JP2022532628A - 修飾シアニン色素およびそのコンジュゲート - Google Patents

Abstract

本発明は、光学イメージングの分野に関する。より具体的には、本発明は、改善された物理化学的および生物学的特性を特徴とするシアニンファミリーの化合物、ならびにそれらの生物学的リガンドとのコンジュゲートに関する。本発明はまた、固形腫瘍の画像化または治療における光学的診断薬としてのこれらの化合物の使用、それら化合物の製造方法、およびそれら化合物を含む組成物に関する。

Description

発明の分野
本発明は、光学イメージングの分野に関する。より具体的には、本発明は、改善された物理化学的および生物学的特性を特徴とするシアニンファミリーの化合物、ならびにそれらの生物学的リガンドとのコンジュゲートに関する。本発明はまた、固形腫瘍の画像化または治療における光学的診断薬としてのこれらの化合物の使用、それら化合物の製造方法、およびそれら化合物を含む組成物に関する。

背景技術
色素は、光の励起時に特定の波長の光子を吸収し、量子効率に応じて、通常はより長い波長でそのエネルギーの一部を再放出する化学物質である。特に、シアニン色素は、ポリメチン架橋にまたがる、２つの窒素原子間に閉じ込められた非局在化電子系を特徴とする蛍光有機分子である。それらのいくつかは、好ましい光学特性、低毒性および水性媒体への良好な溶解性を有しており、バイオメディカルイメージングのための造影剤として使用することができる。

インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、フルオレセイン、メチレンブルー、５－アミノレブレン酸（５－ＡＬＡ）など、現在、バイオメディカルイメージングに使用されている蛍光分子は、組織内で受動的に拡散し、種々のホーミング機構によって病理学的領域に蓄積し得る。フルオレセインやＩＣＧのようなフルオロフォアは、受動拡散と強化された透過・保持（ＥＰＲ）効果の組み合わせによって腫瘍組織に分布する（Onda N. et al., Int J Cancer 2016, 139, 673-682）。５－ＡＬＡのような代謝中間体は、代謝が増大した組織に蓄積する（Stummer W. et al., Neurosurgery 2015, 77(5）, 663-673）。特定の分子標的に特化していない他のフルオロフォアは、造影剤により強化したX線または磁気共鳴画像法の原理に従って、腫瘍の生理学的特性（すなわち、増強された灌流および透過性）を利用して画像コントラストを生成する（(Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72(3）, 392-398）。一般に、これらの蛍光造影剤は、適当な視覚化のために比較的大量の線量を必要とする。さらに、偽陽性および偽陰性は、それらの使用に伴って一般的にみられる臨床所見である。(Tummers Q. et al., PlosOne 2015）.

検出の感度および特異性を改善するために、過剰発現した腫瘍受容体を標的とする担体部分に結合した色素を利用する、光学イメージング用のさらなる造影剤が開発中である（Achilefu S. et al, J Med Chem 2002, 45, 2003-2015）。

しかしながら、色素－生体分子コンジュゲートのin vivoでの挙動は、蛍光部分の生物学的特性に強く影響され得る。例えば、シアニンCy5の小さな構造変化によって、関連するバイオコンジュゲートの腫瘍およびオフターゲット組織における蓄積が強力に調節される(Bunschoten A. et al., Bioconjugate Chem. 2016, 27, 1253-1258）。非特異的な蓄積が少なく、標的組織に対する選択性が高い蛍光造影剤が生物への適用に好ましい。

US 6,913,743 B2（Institut fur Diagnostikforschung GmbH）は、例えば、新規な水溶性色素およびそれらの生体分子付加体を造影剤として使用するインビボ診断プロセスを開示している。

WO2018/189136およびWO2016/097317（いずれもBracco Imaging SpA）は、術中イメージングにおける腫瘍縁の境界設定に使用される化合物ＤＡ３６４を開示している。このような化合物は、スルホ-Cy5.5色素と結合したアザ－ビシクロアルカンベースの環状RGDペプチドである。

ｃＲＧＤペプチドに結合しているＩＣＧのコンジュゲートの例が、Capozza et al, Photoacoustics, 2018, 11, 36-45に開示されており、これは腫瘍の光音響イメージングに使用される。

US 6,329,531 B1（Schering AG）は、ＮＩＲ放射線による神経変性疾患の診断のための光学診断薬に関するものであり、特に、蛍光標識としてヘプタメチンシアニン色素が開示されている。これらのシアニン色素のいくつかは、例えば、Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72(3）, 392-398 や Ebert et al., J. Biomed. Optics, 2011, 16(6）, 066003に開示されており、臨床的に承認された色素ＩＣＧと比較されている。特に、後者は、ＭＲＩ造影剤と同様の物理化学的特性を示し、ＩＣＧとは異なり、細胞外水の範囲での分布量で血管外分布を特徴とするＳＩＤＡＧという化合物を開示す。ＳＩＤＡＧは、ＩＣＧの親水性代替品であり、その無視できる血管外漏出と急速な肝臓への取込みという技術的な問題を解決するように設計されている。しかしながら、分子イメージングのための蛍光プローブとしてのそのような化合物、特にＳＩＤＡＧの可能な使用について、およびこのような対称シアニン誘導体の機能的誘導体化やさらなるコンジュゲーションのための何等かの合成アプローチについては言及されていない。例えば、ＳＩＤＡＧは、ガドペンテチン酸（Ｇｄ－ＤＴＰＡ）のようなＭＲＩ造影剤の挙動を模倣する血管外分布パターンを有する生物学的に不活性な色素として提案された。ＳＩＤＡＧは、変化を受けた腫瘍血管の細孔から急速に拡散するため、受動拡散をよって腫瘍組織のより深い領域に到達できるが、病的な細胞や組織内に高い効率と特異性で内在化および蓄積する能力のような、分子イメージングへの応用に必要な機能を欠いている。

WO2005/123768（Amersham Health AS）には、血管新生関連疾患の診断のための光学イメージングの造影剤として適した少なくとも1つのシアニン色素レポーターで標識された新規なペプチドベースの化合物が記載されている。

WO2012/088007（Pierce Biotechnology Inc. and Dyomics Gmbh）には、インドール複素環骨格上に２～４個のスルホン酸官能基を有するシアニン色素が開示されている。

適当な造影剤を見つけるための努力がいくつかなされているものの、依然として、最適な安定性と蛍光効率、ならびに最適な物理化学的および生物学的特性を備え、生物の光学的イメージングのために設計された改良された色素を見いだす必要がある。この必要性は、分子エピトープまたは病的な組織（例：腫瘍）に特異的に結合する生体分子に色素が結合している場合など、微細な分子変化をイメージングし、標的細胞に高い効率で蓄積する能力を備えた、特異性の高いツールを必要とする分子イメージングのための応用にとって特に重要である。本発明は、これらおよび他の必要性に対処するものである。

一般的に、本発明の目的は、光学イメージングのための造影剤として有用であり、上記の問題を解決することを目的とした、新規なシアニン色素、特に結合部分へのそれらの対応するコンジュゲートを提供することである。特に、本発明は、分子イメージングの応用に最適な特性を有する光学イメージング剤を得るという技術的課題にに取り組むものである。例えば、本発明の新規なシアニン誘導体は、生物学的基質と相互作用し、病的な細胞や組織に蓄積するのに特に適当な特性を示すことが見出された。

本明細書に記載の新規なシアニン誘導体は、驚くべきことに、低い線量での画像化効率の改善およびＳ／Ｎ比の改善につながる顕著な光学特性を備えている。さらに、本発明者らは、光学イメージングのための非常に特異的で高感度の造影剤を提供する、新規なシアニン色素を合成するための、そして、それらを結合部位として作用する適当な官能基を介して種々の標的化部分とコンジュゲートさせるための、適当な手順を発見した。本発明で提供される色素、スペーサーおよび標的化部分の新規な組み合わせは、驚くべきことに、光学イメージング剤に対して最適な細胞内在化効率と分子造影のための全体的特性を備えた化合物をもたらした。

詳細には、本発明の化合物によって達成できるいくつかの利点の中で、特に結合部分とのコンジュゲートについて、例えば、以下の特徴を強調することができる：血漿タンパク質との相互作用が低い、標的組織に対して選択的で他の組織との非特異的な相互作用に起因する蓄積は低い、水への溶解性が高い、全身投与後の副作用は無視できるか観察されない、投与後の血漿中の化学的および光学的安定性が良好。

特に、本発明の化合物は、ヒトアルブミンに対して非常に低い結合親和性を有することが見出され、このことは、これらの化合物をヒトでの画像化に使用する場合に特に有利である：この低い親和性は、アルブミンなどの血液中に存在する大きなタンパク質によって化合物が血漿コンパートメントに隔離され、その結果として目的の組織における蓄積に利用可能な遊離色素の割合が減少することを防ぐ。実際、高分子量のアルブミンは、結合した色素の挙動を決定するため、色素のアルブミン結合画分は巨大分子の輸送速度で組織に蓄積し、健康な組織や器官において望ましくない非特異的蓄積を引き起こす。この生物学的特性は、色素コンジュゲートの場合においては特に重要である。なぜなら、それらの遊離画分（アルブミンに結合していない）のみが分子標的と適切に相互作用でき、特定の抗原を発現する細胞によって効率的に内在化できるからである。

本発明のさらなる態様は、特にヒトまたは動物の器官または組織の光学的イメージングに使用するための、画像化が器官の断層撮影画像化、血管造影を含む器官機能のモニタリング、尿路造影、胆管造影、神経造影、術中の癌識別、蛍光ガイド下手術、蛍光ライフタイム造影、短波長赤外線造影、蛍光内視鏡検査、蛍光腹腔鏡検査、ロボット手術、オープンフィールド手術、レーザーガイド下手術、または光音響法または超音波蛍光法である、光学的イメージングの方法に使用するための、診断剤としてのそのような色素コンジュゲートに関する。

さらに、本発明は、提供される色素、対応するコンジュゲートおよび／またはそれらの薬学的に許容される塩の調製のための製造方法、および診断薬の製造におけるそれらの使用に関する。

さらなる態様によれば、本発明は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤との混合物中に、本発明の少なくとも１つの色素または色素コンジュゲート化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的に許容される組成物に関する。該組成物は、特に、ヒトまたは動物の器官または組織の有用な画像化を提供するための光学的イメージング剤として有用である。

別の態様では、本発明は、本発明の化合物の有効量の使用を含んでなる、光学的イメージング技術の使用による身体の器官、組織または領域の光学的イメージングのための方法に関する。

発明の詳細な記載
したがって、本発明の第１の目的は、式（Ｉ）で示される化合物またはその薬学的に許容される塩を提供することである。

式中、
Ｒ１およびＲ２は独立して－ＣＯ－ＮＨ－Ｙ基であり、Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基で置換されている、直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択され；
Ｒ３は、－ＮＨ_２、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ_２から選択される基で置換された直鎖または分岐鎖のアルキルであり；
Ｒ４は直鎖または分岐鎖の鎖の二価アルキルであり；
Ｒ５は－ＣＯＯ－および－ＣＯＮＨ－から選択され；
Ｓはスペーサーであり；
Ｔは標的化部分であり；
ｎは、１、２、または３に等しい整数であり；
ｍは０または１に等しい整数である。

本発明はさらに、式（ＩＩ）で示される中間体化合物、またはその薬学的に許容される塩によって表される対応する官能化色素を提供する。

式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびｎは、上で定義されたとおりであり、
Ｒ５’は、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＯ－Ｐｇ、および－ＣＯＮＨ－Ｐｇから選択され、ここで、Ｐｇは保護基である。

本発明はまた、合成による変換工程によって、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を調製するための方法に関する。

本発明はまた、ガイド下手術において腫瘍縁を検出するための蛍光プローブとして使用するための式（Ｉ）の化合物を含む。

定義
本明細書の記載において、および別段の定めがない限り、本明細書で使用される以下の用語は、以下の意味を有することを意図している。

「直鎖または分岐鎖のアルキル」という表現は、脂肪族炭化水素基を指し、鎖中に１から８個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の鎖であり得る。例えば、「Ｃ_４アルキル」は、その意味において、４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の鎖を含む。代表的で好ましいアルキル基には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチルおよびヘキシルが含まれる。特に明記しない限り、直鎖または分岐鎖のアルキルは一価の基である。場合によっては、２個以上の水素原子が、上記の炭化水素基から除去され、置換されている「二価の」または「多価の」基（例えば、メチレン、エチレン、イソプロピレン基など）であり得る。

本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、その意味において、３から７個の炭素原子を含む飽和（すなわち、脂環式）炭素環を含む。適当な例としては、Ｃ_５－Ｃ_７炭素環（例えば、シクロヘキシル環）が挙げられる。

本明細書で使用される「ヘテロシクリル」という用語は、環状鎖にＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子をさらに含む飽和脂環式環、好ましくは５～７員の飽和環、を含む。好ましくは、テトラヒドロピランを指す。

「ヒドロキシアルキル」という用語は、１つまたは複数の水素原子がヒドロキシル基で置き換えられている対応する任意のアルキル鎖を指す。

「アルコキシ」という用語は、その意味において、１つまたは複数の酸素原子をさらに含む上で定義されたアルキル鎖を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソ－プロポキシなどのアルキル－オキシ基、およびアルキル鎖が１つまたは複数の酸素原子によって中断されているアルキル－（ポリ）オキシ基が含まれる。

本明細書において、「保護基」（Ｐｇ）という用語は、それが結合している基の機能を保存するのに適した保護基を指す。具体的には、保護基は、アミノ、ヒドロキシル、またはカルボキシル機能を保存するために使用される。適当な保護基としては、例えば、ベンジル、カルボニル（ホルミル、９－フルオロメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニルまたはアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）など）、アルキル（例えば、ｔｅｒｔ－ブチルまたはトリフェニルメチル）、スルホニル、トリフルオロアセチルなどのアセチル基、ベンジルエステル、アリル、または当業者によく知られているそのような機能の保護に一般的に使用される他の置換基（例えば、文献T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4^th Ed., Ch. 5を参照）が挙げられる。

より具体的には、本発明は、Ｒ５’の官能基、すなわち、カルボン酸またはカルボキサミドが、上で定義された適当な保護基（Ｐｇ）、好ましくはアルキル基で保護されている式（ＩＩ）の化合物を含む。そのような誘導体は、例えば、式（Ｉ）で示される所望の化合物またはその塩の調製における適当な前駆体または中間体化合物としての用いられる。

必要に応じて、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物の調製において、Ｒ１およびＲ２のヒドロキシル基および／またはＲ３の官能基を適当な保護基（Ｐｇ）で保護して、例えばアセトキシ、アルコキシ、エステルまたはアミド基を形成することもできる。

「カップリング試薬」という表現は、例えば、カルボキシル部分とアミノ部分との間のアミド結合の形成に使用される試薬を指す。反応は、２つの連続するステップからなり得る：カルボキシル部分の活性化、次いで、活性化されたカルボン酸によるアミノ基のアシル化。
そのようなカップリング剤の非限定的な例は、以下からなる群から選択される：カルボジイミド（例えば、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）など）；ホスホニウム試薬（例えば、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセトアト－Ｏ２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ）および３－（ジエトキシホスホリルオキシ）－１，２，３－ベンゾトリアジン－４（３Ｈ）－オン（ＤＥＰＢＴ）など）；およびアミニウム／ウロニウム－イモニウム試薬（例えば、Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１ －イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＡＴＵ）、Ｏ－（１Ｈ－６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、１－［１－（シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデン－アミノオキシ）－ジメチルアミノ－モルホリノ］－ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）およびフルオロ－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＦＦＨ）など）または当業者によく知られている他の化合物。

「活性化されたカルボン酸」という表現は、遊離のカルボキシル基よりも求核攻撃を受けやすいカルボキシル基の誘導体を指し、適当な誘導体としては、例えば、酸無水物、チオエステル、ハロゲン化アシル、ＮＨＳエステルおよびスルホＮＨＳエステルが挙げられる。

「部分」または「残基」という用語は、本明細書では、直接または適当なリンカーおよび／またはスペーサーを介して分子の残りの部分に適切に結合またはコンジュゲートする場合の所与の分子の残余部分を定義することを意図している。

「造影剤」という用語は、適当な画像診断技術と関連して使用される場合、生きている哺乳動物患者、好ましくはヒト患者ならびに人体の器官、領域または組織に由来する細胞、生体液および生体組織を含む生物学的成分をインビトロまたはインビボで視覚化または検出するために使用できる検出可能な実体を指す。

標的化部分（Ｔ）
本発明によれば、標的化部分（Ｔ）は、生物学的標的に特定の選択性で結合し、特定の組織または体の一部における造影剤の蓄積を促進する分子である。一般的に、標的化部分は生物学的システムで使用するための天然または合成分子として表される。そのような特異的結合は、例えば、小分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、酵素基質、抗体または抗体の断片またはアプタマーなどのリガンドを介して達成され、目的の組織または細胞の表面に発現する特定の生物学的標的と相互作用する。

本発明の化合物の適当な生物学的標的は、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体（ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２など）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体（ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ２など）；炭酸脱水酵素（ＣＡ）（ＣＡＩＸ、ＣＡＩＩまたはＣＡＸＩＩなど）；ムチン糖タンパク質（ＭＵＣ１など）；グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ－１など）；ナトリウム水素アンチポーター（ＮＨＥ１など）；癌胎児性糖タンパク質（癌胎児性抗原（ＣＥＡ）など）；ケモカイン受容体（ケモカイン受容体タイプ４（ＣＸＣＲ４）など）；細胞接着分子（ＩＣＡＭ、ＥＰＣＡＭ、ＶＣＡＭ、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチンなど）；肝細胞増殖因子ＨＧＦＲ（ｃ－ｍｅｔ）；トランスフェリンの受容体；エフリン受容体（ＥＰＨＡ２など）；葉酸の受容体（ＦＲ－アルファなど）；糖タンパク質結合イアルロン酸（ＣＤ４４など）：ボンベシン受容体（ＢＢ１、ＢＢ２、ＢＢ３など）；Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタミン酸（ＮＡＡＧ）ペプチダーゼ（前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）など）；および特にインテグリン受容体（α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、α_ｖβ_６またはα_５β_１インテグリン受容体など）であり得る。

例えば、インテグリン受容体標的化部分は、配列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含む直鎖状または環状ペプチドによって表される。このトリペプチドは受容体に対して高い結合特異性を持っており、細胞膜に存在するインテグリン受容体のファミリーによってリガンドとして認識される。実際、このＲＧＤモチーフを利用して細胞接着を仲介する、フィブロネクチンやビトロネクチンなどの、細胞外マトリックス糖タンパク質において同定されている。

したがって、例えばｃＲＧＤ、ｃＲＧＤｆＫ、ｃＲＧＤｙＫ、ｃＲＧＤｆＣ、ＲＧＤ－４Ｃ、ＲＧＤ－２Ｃ、ＡＨ１１１５８５、ＮＣ１００６９２、ＲＧＤ－Ｋ５などの配列Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含む線状および環状ペプチドおよびペプチド模倣物（Kapp et al., Sci Rep, 2017, 7：3905）、またはそれらの類似体および誘導体は、細胞膜インテグリンが健康な組織と比較してアップレギュレートされている癌組織を標的とする結合モチーフのよく知られた例である。

一実施形態では、本発明の化合物は、他の小分子、ペプチド、タンパク質または抗体（例えば、治療にすでに使用されているモノクローナル抗体など）にコンジュゲートすることができる。薬物アセタゾラミドを含む小分子（例えば化合物４ａ、５ａ、６ａ、７ａおよび８ａ（Wichert et al., Nat Chem 2015, 7: 241-249など）、またはそれらの類似体および誘導体は、酵素ＣＡＩＸを標的とする小分子の例である。線状および環状ペプチドおよびペプチド模倣物（ペプチドＧＥ１１（Li et al., FASEB J 2005, 19:1978-85に記載）および／またはペプチドＬ１（Williams et al., Chem Biol Drug Des 2018, 91:605-619に記載）など）、またはそれらの類似体および誘導体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするペプチドの例である。タンパク質では、上皮成長因子（ＥＧＦ）の誘導体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする小さなタンパク質の例である。抗体では、パニツムマブとセツキシマブは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするモノクローナル抗体の例である。

好ましくは、本発明の標的化リガンドは、腫瘍細胞または組織と選択的に結びつけることことができる。特に、脳癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、皮膚癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌、口腔癌、肺癌、腎臓癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、結腸直腸癌から選択される腫瘍に結びつけることができる。さらに、標的化リガンドは、癌の発生源とは異なる種々の組織や器官における上記の癌の転移性の広がりと結びつけることができる。さらに、標的化リガンドは、種々の組織および器官における前腫瘍性病変および異形成と結びつけることができる。

一実施形態では、標的化部分はまた、金属と複合体化して強固に結合するキレート剤であり得る。
そのような金属キレート剤の例は当業者に知られており、従来技術において報告されており、例えば、ＤＯＴＡ、ＮＯＤＡＧＡ、ＴＥＴＡ、ＣＢ－ＴＥ２Ａ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、デフェロキサミン、ＮＯＴＡ、ＡＡＺＴＡなどの分子を挙げることができる。これらのキレート剤は、Ｇｄ^３＋やＭｎ^２＋などの金属との複合体形成に使用でき、磁気共鳴イメージングの造影剤として適用できる。好ましい実施形態では、キレート剤を使用して放射性金属（テクニチウム、インジウム、フッ化アルミニウム、ジルコニウム、イットリウム、ルチチウム、スカンジウム、アチニウム、ガリウムまたは銅など）との複合体を形成し、例えば、陽電子放出断層撮影、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法、およびガンマカウンティングによる分析における造影剤として用いることができる。

スペーサーＳ
本発明によれば、Ｓは、場合により存在する、標的部分と色素を分離するスペーサーである。スペーサーの存在は、標的化部分と色素が互いに好ましくない相互作用をするリスクがある実施形態に特に関連する。さらに、色素が比較的大きく、標的部位への標的化部分の結合を妨害する可能性がある場合、スペーサーの存在が必要となり得る。

スペーサーは、色素が標的から離れて位置するよう、フレキシブル（例えば、単純なアルキル鎖）かまたはリジット（例えば、シクロアルキルまたはアリール鎖）であり得る。スペーサーはまた、生体内でイメージング剤として使用される式（Ｉ）で示されるコンジュゲートの薬物動態および代謝を改変することができる。

親水性スペーサーは、血漿タンパク質との相互作用を減少し、血液循環時間を減少し、排出をを促進し得る。例えば、スペーサーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である場合、インビボでのイメージング剤の薬物動態および血液クリアランス速度は変化し得る。そのような実施形態では、スペーサーは、バックグラウンド組織（すなわち、筋肉、血液）からのイメージング剤の排出を改善することができ、したがって、高い標的対バックグラウンドコントラストにより、より良い診断画像を得ることができる。さらに、特定の親水性スペーサーの導入は、イメージング剤の排出を肝臓から腎臓へとシフトし、したがって、全身の保持が減少し得る。

したがって、好ましい一実施形態では、スペーサーは、－ＮＨ（ＣＨ_２）_ｐＣＯＯ－、－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯ－および－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ）_２Ｏ）_ｐＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ－（ここで、ｐは０から２０までの整数、好ましくは、ｐは２、６または１２である）からなる群から選択される。

必要がなければ、スペーサーは不在（すなわち、ｍは０であり、Ｓは直接の結合を表す）であるのが好ましい。

スペーサー、またはスペーサーが存在しない場合の標的化部分は、式（ＩＩ）の化合物において連結部分Ｒ５’として表される、Ｒ５残基で式（Ｉ）の化合物において結合することができる。

Ｒ５’の連結基は、化学結合の形成によって色素を標的化部分にコンジュゲートさせるのに適した、カルボン酸またはカルボキサミド残基などの反応性官能基である。

例えば、アミン含有標的化部分（Ｔ）が、Ｒ５’がカルボン酸である式（ＩＩ）の化合物とコンジュゲートされる場合、このカルボン酸は、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルまたは混合無水物を形成する、活性化試薬を使用するより反応性の形態での変換によるコンジュゲーションを実施する前に、必要に応じて活性化され得る。次に、式（Ｉ）の対応する化合物を得るために、アミン含有標的化部分を、得られた活性化された酸で処理して、アミド結合を形成する。通常、この反応は水性緩衝液中で行われる。

あるいは、「非活性化」カルボン酸を使用して直接コンジュゲートを行ってもよい。
同様に、Ｒ５’の連結基がカルボキサミド基である場合、適当な標的化部分の結合手順は同様であるが、リンカーの活性化ステップは一般的に必要なく、色素と標的化部分を直接処理する。

上記の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、１つまたは複数の不斉炭素原子（キラル炭素原子とも称される）を有していてもよく、したがって、ジアステレオマーおよび光学異性体を生じ得る。特に規定しない限り、本発明は、そのようなすべての可能なジアステレオマーならびにそれらのラセミ混合物、それらの実質的に純粋な分割されたエナンチオマー、すべての可能な幾何異性体、およびそれらの薬学的に許容される塩をさらに含む。

本発明はさらに、Ｒ３および／またはＲ５’の官能基、例えば、スルホニル、カルボキシアミノまたはカルボキシル基、が薬学的に許容される塩の形態であり得る、上記の式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物に関する。

一実施形態では、本発明は、Ｒ１およびＲ２が独立して－ＣＯ－ＮＨ－Ｙで示される基であり、Ｙは、場合によりＲ１およびＲ２について同じ部分であり、２～５個のヒドロキシル基で置換されている、直鎖または分岐鎖の鎖のアルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択される、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物に関する。

好ましい実施形態において、本発明は、ｎが３であり、Ｒ３が－ＳＯ_３Ｈで置換されているアルキルであり、Ｒ１およびＲ２が、同じかまたは異なっていてもよく、以下からなる群から選択される、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物に関する。

より好ましくは、ｎは３であり、Ｒ３は、－ＳＯ_３Ｈで置換されたアルキルであり、Ｒ１およびＲ２は同一である。

本発明の別の実施形態では、ｍは０であり、スペーサー（Ｓ）は直接の結合として表されるか、またはｍは１であり、スペーサーは、アルキル、シクロアルキル、またはアリール基を含む親水性部分である。

好ましくは、スペーサーは、－ＮＨ（ＣＨ_２）_ｐＣＯＯ－、－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯ－および－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ－（ここで、ｐは０から２０までの整数、好ましくはｐは２、６または１２である）から選択される。

さらなる実施形態において、Ｔは、小分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、酵素基質、抗体または抗体の任意のフラグメント、およびアプタマーから選択される標的化部分である。
好ましくは、Ｔはペプチドとして表され、特に、インテグリン受容体（α_vβ₃、α_vβ₅、α_vβ₆、α₅β₁など）、好ましくはα_vβ₃インテグリン受容体、と相互作用する部分として表される。

別の好ましい実施形態において、本発明は、ｎが３であり、Ｒ３が－ＳＯ_３Ｈで置換されたＣ_４－アルキルであり、Ｒ１およびＲ２がいずれも上で定義した基（ｉｖ）である、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物であるか、あるいは、それぞれ次の式（Ｉａ）または（ＩＩａ）で示される化合物に関する。

式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ５’、Ｓ、ｍおよびＴは上で定義したとおりである。

別の実施形態では、本発明は、ｎが１または２である、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物に関する。

特に、Table IaおよびIbに記載される式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物が好ましい。

本発明はまた、下記の記載で説明するとおり調製した式（Ｉ）および（ＩＩ）で示される化合物を合成するための方法に関する。本発明の化合物は、ヒトおよび動物両方の腫瘍の検出における造影剤として有用である。したがって、本発明は、特に腫瘍がインテグリン受容体の過剰発現の減少または変動を示す腫瘍である、個々の患者のガイド下手術における腫瘍縁の検出および境界設定のための蛍光プローブとして使用するための、上で定義した式（Ｉ）で示される化合物を提供する。好ましくは、画像化される対象はヒトである。

本発明はまた、腫瘍縁の検出および境界設定がＮＩＲ放射線下で行われる、上で定義された蛍光プローブとして使用するための式（Ｉ）の化合物を提供する。

本発明のさらなる態様は、上で定義された式（Ｉ）または式（ＩＩ）の色素のコンジュゲートまたはその塩と、１つまたは複数の薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。

本発明の別の態様は、上で定義された式（Ｉ）のコンジュゲートを含む診断キットに関する。さらに、キットは、光学イメージングを実施するためのさらなるアジュバントを含み得る。これらのアジュバントは、例えば、適当な緩衝液、容器、検出試薬、または使用説明書である。キットは、好ましくは、本発明の化合物の静脈内投与のためのすべての材料を含む。

本発明の化合物は、イメージングの手順に先立ち、画像化される器官または組織に全身的または局所的に投与され得る。例えば、化合物は静脈内投与することができる。別の実施形態では、化合物は非経口または経腸投与され得る。組成物は、腫瘍、組織または器官の所望の光学的画像を得るのに有効な用量で投与され、これは、使用される化合物、イメージング手順に供される組織、使用されるイメージング装置などに依存して大きく変わり得る。イメージング剤の正確な濃度は、実験条件や所望の結果に依存するが、通常、０．０００００１ｍＭ～０．１ｍＭの範囲であり得る。最適な濃度は、最小限のバックグラウンド蛍光で満足のいく結果が得られるまで系統的に変化させて決定される。投与した後、本発明のイメージング剤は、組織層を通過することができる光または他の形態のエネルギーに曝露される。放射線波長または波長帯は、光増感剤の励起波長または波長帯と一致しており、対照の非標的細胞やその他（血液タンパク質を含む）による吸収が低いことが好ましい。通常、光学的シグナルは観察または機器で検出可能であり、その応答は蛍光または光の強度、分布、および寿命に関連する。

合成の説明
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の、それ自体または生理学的に許容される塩の形態での調製は、本発明のさらなる目的である。本発明のシアニン色素および色素コンジュゲートは、例えば、以下のセクションおよび実験パートに記載される方法に従って調製することができる。シアニン色素の調製に関する一般的な教示は、スルホインドシアニン色素の合成とラベリングに関する、Mujumdar R.B. et al., Bioconjugate Chem. 1993, 4(2）, 105-111に記載されている。しかしながら、本発明のシアニンは、適当な合成アプローチの設定を必要とする当技術分野の化合物には存在しない特定の官能化パターンによって特徴付けられる。実際、他の既知のシアニンとは異なり、本発明の化合物は、異なる方法で誘導体化される３つの官能部分（カルボン酸またはアミノ／アミド基）も有するので、多くの場合、所望の官能基上で反応させるために保護基の使用が必要であった。

ポリメチン骨格の安定性が損なわれて色素が著しく劣化する場合があるため、保護基の除去に必要な強いｐＨおよび温度条件でシアニンを操作すると問題が生じ得ることが知られている。

さらに、Ｒ５のカルボキシル基を脱保護する場合に、アミド基Ｒ１およびＲ２の加水分解および分解の可能性に起因する、さらなる問題に遭遇することもある（通常、アミド誘導体は濃アルカリ性媒体中で加水分解し得る。例えば、Yamana et al, Chem. Pharm. Bull., 1972, 20(5）, 881-891を参照）。

予想に反して、本発明の化合物は、塩基性ｐＨ（すなわち、ｐＨ約１１）で非常に安定であることが見出され、保護基の除去中に観察される分解は無かったか無視できる程度であった。

好ましい実施形態では、Ｒ５’で示される部分の保護基はエステル基である。
より好ましくは、エチルエステル基を有利に使用することができる。

式（ＩＩ）のシアニン色素の調製
本発明によれば、式（ＩＩ）の化合物は、Ｒ１がＲ２と同じである実施形態については、以下のスキーム１に示される一般的な合成プロセスにより、あるいは、Ｒ１とＲ２が別の意味を有する実施形態については、以下のスキーム２に示される一般的な合成プロセスにより、調製することができる。

上記のスキーム１において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびｎは上で定義された通りであり、Ｒ５’’は－ＣＯＯＰｇまたは－ＣＯＮＨＰｇであり、Ｐｇは保護基であり、Ｒ５’’’は－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＮＨ_２であり、Ｘは、ハロゲン、メシレート、トリフラートなどの適当な脱離基である。

したがって、本発明の製造方法は、以下の工程を含む：
ａ）ある量の５－カルボキシ－２，３，３－トリメチルインドレニン（ＩＩＩ）を求核試薬Ｒ３－Ｘ（ＩＶ）（ここで、Ｒ３は上記で定義したとおりであり、Ｘはハライド基などの適当な脱離基であるか、またはＲ３－ＸはＣ_１～Ｃ_６アルカンスルホン分子を表す）で処理し、中間体（ＶＩ）を得；
ｂ）別のある量の５－カルボキシ－２，３，３－トリメチルインドレニン（ＩＩＩ）を求核試薬Ｒ５’’－Ｒ４－Ｘ（Ｖ）（ここで、Ｒ５’’とＲ４は上で定義されたとおりであり、Ｘはハライド基などの適当な脱離基である）で処理し、中間体（ＶＩＩ）を得；
ｃ）中間体（ＶＩ）および中間体（ＶＩＩ）を試薬（ＶＩＩＩ）と反応させて、シアニン骨格（ＩＸ）（ここで、ｎ、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５’’は上で定義された通りである）を得；
ｄ）例えばグルカミン、メグルミン、グルコサミン、トロメタモール、セリノールまたはイソセリノールなどのポリヒドロキシル化アミンを用いて、インドレン環上のカルボン酸基を誘導体化し；
ｅ）場合により、得られた中間体（Ｘ）から保護基を除去し、式（ＩＩ）の化合物またはその塩を単離する。

工程ａ）およびｂ）に従って、誘導体（ＩＩＩ）と求核試薬Ｒ３－Ｘ（ＩＶ）またはＲ５’’－Ｒ４－Ｘ（Ｖ）との反応を、ニートでまたは高沸点溶媒（ブチロニトリル、スルホラン、１，２－ジクロロベンゼン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドなど）中で、溶液を高温（例えば９０℃～１８０℃）にて数時間（典型的には１２時間～５日間）、攪拌しながら行うことができる。

工程ｃ）に従って、反応を、ビスアニリド形態（スキーム１で示されるように）またはビスアルデヒド形態のビルスマイヤー試薬を用いて実施することができる。反応は、例えばエタノール、メタノール、無水酢酸または酢酸などの溶媒中、トリメチルアミン、ピリジン、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどの種々の塩基を添加してまたは添加せずに、混合物を種々の温度（４５℃～１２０℃）にて数時間（通常２～２４時間）撹拌しながら実施することができる。

工程ｄ）に従って、反応を、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、ＤＳＣ、ＤＣＣ－ＮＨＳなどのいくつかのカップリング剤と、ＴＥＡ、ＤＩＰＥＡ、ＮＭＭ、ピリジンなどのいくつかの有機塩基を用い、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリルなどの溶媒中、室温で３０分～数時間の適当な時間、実施することができる。

場合により、工程ｅ）に従って、中間体（Ｘ）の保護基を、例えば、T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4^th Ed., Ch. 5に記載されている既知の手順に従って、Ｒ５’’で示される部分から除去する。

あるいは、上記のとおり、Ｒ１がＲ２と異なる場合は、式（ＩＩ）の化合物を、以下のスキーム２に示すように調製することができる。

式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびｎは上で定義されたとおりであり、Ｒ５’’は－ＣＯＯＰｇまたは－ＣＯＮＨＰｇであり、Ｐｇは保護基であり、Ｒ５’’’は－ＣＯＯＨまたは－ＣＯＮＨ_２であり、Ｘは、ハロゲン、メシレートまたはトリフラートなどの適当な脱離基である。

スキーム２に従って、ポリヒドロキシル化アミンを、工程ｂ’）で中間体（ＶＩＩ）と反応させて、残基－Ｒ２を有する中間体（ＸＩ）を形成し、その後、工程ｃ）のビルスマイヤー反応を実行してシアニン（ＩＸ）を形成する。他の異なる残基－Ｒ１は、後でもうひとつのインドレニン環に付加できる。あるいは、－Ｒ１を、工程ｃ）を実行する前に、対応する工程ａ’）で中間体（ＶＩ）に導入してもよい。

したがって、工程ｂ’）、および／または場合により工程ａ’）は、工程ｄ）について上で説明したように実行される。さらなる実施形態では、本発明の製造法に従って調製した式（ＩＩ）の化合物は、周知の合成条件に従って操作することにより、式（ＩＩ）の別の化合物に都合よく変換することができ、可能な変換の例は以下のとおりである：
ｆ）Ｒ５’’’が－ＣＯＯＨである式（ＩＩ）の化合物、すなわち式（ＩＩｂ）で示される化合物を、Ｒ５’’’が－ＣＯＮＨ_２である式（ＩＩ）の対応する化合物、即ち式（ＩＩｃ）で示される化合物に変換する。

工程ｆ）に従って、式（ＩＩｂ）で示されるカルボン酸の、式（ＩＩｃ）で示される対応するカルボキサミドへの変換は、カルボキサミドの調製について当技術分野で広く知られている様々な方法および実験条件で実施することができる。一例として、カルボン酸を、最初に適当な活性エステルに変換した後、好ましくはＨＢＴＵなどのカップリング剤の存在下で、ＮＨ_４Ｃｌなどのアンモニウム塩と反応させることができる。

式（Ｉ）のコンジュゲート化合物の調製
次に、スキーム３に示されるように、式（ＩＩ）のシアニン誘導体またはその塩を、場合によりスペーサーを挿入して、適当な標的化部分とコンジュゲートし、式（Ｉ）の対応する化合物を得ることができる。

コンジュゲーションは、当技術分野で知られている種々の手順、例えば、官能基Ｒ５’’’を標的化部分の求核性残基と、または場合によりスペーサーとともに、直接反応させる直接のカップリングにより、あるいはＲ５’’’で示される官能基（典型的には酸）を、より反応性の高い基（例えば、ＮＨＳなどのエステル）に変換する活性化後にカップリングすることによって、実施することができる。

上記の方法に従って調製した式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物が異性体の混合物として得られる場合、従来の技術を用いる式（Ｉ）または（ＩＩ）の単一の対応する異性体への分離は本発明の範囲内である。

最終化合物は、慣用の手順（例えば、クロマトグラフィーおよび／または結晶化および塩形成）を用いて単離および精製することができる。

上で定義された式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、薬学的に許容される塩に変換することができる。上で定義された式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に製剤化して医薬組成物とすることができる。

図１は、Balb/c nu/nuマウス（ｎ＝５／群）に化合物１を３種類の用量で静脈内投与した後の健康な筋肉組織の蛍光シグナルの減衰を表す（0.3 nmol／マウス 〇、1 nmol/マウス □、3 nmol/マウス △）。 図２は、U87MG細胞（1,000万個）を移植したBalb/c nu/nuマウスに1nmolの化合物1を静脈内投与した後の腫瘍（●）と筋肉組織（〇）の蛍光減衰（左のy軸）、および腫瘍対バックグラウンド比の経時変化（□、右のy軸）を表す。 図３は、Detroit-562細胞（250万個）を移植したBalb/c nu/nuマウス（ｎ＝５）に３ｎｍｏｌ／マウスの用量で投与した化合物１の腫瘍対バックグラウンド比（ＴＢＲ）を示す。 図４は、HT-29細胞（500万個）を移植した無胸腺ヌードマウス（ｎ＝５）に１ ｎｍｏｌの化合物１を投与した後の腫瘍（●）と筋肉組織（〇）の蛍光減衰（左のｙ軸）、および腫瘍対バックグラウンド比の経時変化（□、右のｙ軸）を表す。データはすべての平均±標準偏差として表す。

実験パート
以下のパートに記載する本発明およびその特定の実施形態は、単なる例示であり、本発明の限定と見なされるべきではない。それらは、本発明がどのように実施され得るかを示し、本発明の範囲の限定ではなく例示であることを意味する。

材料と装置
化学物質と溶媒はすべて試薬グレードのものを反応に使用した。分析グレードの溶媒はクロマトグラフィー精製に使用した。特に示さない限り、標的化部分を含め、ほとんどの試薬は市販品である（例えば、パニツムマブ（Vectibix、Amgen;活性物質のCAS登録番号：339177-26-3）;セツキシマブ（Erbitux、Merck; 活性物質のCAS登録番号：205923-56-4））。

合成した化合物はすべて、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製し、ＵＶ－ＶＩＳ検出器とＥＳＩ源を備えたＬＣ／ＭＳ装置を使用した質量分析によって特徴付けた。分析は、Waters Atlantis dC 18 5μm、4.6×150 mmカラムで、Ａ相(ＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４ １０ｍＭ）とＢ相（アセトニトリル）のグラジエントを用いて実施した。測定された質量/電荷比を、各化合物について記載する。

デュアルビームＵＶ－ＶＩＳ分光光度計（Ｌａｍｂｄａ ４０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、本発明の化合物の吸光度（Ａｂ）を決定した。発光/励起（Em/Ex）スペクトルおよび絶対蛍光量子収率（Φ）測定は、F-3018積分球アクセサリを備えた分光蛍光光度計（FluoroLog-3 1IHR-320、Horiba Jobin Yvon）で実施した。測定は、種々の色素の最大吸光度での励起波長を使用して行い、サンプルは４５０Ｗキセノン光源で励起した。検出は、光電子増倍管（ＰＭＴ－ＮＩＲ）冷却検出器またはＴＢＸ－０４検出器によって行った。再吸収現象を最小限に抑えるために、０．１（光学密度）未満の吸光度となるよう色素溶液を注意深く調製した。

IVIS Spectrum In Vivo Imaging System（Perkin Elmer Inc.）を使用して、in vivoイメージング実験を行った。このシステムには、４３０～８５０ｎｍにわたり１０個の狭帯域励起フィルター（帯域幅３０ｎｍ）と１８個の狭帯域放射フィルター（帯域幅２０ｎｍ）が装備されている。

略語のリスト
ＤＣＣ Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＳＣ Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート
ＨＡＴＵ １－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］ －１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ Ｏ－ベンゾトリアゾール－１－イル－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＮＨＳ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＭ Ｎ－メチルモルホリン
ＲＴ 室温
ＰｙＢＯＰ （ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＢＴＵ ２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＳＴＵ Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
μＬ マイクロリットル
μＭ マイクロモーラー
ｔ_Ｒ 保持時間（ＨＰＬＣ）
ｃＲＧＤｆＫ シクロ－（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）
ａｚａ－ｃＲＧＤ－ＮＨ_２ アザ－シクロ－（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）

個々のアミノ酸残基の略語は慣習通りである。例えば、ＡｓｐまたはＤはアスパラギン酸、ＧｌｙまたはＧはグリシン、ＡｒｇまたはＲはアルギニンである。本明細書で言及されるアミノ酸は、特に断りのない限り、Ｌ－異性体の立体配置であると理解される。

実施例１：化合物４の合成

中間体（ＶＩａ）の調製、ステップａ
丸底フラスコに、５－カルボキシ－２，３，３－トリメチルインドレニン（１．５０ｇ、７．３８ｍｍｏｌ）、２，４－ブタンスルホン（１．１１ｇ、８．１５ｍｍｏｌ）およびブチロニトリル（２ｇ）を加えた。混合物を１２０℃で２日間加熱した。次に、固体を乾燥アセトンで処理し、真空下で濾過し、アセトンで２回洗浄した。ピンク色の固体を真空下で乾燥させ、それ以上精製せずに使用した（２．４０ｇ、９６％）。270 nmでのHPLC純度94％、MS：[M + H] +339.2。

中間体（ＶＩＩａ）の調製、ステップｂ
丸底フラスコに、中間体ＩＩＩ（１．５ｇ、７．３８ｍｍｏｌ）、６－ブロモヘキサノエートエチル（１．９７ｇ、８．８５ｍｍｏｌ）およびスルホラン（６．８ｇ）を加えた。懸濁液を９０℃で３日間加熱した。次に、酢酸エチル（２５ｍＬ）を加え、紫色の分散液を室温で１５分間撹拌し、真空下で濾過した。固体を酢酸エチルで３回洗浄した後、新鮮な酢酸エチル（１５ｍＬ）に再分散させ、室温で１５分間撹拌し、真空下で濾過し、そして酢酸エチルで洗浄した。この操作をさらに２回繰り返した。最後に、所望の生成物と出発物質の両方を含むピンク／紫色の固体を真空下で乾燥させた。次にそれをアセトニトリル（４ｍＬ）に分散させ、高密度の分散液を室温で１５分間撹拌し、濾過した。固体を数倍量の冷アセトニトリルで洗浄した。母液は主に所望の生成物を含んでいたが、固体は出発物質を含んでいた。アセトニトリルを真空留去し、固体を再びアセトニトリル（４ｍＬ）に分散させ、１５分間撹拌し、濾過し、固体を冷アセトニトリルで洗浄した。溶液を真空下で濃縮して、２７０ｎｍで９２％のＨＰＬＣ純度（臭素塩として１．２５ｇ、４０％）のピンク／紫色の固体を得た。MS：[M + H] +346.5。

中間体（ＩＸａ）の調製、ステップｃ
丸底フラスコに、塩酸グルタコンアルデヒドジアニル（０．４８ｇ、１．４ｍｍｏｌ）、無水酢酸（４７ｍＬ）および酢酸（１３ｍＬ）を加えた。橙－褐色の溶液を６０℃で３時間加熱した。次に、反応混合物を室温に冷却し、エタノール（１０ｍＬ）中の中間体（ＩＶａ）（０．６０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で約２０分で滴下した。赤色の溶液を３５℃で２時間加熱した後、温度を５０℃に上げ、中間体（ＩＩＩ）（０．４８ｇ、１．４ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（０．１１ｇ、１．３ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１９ｍＬ）を加えた。直後にピリジン（２．０ｍＬ）を加えた。反応混合物を６０℃で１．５時間加熱した後、溶媒を真空留去し、暗色の油を冷水（１００ｍＬ）中に沈殿させた。暗緑色の固体を濾過し、冷水で洗浄した。次に、それを最小量のエタノールに溶解し、この溶液を撹拌しながら酢酸エチル（４００ｍＬ）に滴下した。固体を濾過し、酢酸エチルで洗浄し、ジクロロメタンに溶解し、ゆっくりとしたジクロロメタン－メタノール勾配でシリカゲル上で精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせ、真空下でエバポレートし、乾燥させて、青緑色の固体（３５０ｍｇ、収率３３％）を得た。756 nmでのHPLC純度94％、MS：[M + H] +747.3。

化合物４の合成、ステップｄおよびｅ
乾燥した丸底フラスコに、乾燥ＤＩＰＥＡ（１１５μＬ、０．５６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）中の中間体（ＩＸａ）（１５０ｍｇ、７０％純度、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。窒素気流下で３０分間撹拌した後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＴＢＴＵ（３０９ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１時間後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＤ－グルカミン（８７ｍｇ、０．３３６ｍｍｏｌ）の懸濁液を加えた。混合物を室温で２時間撹拌した後、濃縮し、プレパックされたＣ１８シリカカラム上で水－アセトニトリル勾配により精製した。純粋な生成物を含む画分を集め、濃縮し、凍結乾燥して、青緑色の粉末（９５．８ｍｇ、収率６４％）を得た。756 nmでのHPLC純度97％、MS：[M + Na] +1095.3。

このようにして得られた中間体（Ｘａ）（９５ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を水（１０ｍＬ、ｐＨ６．３５）に可溶化した後、２Ｎ ＮａＯＨをｐＨ １１．１４まで加えた。溶液を室温で撹拌し、０．１Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨ １１に維持した。４０時間後、反応が完了した後、混合物を１Ｎ ＨＣｌで中和し、プレパックされたＣ１８シリカカラムで水－アセトニトリル勾配により精製した。純粋な生成物を含む画分を集め、濃縮し、凍結乾燥して、青緑色の粉末（８１ｍｇ、収率８６％）を得た。756 nmでのHPLC純度98％、MS：[M + H] +1045.3。

実施例２：化合物５の合成

ステップｆ
乾燥した丸底フラスコ中で、Ｎ－メチルモルホリン（１０μＬ、０．０９１ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中の実施例１で調製した化合物４（１０ｍｇ、０．００９６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。窒素気流下で３０分間撹拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＨＢＴＵ（１３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１時間後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮＨ_４Ｃｌ（１０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の懸濁液を加えた。混合物を２日間撹拌し続けた後、真空下で乾燥させ、プレパックされたＣ１８シリカカラムで水－アセトニトリル勾配により精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせ、濃縮し、凍結乾燥して、青色の固体（２，５６ｍｇ、収率２０％）を得た。756 nmでのHPLC純度97.5％、MS：[M + H]⁺ 1043.1。

実施例３：化合物７の合成

中間体Ｘｂの調製、ステップｄ
中間体ＩＸｂは、実施例１の手順に従って調製したが、ステップｃ）で試薬マロンアルデヒドジアニリド塩酸塩を使用した。中間体ＩＸｂ（５８ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に懸濁した。トロメタモール（２３．５ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（６１μＬ、０．３５２ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（７３．７７ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を不活性雰囲気下、室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、粗製物を、プレパックされたＣ１８シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（水／メタノール勾配）によって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、明るい青色の固体（６０ｍｇ、収率８０％）を得た。655 nmでのHPLC純度：99.6％。MS：[M + H]⁺ 927.3。

化合物７の合成、ステップｅ
中間体Ｘｂ（１１０ｍｇ、０．１０６ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）に溶解し、水（１８ｍＬ）を加えた。溶液を４０℃に加熱し、加水分解が完了するまで（約６時間）、０．１Ｎ ＮａＯＨでｐＨを１１に保った。ＰＨを０．１Ｎ ＨＣｌで７にし、粗製物を、プレパックされたＣ１８シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（水／メタノール勾配）によって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、明るい青色の固体（１８．７ｍｇ、収率１９％）を得た。655 nmでのHPLC純度：95.7％。MS：[M + H]⁺ 899.3。

実施例４：化合物８の合成

中間体ＶＩｃおよびＶＩＩｃは、中間体ＶＩａおよびＶＩＩａについて上記した手順に従って調製した。実施例１と同様に、対応する試薬Ｎ，Ｎ－ジフェニルホルムアミジンで処理して、トリメチン中間体ＩＸｃを得た。

中間体Ｘｃの調製、ステップｄ
中間体ＩＸｃ（６２ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）に懸濁した。Ｄ－グルカミン（３３．９ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（６２μＬ、０．３５６ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（７１．１０ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を不活性雰囲気下、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、粗製物を、プレパックされたＣ１８シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（水／アセトニトリル勾配）によってによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、明るいピンク色の固体（８２．４ｍｇ、収率９１％）を得た。560 nmでのHPLC純度：99.8％。MS：[M + H]⁺ 1021.3。

化合物８の合成、ステップｅ
中間体Ｘｃ（８１．４ｍｇ。０．０８ｍｍｏｌ）をエタノール（２ｍＬ）に溶解し、水（１８ｍＬ）を加えた。溶液を室温で撹拌し、加水分解が完了するまで（約４６時間）、ｐＨを０．１Ｎ ＮａＯＨで１１に保った。次に、ｐＨを０．１Ｎ ＨＣｌで７に調整し、粗製物をプレパックされたＣ１８シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー（水／アセトニトリル勾配）によってによって精製した。純粋な生成物を含む画分を合わせ、真空下で蒸留し、凍結乾燥して、明るいピンク色の固体（７９ｍｇ、収率９９．４％）を得た。560 nmでのHPLC純度：100％。MS：[M + H]⁺ 993.3。

実施例５：化合物１の合成

化合物１は、化合物４に対応する色素と環状ペンタペプチドｃ－ＲＧＤｆＫとのコンジュゲーションによって合成し、コンジュゲーションは、２つの手順ＡまたはＢによって実施した。化合物４は、実施例１に記載したとおり調製した。標的化部分を表すｃ－ＲＧＤｆＫは市販の試薬である。

手順Ａ－直接結合によるコンジュゲーションステップ
乾燥した丸底フラスコ中、Ｎ－メチルモルホリン（１０μｌ、０．０９ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中の実施例１に記載したとおりに調製した化合物４の溶液（１０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）に加えた。窒素気流下で３０分間撹拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＴＢＴＵ（６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１時間後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のｃ（ＲＧＤ）ｆＫ（６ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を室温で２０時間撹拌した後、さらなるＴＢＴＵ（４ｍｇ）とＮ－メチルモルホリン（２μＬ）を加え、２時間後、ｃ（ＲＧＤ）ｆＫ（２ｍｇ）を加えた。混合物をさらに６時間撹拌した後、濃縮し、粗製物を、Ｃ１８シリカカラムでの分析ＨＰＬＣ（０．１％酢酸アンモニウム－アセトニトリル勾配）で精製した。純粋な生成物を含む画分を集め、濃縮し、３回凍結乾燥して、青色の固体（４．４ｍｇ、収率２９％）を得た。756 nmでのHPLC純度99％、MS：[M / 2]⁺ 841.0。

手順Ｂ－ＮＨＳエステルによる以前の活性化によるコンジュゲーションステップ
実施例１に記載したとおりに調製した化合物４（４ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ）を、窒素気流下で乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）に懸濁させた。Ｎ－メチルモルホリン（０．８μｌ、０．００７６ｍｍｏｌ）およびＴＳＴＵ（２．３ｍｇ、０．００７６ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で２０時間撹拌した。冷ジエチルエーテルの添加により所望の生成物を沈殿させ、遠心分離し、ジエチルエーテルで２回洗浄した。

固体を、ｐＨ９のホウ酸塩緩衝液（２ｍＬ）中のｃ（ＲＧＤ）ｆＫ（３．０ｍｇ、０．００４２ｍｍｏｌ）の溶液に溶解した。溶液を一晩撹拌した後、１Ｎ ＨＣｌでｐＨを６に調整し、粗製物を、Ｃ１８シリカカラムでの分析ＨＰＬＣ（０．１％酢酸アンモニウム／アセトニトリル勾配）で精製した。純粋な生成物を含む画分を集め、濃縮し、そして３回凍結乾燥して、青色の固体（５．２ｍｇ、収率８３％）を得た。756 nmでのHPLC純度99％、MS：[M / 2]⁺ 841.0。

実施例６：化合物３の合成

乾燥した丸底フラスコ中、Ｎ－メチルモルホリン（１０μｌ、０．０９ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中の実施例１に記載したとおりに調製した化合物４（１０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。窒素気流下で１５分間撹拌した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＨＢＴＵ（３．６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。３０分後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のａｚａ－ｃＲＧＤ－ＮＨ_２（５．７ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を２日間撹拌した後、真空下で濃縮し、Ｃ１８シリカカラムでの分析ＨＰＬＣ（０．１％酢酸アンモニウム／アセトニトリル勾配）で精製した。純粋な生成物を含む画分を集め、濃縮し、３回凍結乾燥して、青色の粉末（３．５７ｍｇ、収率２１％）を得た。756 nmでのHPLC純度99％、MS：[M / 2]⁺ 780.8。

実施例７：化合物９の合成
モノクローナル抗体ＥＧＦＲリガンドであるパニツムマブ（６ｍｇ）をＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、１２０μＬの１．０Ｍリン酸カリウムを添加してｐＨ９に調整した。化合物４－ＮＨＳエステル（実施例５の手順Ｂで説明したように調製）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解した。次に、色素と抗体を２．５：１のモル比ですばやく混合し、室温で３時間暗所に置いた。３時間後、コンジュゲーション反応混合物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したＺｅｂａ Ｓｐｉｎカラムに重層し、１５００ｇで２分間遠心分離して、コンジュゲートを遊離色素から分離した。０．２２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブレンでろ過した後、ｐＨ ７．４のＰＢＳ中のコンジュゲートしたパニツムマブ溶液をＳＥ－ＨＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度法で分析し、濃度と純度を決定した。コンジュゲーションモル比（抗体に対する結合色素分子）は約１．３であった。

実施例８：化合物１０の合成
モノクローナル抗体ＥＧＦＲリガンドであるセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ）を、１０Ｋ ＤａＭＷＣＯメンブレンでＰＢＳに対して透析した。１０ｍｇの透析したＭＡｂ（４．５２ｍｇ／ｍＬ、６８．８ｎｍｏｌ）を２２１μＬの１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ９に添加した。化合物４－ＮＨＳエステル（実施例５、手順Ｂで説明したように調製）を６．８６ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解した。４３．３μＬの色素をセツキシマブ溶液（モル比４．３：１）に添加し、室温で暗所に３時間保持した。この後、コンジュゲーション反応混合物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化したＺｅｂａ Ｓｐｉｎカラムに重層し、１０００ｇで２分間遠心分離して、コンジュゲートを遊離色素から分離した。０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）メンブレンでろ過した後、ｐＨ７．４のＰＢＳ中のコンジュゲートしたセツキシマブ溶液をＳＥ－ＨＰＬＣ、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度法で分析し、濃度と純度を決定した。コンジュゲーションモル比（抗体に対する結合色素分子）は約１．１であった。

実施例９：化合物１１の合成

Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241－249に記載されている小分子ＣＡＩＸリガンド４ａを、該文献に開示されている手順に従って調製し、化合物４にコンジュゲートさせた。１１ｍｇの化合物４（１０．０μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解した後、５．５ｍｇのＰｙＢＯＰ（１０，０μｍｏｌ）と７μＬのＤＩＰＥＡ（４０，０μｍｏｌ）を攪拌しながら添加した。２０分後、９ｍｇの小分子４ａ（１５．０μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解し、反応混合物に加え、室温でさらに３０分間撹拌した。精製は分取ＨＰＬＣにより行った（収率６０％）。単離された純粋な生成物は、Waters Atlantis dC18カラム（μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を使用したＨＰＬＣ－ＵＶ－ＶＩＳ－ＭＳ－ＥＳＩ（＋）によって特徴づけた。758 nmでのHPLC純度：98％; MS：[M/2]⁺ 823.3。

実施例１０：化合物１２の合成

Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241－249に記載されている小分子ＣＡＩＸリガンド８ａを、該文献に記載されている手順に従って調製し、化合物４にコンジュゲートさせた。１５ｍｇの化合物４（１４．０μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解した後、７．３ｍｇのＰｙＢＯＰ（１４，０μｍｏｌ）と１０μＬのＤＩＰＥＡ（５７，０μｍｏｌ）を攪拌しながら添加した。２０分後、２２ｍｇの小分子８ａ（２１．０μｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに溶解し、反応混合物に加え、室温でさらに３０分間撹拌した。精製は分取ＨＰＬＣにより行った（収率３４％）。単離された純粋な生成物は、Waters Atlantis dC18カラム（μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を使用したＨＰＬＣ－ＵＶ－ＶＩＳ－ＭＳ－ＥＳＩ（＋）によって特徴づけた。
758 nmでのHPLC純度：95％; MS：[M/2]⁺ 1051.8。

実施例１１：中間体（Ｘａ）の安定性
最適な条件でエチルエステルの加水分解を行うため、実施例１のステップｄ）に記載したとおりに調製した中間体（Ｘａ）の安定性を種々の条件で評価した。実際、このようなタイプのシアニンは、酸性および塩基性媒体中では、かなり安定ではないことが知られている。
例えばＷＯ２０１８／１８９１３６に記載されている、酸性条件でより安定である化合物ＤＡ３６４などのポリスルホニル基を有する他の類似体とは対照的に、中間体（Ｘａ）は、強い条件下（例えば、ｐＨ１１および４５℃で数時間）で加水分解を行った場合、Ｒ１およびＲ２基の分解なしに予想外に顕著な安定性を示した。驚くべきことに、ブタおよびウサギの肝臓酵素抽出物（ＰＢＳ緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ ８、３８℃で作用）で加水分解を行っても良好な結果が得られた。分解することなく、たった２０～２４時間後に完全な変換物が得られた。

実施例１２：光学特性
本発明の化合物を、水性媒体（すなわち、水／ＰＢＳ ｐＨ７．４）、およびヒト血清の化学組成と光学特性を模倣した臨床化学対照血清（セロノルム、Ｓｅｒｏ ＳＡ）における、インビトロでの光学特性に関して特徴付けた。色素または色素複合体溶液はすべて新たに調製した。
特に、式（Ｉ）の代表的な化合物および式（ＩＩ）の対応する色素の励起および発光の最大値と絶対蛍光量子収量（Φ）を、市販のビスルホン化ヘプタメチン色素インドシアニングリーン（ICG、Sigma）、ビスルホン化ペンタメチン色素スルホ-Cy5（Lumiprobe）およびビスルホン化トリメチン色素スルホ－Ｃｙ３（Lumiprobe）と比較してTable IIに示す。

本発明の化合物は、約５５０ｎｍ～７６０ｎｍの範囲に含まれる吸収極大によって特徴付けられる。本発明の化合物について得られた蛍光量子収率は、参照化合物よりも顕著に高く、同じ長さのポリメチン鎖を有する対応する参照化合物よりも約１．５から７倍大きい値であった。注目すべきことに、本発明の化合物は、同様の溶解特性を有する参照化合物よりも、水性緩衝液ＰＢＳにおいてより大きな量子収率を示した。

実施例１３：ヒトアルブミンに対する親和性
本発明の化合物のヒトアルブミンに対する結合親和性の分析を行い、その結果を参照のインドシアニングリーン（ＩＣＧ）と比較した。
ヒト血清アルブミン（HSA; Sigma Aldrich、A9511）に対する結合親和性は、化合物の結合親和性レベルに応じて、２つの方法を用いて測定した。
ＨＳＡと強く相互作用する化合物に最適な第一の方法は、ＨＳＡを含む溶液中で色素をインキュベートした後の吸光度スペクトルのピークシフトの分析に基づいている。簡単に説明すると、サンプルをＨＳＡ希釈液（１×１０^－６～４×１０^－４Ｍ）で固定濃度（１μＭ）でリン酸緩衝液中、２５℃にて分光光度計で５分間インキュベートした後、測定した。測定は、シフトしたピークの最大吸光度波長で行った。
第二の方法は、ＨＳＡに対する親和性が低い化合物に最適であり、限外ろ過後の色素と種々の濃度のＨＳＡを含む溶液の吸光度の変化を測定することに基づいている。簡単に説明すると、各化合物をリン酸緩衝液中でＨＳＡ希釈液（１×１０^－６～４×１０^－４Ｍ）とともに固定濃度（２μＭ）でインキュベートした。サンプルをMicroconデバイス（10 kDa MWCO、Ultracel-10メンブレンを備えたAmicon Ultra-0.5遠心フィルターユニット、Millipore）で遠心分離（１０，０００ｇ、２５℃で３０分間）し、ろ液の吸光度測定値を、分光光度計によりフルオロフォアの最大吸光度波長で得た。
いずれの方法も、親和性定数（Ｋ_Ａ、Ｍ^－１）を、生データを次の式でフィッティングすることによって計算した。

式中、
ΔＡ／ｂ＝測定された吸光度（ｂ＝１ｃｍ）
Ｋ_ＲＬ＝回帰分析で計算（カーブフィッティング）したＫ_Ａ
回帰分析（カーブフィッティング）によって計算されたΔε・Ｒｔ
［Ｌ］＝ルブミン濃度
第一の方法では、ΔＡ／ｂは、各サンプルで測定された吸光度に対応するが、第二の方法では、ΔＡ／ｂは、それぞれサンプルの吸光度からコントロールサンプル（ＨＳＡを含まない色素）の吸光度を差し引いて得られる。
第一の方法（HSA K_A=215,000 M^-1）および第二の方法（HSA K_A=216,000 M^-1）を用い、市販のシアニン色素IRDye 800CWカルボキシレート（LI-COR Inc.、Lincoln, USA）について行った並行実験によって示されるとおり、両方の方法で同等の結果が得られることが実証された。ただし、化合物の親和性レベルに応じて適当な方法を用いることで親和性定数の測定はより正確になる。

２つの方法のうちのいずれか一方で本発明の代表的な化合物について測定した結合親和性の結果をTable IIIに示し、参照化合物として臨床的に利用可能なＩＣＧ色素、ＩＣＧ－ＲＧＤおよびＤＡ３６４で得られた結果と比較する。

Table IIIに示されるように、本発明の色素および色素コンジュゲートは、利用可能なＩＣＧおよび他の多くの既知のシアニン化合物と比較して、ヒトアルブミンに対して著しく低い結合親和性を示しており、親和性定数は１桁または２桁低い。この有利な特徴は、式（ＩＩ）の色素（例えば、化合物４）および標的化部分と結合した場合の対応する色素（例えば、化合物１および３）の両方に関連しており、標的化部分との色素の結合がヒトアルブミンに対する親和性に影響を及ぼさないことを示唆する。
むしろ、代表的な化合物１および３などの式（Ｉ）のＲＧＤコンジュゲートは、Table IIIに示されるように、ＩＣＧ－ＲＧＤ（HSA K_A= 219,000 M^-1, Capozza et al., 2018）またはＤＡ３６４（HSA K_A= 28,670 M^-1, ＷＯ２０１６／０９７３１７）のような、標的化部分と結合した場合の当分野で知られている他の色素よりもヒトアルブミンに対して予想外にはるかに低い親和性を示した。
さらに、参照化合物ＤＡ３６４は、本化合物とまったく同じ実験条件で正確に分析した場合、より高いＨＳＡ親和性を示し、親和性定数（K_A）は110,000 M^-1であった。

実施例１４：受容体結合親和性
本発明の色素で標識した後、分子ベクターの標的化効果が維持されるかどうかを評価するため、特定の受容体に対する式（Ｉ）のコンジュゲートの結合親和性を測定した。
ペプチド／ペプチド模倣分子コンジュゲート
ペプチド／ペプチド模倣物コンジュゲートの例として、代表的なインテグリン結合コンジュゲートの受容体親和性を、過去に報告されているように（Kapp et al., Sci. Rep. 2017, 7, 39805）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＩＣ_５０（最大阻害濃度の半分）の計算によって評価した。
簡単に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、炭酸緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ ９．６）中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質ビトロネクチンで４℃で一晩コーティングした。次に、各ウェルをＰＢＳ－Ｔバッファー（リン酸緩衝生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ２０、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ ７．４）で洗浄した。ＴＳ－Ｂバッファー（Ｔｒｉｓ－生理食塩水／ＢＳＡバッファー；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２、ｐＨ ７．５、１％ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックした。その間に、化合物と内部標準の希釈系列を追加のプレートで調製した。アッセイプレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、５０μＬの希釈系列を各ウェルに移した。ＴＳ－Ｂバッファー中のヒト組換えインテグリンα_ｖβ_３（R＆D Systems、1μg/mL）の溶液５０μＬをウェルに移し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔバッファーで３回洗浄した後、一次抗体抗α_ｖβ_３をプレートに加えた。インキュベーションおよびＰＢＳ－Ｔでの３回の洗浄後、二次抗ＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体をプレートに添加し、１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をすばやく添加してプレートを発色させ、暗所で５分間インキュベートした。３Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で反応を停止し、プレートリーダー（Victor3、PerkinElmer）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
代表的な化合物１および３のＩＣ_５０を２重でテストし、得られた阻害曲線をWindows用のGraphPad Prismバージョン4.0（GraphPad Software）を使用して分析した。変曲点がＩＣ_５０の値を定義される。実験はすべて、内部標準としてｃ（ＲＧＤｆＫ）を使用して実施した。

ｃ（ＲＧＤｆＫ）（すなわち化合物１）またはｃ（ＲＧＤ）ａｚａ（すなわち化合物３）のいずれかに結合した試験分子プローブは、ヒトα_ｖβ_３受容体と同等の親和性、および非結合参照と同様の親和性を示した。表ＩＶに報告されているペプチド模倣ｃ（ＲＧＤｆＫ）。

小分子コンジュゲート
小分子コンジュゲートの例として、ＣＡＩＸ酵素に対する代表的なコンジュゲートの阻害活性を、市販の比色キットK473（BioVision）を使用して評価した。プロトコルは製造元の指示に従って行い、コンジュゲートの阻害効力（最大阻害濃度の半分、ＩＣ_５０）を非コンジュゲートのアセタゾラミドと比較した。簡単に言えば、このキットは、発色生成物を放出するエステル基質に対する活性炭酸脱水酵素のエステラーゼ活性を利用する。放出された生成物は、吸光マイクロプレートリーダー（吸光度：４０５ｎｍ）を使用して定量化する。アセタゾラミド、および式（Ｉ）のコンジュゲートについて、炭酸脱水酵素特異的阻害剤の存在下では、酵素はその活性を失い、その結果、吸光度が低下する。式（Ｉ）の小分子コンジュゲートは、コンジュゲートされていないアセタゾラミドと比較して、酵素炭酸脱水酵素に対する高い阻害効力を示し、ＩＣ_５０値は、低いナノモル範囲であった（アセタゾラミド：３．７ｎＭ；化合物１１：６．５ｎＭ；化合物１２：１．２ｎＭ）。

タンパク質分子コンジュゲート
タンパク質分子コンジュゲートの例として、代表的なＥＧＦＲ結合コンジュゲートの受容体親和性をAlphaLISAキットAL366H（Perkin Elmer）を使用して評価した。このAlphaLISAアッセイでは、ビオチン化EGFがストレプトアビジンでコーティングされたAlpha Donorビーズに結合し、EGFR-FcはAnti-Human IgG Fc特異的AlphaLISA Acceptorビーズによって捕捉さる。ＥＧＦがＥＧＦＲに結合すると、ドナービーズとアクセプタービーズが近接する。ドナービーズの励起は、アクセプタービーズのエネルギー移動のカスケードをトリガーする一重項酸素分子の放出を引き起こし、６１５ｎｍでの発光の鋭いピークをもたらす。実験は、コンジュゲートの親和性を相対的な非標識分子ベクターと比較することによって実施した。ＥＧＦＲ受容体に結合しない非標識抗体トラスツズマブをネガティブコントロールとして使用した。サンプル段階希釈液（化合物９と化合物１０、および相対的な非標識分子ベクターであるパニツムマブとセツキシマブ）をＥＧＦＲアクセプタービーズと３０分間インキュベートした後、ビオチン化ＥＧＦと３０分間インキュベートした。すなわち、ストレプトアビジン結合ドナービーズをプレートに加え、３０分間インキュベートした。プレートリーダー（EnSight、Perkin Elmer）を使用して、６１５ｎｍで吸光度を測定した。トラスツズマブ抗体には特異的結合は観察されなかった。これとは異なり、化合物９（ＩＣ_５０、０．２ｎＭ）および化合物１０（ＩＣ_５０、０．４ｎＭ）で特異的な受容体結合が観察され、非標識の親抗体パニツムマブ（ＩＣ_５０、０．５ｎＭ）およびセツキシマブ（ＩＣ_５０、０．４ｎＭ）、それぞれに匹敵した。予期せぬことに、セツキシマブやパニツムマブのような大きな分子は、本発明の色素と結合した後でも、本来の抗原結合特性を維持することが見出された。
全体として、これらの結果は、小分子、ペプチド/ペプチド模倣物、またはタンパク質部分のいずれかを式（ＩＩ）の色素化合物に結合させても、最終化合物（Ｉ）の標的への結合親和性は損なわれないことを示している。

実施例１５：細胞取込み
ヒトメラノーマ細胞株WM-266-4（ATCC、CRL-1676）をin vitroモデルとして使用し、これらの細胞の膜上でのインテグリン受容体、特にα_ｖβ_３の高発現（Capasso et al., PlosOne 2014）に基づいて、代表的なインテグリン結合化合物1および3の細胞取込みを評価した。
約７０％のコンフルエンスの付着細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の存在下、化合物１または３（１μＭ）とともに３℃（５％ＣＯ_２）で２時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ中の０．１ｍＭ ＥＤＴＡを使用して細胞を剥離し、遠心分離し、フローサイトメトリー実験用のバッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）に懸濁した。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、細胞取込みの尺度として、細胞内の蛍光シグナルを検出した。サンプルをアルゴンレーザーで励起し、発光を６７０ｎｍロングパスフィルターを使用して検出した。蛍光強度の値を、機器ソフトウェアによって生成されたヒストグラム統計から求めた。

受容体を介した細胞取込みの特異性を評価するために、競合物質として高濃度（１００μＭ）の非標識分子ベクターｃ（ＲＧＤｆＫ）の存在下で、細胞を分子プローブとともにインキュベートすることにより実験を行った。残存する内在化（residual internalization）は、競合物質が存在しない場合の蛍光強度の値を１００％と見なして計算した。
さらに、細胞取込みに対する体液の影響を評価するために、男性のＡＢ血漿（Sigma Aldrich、H4522）またはヒトアルブミン（Sigma Aldrich、A9511）からのヒト血清の存在下で細胞を本発明の化合物とインキュベートして並行実験を行った。残存する内在化は、血清の非存在下での蛍光強度の値を１００％と見なして計算した。このような取込み評価はまた、目的の組織や特定の標的受容体に到達する前に血管区画を通って拡散するときに、血漿タンパク質、特にアルブミンによって隔離される化合物のパーセンテージの指標を表す。

Table Vに、本発明の代表的な化合物１および３の細胞取込み能を示す。
本化合物は、ヒト血清の存在下または４％ＨＳＡの存在下のいずでも高い細胞取込みを示したが（化合物１、残存取込み７０％）、競合物質としてのベクターｃ（ＲＧＤｆＫ）の存在下では低い残存取込みを示した（化合物１、残存取込み１０％；化合物３、残存取込み１５％）。したがって、本発明の化合物については、細胞内内在化が受容体媒介性であり、ヒト血清タンパク質、特にアルブミンへの結合による影響はわずかであると観察され（残存取込みの約１０～２０％）、培地－本化合物のヒトアルブミンへの結合親和性は中程度～低度であると確認された（実施例１０に示すように、Ｋ_Ａ＝約１～６×１０^３Ｍ^－１）。
さらに、Table Vは、化合物１および３のヒト血清の存在下での残存細胞取込みの、参照化合物ＤＡ３６４、ＩＣＧ－ＲＧＤ（Capozza et al., Photoacoustic 2018, 11, 36-45）およびＩＣＧ－ＲＧＤと同じ方法で調製したＩＣＧ－ｃ（ＲＧＤｆＫ）との比較を示す。これらの結果は、本発明の化合物が驚くべきことに、当分野で知られている同様の化合物と比較して細胞内在化においてより高い効力を有することが見出されたことを示している。

とりわけ、本化合物と細胞表面上の受容体との相互作用も、細胞内の受容体－プローブ複合体の内在化も、コンジュゲート色素の構造、特に、化合物の位置Ｒ１およびＲ２に存在する、親水性が高く立体障害の高い部分によって、損なわれなかった。したがって、コンジュゲート色素上の親水性部分の存在は、親水性部分を欠くコンジュゲートを隔離し結合効率に悪影響を与えるような血漿タンパク質やアルブミンの存在下であっても、非常に効率的かつ特異的な受容体結合およびプローブ内在化をもたらす。

実施例１６：生体内分布と排出
本発明の蛍光剤の生体内分布と排出を、６～１０週齢の雄のBalb/c nu/nuマウス（Charles River Laboratories）に静脈内投与した後の光学イメージングによって評価した。
簡単に説明すると、マウスをケージごとに４匹飼育し、順化期間の終わり（５日間）までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌食餌（Special Diets Services Ltd）を与えた。その後、実験終了まで、自家蛍光を低減する特殊飼料であるＡＩＮ－７６ａ齧歯動物用飼料（Research Diets）を使用した。イメージング実験は、前臨床光学システムIVIS Spectrum（Perkin Elmer）を使用して行った。
インビボイメージングは、ガス麻酔下で行った（酸素中のセボフルオラン６～８％）。動物に化合物を静脈内注射し、投与後３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、および２４時間で縦方向に画像化した。すなわち、動物は麻酔の過剰摂取によって安楽死させ、目的の主要な組織および器官をエクスビボ光学イメージングのために切除した。各蛍光画像についてすべての時点で目的組織上の関心領域（ＲＯＩ）を描画し、シグナル強度（平均放射効率として表される）を評価した。次に、筋肉（バックグラウンド組織）と排出器官（腎臓、肝臓）との間の蛍光シグナルの比率を計算して、コントラストを評価した。組織での半減期は、GraphPad Prismソフトウェア（Windows用バージョン5）を使用して、筋肉の蛍光シグナルの減衰を双指数関数的減衰方程式モデル（bi-exponential decay equation model）に適合させることによって計算した。

化合物１の組織動態を図１に示す。ここでは、筋肉組織の蛍光シグナルの減衰を時間に対してプロットして、種々用量での生成物のウォッシュアウトを評価した。注目すべきことに、化合物１は、組織のウォッシュアウトが速く、体内からの排出が改善され非常に好ましい排出動態を示し、特に、試験したすべての用量（０．３、１、３ｎｍｏｌ／マウス）で非常に短い（＜１時間）組織半減期を示した。化合物は体内に急速に分布し、膀胱に蓄積し、腎排出を示唆した。さらに、迅速な体内からの排出と低い保持率を示し、投与後の早期のイメージングを可能になりイメージングが有利に可能になる。

Table VIは、化合物１または３の１ ｎｍｏｌ／マウスの静脈内（ｉｖ）投与の２４時間後に光学イメージングによって検出された蛍光シグナルの比率（切除した排出器官（肝臓および腎臓） 対 筋肉）を示す。
切除した器官および組織のエクスビボイメージングによって、より速い体内からの排出と非特異的蓄積の減少に関連して、化合物１および３の排出器官の腎臓および肝臓における非常に低い保持が明らかとなった。

実施例１７：腫瘍取込み
本発明の化合物の腫瘍取込みは、マウスへの静脈内投与後の光学的イメージングによって評価した。
腫瘍取込み実験は、インテグリン受容体、特にα_ｖβ_３を過剰発現するヒト神経膠芽腫（皮下）の動物モデルで実施した。簡単に説明すると、ヒト神経膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－１４）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。４～６週齢の雄のBalb/c nu/nuマウス（Charles River Laboratories）に、０．１ｍＬのＥＭＥＭに懸濁した細胞（約１，０００万個）を皮下移植（右脇腹）した。マウスはケージごとに４匹飼育し、餌と水を自由摂取させた。動物に、順化期間の終わり（５日間）までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌食餌（Special Diets Services Ltd）を与えた。その後、実験終了まで、自家蛍光を低減する特殊飼料であるＡＩＮ－７６ａ齧歯動物用飼料（ResearchDiets）を使用した。腫瘍の成長を、目標サイズ３００～６００ｍｍ^３（細胞移植後３～４週間）まで、キャリパーを使用した縦断的評価によって監視した。イメージング実験は、前臨床光学システムIVIS Spectrum（Perkin Elmer）を使用して行った。
インビボイメージングは、ガス麻酔下で実施した（酸素中のセボフルオラン６～８％）。動物に化合物を静脈内注射し（外側尾静脈）、投与後３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、および２４時間に縦方向に画像化した。各蛍光画像についてすべての時点で目的組織上の関心領域（ＲＯＩ）を描画し、シグナル強度（平均放射効率として表される）を評価した。次に、腫瘍と筋肉（バックグラウンド組織）の蛍光シグナルの比率を計算して、コントラストを評価した。

腫瘍および筋肉組織における代表的な化合物１の蛍光減衰値、および腫瘍 対 バックグラウンドの比率を図２に示す。これらの結果は、すでに初期の時点（投与の１～２時間後）で代表的な化合物１の腫瘍取込みが顕著に高く、腫瘍 対 バックグラウンドのコントラストが非常に高い（ＴＢＲ 約２～２．５）ことを示しており、健康な組織での保持が低く腫瘍特異的な蓄積が示唆される。
実際、本発明の化合物は、身体、特に健康な組織（筋肉）から迅速に排出される一方で、標的組織における式（Ｉ）のコンジュゲート色素については、顕著な標的媒介性の蓄積が観察される。
特にインテグリン受容体α_ｖβ_６を過剰発現するDetroit-562細胞を使用して、ヒトの頭頸部癌（同所性）の動物モデルで並行実験を行った。簡単に説明すると、ヒト咽頭癌細胞Detroit-562（ATCC、CCL-138）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００ ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養した。４～６週齢の雄のBalb/c nu/nuマウス（Charles River Laboratories）に、0.03 mL di EMEMに懸濁した細胞（約２５０万個）を舌の前部に同所移植した。マウスはケージごとに４匹飼育し、餌と水を自由摂取させた。動物に、順化期間の終わり（５日間）までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌食餌（Special Diets Services Ltd）を与えた。その後、実験終了まで、自家蛍光を低減する特殊飼料であるAIN-76a齧歯動物用飼料（ResearchDiets）を使用した。腫瘍の成長を、目標サイズの１０～２０ｍｍ^３（細胞移植後７～１０日）まで、キャリパーを使用した縦断的評価により監視した。

イメージング実験は、前臨床光学システムIVIS Spectrum（Perkin Elmer）を使用して行った。動物に３ｎｍｏｌ／マウスを静脈内注射（外側尾静脈）し、投与後２４時間で麻酔の過剰摂取により安楽死させ、エクスビボ光学イメージングのために舌を切除した。関心領域（ＲＯＩ）を、舌の前部（腫瘍細胞の移植部位）と後部（健康な組織）について描画し、腫瘍とバックグラウンドの比率を導き出した。１匹の健康な動物（腫瘍移植なし）に３ｎｍｏｌ／マウスの化合物１を投与し、陰性対照として使用するために上記と同様に画像化した。
化合物１の投与の２４時間後に実施したエクスビボイメージングは、腫瘍細胞の移植の舌部位に明るい領域を示した。これとは異なり、舌の後ろの健康な領域は低いシグナルを示し、健康なマウスで検出されたものと同様に、健康な組織での保持が低いことを示唆している。本発明の化合物の投与は、（図３に示されるように）高い腫瘍 対 バックグラウンドコントラストによって腫瘍の所在が明らかにしている。

低レベルのインテグリン受容体を発現するＨＴ－２９細胞を使用して、ヒト結腸直腸癌（皮下）の動物モデルで並行実験を行った。簡単に説明すると、ヒト結腸直腸腺癌細胞ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３８）を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したMcCoy's 5A培地で培養した。４～６週齢（Envigo）のオスの無胸腺ヌードマウスに、０．１ｍＬの無血清培地に懸濁した細胞（約５００万個）を皮下移植（右脇腹）した。マウスはケージごとに４匹飼育し、餌と水を自由摂取させた。動物に、順化期間の終わり（５日間）までＶＲＦ１（Ｐ）滅菌食餌（Special Diets Services Ltd）を与えた。その後、実験終了まで、自家蛍光を低減する特殊飼料であるAIN-76a齧歯動物用飼料（ResearchDiets）を使用した。腫瘍の成長を、目標サイズ３００～６００ｍｍ^３（細胞移植後３～４週間）まで、キャリパーを使用した縦断的評価により監視した。イメージング実験は、前臨床光学システムIVIS Spectrum（Perkin Elmer）を使用して行った。

インビボイメージングは、ガス麻酔下で実施した（酸素中のセボフルオラン６～８％）。動物に目的の化合物を静脈内注射し（外側尾静脈）、投与後３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、および２４時間で縦方向に画像化した。各蛍光画像についてすべての時点で目的組織上の関心領域（ＲＯＩ）を描画し、シグナル強度（平均放射効率として表される）を評価した。次に、腫瘍と筋肉（バックグラウンド組織）の蛍光シグナルの比率を計算して、コントラストを評価した。
腫瘍および筋肉組織の蛍光減衰値と腫瘍対バックグラウンド比を化合物１について図４に示す。
これらの結果は、すでに初期の時点での代表的な化合物1の高い腫瘍取込みと、健康な組織からの迅速なクリアランスを示しており、腫瘍組織を健康なバックグラウンドから明確に描写するのに十分な中程度の腫瘍対バックグラウンド比（TBR～1.2-1.5）が得られている。

上記のとおり、ヒトインテグリン受容体αＶβ３を過剰発現するヒトの癌の動物モデルにおいて、代表的な化合物１の標的特異性を参照化合物ＤＡ３６４の標的特異性と比較した。化合物は両方とも、１ｎｍｏｌ／マウスの用量で、過剰量の非標識ｃＲＧＤペプチド模倣物（２００ｎｍｏｌ／マウス）と共に（ブロッキング群）またはなし（対照群）で投与した。注射から２４時間後にマウスを安楽死させ、腫瘍組織を切除し、IVIS Spectrum蛍光システム（PerkinElmer）を使用して画像化した。ブロッキングプロトコルは、ＤＡ３６４を投与された動物の腫瘍組織における蛍光シグナル強度（取込みのイメージングサロゲート）の１０％の減少を促した。これとは異なり、ブロッキングプロトコルは、化合物１を投与された動物の腫瘍における蛍光の７５％の減少を促し、本発明の化合物について、より高いインビボ受容体特異性が示された（Table VIIを参照）。

参考文献
1. Onda N. et al., Int J Cancer, 2016, 139, 673-682
2. Stummer W. et al., Neurosurgery, 2015, 77(5）, 663-673
3. Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72(3）, 392-398
4. Tummers Q. et al., PlosOne 2015
5. Achilefu S. et al., J Med Chem, 2002, 45, 2003-2015
6. Bunschoten A. et al., Bioconjugate Chem., 2016, 27, 1253-1258
7. US 6,913,743 B2
8. WO2018/189136
9. WO2016/097317
10. Capozza et al., Photoacoustics, 2018, 11, 36-45
11. US 6,329,531 B1
12. Ebert et al., J. Biomed. Optics, 2011, 16(6）, 066003
13. WO2005/123768
14. WO2012/088007
15. T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4^th Ed., Ch. 5
16. Kapp et al., Sci Rep, 2017, 7, 3905
17. Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241－249
18. Li et al., FASEB J 2005, 19, 1978-85
19. Williams et al., Chem Biol Drug Des 2018, 91, 605－619
20. Mujumdar R.B. et al., Bioconjugate Chem. 1993, 4(2）, 105-111
21. Yamana et al, Chem. Pharm. Bull., 1972, 20(5）, 881-891

Claims (15)

1. 式（Ｉ）
   

   

   ［式中、
   Ｒ１およびＲ２は独立して－ＣＯ－ＮＨ－Ｙ基であり、Ｙは、少なくとも２つのヒドロキシル基で置換されている、直鎖または分岐鎖のアルキル、シクロアルキルおよびヘテロシクリルから選択され；
   Ｒ３は、－ＮＨ_２、－ＳＯ_３Ｈ、－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ_２から選択される基で置換された直鎖または分岐鎖のアルキルであり；
   Ｒ４は直鎖または分岐鎖の鎖の二価アルキルであり；
   Ｒ５は－ＣＯＯ－および－ＣＯＮＨ－から選択され；
   Ｓはスペーサーであり；
   Ｔは標的化部分であり；
   ｎは、１、２、または３に等しい整数であり；
   ｍは０または１に等しい整数である］
   で示される化合物またはその薬学的に許容される塩。
2. ｎが３であり、Ｒ３が－ＳＯ_３Ｈで置換されているアルキルであり、Ｒ１およびＲ２が、独立して、以下
   

   

   からなる群から選択される、請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物。
3. 式（Ｉａ）：
   

   

   ［式中、Ｒ４、Ｒ５、Ｓ、ｍおよびＴは、請求項１で定義したとおりである］
   で示される、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物。
4. Ｓが－ＮＨ（ＣＨ_２）_ｐＣＯＯ－、－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯ－および－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｐＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ－（ここで、ｐは０から２０までの整数である）から選択される、請求項１、２または３に記載の式（Ｉ）の化合物。
5. Ｔが、小分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、酵素基質、抗体またはそれらのフラグメント、およびアプタマーから選択される、上記請求項のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
6. Ｔがインテグリン受容体と相互作用する部分である、上記請求項のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
7. 個々の患者のガイド下手術における腫瘍縁の検出および境界設定のための蛍光造影剤として使用するための、上記請求項のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物。
8. 腫瘍縁の検出および境界設定がＮＩＲ放射線下で行われる、請求項７に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
9. 腫瘍が、脳癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、前立腺癌、食道癌、皮膚癌、胃癌、膵臓癌、膀胱癌、口腔癌、肺癌、腎臓癌、子宮癌、甲状腺癌、肝臓癌、結腸直腸癌から選択される腫瘍である、請求項８に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物。
10. 請求項１で定義した式（Ｉ）の化合物および少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含んでなる、診断用医薬組成物。
11. 光学イメージングを実施するためのさらなるアジュバントとともに請求項１で定義した式（Ｉ）の化合物を含む診断キット。
12. 以下からなる群から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
    

    
13. 式（ＩＩ）
    

    

    ［式中、
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびｎは、請求項１と同意義であり、
    Ｒ５’は、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＯ－Ｐｇ、および－ＣＯＮＨ－Ｐｇから選択され、ここで、Ｐｇは保護基である］
    で示される中間体化合物またはその薬学的に許容される塩。
14. ｎが３であり、Ｒ３が－ＳＯ_３Ｈで置換されているアルキルであり、Ｒ１およびＲ２が、独立して、以下
    

    

    からなる群から選択される、請求項１３に記載の式（ＩＩ）の中間体化合物。
15. 式（ＩＩａ）で示される請求項１３または１４に記載の式（ＩＩ）の中間体化合物
    

    

    式中、Ｒ４およびＲ５’は請求項１３で定義したとおりである。

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