される試薬から、ＧｏｌｄｅｎｓｔａｒＴＭ Ｏｌｉｇｏ （ｄＴ）１７を選択してプライマーとし、キットの説明書における逆転写操作工程に従って逆転写反応系を２０μｌ配置し、各ウェルの細胞の全ＲＮＡに対して逆転写を行った。逆転写の条件として、逆転写反応系を、５０℃で５０ｍｉｎ、次に８５℃で５ｍｉｎ、最後に４℃で３０ｓ培養し、反応が終了した後、逆転写反応系にＤＥＰＣ処理水を８０μｌ加え、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。
各逆転写反応系に対して、上記ｃＤＮＡを含む溶液５μｌをｑＰＣＲのテンプレートとし、ＮｏｖｏＳｔａｒｔ（登録商標） ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｐｌｕｓキット（近岸蛋白質科技有限公司から購入、番号Ｅ０９６－０１Ｂ）より提供される試薬を用いてｑＰＣＲ反応系を２０μｌ配置した。ここで、目的遺伝子Ｃ５及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅するためのＰＣＲプライマー配列を表５に示す。各プライマーの最終濃度は０．２５μＭであった。ｑＰＣＲ反応系をＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置に置き、三段法にて増幅を行い、増幅手順として、９５℃で１０ｍｉｎ予備変性、そして９５℃で３０ｓ変性、６０℃で３０ｓアニール、７２℃で３０ｓ伸長を行い、上記変性、アニール、伸長の過程を計４０回繰り返した後、増幅された目的遺伝子Ｃ５及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨを含む生成物Ｗを得た。そして、生成物Ｗを順に９５℃で１５ｓ、６０℃で１ｍｉｎ、９５℃で１５ｓ培養し、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ装置により、それぞれ生成物Ｗにおける目的遺伝子Ｃ５及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨの融解曲線を得、目的遺伝子Ｃ５及び内因性参照遺伝子ＧＡＰＤＨのＣｔ値を得た。
Figure 2022535708000069
比較Ｃｔ（ΔΔＣｔ）法を用い、各試験群及び対照群における目的遺伝子Ｃ５の発現量について相対定量計算を行い、計算方法は以下のとおりである。
ΔＣｔ（試験群）＝Ｃｔ（試験群の目的遺伝子）－Ｃｔ（試験群の内因性参照遺伝子）
ΔＣｔ（対照群）＝Ｃｔ（対照群の目的遺伝子）－Ｃｔ（対照群の内因性参照遺伝子）
ΔΔＣｔ（試験群）＝ΔＣｔ（試験群）－ΔＣｔ（対照群の平均）
ΔΔＣｔ（対照群）＝ΔＣｔ（対照群）－ΔＣｔ（対照群の平均）
ここで、ΔＣｔ（対照群の平均）は、対照群における４つの培養ウェルそれぞれのΔＣｔ（対照群）の算術平均である。したがって、各試験群の各培養ウェルはいずれも１つのΔΔＣｔ（試験群）に対応しており、対照群の各培養ウェルはいずれも１つのΔΔＣｔ（対照群）に対応している。
対照群を基準とし、試験群のＣ５ ｍＲＮＡの発現レベルを正規化し、対照群のＣ５ ｍＲＮＡの発現レベルを１００％と定義した。
試験群のＣ５ ｍＲＮＡの相対発現レベル＝２＾（－ΔΔＣｔ（試験群））×１００％である。
異なる複合体（複合体１～８）をトランスフェクションした後、ＨｅｐＧ２細胞におけるＣ５ ｍＲＮＡの相対発現レベルにしたがって、Ｇｒａｐｈｐａｄ ５．０ソフトウェアの非直線回帰分析機能によりｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ （ｔｈｒｅｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）用量－効果曲線をフィッティングし、図１Ａ～１Ｈに示される複合体１～８の用量－効果曲線を得た。ここで、ｓｉＲＮＡ複合体の最終濃度の対数値（ｌｇｎＭ）を横座標とし、Ｃ５ ｍＲＮＡの相対発現レベル（％）を縦座標とし、各黒丸は、対照群に対して、試験群の２つの培養ウェルにおけるＣ５ ｍＲＮＡの相対発現レベルの平均を表す。
フィッティングされた用量－効果曲線に対応する以下のような関数から、各複合体のＣ５ ｍＲＮＡに対するＩＣ５０値を算出した。
Figure 2022535708000070
 式中、
Ｙは、試験群のＣ５ ｍＲＮＡの相対発現レベルであり、
Ｘは、ｓｉＲＮＡ複合体の最終濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
Ｘ’は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合に対応するＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線のＸ’での傾きであり、ここでは－１と定義した。
当該用量－効果曲線及び対応する関数から、Ｙ＝５０％である場合に対応するＸ５０値を決定し、各複合体のＩＣ５０値＝１０＾Ｘ５０（ｎＭ）を算出した。
各複合体のＣ５ ｍＲＮＡに対するＩＣ５０値及びフィッティングされた曲線のＲ２値を表６にまとめた。
Figure 2022535708000071
図１Ａ～１Ｈ及び上記表６の結果から分かるように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、体外ＨｅｐＧ２肝がん細胞における抑制活性が高く、ＩＣ５０が１．４９４～９．６８８ｎＭであった。
(実験例２)ｓｉＲＮＡ複合体のＣ５７マウス各臓器での分布状況
１×ＰＢＳ溶液によりＣｙ５－ｓｉＲＮＡ１、Ｃｙ５－複合体１、Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡ２又はＣｙ５－複合体２をそれぞれ濃度０．６ｍｇ／ｍｌ（ｓｉＲＮＡとして）の溶液に溶解させた。
６～７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（北京維通利華実験動物技術有限公司から購入され、単にＣ５７マウスという）を１０匹選択し、２匹／群でランダムに分け、それぞれ１×ＰＢＳ及び上記の作製されたＣｙ５－ｓｉＲＮＡ１、Ｃｙ５－複合体１、Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡ２又はＣｙ５－複合体２溶液を皮下注射し、すべての動物に対して体重から投与量を算出し、投与体積はいずれも５ｍｌ／ｋｇ体重、ｓｉＲＮＡの量として、各動物に対する投与量は３ｍｇ／ｋｇ体重とした。
投与してから２ｈ、６ｈ、２４ｈ、４８ｈ後、各群のマウスを順に小動物生体光学イメージングシステムＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩに置き、イソフルランガスを用いてマウスを麻酔し、麻酔されたマウスを、腹を上に向けて小動物生体光学イメージングシステムに置き、生体イメージングを行い、Ｃｙ５蛍光信号を動的に検出し、Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡ又はＣｙ５標識複合体の動物生体での分布状況を追跡した。Ｃｙ５標識複合体を投与したマウスのみではその肝臓領域に顕著に増強した蛍光信号が示され、Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡ又は１×ＰＢＳを投与したマウスではその肝臓領域にいかなる蛍光信号も示されなかった。
４８ｈ後、すべてのマウスを死亡させ、各マウスの心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓の５つの臓器をそれぞれ摘出し、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩで蛍光イメージングを行った。各群のマウスから１匹選択し、上記５つの臓器を順に縦方向に並べ、１×ＰＢＳ、Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡ１又はＣｙ５－複合体１を投与したマウスの臓器を同一視野において撮像し、結果を図２Ａに示した。１×ＰＢＳ、Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡ２又はＣｙ５－複合体２を投与したマウスの臓器を同一視野において撮像し、結果を図２Ｂに示した。
図２Ａ～図２Ｂから分かるように、Ｃｙ５－複合体１及びＣｙ５－複合体２のみが肝臓に大量に蓄積し、Ｃｙ５－複合体１及びＣｙ５－複合体２が腎臓に少量蓄積しているが、他の臓器には蓄積しておらず、本開示の複合体がｓｉＲＮＡを肝臓に効果的かつ特異的に送達できることを示した。さらに、図１Ｇ（複合体７の体外抑制活性が高いことを示した）及び図１Ｆ（複合体６の体外抑制活性が高いことを示した）の結果と組み合わせることにより、本開示により提供される複合体が肝臓における標的遺伝子の発現を特異的に抑制できることを示唆した。
以上、本開示のいくつかの実施形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段に対して複数種の簡単な変形をすることができ、これらの簡単な変形は、いずれも本開示の保護範囲に属する。
このほかに説明すべきこととして、上記いくつかの実施形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
また、本開示の各種の異なる実施形態は任意に組み合わせることもでき、本開示の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなすべきである。

Claims (58)

  1. 式（３０８）に示される構造を有するｓｉＲＮＡ複合体であって、
    Figure 2022535708000072
     式中、
    ｎ１は、１～３から選択される整数であり、ｎ３は、０～４から選択される整数であり、各ｍ１、ｍ２又はｍ３はそれぞれ独立して、２～１０から選択される整数であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１－Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
    Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基であり、
    Figure 2022535708000073
     式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、
    ＮｕはｓｉＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡはセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドはそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、以下のｉ）～ｖｉ）に示す配列から選択される１つであり、
    ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＣＵＵＣＡＵＵＣＡＵＡＣＡＧＡＣＡＡＺ１－３’（配列番号１）、
    ５’－Ｚ２ＵＵＧＵＣＵＧＵＡＵＧＡＡＵＧＡＡＧ－３’（配列番号２）
    ただし、Ｚ１はＡであり、Ｚ２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１に対応するヌクレオチドＺ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２に対応するヌクレオチドＺ４が含まれ、前記Ｚ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＣＵＡＣＡＧＵＵＵＡＧＡＡＧＡＵＵＵＺ５－３’（配列番号６１）、
    ５’－Ｚ６ＡＡＡＵＣＵＵＣＵＡＡＡＣＵＧＵＡＧ－３’（配列番号６２）
    ただし、Ｚ５はＡであり、Ｚ６はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ５に対応するヌクレオチドＺ７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ６に対応するヌクレオチドＺ８が含まれ、前記Ｚ８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＧＧＡＡＧＧＵＵＡＣＣＧＡＧＣＡＡＵＺ９－３’（配列番号１２１）、
    ５’－Ｚ１０ＡＵＵＧＣＵＣＧＧＵＡＡＣＣＵＵＣＣ－３’（配列番号１２２）
    ただし、Ｚ９はＡであり、Ｚ１０はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ９に対応するヌクレオチドＺ１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１０に対応するヌクレオチドＺ１２が含まれ、前記Ｚ１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＵＵＺ１３－３’（配列番号１８１）、
    ５’－Ｚ１４ＡＡＵＵＣＵＧＣＵＧＵＣＵＧＵＵＣＵ－３’（配列番号１８２）
    ただし、Ｚ１３はＡであり、Ｚ１４はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１３に対応するヌクレオチドＺ１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１４に対応するヌクレオチドＺ１６が含まれ、前記Ｚ１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＣＵＧＣＡＡＺ１７－３’（配列番号２４１）、
    ５’－Ｚ１８ＵＵＧＣＡＧＣＧＵＵＣＵＵＣＵＵＧＧ－３’（配列番号２４２）
    ただし、Ｚ１７はＡであり、Ｚ１８はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１７に対応するヌクレオチドＺ１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１８に対応するヌクレオチドＺ２０が含まれ、前記Ｚ２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、
    ５’－ＣＣＡＧＵＡＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＺ２１－３’（配列番号３０１）、
    ５’－Ｚ２２ＵＵＣＵＧＧＣＵＵＧＣＵＵＡＣＵＧＧ－３’（配列番号３０２）
    ただし、Ｚ２１はＡであり、Ｚ２２はＵであり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ２１に対応するヌクレオチドＺ２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２２に対応するヌクレオチドＺ２４が含まれ、前記Ｚ２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、
    Ｒ２は、長さ１～２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、ここで１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
    各Ｌ１は独立して、長さ１～７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、ここで、１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２－Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６－Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３－Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５－Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、Ｃ６－Ｃ１０アリール基、Ｃ５－Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＯＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＯＨ、－ＯＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＣ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＳＨ、－ＳＣ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＮＨ２、－Ｃ１－Ｃ１０アルキル－ＮＨ２、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、－ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基）、シアノ基、ニトロ基、－ＣＯ２Ｈ、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＣＯＮＨ２、－ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－Ｎ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキルフェニル基、－Ｃ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０ハロアルキル基、－ＯＣ（Ｏ）Ｃ１－Ｃ１０アルキル基、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２（フェニル基）、－ＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０アルキル基）、－ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１又は複数の置換基を任意に有してもよく、
    Figure 2022535708000074
    は、基が共有結合的に結合する部位を表し、Ｍ１は標的基を表す、ｓｉＲＮＡ複合体。
  2. 各Ｌ１が独立して（Ａ１）～（Ａ２６）基及びその任意の結合の組合せからなる群から選択され、
    Figure 2022535708000075
     式中、各ｊ１は独立して１～２０の整数であり、各ｊ２は独立して１～２０の整数であり、
    各Ｒ’は独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基であり、
    各Ｒａは、式（Ａ２７）～（Ａ４５）に示される基又はその任意の結合の組合せからなる群から選択され、
    Figure 2022535708000076
     各Ｒｂは独立してＣ１－Ｃ１０アルキル基であり、
    或いは、Ｌ１がＡ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３から選択される１種又は複数種の結合の組合せであり、
    或いは、Ｌ１がＡ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せであり、
    或いは、Ｌ１がＡ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せであり、
    或いは、Ｌ１の長さが３～２５個の原子であり、
    或いは、Ｌ１の長さが４～１５個の原子であり、
    Figure 2022535708000077
    は、基が共有結合的に結合する部位を表す、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  3. ｊ１は２～１０の整数であり、ｊ２は２～１０の整数であり、Ｒ’は、Ｃ１－Ｃ４アルキル基であり、Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、Ｒｂは、Ｃ１－Ｃ５アルキル基であり、
    或いは、ｊ１は３～５の整数であり、ｊ２は３～５の整数であり、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つであり、Ｒａは、式（Ａ２７）に示される基又は式（Ａ２８）に示される基であり、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  4. ｎ１は１～２の整数であり、ｎ３は０～１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２～３である、請求項１～３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  5. 各ｍ１、ｍ２又はｍ３は、それぞれ独立して２～５の整数であり、及び／又はｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項１～４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  6. 各前記標的基が独立して哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドであり、
    或いは、各前記標的基が独立してアシアロ糖タンパク質又は糖であり、
    或いは、各前記標的基が、Ｄ－マンノピラノース、Ｌ－マンノピラノース、Ｄ－アラビノース、Ｄ－キシロフラノース、Ｌ－キシロフラノース、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－ガラクトース、α－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－マンノピラノース、β－Ｄ－マンノピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニルガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブチリルガラクトサミン、Ｎ－イソブチリルガラクトサミン、２－アミノ－３－Ｏ－［（Ｒ）－１－カルボキシエチル］－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノース、２－デオキシ－２－メチルアミノ－Ｌ－グルコピラノース、４，６－ジデオキシ－４－ホルムアミド－２，３－ジ－Ｏ－メチル－Ｄ－マンノピラノース、２－デオキシ－２－スルホアミノ－Ｄ－グルコピラノース、Ｎ－グリコリル－α－ノイラミン酸、５－チオ－β－Ｄ－グルコピラノース、メチル２，３，４－トリス－Ｏ－アセチル－１－チオ－６－Ｏ－トリチル－α－Ｄ－グルコピラノシド、４－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７－テトラ－Ｏ－アセチル－２－デオキシ－１，５－ジチオ－α－Ｄ－グルコヘプトピラノシド、２，５－アンヒドロ－Ｄ－アロニトリル、リボース、Ｄ－リボース、Ｄ－４－チオリボース、Ｌ－リボース、Ｌ－４－チオリボースから独立して選択される１つであり、
    或いは、前記標的基の少なくとも１つ又は各々がガラクトース又はＮ－アセチルガラクトサミンである、請求項１～５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  7. Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈ、メチル基又はエチル基であり、
    或いは、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４又はＲ１５は、いずれもＨである、請求項１～６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  8. Ｒ２には、窒素含有骨格上のＮに結合される部位及びＲ３におけるＰ原子に結合される部位がともに含まれ、
    或いは、Ｒ２の前記窒素含有骨格上のＮに結合される部位がＮとアミド結合を形成し、前記Ｒ３におけるＰ原子に結合される部位がＰとリン酸エステル結合を形成し、
    或いは、Ｒ２が式（Ｂ５）、（Ｂ６）、（Ｂ５’）又は（Ｂ６’）に示される基から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  9. 式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  10. 式Ａ５９におけるＰ原子は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合され、前記端部とは、前記センス鎖又はアンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指し、
    或いは、式Ａ５９におけるＰ原子が、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合され、又は式Ａ５９におけるＰ原子が、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合され、
    或いは、式Ａ５９におけるＰ原子が、リン酸ジエステル結合により前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合される、請求項１～９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  11. ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  12. ｉ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ４の位置での差異を含み、Ｚ４がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ８の位置での差異を含み、Ｚ８がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ１２の位置での差異を含み、Ｚ１２がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ１６の位置での差異を含み、Ｚ１６がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ２０の位置での差異を含み、Ｚ２０がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｖｉ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ２４の位置での差異を含み、Ｚ２４がＡ、Ｃ又はＧから選択される、請求項１又は１１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  13. Ｚ３がＺ４と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ７がＺ８と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ１１がＺ１２と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ１５がＺ１６と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ１９がＺ２０と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ２３がＺ２４と相補的なヌクレオチドである、請求項１２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  14. 前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩが、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１～１３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  15. 前記センス鎖が、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶの長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩがヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、ヌクレオチド配列ＩＶがヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１１～１４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  16. ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＣＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵＣＵであり、或いは、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＵＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＵＡであり、或いは、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣＡＧであり、或いは、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧＧであり、或いは、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２４３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２４４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧＧであり、或いは、
    ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３０３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号３０４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵＵＡである、請求項１５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  17. 前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶとは、完全に逆相補的である、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  18. 前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成し、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、長さが２ヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である、請求項１～１７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  19. 前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号６８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号２４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号２４８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号３０５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号３０６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号３０７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号３０８に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  20. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＣ５ａ１、ｓｉＣ５ａ２、ｓｉＣ５ｂ１、ｓｉＣ５ｂ２、ｓｉＣ５ｃ１、ｓｉＣ５ｃ２、ｓｉＣ５ｄ１、ｓｉＣ５ｄ２、ｓｉＣ５ｅ１、ｓｉＣ５ｅ２、ｓｉＣ５ｆ１又はｓｉＣ５ｆ２に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１１～１９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  21. 前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項１～２０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  22. 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、前記フルオロ修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｉの少なくとも第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列ＩＩの少なくとも第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位又は２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項２１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  23. 各非フルオロ修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つであり、
    或いは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチドが、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであり、ヌクレオチドアナログがイソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つであり、
    或いは、各非フルオロ修飾ヌクレオチドが、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項２１又は２２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  24. ５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｉの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の残りの位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、請求項２１～２３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  25. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ３、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ３、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ２、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ２、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ３又はｓｉＣ５ｆ２－Ｍ３のいずれか１つである、請求項１～２４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  26. 前記修飾基を有するリン酸エステル基が、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基であり、或いは、前記修飾基を有するリン酸エステル基が、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、請求項２１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
    Figure 2022535708000078
  27. 前記ｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基が、
    前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
    前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項２６に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  28. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ３Ｓ、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ２Ｓ、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ３Ｓ又はｓｉＣ５ｆ２－Ｍ３Ｓのいずれか１つである、請求項１～２７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  29. 前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドが、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、前記５’－リン酸ヌクレオチドが、式（２）に示される構造を有するヌクレオチドであり、前記５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、式（３）～式（６）のいずれか１つに示される構造のヌクレオチドから選択され、
    Figure 2022535708000079
     式中、Ｒが、Ｈ、ＯＨ、メトキシ基又はフッ素から選択され、Ｂａｓｅが、塩基を表し、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される、請求項１～２８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  30. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ２Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ３Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ２ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ３ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ２ＳＰ１又はｓｉＣ５ｆ２－Ｍ３ＳＰ１のいずれか１つである、請求項１～２９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
  31. センス鎖とアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであって、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記フルオロ修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチド配列Ｉとヌクレオチド配列ＩＩに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｉの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列ＩＩの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において残りの位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
    ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１に対応するヌクレオチドＺ３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２に対応するヌクレオチドＺ４が含まれ、前記Ｚ４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ５に対応するヌクレオチドＺ７が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ６に対応するヌクレオチドＺ８が含まれ、前記Ｚ８は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ９に対応するヌクレオチドＺ１１が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１０に対応するヌクレオチドＺ１２が含まれ、前記Ｚ１２は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１３に対応するヌクレオチドＺ１５が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１４に対応するヌクレオチドＺ１６が含まれ、前記Ｚ１６は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ１７に対応するヌクレオチドＺ１９が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ１８に対応するヌクレオチドＺ２０が含まれ、前記Ｚ２０は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、或いは、
    ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列とは、長さが等しく、ヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｉに、位置がＺ２１に対応するヌクレオチドＺ２３が含まれ、前記ヌクレオチド配列ＩＩに、位置がＺ２２に対応するヌクレオチドＺ２４が含まれ、前記Ｚ２４は、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである、ｓｉＲＮＡ。
  32. 各非フルオロ修飾ヌクレオチドが、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである、請求項３１に記載のｓｉＲＮＡ。
  33. ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素基で置換されたヌクレオチドが、２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチドから選択される１つであり、ヌクレオチドアナログが、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである、請求項３２に記載のｓｉＲＮＡ。
  34. 各非フルオロ修飾ヌクレオチドが、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドとは、リボース基の２’－ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項３１～３３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  35. ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号６１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１２１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号１８１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号２４１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、或いは、
    ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉと配列番号３０１に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下であり、及び／又は前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列との間にヌクレオチド差異が１つ以下である、請求項３１～３４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  36. ｉ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ４の位置での差異を含み、Ｚ４がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号６２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ８の位置での差異を含み、Ｚ８がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１２２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ１２の位置での差異を含み、Ｚ１２がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号１８２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ１６の位置での差異を含み、Ｚ１６がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号２４２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ２０の位置での差異を含み、Ｚ２０がＡ、Ｃ又はＧから選択され、或いは、
    ｖｉ）前記ヌクレオチド配列ＩＩと配列番号３０２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ２４の位置での差異を含み、Ｚ２４がＡ、Ｃ又はＧから選択される、請求項３１～３５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  37. Ｚ３が、Ｚ４と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ７が、Ｚ８と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ１１が、Ｚ１２と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ１５が、Ｚ１６と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ１９が、Ｚ２０と相補的なヌクレオチドであり、或いは、Ｚ２３が、Ｚ２４と相補的なヌクレオチドである、請求項３６に記載のｓｉＲＮＡ。
  38. 前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩが、基本的に逆相補的、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項３１～３７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  39. 前記センス鎖が、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶの長さがそれぞれ独立して１～４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩがヌクレオチド配列Ｉの５’末端に結合され、ヌクレオチド配列ＩＶがヌクレオチド配列ＩＩの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記実質的に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記完全に逆相補的とは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項３１～３８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  40. ｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＣＵであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵＣＵであり、或いは、
    ｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＵＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＵＡであり、或いは、
    ｉｉｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１２３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１２４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＣＡＧであり、或いは、
    ｉｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号１８３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号１８４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧＧであり、或いは、
    ｖ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号２４３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号２４４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＡＧＧであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＣＡＧＧであり、或いは、
    ｖｉ）前記ヌクレオチド配列Ｉは、配列番号３０３に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、配列番号３０４に示されるヌクレオチド配列であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＵＵＡであり、又は、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基配列がＧＵＵＡである、請求項３１～３９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  41. 前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶが完全に逆相補的である、請求項４０に記載のｓｉＲＮＡ。
  42. 前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１～３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成し、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、長さが２ヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である、請求項３１～４１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  43. 前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号６８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１２５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号１２６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１２７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号１２８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１８５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１８６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号１８７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１８８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号２４５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号２４６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号２４７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号２４８に示されるヌクレオチド配列を含み、
    或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号３０５に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、配列番号３０６に示されるヌクレオチド配列を含み、或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列番号３０７に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が配列番号３０８に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項３１～４２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  44. ｓｉＣ５ａ１、ｓｉＣ５ａ２、ｓｉＣ５ｂ１、ｓｉＣ５ｂ２、ｓｉＣ５ｃ１、ｓｉＣ５ｃ２、ｓｉＣ５ｄ１、ｓｉＣ５ｄ２、ｓｉＣ５ｅ１、ｓｉＣ５ｅ２、ｓｉＣ５ｆ１又はｓｉＣ５ｆ２に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項３１～４３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  45. ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１又はｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１のいずれか１つである、請求項３１～４４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  46. 前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖中の少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項３１～４５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  47. 前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基であり、或いは、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、請求項４６に記載のｓｉＲＮＡ。
    Figure 2022535708000080
  48. 前記ｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基が、
    前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
    前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
    前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項４７に記載のｓｉＲＮＡ。
  49. 前記ｓｉＲＮＡが、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１Ｓ、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１Ｓ又はｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１Ｓのいずれか１つである、請求項３１～４８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  50. 前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドが、５’－リン酸ヌクレオチド又は５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであり、
    或いは、前記５’－リン酸ヌクレオチドが、式（２）に示される構造を有するヌクレオチドであり、前記５’－リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、式（３）～式（６）のいずれか１つに示される構造のヌクレオチドから選択され、
    Figure 2022535708000081
     式中、Ｒが、Ｈ、ＯＨ、メトキシ基又はフッ素から選択され、Ｂａｓｅが、塩基を表し、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される、請求項３１～４９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  51. ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ａ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｂ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｃ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｄ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｅ２－Ｍ１ＳＰ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１Ｐ１、ｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１ＳＰ１又はｓｉＣ５ｆ２－Ｍ１ＳＰ１のいずれか１つである、請求項３１～５０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  52. ｓｉＣ５ａ１－Ｍ１ＳＰ、ｓｉＣ５ｂ１－Ｍ１ＳＰ、ｓｉＣ５ｃ１－Ｍ１ＳＰ、ｓｉＣ５ｄ１－Ｍ１ＳＰ、ｓｉＣ５ｅ１－Ｍ１ＳＰ又はｓｉＣ５ｆ１－Ｍ１ＳＰのいずれか１つである、請求項３１～５１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
  53. 請求項３１～５２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
  54. 請求項３１～５２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体。
  55. 請求項１～３０及び５４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体、請求項３１～５２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び／又は請求項５３に記載の薬物組成物の、重症筋無力症の治療及び／又は予防のための薬物の調製における使用。
  56. 重症筋無力症の治療及び／又は予防方法であって、請求項１～３０及び５４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体、請求項３１～５２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び／又は請求項５３に記載の薬物組成物の有効量を重症筋無力症に罹患している被験体に投与することを含む、方法。
  57. 肝細胞におけるＣ５遺伝子の発現の抑制方法であって、請求項１～３０及び５４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体、請求項３１～５２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び／又は請求項５３に記載の薬物組成物の有効量を前記肝細胞と接触させることを含む、方法。
  58. 請求項１～３０及び５４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体、請求項３１～５２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び／又は請求項５３に記載の薬物組成物を含むキット。
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