JP2022161526A - 改変糸状菌、及びそれを用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質生産性が向上した改変糸状菌、及び該改変糸状菌を用いたタンパク質の製造方法の提供。
【解決手段】ＡＣＥ３改変体を発現し、該ＡＣＥ３改変体が、ＡＣＥ３のＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメインの実質的に全部を欠損した改変体である改変糸状菌。該改変糸状菌を培養することを含むタンパク質の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、改変糸状菌、及びそれを用いたタンパク質の製造方法に関する。

糸状菌は、多種のセルラーゼ及びヘミセルラーゼを生産する、植物性多糖の分解菌である。なかでも、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）は、セルラーゼとヘミセルラーゼを同時に、かつ大量に生産することが可能であることから、セルラーゼ系バイオマス分解酵素の製造のための微生物として注目されている。

工業的な微生物培養のための炭素源は、安価かつ可溶性であることが望ましい。従来、微生物の培養における炭素源としてはグルコースが汎用されている。一方で、微生物による酵素などのタンパク質の生産には誘導性物質が必要なことがある。例えば、微生物によるセルラーゼ生産には、一般的に誘導性物質が必須である。トリコデルマにおいて、主要なセルラーゼ遺伝子ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２などの発現は、セルロースやセロビオースなどの誘導性物質により誘導される（非特許文献１）。誘導性物質を用いない場合、例えばグルコースのみを単一炭素源として用いた場合には、一般的にトリコデルマにおいて糖化酵素はほとんど生産されない。

誘導性物質を用いた微生物学的タンパク質生産法としては、微結晶性セルロースであるアビセルを用いたセルラーゼ生産法が知られており、また、セルロースを用いずに可溶性のラクトースを用いたセルラーゼ生産法（特許文献１）、トリコデルマ由来のセルラーゼ（βグルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼを含む）とグルコースを高温で反応させることで、グルコースからソホロース、ゲンチオビオースなどの誘導性の糖を合成し、セルラーゼ生産を誘導する方法（特許文献２）が開示されている。しかしながら、セルロース基質は高価であり、また多くは不溶性であるため工業プロセスに負荷をかけることから、工業用途への使用はコスト的に及び設備の面で困難である。また、他の誘導性の糖を用いたセルラーゼ生産もなお、コストやプロセス負荷の面でデメリットを抱える。

そこで、転写制御因子の改変による、誘導性物質を利用せずともセルラーゼ及びキシラナーゼの発現が可能な微生物の作出に向け、セルラーゼ発現機構の解析が進められている。トリコデルマのセルラーゼ誘導発現に関与する正の転写因子としてＸＹＲ１、ＡＣＥ２、ＡＣＥ３、ＨＡＰ２／３／５などが報告されている（非特許文献２）。ＡＣＥ３は、主要セルラーゼであるｃｂｈ１などのプロモーターの制御を行う転写因子である。ＡＣＥ３は、Ｎ末端側のアミノ酸１２０～１６０番目にあるＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を介してプロモーターに結合する（非特許文献３）。また非特許文献３には、ＡＣＥ３とＸＹＲ１が相互作用してトリコデルマ・リーセイのセルラーゼ遺伝子発現を調節することが示唆されている。

特許文献３及び非特許文献４には、トリコデルマ・リーセイにおいて、ｔｒｅ７７５１３（ＡＣＥ３）遺伝子の発現を増加及び減少させることで、そのセルラーゼ等の生産性を増加及び低下させる方法が開示されている。特許文献４及び非特許文献５には、Ｎ側のＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメインの６個のシステインを全て保持し且つＣ末端に７アミノ酸～１７アミノ酸の欠損のある改変ＡＣＥ３を向上発現する糸状菌が、誘導性物質非存在下でもセルラーゼ発現を向上させたことが報告されている。非特許文献５にはまた、該Ｃ末端欠損ＡＣＥ３を向上発現し、さらにＸＹＲ１の野生型又はＡ８２４Ｖ変異体を共発現する糸状菌が記載されている。ただしこの糸状菌における当該ＸＹＲ１の共発現によるセルラーゼ発現に対する効果は、誘導性物質存在下では僅かに観察されたものの、誘導性物質非存在下では観察されていない。

非特許文献６には、ＸＹＲ１のＡ８２４Ｖ変異を有するトリコデルマでキシラナーゼの脱制御が起こり、セルラーゼ生産が増加することが報告されている。非特許文献７には、トリコデルマ株においてＸＹＲ１のＶ８２１Ｆ変異にＡＣＥ２の向上発現を組み合わせることで、グルコースやスクロースを炭素源とする培地でのタンパク質生産性が向上したことが報告されている。

特許第６１６９０７７号公報 特許第５３６６２８６号公報 米国特許第９５１２４１５号公報 国際公開公報第２０１８／０６７５９９号

Curr Genomics, 2013, 14:230-249 BMC Genomics, 2015, 16:326 J Biol Chem, 2019, doi:10.1074/jbc.RA119.008497 Biotech Biofuels, 2014, 7:14 Biotech Biofuels, 2020, 13:137 Biotech Biofuels, 2013, 6:62 Biotech Biofuels, 2017, 10:30

本発明は、改変糸状菌及びその製造方法、ならびに当該改変糸状菌を用いたタンパク質の製造方法を提供することに関する。

本発明者は、Ｚｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメイン（以下の本明細書において、単に「ＤＢＤ」とも呼ぶ）を欠損したＡＣＥ３改変体（variant）を発現する改変糸状菌が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの生産に従来必須であった誘導性物質を用いることなく、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等のタンパク質を高生産することを見出した。

したがって、本発明は、改変糸状菌であって、
ＡＣＥ３改変体を発現し、
該ＡＣＥ３改変体が、ＡＣＥ３のＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメインの実質的に全部を欠損した改変体である、
改変糸状菌を提供する。
また本発明は、前記改変糸状菌を培養することを含む、タンパク質の製造方法を提供する。
また本発明は、改変糸状菌の製造方法であって、
親糸状菌を、ＡＣＥ３改変体を発現させるように改変することを含み、
該ＡＣＥ３改変体が、ＡＣＥ３のＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメインの実質的に全部を欠損した改変体である、
方法を提供する。

本発明により提供される改変糸状菌は、グルコース等のセルラーゼ非誘導性炭素源を主要な炭素源とする環境下でも効率よくタンパク質を生産することができる。また当該糸状菌は、高価なセルラーゼ誘導性物質を使用しなくとも、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等のタンパク質を効率的に生産することができる。本発明によれば、糸状菌を用いたタンパク質生産の効率化及びコスト低下が可能である。

改変糸状菌が発現するＡＣＥ３改変体の構造。 改変糸状菌が発現するＡＣＥ３改変体の構造。 タンパク質生産性に対するＡＣＥ３のＤＢＤ欠損の効果：（Ａ）縦軸の値はＡＣＥ３改変体を発現する改変糸状菌の相対タンパク質生産性を表し、横軸の１、２、３は同じＡＣＥ３改変体を発現する３つの改変糸状菌株を表す、（Ｂ）改変糸状菌の培養物のゲル電気泳動像。 各種トリコデルマ属菌由来のＡＣＥ３改変体のアミノ酸配列のアラインメント。 各種トリコデルマ属菌由来のＡＣＥ３改変体を発現する改変糸状菌におけるタンパク質生産：（Ａ）相対タンパク質生産性、（Ｂ）改変糸状菌の培養物のゲル電気泳動像。 タンパク質生産性に対するＡＣＥ３のＣ末端欠損の効果：（Ａ）ＡＣＥ３改変体を発現する改変糸状菌の相対タンパク質生産性、（Ｂ）改変糸状菌の培養物のゲル電気泳動像。 タンパク質生産性に対する変異ＸＹＲ１とＡＣＥ３改変体との共発現の効果：（Ａ）改変糸状菌の培養物のゲル電気泳動像、（Ｂ）改変糸状菌の培養物のタンパク質組成比。 タンパク質生産性に対する変異ＸＹＲ１発現と、ＡＣＥ３のＤＢＤ欠損及びＣ末端欠損との組み合わせの効果：（Ａ）改変糸状菌の培養物のゲル電気泳動像、（Ｂ）改変糸状菌の培養物のタンパク質組成比。

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。

本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列におけるアミノ酸及びヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～１６個、より好ましくは１～１２個、さらに好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～４個を意味し得る。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「挿入」には、所定の位置の５’側又は３’側へのアミノ酸又はヌクレオチドの挿入が含まれる。

本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。また、相当する位置により挟まれた領域、または相当するモチーフからなる領域は、相当する領域とみなされる。

当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸が存在する位置の数の全長アミノ酸数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸を意味する。そのような類似のアミノ酸からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、「アミノ酸」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。

本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。

本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。

本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」及び「ネイティブ」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。

本発明は、糸状菌のタンパク質生産性を向上させることに関する。従来、糸状菌をグルコース存在下で培養すると、カタボライト抑制によりタンパク質生産が抑制されることがあった。特に、糸状菌におけるセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等のセルラーゼ系バイオマス分解酵素の発現は、通常、セルロース、ソホロース、セロオリゴ糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオース等）などのセルラーゼ誘導性物質により誘導される必要があり、一方、グルコース存在下では発現誘導が抑制される。

糸状菌における該誘導性物質によるセルラーゼ系バイオマス分解酵素の誘導発現は、ＸＹＲ１、Ｃｒｅ１、ＡＣＥ１、ＡＣＥ２、ＡＣＥ３、ＨＡＰ２／３／５などの多くの転写因子により制御されている。ＡＣＥ３は、糸状菌におけるセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子である。ＡＣＥ３は、ラクトース誘導時のセルラーゼ遺伝子、及び一部のキシラナーゼ遺伝子の転写に必須である。またＡＣＥ３は、ｘｙｒ１遺伝子の転写制御にも部分的に関与する。トリコデルマ・リーセイのＡＣＥ３は、ｎｃｂｉデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／］）において、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＱＥＭ２４９１３．１として登録されており、ここでＡＣＥ３は、配列番号１のアミノ酸配列からなり、配列番号６のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドとして規定されている。また、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＸＰ＿００６９６６０９２．１ ［ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＸＰ＿００６９６６０９２．１］によれば、配列番号１のアミノ酸配列のうち、５２３～７３４位はＸＹＲ１と相互作用すると推定されている領域であり、３９１～５２２位は糸状菌特異的転写因子ドメインと推定されている領域であり、１２０～１６０位はＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と推定されている領域である。ＤＢＤをコードする遺伝子は、イントロンによって２つの領域に分けられている。その一方（Ｅｘｏｎ２）は、ＤＢＤのＮ側の２つのＣｙｓを含む領域（Ｃ２）をコードし、もう一方（Ｅｘｏｎ３）は、残り４つのＣｙｓを含む領域（Ｃ４）をコードする。他のトリコデルマ属菌にも同等の構造を有するＡＣＥ３が存在する。

ＡＣＥ３のＣ末端アミノ酸の欠損が、糸状菌における誘導性物質なしでのタンパク質生産を可能にすることが報告されている（非特許文献５）。ただし、非特許文献５には、このＣ末端欠損による効果が、ＤＢＤのＣ２の欠損によって消失したことが開示されている。

これに対し、本発明者は、ＤＢＤのＣ２だけでなくＣ４も欠損したＡＣＥ３改変体が、糸状菌に誘導性物質なしでセルラーゼ及びヘミセルラーゼを発現させる能力を与え、かつ該糸状菌がグルコース等のセルラーゼ非誘導性炭素源の存在下でセルラーゼ及びヘミセルラーゼ等のタンパク質を高発現することを可能にすることを見出した。さらに、このＡＣＥ３におけるＣ２及びＣ４の欠損は、Ｃ末端欠損と組み合わせると、タンパク質生産性を相乗的に向上させる。

したがって、一態様において本発明は、ＤＢＤの実質的に全部を欠損したＡＣＥ３改変体を発現する改変糸状菌、及び該改変糸状菌の製造方法を提供する。本発明の改変糸状菌は、親糸状菌を、該ＤＢＤの実質的に全部を欠損したＡＣＥ３改変体を発現させるように改変することによって製造することができる。製造された本発明の改変糸状菌は、該ＤＢＤの実質的に全部を欠損したＡＣＥ３改変体を発現する。

ＡＣＥ３のＤＢＤは、ＡＣＥ３のアミノ酸配列のＮ末端側、具体的には配列番号１の１２０～１６０位アミノ酸に相当する領域に位置し、このうち１２０～１３１位がＣ２であり、１３２～１６０位がＣ４である。本明細書において、「ＤＢＤの実質的に全部の欠損」とは、ＤＢＤがＣ２の一部又は全部の欠損とＣ４の一部又は全部の欠損とを有することをいい、好ましくは、ＤＢＤがＣ２の全部とＣ４の一部又は全部を欠損していることをいう。ここで、「Ｃ４の一部」とは、好ましくは、Ｃ４中の少なくとも２つのＣｙｓを含む領域をいい、より好ましくは、Ｃ４中の少なくとも３つのＣｙｓを含む領域をいい、さらに好ましくは、Ｃ４中の４つのＣｙｓを含む領域、例えば配列番号１の１３２～１５１位アミノ酸に相当する領域をいう。本明細書における「ＤＢＤの実質的に全部の欠損」の例としては、ＤＢＤのアミノ酸配列の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上が欠損しており、かつＤＢＤ中の６つのＣｙｓが欠損している状態が挙げられる。

本発明の改変糸状菌の親糸状菌とは、上記ＤＢＤの実質的に全部を欠損したＡＣＥ３改変体を発現させる改変を受けて、本発明の改変糸状菌へと調製される糸状菌である。該親糸状菌は、本来的にＡＣＥ３を発現するものであることが好ましい。例えば、該親糸状菌は、好ましくは、ＤＢＤの全部を有する、ネイティブなＡＣＥ３又はその改変体を発現する。より好ましくは、該親糸状菌は、ＤＢＤの全部を有する、ネイティブなＡＣＥ３又はその改変体を発現し、かつセルラーゼ活性を有する菌である。

本発明で用いられる親糸状菌の例としては、限定ではないが、真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）に属する糸状菌が挙げられる。より詳細な例としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属等の糸状菌が挙げられる。このうち、トリコデルマ属の糸状菌が好ましい。

該トリコデルマ属の糸状菌（以下、トリコデルマ属菌とも呼ぶ）の例としては、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハリジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アトロヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、等が挙げられ、好ましくはトリコデルマ・リーセイ及びその変異株が挙げられる。例えば、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株及びその変異株、好ましくは、トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、トリコデルマ・リーセイＰＣＤ－１０株（ＦＥＲＭ Ｐ－８１７２）、トリコデルマ・リーセイＥ１ＡＢ１株（以下、ＪＮ１３株という場合もある）又はそれらの変異株などを、親糸状菌として好ましく用いることができる。Ｅ１ＡＢ１株は、トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株に対し、egl1プロモーターを用いてアスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）由来のβ―グルコシダーゼ（ＢＧＬ）を発現させた株である（Enzyme and Microbial Technology (2016) 82:89-95、及びＷＯ２０１３／１１５３０５の実施例１～３を参照）。

本発明の改変糸状菌が発現するＡＣＥ３改変体は、親ＡＣＥ３を、ＤＢＤの実質的に全部を欠損するように改変することで得ることができる。該親ＡＣＥ３は、ＤＢＤの一部又は全部を有する、ネイティブなＡＣＥ３又はその改変体などであり得る。好ましくは、該親ＡＣＥ３は、少なくともＤＢＤのＣ４を有する、ネイティブなＡＣＥ３又はその改変体などであり得る。好ましくは、該親ＡＣＥ３は、トリコデルマ属菌由来のＡＣＥ３又はその改変体である。該トリコデルマ属菌の例としては、上述したものを挙げることができるが、好ましくは、トリコデルマ・リーセイ、トリコデルマ・ハリジアウム、及びトリコデルマ・アトロヴィリデが挙げられる。

該親ＡＣＥ３の好ましい例としては、配列番号１～４のアミノ酸配列からなるＡＣＥ３又はその改変体が挙げられる。配列番号１は、トリコデルマ・リーセイの全長ＡＣＥ３のアミノ酸配列を表す。配列番号２は、トリコデルマ・リーセイのＤＢＤ部分（Ｃ２）欠損ＡＣＥ３改変体のアミノ酸配列を表す。配列番号３は、トリコデルマ・アトロヴィリデのＤＢＤ部分（Ｃ２）欠損ＡＣＥ３改変体のアミノ酸配列を表す。配列番号４は、トリコデルマ・ハリジアウムのＤＢＤ部分（Ｃ２）欠損ＡＣＥ３改変体のアミノ酸配列を表す。

該親ＡＣＥ３の別の好ましい例としては、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。該親ＡＣＥ３の別の好ましい例としては、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。これらの親ＡＣＥ３のポリペプチドは、ネイティブＡＣＥ３（例えば配列番号１）のＤＢＤの一部又は全部に相当する配列を有しており、好ましくはネイティブＡＣＥ３のように、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能し得る。

本発明の改変糸状菌が発現するＡＣＥ３改変体は、ＤＢＤの実質的に全部を欠損している。好ましくは、該ＡＣＥ３改変体は、少なくとも配列番号１の１２０～１６０位アミノ酸に相当する領域を欠損している。さらに、該ＡＣＥ３改変体は、ＤＢＤよりもＮ末端側の領域や、ＤＢＤよりもＣ末端側の領域が欠損していてもよい。一実施形態において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の１２０～１５１位アミノ酸に相当する領域を欠損している。一実施形態において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の１～１５１位アミノ酸に相当する領域を欠損している。一実施形態において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の１～１６０位アミノ酸に相当する領域を欠損している。一実施形態において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の１～２００位アミノ酸に相当する領域を欠損している。一実施形態において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の１～２４０位アミノ酸に相当する領域を欠損している。

該ＡＣＥ３改変体は、上記のＤＢＤ欠損に加えて、Ｃ末端領域が欠損していてもよい。Ｃ末端領域欠損の例としては、非特許文献５に開示されるタンパク質生産性向上をもたらす欠損である、Ｃ末端の７アミノ酸～１７アミノ酸の欠損が挙げられる。一実施形態において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１のアミノ酸配列におけるＣ末端の少なくとも７アミノ酸（７２８位～Ｃ末端）～最大１７アミノ酸（７１８位～Ｃ末端）に相当する領域が欠損していてもよい。一実施形態において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の－７～－１７位（７１８～７２８位）アミノ酸に相当するアミノ酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸が欠損していてもよい。一実施形態において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１のアミノ酸配列におけるＣ末端の１１アミノ酸（７２４位～Ｃ末端）に相当する領域が欠損していてもよい。一実施形態において、該ＡＣＥ３改変体は、親ＡＣＥ３に対してＣ末端の欠失を有さない。

好ましくは、該ＡＣＥ３改変体において、上述したＤＢＤを含む領域、及びＣ末端領域以外のアミノ酸は維持されている。
好ましい例において、該ＡＣＥ３改変体は、少なくとも配列番号１の２８０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する。より好ましくは、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２８０～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する。より好ましくは、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２８０～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する。該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２８０～７２７位アミノ酸に相当する領域を有していてもよい。
より好ましい例において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２６０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する。さらに好ましくは、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２６０～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する。さらに好ましくは、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２６０～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する。該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２６０～７２７位アミノ酸に相当する領域を有していてもよい。
さらに好ましい例において、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２５０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する。さらに好ましくは、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２５０～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する。さらに好ましくは、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２５０～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する。該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２５０～７２７位アミノ酸に相当する領域を有していてもよい。
さらに好ましい例において、、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２４１～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する。さらにより好ましくは、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２４１～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する。なお好ましくは、該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２４１～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する。該ＡＣＥ３改変体は、配列番号１の２４１～７２７位アミノ酸に相当する領域を有していてもよい。
好ましくは、上記に挙げた配列番号１の各アミノ酸領域に相当する領域は、それぞれ、当該配列番号１の各アミノ酸領域に対して少なくとも９０％配列同一であるか又は１００％配列同一である。

あるいは、Ｃ末端領域の欠損がない場合、該ＡＣＥ３改変体は、好ましくは配列番号１の２８０～７３４位アミノ酸に相当する領域を有し、より好ましくは配列番号１の２６０～７３４位アミノ酸に相当する領域を有し、さらに好ましくは配列番号１の２５０～７３４位アミノ酸に相当する領域を有し、さらに好ましくは配列番号１の２４１～７３４位アミノ酸に相当する領域を有する。好ましくは、上記に挙げた配列番号１の各アミノ酸領域に相当する領域は、それぞれ、当該配列番号１の各アミノ酸領域に対して少なくとも９０％配列同一であるか又は１００％配列同一である。

前述したＤＢＤの実質的に全部、さらに必要に応じてＣ末端領域を欠損したＡＣＥ３改変体（以下、目的のＡＣＥ３改変体ともいう）を発現させるように親糸状菌を改変する手段としては、例えば、目的のＡＣＥ３改変体をコードする外来の遺伝子を、親糸状菌に導入して発現させる方法、親糸状菌が本来有するＡＣＥ３をコードする遺伝子を、目的のＡＣＥ３改変体をコードする遺伝子へと変異させる方法、が挙げられる。

目的のＡＣＥ３改変体をコードする遺伝子（目的遺伝子）は、遺伝子工学的に、又は化学的に合成することができる。例えば、トリコデルマ属菌などの糸状菌のゲノムＤＮＡから親ＡＣＥ３をコードする遺伝子（親遺伝子）のＤＮＡを単離し、次いでＤＢＤをコードする領域の一部又は全部、さらに必要に応じてＣ末端領域をコードする部位を欠失させることで、目的遺伝子を調製することができる。親遺伝子の例としては、配列番号６～９のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％配列同一な配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。あるいは、公知の配列情報に基づいて、ＤＢＤをコードする領域の一部又は全部や、さらにＣ末端領域をコードする部位が欠失した目的遺伝子を化学合成することができる。ＡＣＥ３の配列情報は、ｎｃｂｉデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／］）などから入手可能である。必要に応じて、目的遺伝子は、それを導入する宿主（親糸状菌）にあわせてコドン至適化されてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（［ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／］）から入手可能である。

目的のＡＣＥ３改変体をコードする外来遺伝子を親糸状菌に導入する方法としては、例えば、組換えを利用した方法、及び、発現ベクターを用いる方法を挙げることができる。例えば、親糸状菌のゲノムの所与の領域を、相同組換え又は非相同組換えによって目的遺伝子と置き換えることができる。糸状菌用の発現ベクターの例としては、酵母発現ベクターｐＮＡＮ８１４２（Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９６，６０：３８３－３８９）、ｐＭＡ９１（Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８，６２：１６１５－１６１８）などが挙げられる。

親糸状菌のＡＣＥ３をコードする遺伝子を変異させる方法としては、例えば、組換えを利用した方法を挙げることができる。例えば、親糸状菌のゲノム中の親遺伝子を、相同組換え又は非相同組換えによって、目的のＡＣＥ３改変体をコードする遺伝子（目的遺伝子）と置き換えることができる。あるいは、ゲノム中の親遺伝子のＤＢＤコード領域を相同組換え又は非相同組換えによってＤＢＤ欠失断片と置き換えることで、親遺伝子を目的遺伝子へと変異させてもよい。

組換えの具体的な方法の例では、まず、目的遺伝子又はＤＢＤ欠失断片、及び必要に応じて薬剤耐性遺伝子又は栄養要求遺伝子を含む組換え用ＤＮＡコンストラクトを構築し、これを常法により親糸状菌に導入する。次いで、薬剤耐性又は栄養要求性などを指標にして、ゲノム上に該組換え用コンストラクトが組込まれた形質転換株を選択する。必要に応じて、ゲノム解析や酵素活性解析により、得られた形質転換株が目的の変異を有することを確認してもよい。

ＤＮＡコンストラクトの親糸状菌への導入には、プラスミド等の形質転換に一般的に使用されるベクターを用いることができる。細胞へのＤＮＡコンストラクトやベクターの導入は、例えばプロトプラスト法、プロトプラストＰＥＧ法、コンピテントセル法などの通常の手法を用いることができる。ＤＮＡコンストラクトの導入用のベクターとしては、宿主細胞内で安定に保持され増殖が可能なものであれば、特に限定されず、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣなどの通常用いられるベクターが挙げられる。このうち、プラスミドベクターが好ましい。導入用ベクターの例としては、ｐＵＣ１１８などが挙げられる。

好ましい実施形態において、本発明の改変糸状菌は、目的のＡＣＥ３改変体を高発現する。親糸状菌に対して、目的のＡＣＥ３改変体の発現を向上させるような改変をさらに行うことで、目的のＡＣＥ３改変体を高発現する改変糸状菌を得ることができる。該ＡＣＥ３改変体の発現を向上させる手段としては、該ＡＣＥ３改変体をコードする遺伝子（目的遺伝子）の転写量を向上させる手段が挙げられる。目的遺伝子の転写量を向上させる手段としては、例えば、親糸状菌のゲノム上の目的遺伝子の制御領域に、該遺伝子の転写を強く促進する制御領域（強制御領域）を置換又は挿入して、該強制御領域を目的遺伝子と作動可能に連結させることが挙げられる。あるいは、必要に応じて制御領域（好ましくは強制御領域）と作動可能に連結された目的遺伝子断片を、親糸状菌のゲノムもしくはプラスミド中に導入して細胞内で発現可能な目的遺伝子の数を増加させることで、目的遺伝子の転写量を向上させることができる。

該転写量の向上のために用いることができる制御領域の例としては、高グルコース条件下においても転写量が低下しない遺伝子、例えばトリコデルマ属菌については、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（gpd）、ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（pdc）、ｅｎｏｌａｓｅ（eno）、ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（adh）、ｔｒｉｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（tpi）、ａｌｄｏｌａｓｅ（fba）、ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ（pyk）、ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（cit）、α－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（kdh）、ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｉ（ald1）、ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ＩＩ（ald2）、ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（pda）、ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ（glk）、ａｃｔｉｎ（act1）、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １α（tef1）、などの遺伝子の制御領域が挙げられる。このうち、好ましい強制御領域の例としては、pdc遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿１２１５３４）のプロモーター、act1遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿４４５０４）のプロモーターなどが挙げられる。

好ましくは、本発明の改変糸状菌における目的のＡＣＥ３改変体の発現量は、親糸状菌におけるＡＣＥ３の発現量と比較して向上している。目的のＡＣＥ３改変体の発現量は、定量ＰＣＲ、マイクロアレイ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ等の公知の手段により、タンパク質の量又はそれをコードする遺伝子の転写量として定量することができる。

好ましくは、さらに本発明の改変糸状菌は、ＸＹＲ１（Ｘｙｌａｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ １）を発現する。より好ましくは、本発明の改変糸状菌は、ＸＹＲ１を高発現するように改変されている。ＸＹＲ１は、糸状菌におけるセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子である。ＸＹＲ１は、Ｚｎ（II）₂Ｃｙｓ₆ ｂｉｎｕｃｌｅａｒ ｃｌｕｓｔｅｒ ｄｏｍａｉｎを持つキシラナーゼ遺伝子発現制御の主要因子で、トリコデルマ属（ＸＹＲ１）、フサリウム属（ＸＹＲ１）、ニューロスポラ属（ＸＹＲ１）、アルペルギルス属（ＸＬＮＲ）などの酵母を除く子嚢菌に広く保存されている。トリコデルマ・リーセイのＸＹＲ１は、キシラナーゼ・キシロース代謝遺伝子、セルラーゼ遺伝子の全てを統御する。トリコデルマ・リーセイのＸＹＲ１は、ｎｃｂｉデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／］）において、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００６９６６０９２．１として登録されており、これは、配列番号１０のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされる、配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

本発明の改変糸状菌が高発現するＸＹＲ１の例としては、配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。該ＸＹＲ１の別の例としては、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列番号５のアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。これらのポリペプチドは、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能し得る。

本発明の改変糸状菌が高発現するＸＹＲ１は、変異ＸＹＲ１であってもよい。該変異ＸＹＲ１の好ましい例としては、配列番号５のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるＸＹＲ１のポリペプチド（親ＸＹＲ１）に対して、配列番号５の８１０～８３３位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸が変異（すなわち置換、欠失、挿入又は付加）した変異ＸＹＲ１が挙げられる。このような変異ＸＹＲ１としては、ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／０４２４８９に開示される変異ＸＹＲ１が挙げられる。

好ましくは、該変異ＸＹＲ１は、親ＸＹＲ１に対して、配列番号５の８１７位、８２１位、８２４位、８２５位及び８２６位に相当する位置におけるアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が置換されている。

より好ましくは、該変異ＸＹＲ１は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ以下からなる群より選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸を有する：
配列番号５の８１７位に相当する位置におけるＴｙｒ；
配列番号５の８２１位に相当する位置におけるＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＰｈｅ；
配列番号５の８２４位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＶａｌ；
配列番号５の８２５位に相当する位置におけるＴｙｒ；
配列番号５の８２６位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；

より好ましくは、該変異ＸＹＲ１は、親ＸＹＲ１に対して、配列番号５の８２１位に相当する位置におけるＶａｌがＰｈｅに置換された変異体（Ｖ８２１Ｆ）であるか、又は配列番号５の８２４位に相当する位置におけるＡｌａがＶａｌに置換された変異体（Ａ８２４Ｖ）である。

改変糸状菌においてＸＹＲ１を高発現させる手段としては、前述したＡＣＥ３改変体の高発現の手段と同じ手段を用いることができる。例えば、強制御領域と作動可能に連結させたＸＹＲ１をコードする外来遺伝子を導入して該改変糸状菌中で発現させるか、又は親糸状菌が本来有するゲノム上のＸＹＲ１遺伝子と強制御領域を作動可能に連結させるか、又は改変糸状菌が発現可能なＸＹＲ１遺伝子の数を増加させることができる。

以上の手順で製造された本発明の改変糸状菌は、前述したＤＢＤの実質的に全部を欠損したＡＣＥ３改変体を発現する。このような本発明の改変糸状菌は、セルラーゼ誘導性物質の非存在下でのタンパク質生産性が向上している。該改変糸状菌は、グルコース等のセルラーゼ非誘導性炭素源を主要な炭素源とする環境下でも、例えばセルラーゼ誘導性物質の非存在下でさえ、効率よくタンパク質を生産することができる。さらに、該改変糸状菌は、セルロース、ソホロース及びセロオリゴ糖などのセルラーゼ誘導性物質の非存在下であっても、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等のセルラーゼ系バイオマス分解酵素を発現することができる。

好ましい実施形態において、本発明の改変糸状菌は、該ＤＢＤの実質的に全部の欠損に加えて、前述したＣ末端領域の欠損を有するＡＣＥ３改変体を発現する。該ＤＢＤの欠損にＣ末端領域の欠損を組み合わせることで、該改変糸状菌のタンパク質生産性は相乗的に向上する。

別の好ましい実施形態において、本発明の改変糸状菌は、該ＤＢＤの実質的に全部を欠損したＡＣＥ３改変体の発現に加えて、前述したように、さらにＸＹＲ１を高発現する。該ＡＣＥ３改変体とＸＹＲ１の発現を組み合わせることで、改変糸状菌に生産されたタンパク質におけるセルラーゼ含有量が増加し、効率的なセルラーゼ生産が可能となる。

より好ましい実施形態において、本発明の改変糸状菌は、前述したＤＢＤの実質的に全部の欠損及びＣ末端領域の欠損を有するＡＣＥ３改変体を発現し、さらにＸＹＲ１を高発現する。このような改変糸状菌は、タンパク質生産性の向上と、生産されたタンパク質におけるセルラーゼ含有量の増加をともに実現する。

したがって、さらなる一態様において、本発明は、前述した本発明の改変糸状菌を用いたタンパク質の製造方法を提供する。本発明によるタンパク質の製造方法においては、本発明の改変糸状菌を培養する。培養により、培養物中に目的のタンパク質が生成、及び蓄積される。該培養物から目的タンパク質を分離することにより、目的タンパク質を製造することができる。

製造される目的タンパク質の例としては、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ系バイオマス分解酵素、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクターゼ、アミラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。該目的タンパク質は、１種類のタンパク質であっても、複数種のタンパク質の混合物であってもよい。好ましくは、該目的タンパク質は、セルラーゼ系バイオマス分解酵素であり、より好ましくはセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼであり、さらに好ましくはセルラーゼ及びヘミセルラーゼである。該ヘミセルラーゼの例としては、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、α－アラビノフラノシダーゼなどが挙げられ、このうちキシラナーゼが好ましい。

あるいは、該目的タンパク質は、糸状菌が本来生産しない異種タンパク質であってもよい。この場合は、本発明の改変糸状菌に対して、異種タンパク質をコードする遺伝子を挿入することで組換え糸状菌を作製し、この組換え糸状菌を培養することで異種タンパク質を含むタンパク質を得ることができる。さらに、該異種タンパク質をコードする遺伝子を糸状菌で機能する分泌シグナルペプチドと作動可能に連結させることによって、該異種タンパク質を培養物中に分泌生産させることができる。

当該タンパク質製造に使用される培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど、通常の糸状菌の増殖及びタンパク質生産に必要な成分を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。

炭素源としては、当該改変糸状菌が資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えばグルコース、フラクトース等の糖質、ソルビトールのような糖アルコール、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを挙げることができる。これらは単独で、又は複数を組み合わせて使用することができる。

好ましくは、本発明によるタンパク質の製造方法では、セルラーゼ非誘導性炭素源を主要な炭素源とする環境下で該改変糸状菌を培養する。セルラーゼ非誘導性炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、マルトース、グリセロールなどが挙げられる。このうち、コストの点でグルコースが好ましい。製造する目的タンパク質がセルラーゼ系バイオマス分解酵素である場合、本方法での培養は、セルロース、ソホロース及びセロオリゴ糖などのセルラーゼ誘導性物質の存在下で行ってもよいが、該誘導性物質の非存在下でも該目的タンパク質の高生産が可能であり、該誘導性物質の使用又は不使用の場合に限定されない。また本発明においては、カタボライト抑制をより低減しつつ、効率よくセルラーゼ系バイオマス分解酵素などのタンパク質を生産するため、グルコースなどの非誘導性炭素源を流加しながら該改変糸状菌を培養してもよい。このとき、該セルラーゼ非誘導性炭素源、例えばグルコースを、窒素源であるアンモニア水、又はアンモニウム塩を含有する水溶液に溶解させ、該溶解液を流加して培養することが、培養効率や培養中の泡立ちを抑制できる点から好ましい。

窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。

無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。

ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の改変糸状菌が生育に要求する物質を添加することができる。

培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、且つ好ましくは５０℃以下、より好ましくは４２℃以下、より好ましくは３５℃以下である。また、好ましくは１０～５０℃、より好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３５℃である。培養時のｐＨは３～９、好ましくは４～５である。培養時間は、１０時間～１０日間、好ましくは２～７日間である。

培養後、得られた培養物から、常法により目的タンパク質を分離する。例えば、培養物を回収し、必要に応じて超音波や加圧等による菌体破砕処理を行い、ろ過、遠心分離、限外ろ過、塩析、透析、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、該培養物から目的タンパク質を分離することができる。目的タンパク質の分離の程度は特に限定されない。例えば、培養上清やその粗分離精製物を、目的タンパク質を含む組成物として取得することができる。

本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

〔１〕改変糸状菌であって、
ＡＣＥ３改変体を発現し、
該ＡＣＥ３改変体が、ＡＣＥ３のＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の実質的に全部を欠損した改変体である、
改変糸状菌。
〔２〕好ましくは、前記ＡＣＥ３が、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１〕記載の改変糸状菌。
〔３〕好ましくは、前記Ｚｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、配列番号１の１２０～１６０位アミノ酸に相当する領域である、〔２〕記載の改変糸状菌。
〔４〕好ましくは、前記ＡＣＥ３改変体は、以下の（１）～（４）のいずれかである：
（１）前記ＤＢＤにおけるＣ２の一部又は全部の欠損と、Ｃ４の一部又は全部の欠損とを有する、ここで該Ｃ２は、配列番号１の１２０～１３１位に相当する領域であり、該Ｃ４は、配列番号１の１３２～１６０位に相当する領域であり、かつ該Ｃ４の一部は、好ましくは、Ｃ４中の少なくとも２つのＣｙｓを含む領域をいい、より好ましくは、Ｃ４中の少なくとも３つのＣｙｓを含む領域をいい、さらに好ましくは、Ｃ４中の４つのＣｙｓを含む領域をいい、さらに好ましくは、配列番号１の１３２～１５１位アミノ酸に相当する領域をいう；
（２）配列番号１の１２０～１６０位アミノ酸に相当する領域のアミノ酸配列の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上が欠損しており、かつ該領域中の６つのＣｙｓが欠損している；
（３）配列番号１の１２０～１５１位アミノ酸に相当する領域を欠損している；
（４）配列番号１の１～１５１位アミノ酸に相当する領域を欠損している、
あるいは、
より好ましくは、前記ＡＣＥ３改変体は、以下の（５）～（７）のいずれかである：
（５）配列番号１の１～１６０位アミノ酸に相当する領域を欠損している；
（６）配列番号１の１～２００位アミノ酸に相当する領域を欠損している；
（７）配列番号１の１～２４０位アミノ酸に相当する領域を欠損している、
〔２〕記載の改変糸状菌。
〔５〕前記ＡＣＥ３改変体が、
好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列におけるＣ末端の少なくとも７アミノ酸～最大１７アミノ酸に相当する領域が欠損している、
好ましくは、配列番号１の－７～－１７位アミノ酸に相当するアミノ酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸が欠損している、又は
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列におけるＣ末端の１１アミノ酸に相当する領域が欠損している、
〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載の改変糸状菌。
〔６〕前記ＡＣＥ３改変体が、
好ましくは、配列番号１の２８０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２８０～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２８０～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２８０～７２７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２６０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２６０～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２６０～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２６０～７２７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２５０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２５０～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２５０～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２５０～７２７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２４１～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２４１～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２４１～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する、又は、
好ましくは、配列番号１の２４１～７２７位アミノ酸に相当する領域を有する、
〔２〕～〔５〕のいずれか１項記載の改変糸状菌。
〔７〕好ましくは、前記ＡＣＥ３改変体を発現する遺伝子が導入されている、請求項〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の改変糸状菌。
〔８〕好ましくは、前記ＡＣＥ３改変体を発現する遺伝子が、該遺伝子の転写を促進する制御領域と作動可能に連結されており、
好ましくは、該制御領域が、pdcプロモーター及びact1プロモーターからなる群より選択される、
〔７〕記載の改変糸状菌。
〔９〕前記糸状菌が、
好ましくは、トリコデルマ属であり、
より好ましくは、トリコデルマ・リーセイ又はその変異株である、
〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の改変糸状菌。
〔１０〕前記改変糸状菌が、好ましくはＸＹＲ１又は変異ＸＹＲ１を発現し、より好ましくは変異ＸＹＲ１を発現し、
好ましくは、該ＸＹＲ１又は変異ＸＹＲ１が、配列番号５のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、
好ましくは、該変異ＸＹＲ１は、配列番号５のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列に対して、配列番号５の８１０～８３３位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸が変異しており、
より好ましくは、該変異ＸＹＲ１は、配列番号５のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列に対して、配列番号５の８１７位、８２１位、８２４位、８２５位及び８２６位に相当する位置におけるアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が置換されており、
さらに好ましくは、該変異ＸＹＲ１は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ以下からなる群より選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸を有する：
配列番号５の８１７位に相当する位置におけるＴｙｒ；
配列番号５の８２１位に相当する位置におけるＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＰｈｅ；
配列番号５の８２４位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＶａｌ；
配列番号５の８２５位に相当する位置におけるＴｙｒ；
配列番号５の８２６位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、
〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の改変糸状菌。

〔１１〕前記〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の改変糸状菌を培養することを含む、タンパク質の製造方法。
〔１２〕好ましくは、前記タンパク質がセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼである、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕好ましくは、前記培養がグルコース存在下で行われる、〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
〔１４〕好ましくは、前記培養がセルラーゼ誘導性物質の非存在下で行われる、〔１３〕記載の方法。

〔１５〕改変糸状菌の製造方法であって、
親糸状菌を、ＡＣＥ３改変体を発現させるように改変することを含み、
該ＡＣＥ３改変体が、ＡＣＥ３のＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）の実質的に全部を欠損した改変体である、
方法。
〔１６〕好ましくは、前記ＡＣＥ３が、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１５〕記載の方法。
〔１７〕好ましくは、前記Ｚｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、配列番号１の１２０～１６０位アミノ酸に相当する領域である、〔１６〕記載の方法。
〔１８〕好ましくは、前記ＡＣＥ３改変体は、以下の（１）～（４）のいずれかである：
（１）前記ＤＢＤにおけるＣ２の一部又は全部の欠損と、Ｃ４の一部又は全部の欠損とを有する、ここで該Ｃ２は、配列番号１の１２０～１３１位に相当する領域であり、該Ｃ４は、配列番号１の１３２～１６０位に相当する領域であり、かつ該Ｃ４の一部は、好ましくは、Ｃ４中の少なくとも２つのＣｙｓを含む領域をいい、より好ましくは、Ｃ４中の少なくとも３つのＣｙｓを含む領域をいい、さらに好ましくは、Ｃ４中の４つのＣｙｓを含む領域をいい、さらに好ましくは、配列番号１の１３２～１５１位アミノ酸に相当する領域をいう；
（２）配列番号１の１２０～１６０位アミノ酸に相当する領域のアミノ酸配列の８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上が欠損しており、かつ該領域中の６つのＣｙｓが欠損している；
（３）配列番号１の１２０～１５１位アミノ酸に相当する領域を欠損している；
（４）配列番号１の１～１５１位アミノ酸に相当する領域を欠損している、
あるいは、
より好ましくは、前記ＡＣＥ３改変体は、以下の（５）～（７）のいずれかである：
（５）配列番号１の１～１６０位アミノ酸に相当する領域を欠損している；
（６）配列番号１の１～２００位アミノ酸に相当する領域を欠損している；
（７）配列番号１の１～２４０位アミノ酸に相当する領域を欠損している、
〔１６〕記載の方法。
〔１９〕前記ＡＣＥ３改変体が、
好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列におけるＣ末端の少なくとも７アミノ酸～最大１７アミノ酸に相当する領域が欠損している、
好ましくは、配列番号１の－７～－１７位アミノ酸に相当するアミノ酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸が欠損している、又は
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列におけるＣ末端の１１アミノ酸に相当する領域が欠損している、
〔１６〕～〔１８〕のいずれか１項記載の方法。
〔２０〕前記ＡＣＥ３改変体が、
好ましくは、配列番号１の２８０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２８０～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２８０～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２８０～７２７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２６０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２６０～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２６０～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２６０～７２７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２５０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２５０～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２５０～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２５０～７２７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２４１～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２４１～７１７位アミノ酸に相当する領域を有する、
好ましくは、配列番号１の２４１～７２３位アミノ酸に相当する領域を有する、又は、
好ましくは、配列番号１の２４１～７２７位アミノ酸に相当する領域を有する、
〔１６〕～〔１９〕のいずれか１項記載の方法。
〔２１〕好ましくは、前記親糸状菌の改変が、前記ＡＣＥ３改変体を発現する遺伝子を該親糸状菌に導入することを含む、〔１５〕～〔２０〕のいずれか１項記載の方法。
〔２２〕好ましくは、前記ＡＣＥ３改変体を発現する遺伝子が、該遺伝子の転写を促進する制御領域と作動可能に連結されており、
好ましくは、該制御領域が、pdcプロモーター及びact1プロモーターからなる群より選択される、
〔２１〕記載の方法。
〔２３〕前記糸状菌が、
好ましくは、トリコデルマ属であり、
より好ましくは、トリコデルマ・リーセイ又はその変異株である、
〔１５〕～〔２２〕のいずれか１項記載の方法。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ 遺伝子導入用プラスミドＤＮＡの構築
トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにて、以下のＤＮＡ断片１～５を調製した。断片１：act1遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿４４５０４）の上流約１．５ｋｂｐのプロモーター領域、断片２：ＡＣＥ３の全長ポリペプチド（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号６、約２．９ｋｂｐ）、断片３：ＡＣＥ３のＤＢＤ部分欠損ポリペプチド（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７、約２．０ｋｂｐ）、断片４：ＸＹＲ１の全長ポリペプチド（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０、約３．０ｋｂｐ）、断片５：cbh1遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿４４５０４）の下流約０．６ｋｂｐのターミネーター領域、断片６：pyr4遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿７４０２０）の約２．７ｋｂｐ領域。

断片１と２を結合してカセット１：Ｐａｃｔ１－ＴｒＡＣＥ３（１－７３４）を構築した。断片１と３を結合してカセット２：Ｐａｃｔ１－ＴｒＡＣＥ３（１－６２９）を構築した。断片１と４を結合してカセット３：Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１を構築した。断片６の上流及び下流に、それぞれ約０．５ｋｂｐの断片７と約１．０ｋｂｐの断片８を、ポップアウト用の相同配列として配置した形質転換マーカー断片を調製した。断片５と該形質転換マーカー断片とを結合して、カセット４：Ｔｃｂｈ１－ｐｙｒ４を構築した。

ｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点に、ｓｍｉＩ制限酵素サイトを付与しながらrce1遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿７２６１１）の上流約１．５ｋｂｐ領域（断片９）及び下流約１．４ｋｂｐ領域（断片１０）を挿入したものを構築し、カセット５：ΔＲＣＥ１とした。また、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点に、ｓｍｉＩ制限酵素サイトを付与しながらace1遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿７５４１８）の上流約１．６ｋｂｐ領域（断片１１）及び下流約１．２ｋｂｐ領域（断片１２）を挿入したものを構築し、カセット６：ΔＡＣＥ１とした。

ＤＮＡ断片の結合はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って実施した。構築したカセット及びそれに含まれるＤＮＡ断片、ならびにカセットの構築に用いたプライマーを表１に示す。

カセット５のrce1遺伝子上流領域と下流領域の間に、表２のプライマーを用いたＰＣＲによりカセット１と４を結合したものを挿入し、全長ace3恒常発現プラスミドｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴｒＡＣＥ３（１－７３４）を構築した（プラスミド１）。カセット５のrce1遺伝子上流領域と下流領域の間に、表２のプライマーを用いたＰＣＲによりカセット２と４を結合したものを挿入し、ＤＢＤ部分欠損ace3恒常発現プラスミドｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴｒＡＣＥ３（１－６２９）を構築した（プラスミド２）。プラスミド１は、配列番号１からなるＴ．ｒｅｅｓｅｉの全長ＡＣＥ３を発現し、プラスミド２は、配列番号１に対してＤＢＤの一部（Ｃ２）を欠損したＡＣＥ３改変体を発現する（図１）。

カセット６のace1遺伝子上流領域と下流領域の間に、表２のプライマーを用いたＰＣＲによりカセット３と４を結合したものを挿入して、xyr1遺伝子恒常発現プラスミドｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１を構築した（プラスミド３）。プラスミド３は、キシラナーゼＸＹＲ１を発現する。

プラスミド１を鋳型とする表３のプライマーを用いたＰＣＲにより、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴｒＡＣＥ３（１６１－７３４）（プラスミド４）、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴｒＡＣＥ３（２０１－７３４）（プラスミド５）、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴｒＡＣＥ３（２４１－７３４）（プラスミド６）、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴｒＡＣＥ３（２８１－７３４）（プラスミド７）、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴｒＡＣＥ３（３００－７３４）（プラスミド８）をそれぞれ構築した。プラスミド４～８は、配列番号１に対してＮ末端側のＤＢＤを含む所定の領域を欠損したＡＣＥ３改変体を発現する（図１）。

トリコデルマ・アトロヴィリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）のＡＣＥ３ポリペプチドの改変体（配列番号３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８、約２．０ｋｂｐ）、トリコデルマ・ハリジアウム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）のＡＣＥ３ポリペプチドの改変体（配列番号４）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９、約２．０ｋｂｐ）を人工合成した。得られた断片を表４のプライマーを用いたＰＣＲによりプラスミド１と結合することで、それぞれｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴａＡＣＥ３（１－６３０）（プラスミド９）、及びｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴｈＡＣＥ３（１－６３０）（プラスミド１０）を構築した。プラスミド９～１０は、ＤＢＤの一部（Ｃ２）を欠損したＡＣＥ３改変体を発現する。

プラスミド９又はプラスミド１０を鋳型とする表４のプライマーを用いたＰＣＲにより、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴａＡＣＥ３（１３７－６３０）（プラスミド１１）、及びｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＴｈＡＣＥ３（１３７－６３０）（プラスミド１２）をそれぞれ構築した。プラスミド１１及び１２は、それぞれ配列番号３及び配列番号４のＡＣＥ３改変体に対してさらにＮ末端側１３６アミノ酸を欠損した、ＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変体を発現する。

プラスミド１を鋳型とする表５のプライマーを用いたＰＣＲにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＡＣＥ３（配列番号１）に対してＣ末端側の所定領域を欠損させたＡＣＥ３改変体を発現するプラスミド（プラスミド１３）を構築した。プラスミド２又は４を鋳型とする表５のプライマーを用いたＰＣＲにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＡＣＥ３（配列番号１）に対してＮ末端側及びＣ末端側の所定領域を欠損させたＡＣＥ３改変体を発現するプラスミド（プラスミド１４～１７）を構築した。また、プラスミド１を鋳型とする表５のプライマーを用いた２段階のＰＣＲにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＡＣＥ３（配列番号１）に対してＮ末端側及びＣ末端側の所定領域を欠損させたＡＣＥ３改変体を発現するプラスミド（プラスミド１８～１９）を構築した。プラスミド１３～１８に含まれるＡＣＥ３改変体の構成を図２に示す。

プラスミド３を鋳型とする表５のプライマーを用いたＰＣＲにより、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）を構築した（プラスミド２０）。これは、配列番号５のアミノ酸配列に対してＶ８２１Ｆのアミノ酸置換がなされた変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）をコードするプラスミドである。

本実施例で構築したプラスミド１～２０、それらに含まれる断片（カセット、プラスミド等）及びそれらの構築に使用したプライマー、ならびにそれらが発現するＡＣＥ３を表２～５に示す。

構築したプラスミドを複製した。コンピテントセルＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）に上記で作製したプラスミドを導入し、アンピシリン添加ＬＢ培地で培養した（３７℃、１日間）。培養後の菌体からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ^TMＰｌａｓｍｉｄ（マッハライ・ナーゲル）を用いてプラスミドを回収及び精製した。

実施例２ 改変糸状菌の作製
トリコデルマ・リーセイＥ１ＡＢ１（ＪＮ１３）のｐｙｒ４遺伝子欠損株（ＪＮ１３Δｐｙｒ４株）を実施例１で構築したプラスミド由来のＤＮＡ断片を導入して形質転換させた。実施例１で構築したプラスミドをｓｍｉＩ制限酵素サイトで切断することで線状化し、プロトプラストＰＥＧ法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２，１０９（１）：９２－９９）により親株に導入して形質転換した。形質転換体は、ｐｙｒ４遺伝子をマーカーとして、選択培地（２％グルコース、１．１Ｍソルビトール、２％アガー、０．２％ ＫＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ５．５）、０．０６％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０６％ ＣｓＣｌ₂、０．０６％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ１；％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ１の組成は以下のとおりである：０．５ｇ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ₂、０．１６ｇ ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、０．１４ｇ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。選抜した形質転換体の中から、目的の遺伝子断片がrce1ローカス又はace1ローカスに挿入されていることをＰＣＲにより確認し、目的の形質転換体を得た。

変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）、及びＡＣＥ３又はその改変体を発現する二重形質転換体を作製した。０．２％の５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）一水和物が含まれるＰＤＡ培地を用いてプラスミド２０を導入したＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）発現株を培養し、再度５－ＦＯＡ耐性を獲得し生育する株を選抜した。生育株をＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）Δｐｙｒ４株として取得した。取得された株に対し、上記ＡＣＥ３発現用プラスミド（プラスミド１～１９）を再度形質転換した。これらの株は、変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）及びＡＣＥ３又はその改変体を発現する。

実施例３ 改変糸状菌の培養
実施例２で得た糸状菌株を培養してタンパク質を生産させた。前培養では、５００ｍＬのフラスコに培地を５０ｍＬ仕込み、実施例２で作製した株の胞子を１×１０⁵個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。前培養の培地組成は以下の通りである。１％グルコース、０．１４％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．２％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０３％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．１％ハイポリペプトンＮ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ２、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ２の組成は以下の通りである。６ｍｇ Ｈ₃ＢＯ₃、２６ｍｇ （ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ₂・４Ｈ_２Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ₂を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。

２日間の前培養後、本培養を行った。５００ｍＬのフラスコに培地を５０ｍＬ仕込み、前培養液を１％（ｖ／ｖ％）植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて４日間培養した。本培養の培地組成は以下の通りである。３％グルコース、０．１４％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．２％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０３％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．１％ハイポリペプトンＮ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ２、１．２８％クエン酸水素二アンモニウム、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。

実施例４ ＤＢＤ欠損ＡＣＥ３の恒常発現がタンパク質生産に及ぼす効果
実施例２で作製した、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来全長ＡＣＥ３又はＤＢＤ欠損ＡＣＥ３改変体を恒常発現する形質転換体について、タンパク質生産性、及び生産したタンパク質の組成を評価した。

１）タンパク質生産性の評価
実施例３の培養物のタンパク質濃度をｂｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。ｂｒａｄｆｏｒｄ法では、Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、ウシγグロブリンを標準タンパク質として作成した検量線をもとにタンパク質量を計算した。グルコースのみを炭素源に用いた培養（グルコース培養）でのＪＮ１３のタンパク質生産性を１としたときの、各株の相対タンパク質生産性を計算した。

図３（Ａ）に各形質転換体の相対タンパク質生産性を示す。図３（Ａ）のとおり、全長ＡＣＥ３（ＴｒＡＣＥ３（１－７３４）；配列番号１）発現株（“１－７３４”）、及びＤＢＤの一部（Ｃ２）を欠損したＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１－６２９）；配列番号２）発現株（“１－６２９”）と比較して、配列番号１に対してＮ末端側１６０～２４０アミノ酸が欠損したＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１６１－７３４）、ＴｒＡＣＥ３（２０１－７３４）及びＴｒＡＣＥ３（２４１－７３４））を発現する株（“１６１－７３４”、“２０１－７３４”及び“２４１－７３４”）では、タンパク質生産性が向上した。なかでも、配列番号１に対してＮ末端側２４０アミノ酸が欠損している場合（“２４１－７３４”）にはタンパク質生産性が顕著に向上し、ＤＢＤ部分欠損株（“１－６２９”）と比較して約１．６倍の生産性を示した。一方、配列番号１に対してＮ末端側が２８０アミノ酸以上欠損したＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（２８１－７３４）及びＴｒＡＣＥ３（３００－７３４））を発現する株（“２８１－７３４”及び“３００－７３４”）では、タンパク質生産性向上効果は消失した。

２）タンパク質組成分析
実施例３の培養物のタンパク質組成を分析した。分析には、Ｍｉｎｉ ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｇｅｌｓ（Ａｎｙ ＫＤ，１５ｗｅｌｌ，ＢＩＯＲＡＤ）を用いた。スタンダードとして、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｓを用いた。適宜希釈した実施例３の培養物とＢｕｆｆｅｒを混合して９９℃で５分間処理したものをゲルにアプライし、２００Ｖ、３５分間電気泳動した。得られた画像ファイルから、解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ）を用いてバンド強度比率を計算し、生産された糖化酵素の組成比を計算した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ａ）で示したタンパク質生産性が向上したＤＢＤ欠損ＡＣＥ３改変体発現株（図３（Ｂ）中“１６１－７３４”、“２０１－７３４”及び“２４１－７３４”）において、主要なセルラーゼであるＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ１の増加が確認された。すなわち、ＤＢＤ欠損ＡＣＥ３改変体によるタンパク質生産性向上は、主にセルラーゼ成分の増加によるものであることが示された。

実施例５ 他のトリコデルマ属由来ＡＣＥ３におけるＤＢＤ欠損効果
実施例２で作製した形質転換体が発現するＴ．ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ及びＴ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ由来のＤＢＤ部分欠損ＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１－６２９）：配列番号２、ＴａＡＣＥ３（１－６３０）：配列番号３、及びＴｈＡＣＥ３（１－６３０）：配列番号４）、及びＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（２４１－７３４、ＴａＡＣＥ３（１３１－６３０）及びＴｈＡＣＥ３（１３１－６３０））の、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ全長ＡＣＥ３（ＴｒＡＣＥ３（１－７３４）：配列番号１）に対するアミノ酸配列のアライメントを、図４に示した。配列アライメントから、Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ及びＴ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ由来のＤＢＤ部分欠損ＡＣＥ３改変体（ＴａＡＣＥ３（１－６３０）及びＴｈＡＣＥ３（１－６３０））の配列は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来ＤＢＤ部分欠損ＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１－６２９））の配列に相当することが示された。同様に、Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ及びＴ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ由来のＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変体（ＴａＡＣＥ３（１３１－６３０）及びＴｈＡＣＥ３（１３１－６３０））の配列は、配列番号１のＮ末端側２４０アミノ酸が欠損しているＴ．ｒｅｅｓｅｉ由来ＤＢＤ部分欠損ＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（２４１－７３４））の配列に相当することが示された。

上記のＴ．ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ及びＴ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ由来ＤＢＤ部分又は完全欠損ＡＣＥ３改変体を恒常発現する形質転換体について、実施例４、１）と同様の手法でタンパク質生産性を評価した。結果を図５（Ａ）に示す。Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ及びＴ．ｈａｒｚｉａｎｕｍのＡＣＥ３においても、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＡＣＥ３と同様に、ＤＢＤ部分欠損ＡＣＥ３改変体の発現株と比較して、ＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変体の発現株ではタンパク質生産性が向上した。また、実施例４、２）と同様の手法でＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した結果、図５（Ｂ）に示すとおり、図３（Ｂ）と同様に主要なセルラーゼであるＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ１の増加が確認された。したがって、ＤＢＤ欠損ＡＣＥ３改変体によるセルラーゼ生産性向上は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＡＣＥ３のみならず、他のトリコデルマ属菌種のＡＣＥ３においても生じることが示された。

実施例６ ＤＢＤ欠損とＣ末端欠損ＡＣＥ３恒常発現の相乗効果
ＡＣＥ３のＣ末端欠損によるセルラーゼ生産性向上効果が報告されている（特許文献４及び非特許文献５）。本実施例では、実施例２で作製した、配列番号１に対しＣ末端１１アミノ酸を欠損したＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１－７２３））、Ｃ末端欠損かつＤＢＤ部分欠損のあるＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１－６１８））、Ｃ末端欠損かつＤＢＤ完全欠損のあるＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１６１－７２３））を恒常発現する形質転換体について、実施例４、１）と同様の手法でタンパク質生産性を評価した。結果を図６（Ａ）に示す。同等のＣ末端欠損を有する場合でも、Ｎ末端欠損なし又はＤＢＤ部分欠損ＡＣＥ３改変体の発現株と比較して、ＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変体の発現株ではタンパク質生産性が大幅に向上した。さらに図３（Ａ）及び６（Ａ）からは、ＤＢＤ欠損とＣ末端欠損の組み合わせにより、タンパク質生産性に対して予想外の高い相乗効果が得られたことが分かった。また、実施例４、２）と同様の手法でＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した結果、図６（Ｂ）に示すとおり、図３（Ｂ）と同様に主要なセルラーゼであるＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ１の増加が確認された。したがって、ＡＣＥ３におけるＤＢＤの完全欠損はＣ末端欠損よりも高いセルラーゼの生産性向上効果が発揮されること、さらにＤＢＤの完全欠損とＣ末端欠損との組み合わせにより効果が相乗的に増加することが明らかになった。

実施例７ ＤＢＤ欠損ＡＣＥ３と変異型ＸＹＲ１恒常発現との組合せ効果
実施例２で作製した変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）発現株、及び変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）と、ＡＣＥ３又はその改変体とを恒常発現する二重形質転換体について、実施例４、１）及び２）と同様の手法でタンパク質生産性を評価した。

ＪＮ１３株に比べ、変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）発現株ではタンパク質生産性が向上した。二重形質転換体については、変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）単独発現株と比べて、全長ＡＣＥ３（ＴｒＡＣＥ３（１－７３４））共発現株のタンパク質生産性向上は僅かであったが、ＤＢＤ部分欠損ＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１－６２９））共発現株のタンパク質生産性は約１.５倍に向上した。Ｖ８２１Ｆと、ＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変（ＴｒＡＣＥ３（１６１－７３４）、ＴｒＡＣＥ３（２０１－７３４）又はＴｒＡＣＥ３（２４１－７３４））との共発現株のタンパク質生産性は、Ｖ８２１ＦとＤＢＤ部分欠損体（ＴｒＡＣＥ３（１－６２９））との共発現株と同等であり、さらなる生産量の増加は確認されなかった。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図７（Ａ）に示した。また生産された糖化酵素の組成比を図７（Ｂ）に示した。変異型ＸＹＲ１とＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変体を恒常発現する株では、タンパク質生産性の向上だけでなく、主要なセルラーゼであるＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ１の含有比が増加していた。一方、実施例４（図３）の結果と同様に、Ｎ末端側が２８０アミノ酸以上欠損したＡＣＥ３改変体を発現する株では、タンパク質生産性及びセルラーゼ含有比向上の効果は消失した。したがって、変異型ＸＹＲ１と、特定のＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変体との共発現により、既存の変異型ＸＹＲ１とＡＣＥ３又はその改変体との共発現と比較して、タンパク質生産性及び生産したタンパク質中のセルラーゼ含有量をより向上させることができ、よってより効率的なセルラーゼ生産が可能となることが示された。

実施例８ ＤＢＤ欠損及びＣ末端欠損ＡＣＥ３と変異型ＸＹＲ１恒常発現との組合せ効果
実施例７と同様の手順で、実施例２で作製した変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）とＤＢＤ及びＣ末端欠損ＡＣＥ３改変体とを恒常発現する二重形質転換体について、実施例４、１）及び２）と同様の手法でタンパク質生産性を評価した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図８（Ａ）に示した。また生産された糖化酵素の組成比を図８（Ｂ）に示した。変異ＸＹＲ１とＤＢＤ完全欠損かつＣ末端欠損ＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１６１－７２３））とを恒常発現する株は、タンパク質生産性が高く、かつ最も高いセルラーゼ含有比を示した。変異ＸＹＲ１とＣ末端欠損との組み合わせにおいても、ＡＣＥ３のＤＢＤの完全欠損がセルラーゼ含有比向上に有効であることが分かった。一方、他のＣ末端欠損ＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１－７２３）、ＴｒＡＣＥ３（１－６１８）、ＴｒＡＣＥ３（１－５９５）、ＴｒＡＣＥ３（１－４５５）、ＴｒＡＣＥ３（３００－５２２）、又はＴｒＡＣＥ３（３００－５６０））では、Ｃ末端欠損のないＤＢＤ部分欠損ＡＣＥ３改変体（ＴｒＡＣＥ３（１－６２９））と比べてタンパク質生産量の増加は確認されなかった。

以上のとおり、Ｚｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を完全欠損したＡＣＥ３改変体の恒常発現は、誘導性物質の非存在下における微生物のタンパク質生産性を顕著に向上させた。このようなＡＣＥ３改変体は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのみならず、他のトリコデルマ属菌においても有効であり、また既知の有効変異であるＣ末端欠損や、変異ＸＹＲ１（例えばＶ８２１Ｆ）との組合せにおいても有効であった。したがって、上記ＤＢＤ完全欠損ＡＣＥ３改変体の恒常発現により、グルコースなどのセルラーゼ非誘導性炭素源を用いた培養下で、微生物におけるセルラーゼプロモーターを高活性化させ、高効率なタンパク質生産が実現できることが示された。

Claims (21)

1. 改変糸状菌であって、
   ＡＣＥ３改変体を発現し、
   該ＡＣＥ３改変体が、ＡＣＥ３のＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメインの実質的に全部を欠損した改変体である、
   改変糸状菌。
2. 前記ＡＣＥ３が、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の改変糸状菌。
3. 前記Ｚｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１の１２０～１６０位アミノ酸に相当する領域である、請求項２記載の改変糸状菌。
4. 前記ＡＣＥ３改変体が、配列番号１の１～１６０位アミノ酸に相当する領域を欠損している、請求項２記載の改変糸状菌。
5. 前記ＡＣＥ３改変体が、配列番号１の２８０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、請求項２～４のいずれか１項記載の改変糸状菌。
6. 前記ＡＣＥ３改変体が、配列番号１のアミノ酸配列におけるＣ末端の１１アミノ酸に相当する領域を欠損している、請求項２～５のいずれか１項記載の改変糸状菌。
7. 前記ＡＣＥ３改変体を発現する遺伝子が導入されている、請求項１～６のいずれか１項記載の改変糸状菌。
8. 前記ＡＣＥ３改変体を発現する遺伝子が該遺伝子の転写を促進する制御領域と作動可能に連結されている、請求項７記載の改変糸状菌。
9. 前記糸状菌がトリコデルマ属である、請求項１～８のいずれか１項記載の改変糸状菌。
10. 請求項１～９のいずれか１項記載の改変糸状菌を培養することを含む、タンパク質の製造方法。
11. 前記タンパク質がセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼである、請求項１０記載の方法。
12. 前記培養がグルコース存在下で行われる、請求項１０又は１１記載の方法。
13. 改変糸状菌の製造方法であって、
    親糸状菌を、ＡＣＥ３改変体を発現させるように改変することを含み、
    該ＡＣＥ３改変体が、ＡＣＥ３のＺｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメインの実質的に全部を欠損した改変体である、
    方法。
14. 前記ＡＣＥ３が、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１３記載の方法。
15. 前記Ｚｎ（II）₂Ｃｙｓ₆型ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１の１２０～１６０位アミノ酸に相当する領域である、請求項１４記載の方法。
16. 前記ＡＣＥ３改変体が、配列番号１の１～１６０位アミノ酸に相当する領域を欠損している、請求項１４記載の方法。
17. 前記ＡＣＥ３改変体が、配列番号１の２８０～７０１位アミノ酸に相当する領域を有する、請求項１４～１６のいずれか１項記載の方法。
18. 前記ＡＣＥ３改変体が、配列番号１のアミノ酸配列におけるＣ末端の１１アミノ酸に相当する領域を欠損している、請求項１４～１７のいずれか１項記載の方法。
19. 前記親糸状菌の改変が、前記ＡＣＥ３改変体を発現する遺伝子を該親糸状菌に導入することを含む、請求項１３～１８のいずれか１項記載の方法。
20. 前記ＡＣＥ３改変体を発現する遺伝子が、該遺伝子の転写を促進する制御領域と作動可能に連結されている、請求項１９記載の方法。
21. 前記糸状菌がトリコデルマ属である、請求項１３～２０のいずれか１項記載の方法。

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