JP2022517742A - Ｈｍｇｂ１発現を阻害するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、特に肝細胞におけるＨＭＧＢ１発現を低減するために有用なオリゴヌクレオチド、組成物及び方法に関する。ＨＭＧＢ１発現を低減するための開示したオリゴヌクレオチドは、二本鎖又は一本鎖のいずれかであってよく、また、ヌクレアーゼに対する耐性が強く、免疫原性が低くなるように特徴を改善するために修飾してもよい。ＨＭＧＢ１発現を低減するための開示したオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝細胞などの特定の細胞又は器官を標的とするための標的化リガンドを含むように設計してもよく、また、肝線維症や関連する状態を治療するために使用してもよい。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月２８日出願の米国仮出願第６２／７８６，２８７号、２０１８年１２月３１日出願の米国仮出願第６２／７８７，０３８号、及び２０１９年１月３日出願の米国仮出願第６２／７８８，１１１号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張するものであり、それぞれは、その内容全体が参照により本明細書に援用される。

配列リスト、表又はコンピュータプログラムの参照
「配列リスト」の公式なコピーは、ＥＦＳ‐Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして本明細書と同時に提出され、そのファイル名は「４００９３０‐０１４ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、作成日は２０１９年１２月１２日、サイズは３０６キロバイトである。ＥＦＳ‐Ｗｅｂ経由で提出された配列リストは、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。

本出願は、オリゴヌクレオチド及びその使用に関し、特にその使用は線維症に関与する状態の治療に関する。

組織線維症は、細胞外マトリックスと炎症因子の異常な蓄積を特徴とする状態を指し、この状態は瘢痕化をもたらし、慢性的な器官損傷を促進する。肝臓では、線維症は硬変や肝細胞癌につながる可能性のある肝損傷に対する多細胞反応である。この反応は、アルコール乱用、ウイルス性肝炎、代謝疾患などの状態に伴う肝臓損傷、並びに胆汁うっ滞性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝疾患により引き起こされることが多い。高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）タンパク質が肝線維症において繊維症を進行させる役割を担うことを示唆する研究もある（例えば、Ｌｉ Ｌ‐Ｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１４年、第１８巻（１２号）：ｐ．２３３１‐３９参照）。ＨＭＧＢ１は、損傷した細胞から放出される核タンパク質であり、炎症促進媒体として機能し、肝星細胞及び肝内皮細胞を肝損傷部位に誘導することが分かっている（Ｓｅｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ‐Gａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１３年、第３０５巻：Ｇ８３８‐８４８）。肝星細胞は、肝臓内の線維形成活性を促進する増殖性の筋線維芽細胞への転換を経て、肝線維症の進行に中心的な役割を担うと考えられている（Kａｏ ＹＨら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、２００８年、第４０巻：ｐ．２７０４‐５参照）。

本開示の態様は、ＨＭＧＢ１発現を選択的に阻害するオリゴヌクレオチドを使用して、被験体の線維症（例えば、肝線維症）を治療するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１発現を選択的に阻害するために強力なＲＮＡｉオリゴヌクレオチドが開発されている。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、特に肝細胞でのＨＭＧＢ１発現を減少させ、それにより線維症を減少又は防止するために有用である。いくつかの実施形態では、ニックドテトラループ構造を組み込んだＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、肝細胞への送達を容易にするためにＧａｌＮＡｃ部分と共役し(conjugate)、肝線維症治療のためにＨＭＧＢ１発現を阻害する（例えば、サル又はヒト初代培養肝細胞でＧａｌＮＡｃを共役したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドを評価した実施例３及び４を参照）。いくつかの実施形態では、例えば胆汁うっ滞性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝臓状態にある被験体又はその疑いのある被験体を治療するためのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの使用を含む方法を本明細書で提供する。更なる実施形態では、本開示は、特にＲＮＡｉオリゴヌクレオチドをベースとするアプローチを利用してｍＲＮＡノックダウンを起こし易いＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの主要な標的配列の同定に基づいている。更に、特定の修飾パターンを有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを本明細書で開発し（表２に概説）、インビボでＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ発現レベルを低下させるために特に有用なものを本明細書で提供する。
本開示のいくつかの態様はＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドを提供し、該オリゴヌクレオチドは、１５～５０ヌクレオチド長のセンス鎖及び１５～３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖から成り、センス鎖はアンチセンス鎖と二重鎖領域を形成し、センス鎖は配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列から成り、アンチセンス鎖は配列番号１４～２６から選択した相補配列を含む。

いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号２７～３９のいずれか１つに記載の配列を含むか、又はその配列から成る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖配列は配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列から成る。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号２７に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号１４に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態ではセンス鎖配列は配列番号２８に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号１５に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号２９に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号１６に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３０に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号１７に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３１に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号１８に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３２に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号１９に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３３に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号２０に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３４に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号２１に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３５に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号２２に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３６に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号２３に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３７に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号２４に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３８に記載の配を含み、アンチセンス鎖配列は配列番号２５に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は配列番号３９に記載の配列を含み、アンチセンス鎖配列は、配列番号２６に記載の配列を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドは全て修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは２’‐修飾を含む。いくつかの実施形態では、２’‐修飾は２’‐フルオロ又は２’‐Ｏ‐メチルである。
いくつかの実施形態では、センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８～２７位、及び３１～３６位のうち１つ以上、並びに／又はアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位、及び２０～２２位のうち１つ以上は２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８～２７位、及び３１～３６位の全て、並びにアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位、及び２０～２２位の全ては２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、５位、８～１１位、１３位、１５位、及び１７位のうち１つ以上、並びに／又はアンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位のうち１つ以上は２’‐フルオロで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、５位、８～１１位、１３位、１５位、及び１７位の全て、並びにアンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位の全ては２’‐フルオロで修飾されている。
いくつかの実施形態では、センス鎖の１～７位、１２～２７位、及び３１～３６位のうち１つ以上、並びに／又はアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１～１３位、及び１５～２２位のうち１つ以上は２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の１～７位、１２～２７位、及び３１～３６位の全て、並びにアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１～１３位、及び１５～２２位の全ては２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の８～１１位のうち１つ以上、並びに／又は、アンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、及び１４位のうち１つ以上は２’‐フルオロで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の８～１１位の全て、並びにアンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、及び１４位の全ては２’‐フルオロで修飾されている。

いくつかの実施形態では、センス鎖の１位、２位、４～７位、９位、１１位、１４～１６位、１８～２７位、及び３１～３６位のうち１つ以上、並びに／又はアンチセンス鎖の１位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位、及び２０～２２位のうち１つ以上は２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の１位、２位、４～７位、９位、１１位、１４～１６位、１８～２７位、及び３１～３６位の全て、並びにアンチセンス鎖の１位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位、及び２０～２２位の全ては２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、８位、１０位、１２位、１３位、及び１７位のうち１つ以上、並びに／又はアンチセンス鎖の２～５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位のうち１つ以上は２’‐フルオロで修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、８位、１０位、１２位、１３位、及び１７位の全て、並びにアンチセンス鎖の２～５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位の全ては２’‐フルオロで修飾されている。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは以下の１つ以上の組み合わせの間：センス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の２位と３位との間、アンチセンス鎖の３位と４位との間、アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは以下の各組み合わせの間：センス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の２位と３位との間、アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、アンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の第１位置のウリジンはリン酸類似体を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖の１位に以下の構造を含む：

いくつかの実施形態では、センス鎖上にある２８～３０位の‐ＡＡＡ‐配列のヌクレオチドのうち１つ以上は一価ＧａｌＮＡｃ部分と共役している。いくつかの実施形態では、センス鎖上にある２８～３０位の‐ＡＡＡ‐配列の各ヌクレオチドは一価ＧａｌＮＡｃ部分と共役している。いくつかの実施形態では、センス鎖上にある２８～３０位の‐ＡＡＡ‐モチーフは以下の構造を含む：

式中：
Ｌは、両端の数字を含む(inclusive)１～２０個で連続的な共有結合原子長の結合、クリックケミストリーハンドル、又はリンカーを表し、Ｌは置換及び非置換アルキレン、置換及び非置換アルケニレン、置換及び非置換アルキニレン、置換及び非置換ヘテロアルキレン、置換及び非置換ヘテロアルケニレン、置換及び非置換ヘテロアルキニレン、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される；ＸはＯ、Ｓ、又はＮである。

いくつかの実施形態では、Ｌはアセタールリンカーである。いくつかの実施形態では、ＸはＯである。
いくつかの実施形態では、センス鎖上にある２８～３０位の‐ＡＡＡ‐配列は以下の構造を含む：

本開示の他の態様は、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは１５～３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに相補的なＨＭＧＢ１に相補的である領域を有する。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は１９～２７ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は２２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは１５～５０ヌクレオチド長のセンス鎖を更に含み、センス鎖はアンチセンス鎖と共に二重鎖領域を形成する。いくつかの実施形態では、センス鎖は１９～５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、二重鎖領域は２０ヌクレオチド長である。

いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドはセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み：
（ａ）センス鎖は配列番号７８８に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８１４に記載の配列を含む；
（ｂ）センス鎖は配列番号７８９に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８１５に記載の配列を含む；
（ｃ）センス鎖は配列番号７９０に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８１６に記載の配列を含む；
（ｄ）センス鎖は配列番号７９１に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８１７に記載の配列を含む；
（ｅ）センス鎖は配列番号７９２に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８１８に記載の配列を含む；
（ｆ）センス鎖は配列番号７９３に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８１９に記載の配列を含む；
（ｇ）センス鎖は配列番号７９４に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８２０に記載の配列を含む；
（ｈ）センス鎖は配列番号７９５に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８２１に記載の配列を含む；
（ｉ）センス鎖は配列番号７９６に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８２２に記載の配列を含む；
（ｊ）センス鎖は配列番号７９７に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８２３に記載の配列を含む；
（ｋ）センス鎖は配列番号７９８に記載の配列から成り、アンチセンス鎖は配列番号８２４に記載の配列から成り；
（ｌ）センス鎖は配列番号７９９に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８２５に記載の配列を含む；
（ｍ）センス鎖は配列番号８００に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８２６に記載の配列を含む；
（ｎ）センス鎖は配列番号８０１に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８２７に記載の塩基配列を含む；
（ｏ）センス鎖は配列番号８０２に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８２８に記載の配列を含む；
（ｐ）センス鎖は配列番号８０３に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８２９に記載の配列を含む；
（ｑ）センス鎖は配列番号８０４に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３０に記載の配列を含む；
（ｒ）センス鎖は配列番号８０５に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３１に記載の配列を含む；
（ｓ）センス鎖は配列番号８０６に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３２に記載の配列を含む；
（ｔ）センス鎖は配列番号８０７に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３３に記載の配列を含む；
（ｕ）センス鎖は配列番号８０８に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３４に記載の配列を含む；
（ｖ）センス鎖は配列番号８０９に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３５に記載の配列を含む；
（ｗ）センス鎖は配列番号８１０に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３６に記載の配列を含む；
（ｘ）センス鎖は配列番号８１１に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３７に記載の配列を含む；
（ｙ）センス鎖は配列番号８１２に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３８に記載の配列を含む；又は
（ｚ）センス鎖は配列番号８１３に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号８３９に記載の配列を含む。

更に、本明細書に記載のいずれかのオリゴヌクレオチド及び賦形剤含む組成物を、本明細書で提供する。
更に、オリゴヌクレオチドを被験体に送達する方法を本明細書で提供し、当該方法には、本明細書に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドを含む組成物を被験体に投与することが含まれる。
いくつかの実施形態では、被験体は肝線維症に罹患しているか、又はそのリスクがある。いくつかの実施形態では、被験体は胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを被験体に投与することによりＨＭＧＢ１タンパク質の発現を低減する。
更に本明細書では、肝線維症に罹患しているか、又はそのリスクがある被験体を治療する方法を提供し、当該方法には、本明細書に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドを被験体に投与することが含まれる。いくつかの実施形態では、被験体は胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体が肝毒性物質に曝される前にオリゴヌクレオチドを投与する。いくつかの実施形態では、被験体が肝毒性物質に曝された後にオリゴヌクレオチドを投与する。いくつかの実施形態では、被験体が肝毒性物質に曝されると同時にオリゴヌクレオチドを投与する。いくつかの実施形態では、その投与により、肝臓ＨＭＧＢ１レベルが低下する。いくつかの実施形態では、その投与により、血清ＨＭＧＢ１レベルが低下する。
本明細書では更に、肝線維症に罹患しているか、又はそのリスクがある被験体を治療するための、本明細書に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドの使用を提供する。いくつかの実施形態では、被験体は、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している。
以下の添付図面は本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、特定の実施形態を説明し、書面による説明と合わせて、本明細書に開示した組成物及び方法の特定の態様の非限定的な例を提供する役割を担う。

３つの異なる修飾パターン（図１Ｂ）を有する３種のＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのインビボ活性評価を示す。ＮＭ＿００２１２８．５の位置番号をｘ軸とした。 ３つの異なる修飾パターンである。 ３つの異なる濃度の３種のＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのインビボ活性評価示す。ＮＭ＿００２１２８．５の位置番号をｘ軸とした。 ３種のＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの４つの異なる時点におけるインビボ活性評価を示す。ＮＭ＿００２１２８．５の位置番号をｘ軸とした。 Ｈｕｈ‐７（ヒト肝臓）細胞における２８８個の３種共通(triple commons)ＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に対応するＮＭ＿００２１２８．５のヌクレオチド位置をｘ軸に示す。５’アッセイ（赤）及び３’アッセイ（青）の各々について、残留ｍＲＮＡの割合を示す。 Ｈｕｈ‐７（ヒト肝臓）細胞における２８８個の３種共通ＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に対応するＮＭ＿００２１２８．５のヌクレオチド位置をｘ軸に示す。５’アッセイ（赤）及び３’アッセイ（青）の各々について、残留ｍＲＮＡの割合を示す。 Ｈｕｈ‐７（ヒト肝臓）細胞における２８８個の３種共通ＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に対応するＮＭ＿００２１２８．５のヌクレオチド位置をｘ軸に示す。５’アッセイ（赤）及び３’アッセイ（青）の各々について、残留ｍＲＮＡの割合を示す。 Ｈｕｈ‐７（ヒト肝臓）細胞における２８８個の３種共通ＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に対応するＮＭ＿００２１２８．５のヌクレオチド位置をｘ軸に示す。５’アッセイ（赤）及び３’アッセイ（青）の各々について、残留ｍＲＮＡの割合を示す。 Ｈｕｈ‐７（ヒト肝臓）細胞における２８８個の３種共通ＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に対応するＮＭ＿００２１２８．５のヌクレオチド位置をｘ軸に示す。５’アッセイ（赤）及び３’アッセイ（青）の各々について、残留ｍＲＮＡの割合を示す。 Ｈｕｈ‐７（ヒト肝臓）細胞における２８８個の３種共通ＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。各ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に対応するＮＭ＿００２１２８．５のヌクレオチド位置をｘ軸に示す。５’アッセイ（赤）及び３’アッセイ（青）の各々について、残留ｍＲＮＡの割合を示す。 図４Ａ～４Ｆのスクリーンで同定した２２種のＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのインビボ活性評価を示す。２２種のＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、２つの異なる修飾パターン（Ｍ２及びＭ３、修飾パターンについては図１Ｂ参照）でＧａｌＮＡｃ共役している。ＮＭ＿００２１２８．５の位置番号をｘ軸とした。 投与から２１日後のリードＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのインビボ活性評価を示す。ＮＭ＿００２１２８．５の位置番号をｘ軸とした。 サル／ヒト初代培養肝細胞で試験したＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドを示す。矢印は、非ヒト霊長類スクリーンでも試験するためにオリゴヌクレオチドを選択したことを示す。 ＩＣ５０曲線で示したカニクイザル肝細胞＃１における６種のＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの活性を示す。 ＩＣ５０曲線で示したカニクイザル肝細胞＃２におけるＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの活性を示す。 ＩＣ５０曲線で示したヒト肝細胞＃１におけるＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの活性を示す。 ＩＣ５０曲線で示したサル及びヒト肝細胞における陽性対照ＧａｌＮＡｃ共役ＬＤＨＡオリゴヌクレオチドの活性を示す。 非ヒト霊長類におけるＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのインビボ活性評価を示す。４ｍｇ／ｋｇの１回投与。 非ヒト霊長類におけるＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのインビボ活性評価を示す。１回投与量は２ｍｇ／ｋｇで、投与は４回繰り返す。 マウス細胞株における、３つの異なる濃度（０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、及び１ｎＭ）での６種のＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。５’アッセイである。 マウス細胞株における、３つの異なる濃度（０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、及び１ｎＭ）での６種のＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。３’アッセイである。 サル細胞株における、３つの異なる濃度（０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、及び１ｎＭ）での６種のＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。５’アッセイである。 サル細胞株における、３つの異なる濃度（０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、及び１ｎＭ）での６種のＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。３’アッセイである。 ヒト細胞株における、３つの異なる濃度（０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、及び１ｎＭ）での６種のＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。５’アッセイである。 ヒト細胞株における、３つの異なる濃度（０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、及び１ｎＭ）での６種のＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドのスクリーニングを示す。３’アッセイである。 ｍｏｃｋに正規化したＨＭＧＢ１のＩＣ５０曲線による、Ｈｕｈ‐７細胞における４種のＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの活性をしめす。 ｍｏｃｋに正規化したＨＭＧＢ２のＩＣ５０曲線による、Ｈｕｈ‐７細胞における４種のＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの活性を示す。 ｍｏｃｋに正規化したＨＭＧＢ３のＩＣ５０曲線による、Ｈｕｈ‐７細胞における４種のＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの活性を示す。

いくつかの態様によれば、本開示は、肝線維症の治療のために、細胞、特に肝臓の細胞（例えば肝細胞）におけるＨＭＧＢ１発現の低減に有効な、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを提供する。従って、関連する態様では、本開示は、肝臓におけるＨＭＧＢ１遺伝子発現を選択的に低減することを含む線維症治療方法を提供する。特定の実施形態では、本明細書で提供するＨＭＧＢ１を標的とするオリゴヌクレオチドは、標的組織の選択した細胞（例えば、肝臓の肝細胞）に送達して、その組織の線維症を治療するように設計する。インビボでＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡをノックダウンするために特に有用な、特定の修飾パターンを有するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを本明細書において開示している（表２に概説）。
定義した用語の説明を含む、本開示の更なる態様を以下に提供する。

Ｉ．定義
およそ：本明細書で使用しているように、１つ以上の対象の数値に適用される用語「およそ」又は「約」は、記載した参照数値に近い数値を指す。特定の実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、特段の記載がない限り、又は文脈から特段に明白でない限り、記載した参照数値のいずれかの方向（参照値を超える値又は下回る値）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に収まる数値の範囲を指す（ただし、そのような数値が、有り得る数値の１００％を超える場合を除く）。
投与：本明細書で使用しているように、用語「投与する」又は「投与」は、（例えば、被験体の状態を治療するために）薬理学的に有用な方法で、被験体に物質（例えば、オリゴヌクレオチド）を提供することを意味する。
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）：本明細書で使用しているように、用語「アシアロ糖たんぱく質受容体」又は「ＡＳＧＰＲ」は、大きい方の４８ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ‐１）及び小さい方の４０ｋＤａサブユニット（ＡＳＧＰＲ‐２）により形成される２部構成Ｃ型レクチンを指す。ＡＳＧＰＲは主に肝細胞の類洞表面に発現し、末端ガラクトース又はＮ‐アセチルガラクトサミン残基を含む循環糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内部移行、及びその後のクリアランスに主要な役割を担っている。
減衰：本明細書で使用しているように、用語「減衰させる」は低減すること、又は効果的に停止することを意味する。非限定的な例として、本明細書で提供する１つ以上の治療法は、被験体における肝線維症又は肝臓の炎症の発症又は進行を低減又は効果的に停止させる可能性がある。この減衰には、例えば、肝線維症又は肝臓の炎症の１つ以上の態様（例えば、症状、組織の特徴、及び細胞、炎症又は免疫の活性等）の減少、肝線維症又は肝臓の炎症の１つ以上の態様の検出可能な進行（悪化）の消失、或いは他の方法で予想できる場合の、被験体における肝線維症又は肝臓の炎症の検出可能な態様の消失が挙げられる。

相補的：本明細書で使用しているように、用語「相補的」は、２つのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にする２つのヌクレオチド（例えば、２つの対向する核酸上、又は単一の核酸鎖の対向する領域上）間の構造的関係を指す。例えば、１つの核酸のプリンヌクレオチドは対向する核酸のピリミジンヌクレオチドに相補的であり、互いに水素結合を形成することにより一緒に塩基対になる。いくつかの実施形態では、互いに相補的なヌクレオチドは、ワトソン‐クリック様式で、又は安定二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で塩基対になることが可能である。いくつかの実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載しているように、相補性領域を形成するように互いに相補的な複数のヌクレオチドの領域を有してもよい。
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較して、そのペントース糖の２’位置にヒドロキシルの代わりに水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドとは、２’位以外の位置で原子の１つ以上の修飾又は置換を有するデオキシリボヌクレオチドであり、糖、リン酸基、もしくは塩基中に修飾もしくは置換を含むか、又は糖、リン酸基、もしくは塩基の修飾もしくは置換を含む。
二本鎖オリゴヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「二本鎖オリゴヌクレオチド」は、ほぼ二重鎖形態であるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（単数又は複数）の相補的塩基対は、共有結合していない核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（単数又は複数）の相補的な塩基対は、共有結合している核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間に形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの二重鎖領域（単数又は複数）の相補的な塩基対は、一緒に塩基対となるヌクレオチドの相補的な逆平行配列を提供するように（例えば、ヘアピンを介して）折り畳まれた単一の核酸鎖から形成される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに完全に二重化された２つの共有結合していない核酸鎖を含む。しかし、いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に二重化された、例えば一端又は両端にオーバーハングを有する２つの共有結合していない核酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、部分的に相補的であるヌクレオチドの逆平行配列を含み、従って、内部ミスマッチ又は末端ミスマッチなどの１つ以上のミスマッチを有していてもよい。

二重鎖：本明細書で使用しているように、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して、用語「二重鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的な塩基対合を経て形成される構造を指す。
賦形剤：本明細書で使用しているように、用語「賦形剤」は、例えば、所望の一致性又は安定化効果を提供するか、又はそれらに寄与するために組成物に含まれてもよい非治療剤を指す。
肝細胞：本明細書で使用しているように、用語「肝細胞（単数又は複数）」は、肝臓の実質組織の細胞を指す。これらの細胞は肝臓の質量のおよそ７０～８５％を占め、血清アルブミン、フィブリノーゲン、及び凝固因子（因子３及び４を除く）のプロトロンビン群を産生する。肝細胞系統細胞のマーカーとしては：トランスサイレチン（Ｔｔｒ）、グルタミン合成酵素（Ｇｌｕｌ）、肝細胞核因子１ａ（Ｈｎｆ１ａ）、及び肝細胞核因子４ａ（Ｈｎｆ４ａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。成熟肝細胞のマーカーとしては、限定するものではないが：シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ３ａ１１）、フマリルアセトアセテート加水分解酵素（Ｆａｈ）、グルコース６‐リン酸（Ｇ６ｐ）、アルブミン（Ａｌｂ）、及びＯＣ２‐２Ｆ８（例えば、Ｈｕｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１３年、第４９４巻（７４３６号）：ｐ．２４７‐２５０参照）が挙げられ、肝細胞マーカーに関するこれらの内容は参照により本明細書に援用される。
肝毒性物質：本明細書で使用しているように、用語「肝毒性物質」は、それ自体が肝臓に毒性であるか、又は肝臓に毒性を持つ代謝物を形成するように処理できる化合物、ウイルス、又は他の物質である。肝毒性物質としては、四塩化炭素（ＣＣｌ₄）、アセトアミノフェン（パラセタモール）、塩化ビニル、ヒ素、クロロホルム、及び非ステロイド系抗炎症剤（アスピリンやフェニルブタゾンなど）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

肝臓の炎症：本明細書で使用しているように、用語「肝臓の炎症」又は「肝炎」は、特に損傷や感染の結果として肝臓が腫脹、機能障害、及び／又は疼痛を起こしている身体的状態を指し、肝毒性物質への暴露により引き起こされる場合もある。症状としては、黄疸（皮膚や目が黄色くなる）、疲労感、脱力感、吐き気、嘔吐、食欲不振、及び体重減少が挙げられる。肝臓の炎症は、治療せずに放置すると、線維症、硬変、肝不全、又は肝臓癌へと進行する恐れがある。
肝線維症：本明細書で使用しているように、用語「肝線維症」又は「肝臓の線維症」は、コラーゲン（Ｉ、ＩＩＩ、及びＩＶ）、フィブロネクチン、ウンジュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）、エラスチン、ラミニン、ヒアルロナン、及びプロテオグリカンなどの細胞外マトリックスタンパク質が肝臓内に過剰に蓄積することを意味し、炎症及び肝臓細胞死に起因する。肝線維症は、治療せずに放置すると、硬変、肝不全、肝臓癌へと進行する恐れがある。
ループ：本明細書で使用しているように、「ループ」は、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、リン酸緩衝液中や、細胞内）で、不対領域に隣接する２つの逆平行領域がハイブリダイズして二重鎖（「ステム」と称する）を形成するように互いに十分に相補的な核酸の２つの逆平行領域に隣接した核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の不対領域を指す。

修飾ヌクレオチド間結合：本明細書で使用しているように、用語「修飾ヌクレオチド間結合」は、ホスホジエステル結合を含む基準ヌクレオチド間結合と比較して、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは天然には存在しない結合である。典型的には、修飾ヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低下等を改善する可能性がある。
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「修飾ヌクレオチド」は：アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、及びチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する基準ヌクレオチドと比較して、１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然には存在しないヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、及び／又はリン酸基に１つ以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する基準ヌクレオチドと共役した１つ以上の化学的部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１つ以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解性、生物学的利用能、生物活性、免疫原性低下等を改善する可能性がある。
ニックドテトラループ構造：「ニックドテトラループ構造」は、別個のセンス（パッセンジャー）鎖及びアンチセンス（ガイド）鎖が存在することを特徴とするＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造であって、ここでは、センス鎖はアンチセンス鎖と相補性のある領域を有し、また、鎖の少なくとも１つ、一般的にはセンス鎖は、少なくとも１つの鎖内に形成された隣接ステム領域を安定化するように構成したテトラループを有する。

オリゴヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば１００ヌクレオチド長未満の短い核酸を指す。オリゴヌクレオチドは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは二重鎖領域を有していても、有していなくてもよい。一連の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、又は一本鎖ｓｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドはＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
オーバーハング：本明細書で使用しているように、用語「オーバーハング」は、１つの鎖又は領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を超えて延びる１つの鎖又は領域に起因する末端非塩基対ヌクレオチド（単数又は複数）を指す。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端の二重鎖領域から延びる１つ以上の非対合ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、オーバーハングは、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖又はセンス鎖上の３’又は５’オーバーハングである。
リン酸類似体：本明細書で使用しているように、用語「リン酸類似体」は、リン酸基の静電的及び／又は立体的特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、酵素除去されやすい５’‐リン酸の代わりに、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに配置される。いくつかの実施形態では、５’リン酸類似体はホスファターゼ抵抗性の結合を含む。リン酸類似体の例としては、５’メチレンホスホネート（５’‐ＭＰ）及び５’‐（Ｅ）‐ビニルホスホネート（５’‐ＶＰ）などの５’ホスホネートが挙げられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドにおいて、糖の４’‐炭素位置にリン酸類似体（「４’‐リン酸類似体」と称する）を有する。４’‐リン酸類似体の例としては、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’‐炭素）に結合しているオキシメチルホスホネート又はその類似体が挙げられ（例えば、国際特許公開ＷＯ／２０１８／０４５３１７を参照）、リン酸類似体に関連するその内容は参照により本明細書に援用される。オリゴヌクレオチドの５’末端については、他の修飾が開発されている（例えば、ＷＯ２０１１／１３３８７１；米国特許第８，９２７，５１３号；及びＰｒａｋａｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１５年、第４３巻（６号）：ｐ．２９９３‐３０１１、リン酸類似体に関連するそれぞれの内容は参照により本明細書に援用される）。

発現低下：本明細書で使用しているように、遺伝子の「発現低下」という用語は、適切な基準細胞又は被験体と比較して、細胞又は被験体において、遺伝子にコードされたＲＮＡ転写物もしくはタンパク質量が減少すること、及び／又は遺伝子活性の量が減少することを指す。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス鎖を有するもの）で細胞を処理することは、二本鎖オリゴヌクレオチドで処理していない細胞と比較して、（例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子にコードされた）ＲＮＡ転写産物、タンパク質及び／又は活性の量を減少させる可能性がある。同様に、本明細書で用いられる「発現低下」とは、遺伝子（例えば、ＨＭＧＢ１）の発現を低下させることを指す。
相補性の領域：本明細書で使用しているように、用語「相補性の領域」は、ヌクレオチドの逆平行配列に対して十分に相補的である核酸のヌクレオチド（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）の配列を指し、当該領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、例えばリン酸緩衝液中、細胞内等で、ヌクレオチドの２つの配列間でハイブリダイゼーションを可能にする。
リボヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「リボヌクレオチド」はその五炭糖としてリボースを有するヌクレオチドを指し、これはその２’位置にヒドロキシル基を含む。修飾リボヌクレオチドは、２’位置以外で原子の１つ以上の修飾又は置換を有するリボヌクレオチドであり、リボース、リン酸基、もしくは塩基中に修飾もしくは置換を含むか、又はリボース、リン酸基、もしくは塩基の修飾もしくは置換を含む。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド：本明細書で使用しているように、用語「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は以下のいずれかを指す：（ａ）センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有し、該アンチセンス鎖又はその一部はアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡの切断に使用される、二本鎖オリゴヌクレオチド；又は（ｂ）単一のアンチセンス鎖を有し、該アンチセンス鎖（又はアンチセンス鎖の一部）はＡｇｏ２エンドヌクレアーゼによって標的ｍＲＮＡの切断に使用される、一本鎖オリゴヌクレオチド。

鎖：本明細書で使用しているように、用語「鎖」は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合）を介して一緒に連結された複数のヌクレオチドの単一連続配列を指す。いくつかの実施形態では、鎖は２つの自由端、例えば５’末端及び３’末端を有する。
被験体：本明細書で使用しているように、用語「被験体」は、マウス、ウサギ、及びヒトなどの任意の哺乳類を意味する。いくつかの実施形態では、被験体はヒト又は非ヒト霊長類である。用語「個体」又は「患者」は「被験体」と互換的に使用してもよい。
合成：本明細書で使用しているように、用語「合成」は、人工的に合成された（例えば、機械（例えば、固体状核酸合成機）を使用）か、又はそうでなければ、分子を通常生成する天然源（例えば、細胞又は生物）に由来しない核酸又は他の分子を指す。
標的化リガンド：本明細書で使用しているように、用語「標的化リガンド」は、対象の組織又は細胞の同種分子（例えば、受容体）に選択的に結合する分子（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、又は脂質）、及び他の物質を対象の組織又は細胞に標的として向ける目的で別の物質と共役できる分子を指す。例えば、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドを対象の特異的組織又は細胞に標的として向ける目的で、オリゴヌクレオチドと共役してもよい。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは細胞表面受容体に選択的に結合する。従って、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドと共役すると、標的化リガンドは、細胞表面に発現した受容体への選択的結合、並びにオリゴヌクレオチド、標的化リガンド、及び受容体から成る複合体の細胞によるエンドソーム内部移行を経て、特定細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。いくつかの実施形態では、細胞内部移行後又は細胞内部移行中に切断されるリンカーを介してオリゴヌクレオチドに標的化リガンドを共役し、オリゴヌクレオチドは細胞内で標的化リガンドから放出されるようにする。

テトラループ：本明細書で使用しているように、用語「テトラループ」は、ヌクレオチドの隣接配列のハイブリダイゼーションにより形成される隣接二重鎖の安定性を高めるループを指す。安定性の向上は、無作為に選択した複数のヌクレオチド配列から成る同等の長さのループ群から平均して予測される隣接ステム二重鎖のＴｍより高い隣接ステム二重鎖の融解温度（Ｔｍ）の上昇として検出可能である。例えば、テトラループは、１０ｍＭのＮａＨＰＯ₄中、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、又は少なくとも７５℃の融解温度を少なくとも２塩基対長の二重鎖を含むヘアピンに対して付与できる。いくつかの実施形態では、テトラループは、スタッキング相互作用により隣接ステム二重鎖の塩基対を安定化する可能性がある。また、テトラループ内のヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン‐クリック塩基対、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が挙げられるが、これらに限定されるものではない（Ｃｈｅｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０年、第３４６巻（６２８５号）：ｐ．６８０‐２；Ｈｅｕｓ及びＰａｒｄｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、第２５３巻（５０１６号）：ｐ．１９１‐４）。いくつかの実施形態では、テトラループは３～６個のヌクレオチド、典型的には４～５個のヌクレオチドを含むか、又はそれらから成る。特定の実施形態では、テトラループは３、４、５、又は６個のヌクレオチドから成り、これらは修飾されても修飾されなくてもよい（例えば、標的化部分と共役しても、しなくてもよい）。１実施形態では、テトラループは４個のヌクレオチドから成る。Ｃｏｒｎｉｓｈ‐Ｂｏｗｄｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８５年、第１３巻：ｐ．３０２１‐３０３０に記載されているように、どのようなヌクレオチドでもテトラループに使用してもよく、そのようなヌクレオチドに対して標準的なＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ記号を使用してもよい。例えば、文字「Ｎ」は、任意の塩基がその位置にあってもよいことを示すために使用してもよく、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）又はＧ（グアニン）がその位置にあってもよいことを示すために使用してもよく、「Ｂ」はＣ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、又はＴ（チミン）がその位置にあってもよいことを示すために使用してもよい。テトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例えば、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅら、米国科学アカデミー紀要、米国、１９９０年、第８７巻（２１号）：ｐ．８４６７‐７１；Ａｎｔａｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９１年、第１９巻（２１号）：ｐ．５９０１‐５）。ＤＮＡテトラループの例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ）、ｄ（ＧＮＲＡ））ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。例えば、Ｎａｋａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年、第４１巻（４８号）：ｐ．１４２８１‐１４２９２；Ｓｈｉｎｊｉら、日本化学会講演予稿集、２０００年、第７８巻（２号）：ｐ．７３１を参照されたい；これらの関連する開示内容は参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、テトラループは、ニックドテトラループ構造内に含まれる。
治療：本明細書で使用しているように、用語「治療」は、存在する状態（例えば、疾患、障害）に関して被験体の健康及び／又は福祉を改善する目的で、又は状態の発生可能性を予防もしくは減少させるために、例えば被験体への治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド）の投与を経て、それを必要とする被験体をケアする行為を指す。いくつかの実施形態では、治療には、少なくとも１つの徴候や症状の頻度又は重症度を低減すること、又は被験体が罹患した状態（例えば、疾患、障害）の因子に寄与することが含まれる。

ＩＩ．オリゴヌクレオチドをベースとするＨＭＧＢ１発現阻害剤
ｉ．ＨＭＧＢ１標的配列
いくつかの実施形態では、治療上の利益を得るために使用できる、オリゴヌクレオチドをベースとするＨＭＧＢ１発現阻害剤が本明細書で提供される。複数の異なる種（ヒト、アカゲザル、及びマウス（例えば、実施例１を参照））のｍＲＮＡを含むＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの検討、並びにインビトロ及びインビボ試験を経て、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの特定の配列は他の配列よりもオリゴヌクレオチドベースの阻害をし易いため、標的配列として有用であることが発見された。いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１標的配列は、配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列を含むか、又はそれらから成る。ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡのこれらの領域は、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの発現を阻害する目的で、本明細書で延べているようなオリゴヌクレオチドを用いて標的化してもよい。
従って、いくつかの実施形態では、細胞内のｍＲＮＡを標的とし、その発現を阻害する目的で、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドを、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡに相補的な領域（例えば、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの標的配列内）を有するように設計する。相補性の領域は一般的に、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの発現を阻害する目的でオリゴヌクレオチド（又はその鎖）をＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡにアニーリングできるようにする好適な長さ及び塩基含有量を有する。いくつかの実施形態では、相補性領域は少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、１２～３０（例えば、１２～３０、１２～２２、１５～２５、１７～２１、１８～２７、１９～２７、又は１５～３０）ヌクレオチド長の範囲内にあるＨＭＧＢ１相補性領域を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長のＨＭＧＢ１相補性領域を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは、配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列に少なくとも部分的に相補的な相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは、配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列に完全に相補的な相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上）は、１２～２０ヌクレオチド（例えば、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１２～１４、１４～２０、１４～１８、１４～１６、１６～２０、１６～１８、又は１８～２０）長の範囲内である配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列の連続したヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上）は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０連続ヌクレオチド長である配列番号１１～１３のいずれか１つに記載の配列の連続したヌクレオチド配列に相補的である。
いくつかの実施形態では、配列番号：１～１３のいずれか１つに記載の連続したヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、配列番号：１～１３のいずれか１つに記載の配列の連続したヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドの相補性領域は、アンチセンス鎖の全長の一部に及ぶ。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは、配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチド１～２０にまたがるヌクレオチドの連続した伸長部に少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的な相補性領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖上）を含む。

いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１に相補的な領域はＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの対応する配列と比較して、１つ以上のミスマッチを有してもよい。オリゴヌクレオチド上の相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持していれば、最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個等のミスマッチを有してもよい。或いは、オリゴヌクレオチド上の相補性領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持していれば、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、又は５個以下のミスマッチを有してもよい。いくつかの実施形態では、相補性領域に複数のミスマッチがある場合、適切なハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドがＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する能力を維持していれば、ミスマッチは連続して（例えば、２個、３個、４個、又はそれ以上並んで）配置されていてもよいし、又は相補性領域全体に渡って間隔を置いて配置されてもよい。

ｉｉ．オリゴヌクレオチドの種類
本開示の方法でＨＭＧＢ１を標的にするために有用なオリゴヌクレオチドの構造には、ＲＮＡｉ、アンチセンス、ｍｉＲＮＡ等、様々なものがある。本明細書等に記載されている構造のいずれも、本明細書に記載の配列（例えば、配列番号１～１３に示すようなＨＭＢＧ１のホットスポット（ｈｏｔｐｏｔ）配列）を組み込む又は標的化するためのフレームワークとして使用してもよい。
いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ダイサー関与部の上流又は下流にあるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与する。例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、１～５ヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを有するサイズ１９～２５ヌクレオチドの各鎖を用いて開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号参照）。より長いオリゴヌクレオチドも開発されており、これはダイサーにより処理し、活性なＲＮＡｉ生成物を産生する（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号参照）。更なる研究により、少なくとも１本の鎖の少なくとも一端が二重標的領域を超えて延長されている延長二本鎖オリゴヌクレオチドが生成され、このオリゴヌクレオチドには、鎖の１つが熱力学的安定化テトラループ構造を有する構造が含まれる（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号及び同第８，９２７，７０５号、並びに国際特許公開ＷＯ２０１００３３２２５を参照。これらはそのオリゴヌクレオチドの構造及び形態の開示について参照により本明細書に援用される）。このような構造は、一本鎖（分子の片側又は両側）の延長だけでなく、二本鎖の延長も含んでもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、ダイサー関与部（例えば、ダイサー切断部）の下流でＲＮＡ干渉経路に関与するように設計している。そのようなオリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’末端にオーバーハング（例えば、１、２、又は３ヌクレオチド長）を有していてもよい。そのようなオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡに対するアンチセンスである２１ヌクレオチドのガイド鎖、及び相補的パッセンジャー鎖を含んでもよく、ここではその両鎖がアニールして、その一方の、又は両方の３’末端で１９ｂｐの二重鎖及び２ヌクレオチドのオーバーハングを形成する。また、２３ヌクレオチドのガイド鎖及び２１ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を含むオリゴヌクレオチドなど、より長いデザインのオリゴヌクレオチドも利用可能であり、分子の右側（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）には平滑末端があり、分子の左側（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）には２ヌクレオチドの３’ガイド鎖オーバーハングがある。このような分子では、２１塩基対の二重鎖領域が存在する。例えば、米国特許第９，０１２，１３８号；第９，０１２，６２１号；及び第９，１９３，７５３号を参照されたい。これらの各特許の関連する開示内容は本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは、共に１７～２６（例えば、１７～２６、２０～２５、又は２１～２３）ヌクレオチド長の範囲内のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは、共に１９～２２ヌクレオチド長の範囲のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の長さは等しい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか又は両方に３’オーバーハングが存在するような、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、共に２１～２３ヌクレオチド長の範囲内のセンス鎖及びアンチセンス鎖を有するオリゴヌクレオチドについて、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖とアンチセンス鎖との両方にある３’オーバーハングは１又は２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２２ヌクレオチドのガイド鎖、及び２０ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有し、ここでは、分子の右側（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）には平滑末端があり、分子の左側（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）には２ヌクレオチドの３’ガイド鎖オーバーハングがある。このような分子では、２０塩基対の二重鎖領域が存在する。

本明細書に開示された組成物及び方法を用いて使用するための他のオリゴヌクレオチドの設計には、以下が含まれる：１６量体ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（編）、英国王立化学会、２００６年参照）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ以下のステムを含む；例えば、Ｍｏｏｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年、第６２９巻：ｐ．１４１‐１５８参照）、平滑ｓｉＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ長；例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ及びＢａｋｅｒ、ＲＮＡ、２００６年、第１２巻：ｐ．１６３‐１７６参照）、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ；例えば、Ｓｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００８年、第２６巻：ｐ．１３７９‐１３８２参照）、非対称短二重鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００９年、第１７巻（４号）：ｐ．７２５‐３２参照）、フォークｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、第５５７巻（１‐３号）：ｐ．１９３‐１９８参照）、単鎖ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２年、第３０巻：ｐ．１０６３）、ダンベル状円形ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅら、米国化学会誌、２００７年、第１２９巻：ｐ．１５１０８‐１５１０９参照）、及び内部にセグメント化した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００７年、第３５巻（１７号）：ｐ．５８８６‐５８９７参照）。前記参考文献の各々は、その中での関連開示内容について、その全体が参照により本明細書に援用される。ＨＭＧＢ１発現を低減又は阻害するためにいくつかの実施形態で使用可能なオリゴヌクレオチド構造の更なる非限定的例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短鎖ｓｉＲＮＡが挙げられる（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００２年、第２１巻（１７号）：ｐ．４６７１‐４６７９；米国特許公開第２００９００９９１１５号参照）。
また、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは一本鎖である。このような構造には、一本鎖ＲＮＡｉ分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。最近の取り組みでは、一本鎖のＲＮＡｉ分子の活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１６年、第２４巻（５号）：ｐ．９４６‐９５５参照）。しかし、いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、該核酸塩基配列は５’から３’方向に書き込まれた場合、特定の核酸の標的セグメントの逆相補体を含み、細胞内でその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介切断を誘発するように（例えばギャップマーとして）、又は細胞内で標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように（例えばミックスマーとして）好適に修飾されている。本開示で使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の好適な方法で修飾してもよく、該方法には、例えば米国特許第９，５６７，５８７号に示すような方法が挙げられ、これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に関する開示内容（例えば、長さ、核酸塩基（ピリミジン、プリン）の糖部分、及び核酸塩基の複素環部分の改変を含む）について参照により本明細書に援用される。更に、アンチセンス分子は特定の標的遺伝子の発現を低減するために数十年に渡って使用されてきた（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、「Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇｓ」、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、２０１７年、第５７巻：ｐ．８１‐１０５参照）。

ｉｉｉ．二本鎖オリゴヌクレオチド
ＨＭＧＢ１発現を（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）標的化するための二本鎖オリゴヌクレオチドは一般に、互いに二重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖とは共有結合していない。しかし、いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖とは共有結合している。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成された二重鎖は、少なくとも１５（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１）ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は１５～３０ヌクレオチド長（例えば、１５～３０、１５～２７、１５～２２、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、又は２１～３０ヌクレオチド長）の範囲にある。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖は１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、二重鎖領域は２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖の間に形成される二重鎖は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二重鎖は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかの全長に及ぶ。特定の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖の間の二重鎖はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、表１に配列されているように、配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列を有するセンス鎖、及び配列番号１４～２６から選択される相補配列を含むアンチセンス鎖を含む。

いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号１に記載の配列から成り、アンチセンス鎖は配列番号１４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号２に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号４に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１７に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号５に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号６に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号７に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２０に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号８に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号９に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２２に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号１０に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２３に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号１１に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号１２に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号１３に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２６に記載の配列を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、センス配列及びアンチセンス配列への修飾を含む表２にも配列されているように、配列番号２７～３９のいずれか１つに記載の配列を含むセンス鎖、及び配列番号１４～２６から選択される相補配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号２７に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号２８に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号２９に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３０に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１７に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３１に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３２に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号１９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３３に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２０に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３４に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３５に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２２に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３６に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２３に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３７に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３８に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２５に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は配列番号３９に記載の配列を含み、アンチセンス鎖は配列番号２６に記載の配列を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又は他の核酸の構造を記述する際に配列リストに示した配列を参照してもよいことは理解すべきである。そのような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチド又は他の核酸は、指定した配列と基本的に同一又は類似の相補特性を保持しながら指定した配列と比較して、１つ以上の代替ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ対応ヌクレオチド又はＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ対応ヌクレオチド）、及び／又は１つ以上の修飾ヌクレオチド、及び／又は１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合、及び／又は１つ以上の他の修飾を有してもよい。
いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは２５ヌクレオチドのセンス鎖及び２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、これらがダイサー酵素により作用されると、アンチセンス鎖が成熟したＲＩＳＣに組み込まれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、２７ヌクレオチドより長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は２５ヌクレオチドより長い（例えば、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド）。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖との間に形成された二重鎖の長さは１２～３０ヌクレオチド（例えば、１２～３０、１２～２７、１５～２５、１８～３０、又は１９～３０ヌクレオチド）長であってもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の間に形成された二重鎖の長さは、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、又は少なくとも２５ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖とアンチセンス鎖の間に形成された二重鎖の長さは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドの一方の５’末端は、他方の５’端と比較して熱力学的に安定性が低い。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端、及びアンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを含む非対称オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’オーバーハングは１～８ヌクレオチド長（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８ヌクレオチド長）である。典型的には、ＲＮＡｉ用のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する。しかし、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６ヌクレオチド、任意に１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、もしくは６ヌクレオチド長の３’オーバーハングである。しかし、いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６ヌクレオチド、任意に１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６ヌクレオチド、又は１、２、３、４、５、もしくは６ヌクレオチド長の５’オーバーハングである。

いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端上の２つの末端ヌクレオチドは修飾される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端上の２つの末端ヌクレオチドは標的と相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端上の２つの末端ヌクレオチドは標的と相補的ではない。いくつかの実施形態では、ニックドテトラループ構造中のオリゴヌクレオチドの各３’末端上の２つの末端ヌクレオチドはＧＧである。典型的には、オリゴヌクレオチドの各３’末端上の２つの末端ＧＧヌクレオチドの一方又は両方は標的と相補的ではない。
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個）のミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に複数のミスマッチがある場合、ミスマッチは連続して配置されるか（例えば、一列に２個、３個又はそれ以上配置されている）、又は相補性の領域全体に散在していてもよい。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、１つ以上のミスマッチを含む。１実施形態では、センス鎖の３’末端には２つのミスマッチが組み込まれている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端における塩基ミスマッチ又はセグメントの不安定化により、恐らくダイサーによる処理の促進を経て、ＲＮＡｉ内の合成二重鎖の効力が向上した。

ａ．アンチセンス鎖
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は「ガイド鎖」と称してもよい。例えば、アンチセンス鎖が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と係合してアルゴノートタンパク質に結合するか、又は１つ以上の類似の因子と係合もしくは結合して標的遺伝子のサイレンシングを指示できる場合、そのアンチセンス鎖はガイド鎖と称してもよい。いくつかの実施形態では、ガイド鎖と相補的なセンス鎖は「パッセンジャー鎖」と称してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、最大５０ヌクレオチド長（例えば、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、又は最大１９ヌクレオチド長）であるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、又は少なくとも２７ヌクレオチド長）のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は１２～５０又は１２～３０（例えば、１２～３０、１１～２７、１１～２５、１５～２１、１５～２７、１７～２１、１７～２５、１９～２７、又は１９～３０）ヌクレオチド長の範囲内にある。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１つのアンチセンス鎖は１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列のいずれかにおける１２～２０ヌクレオチド（例えば、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１２～１４、１４～２０、１４～１８、１４～１６、１６～２０、１６～１８、又は１８～２０ヌクレオチド）長の範囲内にあるヌクレオチドの連続配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０連続ヌクレオチド長の配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列におけるヌクレオチドの連続配列を含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列から成るアンチセンス鎖を含む。

ｂ．センス鎖
いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは最大４０ヌクレオチド長（例えば、最大４０、最大３５、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、又は最大１２ヌクレオチド長）のセンス鎖を有してもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１２ヌクレオチド長（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、又は少なくとも３８ヌクレオチド長）のセンス鎖を有してもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２～５０（例えば、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２１、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０、又は３２～４０）ヌクレオチド長の範囲内にあるセンス鎖を有してもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド長のセンス鎖を有してもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は２７ヌクレオチド長を超える（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は２５ヌクレオチド長を超える（例えば、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６ヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、センス鎖は２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、センス鎖は３６ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは配列番号１～１３及び２７～３９のいずれか１つに記載のセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１３及び２７～３９のいずれか１つに記載の配列の、少なくとも１２（例えば、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３）連続ヌクレオチドを含むセンス鎖を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１３及び２７～３９のいずれか１つに記載の配列のいずれかにおける７～３６ヌクレオチド（例えば、１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１７～２１、１８～２７、１９～２７、２０～３６、又は１５～３６ヌクレオチド）長の範囲にあるヌクレオチドの連続配列を含むセンス鎖を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６ヌクレオチド長の配列番号１～１３及び２７～３９のいずれか１つに記載の配列のヌクレオチドの連続配列から成るセンス鎖を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１３及び２７～３９のいずれか１つに記載の配列から成るセンス鎖を有する。

いくつかの実施形態では、センス鎖はその３’末端にステムループを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖はその５’末端にステムループを含む。いくつかの実施形態では、ステムループを含む鎖は２～６６ヌクレオチド長（例えば、２～６６、１０～５２、１４～４０、２～３０、４～２６、８～２２、１２～１８、１０～２２、１４～２６、又は１４～３０ヌクレオチド長）の範囲内にある。いくつかの実施形態では、ステムループを含む鎖は８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ステムは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４ヌクレオチド長の二重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステムループは分子を分解（例えば、酵素分解）から良好に保護し、標的細胞への送達のための標的化特性を容易にする。例えば、いくつかの実施形態では、ループにより、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性にほぼ影響を与えることなく修飾できるヌクレオチドが追加される。特定の実施形態では、本明細書において、センス鎖がＳ₁‐Ｌ‐Ｓ₂で表されるステムループを（例えば、その３’末端に）含むオリゴヌクレオチドを提供し：ここでは、Ｓ₁はＳ₂に相補的であり、ＬはＳ₁とＳ₂の間で最大１０ヌクレオチド長（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長）のループを形成する。
いくつかの実施形態では、ステムループのループ（Ｌ）はテトラループ（例えば、ニックドテトラループ構造内）である。テトラループはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びこれらの組み合わせを含んでもよい。典型的には、テトラループは４～５個のヌクレオチドを有する。しかし、いくつかの実施形態では、テトラループは３～６個のヌクレオチドを含むか、又はそれらから成り、典型的には４～５個のヌクレオチドから成る。特定の実施形態では、テトラループは３個、４個、５個、又は６個のヌクレオチドを含むか、又はそれらから成る。

ｉｖ．オリゴヌクレオチド修飾
オリゴヌクレオチドは、特異性、安定性、送達、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解への耐性、免疫原性、塩基対合特性、ＲＮＡ分布及び細胞取り込み、並びに治療又は研究の使用に関連する他の特徴を向上又は制御するために、様々な方法で修飾し得る（例えば、Ｂｒａｍｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００９年、第３７巻：ｐ．２８６７‐２８８１；Ｂｒａｍｓｅｎ及びＫｊｅｍｓ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１２年、第３巻：ｐ．１‐２２参照）。従って、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の好適な修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その塩基（又は核酸塩基）、糖（例えば、リボース、デオキシリボース）、又はリン酸基中に修飾を有する。
オリゴヌクレオチド上の修飾の数及びそのヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響を与える可能性がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）もしくは類似の担体と共役又は包含させることにより、インビボで送達してもよい。しかし、オリゴヌクレオチドがＬＮＰ又は類似の担体に保護されていない場合、保護されないことはヌクレオチドの少なくとも一部が修飾されることに有利である場合もある。従って、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドのいずれかの特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全て又はほぼ全てのヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、半分を超えるヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、半分を下回るヌクレオチドが修飾される。典型的には、ネイキッド送達により、全ての糖が２’位置で修飾される。これらの修飾は可逆的であっても不可逆的であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは、所望の特徴（例えば、酵素分解からの保護、インビボ投与後に所望の細胞を標的とする能力、及び／又は熱力学的安定性）をもたらすに十分な数及び種類の修飾ヌクレオチドを有する。

ａ．糖修飾
いくつかの実施形態では、修飾糖（本明細書では糖類似体とも称する）は、例えば、糖の２’、３’、４’、及び／又は５’炭素位置で１つ以上の修飾が生じる修飾デオキシリボース又はリボース部分を含む。いくつかの実施形態では、修飾糖は、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８年、第５４巻：ｐ．３６０７‐３６３０参照）、非ロックド核酸（「ＵＮＡ」）（例えば、Ｓｎｅａｄら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ― Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、２０１３年、第２巻、ｅ１０３参照）、及び架橋核酸（「ＢＮＡ」）（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａ、王立化学会、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００２年、第１６巻：ｐ．１６５３‐１６５９参照）に存在するものなどの非天然代替的炭素構造も含んでよい。Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｓｎｅａｄら、及びＩｍａｎｉｓｈｉ及びＯｂｉｋａの文献は、糖修飾に関連するそれらの開示について参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、糖におけるヌクレオチド修飾は２’‐修飾を含む。２’‐修飾は、２’‐アミノエチル、２’‐フルオロ、２’‐Ｏ‐メチル、２’‐Ｏ‐メトキシエチル、及び２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ‐β‐ｄ‐アラビノ核酸であってもよい。典型的には、修飾は２’‐フルオロ、２’‐Ｏ‐メチル、又は２’‐Ｏ‐メトキシメチルである。いくつかの実施形態では、糖における修飾は糖環の修飾を含み、糖環の１つ以上の炭素の修飾を含んでもよい。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’‐酸素が糖の１’‐炭素もしくは４’‐炭素に結合すること、又は２’‐酸素がエチレン又はメチレン架橋を介して１’‐炭素もしくは４’‐炭素に結合することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは２’‐炭素～３’‐炭素結合を欠く非環状の糖を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、又はそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、又はそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は少なくとも１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、又はそれ以上）を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド（即ち、センス鎖とアンチセンス鎖の両方）が修飾される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは２’‐修飾（例えば、２’‐フルオロ又は２’‐Ｏ‐メチル）を含む。
本開示は、様々な修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２７～３９のいずれか１つに記載の配列を有するセンス鎖配列、及び配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列を有するアンチセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドでは、センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８～２７位、及び３１～３６位のうち１つ以上、並びに／又はアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位、及び２０～２２位のうち１つ以上は２’‐Ｏ‐メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８～２７位、及び３１～３６位の全て、並びにアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位、及び２０～２２位の全ては、２’‐Ｏ‐メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、５位、８～１１位、１３位、１５位、及び１７位のうち１つ以上、並びに／又はアンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位のうち１つ以上は２’‐フルオロで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、５位、８～１１位、１３位、１５位、及び１７位の全て、並びにアンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位の全ては２’‐フルオロで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８～２７位、及び３１～３６位の全て、並びにアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位、及び２０～２２位の全ては２’‐Ｏ‐メチルで修飾され、センス鎖の３位、５位、８～１１位、１３位、１５位、及び１７位の全て、並びにアンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位の全ては２’‐フルオロで修飾される。

いくつかの実施形態では、配列番号２７～３９のいずれか１つに記載の配列を有するセンス鎖、及び配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列を有するアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドでは、センス鎖の１～７位、１２～２７位、及び３１～３６位のうち１つ以上、並びに／又はアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１～１３位、及び１５～２２位のうち１つ以上は２’‐Ｏ‐メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の１～７位、１２～２７位、及び３１～３６位の全て、並びにアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１～１３位、及び１５～２２位の全ては２’‐Ｏ‐メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の８～１１位のうち１つ以上、並びに／又は、アンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、及び１４位のうち１つ以上は２’‐フルオロで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の８～１１位の全て、並びにアンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、及び１４位の全ては２’‐フルオロで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の１～７位、１２～２７位、及び３１～３６位の全て、並びにアンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１～１３位、及び１５～２２位の全ては２’‐Ｏ‐メチルで修飾され、センス鎖の８～１１位の全て、並びにアンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、及び１４位の全ては２’‐フルオロで修飾される。
いくつかの実施形態では、配列番号２７～３９のいずれか１つに記載の配列を有するセンス鎖、並びに配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列を有するアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドでは、センス鎖の１位、２位、４～７位、９位、１１位、１４～１６位、１８～２７位、及び３１～３６位のうち１つ以上、並びに／又は、アンチセンス鎖の１位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位、及び２０～２２位のうち１つ以上は２’‐Ｏ‐メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の１位、２位、４～７位、９位、１１位、１４～１６位、１８～２７位、及び３１～３６位の全て、並びにアンチセンス鎖の１位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位、及び２０～２２位の全ては２’‐Ｏ‐メチルで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、８位、１０位、１２位、１３位、及び１７位のうち１つ以上、並びに／又はアンチセンス鎖の２～５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位のうち１つ以上は２’‐フルオロで修飾される。いくつかの実施形態では、センス鎖の３位、８位、１０位、１２位、１３位、及び１７位の全て、並びにアンチセンス鎖の２～５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位の全ては２’‐フルオロで修飾される。
いくつかの実施形態では、リン酸基又は他の基を有する末端にある３’末端基（例えば、３’‐ヒドロキシル）は、例えば、リンカー、アダプターもしくはラベルを付加するために、又はオリゴヌクレオチドを別の核酸に直接ライゲーションするために使用できる。

ｂ．５’末端リン酸
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端リン酸基は、アルゴノート２との相互作用を促進する。しかし、５’‐リン酸基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素を介して分解しやすく、インビボでの生物学的利用能を制限する可能性がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドには、そのような分解に対して抵抗性のある５’リン酸の類似体が含まれる。いくつかの実施形態では、リン酸類似体はオキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートであってもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端は、天然５’‐リン酸基の静電的かつ立体的特性を模倣する化学部分（「リン酸模倣体」）に連結する（例えば、Ｐｒａｋａｓｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１５年、第４３巻（６号）：ｐ．２９９３‐３０１１参照。リン酸類似体に関する内容は参照により本明細書に援用される）。５’末端に連結できる多数のリン酸模倣体が開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号参照。リン酸類似体に関する内容は参照により本明細書に援用される）。オリゴヌクレオチドの５’末端については、他の修飾が開発されている（例えば、国際特許公開ＷＯ２０１１１３３８７１参照。リン酸類似体に関する内容は参照により本明細書に援用される）。特定の実施形態では、ヒドロキシル基はオリゴヌクレオチドの５’末端に連結する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは糖の４’‐炭素位置（「４’‐リン酸類似体」と称する）にリン酸類似体を有する（例えば、「４’‐Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｎａｌｏｇｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」と題された国際特許公開ＷＯ２０１８０４５３１７参照。リン酸類似体に関する内容は参照により本明細書に援用される）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは５’末端ヌクレオチドに４’‐リン酸類似体を含む。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、オキシメチル基の酸素原子が（例えば、その４’‐炭素での）糖部分又はその類似体に結合したオキシメチルホスホネートである。他の実施形態では、４’‐リン酸類似体は、チオメチル基の硫黄原子又はアミノメチル基の窒素原子が糖部分又はその類似体の４’‐炭素に結合しているチオメチルホスホネート又はアミノメチルホスホネートである。特定の実施形態では、４’‐リン酸類似体はオキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態では、オキシメチルホスホネートは式‐Ｏ‐ＣＨ₂‐ＰＯ（ＯＨ）₂又は‐Ｏ‐ＣＨ₂‐ＰＯ（ＯＲ）₂で表し、式中、Ｒは独立してＨ、ＣＨ₃、アルキル基、ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮ、ＣＨ₂ＯＣＯＣ（ＣＨ₃）₃、ＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｓｉ（ＣＨ₃）₃、又は保護基から選択される。特定の実施形態では、アルキル基はＣＨ₂ＣＨ₃である。より典型的には、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ₃、又はＣＨ₂ＣＨ₃から選択される。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドに連結したリン酸類似体はメトキシホスホネート（ＭＯＰ）である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドに連結したリン酸類似体は５’モノ‐メチル保護されたＭＯＰである。いくつかの実施形態では、リン酸類似体を含む以下のウリジンヌクレオチドを、例えば、ガイド（アンチセンス）鎖の第１位置で使用してもよい：

式中、修飾ヌクレオチドは［Ｍｅホスホネート‐４Ｏ‐ｍＵ］又は５’‐メトキシ、ホスホネート‐４’オキシ‐２’‐Ｏ‐メチルウリジンと称する。

ｃ．修飾ヌクレオチド間結合
いくつかの実施形態では、リン酸修飾又は置換により、オリゴヌクレオチドが少なくとも１つ（例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも５個）の修飾ヌクレオチド間結合を含むようになる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１～１０個（例えば、１～１０個、２～８個、４～６個、３～１０個、５～１０個、１～５個、１～３個、又は１～２個）の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１つは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。
修飾ヌクレオチド間結合はホスホロジチオエート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキル（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌ）ホスホネート結合、チオンアルキル（ｔｈｉｏｎａｌｋｙｌ）ホスホトリエステル結合、ホスホラミダイト結合、ホスホネート結合、又はボラノリン酸結合であってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１つのうちの少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは以下の１つ以上の組み合わせの間：センス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の２位と３位との間、アンチセンス鎖の３位と４位との間、アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは以下の各組み合わせの間：センス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の１位と２位との間、アンチセンス鎖の２位と３位との間、アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、及びアンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する。

ｄ．塩基修飾
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドは１つ以上の修飾核酸塩基を有する。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも称する）は、ヌクレオチド糖部分の１’位で結合する。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は窒素塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は窒素原子を含まない（例えば、米国特許公開第２００８０２７４４６２号を参照）。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドはユニバーサル塩基を含む。しかし、特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは核酸塩基を含まない（塩基脱落）。
いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチドにおけるヌクレオチド糖部分の１’位、又はヌクレオチド糖部分置換基における同等の位置に配置された複素環部分であり、これは、二重鎖に存在する場合、二重鎖の構造をほぼ変化させることなく、複数種の塩基の反対側に配置することが可能である。いくつかの実施形態では、標的核酸に完全に相補的な基準一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸で形成された二重鎖より低いＴ_mを有する標的核酸と二重鎖を形成する。しかし、いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基が塩基で置換されて単一のミスマッチが生じている基準一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸で形成された二重鎖より高いＴ_mを有する標的核酸と二重鎖を形成する。
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、１‐β‐Ｄ‐リボフラノシル‐５‐ニトロインドール、及び／又は１‐β‐Ｄ‐リボフラノシル‐３‐ニトロピロールが挙げられる（米国特許公開第２００７０２５４３６２号；Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９５年、第２３巻（２１号）：ｐ．４３６３‐７０；Ｌｏａｋｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９５年、第２３巻（１３号）：ｐ．２３６１‐６；Ｌｏａｋｅｓ及びＢｒｏｗｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻（２０号）：ｐ．４０３９‐４３参照。前述の各文献は、塩基修飾に関する開示について、参照により本明細書に援用される）

ｅ．可逆的修飾
標的細胞に到達する前にインビボ環境からオリゴヌクレオチドを保護するための特定の修飾を行うことが可能である一方で、その修飾は、オリゴヌクレオチドが標的細胞の細胞基質に到達するとオリゴヌクレオチドの効力又は活性を低下させる可能性がある。可逆的修飾は、分子が細胞外では望ましい特性を保持し、細胞の細胞基質環境に入るとその特性は無くなるように行うことが可能である。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用、又は細胞内の化学的条件により（例えば、細胞内グルタチオンによる還元を経て）消すことが可能である。
いくつかの実施形態では、可逆的に修飾したヌクレオチドはグルタチオン感受性部位を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド二リン酸間結合により生じる負電荷を覆い隠して細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を改善するために環状ジスルフィド部分で化学修飾している（例えば、米国特許公開第２０１１０２９４８６９号、国際特許公開ＷＯ２０１５１８８１９７；Ｍｅａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４年、第３２巻：ｐ．１２５６‐１２６３；国際特許公開ＷＯ２０１４０８８９２０参照；各文献は、そのような修飾の開示について参照により援用される）。ヌクレオチド二リン酸間結合の可逆的修飾は、細胞基質の還元環境（例えば、グルタチオン）により細胞内で切断されるように設計している。先行例としては、細胞内で切断可能であると報告されている中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、米国化学会誌、２００３年、第１２５巻：ｐ．９４０‐９５０）。

いくつかの実施形態では、このような可逆的な修飾により、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼや他の過酷な環境条件（例えば、ｐＨ）に曝されるインビボ投与（例えば、血液及び／又は細胞のリソソーム／エンドソーム区分の通過）中に保護が可能になる。細胞外空間と比較してグルタチオンレベルが高い細胞の細胞基質内に放出されると、修飾は打ち消され、結果としてオリゴヌクレオチドが切断される。可逆的なグルタチオン感受性部位を用いると、不可逆的な化学修飾を用いることが可能な場合と比較して、対象のオリゴヌクレオチドに立体的に大型の化学基を導入することが可能となる。何故なら、これらの大型の化学基は細胞基質で除去されるため、細胞の細胞基質内におけるオリゴヌクレオチドの生物学的活性を妨げないはずだからである。その結果、これらの大型の化学基は、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び免疫原性低下など様々な利点をヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドへ付与するように設計できる。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部位の構造は、その放出の動態を改変するように設計できる。
いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分はヌクレオチドの糖に連結している。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は修飾ヌクレオチドの糖の２’炭素に連結している。いくつかの実施形態では、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドである場合に、グルタチオン感受性部分は糖の５’‐炭素に位置する。いくつかの実施形態では、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’‐末端ヌクレオチドである場合に、グルタチオン感受性部分は糖の３’‐炭素に位置する。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分はスルホニル基を含む（例えば、国際特許公開ＷＯ２０１８０３９３６４参照。その内容は、その関連する開示内容について参照により本明細書に援用される）。

ｖ．標的化リガンド
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを１つ以上の細胞又は１つ以上の器官に標的化することが望ましい場合もある。そのような戦略は、他の器官における望ましくない効果を回避することに役立つか、又はオリゴヌクレオチドにとって有益ではない細胞、組織もしくは器官に向かってオリゴヌクレオチドが過度に損失してしまうことを回避し得る。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞又は器官への標的化を容易にするために、例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするために修飾してもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするために修飾してもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは１つ以上の標的化リガンドと共役したヌクレオチドを含む。
標的化リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質の一部（例えば、抗体又は抗体フラグメント）、又は脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的化リガンドはアプタマーである。例えば、標的化リガンドは、腫瘍脈管構造又は神経膠腫細胞を標的とするために使用するＲＧＤペプチド、腫瘍脈管構造又はストーマを標的とするＣＲＥＫＡペプチド、ＣＮＳ脈管構造に発現するトランスフェリン受容体を標的とするトランスフェリン(transferring)、ラクトフェリンもしくはアプタマー、又は神経膠腫細胞上のＥＧＦＲを標的とする抗ＥＧＦＲ抗体であってもよい。特定の実施形態では、標的化リガンドは１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）のヌクレオチドはそれぞれ別の標的化リガンドと共役している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの２～４個のヌクレオチドをそれぞれ別の標的化リガンドと共役している。いくつかの実施形態では、標的化リガンドはセンス又はアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４個のヌクレオチドと共役しており（例えば、リガンドは、センス又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端上の２～４個のヌクレオチドオーバーハング又は延長部と共役している）、ここでは標的化リガンドは歯ブラシの毛に似ており、オリゴヌクレオチドは歯ブラシに似ている。例えば、オリゴヌクレオチドはセンス鎖の５’又は３’末端のいずれかにステム‐ループを含んでもよく、ステムループの１個、２個、３個、又は４個のヌクレオチドは個別に標的化リガンドと共役してもよい。

いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１の発現を低下させるオリゴヌクレオチドを、被験体の肝臓の肝細胞に標的化することが望ましい。この目的のために好適な肝細胞標的化部分であればどのような部分でも使用できる。
ＧａｌＮＡｃは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に高親和性のリガンドであり、主に肝細胞の類洞表面に発現し、末端ガラクトース又はＮ‐アセチルガラクトサミン残基を含む循環糖タンパク質（アシアロ糖タンパク質）の結合、内在化、及びその後のクリアランスにおいて主要な役割を担う。本開示のオリゴヌクレオチドへのＧａｌＮＡｃ部分のコンジュゲーション（間接的又は直接的のいずれか）は、これらの肝細胞上に発現するＡＳＧＰＲにこれらのオリゴヌクレオチドを標的として向けるために利用してもよい。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは一価ＧａｌＮＡｃに直接又は間接的と共役している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、複数の一価ＧａｌＮＡｃに直接又は間接的と共役している（例えば、２個、３個、又は４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分と共役し、典型的には３個又は４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分と共役している）。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の二価ＧａｌＮＡｃ、三価ＧａｌＮＡｃ、又は四価ＧａｌＮＡｃ部分と共役している。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）のヌクレオチドはそれぞれＧａｌＮＡｃ部分と共役している。いくつかの実施形態では、ステム‐ループのループ（Ｌ）の２～４個のヌクレオチドはそれぞれ別のＧａｌＮＡｃと共役している。いくつかの実施形態では、標的化リガンドはセンス又はアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４個のヌクレオチドと共役しており（例えば、リガンドを、センス又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端上の２～４個のヌクレオチドオーバーハング又は延長部と共役している）、ここではＧａｌＮＡｃ部分は歯ブラシの毛に似ており、オリゴヌクレオチドは歯ブラシに似ている。例えば、オリゴヌクレオチドはセンス鎖の５’又は３’末端のいずれかにステム‐ループを含んでもよく、ステムループの１個、２個、３個、又は４個のヌクレオチドはＧａｌＮＡｃ部分に個別と共役してもよい。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分はセンス鎖のヌクレオチドと共役する。例えば、４つのＧａｌＮＡｃ部分は、各ＧａｌＮＡｃ部分が１つのヌクレオチドと共役されているセンス鎖のテトラループのヌクレオチドと共役できる。

いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、以下に示すような［ａｄｅｍＧ‐ＧａｌＮＡｃ］又は２’‐アミノジエトキシメタノール‐グアニジン‐ＧａｌＮＡｃと称するグアニジンヌクレオチドに連結した一価ＧａｌＮＡｃを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、以下に示すような［ａｄｅｍＡ‐ＧａｌＮＡｃ］又は２’‐アミノジエトキシメタノール‐アデニン‐ＧａｌＮＡｃと称するアデニンヌクレオチドに連結した一価ＧａｌＮＡｃを含む。

そのようなコンジュゲーションの一例を、５’～３’のヌクレオチド配列ＧＡＡＡ（Ｌ＝リンカー、Ｘ＝ヘテロ原子）を含むループについて以下に示し、式中、ステム連結点を示している。このようなループは、例えば、図１Ｂに示す分子の２７～３０位に存在してもよい。化学式中、

はオリゴヌクレオチド鎖への連結点を表すために使用している。

適切な方法又は化学反応（例えば、クリックケミストリー）を利用して、標的化リガンドをヌクレオチドに連結することが可能である。いくつかの実施形態では、クリックリンカーを用いて標的化リガンドをヌクレオチドと共役する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドと共役するためにアセタール系リンカーを使用する。アセタール系リンカーは、例えば国際特許公開ＷＯ２０１６１００４０１に開示されており、そのようなリンカーに関するその内容は参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、リンカーは不安定なリンカーである。しかし、他の実施形態では、リンカーは安定している。「不安定なリンカー」とは、例えば酸性ｐＨにより切断できるリンカーを指す。安定したリンカー」とは、切断できないリンカーを指す。
５’～３’のヌクレオチドＧＡＡＡを含むループについて一例を以下に示し、ここではＧａｌＮＡｃ部分はアセタールリンカーを用いたループのヌクレオチドに連結している。このようなループは、例えば、図１０に記載の分子の２７～３０位に存在してもよい。化学式中、

はオリゴヌクレオチド鎖への連結点である。

標的化リガンドをヌクレオチドに連結するために、任意の適切な方法又は化学反応（例えば、クリックケミストリー）を利用することが可能である。いくつかの実施形態では、クリックリンカーを用いて標的化リガンドをヌクレオチドと共役する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドと共役するためにアセタール系リンカーを使用する。アセタール系リンカーは、例えば国際特許公開ＷＯ２０１６１００４０１に開示されており、そのようなリンカーに関するその内容は参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、リンカーは不安定なリンカーである。他の実施形態では、リンカーは安定している。
いくつかの実施形態では、標的化リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）と二本鎖オリゴヌクレオチドとの間に二重鎖延長部（例えば、最大３、４、５、又は６塩基対長）が存在する。

ＩＩＩ．製剤
オリゴヌクレオチドの使用を容易にするために、様々な製剤が開発されている。例えば、分解を最小限に抑え、送達及び／もしくは取り込みを容易にし、又は製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を用いて、オリゴヌクレオチドを被験体又は細胞環境に送達することが可能になる。いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド）を含む組成物が本明細書で提供される。このような組成物は、被験体において標的細胞のごく近い環境に、又は全身に投与されたときに、十分量のオリゴヌクレオチドが細胞に入り、ＨＭＧＢ１発現を低減するように、好適に配合できる。本明細書に開示したＨＭＧＢ１を低減するオリゴヌクレオチドを送達するために、任意の様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤を使用できる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造体、及びカプシド中に配合する。
細胞へのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを促進するために、カチオン性脂質を含むオリゴヌクレオチドの製剤を使用できる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセリン誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン）などのカチオン性脂質を使用できる。好適な脂質としては、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、コロラド州、Ｂｏｕｌｄｅｒ）、又はＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）が挙げられ、これらは全てメーカー説明書に従って使用できる。

従って、いくつかの実施形態では、製剤は脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフィア、もしくはナノ粒子を含むか、又はそうでなければ、それを必要とする被験体の細胞、組織、器官、もしくは身体に投与するために配合してもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、２０１３年参照）。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示した製剤は賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤により、組成物において安定性、吸収、溶解性が向上し、及び／又は有効成分による治療が促進される。いくつかの実施形態では、賦形剤は緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、又は水酸化ナトリウム）、又はビヒクル（例えば、緩衝液、ペトロラタム、ジメチルスルホキシド、又は鉱油）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは貯蔵寿命を延長するために凍結乾燥し、その後、使用（例えば、被験体への投与）前に溶液にする。従って、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１種を含む組成物中の賦形剤は、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、又はポリビニルピロリドン）、又は崩壊温度調整剤（例えば、デキストラン、フィコール、又はゼラチン）であってもよい。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、意図した投与経路に適合するように配合する。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸投与が挙げられる。

注射用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射用液又は分散液を即席に調製するための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与では、好適な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ社、米国、ニュージャージー州、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、又はリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体となり得る。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。滅菌注射用溶液は、上述で列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に、必要量のオリゴヌクレオチドを、選択した溶媒中に組み込み、次いで必要に応じてろ過滅菌することにより調製できる。
いくつかの実施形態では、組成物は、治療剤（例えば、ＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチド）を少なくとも約０．１％、又はそれ以上を含有してもよいが、有効成分（単数又は複数）の割合は全組成物の重量又は体積の約１％～約８０％以上であってもよい。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命、並びに他の薬理学的考慮事項などの要因は、当業者がそのような医薬製剤を調製することにより検討され、よって様々な投与量及び治療レジメンが望ましいものとなる可能性がある。
多くの実施形態は、本明細書で開示したオリゴヌクレオチドのいずれかの肝臓標的送達を意図しているが、他の組織の標的化も検討されている。

ＩV．使用方法
ｉ．細胞内ＨＭＧＢ１発現の低減
いくつかの実施形態では、細胞内ＨＭＧＢ１発現を低減する目的で、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１つを有効量で細胞に送達するための方法を提供する。本明細書で提供する方法は、任意の適切な細胞型において有用である。いくつかの実施形態では、細胞はＨＭＧＢ１を発現する任意の細胞（例えば、肝細胞、マクロファージ、単球由来細胞、前立腺癌細胞、脳細胞、内分泌組織、骨髄、リンパ節、肺、胆嚢、肝臓、十二指腸、小腸、膵臓、腎臓、消化管、膀胱、脂肪組織及び軟部組織、及び皮膚）である。いくつかの実施形態では、細胞は、被験体から得た初代培養細胞、及び限られた回数の継代を経てもよい初代培養細胞であり、よって細胞は天然の表現型特性をほぼ維持している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを送達する細胞は、エクスビボ又はインビトロ細胞である（例えば、培養液中の細胞、又は細胞が存在する生物に送達できる細胞）。具体的な実施形態では、肝細胞におけるＨＭＧＢ１発現のみを低減する目的で、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１つを有効量で細胞に送達する方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは適切な核酸送達方法を用いて導入可能であり、該方法には、オリゴヌクレオチドを含有する溶液の注入、オリゴヌクレオチドで覆われた粒子による衝撃、オリゴヌクレオチドを含有する溶液への細胞又は生物の曝露、又はオリゴヌクレオチドの存在下での細胞膜の電気穿孔が含まれる。オリゴヌクレオチドを細胞に送達するための他の適切な方法も使用してよく、例えば脂質媒介担体輸送、化学物質媒介輸送、リン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクション等が挙げられる。
阻害の結果は、細胞又は被験体の１つ以上の特性を評価する適切なアッセイにより、又はＨＭＧＢ１発現の指標となる分子（例えば、ＲＮＡ、タンパク質）を評価する生化学的技術により確認できる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するオリゴヌクレオチドがＨＭＧＢ１発現レベルを低下させる程度は、ＨＭＧＢ１の発現レベル（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベル）を適切な対照（例えば、オリゴヌクレオチドが送達されていない細胞もしくは細胞集団、又は陰性対照が送達された細胞もしくは細胞集団におけるＨＭＧＢ１発現レベル）と比較することにより評価する。いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１発現の適切な対照レベルは、対照レベルを毎回測定する必要がないような所定のレベル又は数値であってもよい。所定のレベル又は数値は様々な形態をとることが可能である。いくつかの実施形態では、所定のレベル又は数値は、中央値又は平均値などの単一のカットオフ値とすることが可能である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの投与により、細胞内ＨＭＧＢ１発現レベルが低下する。いくつかの実施形態では、ＨＭＧＢ１発現レベルの低下は、ＨＭＧＢ１の適切な対照レベルと比較して、１％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、又は９０％以下の低下であってもよい。適切な対照レベルは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞又は細胞集団におけるＨＭＧＢ１発現レベルであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示した方法に従った細胞へのオリゴヌクレオチドの送達効果は有限期間後に評価する。例えば、ＨＭＧＢ１レベルは、細胞へのオリゴヌクレオチドの導入から少なくとも８時間、１２時間、１８時間、２４時間；又は少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、もしくは１４日後に、細胞内で分析してもよい。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド（例えば、そのセンス鎖及びアンチセンス鎖）を細胞内で発現するように設計した導入遺伝子の形態で送達する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示した任意のオリゴヌクレオチドを発現するように設計した導入遺伝子を用いて送達する。導入遺伝子はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルス）又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミド又は合成ｍＲＮＡ）を用いて送達してもよい。いくつかの実施形態では、導入遺伝子を被験体に直接注入できる。

ｉｉ．治療方法
本開示の態様は、被験体における肝線維症の発症又は進行を抑制するための、ＨＭＧＢ１発現を低減する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法には、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドのいずれか１種を有効量で、それを必要とする被験体に投与することが含まれてもよい。そのような治療は、例えば任意のタイプの肝線維症を遅延又は停止するために使用できる。本開示は、肝線維症及び／又は肝臓の炎症に伴う疾患又は障害のリスクがある（又は罹患し易い）被験体を治療する予防的方法及び治療的方法の両方を提供する。
本発明の化合物は、肝臓においてのみＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡを選択的に標的とする。他のＮＡＳＨ治療薬と比較して、この選択性は、非特異的な相互作用及び潜在的な副作用を減少させながら、本発明のＨＭＧＢ１阻害剤の効力を増加させることが期待される。
特定の態様では、本開示は、治療剤（例えば、オリゴヌクレオチド又はそれをコードするベクターもしくは導入遺伝子）を被験体に投与することにより、被験体において本明細書に記載の疾患又は障害を予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療対象の被験体は、例えば肝臓でのＨＭＧＢ１タンパク質の量の減少から治療上の利益が得られる対象である。疾患又は障害のリスクがある被験体は、例えば、当技術分野で公知の診断又は予後アッセイのうちの１つ又は組み合わせにより同定できる（例えば、肝線維症及び／又は肝臓の炎症の同定）。予防薬の投与は、疾患又は障害に特徴的な症状の検出又は顕在化に先立って行うことが可能であり、その結果、疾患又は障害が予防されるか、或いはその進行を遅らせる。

いくつかの実施形態では、本開示は、例えば胆汁うっ滞性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝臓状態にあるか、又はその疑いのある被験体を治療するための本発明のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えば胆汁うっ滞性肝疾患、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨなどの肝臓状態にあるか、又はその疑いのある被験体を治療する際に使用するための本明細書に記載のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えば胆汁性肝疾患、ＮＡＦＬＤ及び非アルコール性脂肪性肝炎ＮＡＳＨなどの肝臓状態にあるか、又はその疑いのある被験体を治療するための薬剤を調製するためのＲＮＡｉを提供する。
本明細書に記載の方法は典型的には、オリゴヌクレオチドを有効量、即ち、望ましい治療結果をもたらし得る量を被験体に投与することを含む。治療的に許容可能な量とは、疾患又は障害を治療し得る量であってもよい。任意の１被験体のための適切な投与量は、被験体の体格、体表面積、年齢、投与する特定の組成物、組成物中の有効成分（単数又は複数）、投与期間及び投与経路、健康全般、及び併用投与している他の薬剤など、特定の要因によって異なる。

いくつかの実施形態では、被験体には、本明細書に開示した組成物のいずれか１種を、経腸（例えば、経口、経胃栄養管、経十二指腸栄養管、経胃瘻、又は経直腸）、非経口（例えば、皮下注射、静脈内注射又は輸液、動脈内注射又は輸液、骨内注入、筋肉内注射、脳内注射、脳室内注射、髄腔内投与）、局所投与（経皮、吸入、点眼、又は経粘膜）、又は標的器官（例えば、被験体の肝臓）への直接注射、のいずれかで投与する。典型的には、本明細書に開示したオリゴヌクレオチドは静脈内又は皮下に投与する。
非限定的な一連の例として、本開示のオリゴヌクレオチドは典型的には、四半期ごとに（３か月に１回）、隔月で（２か月に１回）、毎月、又は毎週投与する。例えば、オリゴヌクレオチドは、毎週、又は２週間ごとに、又は３週間ごとに投与してもよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは毎日投与してもよい。
いくつかの実施形態では、治療対象の被験体は、ヒト又は非ヒトの霊長類又は他の哺乳類被験体である。他の例示的な被験体としては、イヌ及びネコなどの飼い慣らされた動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリなどの家畜；並びにマウス、ラット、モルモット、及びハムスターなどの動物が挙げられる。

実施例１：ＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドのインビボ活性
本実施例で使用したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、ヒト、サル（本例での２匹のサルは両方ともアカゲザル）、及びマウスの配列においてアルゴリズムにより同定した保存配列（「３種共通」配列）に結合するように設計した。本研究では、３つの３種共通オリゴヌクレオチド配列（Ｓ３１‐ＡＳ１８、Ｓ３５‐ＡＳ２２、及びＳ３６‐ＡＳ２３）を、３つの異なる修飾パターン（Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３、図１Ａ及び１Ｂ参照）で試験した。オリゴヌクレオチドを１ｍｇ／ｋｇでＣＤ‐１マウスに皮下投与し、投与後５日目にマウスを安楽死させた。肝臓試料を採取し、ＲＮＡを抽出し、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲ（ＨＰＲＴ１‐Ｆ５７６（ハウスキーピング遺伝子）に正規化）により評価した。残留したＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡのレベルは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲアッセイを利用して調べた。
ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの異なる領域に特異的な２つの異なるプライマーを用いてｑＰＣＲを行った。他のプライマーを用いず５’末端のプライマーを用いて実行するｑＰＣＲを「５’ｑＰＣＲ」と指定した。同様に、他のプライマーを用いず３’末端のプライマーを用いて実行するｑＰＣＲを「３’ｑＰＣＲ」と指定した。この実験では、３’ｑＰＣＲアッセイ（プライマーＭｍＨＭＧＢ１‐Ｆ１５４１を使用）を使用した。そのデータから、（ＰＢＳ対照処理に正規化した）マウス肝臓に残留しているＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの量が減少したことで示されているように、試験した全てのＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、投与５日後にＨＭＧＢ１を強力にノックダウンしたことが分かった（図１Ａ）。

異なる修飾パターンを持つ２つのＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（Ｓ３１‐ＡＳ１８‐Ｍ３、及びＳ３５‐ＡＳ２２‐Ｍ２）を、ツール化合物Ｓ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ２を対照として、用量反応分析で更に試験した。３種類のオリゴヌクレオチドを３種類の異なる投与量（０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び２ｍｇ／ｋｇ）でＣＤ‐１マウスに皮下投与した。投与後５日目にマウスを安楽死させた。肝臓試料を採取し、ＲＮＡを抽出し、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲ（ＨＰＲＴ１‐Ｆ５７６（ハウスキーピング遺伝子）に正規化）により評価した。残留したＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡのレベルを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲアッセイ（上述の３’アッセイを使用）を利用して調べた。その結果から、試験した２種類のＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、両修飾パターンにおいてマウス肝臓のＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルを低下させたことが分かる（図２）。特に非肝細胞の「底値」を考慮した場合、全てのオリゴヌクレオチドは約０．５～１．０ｍｇ／ｋｇのＥＤ₅₀を示した。
次に、修飾パターンが異なる２つのＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（Ｓ３１‐ＡＳ１８‐Ｍ３及びＳ３５‐ＡＳ２２‐Ｍ２）を、持続研究においてインビボで試験し、マウスにおけるＨＭＧＢ１発現を阻害する際の活性を評価した。この実験では、ＰＢＳを陰性対照とし、ツール化合物Ｓ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ２を陽性対照とした。オリゴヌクレオチドを１ｍｇ／ｋｇでＣＤ‐１マウスに皮下投与し、投与後７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目にマウスを安楽死させた。肝臓試料を採取し、ＲＮＡを抽出し、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲ（ＨＰＲＴ１‐Ｆ５７６ハウスキーピング遺伝子に正規化）により評価した。上述した３’アッセイを利用した。そのデータから、（ＰＢＳ対照処理に正規化した）７、１４、２１、及び２８日目のマウス肝臓に残留しているＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの量が減少したことで示されているように、１ｍｇ／ｋｇ単回投与でも、注射から３週間後に全ての試験したＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドがＨＭＧＢ１を強力にノックダウンしたことが分かった（図３）。

実施例２：ＨＭＧＢ１発現を阻害する追加のＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを同定するための新規ＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド配列の追加的インビトロスクリーニング
追加の２８８個の３種共通ＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（配列については表４参照）をインビトロ活性アッセイでスクリーニングし、ＨＭＧＢ１発現を阻害する際に有効な追加のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド配列を同定した（図４Ａ～４Ｆ）。このアッセイでは、Ｈｕｈ‐７細胞を、上記に示したオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。トランスフェクト後２４時間、細胞を維持し、ｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ‐ｑＰＣＲ試料調製緩衝液を用いてＲＮＡを単離した。ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲアッセイを利用して調べた。２種のｑＰＣＲアッセイ、５’アッセイ及び３’アッセイを利用し、それぞれＨＥＸ（ハウスキーピング遺伝子 ― ＨＰＲＴ‐Ｆ５７６／ＳＦＲＳ９‐Ｆ５９４）及びＦＡＭプローブにより測定したｍＲＮＡレベルを決定した。
残留ｍＲＮＡの割合を、５’アッセイ（赤）及び３’アッセイ（青）のそれぞれについて示す。ｍｏｃｋトランスフェクション対照と比較して、残留ｍＲＮＡの割合が最も低いオリゴヌクレオチドを成功（ｈｉｔ）とした。ヒトゲノムとの相補性が低いオリゴヌクレオチドを陰性対照とした。

スクリーニングで同定した２２個の新規配列から、２つの異なる修飾パターン（それぞれＭ２及びＭ３）を有する複数のＧａｌＮＡｃ共役テトラループオリゴヌクレオチド（配列については表２及び表５参照）を作成し、肝臓ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルを低下させるオリゴヌクレオチドのインビボ活性を試験した。この実験では、ＰＢＳを陰性対照とし、２つの異なる修飾パターンを持つツール化合物（Ｓ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ２及びＳ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ３）を陽性対照とした。オリゴヌクレオチドを、１ｍｇ／ｋｇでＣＤ‐１マウスに皮下投与し、投与後５日目にマウスを安楽死させた。肝臓試料を採取し、ＲＮＡを抽出し、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲ（ＨＰＲＴ１‐Ｆ５７６（ハウスキーピング遺伝子）に正規化）により評価した。残留したＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡのレベルは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲアッセイを利用して調べた（３’アッセイを利用した）。その結果、新規ＧａｌＮＡｃ共役リゴヌクレオチドは肝臓ＨＭＧＢ１を阻害する際の活性レベルが異なり、７種の新規ＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（矢印で示す、Ｓ２７‐ＡＳ１４、Ｓ２８‐ＡＳ１５、Ｓ２９‐ＡＳ１６、Ｓ３０‐ＡＳ１７、Ｓ３２‐ＡＳ１９、Ｓ３３‐ＡＳ２０、及びＳ３４‐ＡＳ２１）は、もしマウスに３～５ｍｇ／ｋｇを単回投与してから３週間後にＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡが少なくとも５０％抑制されていれば、ノックダウン持続研究に含めるように選択した（図５）。
ノックダウン持続アッセイでは、異なる修飾パターン（Ｍ２又はＭ３）を有する７種の新規ＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（Ｓ２７‐ＡＳ１４、Ｓ２８‐ＡＳ１５、Ｓ２９‐ＡＳ１６、Ｓ３０‐ＡＳ１７、Ｓ３２‐ＡＳ１９、Ｓ３３‐ＡＳ２０、及びＳ３４‐ＡＳ２１）を試験し、事前に同定した２種のＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（Ｓ３１‐ＡＳ１８‐Ｍ３及びＳ３５‐ＡＳ２２‐Ｍ２）と比較した。ＰＢＳを陰性対照とし、ツール化合物Ｓ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ２を陽性対照とした。オリゴヌクレオチドを、４ｍｇ／ｋｇでＣＤ‐１マウスに皮下投与し、投与後２１日目にマウスを安楽死させた。肝臓試料を採取し、ＲＮＡを抽出し、ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲ（ＨＰＲＴ１‐Ｆ５７６（ハウスキーピング遺伝子）に正規化）により評価した。残留したＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡのレベルは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲアッセイを利用して調べた（３’アッセイを利用した）。オリゴヌクレオチド投与から２１日後の肝臓における残留ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの割合を、ＰＢＳ対照処理に正規化して図６に示す。試験した全てのＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドは、注射から３週間後にＨＭＧＢ１を強力にノックダウンした。

実施例３：初代培養サル又はヒト肝細胞におけるＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドの試験
本実験で試験したＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドを図７に示した。また、図７には、陽性対照として使用するためのＧａｌＮＡｃ共役ＬＤＨＡオリゴヌクレオチドも示す。このアッセイでは、ＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドを、ＡＳＧＰＲ受容体を介した取り込みにより、初代培養サル肝細胞（図８Ａ及び８Ｂ）又はヒト肝細胞（図８Ｃ）細胞に送達した。
オリゴヌクレオチドの送達から２４時間、細胞を維持した。ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲ（サル肝細胞についてはＲｈＰＰＩＢ（ハウスキーピング遺伝子）に正規化し、ヒト肝細胞についてはＨＰＲＴ１‐Ｆ５７６（ハウスキーピング遺伝子）に正規化した）によりＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルを評価した。残留ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡのレベルは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲアッセイを利用して調べた。ＲｈＭＨＧＢ１‐Ｆ４５７ ｑＰＣＲアッセイ（図８Ａ及び８Ｂ）及びＨｓＨＭＧＢ１‐Ｆ８１アッセイ（図８Ｃ）を利用した。ＧａｌＮＡｃ共役ＬＤＨＡ‐１３６０オリゴヌクレオチドをアッセイ対照とし（図８Ｄ）、残留ＬＤＨＡ ｍＲＮＡのレベルをＲｈＬＤＨＡ‐Ｆ８８７ ｑＰＣＲアッセイにより測定した。Ｍｏｃｋ処理に正規化したＲｈＨＭＧＢ１のＩＣ５０曲線を示す。

４つの例示的なＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチド（Ｓ２７‐ＡＳ１４‐Ｍ２、Ｓ３３‐ＡＳ２０‐Ｍ２、Ｓ３５‐ＡＳ２２‐Ｍ２、及びＳ３７‐ＡＳ２４‐Ｍ２）を、ＨＭＧＢ１ノックダウンの際の活性について、非ヒト霊長類（サル）においてインビボで更に試験した。この実験では、ＰＢＳを陰性対照とし、ツール化合物Ｓ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ２を陽性対照とした。Ｓ２７‐ＡＳ１４‐Ｍ２、Ｓ３３‐ＡＳ２０‐Ｍ２、Ｓ３５‐ＡＳ２２‐Ｍ２、及びＳ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ２の構造を図７に示す。
オリゴヌクレオチドを、単回投与４ｍｇ／ｋｇで、又は２ｍｇ／ｋｇ量を４回繰り返して、非ヒト霊長類に皮下投与した。投与後の各時点でサルの肝生検を行った。肝臓試料を採取し、ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲによりＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルを評価した。投与後７日、１４日、２５日、５４日、８１日、１１２日目のサル肝臓における残留ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡの割合を、ＰＢＳ対照処理に正規化し、示す（図９Ａ～９Ｂ）。その結果、試験した全てのオリゴヌクレオチドは、投与後２５日目に肝臓のＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡレベルを有意に低下させた。２ｍｇ／ｋｇ用量を４回繰り返して投与したところ、ＨＭＧＢ１ノックダウン効果は１１２日間持続した（図９Ｂ）。

実施例４：初代培養サル／ヒト肝細胞でのＨＭＧＢ１ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの比較
５種類のＨＭＧＢ１二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（表４のＳ８６６‐ＡＳ８８７、Ｓ８６９‐ＡＳ８７８、Ｓ１１６‐ＡＳ４９０、Ｓ１１７‐ＡＳ４９１、Ｓ８７１‐ＡＳ８８０、及びＳ８７２‐ＡＳ８８１）の活性を、マウス、サル、及びヒトの細胞株で比較した。この実験では、ＰＢＳを陰性対照とし、ツール化合物Ｓ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ２を陽性対照とした。このアッセイでは、マウス細胞（Ｈｅｐａ１‐６細胞、図１０Ａ及び１０Ｂ）、サル細胞（ＬＬＣ‐ＭＫ２細胞、図１０Ｃ及び１０Ｄ）、及びヒト細胞（Ｈｕｈ‐７、図１０Ｅ及び１０Ｆ）をそれぞれ、上記で示したオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。トランスフェクト後２４時間、細胞を維持し、ｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ‐ｑＰＣＲ試料調製緩衝液を用いてＲＮＡを単離した。ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲアッセイを利用して調べた。２種のｑＰＣＲアッセイ、５’アッセイ（図１０Ａ、１０Ｃ、及び１０Ｅ）及び３’アッセイ（図１０Ｂ、１０Ｄ、及び１０Ｆ）を利用し、それぞれＨＥＸ（ハウスキーピング遺伝子 ― ＨＰＲＴ‐Ｆ５７６）及びＦＡＭプローブにより測定したｍＲＮＡレベルを決定した。オリゴヌクレオチド２１０、８４０、８５２、８５３は、０．１ｎＭ及び１ｎＭ濃度で、マウス細胞株における３’アッセイ及び５’アッセイの両方で、８０％を超えるノックダウンを示した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。全てのＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、０．１ｎＭ及び１ｎＭの濃度で８０％を超えるＫＤを示す（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。オリゴヌクレオチド２１０、８４０、８５２、８５３、９３２は、ヒト細胞株において０．１ｎＭ及び１ｎＭの濃度で、より強力な約９０％超のＫＤを示す（図１０Ｅ及び１０Ｆ）。

実施例５：ＨＭＧＢ１選択性についてのＧａｌＸＣ‐ＨＭＧＢ１試験
ＧａｌＮＡｃ共役ＨＭＧＢ１オリゴヌクレオチドＳ２７‐ＡＳ１４‐Ｍ２、Ｓ３３‐ＡＳ２０‐Ｍ２、Ｓ３５‐ＡＳ２２‐Ｍ２、及びＳ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ２の、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、及びＨＭＧＢ３に対する選択性を、ヒト肝細胞で試験した。Ｓ２７‐ＡＳ１４‐Ｍ２、Ｓ３３‐ＡＳ２０‐Ｍ２、Ｓ３５‐ＡＳ２２‐Ｍ２、及びＳ３６‐ＡＳ２３‐Ｍ２の構造を図７に示す。ＧａｌＮＡｃ共役ＬＤＨＡオリゴヌクレオチドを陽性対照とする。Ｈｕｈ‐７細胞を、８つの異なる濃度（８時点で４倍希釈、最高濃度は１ｎＭ）の上記で示したオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。トランスフェクト後２４時間、細胞を維持し、ｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ‐ｑＰＣＲ試料調製緩衝液を用いてＲＮＡを単離した。ＨＭＧＢ１ ｍＲＮＡは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲアッセイを利用して調べた。５’アッセイを利用し、それぞれＨＥＸ（ハウスキーピング遺伝子‐ＳＦＲＳ９）及びＦＡＭプローブにより測定したｍＲＮＡレベルを決定した。ＨＭＧＢ１（図１１Ａ）、ＨＭＧＢ２（図１１Ｂ）及びＨＭＧＢ３（図１１Ｃ）のＩＣ５０曲線を、ｍｏｃｋ処理に正規化して示す。試験した４種の共役体は全て、ＨＭＧＢ１に対して同様のＩＣ５０値を示した（図１１Ａ）。どの共役体（ＬＤＨＡ対照オリゴヌクレオチドを含む）も、ＨＭＧＢ２ ｍＲＮＡレベル（図１１Ｂ）又はＨＭＧＢ３ ｍＲＮＡレベル（図１１Ｃ）に影響を及ぼさなかった。

実施例６：材料及び方法
トランスフェクション
最初のスクリーンでは、効率的なトランスフェクションのために、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（商標）を使用してオリゴヌクレオチドを複合化した。オリゴヌクレオチドＲＮＡｉＭＡＸ及びＯｐｔｉ‐ＭＥＭをプレートに添加し、トランスフェクションに先立って室温で２０分間インキュベートした。活発に継代する細胞のフラスコから培養液を吸引し、トリプシン存在下、３７℃で３～５分間インキュベートする。細胞がフラスコに付着しなくなったら、細胞増殖培養液（ペニシリン及びストレプトマイシンを含まない）を加え、トリプシンを中和して細胞を懸濁させた。１０μＬのアリコートを取り出し、血球計数器で細胞数を計数し、１ｍｍ単位で細胞を定量化した。ＨｅＬａ細胞では、１００μＬの培養液中、１ウェル当たり２０，０００個の細胞を播種した。この懸濁液を既知の細胞濃度で希釈し、トランスフェクションを行うための細胞数に必要な総量にした。希釈した細胞懸濁液を、オリゴヌクレオチドを含むＯｐｔｉ‐ＭＥＭが既に入っている９６ウェルのトランスフェクションプレートに添加した。その後、トランスフェクションプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後、各ウェルから培養液を吸引した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキットの溶解緩衝液を用いて細胞を溶解した。溶解緩衝液を各ウェルに添加した。次いで、溶解した細胞を、ＲＮＡ単離用Ｃｏｒｂｅｔｔ ＸｔｒａｃｔｏｒＧＥＮＥ（ＱＩＡｘｔｒａｃｔｏｒ）に移すか、又は－８０℃で保存した。
その後のスクリーンや実験、例えば二次スクリーンでは、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡｘを用いてリバーストランスフェクション用のオリゴヌクレオチドを複合化した。ＲＮＡｉＭＡＸとｓｉＲＮＡとをＯｐｔｉＭＥＭ培地中で１５分間混合することで複合体を作製した。トランスフェクション混合物をマルチウェルプレートに移し、細胞懸濁液をウェルに添加した。２４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで一回洗浄した後、Ｐｒｏｍｅｇａ ＳＶ９６キットの溶解緩衝液を用いて溶解した。ＳＶ９６プレートを用い、真空マニホールド中でＲＮＡを精製した。次いで４マイクロリットルの精製ＲＮＡを６５℃で５分間加熱し、４℃まで冷却した。次に、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、１０マイクロリットルの反応液中で、ＲＮＡを逆転写に供した。その後、ｃＤＮＡをヌクレアーゼフリー水で５０μＬに希釈し、５’‐エンドヌクレアーゼアッセイとＳＳｏＦａｓｔ ｑＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とを複合化した定量的ＰＣＲに供した。

ｃＤＮＡ合成
Ｃｏｒｂｅｔｔ Ｘ‐ｔｒａｃｔｏｒ Ｇｅｎｅ（商標）（ＱＩＡｘｔｒａｃｔｏｒ）を用いて、組織培養液中の哺乳類細胞からＲＮＡを単離した。改変ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩプロトコルを使用し、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。単離したＲＮＡ（約５ｎｇ／μＬ）を６５℃で５分間加熱し、ｄＮＰ、ランダムヘキサマー、オリゴｄＴ、及び水と共にインキュベートした。この混合液を１５秒間冷却した。水、５倍第一鎖緩衝液、ＤＴＴ、ＳＵＰＥＲａｓｅ‐Ｉｎ（商標）（ＲＮＡ阻害剤）、及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴａｓｅから成る「酵素混合物」を混合液に添加した。内容物を４２℃で１時間、次いで７０℃で１５分間加熱した後、熱サイクラーを用いて４℃まで冷却した。次いで、得られたｃＤＮＡをＳＹＢＲ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲに供した。１反応あたり２つの５’エンドヌクレアーゼアッセイが含まれるようにｑＰＣＲ反応を複合化した。
ｑＰＣＲアッセイ
初めに、ＳＹＢＲ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲを利用してプライマーセットをスクリーニングした。アッセイ特異性は、「マイナスＲＴ」対照と共に融解曲線を評価することで検証した。ヒト（Ｈｓ）及びマウス（Ｍｍ）アッセイ試験のためにそれぞれ、ＨｅＬａ及びＨｅｐａ１‐６細胞からのｃＤＮＡテンプレートの希釈（１反応当たり２０ｎｇ～０．０２ｎｇまでの１０倍連続希釈）を利用する。ｑＰＣＲアッセイ分析物を３８４ウェルプレートにセットし、ＭｉｃｒｏＡｍｐフィルムで覆い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製７９００ＨＴで処理した。試薬濃度及びサイクル条件としては、２倍ＳＹＢＲ混合物、１０μＭのフォワードプライマー、１０μＭのリバースプライマー、ＤＤ Ｈ₂Ｏ、及びｃＤＮＡテンプレートを含み、これらは総体積が１０μＬになるようにメスアップしている。
いくつかの例では、前述のように、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）をベースとするｑＰＣＲアッセイによりｑＰＣＲを行った。分析におけるｍＲＮＡレベルを更に確認するため、一般的に標的ｍＲＮＡ（例えば、ＨＭＧＢ１）のコード領域内の２つの異なる位置（互いに５’及び３’）を標的とするＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを使用した。

クローニング
メーカー説明書に従って、単一の融解曲線を示したＰＣＲ単位複製配列をＰｒｏｍｅｇａ社製ｐＧＥＭ（登録商標）‐Ｔ Ｅａｓｙベクターキットにライゲーションした。メーカーのプロトコルに従って、ＪＭ１０９ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ細胞を、新たにライゲーションしたベクターで形質転換した。その後、アンピシリンを含むＬＢプレートに細胞を播種し、コロニー増殖のために３７℃で一晩インキュベートした。
ＰＣＲスクリーニング及びプラスミドミニプレップ
対象の、ライゲーションした単位複製配列を含むベクターで形質転換した大腸菌のコロニーを同定するためにＰＣＲを利用した。ＰＣＲ反応にはインサートに隣接するベクター特異性プライマーを使用した。次いで、染色後に、全てのＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルに流し、トランスイルミネーターで画像化した。ゲルを定性評価し、どのプラスミドが、予想サイズのライゲーションした単位複製配列を含むように見えるかを判定した（約３００ｂｐ、単位複製配列及び使用したプライマーに特異的な隣接ベクター配列を含む）。
次いで、ＰＣＲスクリーニングにより形質転換体であることが確認されたコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢブロスから成る培養液中で、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。その後、大腸菌細胞を溶解し、Ｐｒｏｍｅｇａ社製Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐキットを用いて対象のプラスミドを単離した。プラスミド濃度は２６０ｎｍでのＵＶ吸光度により決定した。

プラスミドの配列決定及び定量
ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列決定キットを用いて、精製プラスミドを配列決定した。ベクター特異性プライマーＴ７を使用して、インサートにまたがる読み取り長さを得た。配列決定反応には、体積を１０μＬにした以下の試薬：水、５倍配列決定緩衝液、ＢｉｇＤｙｅターミネータ混合物、Ｔ７プライマー、及びプラスミド（１００ｎｇ／μＬ）を使用した。この混合物を９６℃で１分間保持した後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で１分１５秒を１５サイクル；９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で１分３０秒を５サイクル；９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で２分を５サイクル保持した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製キャピラリー電気泳動配列決定装置を用いて染色停止反応物の配列決定を行った。
次に、配列が検証されたプラスミドを定量した。それらプラスミドを、単一の切断制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化した。アガロースゲル電気泳動を用いて線状性を確認した。１ｍＬ当たり１００μｇのｔＲＮＡを含むＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）中で全プラスミドを希釈し、ポリプロピレン製バイアルへプラスミドが非特異的結合することを低減した。
次に、線状化したプラスミドを１μＬ当たり１，０００，０００コピー数から０１コピー数になるまで連続的に希釈し、ｑＰＣＲに供した。アッセイ効率を計算し、効率が９０～１１０％の範囲であれば、アッセイは許容可能であるとした。

複合化アッセイ
各標的について、２つの５’ヌクレアーゼアッセイによりｍＲＮＡレベルを定量した。一般に、各標的に対して数個のアッセイ分析物をスクリーニングする。選択した２つのアッセイ分析物では、高い効率、低い検出限界、対象の遺伝子（ＧＯＩ）の広い５’→３’範囲が組み合わさっていた。それぞれのプローブに異なるフルオロフォアを使用した場合、１つの反応で、１つのＧＯＩに対して両アッセイを併用できた。このように、アッセイ確認の最終段階では、選択した複数のアッセイを同じｑＰＣＲで組み合わせた場合、又は「複合化」した場合の、選択したアッセイの効率を判定した。
１０倍希釈した両アッセイ用線状化プラスミドを組み合わせ、ｑＰＣＲを実施した。各アッセイの効率を上述のように判定した。許容可能な効率範囲は９０～１１０％であった。
線状化プラスミド基準を利用して複合化反応を確認する一方で、テンプレートとしてｃＤＮＡを用いて対象の標的に対するＣ_q値も評価した。ヒト又はマウス標的には、それぞれＨｅＬａ及びＨｅｐａ１‐６のｃＤＮＡを使用した。この場合、ｃＤＮＡは、トランスフェクトしていない細胞からＣｏｒｂｅｔｔ上に単離したＲＮＡ（水中、約５ｎｇ／μＬ）に由来していた。このように、この試料ｃＤＮＡから観察されたＣ_q値は、９６ウェルプレートでのトランスフェクションから予想されるＣ_q値を表していた。Ｃ_q値が３０を超える場合、より高い対象遺伝子発現レベルを示す他の細胞株を探した。ハイスループット法によりヒト及びマウス株の各々からＣｏｒｂｅｔｔ上に単離した総ＲＮＡのライブラリを作成し、標的発現が許容可能なレベルであるかをスクリーニングするために使用した。

オリゴヌクレオチド命名法の説明
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは全て、ＳＮ₁‐ＡＳＮ₂‐ＭＮ₃のいずれかに指定されている。以下の指定が適用される：
● Ｎ₁：センス鎖配列の配列識別子番号
● Ｎ₂：アンチセンス鎖配列の配列識別子番号
● Ｎ₃：修飾パターンの参照番号であり、各番号はオリゴヌクレオチドにおける修飾ヌクレオチドのパターンを表す。
例えば、Ｓ１‐ＡＳ１４‐Ｍ１は、配列番号１に記載のセンス配列、及び配列番号１４に記載のアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、修飾パターン番号１に適合する。

本明細書に例示した開示内容は、本明細書に具体的には開示していない１つの要素又は複数の要素、１つの限定又は複数の限定が存在しない状態では好適に実施できる。従って、例えば、本明細書の各例では、用語「を含む」、「基本的に～から成る」、及び「から成る」のいずれかはそれぞれ、他の２つの用語のいずれかに置き換えてもよい。採用した用語や表現は説明のための用語として使用し、限定のためではない。そのような用語や表現の使用において、提示及び説明した特徴又はその一部の等価物を除外する意図はないが、請求した発明の範囲内で様々な修正が可能であることは認識されている。従って、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示してきたが、本明細書に開示した概念の自由選択的な特徴、修正及び変更は当業者に委ねてもよく、そのような修正及び変更は本明細書及び添付の請求項に定義されるような本発明の範囲内であると考えられることは理解すべきである。
また、本発明の特徴又は態様をマーカッシュ群又は代替的な他の群の観点から説明する場合、当業者は、本発明がそれによってマーカッシュ群又は他の群の任意の各メンバー、又はメンバーの下位群の観点からも説明することを認識している。

本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の参照語の使用は、本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅するように解釈すべきである。用語「含む」(comprising)、「有する」(having)、「含む」(including)、及び「含有する」(containing)は、別段の記載がない限り、オープンエンドな用語（即ち、「含むが、限定されるものではない」という意味）として解釈すべきである。本明細書における数値の範囲の参照は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲内にある各個別の数値を個別に参照する簡略表記法として機能することを単に意図しており、各個別の数値は、本明細書において個別に参照されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法は全て、本明細書で別段の指示がない限り、又は文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行できる。本明細書で提供する任意の及び全ての例、又は例示的な語句（例えば、「など」）の使用は、本発明をより明らかにすることを単に意図しており、別段に請求していない限り、本発明の範囲に限定を持ち出すものではない。本明細書のいかなる語句も、本発明の実施に不可欠なものとして請求していない要素を示すものと解釈すべきではない。
本発明の実施形態は、本発明を実施するために発明者らに知られている最良の態様を含めて、本明細書に記載されている。それらの実施形態の変更は、前述の説明を読めば、当業者には明らかになるであろう。
本発明者らは、当業者がそのような変更を適宜採用することを期待しており、また、本明細書に具体的に記載した方法以外の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明には、適用可能な法律で認められているように、添付の特許請求の範囲に引用された主題の全ての修正物及び等価物が含まれる。更に、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈上明らかに矛盾しない限り、上述の要素の組み合わせは、そのあらゆる可能な変形物において、本発明に包含される。当業者であれば、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識しているか、又は通常の実験以下の実験を利用して確認することが可能である。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図している。

Claims (67)

1. ＨＭＧＢ１発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、１５～５０ヌクレオチド長のセンス鎖及び１５～３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と共に二重鎖領域を形成し、前記センス鎖が、配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１４～２６から選択される相補的な配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
2. 前記センス鎖配列が、配列番号２７～３９のいずれか１つに記載の配列を含むか、又は前記配列から成る、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 前記アンチセンス鎖配列が、配列番号１４～２６のいずれか１つに記載の配列から成る、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
   
4. 前記センス鎖配列が、配列番号２７に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号１４に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 前記センス鎖配列が、配列番号２８に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号１５に記載の配列を含み、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 前記センス鎖配列が、配列番号２９に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号１６に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 前記センス鎖配列が、配列番号３０に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号１７に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 前記センス鎖配列が、配列番号３１に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号１８に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 前記センス鎖配列が、配列番号３２に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号１９に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
10. 前記センス鎖配列が、配列番号３３に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号２０に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
11. 前記センス鎖配列が、配列番号３４に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号２１に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
12. 前記センス鎖配列が、配列番号３５に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号２２に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
13. 前記センス鎖配列が、配列番号３６に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号２３に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
14. 前記センス鎖配列が、配列番号３７に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号２４に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
15. 前記センス鎖配列が、配列番号３８に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号２５に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
16. 前記センス鎖配列が、配列番号３９に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖配列が、配列番号２６に記載の配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
17. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
18. 前記オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドが、修飾されている、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
19. 前記修飾ヌクレオチドが、２’‐修飾を含む、請求項１７又は１８に記載のオリゴヌクレオチド。
20. 前記２’修飾が、２’‐フルオロ又は２’‐Ｏ‐メチルである、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
21. 前記センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８～２７位及び３１～３６位のうち１つ以上、及び／又は、前記アンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位及び２０～２２位のうち１つ以上が、２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている、請求項１７～２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
22. 前記センス鎖の１位、２位、４位、６位、７位、１２位、１４位、１６位、１８～２７位及び３１～３６位の全て、及び、前記アンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位及び２０～２２位の全てが、２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
23. 前記センス鎖の３位、５位、８～１１位、１３位、１５位及び１７位のうち１つ以上、及び／又は、前記アンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位及び１９位のうち１つ以上が、２’‐フルオロで修飾されている、請求項１７～２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
24. 前記センス鎖の３位、５位、８～１１位、１３位、１５位及び１７位の全て、及び、前記アンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位及び１９位の全てが、２’‐フルオロで修飾されている、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。
25. 前記センス鎖の１～７位、１２～２７位及び３１～３６位のうち１つ以上、及び／又は、前記アンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１～１３位及び１５～２２位のうち１つ以上が、２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている、請求項１７～２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
26. 前記センス鎖の１～７位、１２～２７位及び３１～３６位の全て、及び、前記アンチセンス鎖の１位、４位、６位、８位、９位、１１～１３位及び１５～２２位の全てが、２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
27. 前記センス鎖の８～１１位のうち１つ以上、及び／又は、前記アンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位及び１４位のうち１つ以上が、２’‐フルオロで修飾されている、請求項１７～２０、２５、及び２６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
28. 前記センス鎖の８～１１位の全て、及び前記アンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位及び１４位の全てが、２’‐フルオロで修飾されている、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
29. 前記センス鎖の１位、２位、４～７位、９位、１１位、１４～１６位、１８～２７位及び３１～３６位のうち１つ以上、及び／又は、前記アンチセンス鎖の１位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位及び２０～２２位のうち１つ以上が、２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている、請求項１７～２０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
30. 前記センス鎖の１位、２位、４～７位、９位、１１位、１４～１６位、１８～２７位及び３１～３６位の全て、及び、前記アンチセンス鎖の１位、６位、８位、９位、１１位、１３位、１５位、１８位及び２０～２２位の全てが、２’‐Ｏ‐メチルで修飾されている、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド。
31. 前記センス鎖の３位、８位、１０位、１２位、１３位及び１７位のうち１つ以上、及び／又は、前記アンチセンス鎖の２～５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位及び１９位のうち１つ以上が、２’‐フルオロで修飾されている、請求項１７～２０、２９及び３０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
32. 前記センス鎖の３位、８位、１０位、１２位、１３位、及び１７位の全て、並びに前記アンチセンス鎖の２～５位、７位、１０位、１２位、１４位、１６位、１７位、及び１９位の全ては２’‐フルオロで修飾されている、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド。
33. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合を含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
34. 前記少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
35. 前記オリゴヌクレオチドが、以下の１つ以上の位置の組み合わせの間、即ち、前記センス鎖の１位と２位との間、前記アンチセンス鎖の１位と２位との間、前記アンチセンス鎖の２位と３位との間、前記アンチセンス鎖の３位と４位との間、前記アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、及び前記アンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する、請求項３３又は３４に記載のオリゴヌクレオチド。
36. 前記オリゴヌクレオチドが、以下の各位置の組み合わせの間、即ち、前記センス鎖の１位と２位との間、前記アンチセンス鎖の１位と２位との間、前記アンチセンス鎖の２位と３位との間、前記アンチセンス鎖の２０位と２１位との間、前記アンチセンス鎖の２１位と２２位との間にホスホロチオエート結合を有する、請求項３５に記載のオリゴヌクレオチド。
37. 前記アンチセンス鎖の第１位置のウリジンが、リン酸類似体を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
38. 前記オリゴヌクレオチドが、前記アンチセンス鎖の１位に以下の構造：
    

    

    を含む、請求項３７に記載のオリゴヌクレオチド。
39. 前記センス鎖上の２８～３０位の‐ＡＡＡ‐配列のヌクレオチドのうち１つ以上が、一価ＧａｌＮＡｃ部分と共役している、請求項１～３８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
40. 前記センス鎖上の２８～３０位の‐ＡＡＡ‐配列の各ヌクレオチドが、一価ＧａｌＮＡｃ部分と共役している、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチド。
41. 前記センス鎖上の２８～３０位の‐ＡＡＡ‐モチーフが、以下の構造：
    

    

    を含み、
    式中：
    Ｌは、数値の両端を含む１～２０個でかつ連続的な共有結合した原子長の結合、クリックケミストリーハンドル、又はリンカーを表し、Ｌは置換及び非置換アルキレン、置換及び非置換アルケニレン、置換及び非置換アルキニレン、置換及び非置換ヘテロアルキレン、置換及び非置換ヘテロアルケニレン、置換及び非置換ヘテロアルキニレン、及びこれらの組み合わせから成る群より選択され；Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮである、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチド。
42. Ｌが、アセタールリンカーである、請求項４１に記載のオリゴヌクレオチド。
43. Ｘが、Ｏである、請求項４１又は４２に記載のオリゴヌクレオチド。
44. センス鎖上の２８～３０位の‐ＡＡＡ‐配列が、以下の構造：
    

    

    
    を含む、請求項４１～４３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
45. ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、１５～３０ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１～１３のいずれか１つに記載の配列の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドに相補的なＨＭＧＢ１に相補的である領域を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
46. 前記アンチセンス鎖が、１９～２７ヌクレオチド長である、請求項４５に記載のオリゴヌクレオチド。
47. 前記アンチセンス鎖が、２２ヌクレオチド長である、請求項４５に記載のオリゴヌクレオチド。
48. 前記オリゴヌクレオチドが、１５～５０ヌクレオチド長のセンス鎖を更に含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と二重鎖領域を形成する、請求項４５～４７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
49. 前記センス鎖が、１９～５０ヌクレオチド長である、請求項４８に記載のオリゴヌクレオチド。
50. 前記二重鎖領域が、２０ヌクレオチド長である、請求項４８又は４９に記載のオリゴヌクレオチド。
51. センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、ＨＭＧＢ１の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、
    （ａ）前記センス鎖が、配列番号７８８に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１４に記載の配列を含む；
    （ｂ）前記センス鎖が、配列番号７８９に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１５に記載の配列を含む；
    （ｃ）前記センス鎖が、配列番号７９０に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１６に記載の配列を含む；
    （ｄ）前記センス鎖が、配列番号７９１に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１７に記載の配列を含む；
    （ｅ）前記センス鎖が、配列番号７９２に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１８に記載の配列を含む；
    （ｆ）前記センス鎖が、配列番号７９３に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８１９に記載の配列を含む；
    （ｇ）前記センス鎖が、配列番号７９４に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２０に記載の配列を含む；
    （ｈ）前記センス鎖が、配列番号７９５に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２１に記載の配列を含む；
    （ｉ）前記センス鎖が、配列番号７９６に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２２に記載の配列を含む；
    （ｊ）前記センス鎖が、配列番号７９７に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２３に記載の配列を含む；
    （ｋ）前記センス鎖が、配列番号７９８に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２４に記載の配列を含む；
    （ｌ）前記センス鎖が、配列番号７９９に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２５に記載の配列を含む；
    （ｍ）前記センス鎖が、配列番号８００に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２６に記載の配列を含む；
    （ｎ）前記センス鎖が、配列番号８０１に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２７に記載の塩基配列を含む；
    （ｏ）前記センス鎖が、配列番号８０２に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２８に記載の配列を含む；
    （ｐ）前記センス鎖が、配列番号８０３に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８２９に記載の配列を含む；
    （ｑ）前記センス鎖が、配列番号８０４に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３０に記載の配列を含む；
    （ｒ）前記センス鎖が、配列番号８０５に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３１に記載の配列を含む；
    （ｓ）前記センス鎖が、配列番号８０６に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３２に記載の配列を含む；
    （ｔ）前記センス鎖が、配列番号８０７に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３３に記載の配列を含む；
    （ｕ）前記センス鎖が、配列番号８０８に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３４に記載の配列を含む；
    （ｖ）前記センス鎖が、配列番号８０９に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３５に記載の配列を含む；
    （ｗ）前記センス鎖が、配列番号８１０に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３６に記載の配列を含む；
    （ｘ）前記センス鎖が、配列番号８１１に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３７に記載の配列を含む；
    （ｙ）前記センス鎖が、配列番号８１２に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３８に記載の配列を含む；又は
    （ｚ）前記センス鎖が、配列番号８１３に記載の配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号８３９に記載の配列を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
52. 請求項１～５１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含むことを特徴とする組成物。
53. オリゴヌクレオチドを被験体に送達する方法であって、請求項５２に記載の組成物を被験体に投与することを含むことを特徴とする方法。
54. 前記被験体が、肝線維症に罹患しているか、又はそのリスクがある、請求項５３に記載の方法。
55. 前記被験体が、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝疾患に罹患している、請求項５４に記載の方法。
56. 前記オリゴヌクレオチドを前記被験体に投与することによりＨＭＧＢ１タンパク質の発現を低減する、請求項５３～５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 肝線維症に罹患しているか、又はそのリスクがある被験体を治療する方法であって、請求項１～５１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを前記被験体に投与することを含むことを特徴とする方法。
58. 前記被験体が、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝疾患に罹患している、請求項５７に記載の方法。
59. 前記被験体が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している、請求項５８に記載の方法。
60. 前記オリゴヌクレオチドが、前記被験体が肝毒性物質に曝される前に投与される、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の方法。
61. 前記オリゴヌクレオチドが、前記被験体が肝毒性物質に曝された後に投与される、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の方法。
62. 前記オリゴヌクレオチドが、前記被験体が肝毒性物質に曝されると同時に投与される、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の方法。
63. 前記投与により肝臓ＨＭＧＢ１レベルが低下する、請求項５７～６２のいずれか１項に記載の方法。
64. 前記投与により血清ＨＭＧＢ１レベルが低下する、請求項５７～６３のいずれか１項に記載の方法。
65. 肝線維症に罹患しているか、又はそのリスクがある被験体を治療するための、請求項１～５１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
66. 前記被験体が、胆汁うっ滞性又は自己免疫性肝疾患に罹患している、請求項６５に記載の使用。
67. 前記被験体が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している、請求項６５に記載の使用。

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