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JP2022533033A - 胃がんを診断するためのｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物、およびキット - Google Patents

胃がんを診断するためのｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物、およびキット Download PDF

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Abstract

本発明は、分子生物学の分野に関する。胃がんを診断するためのｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物およびキットが開示される。当該胃がんを診断するためのｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物には、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから選択される、少なくとも４つのマーカーが含まれる。胃がんを診断するためのマーカーの組み合わせ物は、胃がん患者の血清と健康なヒトの血清とを区別するために用いることができる。本発明の診断キットは、胃がんを容易に、効果的に、そして非侵襲的に診断することができる。
【選択図】なし

Description

本出願は、２０１９年４月３０日に中国特許庁に出願され、「胃がんを診断するためのｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物、およびキット」と題された出願番号201910392316.2の中国特許出願の優先権を主張し、その全内容は、参照することにより本出願に組み込まれる。
技術分野
本発明は、分子生物学の分野にあり、特に、胃がんを診断するための、ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物およびキットに関する。
背景
胃がんは世界でもっとも一般的な悪性腫瘍の一つであり、死亡率が最も高い悪性腫瘍の一つである。胃がん患者の大部分は、診断を受けるときには、診断や治療に最適なタイミングを見逃しており、結果として疾患の進行、腫瘍の転移、そして末期段階への進行にすら至る。胃がんのＴＭＮ分類の観点から、胃がんの５年生存率は、ステージＩの初期で９７．６％、ステージＩの後期で９４．９％、ステージＩＩで７０．４９％、ステージＩＩＩの初期で５６．７％、ステージＩＩＩの後期で３１．９％、そしてステージＩＶで６．５％である。早期胃がんの診断が必要であることが理解できる。
内視鏡（胃鏡）は、現在、胃がんを診断するための最も有益なツールである。早期の胃がんの内視鏡的兆候としては、異常な粘膜の色、粘膜表面における血管の消失、粘膜層における隆起の陥没または肥厚、不規則な結節、および潰瘍の周りの異常な粘膜のひだが挙げられる。必要に応じて、生検のために組織の一部は切除されうる。血液中のタンパク質マーカーの検出は、胃がんの診断の基準として使用されうる。胃がんに対して一般的に使用される腫瘍タンパク質マーカーとしては、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、炭水化物抗原７２－４（ＣＡ７２－４）および炭水化物抗原５０（ＣＡ５０）ならびに胃のプロテアーゼ等が挙げられる。
内視鏡検査後の生検は、胃がん検出のためのゴールドスタンダードである。しかしながら、この方法は侵襲的であり、患者に不快感や恐怖心を引き起こしうる。加えて、無症状の患者は通常、内視鏡検査を受けない。従来の腫瘍タンパク質マーカーは、消化器がんの検出によく使用されるが、感度および／または特異性が不足しているため、胃がんの診断には推奨されない。
現在、組織、血清または血漿中におけるｍｉＲＮＡ腫瘍マーカーの検出は、胃がんの診断の基準として用いられる。ｍｉＲＮＡは、長さが約１９～２４ｎｔの、一種の小さなノンコーディング一本鎖ＲＮＡ分子である。大部分のｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の３’ＵＴＲ領域との相補的結合により、標的遺伝子のタンパク質への翻訳を阻害し得、それにより、細胞、組織、または個体レベルにおける生物の成長と発達に影響を与え、様々な疾患の進行に関与する。ｍｉＲＮＡの発現プロファイルには明らかな組織特異性があり、さまざまな腫瘍において特異的な発現パターンを有する。これらの特徴は、ｍｉＲＮＡが腫瘍の診断のための新しい生物学的マーカーおよび治療標的となることを可能とする。ｑＰＣＲは、既知のｍｉＲＮＡの発現を検出するために最も一般的に使用される方法であり、早く、簡易であり、かつ再現性を有し、非常に高感度で正確な方法でｍｉＲＮＡの発現を定量的に分析でき、臨床応用において最も重要な方法である。これは、循環ｍｉＲＮＡに対して、腫瘍に対する非侵襲的な診断マーカーとしての確かな技術的保証を提供する。
既存の研究においては、胃がんの早期診断に対する多くの有望な血清ｍｉＲＮＡが見出されているが、これらの結果は一貫しておらず、相互に検証することができない。その理由は、さまざまな研究間において、サンプルの選択、採取、および保存の工程に一貫性がないことにある。異なる方法を用いて分離され、保存された末梢血サンプル中におけるバイオマーカーの含有量は異なる。個人間の体液環境、遺伝的特徴、およびその他の非がん性因子が、ｍｉＲＮＡの発現に影響を及ぼし、この影響を排除するためには多数の集団サンプルが必要である。加えて、ｍｉＲＮＡの検出はある程度の困難性を有する。したがって、最終的に胃がんの検診に用いることができる血清ｍｉＲＮＡバイオマーカーとバイオマーカーとの組み合わせ物は、まだ正確には決定されていない。
要旨
このことを鑑みて、本発明の目的は、胃がん患者の血清を健康なヒトの血清と区別し、さらに胃がん患者の血清を胃炎患者の血清から区別することで、胃がんを簡単に、効果的にそして非侵襲的に検出することができる、早期胃がんを診断するためのマーカーの組み合わせ物とキットを提供することである。
本発明の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決策を採用する。
本出願人は、胃がんを検出するためのバイオマーカーおよび組み合わせ物として、ＲＴ－ｑＰＣＲ技術を用いて、１２のｍｉＲＮＡ、具体的には ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－ １２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐをスクリーニングおよび取得する。本発明に係るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、４５６６人の被験者を試験するために用いられる。その結果は、ヘリコバクターピロリ検査およびペプシノーゲン検査と比較され、内視鏡検査の臨床的なゴールドスタンダード（ＡＵＣが０．８４）とよく一致しており、かつペプシノーゲンＩ／ＩＩ比およびヘリコバクターピロリ検査の、２つの既存のバイオマーカー（ＡＵＣが０．６２と０．６４）の各々よりも有意に優れている。
胃がんを診断するためのｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、から選択される少なくとも４つのｍｉＲＮＡマーカーを含む。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、から選択される少なくとも５つのｍｉＲＮＡマーカーを含む。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐおよびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、から選択される少なくとも６つのｍｉＲＮＡマーカーを含む。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、から選択される少なくとも７つのｍｉＲＮＡマーカーを含む。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、から選択される少なくとも８つのｍｉＲＮＡマーカーを含む。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、から選択される少なくとも９つのｍｉＲＮＡマーカーを含む。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、から選択される少なくとも１０個のｍｉＲＮＡマーカーを含む。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、から選択される少なくとも１１個のｍｉＲＮＡマーカーを含む。
いくつかの実施形態において、前記胃がんの診断用の、末梢血サンプル中のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、を含む。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、１２個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成る。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、１１個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐおよびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成る。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、１０個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成る。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、９個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成る。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、８個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成る。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、７個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成る。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、６個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成る。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、５個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成る。
いくつかの実施形態において、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、４個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成る。
本発明は、胃がんに罹患しているリスクのある被験者を特定するための方法であって：
ａ．ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから選択される、被験者の末梢血サンプル中の少なくとも４つのｍｉＲＮＡマーカーの発現レベルを検出すること、
ｂ. 非がんコントロールサンプルを基準として、被験者のリスクスコアを算出し、補正すること、および
ｃ．前記リスクスコアに基づいて、被験者が胃がんに罹患する可能性を決定すること
を含む、方法も提供する。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するための方法は、（たとえば、ＳＹＢＲ－ＧｒｅｅｎまたはＴａｇｍａｎをベースとした化学的方法を用いた）定量的ＲＴ－ＰＣＲ、ｃｈｉｐ、またはシークエンシングの使用が含まれる。他の実施形態においては、前記バイオマーカーは、ノーザンブロット、ドロップレットデジタルＰＣＲ、質量分析、電気化学発光、または当該技術分野で知られている他の方法によって検出できる。
前記方法の、いくつかの実施形態においては、リスクスコアを算出するために、線形回帰モデルが用いられる。
前記方法の、いくつかの実施形態においては、用いられる前記線形回帰モデルはロジスティック回帰である。
前記方法の、いくつかの実施形態においては、前記線形回帰モデルは以下：
Figure 2022533033000001
（式中、ｍｉＲＮＡ１、ｍｉＲＮＡ２、ｍｉＲＮＡ３．．．はｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから選択され；
ＣＴはｑＰＣＲによって検出された各ｍｉＲＮＡの相対的な発現レベルであり；および
Ｋは各ｍｉＲＮＡマーカーの係数である）
のとおりである。
本発明は、前記ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物を特異的に検出するための試薬を含む、胃がんの診断用キットも提供する。
いくつかの実施形態において、本発明に係るキット中の試薬は、ｑＰＣＲ法のための検出試薬、ｃｈｉｐ法のための検出試薬、またはシークエンス法のための検出試薬である。
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物を特異的に検出するための前記キット中の試薬は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、胃がんを診断するための、上述した末梢血ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中のｍｉＲＮＡマーカーに特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中におけるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物を特異的に検出するための試薬は、ｑＰＣＲ法のための検出試薬である。
さらに、いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、前記ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物の、逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマー、を含む。
さらに、いくつかの実施形態において、前記キットは、胃がんの診断のための上述した末梢血ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物の中のｍｉＲＮＡマーカーを増幅させるための、ステムループ逆転写プライマーおよび／またはセミネステッド ｑＰＣＲプライマー、を含む。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、１２個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中の各ｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、１１個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中の各ｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、１０個のｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中の各ｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、９つのｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中の各ｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、８つのｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中の各ｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、７つのｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中の各ｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、６つのｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中の各ｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、５つのｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中の各ｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマーを含む。
いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、４つのｍｉＲＮＡマーカー：ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成るｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物中の各ｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよび／またはｑＰＣＲ増幅プライマーを含む。
さらに、いくつかの実施形態において、本発明によるキット中の、ｑＰＣＲ法のための検出試薬は、ポジティブクオリティーコントロール品、ネガティブクオリティーコントロール品、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、逆転写バッファー、ヌクレアーゼフリーの水、ｑＰＣＲバッファー、塩化マグネシウム、ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光色素の、少なくとも１つをさらに含む。
本発明はまた、以下の方法によって、被験者が胃がんを発症する、または胃がんに罹患している、可能性を予測するための胃がん診断試薬の調製におけるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物の使用を提供し、前記方法は：
被験者から取得した末梢血サンプルにおけるｍｉＲＮＡの存在を検出すること；
前記末梢血サンプルにおけるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物における少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定すること；および
前もって測定されたｍｉＲＮＡの発現レベルに基づいたスコアを用いて被験者が胃がんを発症する、または胃がんに罹患している可能性を予測すること
を含む。
前記末梢血は血清または血漿である。
前記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、線形回帰アルゴリズムを用いて、簡単な線形回帰モデルを構築することによってスコア化する。線形回帰モデルはリスクスコアを算出するために用いられる。ロジスティック回帰は、この目的のために用いることのできる線形回帰法の一例である。しかしながら、当業者は、スコアを算出し、取得するために他の形式の線形回帰演算が用いられうることを理解する。リスクスコアの臨界値は、臨床ニーズに基づいて決定され、２つの臨界値が、集団を、高リスク集団、低リスク集団、および未確定集団として判定するために用いられる。
被験者には、中国人、マレーシア人、およびインド人が含まれるが、これらに限定されない。
上記の技術的解決策から、本発明は、胃がんを診断するための、マーカーの組み合わせ物およびキットを提供することが分かり得る。本発明による、胃がんを診断するためのｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから選択される少なくとも４つのｍｉＲＮＡマーカーを含む。被験者における、胃がんを診断するためのマーカーの組み合わせ物を使用する血清の検出は、胃がん患者の血清と健康なヒトの血清とを、また胃がん患者の血清と胃炎患者の血清とを識別することができる。上述した、本発明によるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、被験者を検査するために用いられる。結果は、ヘリコバクターピロリ検査およびペプシノーゲン検査と比較され、内視鏡検査の臨床的なゴールドスタンダードとよく一致しており、かつペプシノーゲンＩ／ＩＩ比とヘリコバクターピロリ検査の２つの既存のバイオマーカーの各々よりも有意に優れている。本発明による、胃がんを診断するためのキットは、単純な組成物を有し、胃がんを簡単に、効果的に、そして非侵襲的に検出することができる。
図面の簡単な説明
本発明の実施形態または先行技術における技術的解決策をさらに明確に説明するため、以下は、実施形態または先行技術の説明において用いられる必要がある図面を簡単に紹介する。
図１は、胃がんにおける血清ｍｉＲＮＡの臨床評価のためのロードマップを示す； 図２は、さまざまな血液マーカーのＲＯＣ特性を示す図表である； 図３は、男性および女性のＲＯＣ特性を示す図表である； 図４は、さまざまな人種の被験者の、本キットにおけるＲＯＣ特性を示す図表である； 図５は、早期胃がんの被験者および末期胃がんの被験者の、本キットにおけるＲＯＣ特性を示す図表である； 図６は、線形回帰アルゴリズムの下、異なるｍｉＲＮＡ数の組み合わせ物におけるＲＯＣ特性を示す図表である；
詳細な説明
本発明は、ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物および胃がんの診断用キットを開示する。当業者は、本文の内容から学習し、本発明を達成するためのプロセスパラメータを適切に改良することができる。特に、すべての類似の置換および改変は当業者にとって明らかであり、それらはすべて本発明に含まれるものとみなされることが指摘されるべきである。本発明の方法およびものは、好ましい実施形態によって記載されている。本発明の技術を実現および適用するために、当業者が、本発明の内容、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法に変更または適切な変更や組み合わせを行いうることは明らかである。
本発明をさらに理解するために、本発明の実施例における技術的解決策は、本発明の実施例とあわせて、以下に明確かつ完全に説明する。あきらかに、記載された実施例は本発明の実例の全てというよりも一部の例にすぎない。本発明の実施例に基づき、当業者により取得された、すべての他の創造的取組みのない実例は本発明の保護範囲に属する。
特に明記しない限り、本発明の実施例に関する試薬はすべて市販の製品であり、それらはすべて、市販の経路を通じて購入することができる。本発明によるｍｉＲＮＡの逆転写プライマーおよびＲＴ－ｑＰＣＲプライマーの設計方法は、米国特許公報Ｎｏ．ＵＳ９８５０５２７Ｂ２およびWan G, Lim Q’, Too H P. High-performance quantification of mature microRNAs by real-time RT -PCR using deoxyuridine-incorporated oligonucleotides and hemi-nested primers [J] Rna-a Publication of the Rna Society, 2010, 16(7):1436-45に記載されている方法にしたがって行われる。本発明で開示されたすべてのｍｉＲＮＡ配列は、miRBaseデータベース（http://www.mirbase.org/）に保存されている。
実施例 １
開発段階においては、ＲＴ－ｑＰＣＲ技術を用いて、２３６人の胃がん患者および２３６人の非がんコントロール被験者の血清ｍｉＲＮＡを検出した。１９１個のｍｉＲＮＡ
Figure 2022533033000002
が、被験者の９０％超で検出できた。１９１個のｍｉＲＮＡのうち７５個は、コントロール群とがん患者の間において、発現が異なっていた（ＦＤＲ Ｐ値＜０．０１）。異なって発現された７５個のｍｉＲＮＡのうち、５１個は胃がん患者においてアップレギュレーションされ、２４個がダウンレギュレーションされた。
検証段階では、ＲＴ－ｑＰＣＲ技術を用いて、９４人の胃がん患者および１１６人の非がんコントロール被験者の血清ｍｉＲＮＡを検出した。開発段階と検証段階の間における、ｍｉＲＮＡ発現の倍率変化には良好な相関関係があった。最終的に、１２個のｍｉＲＮＡ、特にｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、が、胃がんを検出するためのバイオマーカーおよび組み合わせ物としてさらに選択された。各ｍｉＲＮＡ配列とｍｉＲＢａｓｅデータベースの登録番号を表１に示す。
Figure 2022533033000003
２～１２個のｍｉＲＮＡのバイオマーカーの組み合わせ物の性能を試験するために、スクリーニングから得られた１２個のｍｉＲＮＡバイオマーカーとノンパラメトリック因子との組み合わせ物に対して２００回の二重交差検定を行った。AUCが単純な線形回帰モデルを構築するための最適化インデックスとして用いられた。線形回帰モデルがリスクスコアを算出するために用いられた。この実施例においては、ロジスティック回帰モデルが用いられた。当該リスクスコアの臨界値は臨床的必要性に基づいて決定され、２つの臨界値が、集団を高リスク集団、低リスク集団、および未確定集団と定義するために用いられた。胃がん集団のロジスティックスコアは健常者集団のロジスティックスコアよりも有意に高かった。
線形回帰モデルの計算式は以下である：
Figure 2022533033000004
式中、Ｋは各ｍｉＲＮＡマーカーの係数であり、各マーカーの係数はマーカーの組み合わせによって異なり、そのあり得るインプリメンテーション（ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は表に示される。
ＣＴは各ｍｉＲＮＡマーカーの相対的な発現レベル、つまりｑＰＣＲによって取得されたＣｔ値である。
Figure 2022533033000005
実施例 ２
１）試験サンプルの調製：血液の採取および血清の分離；
全量２０ｍｌの空腹時の血液サンプルが２本の一般的な血清用試験管に採取された。当該血清用試験管は、３０００ｒｐｍで１０分間、２０°Ｃで遠心分離された。遠心分離および血清の回収は血液の採取後４時間以内に行われた。血清サンプルはただちに－８０°Ｃで保管された。
２）ＲＮＡの抽出；
トータルRNAは、血清２００μｌから、miRNeasy serum/plasma miRNA extraction kit(Qiagen GmbH、ドイツ)を用いて単離された。RNAの抽出前に、三セットの人工的に合成されたmiRNAコントロール（高濃度、中濃度、低濃度で混合）が、本工程における技法上のばらつきをチェックして標準化するために、サンプルリシスバッファーに添加された。
３）逆転写リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
逆転写バッファー、逆転写酵素、および逆転写用プライマーが、特定の反応条件および温度下におけるｍｉＲＮＡの逆転写に用いられた。
逆転写産物（ｃＤＮＡ）は、ｑＰＣＲバッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｍｉＲＮＡ配列特異的プライマーを含有するｑＰＣＲ用プレートを用いて、特定の反応条件および温度下において、ｑＰＣＲによって増幅された。各ｍｉＲＮＡのＣｔ値は閾値を設定することにより取得された。
ＲＴ－ｑＰＣＲの前に、一式の人工的に合成されたｍｉＲＮＡ（３）コントロールが、本工程における技法上のばらつきをチェックして標準化するために、各サンプルに添加された。ＲＴ－ｑＰＣＲの間、各ｍｉＲＮＡに、６つの、対数希釈された、人工的に合成されたテンプレート、ネガティブコントロール、混合ヒト血清ＲＮＡ基準物質を添加し、それぞれの分離した血清ＲＮＡサンプルを逆転写してｑＰＣＲで定量した。これらの品質管理措置は、ＲＴ、ｃＤＮＡの増幅、およびｑＰＣＲの間におけるピペッティングおよび測定効率の技法上のばらつきをチェックして標準化するのに役立つ。
４）検証段階における１２－ｍｉＲＮＡの検出のためのプロトコール（実施例３）
血清サンプルはフェノール／グアニジンで溶解し、血清サンプルのトータルＲＮＡをシリカ精製カラムで分離した。逆転写ステップにおいては、各サンプル中の１２個のｍｉＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために、ｍｉＲＮＡ逆転写用の対応するステムループプライマーを用いた。続いて、配列特異的なフォワードＰＣＲプライマーと、セミネステッドな配列特異的リバースＰＣＲプライマーとを使用してｑＰＣＲを行い、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ色素を検出に使用した。
５）統計分析を行い、胃がんに罹患するリスク値を取得するために、Ｃｔ値が、実施例１で記載した線形回帰モデルにインポートされた。
実施例３
シンガポールの国立大学病院とシンガポールのタントックセン病院から５２８２人の被験者が臨床試験のために選択された。具体的な検証ルートを図１に示す。合計５２８２人の被験者が臨床検証に参加した。実施例２に記載の方法にしたがって、すべての被験者に対して、実施例１に記載された１２個のｍｉＲＮＡバイオマーカーが、ｍｉＲＮＡ試験、ヘリコバクターピロリ試験およびペプシノーゲン試験ならびに胃内視鏡検査および病理学試験のために選択された。当該１２－ｍｉＲＮＡ ｑＰＣＲアッセイは、ＩＳＯ １３４８５ 医療機器品質マネジメントシステムにしたがって、開発および製造された。前記１２－ｍｉＲ ｑＰＣＲアッセイは、ＩＳＯ １３４８５ 医療機器品質マネジメントシステムに従って開発および製造された。内視鏡検査および組織病理学的検査の結果がない場合、ｍｉＲＮＡ試験はＣＡＰ／ＩＳＯ認定を受けた研究室で行われた。ウエスタンブロットアッセイを用いて、血清サンプル中のヘリコバクターピロリ抗体を測定した。ペプシノーゲンＩおよびＩＩのレベルは、ラテックス凝集免疫比濁法キットにより測定された。両測定は、臨床結果が不明なときに行われた。検診後、最終的に４５６６人の被験者がデータ分析に用いられ、１２５人の被験者が胃がんと診断され、４４４１人の被験者ががんのない健康な人間と確認された。表３に、４５６６人の被験者の臨床所見データの解析結果を示す。
Figure 2022533033000006
本発明による、ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせの試験、ヘリコバクターピロリ試験、およびペプシノーゲン試験を比較し、その結果は図２および表４に示される。
Figure 2022533033000007
４５６６人の被験者の結果から、本発明によるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ試験方法は、内視鏡検査の臨床におけるゴールドスタンダード（ＡＵＣは０．８４）とよく一致し、ペプシノーゲンＩ／ＩＩ比とヘリコバクターピロリ試験の２つの既存のバイオマーカー（ＡＵＣは０．６２と０．６４）の各々よりも有意に優れていることが理解できる。４５６６人の被験者のＡＵＣ（０．８４）は、アルゴリズム開発コホートのＡＵＣ（０．８９）に近く、このことは本発明によるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物のための開発コホートと、盲検のための臨床検証コホートとの間の実験結果の一貫性を示した。
臨床検証データにおける性差についてさらに分析を行った。本発明によるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ試験は、男性および女性の被験者において一貫したＡＵＣを示した（図３および表５）。
Figure 2022533033000008
臨床検証データをさらに分析して、異なる人種の集団において、本発明によるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ試験の性能が異なるかどうかを分析した。概してシンガポールの人口統計データと一致し、本臨床試験に参加している被験者のほとんどは中国系（７６．４３％）であり、マレー系、インド系、その他の民族グループがそれぞれ約８％を占めている（表３）。その結果、中国系の被験者のＡＵＣが、他の人種の被験者ＡＵＣよりも高いことが示された（図４、表６）。
Figure 2022533033000009
本発明によるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ試験の性能は、がんのステージ分類によってさらに評価された。本発明によるｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ試験において、早期がん（ステージ０、Ｉ、およびII）のＡＵＣ、ならびに進行したがん（ステージＩＩＩおよびＩＶ）のＡＵＣは、それぞれ０．８３および０．８５であることが示された（図５、表７）。
Figure 2022533033000010
さらに、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、食道がん、前立腺がん、および膀胱がんを含む、他の７種の一般的ながんに対するｍｉＲＮＡ検出の臨床的特異性を証明した。このアッセイは、消化器がんを含む他の一般的ながんとの交差反応性がほとんどなかった（表８）。
Figure 2022533033000011
実施例 ４
実施例２に記載の方法に従って、実施例１に記載の、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、および４個のｍｉＲＮＡの組み合わせ物を、ｍｉＲＮＡの重要な順にしたがって順次選択し、ＲＯＣ特性を示す図表を取得するために、実施例３に記載のがん被験者およびコントロール被験者のサンプルを用いて試験した（図６、表９）。
Figure 2022533033000012
異なるスコアが、がんと非がんとの境界線として使用される場合においては、ロジスティックアルゴリズムは異なる診断性能を示し、異なる診断方法に適していることに留意する必要がある（表８）。たとえば、４０ポイントの境界線が使用された場合、つまりスコアが４０以上の患者をがん患者と定義した場合、その感度は５０ポイントの境界線よりも有意に高く、特異度および正確度は５０ポイントの境界線よりも有意に低い。したがって、低いロジスティック境界線は集団における胃がんの検診に適しており、高いロジスティック境界線は補助診断に適していた。
考察
ｍｉＲＮＡが、がんやその他の疾患を診断するためのマーカーとして用いられうることを示す多くの文献が存在しているが、特定の疾患のための具体的なｍｉＲＮＡ発現プロファイルに関する統一見解はない。診断や予後のマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用は、いくらかの課題に直面する可能性がある(Tiberio et al, 2015)。たとえ同一の疾患であっても、異なる研究においてスクリーニングされたｍｉＲＮＡマーカーは非常に多様であり得る(Leidner et al, 2013)。既存の文献における、研究対象の選択、サンプル採取、処理ステップ、および検出方法に一貫性がないため、診断や予後のためのｍｉＲＮＡバイオマーカーの選択が次善のものとなる可能性がある。また、これらの文献における研究結果のほとんどは、大規模な研究コホートでは検証されていない。
被験者の健康状態および治療状態、ならびに環境的要因および遺伝的要因のすべてがｍｉＲＮＡの発現プロファイルに影響を与えている可能性がある。ｍｉＲＮＡの分析が、単一の研究コホートまたは同一の場所からのサンプルのみに基づいている場合においては、その結果に偏りが生じる可能性がある。したがって、大規模な集団に適用できるｍｉＲＮＡマーカーをスクリーニングするためには、十分大きな集団からサンプルを採取し、適切な設計の制御可能なデータ分析ワークフローを設計する必要がある。本発明は、現在選択されている１２個のｍｉＲＮＡバイオマーカーを完全に検証したものであり、これらの検証は、異なる研究所在地からの異なる患者コホートにおいて行われる。初期の開発段階から始まり、ｍｉＲＮＡバイオマーカーは様々なコホートにおいてスクリーニングおよび検証が行われる。選択された１２個のｍｉＲＮＡは、その後、５２８２人の被験者を対象とした、より大規模な前向き臨床試験でさらに検証される。複数の独立した研究コホートからの多数の被験者において、１２個の、スクリーニングされ、検証されたｍｉＲＮＡは、バイオマーカーとしてのロバスト性を保証し、胃がんのリスクを有する被験者を特定するために幅広い集団に適用することができる。
ｍｉＲＮＡプロファイルは、サンプル採取、処理ステップ、およびサンプル中のｍｉＲＮＡ発現レベルを検出するための方法等の、技術的側面においても影響を受け得る。ｍｉＲＮＡ発現における変化を検出するための感度と特異性は、検出方法が異なるために大幅に異なることがある。ほとんどの公開された研究においては、サンプル採取および処理方法が完全に異なっている可能性がある。加えて、それらの研究において用いられる試薬および方法には差異がある。セミネステッドプライマーは、本発明においてはWan et al, 2010の原理に基づいて設計されており、感度と特異性の高いＲＴ－ｑＰＣＲ法および最適化されたｍｉＲＮＡ発現プロファイルおよびデータ分析ワークフローが採用されており、内部基準が、ｍｉＲＮＡ抽出、逆転写、ｑＰＣＲ、およびその他の工程における効率の違いをチェックし、調節するために用いられている。加えて、５２８２人の被験者の臨床検証研究は、医療診断試験の臨床検証よりも、さらに厳しい方法を採用している（Wilson et al、2008; Mattocks et al、2010）。前記試験キットは、臨床研究では一般的ではない厳格な品質管理要件の下で製造され、実施される。本発明による技術的方法が、胃がんのリスクを特定するために用いられる１２個のｍｉＲＮＡマーカーの有効性およびロバスト性をさらに保証する。
５２８２人の被験者が参加した、１２個のｍｉＲＮＡバイオマーカーを検証するための前向き研究では、これらの被験者は、ヘリコバクターピロリ、ペプシノーゲンＩ／ＩＩ試験、および胃内視鏡検査など、胃がんに関連する他のリスク因子についても試験されている。その結果は、１２個のｍｉＲＮＡの組み合わせの検出が、胃がんの患者を特定するという点で、ヘリコバクターピロリやペプシノーゲンＩ／ＩＩなどの胃がんの高リスク因子に対する、いくつかの従来の臨床試験よりも大幅に優れていることを示している。４－ｍｉＲＮＡ群は、ペプシノーゲン１／２試験（ＡＵＣ＝０．６２）およびヘリコバクターピロリ（ＡＵＣ＝０．６４）と比較して、より類似したＡＵＣを有する。５つ以上のｍｉＲＮＡを有するｍｉＲＮＡの組み合わせは、胃がんの診断に優れたＡＵＣを有する（５－ｍｉＲＮＡ群のＡＵＣは０．８０２９、１２－ｍｉＲＮＡ群のＡＵＣは０．８４２３）。５つ以上のｍｉＲＮＡで構成されるｍｉＲＮＡ検出のＡＵＣは、現在の胃がん診断のゴールドスタンダードである胃内視鏡検査のＡＵＣ（ＡＵＣは０．８４）と非常に近似している。
胃がんのリスクがあると判断される被験者は、例えば、胃内視鏡検査、生検、または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）やコンピューター断層撮影法（ＣＴ）などの画像診断検査等の、さらなる検査が必要になりうる。胃がんと診断された患者は適切な治療を受ける。胃がんの治療は一般的に以下：手術、放射線療法、化学療法もしくは免疫療法、またはトラスツズマブやラムシルマブなどの標的療法の使用、の１以上の介入が挙げられる。胃がん治療に対する薬剤候補としては、小分子、抗体、ワクチン、またはペプチドが挙げられる。胃がん治療のための化学療法薬としては、５－フルオロウラシル、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、エピルビシン、イリノテカン、オキサリプラチン、パクリタキセル、トリフルリジン、およびチピラシルが挙げられる。胃がん治療のための免疫療法薬としては、ペムブロリズマブなどの免疫チェックポイント阻害剤が挙げられる。早期の胃がんのための治療の選択肢は、通常、手術である。早期に検出されるがんについては、内視鏡的切除も可能である。通常、早期の胃がん患者における治療効果は、進行した胃がんの患者における治療効果よりも有意に優れていると考えられている（Lello et al、2007）。したがって、信頼性が高く使いやすい検出方法は、胃がん患者の早期診断にとって非常に重要である。
したがって、本発明は、１２個のｍｉＲＮＡバイオマーカーの組み合わせ物に関する大規模な臨床研究の検証データを詳細に提供する。胃がんのリスクを評価するための従来の検出方法と比較して、本ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物は、胃がんの診断のための胃内視鏡検査と同等のＡＵＣを提供しうるが、胃内視鏡検査の侵襲性およびそれと関連する合併症のリスクは有さない。集団がん検診の重要な原則は、がんの早期検出を促進するための定期的な検診にこだわることである。この点において、より侵襲的な検査と比較して、1回の採血のみを必要とし、信頼できる結論を提供する血液ベースの検査は、より有望性のある開発の方向性でありえる。

Claims (16)

  1. ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐ、から選択される、少なくとも５つのｍｉＲＮＡマーカーを含むことを特徴とする、胃がんを診断するための末梢血ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物。
  2. ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成ることを特徴とする、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物。
  3. ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成ることを特徴とする、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物。
  4. ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成ることを特徴とする、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物。
  5. ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成ることを特徴とする、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物。
  6. ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６－３ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成ることを特徴とする、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物。
  7. ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成ることを特徴とする、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物。
  8. ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成ることを特徴とする、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物。
  9. ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３４０－５ｐから成ることを特徴とする、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物。
  10. ａ． 被験者の末梢血サンプルにおいて、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物の発現レベルを検出すること、
    ｂ． 非がんコントロールサンプルを基準として、前記被験者のリスクスコアを算出し、補正すること、および
    ｃ． 前記リスクスコアに基づいて、被験者が胃がんに罹患する可能性を決定すること、を含む、
    胃がんに罹患しているリスクのある被験者を特定するための方法。
  11. 線形回帰モデルが、前記リスクスコアを算出するために用いられることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。

  12. 前記線形回帰モデルが以下：
    Figure 2022533033000013
    （式中、ｍｉＲＮＡ１、ｍｉＲＮＡ２、ｍｉＲＮＡ３．．．が請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーから選択され；ＣｔがｑＰＣＲによって検出される各ｍｉＲＮＡの相対的な発現レベルであり；かつＫが各ｍｉＲＮＡマーカーの前記係数である）
    のように算出されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記方法が、ｍｉＲＮＡマーカーを検出するためのｑＰＣＲ法、ｃｈｉｐ法、またはシークエンシング方法を含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせ物を特異的に検出するための試薬を含むことを特徴とする、胃がんの診断用キット。
  15. 、前記試薬が少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とし、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーに特異的に結合する、請求項１４に記載のキット。
  16. 前記キットが、請求項１に記載のｍｉＲＮＡマーカーを増幅するための、ステムループ逆転写プライマーおよび／またはセミネステッド ｑＰＣＲプライマーを含む、請求項１５に記載のキット。
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