RU2833355C2

RU2833355C2 - Модифицированные цианиновые красители и их конъюгаты

Info

Publication number: RU2833355C2
Application number: RU2021136246A
Authority: RU
Inventors: Франческо БЛАЗИ; Кьяра БРИОСКИ; Федерика БУОНСАНТИ; Луиджи МИРАГОЛИ; Роберта НАПОЛИТАНО; Лаура ОРИО; Лорена ПИЦЦУТО; Джованни ВАЛЬБУЗА
Original assignee: Бракко Имэджинг Спа
Priority date: 2019-05-13
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2025-01-20

Abstract

Изобретение относится к соединению формулы (I)

(I)

где R1 и R2 независимо являются -CO-NH-Y группой, где Y выбирают из линейного или разветвленного C₁-C₈ алкила, замещенного двумя-пятью гидроксильными группами; R3 является линейным или разветвленным C₄ алкилом, замещенным группой -SO₃H; R4 является линейным двухвалентным C₅ алкилом; R5 выбран из -CONH-; S является спейсером, выбранным из -(CH₂)_p- и -NH(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂-, где p является целым числом от 0 до 4; T является таргетной группой, выбранной из группы, состоящей из малой молекулы, белка, пептида, пептидомиметика и антитела или его фрагмента; n является целым числом, равным 3; и m является целым числом, равным 0 или 1, а также к фармацевтической диагностической композиции, диагностическому набору и промежуточному соединению формулы (II)

где R1, R2, R3, R4 и n такие, как определены по п. 1, и R5' выбран из -COOH, -CONH₂, -COO-Pg и -CONH-Pg, где Pg является защитной группой, такой как C_1-2 алкильная группа. Технический результат: получены новые соединения, которые могут быть применимы для определения и демаркации границы опухоли в направленной хирургии отдельного пациента. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 8 табл., 17 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области оптических изображений. Более конкретно, оно относится к соединениям семейства цианинов, характеризующимся улучшенными физико-химическими и биологическими свойствами, и к их конъюгатам с их биологическими лигандами. Изобретение также относится к применению этих соединений в качестве оптических диагностических агентов при визуализации или терапии солидных опухолей, к способам их получения и к содержащим их композициям.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Красители представляют собой химические вещества, которые поглощают фотоны определенной длины волны при возбуждении светом и повторно излучают часть этой энергии, в зависимости от квантовой эффективности, обычно на более длинной длине волны. В частности, цианиновые красители являются флуоресцентными органическими молекулами, характеризующимися делокализованной системой электронов, которая охватывает полиметиновый мостик и заключена между двумя атомами азота. Некоторые из них, обладая благоприятными оптическими свойствами, низкой токсичностью и хорошей растворимостью в водных средах, могут применяться в качестве контрастных агентов для биомедицинской визуализации.

Флуоресцентные молекулы, используемые в настоящее время для биомедицинской визуализации, такие как индоцианин зеленый (ICG), флуоресцеин, метиленовый синий и 5-аминолевуленовая кислота (5-ALA), пассивно диффундируют в тканях и могут накапливаться в патологических областях благодаря различным механизмам самонаведения. Флуорофоры, такие как флуоресцеин и ICG, распределяются в опухолевых тканях за счет комбинации пассивной диффузии и эффекта повышенной проницаемости и удержания (EPR) (Onda N. et al., Int J Cancer 2016, 139, 673-682). Промежуточные продукты метаболизма, такие как 5-ALA, накапливаются в тканях с повышенным метаболизмом (Stummer W. et al., Neurosurgery 2015, 77 (5), 663-673). Другие флуорофоры, не направленные на конкретную молекулярную мишень, используют физиологические свойства опухоли (например, повышенную перфузию и проницаемость) для создания контрастного изображения, следуя принципам усиленной контрастом рентгеновской или магнитно-резонансной томографии (Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72 (3), 392-398). Как правило, эти флуоресцентные контрастные агенты требуют относительно большой массовой дозы для правильной визуализации. Более того, ложноположительные и ложноотрицательные являются обычными клиническими находками, связанными с их использованием (Tummers Q. et al., PlosOne 2015).

Другие контрастные вещества для оптической визуализации находятся в стадии разработки, они подразумевают использование красителя, конъюгированного с группой носителя, направленного на сверхэкспрессируемый рецептор опухоли, для повышения чувствительности и специфичности обнаружения (Achilefu S. et al, J Med Chem 2002, 45, 2003 -2015).

Однако на поведение конъюгатов краситель-биомолекула in vivo могут сильно влиять биологические свойства флуоресцентной группы. Например, небольшие структурные модификации цианина Cy5 сильно модулируют накопление в опухоли и нецелевых тканях соответствующих биоконъюгатов (Bunschoten A. et al., Bioconjugate Chem. 2016, 27, 1253-1258). Флуоресцентные контрастные агенты с низким неспецифическим накоплением и высокой селективностью в отношении ткани-мишени были бы предпочтительны для применения на живых организмах.

В патенте США 6,913,743 B2 на имя Institut fur Diagnostikforschung GmbH описан, например, in vivo диагностический процесс с использованием новых водорастворимых красителей и их продуктов присоединения биомолекул в качестве контрастной среды.

В WO2018/189136 и WO2016/097317, оба на имя Bracco Imaging SpA, описано соединение DA364, используемое для демаркации краев опухоли при интраоперационной визуализации. Таким соединением является циклический пептид RGD на основе азабициклоалкана, конъюгированный с красителем сульфо-Cy5,5.

Пример конъюгата ICG, который связан с пептидом cRGD, описан в Capozza et al, Photoacoustics, 2018, 11, 36-45, где он используется для фотоакустической визуализации опухолей.

Патент США №6,329,531 B1 на имя Schering AG относится к оптическим диагностическим агентами для диагностики нейродегенеративных заболеваний с помощью NIR излучения и описывает, в частности, гептаметинцианиновые красители в качестве флуоресцентных меток. Некоторые из этих цианиновых красителей также описаны, например, в статьях Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72 (3), 392-398 и Ebert et al., J. Biomed. Optics, 2011, 16 (6), 066003, где они сравниваются с клинически одобренным красителем ICG. В частности, последние описывают соединение, названное SIDAG, которое показало физико-химические свойства, аналогичные свойствам контрастных веществ для МРТ, и, в отличие от ICG, характеризуется внесосудистым распределением с объемами распределения в диапазоне внеклеточной воды. SIDAG является гидрофильной альтернативой ICG, разработанной для решения технической проблемы его незначительной экстравазации и быстрого поглощения печенью. Однако не упоминается о возможном использовании таких соединений, и в частности SIDAG, в качестве флуоресцентных проб для молекулярной визуализации и о любом синтетическом подходе для функциональной дериватизации и дальнейшего конъюгирования таких симметричных производных цианина. Например, SIDAG предложен в качестве биологически инертного красителя с экстраваскулярной моделью распределения, имитирующей поведение контрастных агентов МРТ, таких как гадопентетиновая кислота (Gd-DTPA). SIDAG может быстро диффундировать через поры измененных сосудов опухоли и, таким образом, может достигать более глубоких областей опухолевой ткани через пассивную диффузию, но ему не хватает желаемых признаков для применения в молекулярной визуализации, таких как способность интернализироваться и накапливаться с высокой эффективностью и специфичностью в патологических клетках и тканях.

В WO2005/123768 на имя Amersham Health AS описаны новые соединения на основе пептидов, меченые, по меньшей мере, одним репортером цианинового красителя, подходящие в качестве контрастного агента при оптической визуализации для диагностики заболеваний, связанных с ангиогенезом.

В WO2012/088007 на имя Pierce Biotechnology Inc. and Dyomics Gmbh описаны цианиновые красители, имеющие от двух до четырех функциональных групп сульфоновой кислоты на индольном гетероциклическом каркасе.

Несмотря на несколько попыток найти подходящие агенты для визуализации, все еще существует потребность в поиске улучшенных красителей, наделенных оптимальной стабильностью и эффективностью флуоресценции, а также оптимальными физико-химическими и биологическими свойствами и предназначенных для оптической визуализации живых организмов. Эта потребность имеет первостепенное значение, особенно для областей молекулярной визуализации, требующих высокоспецифических инструментов, со способностью отображать мелкие молекулярные изменения и накапливаться с высокой эффективностью в клетках-мишенях, например, когда краситель конъюгирован с биомолекулой, которая специфически связывает молекулярный эпитоп или патологическую ткань (например, опухоль). Настоящее изобретение удовлетворяет эти и другие потребности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В общем, объектом настоящего изобретения является предоставление новых цианиновых красителей и, в частности, их соответствующих конъюгатов со связывающими группами, полезных в качестве контрастного вещества для оптической визуализации и направленных на решение вышеупомянутых проблем. В частности, настоящее изобретение решает техническую проблему получения агента оптической визуализации с оптимальными свойствами для областей молекулярной визуализации. Например, было обнаружено, что новые производные цианина по изобретению проявляют особенно подходящие свойства для взаимодействия с биологическими субстратами и накопления в патологических клетках и тканях.

Новые производные цианина, описанные в настоящем документе, неожиданно наделены замечательными оптическими свойствами, ведущими к улучшенной эффективности визуализации при малых массовых дозах и улучшенному отношению сигнала к шуму. Кроме того, авторы настоящего изобретения нашли подходящие процедуры для синтеза новых цианиновых красителей и конъюгирования их с различными таргетными группами через подходящие функциональные группы, действующие как сайты связывания, получая, таким образом, очень специфические и чувствительные контрастные агенты для оптической визуализации. Новые комбинации красителя, спейсера и таргетной группы, как представлено в настоящем изобретении, неожиданно дали соединения, наделенные оптимальной эффективностью клеточной интернализации и общими свойствами для молекулярной визуализации для агента оптической визуализации.

Подробно, среди нескольких преимуществ, которые могут быть достигнуты с помощью настоящих соединений, особенно для конъюгатов со связывающей группой, можно выделить следующие особенности, например: низкое взаимодействие с белками плазмы, селективность в отношении ткани-мишени и низкое накопление из-за не специфического взаимодействия с другими тканями, высокую растворимость в воде, незначительные или отсутствующие побочные реакции после системного введения, хорошую химическую и оптическую стабильность в плазме после введения.

В частности, было обнаружено, что соединения по настоящему изобретению обладают очень низкой аффинностью связывания с человеческим альбумином, что особенно выгодно, когда эти соединения используются для визуализации у людей: указанная низкая аффинность предотвращает секвестрацию соединений в компартментах плазмы за счет больших белков, присутствующих в крови, таких как альбумин, и последующее уменьшение доли свободного красителя, доступного для накопления в ткани, представляющей интерес. Фактически, связанная с альбумином фракция красителей будет накапливаться в тканях со скоростью переноса макромолекул, поскольку высокая молекулярная масса альбумина определяет поведение связанного красителя, и будут вызвать их нежелательное неспецифическое накопление в здоровых тканях и органах. Это биологическое свойство особенно важно в случае красителей-конъюгатов, поскольку только их свободная фракция (не связанная с альбумином) может должным образом взаимодействовать с молекулярной мишенью и может эффективно интернализоваться клетками, экспрессирующими конкретный антиген.

Другой аспект изобретения относится к таким красителям-конъюгатам в качестве диагностических агентов, в частности, для использования в оптической визуализации органа или ткани человека или животного, для использования в способе оптической визуализации, где визуализацией является томографическая визуализация органов, отслеживании функций органов, включая ангиографию, визуализации мочевыводящих путей, визуализации желчных протоков, визуализации нервов, интраоперационной идентификации рака, флюоресцентной хирургии, флюоресцентной прижизненной визуализации, коротковолновой инфракрасной визуализации, флуоресцентной эндоскопии, флуоресцентной лапароскопии, роботизированной хирургии, открытой хирургии в полевых условиях, хирургии под лазерным контролем или фотоакустическом или сонофлуоресцентном способе.

Кроме того, изобретение относится к способу получения представленных красителей, соответствующих конъюгатов и/или их фармацевтически приемлемых солей, а также к их применению в приготовлении диагностического агента.

В соответствии с дополнительным аспектом, изобретение относится к фармацевтически приемлемой композиции, содержащей, по меньшей мере, один краситель или соединение краситель-конъюгат по изобретению, или его фармацевтически приемлемую соль в смеси с одним или несколькими физиологически приемлемыми носителями или эксципиентами. Указанные композиции применимы, в частности, в качестве агентов оптической визуализации для получения полезной визуализации органов или тканей человека или животных.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения оптического изображения органа, ткани или области тела с использованием метода оптического изображения, который включает использование эффективной дозы соединения по настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следовательно, первым объектом настоящего изобретения является представление соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли,

(I)

где

R1 и R2 независимо являются -CO-NH-Y группой, где Y выбирают из линейного или разветвленного алкила, циклоалкила и гетероциклила, замещенного, по меньшей мере, двумя гидроксильными группами;

R3 является линейным или разветвленным алкилом, замещенным группой, выбранной из -NH₂, -SO₃H, -COOH и -CONH₂;

R4 является линейным или разветвленным двухвалентным алкилом;

R5 выбран из -COO- и-CONH-;

S является спейсером;

T является таргетной группой;

n является целым числом, равным 1, 2 или 3; и

m является целым числом, равным 0 или 1.

В настоящем изобретении также представлены соответствующие функционализированные красители, представленные промежуточным соединением формулы (II) или его фармацевтически приемлемой солью,

(II)

где

R1, R2, R3, R4 и n такие, как определены выше, и

R5' выбран из -COOH, -CONH₂, -COO-Pg и -CONH-Pg, где Pg является защитной группой.

Настоящее изобретение также относится к способам получения соединений формулы (I) или (II) посредством стадий синтетических превращений.

Изобретение также включает соединения формулы (I) для использования в качестве флуоресцентных проб для обнаружения края опухоли в направленной хирургии.

Определения

В настоящем описании, если не указано иное, следующие термины и фразы, используемые в настоящем документе, имеют следующие значения.

Выражение «прямой или разветвленный алкил» относится к алифатической углеводородной радикальной группе, которая может быть линейной или разветвленной, имеющей от 1 до 8 атомов углерода в цепи. Например, «C₄ алкил» включает в своем значении линейную или разветвленную цепь, содержащую 4 атома углерода. Типовые и предпочтительные алкильные группы включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, пентил и гексил. Если не указано иное, прямой или разветвленный алкил является одновалентной радикальной группой. В некоторых случаях это может быть «двухвалентная» или «многовалентная» радикальная группа, где два или более атома водорода удалены из вышеуказанной углеводородной радикальной группы и замещены, например метиленовые, этиленовые, изопропиленовые группы и подобные.

Используемый в настоящем документе термин «циклоалкил» включает в своем значении насыщенное (т.е. циклоалифатическое) карбоциклическое кольцо, содержащее от 3 до 7 атомов углерода. Подходящие примеры включают C₅-C₇ карбоциклическое кольцо, например циклогексильное кольцо.

Используемый в настоящем документе термин «гетероциклил» включает насыщенное циклоалифатическое кольцо, предпочтительно 5-7-членное насыщенное кольцо, дополнительно содержащее гетероатом в циклической цепи, выбранный из N, O и S. Предпочтительно, он относится к тетрагидропирану.

Термин «гидроксиалкил» относится к любой соответствующей алкильной цепи, где один или несколько атомов водорода замещены гидроксильными группами.

Термин «алкокси» включает в своем значении алкильную цепь, как определено выше, дополнительно содержащую один или несколько атомов кислорода; примеры включают, например, алкилоксигруппы, такие как метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси и подобные, и алкил(поли)оксигруппы, в которых алкильная цепь прервана одним или несколькими атомами кислорода.

В настоящем описании термин «защитная группа» (Pg) обозначает защитную группу, адаптированную для сохранения функции группы, с которой она связана. В частности, защитные группы используются для сохранения амино, гидроксильных или карбоксильных функциональных групп. Соответствующие защитные группы могут включать, например, бензил, карбонил, такой как формил, 9-фторметилоксикарбонил (Fmoc), бензилоксикарбонил (Cbz), трет-бутоксикарбонил (Boc), изопропилоксикарбонил или аллилоксикарбонил (Alloc), алкильные, например трет-бутильные или трифенилметильные, сульфонильные, ацетильные группы, такие как трифторацетил, сложные бензиловые эфиры, аллил или другие заместители, обычно используемые для защиты таких функциональных групп, которые хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, общую ссылку T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4^th Ed., Ch. 5).

Более конкретно, изобретение включает соединения формулы (II), в которых функциональные группы R5', т.е. карбоновая кислота или карбоксамид, защищены соответствующей защитной группой (Pg), как определено выше, предпочтительно алкильными группами. Такие производные находят, например, применение в качестве подходящих предшественников или промежуточных соединений при получении желаемого соединения формулы (I) или его солей.

Если необходимо, гидроксильные группы R1 и R2 и/или функциональные группы R3 могут быть также защищены соответствующей защитной группой (Pg) во время получения соединений формулы (I) или (II), таким образом образуя, например, ацетокси, алкокси, сложноэфирные или амидные группы.

Выражение «связующий агент» относится к реагенту, используемому, например, для образования амидной связи между карбоксильной группой и аминогруппой. Реакция может состоять из двух последовательных стадий: активация карбоксильной группы и затем ацилирование аминогруппы активированной карбоновой кислотой. Неограничивающие примеры таких связующих агентов выбраны из группы, состоящей из: карбодиимидов, таких как N, N'-диизопропилкарбодиимид (DIC), N, N'-дициклогексилкарбодиимид (ДЦК), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDAC), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (WSC); фосфониевые реагенты, такие как гексафторборат (бензотриазол-1-илокси)трис(диметиламино)фосфония (BOP), гексафторборат (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфония (PyBOP), гексафторборат 7-азабензотриазол-1-илокситрипирролидинофосфония (PyAOP), гексафторборат [этил циано(гидроксиимино)ацетато-O2]три-1-пирролидинилфосфония (PyOxim), гексафторборат бромтрипирролидинофосфония (PyBrOP) и 3-(диэтоксифосфорилокси)-1,2,3-бензотриазин-4(3H)-он (DEPBT); и аминиевые/урониевые-имониевые реагенты, такие как тетрафторборат O-(N-Сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилурония (TSTU), тетрафторборат N, N,N',N'-тетраметил-O-(бензотриазол-1-ил)урония (TBTU), гексафторборат N, N,N',N'-тетраметил-O-(1H-бензотриазол-1-ил)урония (ΗBTU), гексафторборат N, N,N',N'-тетраметил-O-(7-азабензотриазол-1-ил)урония (ΗATU), гексафторборат O-(1H-6-хлорбензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (HCTU), гексафторборат 1-[1-(циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламиноморфолино]урония (COMU) и гексафторборат фтор-N, N,N',N'-тетраметилформамидиния (TFFH) или другие соединения, хорошо известные специалистам в данной области техники.

Выражение «активированная карбоновая кислота» относится к производному карбоксильной группы, которое более восприимчиво к нуклеофильной атаке, чем свободная карбоксильная группа; подходящие производные могут включать, например, ангидриды кислот, сложные тиоэфиры, ацилгалогениды, сложный эфир NHS и сложные эфиры сульфо NHS.

Термины «группа» или «остаток» в настоящем документе предназначены для определения остаточной части данной молекулы, когда она должным образом присоединена или конъюгирована, либо непосредственно, либо через подходящий линкер и/или спейсер, с остальной частью молекулы.

Термин «агент визуализации» относится к определяемому веществу, которое можно использовать для in vitro или in vivo визуализации или определения биологического элемента, включая клетки, биологические жидкости и биологические ткани, происходящие от живого пациента-млекопитающего, и, предпочтительно, пациента-человека, а также органа, областей или тканей тела человека, когда указанное определяемое вещество используют в сочетании с подходящей методикой диагностической визуализации.

Таргетная группа (T)

Согласно изобретению таргетная группа (Т) представляет собой молекулу, которая с особой селективностью связывается с биологической мишенью и способствует накоплению контрастного агента в конкретной ткани или части тела. Как правило, она представлена природной или синтетической молекулой для использования в биологических системах.

Такое специфическое связывание может быть достигнуто с помощью лиганда, такого как, например, малая молекула, белок, пептид, пептидомиметик, ферментный субстрат, антитело или его фрагмент или аптамер, взаимодействующий со специфической биологической мишенью, экспрессируемой на поверхности. тканей или клеток, представляющих интерес.

Подходящими биологическими мишенями для соединений по изобретению могут быть, например, рецептор фактора роста эпителия (EGF), такой как EGFR или HER2; рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), такой как VEGFR1 или VEGFR2; фермент карбоангидраза (CA), такой как CAIX, CAII или CAXII; гликопротеин муцина, такой как MUC1; транспортер глюкозы, такой как GLUT-1; натрий-водородный антипортер, такой как NHE1; карциноэмбриональный гликопротеин, такой как карциноэмбриональный антиген (CEA); хемокиновый рецептор, такой как хемокиновый рецептор типа 4 (CXCR4); молекула клеточной адгезии, такая как ICAM, EPCAM, VCAM, E-Selectin, P-Selectin; фактор роста гепатоцитов HGFR (c-met); рецептор трансферрина; рецептор эфрина, такой как EPHA2; рецептор фолиевой кислоты, такой как FR-альфа; связывающая гликопротеин иалуроновая кислота, такая как CD44; рецептор бомбезина, такой как BB1, BB2, BB3; пептидаза N-ацетил-L-аспартил-L-глутамата (NAAG), такая как простатспецифический мембранный антиген (PSMA); и, в частности, интегриновый рецептор, такой какα αvβ3, αvβ5, αvβ6 или α5β1 интегриновые рецепторы.

Например, таргетные группы для интегриновых рецепторов представлены линейными или циклическими пептидами, содержащими последовательность Arg-Gly-Asp (RGD). Этот трипептид обладает высокой специфичностью связывания с рецептором, поскольку он распознается как лиганд семейством интегриновых рецепторов, расположенных в клеточной мембране. Фактически, он идентифицирован в некоторых гликопротеинах внеклеточного матрикса, таких как фибронектин или витронектин, которые используют этот мотив RGD для опосредования клеточной адгезии.

Следовательно, линейные и циклические пептиды и пептидомиметики, содержащие последовательность Arg-Gly-Asp (RGD), такие как, например, cRGD, cRGDfK, cRGDyK, cRGDfC, RGD-4C, RGD-2C, AH111585, NC100692, RGD et-K5 (Kapp al., Sci Rep, 2017, 7: 3905), или их аналоги и производные, являются хорошо известным примером связывающего мотива, направленного на раковые ткани, на которых интегрины клеточной мембраны активируются по сравнению со здоровыми тканями.

В одном варианте осуществления, соединения по изобретению могут быть конъюгированы с другими малыми молекулами, пептидами, белками или антителами, такими как, например, моноклональные антитела, уже используемые для терапии. Малые молекулы, содержащие лекарственное средство ацетазоламид, такие как, например, соединения 4a, 5a, 6a, 7a и 8a (Wichert et al., Nat Chem 2015, 7: 241-249), или их аналоги и производные, являются примерами малых молекул, направленных на фермент CAIX. Линейные и циклические пептиды и пептидомиметики, такие как пептид GE11 (описанный в Li et al., FASEB J 2005, 19: 1978-85) и/или пептид L1 (описанный в Williams et al., Chem Biol Drug Des 2018, 91: 605-619), или их аналоги и производные, являются примерами пептидов, направленных на рецептор фактора роста эпителия (EGFR). Среди белков, производные фактора роста эпителия (EGF) являются примерами малого белка, направленного на рецептор фактора роста эпителия (EGFR). Среди антител, панитумумаб и цетуксимаб являются примерами моноклональных антител, направленных на рецептор фактора роста эпителия (EGFR).

Предпочтительно, таргетные лиганды по изобретению способны селективно связывать опухолевые клетки или ткани. В частности, они способны связывать опухоли, выбранные из рака мозга, рака груди, рака головы и шеи, рака яичников, рака простаты, рака пищевода, рака кожи, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака полости рта, рака легких, рака почек, рака матки, рака щитовидной железы, рака печени и колоректального рака. Кроме того, таргетные лиганды способны связывать метастатическое распространение вышеупомянутых видов рака в тканях и органах, отличных от первичного источника. Кроме того, таргетные лиганды способны связывать предопухолевые поражения и дисплазию в различных тканях и органах.

В одном варианте осуществления, таргетная группа также может быть хелатором, который образует комплексы и прочно связывает металлы. Примеры таких хелаторов металлов известны специалистам в данной области техники и описаны в известном уровне техники и могут быть представлены, например, молекулами DOTA, NODAGA, TETA, CB-TE2A, EDTA, DTPA, Дефероксамин, NOTA, AAZTA и т. д. Эти хелаторы можно использовать для образования комплексов с металлами, такими как Gd³⁺ или Mn²⁺, и применять в качестве контрастных агентов при магнитно-резонансной томографии. В предпочтительном варианте осуществления, хелаторы могут использоваться для образования комплексов с радиометаллами, такими как технитий, индий, фторид алюминия, цирконий, иттрий, лютиций, скандий, аттиний, галлий или медь, и находят применение, например, в качестве агентов визуализации при анализе с помощью позитронно-эмиссионной томографии, однофотонной эмиссионной компьютерной томографии и гамма-счетчиков.

Спейсер S

Согласно изобретению, S является спейсером, необязательно присутствующим, который отделяет таргетную группу от красителя.

Присутствие спейсера особенно актуально для некоторых вариантов осуществления, в которых таргетная группа и краситель рискуют неблагоприятно взаимодействовать друг с другом. Более того, присутствие спейсера может быть необходимо, когда краситель относительно большой и может мешать связыванию таргетной группы с сайтом-мишенью.

Спейсер может быть гибким (например, простые алкильные цепи) или жестким (например, циклоалкильные или арильные цепи), так что краситель ориентирован от мишени. Спейсер может также изменять фармакокинетику и метаболизм конъюгатов формулы (I), используемых в качестве агентов визуализации в живом организме.

Гидрофильные спейсеры могут уменьшить взаимодействие с белками плазмы, сократить время пребывания в кровотоке и облегчить выведение. Например, если спейсером является фрагмент полиэтиленгликоля (PEG), фармакокинетика и скорость клиренса из крови агента визуализации in vivo могут быть изменены. В таких вариантах осуществления, спейсер может улучшить клиренс агента визуализации из фоновой ткани (например, мышц, крови), таким образом, обеспечивая лучшее диагностическое изображение благодаря высокому контрасту между мишенью и фоном. Более того, введение определенного гидрофильного спейсера может сдвинуть выведение контрастного вещества с печени на почки, тем самым уменьшая общую задержку в теле.

Поэтому, в одном предпочтительном варианте осуществления, спейсер выбран из группы, состоящей из -NH(CH₂)_pCOO-, -NH(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂COO- и -NH(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂NH-, где p является целым числом от 0 до 20. Предпочтительно, p равно 2, 6 или 12.

Когда нет необходимости, спейсер предпочтительно отсутствует, т.е. m равно 0, а S является прямой связью.

Спейсер или, альтернативно, таргетная группа, когда спейсер отсутствует, может быть связан в соединении формулы (I) на остатке R5, представленном связывающей группой R5'в соединениях формулы (II).

Связывающие группы R5' являются реакционноспособными функциональными группами, такими как карбоксильные или карбоксамидо остатки, подходящие для конъюгирования красителя с таргетной группой через образование химической связи.

Например, когда аминсодержащая таргетная группа (Т) конъюгирована с соединением формулы (II), где R5' является карбоновой кислотой, эта карбоновая кислота может быть необязательно активирована перед проведением конъюгации через превращение в более реакционноспособную форму с использованием активирующего реагента, например, с образованием сложного эфира N-гидроксисукцинимида (NHS) или смешанного ангидрида. Затем, для получения соответствующего соединения формулы (I), аминсодержащую таргетную группу обрабатывают полученной активированной кислотой с образованием амидной связи. Обычно эту реакцию проводят в водном буфере.

В противном случае может быть выполнено прямое конъюгирование с использованием «неактивированной» карбоновой кислоты.

Точно так же, когда связывающая группа R5' является карбоксамидо группа, процедура присоединения подходящей таргетной группы аналогична, но обычно не требует стадии активации линкера, и краситель и таргетную группу обрабатывают напрямую.

Соединения вышеуказанной формулы (I) или (II) могут иметь один или несколько асимметричных атомов углерода, иначе называемых хиральными атомами углерода, и, таким образом, могут давать диастереомеры и оптические изомеры. Если не указано иное, настоящее изобретение дополнительно включает все такие возможные диастереомеры, а также их рацемические смеси, их по существу чистые разделенные энантиомеры, все возможные геометрические изомеры и их фармацевтически приемлемые соли.

Настоящее изобретение также относится к соединениям вышеуказанной формулы (I) или (II), в которых функциональные группы R3 и/или R5', например сульфонильная, карбоксиамино или карбоксильная группа, могут быть в форме фармацевтически приемлемой соли.

В одном варианте осуществления, изобретение относится к соединению формулы (I) или (II), где R1 и R2 независимо являются группой -CO-NH-Y где Y, необязательно одну и ту же группу для R1 и R2, выбирают из линейного или разветвленного алкила, циклоалкила и гетероциклила, замещенного от двух до пяти гидроксильными группами.

В предпочтительном варианте осуществления, изобретение относится к соединению формулы (I) или (II), где n равно 3, R3 является алкилом, замещенным -SO₃H, и R1 и R2 могут быть одинаковыми или разными и их выбирают из группы, состоящей из

Более предпочтительно, n равно 3, R3 является алкилом, замещенным -SO₃H, и R1 и R2 являются одинаковыми.

В другом варианте осуществления изобретения, m равно 0 и спейсер (S) представлен прямой связью, или m равно 1 и спейсер является гидрофильной группой, содержащей алкильную, циклоалкильную или арильную группы.

Предпочтительно, спейсер выбран из -NH(CH₂)_pCOO-, -NH(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂COO- и -NH(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂NH-, где p равно целому числу от 0 до 20. Предпочтительно, p равно 2, 6 или 12.

В другом варианте осуществления, T является таргетной группой, выбранной из малой молекулы, белка, пептида, петидомиметика, ферментного субстрата, антитела или любого их фрагмента и аптамера.

Предпочтительно, T представлен пептидом, и в частности, группой, взаимодействующей с интегриновым рецептором, таким как α_vβ₃, α_vβ₅, α_vβ₆, α₅β₁ и подобные, предпочтительно, с α_vβ₃интегриновым рецептором.

В другом предпочтительном варианте осуществления, изобретение относится к соединению формулы (I) или (II), где n равно 3, R3 является C₄-алкилом, замещенным -SO₃H, и обе R1 и R2 являются группой (iv), такой как определена выше, в другом случае представленной следующими формулами (Ia) или (IIa), соответственно:

где R4, R5, R5', S, m и T такие, как определены выше.

В другом варианте осуществления, изобретение относится к соединению формулы (I)или (II), где n равно 1 или 2.

Особенно предпочтительными являются соединения формулы (I) или (II), перечисленные в таблице Ia и Ib.

Таблица Ia - Предпочтительные соединения формулы (I)

Соединение 1

Соединение 2

Соединение 3

Соединение 9

Соединение 10

Соединение 11

Соединение 12

Таблица 1b - Предпочтительные соединения формулы (II)

Соединение 4

Соединение 5

Соединение 6

Соединение 7

Соединение 8

Настоящее изобретение также относится к способам синтеза соединений формулы (I) и (II), полученных, как проиллюстрировано в нижеследующем описании. Соединения по изобретению полезны в качестве агентов визуализации при обнаружении опухолей как у людей, так и у животных. Соответственно, изобретение представляет соединения формулы (I), как определено выше, для использования в качестве флуоресцентных проб для определения и демаркации границы опухоли в направленной хирургии отдельного пациента, в частности, когда указанной опухолью является опухоль, показывающая уменьшенную или изменчивую сверхэкспрессию интегриновых рецепторов. Предпочтительно, визуализируемым субъектом является человек.

В изобретении также представлено соединение формулы (I) для использования в качестве флуоресцентной пробы, как определено выше, где определение и разграничение границы опухоли проводят под NIR излучением.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат формулы (I) или краситель формулы (II), как определено выше, или его соль, и один или несколько фармацевтически приемлемых адъювантов, эксципиентов или разбавителей.

Другой аспект настоящего изобретения относится к диагностическому набору, содержащему конъюгат формулы (I), как определено выше. Кроме того, набор может содержать дополнительные адъюванты для реализации оптического изображения. Эти адъюванты включают, например, подходящие буферы, сосуды, реагенты для определения или инструкции по применению. Набор предпочтительно содержит все материалы для внутривенного введения соединений по изобретению.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить системно или локально в орган или ткань, которые необходимо визуализировать, до процедуры визуализации. Например, соединения могут вводиться внутривенно. В другом варианте осуществления они могут вводиться парентерально или энтерально. Композиции вводят в дозах, эффективных для достижения желаемого оптического изображения опухоли, ткани или органа, которые могут широко варьироваться в зависимости от используемого соединения, ткани, подвергнутой процедуре визуализации, оборудования, используемого для визуализации и подобных. Точная концентрация агентов визуализации зависит от условий эксперимента и желаемых результатов, но обычно может находиться в диапазоне от 0,000001 мМ до 0,1 мМ. Оптимальная концентрация определяется систематическим изменением до получения удовлетворительных результатов с минимальной фоновой флуоресценцией. После введения, агенты визуализации по изобретению подвергают воздействию света или другой формы энергии, которая может проходить через слой ткани. Предпочтительно, длина волн или диапазон волн излучения соответствует длине волны или диапазону волн возбуждения фотосенсибилизирующего агента и имеет низкое поглощение нецелевыми клетками и остальной частью субъекта, включая белки крови. Обычно оптический сигнал определяется либо наблюдением, либо инструментально, и его ответ зависит от флуоресценции или интенсивности света, распределения и срока службы.

ОПИСАНИЕ СИНТЕЗА

Получение соединений формулы (I) или (II), как таковых или в форме физиологически приемлемых солей, представляет еще один объект изобретения. Цианиновые красители и красители-конъюгаты по изобретению могут быть получены, например, согласно способам, описанным в следующих разделах и в экспериментальной части. Общие знания относительно получения цианиновых красителей могут быть найдены в Mujumdar R.B. et al., Bioconjugate Chem. 1993, 4(2), 105-111, который относится к синтезу и мечению сульфоиндоцианиновых красителей. Однако, цианины по настоящему изобретению характеризуются специфичным шаблоном функционализации, не присутствующем в соединениях известного уровня техники, для которых требуется установка подходящего синтетического подхода. Фактически, в отличие от других известных цианинов, соединения по изобретению несут даже три функциональные группы (группы карбоновой кислоты или амино/амида) для дериватизации различными путями так, что применение защитных групп является необходимым в большинстве случаев для направления реакций на желаемую функциональную группу.

Известно, что могут возникнуть трудности при манипуляциях с цианинами при жестких условиях рН и температуры, необходимых для удаления защитных групп, так как стабильность полиметинового каркаса может быть нарушена в некоторых случаях, с тяжелым разложением красителей.

Кроме того, другие обстоятельства могут приниматься во внимание из-за возможного гидролиза и разложения амидных групп R1 и R2 при снятии защиты с карбоксильной группы R5 (обычно, амидные производные могут гидролизоваться в концентрированной щелочной среде, см., например, Yamana et al, Chem. Pharm. Bull., 1972, 20(5), 881-891).

В отличие от ожидаемого, было обнаружено, что соединения по изобретению являются очень стабильными при щелочном pH (т.е. при примерно pH 11) и никакое или незначительное разложение наблюдается во время удаления защитных групп.

В одном предпочтительном варианте осуществления, защитной группой для группы R5' является сложная эфирная группа.

Более предпочтительно, преимущественно применяют группу этилового эфира.

Получение цианиновых красителей формулы (II)

Согласно изобретению, соединения формулы (II) могут быть получены с применением общего способа синтеза, показанного на следующей схеме 1, для вариантов осуществления, где R1 является таким же, как R2, или на схеме 2, для вариантов изобретения, где R1 и R2 имеют разные значения.

Схема 1

На вышеуказанной схеме 1, R1, R2, R3, R4 и n такие, как определены выше, R5'' является -COOPg или -CONHPg, где Pg является защитной группой, R5''' является -COOH или -CONH₂ и X является подходящей уходящей группой, такой как галоген, мезилат или трифлат.

Следовательно, способ по настоящему изобретению включает следующие стадии:

а) обработка количества 5-карбокси-2,3,3-триметилиндоленин (III) нуклеофилом R3-X (IV), где R3 такой, как определен выше, и X является подходящей уходящей группой, такой как галогенидная группа, или R3-X является молекулой C₁-C₆-алкансультона, с получением промежуточного соединения (VI);

b) обработка другого количества 5-карбокси-2,3,3-триметилиндоленина (III) нуклеофилом R5''-R4-X (V), где R5'' и R4 такие, как определены выше и X является подходящей уходящей группой, такой как галогенидная группа, с получением промежуточного соединения (VII);

с) взаимодействие промежуточного соединения (VI) и промежуточного соединения (VII) вместе с реагентом (VIII) с получением цианинового каркаса (IX), где n, R3, R4 и R5'' такие, как определены выше;

d) дериватизация групп карбоновой кислоты на индоленовых кольцах полигидроксилированным амином, таким как, например, глюкамин, меглумин, глюкозамин, трометамол, серинол или изосеринол;

е) необязательно, удаление любой защитной группы из полученного промежуточного соединения (X) и выделение соединения формулы (II) или его соли.

Согласно стадиям a) и b), взаимодействие производного (III) с нуклеофилом R3-X (IV) или R5''-R4-X (V) может проводиться в чистом виде или в высококипящих растворителях, таких как бутиронитрил, сульфолан, 1,2-дихлорбензол, диметилацетамид, диметилформамид или диметилсульфоксид, перемешиванием раствора при высокой температуре, например, от 90°C и 180°C, в течение нескольких часов, обычно от 12 часов до 5 дней.

Согласно стадии c), реакция может проводиться с применением реагента Вилсмейера в бис анилидо форме (как показано на схеме 1) или в бис альдегидной форме. Реакция может проводиться в нескольких растворителях, таких как, например, этанол, метанол, уксусный ангидрид или уксусная кислота, с или без добавления разных оснований, таких как триметиламин, пиридин, ацетат натрия, ацетат калия и т.д., перемешивание смеси при разных температурах, варьирующихся от 45°C до 120°C в течение нескольких часов (обычно, 2-24 часа).

Согласно стадии d) реакция может проводиться с применением нескольких агентов сочетания, таких как TBTU, HBTU, HATU, PyBOP, ДЦК, ДСК, ДЦК-NHS и нескольких органических оснований, таких как ТЭА, ДИПЭА, NMM, пиридин, и т.д., в растворителях, таких как диметилформамид, диметилацетамид, диметилсульфоксид, ацетонитрил и т.д., при комнатной температуре в течение подходящего времени, варьирующегося от 30 минут до нескольких часов.

Согласно необязательной стадии e), любую защитную группа промежуточного соединения (X) удаляют из группы R5'' известными методами, описанными, например, в T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4^th Ed., Ch. 5.

Альтернативно, как сказано выше, если R1 отличается от R2, соединение формулы (II) может быть получено, как показано на следующей схеме 2:

Схема 2

где R1, R2, R3, R4 и n такие, как определены выше, R5'' является -COOPg или -CONHPg, где Pg является защитной группой, R5''' является -COOH или -CONH₂ и X является подходящей уходящей группой, такой как галоген, мезилат или трифлат.

Согласно схеме 2, полигидроксилированный амин взаимодействует на стадии b') с промежуточным соединением (VII) с получением промежуточного соединения (XI), несущего остаток -R2, затем проведение реакции Вилсмейера со стадии c) с получением цианина (IX). Другой отличный остаток -R1 может быть добавлен после на второе индолениновое кольцо.

Альтернативно, группа -R1 также может быть введена в промежуточное соединение (VI) на соответствующей стадии a'), до проведения стадии c).

Следовательно, стадию b') и/или, необязательно, a'), проводят как описано выше для стадии d).

В другом варианте осуществления, соединение формулы (II), полученное способами настоящего изобретения, могут быть удобным образом превращены в другое соединение формулы (II), работая в хорошо известных синтетических условиях, где далее представлены примеры возможных превращений:

f) превращение соединения формулы (II), где R5''' является -COOH, т.е. соединения формулы (IIb) в соответствующее соединение формулы (II), где R5''' является -CONH₂, т.е. соединение формулы (IIc):

Согласно стадии f), превращение карбоновой кислоты формулы (IIb) в соответствующий карбоксамид формулы (IIc) может проводиться множеством путей и экспериментальных условий, которые широко известны в данной области техники для получения карбоксамидов. В качестве примера, карбоновая кислота может быть сначала превращена в подходящий активированный сложный эфир и затем взаимодействовать с аммониевой солью, такой как NH₄Cl, предпочтительно, в присутствии агента сочетания, такого как HBTU.

Получение конъюгатов соединений формулы (I)

Цианиновые производные формулы (II), или их соли, затем могут быть конъюгированы с подходящей таргетной группой, необязательно со вставкой спейсера, с получением соответствующих соединений формулы (I), как показано на схеме 3:

Схеме 3

Конъюгирование может проводиться согласно разным методикам, известным в данной области техники, таким как, например, прямое сочетание, где функциональная группа R5''' непосредственно взаимодействует с нуклеофильным остатком таргетной группы, или, необязательно, со спейсером, или с предварительной активацией, где функциональная группы R5''', обычно кислота, превращается в более реакционноспособную группу, например, в сложный эфир, такой как NHS, до сочетания.

Если соединение формулы (I) или (II), полученное способами, описанными выше, получают в виде смеси изомеров, их разделение с применением обычных методов на отдельные соответствующие изомеры формулы (I) или (II) входит в объем настоящего изобретения.

Конечные соединения могут быть выделены и очищены с применением обычных методов, например, хроматографии и/или кристаллизации и образования соли.

Соединение формулы (I) или (II), как определено выше, может быть превращено в фармацевтически приемлемую соль. Соединения формулы (I) или (II), как определено выше, или их фармацевтически приемлемая соль, затем могут быть составлены с фармацевтически приемлемыми носителем или разбавителем с получением фармацевтической композиции.

ОПИСАНИЕ ЧЕРЕТЖЕЙ

На фиг. 1 представлено затухание сигнала флуоресценции в здоровой мышечной ткани после внутривенного введения трех доз (0,3 нмоль/мышь, круги; 1 нмоль/мышь, квадраты; 3 нмоль/мышь, треугольники) соединения 1 у мышей Balb/c nu/nu (n=5/группу).

На фиг. 2 представлено затухание сигнала флуоресценции (левая ось y) в опухоли (черные круги) и мышечной ткани (белые круги) после введения 1 нмоль соединения 1 мышам Balb/c nu/nu, которым имплантированы 10 миллионов клеток U87MG, и отношение опухоли к фону (квадраты, правая ось y) с течением времени.

На фиг. 3 показано отношение опухоли к фону (TBR) соединения 1, введенного в дозе 3 нмоль/мышь мышам Balb/c nu/nu, которым имплантированы 2,5 миллиона клеток Detroit-562 (n=5).

На фиг. 4 представлено затухание флуоресценции (левая ось y) в опухоли (черные круги) и мышечной ткани (белые круги) после введения 1 нмоль соединения 1 бестимусным голым мышам, которые имплантированы 5 миллионов клеток HT-29 (n=5), и отношение опухоли к фону (квадраты, правая ось y) с течением времени.

Все данные показаны как среднее ± стандартное отклонение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Изобретение и его конкретные варианты осуществления, описанные в следующей части, являются только иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения: они показывают, как настоящее изобретение может быть реализовано, и предназначены для иллюстрации без ограничения объема изобретения.

Материалы и оборудование

Все химические ингредиенты и растворители, применяемые для реакций, являются химически чистыми. Аналитически чистые растворители применяют для хроматографических очисток. Большинство реагентов, если не указано иное, являются коммерческими продуктами, включая таргетные группы (например, панитумумаб (Vectibix, Amgen; CAS Регистрационный номер активного вещества: 339177-26-3); цетуксимаб (Erbitux, Merck; CAS Регистрационный номер активного вещества: 205923-56-4)).

Все синтезированные соединения очищают хроматографией с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ) и характеризуют масс спектроскопией с применением ЖХ/МС инструмента, оборудованного НФ-ВИД детектором и источником ИЭР. Анализ проводят на колонке Waters Atlantis dC18 5мкм, 4,6 × 150 мм с применением градиента фазы A CH₃COONH₄ 10 мМ и фазы B ацетонитрила. Измеренные отношения масса/заряд перечислены для каждого соединения.

УФ-ВИД спектрофотометр с двойным лучом (Lambda 40, Perkin Elmer) применяют для определения абсорбции (Abs) соединений по изобретению. Измерения спектров испускания/возбуждения (Em/Ex) и абсолютного квантового выхода флуоресценции (ɸ) проводят на спектрофлуориметре (FluoroLog-3 1IHR-320, Horiba Jobin Yvon), оборудованном F-3018 необязательным фотометрическим шаром. Измерения проводят с применением длины волны возбуждения при максимальной абсорбции разных красителей, и образец возбуждают с помощью 450W Xenon Light Source. Определение проводят с применением охлажденного датчика с фотоэлектронными умножителями (PMT-NIR) или датчика TBX-04. Растворы красителей осторожно готовят так, чтобы они имели абсорбцию ниже 0,1 (оптические плотности) для минимизации явления повторной абсорбции.

In vivo эксперименты визуализации проводят с применением IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perkin Elmer Inc.). Систему оборудуют 10 узкополосными фильтрами возбуждения (ширина полосы 30 нм) и 18 узкополосными фильтрами испускания (ширина полосы 20 нм) с интервалом 430-850 нм.

Список сокращений

ДЦК	N, N'-дициклогексилкарбодиимид
ДИПЭА	N, N-Диизопропилэтиламин
ДМФ	Диметилформамид
ДМСО	Диметилсульфоксид
ДСК	N, N'-Дисукцинимидил карбонат
HATU	Гексафторборат 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиния 3-оксид
HBTU	Гексафторборат O-бензотриазол-1-ил-N, N,N',N'-тетраметилурония
ВЭЖХ	Высокоэффективная жидкостная хроматография
ФРФБ	Физиологический раствор с фосфатным буфером
NHS	N-гидроксисукцинимид
NMM	N-метилморфолин
КТ	Комнатная температура
PyBOP	Гексафторборат (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфония
ТЭА	Триэтиламин
TBTU	Тетрафторборат 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония
TSTU	Тетрафторборат O-(N-сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилурония
мкл	Микролитр
мкМ	Микромолярный
t_R	Время удержания (ВЭЖХ)
cRGDfK	Цикло-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)
аза-cRGD-NH₂	Аза-цикло-(Arg-Gly-Asp)

Аббревиатуры для индивидуальных аминокислотных остатков являются обычными: например, Asp или D являются аспарагиновой кислотой, Gly или G является глицином, Arg или R является аргинином. Аминокислоты, указанные в настоящем документе, должны пониматься как находящиеся в конфигурации L-изомера, если не указано иное.

Пример 1 : Синтез соединения 4

Получение промежуточного соединения (VIa), стадия a

В круглодонную колбу добавляют 5-карбокси-2,3,3-триметилиндоленин (1,50 г, 7,38 ммоль), 2,4-бутансультон (1,11 г, 8,15 ммоль) и бутиронитрил (2 г). Смесь нагревают при 120°C в течение 2 дней. Твердое вещество затем обрабатывают сухим ацетоном, фильтруют в вакууме и дважды промывают ацетоном. Розовое твердое вещество сушат в вакууме и применяют без дальнейшей очистки (2,40 г, 96%). ВЭЖХ чистота при 270 нм 94%, МС: [M+H]+ 339,2.

Получение промежуточного соединения (VIIa), стадия b

В круглодонную колбу добавляют промежуточное соединение III (1,5 г, 7,38 ммоль), этил 6-бромгексаноат (1,97 г, 8,85 ммоль) и сульфонат (6,8 г). Суспензию нагревают при 90°C в течение 3 дней. Затем добавляют этилацетат (25 мл), пурпурную дисперсию перемешивают при КТ в течение 15 минут и фильтруют в вакууме. Твердое вещество промывают этилацетатом три раза, затем его редиспергируют в свежем этилацетата (15 мл), перемешивают при КТ в течение 15 минут, фильтруют в вакууме и промывают этилацетатом. Эту операцию повторяют еще два раза. Наконец, розовое/фиолетовое твердое вещество, содержащее и желаемый продукт, и исходный материал, сушат в вакууме. Затем его диспергируют в ацетонитриле (4 мл), плотную дисперсию перемешивают при КТ в течение 15 минут и фильтруют. Твердое вещество промывают небольшим объемом холодного ацетонитрила. Маточный раствор содержит преимущественно желаемый продукт, тогда как твердое вещество содержит исходный материал. Ацетонитрил выпаривают под вакуумом, и твердое вещество снова диспергируют в ацетонитриле (4 мл), перемешивают в течение 15 минут, фильтруют и твердое вещество промывают холодным ацетонитрилом. Раствор концентрируют под вакуумом с получением розового/фиолетового твердого вещества с ВЭЖХ чистотой 92% при 270 нм (1,25 г в виде соли брома, 40%). МС: [M+H]+ 346,5.

Получение промежуточного соединения (IXa), стадия c

В круглодонную колбу добавляют глютакональдегид дианил гидрохлорид (0,48 г, 1,4 ммоль), уксусный ангидрид (47 мл) и уксусную кислоту (13 мл). Оранжево-коричневый раствор нагревают при 60°C в течение 3 ч. реакционную смесь затем охлаждают до КТ, и раствор промежуточного соединения (IVa) (0,60 г, 1,4 ммоль) в этаноле (10 мл) добавляют по каплям при КТ за примерно 20 минут. Красный раствор нагревают при 35°C в течение 2 ч, затем температуру повышают при 50°C и добавляют раствор промежуточного соединения (III) (0,48 г, 1,4 ммоль) и ацетат натрия (0,11 г, 1,3 ммоль) в этаноле (19 мл). Сразу же после добавляют пиридин (2,0 мл). Реакционную смесь нагревают при 60°C в течение 1,5 ч, затем растворители выпаривают под вакуумом, и темное масло осаждают в холодной воде (100 мл). Темно-зеленое твердое вещество фильтруют и промывают холодной водой. Затем, его растворяют в минимальном количестве этанола, и этот раствор по каплям добавляют при перемешивании в этилацетат (400 мл). Твердое вещество фильтруют, промывают этилацетатом, растворяют в дихлорметане и очищают на силикагеле с медленным градиентом дихлорметан-метанол. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют, выпаривают под вакуумом и сушат с получением зелено-синего твердого вещества (350 мг, 33% выход). ВЭЖХ чистота при 756 нм 94%, МС: [M+H]+ 747,3.

Синтез соединения 4, стадии d и e

В высушенной круглодонной колбе, сухой ДИПЭА (115 мкл, 0,56 ммоль) добавляют к раствору промежуточного соединения (IXa) (150 мг, 70% чистота, 0,14 ммоль) в ДМФ (2 мл). Через 30 минут перемешивания под потоком азота, добавляют раствор TBTU (309 мг, 0,67 ммоль) в ДМФ (2 мл). Через 1 ч добавляют суспензию D-глюкамина (87 мг, 0,336 ммоль) в ДМФ (2 мл). Смесь перемешивают в течение 2 ч при КТ, затем концентрируют и очищают на заранее упакованной C18 колонке с диоксидом кремния с градиентом вода-ацетонитрил. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают, концентрируют и сушат вымораживанием, с получением зелено-синего порошка (95,8 мг, 64% выход). ВЭЖХ чистота при 756 нм 97%, МС: [M+Na]+ 1095,3.

Промежуточное соединение (Xa), полученное таким образом (95 мг, 0,089 ммоль) солюбилизируют в воде (10 мл, pH 6,35), затем добавляют 2N NaOH до pH 11,14. Раствор перемешивают при комнатной температуре, сохраняя pH 11 через добавление 0,1N NaOH. Через 40 ч реакцию завершают, смесь нейтрализуют 1N HCl и очищают на заранее упакованной C18 колонке с диоксидом кремния с градиентом вода-ацетонитрил. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают, концентрируют и сушат вымораживанием с получением зелено-синего порошка (81 мг, 86% выход). ВЭЖХ чистота при 756 нм 98%, МС: [M+H]+ 1045,3.

Пример 2 : Синтез соединения 5

Стадия f

В высушенной круглодонной колбе, N-метилморфолин (10 мкл, 0,091 ммоль) добавляют к раствору соединения 4, полученного в примере 1 (10 мг, 0,0096 ммоль) в сухом ДМФ (1 мл). Через 30 минут перемешивания под потоком азота, добавляют раствор HBTU (13 мг, 0,03 ммоль) в ДМФ (1 мл). Через 1 ч, добавляют суспензию NH₄Cl (10 мг, 0,19 ммоль) в ДМФ (1 мл). Смесь продолжают перемешивать в течение 2 дней, затем ее сушат в вакууме и очищают на заранее упакованной C18 колонке с диоксидом кремния с градиентом вода-ацетонитрил. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают, концентрируют и сушат вымораживанием с получением синего твердого вещества (2,56 мг, 20% выход). ВЭЖХ чистота при 756 нм 97,5%, МС: [M+H]⁺ 1043,1.

Пример 3 : Синтез соединения 7

Получение промежуточного соединения Xb, стадия d

Промежуточное соединение IXb получают по методике примера 1, но с применением реагента малональдегида дианилида гидрохлорида для стадии c). Промежуточное соединение IXb (58 мг, 0,081 ммоль) суспендируют в сухом ДМФ (10 мл). Добавляют трометамол (23,5 мг, 0,194 ммоль), ДИПЭА (61 мкл, 0,352 ммоль) и HATU (73,77 мг, 0,194 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в инертной атмосфере при КТ в течение 2 часов. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и неочищенный продукт очищают флэш хроматографией на заранее упакованной С18 колонке с диоксидом кремния с градиентом вода/метанол. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают и отгоняют под вакуумом и сушат вымораживанием, с получением ярко-синего твердого вещества (60 мг, 80% выход). ВЭЖХ чистота при 655 нм: 99,6%. МС: [M+H]⁺ 927,3.

Синтез соединения 7, стадия e

Промежуточное соединение Xb (110 мг, 0,106 ммоль) растворяют в этаноле (2 мл) и добавляют воду (18 мл). Раствор нагревают при 40°C, и поддерживают pH 11 добавлением 0,1N NaOH до завершения гидролиза (около 6 часов). PH доводят до 7 добавлением 0,1N HCl, и неочищенный продукт очищают флэш хроматографией на заранее упакованной С18 колонке с диоксидом кремния с градиентом вода/метанол. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают, отгоняют под вакуумом и сушат вымораживанием, с получением ярко-синего твердого вещества (18,7 мг, 19% выход). ВЭЖХ чистота при 655 нм: 95,7%. MS: [M+H]⁺ 899,3.

Пример 4 : Синтез соединения 8

Промежуточные соединения VIc и VIIc получают по методике выше, описанной для промежуточных соединений VIa и VIIa. Аналогично примеру 1, их обрабатывают соответствующим реагентом, N, N-дифенилформамидином, с получением триметинового промежуточного соединения IXc.

Получение промежуточного соединения Xc, стадия d

Промежуточное соединение IXc (62 мг, 0,089 ммоль) суспендируют в сухом ДМФ (15 мл). Добавляют D-глюкамин (33,9 мг, 0,187 ммоль), ДИПЭА (62 мкл, 0,356 ммоль) и HATU (71,10 мг, 0,187 ммоль), и реакционную смесь перемешивают под инертной атмосферой при КТ в течение 4 часов. Растворитель отгоняют под пониженным давлением, и неочищенный продукт очищают флэш хроматографией на заранее упакованной С18 колонке с диоксидом кремния с градиентом вода/ацетонитрил. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают, отгоняют под вакуумом и сушат вымораживанием, с получением ярко-розового твердого вещества (82,4 мг, 91% выход). ВЭЖХ чистота при 560 нм: 99,8%. МС: [M+H]⁺ 1021,3.

Синтез соединения 8, стадия e

Промежуточное соединение Xc (81,4 мг, 0,08 ммоль) растворяют в этаноле (2 мл) и добавляют воду (18 мл). Раствор перемешивают при КТ и поддерживают pH 11 добавлением 0,1N NaOH до завершения гидролиза (около 46 часов). Затем, pH доводят до 7 добавлением 0,1 N HCl и неочищенный продукт очищают флэш хроматографией на заранее упакованной С18 колонке с диоксидом кремния с градиентом вода/ацетонитрил. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают, отгоняют под вакуумом и сушат вымораживанием, с получением ярко-розового твердого вещества (79 мг, 99,4% выход). ВЭЖХ чистота при 560 нм: 100%. МС: [M+H]⁺ 993,3.

Пример 5 : Синтез соединения 1

Соединение 1 синтезируют конъюгированием красителя, соответствующего соединению 4, и циклического пентапептида c-RGDfK, где конъюгирование проводят двумя альтернативными методиками A или B. Соединение 4 получают как описано в примере 1. Пептид c-RGDfK, представляющий таргетную группу, является коммерческим реагентом.

Методика A - Стадия конъюгирования через прямое сочетание

В высушенной круглодонной колбе, N-метилморфолин (10 мкл, 0,09 ммоль) добавляют к раствору соединения 4, полученного как описано в примере 1 (10 мг, 0,009 ммоль) в сухом ДМФ (1 мл). Через 30 минут перемешивания под потоком азота, добавляют раствор TBTU (6 мг, 0,02 ммоль) в ДМФ (1 мл). Через 1 час добавляют раствор c(RGD)fK (6 мг, 0,009 ммоль) в ДМФ (1 мл). Смесь перемешивают при КТ в течение 20 часов, затем добавляют еще TBTU (4 мг) и N-метилморфолин (2 мкл), и через 2 часа добавляют c(RGD)fK (2 мг). Смесь перемешивают в течение еще 6 ч, затем ее концентрируют, и неочищенный продукт очищают на аналитической ВЭЖХ на C18 колонке с диоксидом кремния с градиентом 0,1% ацетат аммония-ацетонитрил. Фракции, содержащие неочищенный продукт, собирают, концентрируют и сушат вымораживанием три раза, с получением синего твердого вещества (4,4 мг, 29% выход). ВЭЖХ чистота при 756 нм 99%, МС: [M/2]⁺ 841,0.

Методика B - Стадия конъюгирования через предварительную активацию с NHS сложным эфиром

Соединение 4, полученное как описано в примере 1 (4 мг, 0,0038 ммоль) суспендируют в сухом ДМФ (3 мл) под потоком азота. Добавляют N-метилморфолин (0,8 мкл, 0,0076 ммоль) и TSTU (2,3 мг, 0,0076 ммоль), и раствор перемешивают при КТ в течение 20 ч. Желаемый продукт осаждают добавлением холодного диэтилового эфира, центрифугируют и дважды промывают диэтиловым эфиром.

Твердое вещество растворяют в растворе c(RGD)fK (3,0 мг, 0,0042 ммоль) в боратном буфере при pH 9 (2 мл). Раствор перемешивают в течение ночи, затем pH доводят до 6 добавлением 1N HCl, и неочищенный продукт очищают на аналитической ВЭЖХ на C18 колонке с диоксидом кремния с 0,1% градиентом ацетат аммония/ацетонитрил. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают, концентрируют и сушат вымораживанием три раза, с получением синего твердого вещества (5,2 мг, 83% выход). ВЭЖХ чистота при 756 нм 99%, МС: [M/2]⁺841,0.

Пример 6 : Синтез соединения 3

В высушенной круглодонной колбе, N-метилморфолин (10 мкл, 0,09 ммоль) добавляют к раствору соединения 4, полученному как описано в примере 1 (10 мг, 0,009 ммоль) в сухом ДМФ (1 мл). Через 15 минут перемешивания под потоком азота, добавляют раствор HBTU (3,6 мг, 0,01 ммоль) в ДМФ (1 мл). Через 30 минут, добавляют раствор аза-cRGD-NH₂ (5,7 мг, 0,01 ммоль) в ДМФ (1 мл). Смесь перемешивают в течение 2 дней, затем ее концентрируют под вакуумом и очищают на аналитической ВЭЖХ на C18 колонке с диоксидом кремния с 0,1% градиентом ацетат аммония/ацетонитрил. Фракции, содержащие чистый продукт, собирают, концентрируют и сушат вымораживанием три раза, с получением синего порошка (3,57 мг, 21% выход). ВЭЖХ чистота при 756 нм 99%, МС: [M/2]⁺ 780,8.

Пример 7 : Синтез соединения 9

Моноклональное антитело EGFR лиганд Панитумумаб (6 мг) разводят до 5 мг/мл в ФРФБ и pH доводят добавлением 120 мкл 1,0 M фосфата калия до pH 9. Соединение сложный эфир 4-NHS (полученный как описано в примере 5, методика B) растворяют в ДМСО в концентрации 10 мг/мл; затем краситель и антитело сразу же смешивают в молярном отношении 2,5:1 и хранят при комнатной температуре в темноте в течение 3 ч. Через 3 ч, конъюгированную реакционную смесь расслаивают на уравновешенных физиологическим раствором с фосфатным буфером (ФРФБ) колонках Zeba Spin и центрифугируют при 1500g в течение 2 мин для отделения конъюгата от свободного красителя. После фильтрации через 0,22 мкм полиэфирсульфоновую (PES) мембрану, конъюгированный раствор Панитумумаба в ФРФБ при pH 7,4 анализируют ЭР-ВЭЖХ, ОФ-ВЭЖХ, УФ/ВИД спектрофотометрией для определения концентрации и чистоты. Молярное отношение конъюгирования (молекулы красителя, сопряженные с антителом) составляет примерно 1,3.

Пример 8 : Синтез соединения 10

Моноклональное антитело EGFR лиганд Цетуксимаб (5 мг/мл) диализируют к ФРФБ в 10K Da MWCO мембране. 10мг диализированного MAb (4,52 мг/мл, 68,8 нмоль) добавляют к 221 мкл 1 M фосфатного буфера до pH 9. Соединение сложный эфир 4-NHS (полученный как описано в примере 5, методика B) растворяют в ДМСО в концентрации 6,86 мМ. 43,3 мкл красителя добавляют в раствор Цетуксимаба (молярное отношение 4,3:1) и хранят при комнатной температуре в темноте в течение 3 ч. После этого, конъюгированную реакционную смесь расслаивают на уравновешенных физиологическим раствором с фосфатным буфером (ФРФБ) колонках Zeba Spin и центрифугируют при 1000g в течение 2 мин для отделения конъюгата от свободного красителя. После фильтрации через 0,22 мкм полиэфирсульфоновую (PES) мембрану, конъюгированный раствор Цетуксимаба в ФРФБ при pH 7,4 анализируют ЭР-ВЭЖХ, ОФ-ВЭЖХ, УФ/ВИД спектрофотометрией для определения концентрации и чистоты. Молярное отношение конъюгирования (молекулы красителя, сопряженные с антителом) составляет примерно 1,1.

Пример 9 : Синтез соединения 11

Малую молекулу CAIX лиганд 4a, описанную в Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241-249, получают по методике, описанной в настоящем документе, и конъюгируют с соединением 4. 11 мг соединения 4 (10,0 мкмоль) растворяют в 1 мл ДМФ, затем добавляют 5,5 мг PyBOP (10,0 мкмоль) и 7 мкл ДИПЭА (40,0 мкмоль) при непрерывном перемешивании. Через 20 минут, 9 мг малой молекулы 4a (15,0 мкмоль) растворяют в 1 мл ДМФ и добавляют к реакционной смеси, которую перемешивают в течение дополнительных 30 минут при комнатной температуре. Очистку проводят препаративной ВЭЖХ с выходом 60%. Выделенный чистый продукт характеризуют ВЭЖХ-УФ-ВИД-МС-ИЭР (+) с применение колонки Waters Atlantis dC18 (мкм, 4,6×150 мм). ВЭЖХ чистота при 758 нм: 98%; МС: [M/2]⁺ 823,3.

Пример 10 : Синтез соединения 12

Малую молекулу CAIX лиганд 8a, описанную в Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241-249, получают по методике, описанной в настоящем документе, и конъюгируют с соединением 4. 15 мг соединения 4 (10,0 мкмоль) растворяют в 1 мл ДМФ, затем добавляют 7,3 мг PyBOP (14,0 мкмоль) и 10 мкл ДИПЭА (57,0 мкмоль) при непрерывном перемешивании. Через 20 минут, 22 мг малой молекулы 8a (15,0 мкмоль) растворяют в 1 мл ДМФ и добавляют к реакционной смеси, которую перемешивают в течение дополнительных 30 минут при КТ. Очистку проводят препаративной ВЭЖХ с выходом 34%. Выделенный чистый продукт характеризуют ВЭЖХ-УФ-ВИД-МС-ИЭР (+) с применение колонки Waters Atlantis dC18 (мкм, 4,6×150 мм).

ВЭЖХ чистота при 758 нм: 95%; МС: [M/2]⁺ 1051,8.

Пример 11 : Стабильность промежуточного соединения (Xa)

Стабильность промежуточного соединения (Xa), полученного как описано в примере 1 стадия d), оценивают в разных условиях для проведения гидролиза этилового эфира в оптимальных условиях. Фактически, известно, что такой тип цианинов достаточно стабилен в кислых и основных средах.

В отличие от других аналогов, несущих полисульфонильные группы, таких как, например, соединение DA364, описанное в WO2018/189136, которое более стабильно в кислых условиях, промежуточное соединение (Xa) неожиданно показало значительную стабильность при проведении гидролиза в жестких условиях, таких как pH 11 и 45°C в течение нескольких часов, без разложения R1 и R2 групп.

Неожиданно, хорошие результаты также были получены при проведении гидролиза с ферментными экстрактами печени свиньи и кролика, работая при 1 мг/мл, pH 8 и 38°C в ФРФБ буфере. Полное превращение получено всего через 20-24 часа, без какого-либо разложения.

Пример 12 : Оптические свойства

Соединения по изобретению характеризуют по их оптическим свойствам in vitro в водной среде (т.е., воде/ФРФБ pH 7,4) и в контрольной сыворотке для клинической химии (Seronorm, Sero SA), имитируя химическую композицию и оптические свойства сыворотки человека. Все растворы краситель-конъюгат были свежеприготовленными.

В частности, максимы возбуждения и испускания и абсолютного квантового выхода флуоресценции (Φ) типовых соединений формулы (I) и соответствующих красителей формулы (II) показаны в таблице II в сравнении с коммерческим би-сульфонированным гептаметиновым красителем Indocyanine Green (ICG, Sigma), би-сульфонированным пентаметиновым красителем сульфо-Cy5 (Lumiprobe) и би-сульфонированным триметиновым красителем сульфо-Cy3 (Lumiprobe).

Таблица II - Максима возбуждения/испускания и абсолютный квантовый выход флуоресценции соединений формулы (I) (соединения 1 и 3) и (II) (соединения 4, 6, 7, 8)

Cy7	Max Ex/Em (нм, ФРФБ pH 7,4)	Φ (ФРФБ pH 7,4)	Φ (Seronorm)
ICG (Эталон)	780/810	1,5%	7,8%
Соединение 1	757/786	9,8%	13,0%
Соединение 3	757/785	10,6%	11,7%
Соединение 4	755/785	8,9%	13,4%
Cy5	Max Ex/Em (nm, ФРФБ pH 7,4)	Φ (ФРФБ pH 7,4)	Φ (Seronorm)
Сульфо-Cy5 (Эталон)	645/665	27,0%	35,6%
Соединение 6	656/675	35,6%	35,9%
Соединение 7	655/675	35,1%	35,1%
Cy3	Max Ex/Em (nm, ФРФБ pH 7,4)	Φ (ФРФБ pH 7,4)	Φ (Seronorm)
Сульфо-Cy3 (Эталон)	548/565	6,8%	н/д
Соединение 8	557/573	14,5%	20,0%

н/д, не доступно

Соединения по изобретению характеризуются максимой абсорбции в диапазоне от примерно 550 нм до 760 нм. Квантовые выходы флуоресценции, полученные для соединений по изобретению, были значительно выше, чем для эталонного соединения, со значениями в примерно 1,5-7 раз больше, чем соответствующие эталонные соединения с той же длиной полиметиновой цепи. Примечательно, соединения по изобретению демонстрируют больший квантовый выход в водном буфере ФРФБ, чем эталонные соединения с аналогичными свойствами растворимости.

Пример 13 : Аффинность к человеческому альбумину

Проводят анализ аффинности связывания соединений по изобретению с человеческим альбумином, и результаты сравнивают с эталонным Indocyanine Green (ICG).

Аффинность связывания с человеческим сывороточным альбумином (HSA; Sigma Aldrich, A9511) измеряют с использованием двух способов в соответствии с уровнем аффинности связывания соединений.

Первый способ, оптимальный для соединений, которые сильно взаимодействуют с HSA, основан на анализе сдвига пика спектра абсорбции после инкубации красителя в растворах, содержащих HSA. Коротко, образцы инкубируют при фиксированной концентрации (1 мкМ) с разведением HSA (1×10^-6-4×10^-4 M) в фосфатном буфере в течение 5 минут в спектрофотометре при 25°C перед измерениями. Измерение проводят при длине волны максимальной абсорбции смещенного пика.

Второй способ, оптимальный для соединения с низкой аффинностью к HSA, основан на измерении изменения абсорбции растворов, содержащих краситель и различные концентрации HSA после ультрафильтрации. Коротко, каждое соединение инкубируют при фиксированной концентрации (2 мкМ) с разведением HSA (1х10^-6-4х10^-4 М) в фосфатном буфере. Образцы центрифугируют (10000 g в течение 30 мин при 25°C) в приборе Microcon (MWCO 10 кДа, центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-0,5 с мембраной Ultracel-10, Millipore) и измеряют абсорбцию фильтратов спектрофотометром на длине волны максимальной абсорбции флуорофора.

Для обоих способов, константа аффинности (K_A, M^-1) рассчитывают путем подбора исходных данных по следующей формуле:

где

ΔA/b=измеренная абсорбция (b=1 см)

K_RL=K_A рассчитанная регрессионным анализом (аппроксимация кривой)

Δε ⋅ Rt рассчитано регрессионным анализом (аппроксимация кривой)

[L]=концентрация альбумина

В первом способе, ΔA/b соответствует абсорбции, измеренной для каждого образца, тогда как во втором способе ΔA/b получают вычитанием абсорбции контрольного образца (краситель без HSA) из абсорбции каждого другого образца.

Оба способа продемонстрировали получение сравнимых результатов, как показано параллельными экспериментами, проведенными на коммерческом цианиновом красителе IRDye 800CW карбоксилат (LI-COR Inc., Lincoln, USA) с использованием первого способа (HSA K_A=215000 М^-1) и второго способа (HSA K_A=216000 M^-1). Однако измерение константы аффинности является более точным, когда подходящий способ используют как функцию от уровня сродства соединения.

Результаты аффинности связывания, измеренной для типовых соединений по изобретению одним из двух способов, представляют в таблице III и сравнивают с результатами, полученными для клинически доступного красителя ICG и для ICG-RGD и DA364 в качестве эталонных соединений.

Таблица III - Аффинность связывания с сывороточным человеческим альбумином (HSA)

Соединение	HSA аффинность (K_A, M^-1)
ICG (Эталонное соединение)	347,000
ICG-RGD (Эталонное соединение)	219,000
DA364 (Эталонное соединение)	28,670
Соединение 1	6,290
Соединение 3	4,200
Соединение 4	5,110
Соединение 6	<1,000
Соединение 7	3,460
Соединение 8	2,070

Как показано в Таблице III, красители и красители-конъюгаты по изобретению проявляют заметно низкую аффинность связывания с человеческим альбумином по сравнению с доступным ICG и многими другими известными цианиновыми соединениями, с константами аффинности на один или два порядка ниже. Эта полезная особенность относится как к красителям формулы (II) (например, Соединению 4), так и к соответствующему красителю при конъюгировании с таргетной группой (например, Соединениям 1 и 3), позволяя предположить, что конъюгация красителей с таргетной группой не влияет на аффинность к человеческому альбумину.

Скорее, конъюгаты RGD формулы (I), такие как типовые Соединения 1 и 3, неожиданно показали гораздо более низкую аффинность к человеческому альбумину, чем другие красители, известные в данной области, при конъюгировании с RGD таргетной группой, такие как ICG-RGD (HSA K_A=219000 M^-1, Capozza et al., 2018) или DA364 (HSA K_A=28 670 M^-1, WO2016/097317), как указано в таблице III. Более того, эталонное соединение DA364 при анализе точно в тех же экспериментальных условиях, что и настоящие соединения, показало более высокую аффинность к HSA с константой аффинности (K_A) 110000 М^-1.

Пример 14 : Аффинность связывания рецептора

Аффинность связывания конъюгатов формулы (I) со специфическим рецептором определяют для оценки того, сохраняется ли таргетная эффективность молекулярного вектора после мечения красителями по изобретению.

Конъюгаты молекулы пептид/пептидомиметик

В качестве примера конъюгатов пептид/пептидомиметик, аффинность к рецептору типовых интегрин-связывающих конъюгатов оценивают путем расчета их IC₅₀ (половины максимальной ингибирующей концентрации) с использованием иммуноферментного анализа (ELISA), как сообщалось ранее (Kapp et al. , Sci. Rep.2017, 7, 39805).

Коротко, 96-луночные планшеты для ELISA покрывают в течение ночи при 4°C белком внеклеточного матрикса (ECM) Витронектином в карбонатном буфере (15 мМ Na₂CO₃, 35 мМ NaHCO₃, pH 9,6). Каждую лунку затем промывают ФРФБ-T-буфером (фосфатно-солевой буфер/Tween20, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ KH₂PO₄, 0,01% Tween20, pH 7,4) и блокируют в течение 1 ч при КТ с TS-B-буфером (Трис-солевой раствор/BSA буфер; 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ MnCl₂, pH 7,5, 1% BSA). Тем временем, в дополнительном планшете готовят серию разведений соединения и внутреннего стандарта. После промывания аналитического планшета три раза ФРФБ-T, в каждую лунку переносят 50 мкл серии разведений. 50 мкл раствора человеческого рекомбинантного интегрина αvβ3 (R&D Systems, 1 мкг/мл) в TS-B-буфере переносят в лунки и инкубируют в течение 1 ч. Планшет промывают три раза буфером ФРФБ-T, и затем в планшет добавляют анти-αvβ3 антитело. После инкубации и промывания три раза с ФРФБ-T в планшет добавляют вторичное анти-IgG антитело, меченное пероксидазой, и инкубируют в течение 1 ч. После промывания планшета три раза ФРФБ-T, планшет проявляют быстрым добавлением 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) и инкубируют в течение 5 мин в темноте. Реакцию останавливают 3 М H₂SO₄, и оптическую плотность измеряют при 450 нм на планшетном ридере (Victor3, Perkin Elmer).

IC₅₀ типовых соединений 1 и 3 тестируют в двух экземплярах, и полученные кривые ингибирования анализируют с использованием GraphPad Prism версии 4,0 для Windows (GraphPad Software). Точка перегиба определяет значение IC₅₀. Все эксперименты проводят с использованием c(RGDfK) в качестве внутреннего стандарта.

Тестированные молекулярные пробы, связанные либо с c(RGDfK) (т.е. Соединением 1), либо с c(RGD)аза (т.е. Соединением 3), показали сравнимую аффинность с рецептором α_vβ₃ человека и аналогичную аффинность к неконъюгированному эталонному пептидомиметику c(RGDfK), как показано в таблице IV.

Таблица IV - Аффинность связывания с рецептором интегрина α _v β ₃ человека соединений 1 и 3 по сравнению с пептидомиметиком c(RGDfK)

Соединение	Аффинность рецептора (IC₅₀, нМ)
c(RGDfK)	2,69 ± 0,70
Соединение 1	2,96 ± 0,49
Соединение 3	2,64 ± 0,35

Низкомолекулярные конъюгаты

В качестве примера низкомолекулярных конъюгатов, ингибирующая активность типовых конъюгатов по отношению к ферменту CAIX оценивают с использованием коммерчески доступного колориметрического набора K473 (BioVision). Протокол выполняют в соответствии с инструкциями производителя, и ингибирующую активность (половину максимальной ингибирующей концентрации, IC₅₀) конъюгатов сравнивают с таковой не конъюгированного ацетазоламида. Коротко, набор использует эстеразную активность активного фермента карбоангидразы на сложноэфирном субстрате, который высвобождает хромогенный продукт. Высвободившийся продукт количественно определяют с использованием микропланшетного ридера абсорбции (абсорбция: 405 нм). В присутствии специфического к карбоангидразе ингибитора, для ацетазоламида и конъюгатов формулы (I), фермент теряет свою активность, что приводит к снижению абсорбции. Низкомолекулярные конъюгаты формулы (I) показали высокую ингибирующую способность в отношении фермента карбоангидразы со значениями IC₅₀ в низком наномолярном диапазоне, сравнимом со значениями IC₅₀ не конъюгированного ацетаксоламида (ацетазоламид: 3,7 нМ; Соединение 11: 6,5 нМ; Соединение 12: 1,2 нМ).

Конъюгаты белковых молекул

В качестве примера конъюгатов с белковой молекулой, аффинность к рецептору типовых EGFR-связывающих конъюгатов оценивают с использованием набора AlphaLISA AL366H (Perkin Elmer). В этом анализе AlphaLISA, биотинилированный EGF связывают с покрытыми стрептавидином донорными гранулами Alpha, в то время как EGFR-Fc захватывают акцепторными гранулами AlphaLISA, специфичными к анти-человеческому IgG Fc. Когда EGF связывается с EGFR, донорные гранулы и акцепторные гранулы находятся в непосредственной близости. Возбуждение донорных гранул вызывает высвобождение синглетных молекул кислорода, которые запускают каскад передачи энергии в акцепторных гранулах, что приводит к резкому пику испускания света при 615 нм. Эксперименты проводят путем сравнения аффинности конъюгата к родственному не меченому молекулярному вектору. Не меченое антитело трастузумаб, которое не связывается с рецептором EGFR, используют в качестве отрицательного контроля. Серии разведений образцов (Соединение 9 и Соединение 10 и родственные не меченые молекулярные векторы Панитумумаб и Цетуксимаб, соответственно) инкубируют в течение 30 минут с акцепторными гранулами EGFR с последующей инкубацией в течение 30 минут с биотинилированным EGF. Таким образом, донорные гранулы, конъюгированные со стрептавидином, добавляют в планшет и инкубируют в течение 30 минут. Абсорбцию измеряют при 615 нм с применением планшетного ридера (EnSight, Perkin Elmer). Для антитела трастузумаб не наблюдают специфического связывания. Наоборот, специфическое связывание рецептора наблюдают для Соединения 9 (IC₅₀, 0,2 нМ) и Соединения 10 (IC₅₀, 0,4 нМ), что сравнимо с не мечеными исходными антителами Панитумумабом (IC₅₀, 0,5 нМ) и Цетуксимабом (IC₅₀, 0,4 нМ), соответственно. Неожиданно было обнаружено, что большие молекулы, такие как цетуксимаб и панитумумаб, сохраняют нативные антигенсвязывающие свойства даже после конъюгации с красителями по изобретению.

В целом, эти результаты демонстрируют, что конъюгация малых молекул, пептидов/пептидомиметиков или белковых групп с красителем формулы (II) не ухудшает аффинность связывания конечного соединения (I) с мишенью.

Пример 15 : Поглощение клеток

Клеточная линия меланомы человека WM-266-4 (ATCC, CRL-1676) используют в качестве модели in vitro для оценки поглощения клетками типовых интегрин-связывающих соединений 1 и 3 на основании высокой экспрессии рецепторов интегрина, в частности α_vβ₃, на мембране этих клеток (Capasso et al., PlosOne 2014).

Прилипшие клетки с примерно 70% конфлюэнтностью инкубируют с соединениями 1 или 3 (1 мкМ) в течение 2 часов при 37°C (5% CO₂) в присутствии модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) с добавлением 10% FBS, 2 мМ глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. После двух стадий промывки ФРФБ, клетки отделяют с помощью 0,1 мМ EDTA в ФРФБ, центрифугируют и суспендируют в буфере (ФРФБ, 0,5% BSA, 0,1% NaN₃) для экспериментов проточной цитометрией. Сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) используют для обнаружения сигнала флуоресценции внутри клеток в качестве меры поглощения клетками. Образцы возбуждают аргоновым лазером, и испускание определяют с помощью длиннопроходного фильтра 670 нм. Значения интенсивности флуоресценции получают из статистической гистограммы, созданной программным обеспечением инструмента.

Для оценки специфичности рецептор-опосредованного поглощения клетками, эксперименты проводят путем инкубации клеток с молекулярными пробами в присутствии высокой концентрации (100 мкМ) не меченого молекулярного вектора c(RGDfK) в качестве конкурента. Остаточную интернализацию рассчитывают, принимая значение интенсивности флуоресценции в отсутствие конкурента за 100%.

Кроме того, чтобы оценить влияние биологических жидкостей на поглощение клетками, проводят параллельные эксперименты с инкубацией клеток с соединениями по настоящему изобретению в присутствии человеческой сыворотки из мужской плазмы АВ (Sigma Aldrich, H4522) или человеческого альбумина (Sigma Aldrich, A9511). Остаточную интернализацию рассчитывают, принимая значение интенсивности флуоресценции в отсутствие сыворотки за 100%. Такая оценка поглощения также представляет собой показатель доли соединения, которое секвестрируется белками плазмы, в частности альбумином, когда оно диффундирует через сосудистый компартмент, прежде чем достигнет ткани, представляющей интерес, и конкретного рецептора-мишени.

В таблице V показаны характеристики поглощения клетками типовых Соединений 1 и 3 по настоящему изобретению.

Настоящие соединения демонстрируют высокое поглощение клетками либо в присутствии человеческой сыворотки, либо в присутствии 4% HSA (Соединение 1, остаточное поглощение 70%), в то время как они демонстрируют низкое остаточное поглощение в присутствии вектора c(RGDfK) в качестве конкурента. (Соединение 1, остаточное поглощение 10%; Соединение 3, остаточное поглощение 15%). Таким образом, для настоящих соединений наблюдается, что интернализация в клетках опосредована рецептором и лишь незначительно зависит от связывания с белками сыворотки человека, в частности с альбумином (примерно 10-20% остаточного поглощения), что подтверждает средне-низкую аффинность настоящих соединений связывания с человеческим альбумином (K_A=примерно 1-6×103 M^-1, как показано в примере 10).

Кроме того, в таблице V представлено сравнение остаточного поглощения клетками соединений 1 и 3 в присутствии человеческой сыворотки с контрольными соединениями DA364, ICG-RGD (Capozza et al., Photoacoustic 2018, 11, 36-45) и ICG-c(RGDfK), полученного тем же способом для ICG-RGD. Эти результаты показывают, что неожиданно было обнаружено, что соединения по настоящему изобретению обладают более высокой эффективностью при интернализации клеток по сравнению с аналогичными соединениями, известными в данной области техники.

Таблица V - Поглощение интегрин-связывающих флуоресцентных проб клетками меланомы человека WM-266-4 в присутствии человеческой сыворотки

Соединение	Остаточное поглощение клетками в присутствии человеческой сыворотки
Cy5.5-cRGD (DA364)	15%
ICG-cRGD	12%
ICG-c(RGDfK)	8%
Соединение 1	80%
Соединение 3	75%

Примечательно, что ни взаимодействие настоящих соединений с рецептором на поверхности клетки, ни интернализация комплекса рецептор-проба внутри клетки не были ухудшены структурой конъюгированных красителей, и особенно присутствием в положениях R1 и R2 соединения групп, являющихся сильно гидрофильными и с высоким пространственным затруднением. Таким образом, присутствие гидрофильных групп в конъюгированных красителях обеспечивает высокоэффективное и специфическое связывание рецептора и интернализацию пробы даже в присутствии белков плазмы и альбумина, что может секвестировать конъюгат, лишенный гидрофильных групп, и отрицательно повлиять на эффективность связывания.

Пример 16 : Биораспределение и выведение

Биораспределение и выведение флуоресцентных агентов по изобретению оценивают с помощью оптической визуализации после внутривенного введения самцам мышей Balb/c nu/nu в возрасте 6-10 недель (Charles River Laboratories).

Коротко, мышей содержат по 4 в клетке и кормят стерильным кормом VRF1 (P) (Special Diets Services Ltd) до конца периода акклиматизации (5 дней). Затем до конца экспериментов используют корм для облученных грызунов AIN-76a (Research Diets), специальный корм, который снижает аутофлуоресценцию. Эксперименты по визуализации проводят с использованием доклинической оптической системы IVIS Spectrum (Perkin Elmer).

Визуализацию in vivo проводят под газовой анестезией (севофлуоран 6-8% в кислороде). Животным внутривенно вводят соединения и визуализируют в продольном направлении через 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 6 часов и 24 часа после введения. Таким образом, животных умерщвляют передозировкой анестезии, и основные ткани и органы, представляющие интерес, вырезают для оптической визуализации ex vivo. Области, представляющие интерес (ROI), отмечают на тканях, представляющих интерес, для каждого флуоресцентного изображения в каждый момент времени для оценки интенсивности сигнала (выраженной как средняя эффективность источника излучения). Затем рассчитывают соотношение между сигналом флуоресценции в мышце (фоновая ткань) и выделительных органах (почка, печень) для оценки контраста. Период полужизни в ткани рассчитывают путем аппроксимации затухания сигнала флуоресценции в мышце с помощью модели двухэкспоненциального уравнения затухания с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 5 для Windows).

Кинетика в ткани Соединения 1 показана на Фигуре 1, где график затухания сигнала флуоресценции в мышечной ткани построен в зависимости от времени для оценки вымывания продукта при различных дозах. Примечательно, что Соединение 1 показало очень благоприятную кинетику выведения с быстрым вымыванием из тканей и улучшенным вымыванием из организма, и, в частности, оно показало очень короткий (<1 час) период полужизни в тканях при всех тестированных дозах (0,3, 1, 3 нмоль/мышь). Соединение быстро распределяется в организме и накапливается в мочевом пузыре, что свидетельствует о его выведении через почки. Более того, оно демонстрирует быстрое выведение из тела и низкое удерживание, что преимущественно позволяет раннюю визуализацию после введения.

В таблице VI показаны отношения между сигналом флуоресценции, обнаруженным с помощью оптической визуализации в вырезанных выделительных органах (печени и почках), и в мышцах через 24 часа после внутривенного (вв) введения 1 нмоль/мышь Соединения 1 или 3.

Визуализация ex vivo вырезанных органов и тканей выявила очень низкое удерживание Соединений 1 и 3 в выделительных органах почках и печени, связанное с более быстрым выведением из организма и сниженным неспецифическим накоплением.

Таблица VI - Соотношение между затуханием сигнала флуоресценции в выделительных органах и в мышцах через 24 часа после вв введения.

Соединение	Соотношение почек к мышцам	Соотношение печени к мышцам
Соединение 1	3,18 ± 0,32	2,92 ± 0,21
Соединение 3	2,90 ± 0,55	2,50 ± 0,32

Пример 17 : Поглощение опухолью

Поглощение опухолью соединений по настоящему изобретению оценивают с помощью оптической визуализации после внутривенного введения мышам.

Эксперименты по поглощению опухолью проводят на животной модели глиобластомы человека (подкожной), сверхэкспрессирующей интегриновые рецепторы, в частности α_vβ₃. Коротко, клетки глиобластомы человека U87MG (ATCC, HTB-14) культивируют в минимальной поддерживающей среде Игла (EMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Самцам мышей Balb/c nu/nu в возрасте 4-6 недель (Charles River Laboratories) проводят подкожную имплантацию (правый бок) около 10 миллионов клеток, суспендированных в 0,1 мл EMEM. Мышей содержат по 4 на клетку с пищей и водой ad libitum. Животных кормят стерильным кормом VRF1 (P) (Special Diets Services Ltd) до конца периода акклиматизации (5 дней). Затем до конца эксперимента используют корм для облученных грызунов AIN-76a (Research Diets), специальный корм, который снижает аутофлуоресценцию. За ростом опухоли следят путем продольной оценки с помощью штангенциркуля до заданного размера 300-600 мм³ (через 3-4 недели после имплантации клеток). Эксперименты по визуализации проводят с использованием доклинической оптической системы IVIS Spectrum (Perkin Elmer).

Визуализацию in vivo проводят под газовой анестезией (севофлуоран 6-8% в кислороде). Животным внутривенно вводят соединения (в боковую хвостовую вену) и визуализируют в продольном направлении через 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа и 24 часа после введения. Области, представляющие интерес (ROI), отмечают на тканях, представляющих интерес, для каждого флуоресцентного изображения в каждый момент времени для оценки интенсивности сигнала (выраженной как средняя эффективность источника излучения). Затем рассчитывают соотношение между сигналом флуоресценции в опухоли и в мышце (фоновой ткани) для оценки контраста.

Значения затухания флуоресценции типового Соединения 1 в опухоли и мышечной ткани и отношение опухоли к фону показаны на фигуре 2. Эти результаты показывают удивительно высокое поглощение опухолью типового Соединения 1 уже в ранние моменты времени (1-2 часа после введения), обеспечивая очень высокий контраст между опухолью и фоном (TBR ~2-2,5) и низкое удерживание в здоровой ткани, что свидетельствует об опухолеспецифическом накоплении.

Фактически, настоящие соединения быстро выводятся из организма, особенно из здоровых тканей (мышц), в то время как значительное опосредованное мишенью накопление может наблюдаться для конъюгированных красителей формулы (I) в тканях-мишенях.

Параллельные эксперименты проводят на животной модели рака головы и шеи человека (ортотопического) с использованием клеток Detroit-562, сверхэкспрессирующих, в частности, интегриновый рецептор α_vβ₆. Коротко, клетки карциномы глотки человека Detroit-562 (ATCC, CCL-138) культивируют в минимальной поддерживающей среде Игла (EMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Самцам мышей Balb/c nu/nu в возрасте 4-6 недель (Charles River Laboratories) проводят ортотопическую имплантацию в переднюю часть языка около 2,5 миллионов клеток, суспендированных в 0,03 мл ди EMEM. Мышей содержат по 4 на клетку с пищей и водой ad libitum. Животных кормят стерильным кормом VRF1 (P) (Special Diets Services Ltd) до конца периода акклиматизации (5 дней). Затем до конца эксперимента используют корм для облученных грызунов AIN-76a (Research Diets), специальный корм, который снижает аутофлуоресценцию. Рост опухоли контролируют путем продольной оценки с помощью штангенциркуля до целевого размера 10-20 мм³ (7-10 дней после имплантации клеток).

Эксперименты по визуализации проводят с использованием доклинической оптической системы IVIS Spectrum (Perkin Elmer). Животным внутривенно вводят (в боковую хвостовую вену) 3 нмоль/мышь, через 24 часа после введения умерщвляют передозировкой анестезии и вырезают языки для получения оптических изображений ex vivo. Области, представляющие интерес (ROI), отмечают на передней части языка (место имплантации опухолевых клеток) и на задней области (здоровая ткань) для определения отношения опухоли к фону. Одному здоровому животному (без имплантации опухоли) вводят 3 нмоль/мышь Соединения 1 и получают изображения, как описано выше, для использования в качестве отрицательного контроля.

Визуализация ex vivo, выполненная через 24 часа после введения соединения 1, выявила яркую область на языке в месте имплантации опухолевых клеток. Иначе говоря, здоровая область на задней части языка показывала низкий сигнал, аналогичный тому, который обнаруживается у здоровых мышей, что указывает на низкое удерживание в здоровой ткани. Введение соединения по настоящему изобретению выявляет местоположение опухоли с высоким контрастом опухоли к фону (как показано на фигуре 3).

Параллельные эксперименты проводят на животной модели колоректального рака человека (подкожного) с использованием клеток HT-29, экспрессирующих низкие уровни интегриновых рецепторов. Коротко, клетки колоректальной аденокарциномы человека HT-29 (ATCC, HTB-38) культивируют в среде McCoy 5A с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Самцам бестимусных голых мышей в возрасте 4-6 недель (Envigo) проводят подкожную имплантацию (правый бок) около 5 миллионов клеток, суспендированных в 0,1 мл бессывороточной среды. Мышей содержат по 4 на клетку с пищей и водой ad libitum. Животных кормят стерильным кормом VRF1 (P) (Special Diets Services Ltd) до конца периода акклиматизации (5 дней). Затем до конца эксперимента используют корм для облученных грызунов AIN-76a (Research Diets), специальный корм, который снижает аутофлуоресценцию. За ростом опухоли следят путем продольной оценки с помощью штангенциркуля до заданного размера 300-600 мм³ (через 3-4 недели после имплантации клеток). Эксперименты по визуализации проводят с использованием доклинической оптической системы IVIS Spectrum (Perkin Elmer).

Визуализацию in vivo проводят под газовой анестезией (севофлуоран 6-8% в кислороде). Животным внутривенно вводят (в боковую хвостовую вену) соединения, представляющие интерес, и визуализируют в продольном направлении через 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа и 24 часа после введения. Области, представляющие интерес (ROI), отмечают на тканях, представляющих интерес, для каждого флуоресцентного изображения в каждый момент времени для оценки интенсивности сигнала (выраженной как средняя эффективность источника излучения). Затем рассчитывают соотношение между сигналом флуоресценции в опухоли и в мышце (фоновой ткани) для оценки контраста.

Значения затухания флуоресценции в опухолевой и мышечной ткани и отношение опухоли к фону показаны на рисунке 4 для Соединения 1.

Эти результаты показывают высокое поглощение опухолью типового Соединения 1 уже в ранние моменты времени и быстрое выведение из здоровых тканей, что приводит к умеренному соотношению опухоль/фон (TBR ~1,2-1,5), достаточному для четкого определения границ ткань опухоли из здорового фона.

Специфичность типового Соединения 1 к мишени сравнивают со специфичностью контрольного соединения DA364 на животной модели рака человека, который сверхэкспрессирует интегриновый рецептор человека αVβ3, как описано выше. Оба соединения вводят в дозе 1 нмоль/мышь либо с (блокирующая группа), либо без (контрольная группа) избытка не меченого пептидомиметика cRGD (200 нмоль/мышь). Через 24 часа после инъекции мышей умерщвляют, ткани опухоли вырезают и визуализируют с использованием системы флуоресценции IVIS Spectrum (Perkin Elmer). Протокол блокирования вызвал 10% снижение интенсивности сигнала флуоресценции (суррогат изображения поглощения) в опухолевой ткани животных, которым вводили DA364. Наоборот, протокол блокирования вызвал снижение на 75% флуоресценции в опухолях животных, которые получали Соединение 1, что указывает на более высокую специфичность рецептора in vivo для соединения по настоящему изобретению (см. таблицу VII).

Таблица VII - Определение специфичности рецептора in vivo путем эксперимента по блокированию

Соединение	Снижение флуоресценции опухоли после блокирования рецептора
DA364 (Эталон)	10% (n=5/группу)
Соединение 1	75% (n=5/группу)

Ссылки

Onda N. et al., Int J Cancer, 2016, 139, 673-682.

Stummer W. et al., Neurosurgery, 2015, 77(5), 663-673.

Licha et al., Photochemistry and Photobiology, 2000, 72(3), 392-398.

Tummers Q. et al., PlosOne 2015.

Achilefu S. et al., J Med Chem, 2002, 45, 2003-2015.

Bunschoten A. et al., Bioconjugate Chem., 2016, 27, 1253-1258.

US 6,913,743 B2.

WO2018/189136.

WO2016/097317.

Capozza et al., Photoacoustics, 2018, 11, 36-45.

US 6,329,531 B1.

Ebert et al., J. Biomed. Optics, 2011, 16(6), 066003.

WO2005/123768.

WO2012/088007.

T.W. Green and P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N.Y. 2007, 4^th Ed., Ch. 5.

Kapp et al., Sci Rep, 2017, 7, 3905.

Wichert et al., Nat Chem 2015, 7, 241-249.

Li et al., FASEB J 2005, 19, 1978-85.

Williams et al., Chem Biol Drug Des 2018, 91, 605-619.

Mujumdar R.B. et al., Bioconjugate Chem. 1993, 4(2), 105-111.

Yamana et al, Chem. Pharm. Bull., 1972, 20(5), 881-891.

Claims

1. Соединение формулы (I)

(I)

где

R1 и R2 независимо являются -CO-NH-Y группой, где Y выбирают из линейного или разветвленного C₁-C₈ алкила, замещенного двумя-пятью гидроксильными группами;

R3 является линейным или разветвленным C₄ алкилом, замещенным группой -SO₃H;

R4 является линейным двухвалентным C₅ алкилом;

R5 выбран из -CONH-;

S является спейсером, выбранным из -(CH₂)_p- и -NH(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂-, где p является целым числом от 0 до 4;

T является таргетной группой, выбранной из группы, состоящей из малой молекулы, белка, пептида, пептидомиметика и антитела или его фрагмента;

n является целым числом, равным 3; и

m является целым числом, равным 0 или 1;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение формулы (I) по п. 1, отличающееся тем, что R1 и R2 независимо выбирают из группы, состоящей из

3. Соединение формулы (I) по п. 1 или 2, которое представлено формулой (Ia)

где R4, R5, S, m и T такие, как определены по п. 1.

4. Соединение формулы (I) по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что T является группой, взаимодействующей с интегриновым рецептором.

5. Соединение формулы (I) по любому из предшествующих пунктов для применения в качестве флуоресцентного контраста для определения и демаркации границ опухоли при направленной хирургии отдельного пациента.

6. Соединение формулы (I) для применения по п. 5, отличающееся тем, что определение и демаркацию границ опухоли проводят под NIR облучением.

7. Соединение формулы (I) для применения по п. 6, отличающееся тем, что указанной опухолью является опухоль, выбранная из рака мозга, рака груди, рака головы и шеи, рака яичников, рака простаты, рака пищевода, рака кожи, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака полости рта, рака легких, рака почек, рака матки, рака щитовидной железы, рака печени и колоректального рака.

8. Фармацевтическая диагностическая композиция для применения в качестве флуоресцентных проб для определения и демаркации границы опухоли в направленной хирургии отдельного пациента, содержащая эффективное количество соединения формулы (I) по п. 1 и, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

9. Диагностический набор, содержащий соединение формулы (I) по п. 1 вместе с дополнительными адъювантами, выбранными из подходящих буферов, сосудов, реагентов для определения или инструкций по применению для осуществления оптической визуализации.

10. Соединение формулы (I) по п. 1, выбранное из

и

11. Промежуточное соединение формулы (II)

(II)

где

R1, R2, R3, R4 и n такие, как определены по п. 1, и

R5' выбран из -COOH, -CONH₂, -COO-Pg и -CONH-Pg, где Pg является защитной группой, такой как C_1-2алкильная группа,

или его фармацевтически приемлемая соль.

12. Промежуточное соединение формулы (II) по п. 11, где R1 и R2 независимо выбирают из группы, состоящей из

13. Промежуточное соединение формулы (II) по п. 11 или 12, которые представлены формулой (IIa)

где R4 и R5' такие, как определены по п. 11.