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CN103911436A - 一种非贲门胃癌早期诊断的血清/血浆miRNA标志物及其应用 - Google Patents

一种非贲门胃癌早期诊断的血清/血浆miRNA标志物及其应用 Download PDF

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CN103911436A
CN103911436A CN201410092738.5A CN201410092738A CN103911436A CN 103911436 A CN103911436 A CN 103911436A CN 201410092738 A CN201410092738 A CN 201410092738A CN 103911436 A CN103911436 A CN 103911436A
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serum
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seq
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CN201410092738.5A
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沈洪兵
靳光付
胡志斌
马红霞
戴俊程
陈佳萍
朱陈
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Nanjing Medical University
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Nanjing Medical University
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Abstract

本发明属于基因工程及肿瘤学领域，公开了一种与早期非贲门胃癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。该标志物为miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p的组合。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于非贲门胃癌早期的辅助早期诊断。

Description

一种非贲门胃癌早期诊断的血清/血浆miRNA标志物及其应用
发明领域
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及一种非贲门胃癌早期诊断的血清/血浆miRNA标志物及其应用。
背景技术
胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织估计，2008年全球范围内大约100万胃癌新发病例，占全部肿瘤发病的7.8%，仅次于肺癌、乳腺癌和结直肠癌。超过70%的胃癌病例发生在发展中国家，其中50%发生在中国。在我国，胃癌年龄标化发病率男性为41.3/10万，女性为18.5/10万，仅次于肺癌。大约90%-95%的胃癌为腺癌，起源于胃部上皮组织。从解剖学上可分为贲门癌和非贲门癌。贲门癌是发生在胃贲门部食管胃交界线下2cm范围内的腺癌。非贲门癌主要包括发生在胃底、胃角、胃窦和幽门部恶性肿瘤。根据国内以往的统计，贲门癌约占全部胃癌的20%，而非贲门癌占据了80%。尽管在全球范围内胃癌的发病率及死亡率均处于下降趋势，而我国仍处于较高发病的及死亡水平。随着人口基数的不断增大和胃癌期望寿命的延长，庞大的胃癌，特别是非贲门癌患病和死亡人数，将在未来相当长一段时期内给我国带来严重的负担，仍然是肿瘤预防及控制的重点。
目前，胃癌的初步诊断方法主要为病史询问、体格检查、实验室检查、胃肠X线检查、纤维内窥镜检查、脱落细胞学检查、B超以及CT检查、肿瘤标记物检测等。鉴别诊断主要依靠X线钡餐造影、胃镜和活组织病理检查。但是现在临床常用的X线钡餐造影和纤维内窥镜检查也存在一些弊端。X线钡餐造影对局部粘膜上较小的肿瘤难以发现，或难以肯定；检查有一定的盲区，可能漏掉小病变，不能确定病变的性质，可能有假阳性或假阴性。纤维内窥镜检查对胃壁整体蠕动情况及胃的形态观察欠完整；对肿瘤的浸润深度、有无转移了解不清；对外压性肿物还是胃壁内肿物难以区别。目前临床所用胃癌标志物特异性不强。血清癌胚抗原(CEA)对诊断意义不大，虽半数患者的胃液中CEA有明显升高，超过100ng/ml，但也与慢性萎缩性胃炎的胃液中含量有重叠。病理活组织检查作为胃癌诊断的金标准，在临床胃癌确诊中居于重要地位，但由于需要做胃镜取胃部组织，不适合作为临床健康筛查。因此，我们亟需发现更加明确而有效的生物标志物，对胃癌做出明确的早期诊断，这将有助于胃癌患者做出早期治疗，提高生存率。
MicroRNAs(即miRNAs)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点，它的成熟状态是一类长约19-23个核苷酸的小单链RNA分子，进化上具有高度保守性。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。
MiRNAs的主要功能是调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。自从参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。2005年预测miRNAs至少能调控5300个人类基因，即所有基因的30%。随着研究的深入，越来越多的miRNAs不断被发现。聚光灯下的miRNAs已经逐步摆脱了DNA光芒的掩盖，从“配角”变成“主角”，并且对DNA的中心地位提出了新的挑战。近年来，miRNA与肿瘤的关系已经成为研究的热点和重点，已经发现miRNAs通过负调控基因的表达与肺癌，乳腺癌，胃癌，胰腺癌等的发病高度相关。
研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。现有的成熟的技术，包括定性和定量miRNA分子的技术，表明利用血清/血浆miRNAs作为分子生物标志物的方法比传统的特异蛋白分子标记方法将更加有效，为生物标志物开拓了新境界。
然而，目前还没有用于早期非贲门胃癌诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出早期非贲门胃癌异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国非贲门胃癌诊断现状必将是一次有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途径。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种非贲门胃癌早期诊断的血清/血浆miRNA标志物。
本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆miRNAs标志物的引物。
本发明的第三个目的是提供上述血清/血浆miRNAs标志物及其引物在制备非贲门胃癌早期辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第四个目的是提供辅助非贲门胃癌早期诊断的试剂盒。
发明人通过分离和研究早期非贲门胃癌患者及与其性别、年龄匹配的非肿瘤对照(包括健康对照和癌前病变对照)血清/血浆中的miRNAs，寻找一种非贲门胃癌早期诊断的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于临床应用的早期非贲门胃癌诊断试剂盒，为非贲门胃癌的筛查和诊断提供数据支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种非贲门胃癌早期诊断的血清/血浆miRNAs标志物，该标志物为miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p中的任意一种或多种。
所述的血清/血浆miRNAs标志物的引物，这些引物为：
miR-16的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；miR-25的引物为SEQ ID No.3和SEQID No.4；miR-92a的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；miR-451的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；miR-486-5p的引物为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。
所述的血清/血浆miRNAs标志物在制备非贲门胃癌早期辅助诊断试剂盒中的应用。
所述血清/血浆miRNAs标志物的引物在制备非贲门胃癌早期诊断试剂盒中的应用。
一种非贲门胃癌早期辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p中任意一种或多种miRNA的引物。
所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的血清/血浆miRNAs标志物的引物为：
miR-16的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；miR-25的引物为SEQ ID No.3和SEQID No.4；miR-92a的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；miR-451的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；miR-486-5p的引物为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。
所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清/血浆miRNAs差异表达谱分析：选择早期非贲门胃癌以及与病例性别、年龄匹配的健康对照，检测其血清/血浆miRNAs表达谱及含量，分析早期非贲门胃癌和健康对照间血清/血浆miRNAs的共性和特性，筛选差异表达miRNAs。(3)对已筛选的血清/血浆差异表达miRNAs在大样本人群中进行定量分析，确定与早期非贲门胃癌发病相关血清/血浆miRNAs。(4)血清/血浆miRNAs筛查和诊断试剂盒的研制：根据早期非贲门胃癌和非肿瘤对照的特异血清/血浆miRNAs开发用于非贲门胃癌早期辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，并控制疾病分期、患者性别、年龄等因素对于发病的影响)，并采用了RT-PCR、Real-time PCR方法、TaqMan Low Density Array(TLDA)芯片检测等。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择；
(1)经病理学明确诊断的早期(Ⅰ期)非贲门胃癌病例；
(2)采血前未经过手术和放化疗治疗；
(3)与病例性别、年龄匹配的健康对照和癌前病变对照。
本研究共采用230例符合标准的样本进行研究。
2.Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)和miRNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)提取血清/血浆总RNA，按常规方法操作。通常能得到～5μg RNA/50ml血清或血浆。
3.TLDA(Applied Biosystems公司)芯片检测
(1)总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品；
(2)cDNA样品进行预扩增反应；
(3)预扩增产物进行TLDA芯片检测，得到miRNAs的表达谱；
(4)数据分析与处理。
4.Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法
(1)取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；
(2)设计引物；
(3)加入荧光探针或染料进行PCR反应；
(4)检测并比较早期非贲门胃癌病例与非肿瘤对照(包括健康对照和癌前病变对照)血清/血浆样本中miRNAs表达水平的变化。
5.诊断试剂盒制备方法
TLDA芯片检测方法确定早期非贲门胃癌病例与健康对照中有表达差异的miRNAs，通过qRT-PCR技术筛选在早期非贲门胃癌病例与健康对照中表达量稳定且差异程度大的一组血清/血浆miRNAs，作为辅助非贲门胃癌早期辅助诊断的指标。最后筛选出的与早期非贲门胃癌发病有关的血清/血浆miRNAs组成诊断试剂盒(miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p)。诊断试剂盒可以包括这些血清/血浆miRNAs组合的引物、Taq酶和dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用卡方检验(用于分类变量)及student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征；运用Mann-Whitney检验比较miRNA表达水平在研究对象组间分布的差异。
我们在探索性样本(40例早期非贲门胃癌病例和40例健康对照)中运用TLDA芯片的研究结果发现有5种miRNAs与早期非贲门胃癌发病情况有显著关联。个体miRNAs检测的表达水平以2–△CT表示，其中ΔCT=CT样本–CT内参,我们在每一个样本提取时加入cel-mir-39作为参照，计算相对表达量。对有统计学显著差异的miRNAs在另外48例早期非贲门胃癌病例和102例非肿瘤对照(包括48例健康对照和54癌前病变对照)中进行进一步验证，进而观察本研究结果的稳定程度。
为了进一步研究这五种miRNAs构成的综合指征用于早期非贲门胃癌诊断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每种miRNA与早期非贲门胃癌发病的正、负关联情况和联系强度。具体来说，首先通过ROC(Receiver Operating Characteristic Curve，受试者工作特征曲线)确定探索性样本miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p表达量的最佳临界值(ROC曲线左上角的点，该临界点可获得最大的灵敏度和特异度)，并以此临界值为标准分别将这5种miRNAs的表达水平评为0分和1分，然后通过单因素Logistic回归模型，获得探索性样本的回归系数，并以此作为单个miRNA权重，综合考虑每种miRNA的表达情况给每个病人确定一个危险分值。危险分值的计算方法如下：危险分值=(5.142×miR-16的评分)+(5.609×miR-25的评分)+(5.398×miR-92a的评分)+(4.043×miR-451的评分)+(4.181×miR-486-5p的评分)，获得的危险分值系数以及界限值被直接应用于验证人群。
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(SAS，v.9.1.3)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。图形绘制采用Graphpad Prism软件(v.6.01)和R软件(v.2.15.3)完成。
以下是本发明进一步的说明：
在上述符合条件的40例早期非贲门胃癌病例及性别、年龄匹配的40例健康对照作为探索性样本，经TLDA芯片检测获得相关结果。
在TLDA芯片中，选择满足下列条件的miRNAs用qRT-PCR方法进一步的验证：1)两组研究对象的CT值均小于30，或仅有一组研究对象的CT值小于30，并且另一组研究对象的CT值小于35以提高检测效率；2)ΔΔCT=ΔCT病例-ΔCT对照，ΔΔCT大于2，即差异表达大于4倍。
满足上述条件的miRNAs包括：miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p。qRT-PCR对探索阶段单个样本的验证，结果发现TLDA芯片筛选出的5种miRNAs在早期非贲门胃癌病例组和健康对照组中的表达情况存在显著性差异。
根据上述结果，将这5个与早期非贲门胃癌发病相关的miRNAs在另外48例早期非贲门胃癌病例和与其性别、年龄匹配的102例非肿瘤对照(包括48例健康对照和54癌前病变对照)中进一步的验证。我们发现血清/血浆高表达miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p均与早期非贲门胃癌发病相关联。
进一步分析这5种miRNAs的组合用于非贲门胃癌早期诊断的效果，使用AUC(areaunder receiver-operated curve，曲线下面积)发现其组合对非贲门胃癌早期诊断的AUC与单个miRNA相比增加。
根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于非贲门胃癌早期辅助诊断的试剂盒，包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p的引物和其他检测试剂。
具体而言，这5种miRNAs的组合，或者这5种miRNAs的引物组合构成的相关诊断试剂盒有助于非贲门胃癌早期的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持，从而最大限度提高非贲门癌患者的生存率。
本发明的有益效果：
本发明提供的血清/血浆miRNAs标志物作为非贲门胃癌早期辅助诊断的标志物的优越性在于：
(1)血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发有助于非贲门胃癌早期的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)血清/血浆miRNAs试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于非贲门胃癌患者早期辅助诊断，有助于反映早期非贲门胃癌患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(3)采用严密的设计和评价体系，本发明人初期采用TLDA芯片对血清/血浆miRNAs进行检测以获取疾病特异和异常表达的血清/血浆miRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法在大样本中进行了多阶段验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过控制性别、年龄等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆miRNAs在非贲门胃癌早期辅助诊断的应用前景，阐述异常表达的miRNAs对于早期非贲门胃癌进展的影响，揭示其筛查和诊断价值。因此，本发明获得了早期非贲门胃癌发病相关血清/血浆miRNAs表达数据库和特异性标志物；通过血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得非贲门胃癌的早期诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1.显示五种miRNAs在早期非贲门胃癌病例组与对照组的相对表达水平箱线图。
图2.显示探索性阶段，早期非贲门胃癌病例组和对照组的ROC曲线。
图中，AUC=0.989，敏感度=97.5%，特异度=87.5%。
图3.显示验证性阶段，早期非贲门胃癌病例组和对照组的ROC曲线。
图中，AUC=0.812，敏感度=72.9%，特异度=89.2%。
图4.230例样本，早期非贲门胃癌病例组和对照组的ROC曲线。
AUC＝0.890，敏感度=84.1%，特异度=90.8%。
具体实施方式
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2006年开始至今从江苏省人民医院和扬州李典区收集了大量的早期非贲门胃癌患者、健康对照以及癌前病变对照的外周血样品(用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一)，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了230例符合下列标准的样本作为TLDA芯片检测和后续qRT-PCR验证的实验样品：
1、经病理学明确诊断的早期(Ⅰ期)非贲门胃癌病例
2、采血前未经过手术和放化疗治疗
3、与病例性别、年龄匹配的健康对照和癌前病变对照
并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。
实施例2血清/血浆中miRNAs的TLDA芯片检测
将初筛阶段40例早期非贲门胃癌患者和40例健康对照经TLDA芯片检测获得相关结果。具体步骤为：
1、分别取早期非贲门胃癌病例组和健康对照组患者的血清600μl，加入3倍体积的Trizol试剂；
2、相分离:室温放置15min，加入终浓度为10-4pmol/μl的cel-39(TAKARA)作为内参，然后加入与血浆等体积的氯仿，震荡50s，室温15min，14,000rpm,4℃，离心15min；
3、RNA沉淀：将水相转移到新的15ml的离心管，加入1.5倍水相体积的无水乙醇，充分混匀；
4、用QIAGEN miRNeasy kit富集RNA：每次吸取700μl样本至离心柱中，14,000rpm离心15s，弃去收集管中滤液，重复至样本均过柱；加入700μl洗液1，14,000rpm离心15s，弃收集管中滤液；加入500μl洗液2，14,000rpm离心15s，弃收集管中滤液；再加入500μl洗液2，14,000rpm离心2min，弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14,000rpm离心2min以干燥离心管；将离心管放入新的1.5ml管中，加入50μl无核酸酶水，10,000rpm离心1min；将管中的液体倒回离心柱中，14,000rpm离心1min，弃离心柱；
5、测量浓度:通常能得到～1250ng RNA/600μl血清；
6、用TLDA芯片配套的逆转录试剂盒通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括0.8μl逆转录引物(10?)、0.2μl100mM dNTPs混合物、1.5μl逆转录酶(50U/μL)、0.8μl10?逆转录缓冲液、0.9μl25mM氯化镁、0.1μl RNA抑制剂以及0.2μl无核酸酶水。加入3μl(1-350ng)的总RNA。反应步骤为16℃孵育2分钟，42℃反应1分钟，50℃反应1秒，上述3步经40个循环反应，再85℃孵育5分钟；
10、对芯片特异性的miRNAs进行预扩增以增加表达所需的cDNA的量。预扩增的反应体系包括：12.5μl预扩增Master Mix(2?)、2.5μl预扩增引物(10?)、7.5μl无核酸酶水、2.5μl cDNA。反应步骤为：95℃10分钟→55℃2分钟→72℃2分钟→95℃15秒、60℃4分钟，12个循环→99.9℃10分钟；反应结束后加入75μl0.1X TE稀释；
11、取9μl稀释后的预扩增产物，加入450μl基因表达Master Mix，441μl无核酸酶水，充分混匀后，在TLDA芯片上加入100μl/孔；1000rpm离心1min，离心2次。TLDA芯片实验使用的是ABI Prism7900荧光定量PCR仪。选择384-well TaqMan Low Density Array特定的程序进行反应；
12、数据分析与处理：用RQ-Manger软件进行数据处理，CT阈值设为0.2，ΔCT=CT样 本–CT内参(cel-miR-39作为内参用以控制RNA提取时的差异)，两组样品血清miRNA的表达量比值可用方程ΔΔCT表示，ΔΔCT=ΔCT病例-ΔCT对照。运用TLDA芯片检测发现的早期非贲门胃癌病例组和健康对照组中血清差异表达的miRNAs在上文中已经罗列出。
实施例3血清/血浆中miRNAs的qRT-PCR实验
根据上述TLDA结果，选择满足下列条件的miRNAs用qRT-PCR方法进一步的验证：1)两组研究对象的CT值均小于30，或仅有一组研究对象的CT值小于30，并且另一组研究对象的CT值小于35以提高检测效率；2)ΔΔCT=ΔCT病例-ΔCT对照，ΔΔCT大于2，即差异表达大于4倍。对所选择的miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p设计逆转录和qRT-PCR的引物(见表1)。对早期非贲门癌病例组和健康对照组的血清单个个体进行miRNAs的qRT-PCR检测。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。分别用染料法和探针法两种方法进行qRT-PCR检测。
(1)制备RNA样品：a)取100μl血清；b)加3倍体积的Trizol室温放置15min，加入终浓度为10-4pmol/μl的cel-39(TAKARA)作为内参，然后加入与血浆等体积的氯仿，震荡50s，室温15min，14,000rpm,4℃，离心15min；c)将水相转移到新的15ml的离心管，加入1.5倍水相体积的无水乙醇，充分混匀；d)用QIAGEN公司的miRNeasy kit富集RNA：每次吸取700μl样本至离心柱中，14,000rpm离心15s，弃去收集管中滤液，重复至样本均过柱；加入700μl洗液1，14,000rpm离心15s，弃收集管中滤液；加入500μl洗液2，14,000rpm离心15s，弃收集管中滤液；再加入500μl洗液2，14,000rpm离心2min，弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14,000rpm离心2min以干燥离心管；将离心管放入新的1.5ml管中，加入50μl无核酸酶水，10,000rpm 离心1min；将管中的液体倒回离心柱中，14,000rpm离心1min，弃离心柱，将管中的液体作为RNA样品；
(2)探针法：使用ABI试剂盒。
a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录反应体系包括0.15μl 100mMdNTPs混合物、1μl逆转录酶(50 U/μL) 、1.5μl 10X 逆转录缓冲液、0.19μl RNA抑制剂以及3μl 5?逆转录引物一种或几种的混合物。加入9.16μl的总RNA。反应步骤为16℃孵育30分钟，42℃反应30分钟，85℃孵育5分钟；
b)q-PCR：将cDNA加入5μl水稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.25μl  20?MicroRNA检测探针、2.5μl  2?基因表达Master Mix、1.25μl双蒸水，5μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→ 95℃、15秒，60℃、1分钟进行45个循环。
(3)染料法：
a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。染料法的逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合物(Takara公司)、0.5μl RNase抑制剂(Takara公司)、2μlAMV(Takara公司)以及1.5μl miRNA特异性反向引物一种或几种的混合物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；
b)q-PCR：将cDNA按1/5体积稀释，取0.5μl稀释后的cDNA，加入0.15μl Taq酶(Takara公司)，0.5μl 20×EVA GREEN，0.1μl 10μM正向引物一种，0.1μl 10μM 通用反向引物(URP:TGGTGTCGTGGAGTCG，SEQ ID No.13)，0.6μl 25mM MgCl2，0.8μl 2.5mM dNTP 混合物(Takara公司)，1μl 10×PCR缓冲液，6.75μl双蒸水，10μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行45个循环。
(4)数据处理与分析
两组样品血清miRNAs的表达量比值可用方程2–△Ct表示，其中△CT=CT样本 –CT内参, 我们在每一个样本提取时加入cel-miR-39作为参照，计算相对表达量(cel-miR-39: SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12)。
染料法和探针法qRT-PCR结果均发现在初筛阶段的80例样本中，上述5种miRNAs(miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p)在两组间的表达情况存在显著性差异，探针法结果见表2、表4和图1，染料法结果因与探针法类似不再列出。
实施例4血清中微小核糖核酸qRT-PCR实验的进一步研究
根据上述结果，将这5种与早期非贲门胃癌发病相关的miRNA在另外48例早期非贲门胃癌患者与102例年龄匹配的非肿瘤对照(包括48例健康对照和54例癌前病变对照)中进行进一步检测。我们发现上述5种miRNAs(miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p)在早期非贲门胃癌病例组血清中的表达均显著高于对照组(表3、表5和图1)。
实施例5利用危险度评分方法进一步分析5种miRNAs的组合对早期非贲门胃癌发病的诊断
根据上述Real-time PCR结果，本发明人通过对2组血浆样品(早期非贲门胃癌病例组和健康对照组)的miRNAs表达水平的分析，以探索性样本健康对照组miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p表达量的最佳临界值(ROC曲线左上角的点，该临界值可获得最大的灵敏度和特异度)为标准，对这5种miRNAs进行评分，表达量小于最佳临界值为0分，表达量大于最佳临界值评分为1分，以回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这5种miRNAs对早期非贲门胃癌发病的判断能力(见表4和表5)。对5个标志物的联合分析发现，在探索性样本中，这5种miRNAs以0.989的AUC将健康对照组和早期非贲门胃癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为97.5%，特异度：87.5%；在验证样本人群中，这5种miRNAs以0.812的AUC将非肿瘤对照组和早期非贲门胃癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为72.9%，特异度：89.2%(图2和图3)。对于纳入研究的230例样本，这5种miRNAs以0.890的AUC将非肿瘤对照组和早期非贲门胃癌病例组分开，最佳临界点的灵敏度为84.1%，特异度：90.8%(图4)。
因此，本发明人证明了采用miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p能够很好地将非肿瘤对照和早期非贲门胃癌患者区分。
实施例6用于早期非贲门胃癌辅助诊断的miRNA试剂盒的制作
miRNA试剂盒的制作和操作流程是基于TLDA芯片检测，RT-PCR和real-time PCR等技术。试剂盒包括血清/血浆miRNAs引物(包括下列引物：miR-16的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；miR-25的引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；miR-92a的引物为SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6；miR-451的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；miR-486-5p的引物为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶、通用反向引物(URP：TGGTGTCGTGGAGTCG，SEQ ID NO：13)等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的线虫cel-miR-39样本等)。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过探针法检测miRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助诊断早期非贲门胃癌，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。
表1差异表达的miRNAs引物信息
表2. 探索性样本TLDA芯片检测以及单样本qRT-PCR结果比较
1 TLDA芯片检测结果，ΔCT=CT样本–CT内参(以cel-miR-39作为内参)
2ΔΔCT=ΔCT病例-ΔCT对照
3Mann-Whitney U 检验
表3.验证性样本qRT-PCR结果比较
1Mann-Whitney U 检验
表4探索性样本单因素logistic回归分析结果(以对照组表达值ROC曲线的最佳临界值为界值)
表5验证性样本单因素logistic回归分析结果(以探索性样本对照组ROC曲线的最佳临界值为界值)

Claims (8)

1.一种非贲门胃癌早期诊断的血清/血浆miRNA标志物，其特征在于该标志物为以下miRNA中的一种或多种：miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p。
2.权利要求1所述血清/血浆miRNA标志物的引物，其特征在于该引物为：
miR-16的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；miR-25的引物为SEQ ID No.3和SEQID No.4；miR-92a的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；miR-451的引物为SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8；miR-486-5p的引物为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。
3.权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物在制备非贲门胃癌早期辅助诊断试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的血清/血浆miRNA标志物的引物在制备非贲门胃癌早期辅助诊断试剂盒中的应用。
5.一种非贲门胃癌早期辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测血清/血浆中miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p。
6.根据权利要求5所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p中任意一种或多种miRNA的引物。
7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的血清/血浆miRNA标志物的引物。
8.根据权利要求6或7所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的酶和试剂。
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