JP2022160449A - 胎盤幹細胞を用いる血管形成 - Google Patents

Abstract

【課題】単離された胎盤幹細胞、該胎盤幹細胞の集団、並びにそれらを用いて、血管形成を促進する方法、及び循環器系の疾患又は障害、例えば、血管形成を促進することによって治療可能な疾患又は障害を治療する方法を提供する。【解決手段】単離された胎盤由来接着細胞であって、ここで、該細胞は、組織培養プラスチックに接着し、かつ該細胞は、フローサイトメトリーで決定した場合、CD10+、CD34-、CD105+、及びCD200+であり、かつ該細胞は、（1）内皮細胞の増殖を促進するか；（2）内皮細胞の集団内での新芽もしくは管状構造の形成を促進するか；又は（3）内皮細胞の遊走を促進する、前記単離された胎盤由来接着細胞である。【選択図】図１

Description

（1.分野）
本明細書でPDACと呼ばれる、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば、胎盤幹細
胞を用いて、血管形成を促進する方法、及び循環器系の疾患又は障害、例えば、不十分な
血管新生もしくは血流と関連するか又はそれらに起因する、或いは血管形成を促進するこ
とによって治療可能な、疾患又は障害を治療する方法が本明細書で提供される。

（2.背景）
胎盤は、特に魅力的な幹細胞の供給源である。哺乳動物の胎盤はボリュームがあり、通
常、医療廃棄物として捨てられるので、それらは、医療上有用な幹細胞の独特の供給源で
ある。そのような単離された胎盤幹細胞、該胎盤幹細胞の集団、並びにそれらを用いて、
血管形成を促進する方法、及び循環器系の疾患又は障害、例えば、血管形成を促進するこ
とによって治療可能な疾患又は障害を治療する方法が本明細書で提供される。

（3.概要）
一態様では、循環器系の疾患又は障害を有する個体を治療する方法であって、該個体に
、本明細書でPDAC（胎盤由来接着細胞、例えば、下の第5.2節に記載の胎盤由来接着細胞
）とも呼ばれる、組織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞の治療有効
量を、該疾患又は障害の1以上の症状の検出可能な改善に十分な量及び時間で投与するこ
とを含む、方法が本明細書で提供される。しかしながら、本明細書に記載のPDACは、その
開示がその全体として引用により本明細書中に組み込まれている、2009年11月19日に出願
された「羊膜由来血管形成細胞（Amnion Derived Angiogenic Cells）」という表題の係
属米国特許出願第12／622,352号に記載されている羊膜由来接着細胞ではない。特定の実
施態様では、本方法は、PDACを、該個体に、心機能の1以上の兆候の検出可能な改善に十
分な量及び時間で投与することを含み、ここで、該心機能の兆候は、該PDACの投与前の該
個体と比較したときの、胸部心拍出量（CO）、心係数（CI）、肺動脈楔入圧（PAWP）、心
係数（CI）、％短縮率（％FS）、駆出率（EF）、左室駆出率（LVEF）；左室拡張末期径（
LVEDD）、左室収縮末期径（LVESD）、収縮力（dP／dt）、心房機能もしくは心室機能の低
下、ポンプ効率の増大、ポンプ効率の損失率の低下、血行動態機能の損失の減少、又は心
筋症と関連する合併症の減少である。

他の実施態様では、該循環器系の疾患又は障害は、心筋梗塞である。別の実施態様では
、該疾患又は障害は、心筋症である。他の実施態様では、該疾患又は障害は、動脈瘤、狭
心症（angina）、大動脈狭窄、大動脈炎、不整脈、動脈硬化症、動脈炎、非対称性心室中
隔肥大（ASH）、アテローム動脈硬化症、心房細動及び粗動、細菌性心内膜炎、バーロー
症候群（僧帽弁逸脱症）、徐脈、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、心肥大、心臓炎、
頸動脈疾患、大動脈縮窄症、先天性心欠損、先天性心不全、冠動脈疾患、アイゼンメンガ
ー症候群、塞栓症、心内膜炎、先端紅痛症、細動、線維筋性形成異常、心ブロック、心雑
音、高血圧症、低血圧症、特発性乳児動脈石灰化、川崎病（皮膚粘膜リンパ節症候群、皮
膚粘膜リンパ節疾患、乳児多発性動脈炎）、メタボリックシンドローム、微小血管狭心症
、心筋炎、発作性心房頻拍（PAT）、結節性動脈周囲炎（多発性動脈炎、結節性多発性動
脈炎）、心膜炎、末梢血管疾患、重症肢虚血、静脈炎、肺動脈弁狭窄（肺動脈狭窄）、レ
イノー病、腎動脈狭窄、腎血管性高血圧症、リウマチ性心疾患、糖尿病性血管症、中隔欠
損、無症候性虚血、X症候群、頻脈、高安動脈炎、ファローの四徴症、大血管転位症、三
尖弁閉鎖症、総動脈幹症、心臓弁膜症、静脈瘤性潰瘍、静脈瘤、血管炎、心室中隔欠損、
ウルフ-パーキンソン-ホワイト症候群、心内膜床欠損、急性リウマチ熱、急性リウマチ性
心膜炎、急性リウマチ性心内膜炎、急性リウマチ性心筋炎、慢性リウマチ性心疾患、僧帽
弁の疾患、僧帽弁狭窄、リウマチ性僧帽弁閉鎖不全症、大動脈弁の疾患、他の心内膜構造
の疾患、虚血性心疾患（急性及び亜急性）、狭心症（angina pectoris）、急性肺性心疾
患、肺塞栓症、慢性肺性心疾患、脊柱後側弯性心疾患、心筋炎、心内膜炎、心内膜心筋線
維症、心内膜弾性線維症、房室ブロック、心律動障害、心筋変性、脳血管疾患、動脈、細
動脈、及び毛細血管の疾患、又は静脈及びリンパ管の疾患である。

他の具体的な実施態様では、該疾患又は障害は、前大脳動脈の閉塞及び狭窄、又は大脳
動脈の閉塞である。一態様では、個体の脳又はその周辺の血流の途絶を有する、例えば、
個体の脳もしくは中枢神経系（CNS）又はそれらの周辺の血流の途絶に起因する症状又は
神経学的欠損を有する個体を治療する方法であって、該個体に、単離された胎盤細胞（例
えば、PDAC）の治療有効量を投与することを含む、方法が本明細書で提供される。特定の
実施態様では、該血流の途絶は、個体の脳又はCNSの酸素欠乏傷害又は低酸素傷害をもた
らす。

他の具体的な実施態様では、該疾患又は障害は、末梢動脈の閉塞及び狭窄である。一態
様では、肢又はその周辺の血流の途絶を有する、例えば、個体の末梢血管系又はその周辺
の血流の途絶に起因する症状又は血管欠損を有する個体を治療する方法であって、該個体
に、単離されたPDACの治療有効量を投与することを含む、方法が本明細書で提供される。
特定の実施態様では、該血流の途絶は、個体の肢及び又は四肢の酸素欠乏傷害又は低酸素
傷害をもたらす。

治療方法の別の具体的な実施態様では、該細胞は、注射によって該個体に投与される。
より具体的な実施態様では、該注射は、個体の心臓の虚血領域への注射である。治療方法
の別の具体的な実施態様では、該細胞は、静脈内注入によって該個体に投与される。治療
方法の別の具体的な実施態様では、該細胞、又は該細胞の集団、又は該細胞を含む細胞の
集団は、上記の胎盤由来接着細胞を含むマトリックス又はスキャフォールドの該個体への
埋め込みによって、該個体に投与される。

特定の実施態様では、該胎盤細胞は、該個体に静脈内投与される。他の実施態様では、
治療方法は、少なくとも約1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、又は1×1
0¹⁰個の胎盤細胞を該個体に投与することを含む。別の具体的な実施態様では、本明細書
に記載の該胎盤細胞は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18
、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38
、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、又は50回以下の集団倍加の間、インビ
トロで増殖させたものである。別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞は
いずれも、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、1
8、19、もしくは20回、又はそれより多くの回数継代された該細胞の培養物由来のもので
ある。本明細書における実施態様のいずれかの別の実施態様では、該胎盤細胞は、凍結保
存され、該投与することの前に解凍されたものである。

他の実施態様では、該胎盤細胞は、凍結保存され、該接触させることの前に解凍された
ものである。

上記の方法のいずれかの特定の実施態様では、該胎盤細胞は、組織培養プラスチックに
接着し、かつフローサイトメトリーで検出した場合、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、及びCD200⁺
である。特定の実施態様では、胎盤細胞は、骨形成細胞又は軟骨形成細胞に分化する能力
を有する。別の実施態様では、該胎盤細胞は、組織培養プラスチックに接着し；フローサ
イトメトリーで検出した場合、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、及びCD200⁺であり；かつ骨形成細
胞又は軟骨形成細胞の1以上の特徴、例えば、骨細胞又は軟骨細胞の特徴を有する細胞に
分化する能力を有する。他の実施態様では、胎盤細胞はさらに、神経細胞又は神経形成細
胞の1以上の特徴、例えば、ニューロンの特徴；グリア細胞の1以上の特徴、例えば、グリ
ア又は星状細胞の特徴；脂肪細胞系細胞（adipocytic cell）の1以上の特徴、例えば、脂
肪細胞（adipocyte）の特徴；膵臓細胞の1以上の特徴；及び／又は心臓細胞の1以上の特
徴を有する細胞に分化する能力を有する。

別の実施態様では、該胎盤細胞は、フローサイトメトリー及び／又はRT-PCRで検出した
場合、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、及びCD200⁺、かつCD38^-、CD45^-、CD80^-、CD86^-、CD133^-、
HLA-DR、DP、DQ^-、SSEA3^-、SSEA4^-、CD29⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、HLA-A、B、C
⁺、PDL1⁺、ABC-p⁺、及び／又はOCT-4⁺のうちの1つ又は複数である。別の実施態様では、
該胎盤細胞は、フローサイトメトリーで検出した場合、CD34^-、CD45^-、CD10⁺、CD90⁺、CD
105⁺、及びCD200⁺である。別の実施態様では、該胎盤細胞は、フローサイトメトリーで検
出した場合、CD34^-、CD45^-、CD10⁺、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、CD105⁺、及びCD200⁺である。
別の実施態様では、該胎盤細胞は、フローサイトメトリーで検出した場合、CD34^-、CD45^-
、CD10⁺、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、CD105⁺、及びCD200⁺、かつさらにCD29⁺、CD38^-、CD44⁺
、CD54⁺、SH3⁺、又はSH4⁺のうちの1つ又は複数である。別の実施態様では、該胎盤細胞は
、フローサイトメトリーで検出した場合、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、
CD54⁺、CD73⁺、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、CD105⁺、及びCD200⁺である。

別の実施態様では、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、及びCD200⁺胎盤細胞はさらに、CD117^-、
CD133^-、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、もしくはプログラム死-1リ
ガンド（PDL1）⁺のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組合せである。別の具体
的な実施態様では、該胎盤細胞は、フローサイトメトリーで検出した場合、CD34^-、CD38^-
、CD45^-、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD73⁺、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、CD105⁺、CD117^-
、CD133^-、CD200⁺、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、又はプログラム
死-1リガンド（PDL1）⁺である。

別の実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞はいずれもさらに、フローサイトメトリ
ーで検出した場合、ABC-p⁺、又は例えば、RT-PCRで決定した場合、OCT-4⁺（POU5F1⁺）で
あり、ここで、ABC-pは、胎盤特異的ABC輸送体タンパク質（乳癌耐性タンパク質（BCRP）
及びミトキサントロン耐性タンパク質（MXR）としても知られる）である。別の実施態様
では、本明細書に記載の胎盤細胞はいずれもさらに、例えば、フローサイトメトリーで決
定した場合、SSEA3^-又はSSEA4^-であり、ここで、SSEA3はステージ特異的胚抗原3であり、
かつSSEA4はステージ特異的胚抗原4である。別の実施態様では、本明細書に記載の胎盤細
胞はいずれもさらに、SSEA3^-及びSSEA4^-である。

本明細書に記載の方法の別の実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞はいずれもさら
に、MHC-I⁺（例えば、HLA-A、B、C⁺）、MHC-II^-（例えば、HLA-DP、DQ、DR^-）、又はHLA-
G^-のうちの1つ又は複数である。別の実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞はいずれ
もさらに、MHC-I⁺（例えば、HLA-A、B、C⁺）、MHC-II^-（例えば、HLA-DP、DQ、DR^-）、及
びHLA-G^-の各々である。

別の実施態様では、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺細胞はさらに、CD29⁺、CD38^-、CD44
⁺、CD54⁺、CD80^-、CD86^-、SH3⁺、又はSH4⁺のうちの1つ又は複数である。別の実施態様で
は、該細胞はさらに、CD44⁺である。別の実施態様では、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺
胎盤細胞はさらに、CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD62E^-、CD62L
^-、CD62P^-、SH3⁺（CD73⁺）、SH4⁺（CD73⁺）、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺（CD105⁺）、CD
106／VCAM⁺、CD117^-、CD144／VE-カドヘリン^low、CD184／CXCR4^-、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA
3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、HLA-G^-、又は
プログラム死-1リガンド（PDL1）⁺のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組合せ
である。別の実施態様では、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞はさらに、CD13⁺、C
D29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54／ICAM⁺、CD62E^-、CD62L^-、CD62P^-、SH3⁺（CD7
3⁺）、SH4⁺（CD73⁺）、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺（CD105⁺）、CD106／VCAM⁺、CD117^-、
CD144／VE-カドヘリン^dim、CD184／CXCR4^-、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、
KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、HLA-G^-、及びプログラム死-1リガン
ド（PDL1）⁺である。

本明細書に開示されている方法の他の実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD200⁺及
びHLA-G^-；CD73⁺、CD105⁺、及びCD200⁺；CD200⁺及びOCT-4⁺；CD73⁺、CD105⁺、及びHLA-G^-
；CD73⁺及びCD105⁺；もしくはOCT-4⁺；又はそれらの任意の組合せである。

本明細書に開示されている方法の特定の実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD10⁺
、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSE
A4^-、OCT-4⁺、MHC-I⁺、又はABC-p⁺のうちの1つ又は複数であり、ここで、ABC-pは、胎盤
特異的ABC輸送体タンパク質（乳癌耐性タンパク質（BCRP）及びミトキサントロン耐性タ
ンパク質（MXR）としても知られる）である。別の実施態様では、単離された胎盤細胞は
、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA
3^-、SSEA4^-、及びOCT-4⁺である。別の実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD10⁺、CD2
9⁺、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD54⁺、SH2⁺、SH3⁺、及びSH4⁺である。別の実施態様では、単
離された胎盤細胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD54⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、
及びOCT-4⁺である。別の実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、C
D38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、MHC-1⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺である。別の実施態様で
は、単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺及びABC-p⁺である。別の実施態様では、単離された胎
盤細胞は、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、及びOCT-4⁺である。別の実施態様では、単離された胎盤細
胞は、OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、及びSSEA4^-である。具体的な実施態様では、該OCT-4⁺、C
D34^-、SSEA3^-、及びSSEA4^-細胞はさらに、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、
CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、及びSH4⁺である。別の実施態様では、単離された胎盤細胞は、OCT-4
⁺及びCD34^-、かつSH3⁺又はSH4⁺のいずれかである。別の実施態様では、単離された胎盤細
胞は、CD34^-かつCD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺、又はOCT-4⁺のいずれかである。特
定の実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、及びCD200⁺である。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法において有用な単離された胎盤細胞は、CD10
⁺、CD29^-、CD44⁺、CD45^-、CD54／ICAM^-、CD62-E^-、CD62-L^-、CD62-P^-、CD80^-、CD86^-、CD
103^-、CD104^-、CD105⁺、CD106／VCAM⁺、CD144／VE-カドヘリン^dim、CD184／CXCR4^-、β2-
ミクログロブリン^dim、MHC-I^dim、MHC-II^-、HLA-G^dim、及び／又はPDL1^dimのうちの1つ又
は複数である。特定の実施態様では、そのような胎盤細胞は、少なくともCD29^-及びCD54^-
である。別の実施態様では、そのような単離された胎盤細胞は、少なくともCD44⁺及びCD1
06⁺である。別の実施態様では、そのような単離された胎盤細胞は、少なくともCD29⁺であ
る。

上記の特徴のいずれかの特定の実施態様では、細胞マーカー（例えば、分化抗原群（cl
uster of differentiation）又は免疫学的マーカー）の発現は、フローサイトメトリーで
決定される。特定の他の実施態様では、細胞マーカーの発現は、RT-PCRで決定される。

別の実施態様では、本明細書に開示されている方法において有用な該胎盤細胞、例えば
、該CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも検出可
能に高いレベルで1種以上の遺伝子を発現し、ここで、該1種以上の遺伝子は、ACTG2、ADA
RB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、D
SC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAM1、IER3、IGFBP7、
IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDL
IM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、及び
ZC3H12Aのうちの1つ又は複数であり、かつ該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離された胎盤
細胞が経た継代数と同等の培養継代数を経たものである。特定の実施態様では、該1種以
上の遺伝子の該発現は、例えば、RT-PCR、又は例えば、U133-Aマイクロアレイ（Affymetr
ix）を用いるマイクロアレイ解析によって決定される。別の実施態様では、該単離された
胎盤細胞は、60％DMEM-LG（例えば、Gibco製）及び40％MCDB-201（例えば、Sigma製）；2
％胎仔ウシ血清（例えば、Hyclone Labs.製）；1×インスリン-トランスフェリン-セレン
（ITS）；1×リノール酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）；10^-9Mデキサメタゾン（例えば
、Sigma製）；10^-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（例えば、Sigma製）；上皮成長因子1
0ng／mL（例えば、R&D Systems製）；並びに血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／mL（
例えば、R&D Systems製）を含む培地中で、例えば、約3～約35回の範囲の集団倍加の間、
培養したときに、該1種以上の遺伝子を発現する。別の実施態様では、該単離された胎盤
細胞は、60％DMEM-LG（例えば、Gibco製）及び40％MCDB-201（例えば、Sigma製）；2％胎
仔ウシ血清（例えば、Hyclone Labs.製）；1×インスリン-トランスフェリン-セレン（IT
S）；1×リノール酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）；10^-9Mデキサメタゾン（例えば、Si
gma製）；10^-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma）；上皮成長因子10ng／mL（例え
ば、R&D Systems製）；並びに血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／mL（例えば、R&D Sy
stems製）を含む培地中で、約3～約35回の集団倍加の間、培養したときに、該1種以上の
遺伝子を発現する。

特定の実施態様では、胎盤細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）よりも検
出可能に高いレベルで、CD200及びARTS1（1型腫瘍壊死因子のアミノペプチダーゼ調節因
子）；ARTS-1及びLRAP（白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ）；IL6（インターロ
イキン-6）及びTGFB2（形質転換成長因子、β2）；IL6及びKRT18（ケラチン18）；IER3（
即初期応答3）、MEST（中胚葉特異的転写産物ホモログ）及びTGFB2；CD200及びIER3；CD2
00及びIL6；CD200及びKRT18；CD200及びLRAP；CD200及びMEST；CD200及びNFE2L3（核因子
（赤血球由来2）-様3）；又はCD200及びTGFB2を発現し、ここで、該骨髄由来間葉系幹細
胞は、該単離された胎盤細胞が経た継代数と同等の培養継代数を経たものである。他の実
施態様では、胎盤細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞BM-MSCよりも検出可能に高いレ
ベルで、ARTS-1、CD200、IL6、及びLRAP；ARTS-1、IL6、TGFB2、IER3、KRT18、及びMEST
；CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2；ARTS-1、CD200、IER3、I
L6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2；又はIER3、MEST、及びTGFB2を発現し、こ
こで、該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離された胎盤細胞が経た継代数と同等の培養継代
数を経たものである。

ヒト細胞を用いるとき、全体を通じて遺伝子表記はヒト配列を指し、当業者に周知であ
るように、代表的な配列は、文献、又はGenBankに見出すことができる。該配列に対する
プローブは、公表されている配列によるか、又は市販供給源、例えば、特異的なTAQMAN（
登録商標）プローブもしくはTAQMAN（登録商標）Angiogenesis Array（Applied Biosyste
ms, 部品番号. 4378710）によって、決定することができる。

様々な実施態様では、本明細書に開示されている方法において有用な該単離された胎盤
細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞は、その細胞の少なくとも10％、15％、20
％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％
、90％、95％、98％、又は99％が該単離された胎盤細胞である細胞の集団内に含まれる。
特定の他の実施態様では、該細胞の集団内の胎盤細胞は、母親の遺伝子型を有する細胞を
実質的に含まず；例えば、該集団内の胎盤細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60
％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、胎児の遺伝子型を
有する、すなわち、胎児起源のものである。特定の他の実施態様では、該胎盤細胞を含む
細胞の集団は、母親の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例えば、該集団内の細胞
の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95
％、98％、又は99％は、胎児の遺伝子型を有する、すなわち、胎児起源のものである。特
定の他の実施態様では、該胎盤細胞を含む細胞の集団は、母親の遺伝子型を有する細胞を
含み；例えば、該集団内の細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％
、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99
％は、母親の遺伝子型を有する、すなわち、母親起源のものである。

本明細書における胎盤細胞（例えば、PDAC）の実施態様のいずれかの実施態様では、胎
盤細胞は、該単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にす
る条件下で培養したとき、例えば、増殖条件下で培養したとき、該集団内での1以上の胚
様体様体の形成を促進する。

特定の実施態様では、本明細書で提供される方法において有用な胎盤細胞（例えば、PD
AC）は、1～100ng／mLのVEGFへの4～21日間の曝露後に、免疫局在化によって検出した場
合、CD34を発現しない。具体的な実施態様では、該胎盤接着細胞は、組織培養プラスチッ
クに接着する。別の具体的な実施態様では、該細胞の集団は、血管形成因子、例えば、血
管内皮成長因子（VEGF）、上皮成長因子（EGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、又は塩
基性線維芽細胞成長因子（bFGF）の存在下、例えば、MATRIGEL（商標）などの基材の上で
培養したとき、新芽又は管状構造を形成する。

別の態様では、本明細書で提供されるPDAC、細胞の集団、例えば、PDACの集団、又は該
単離された細胞集団内の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、もし
くは98％がPDACである細胞の集団は、VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、
G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレクチン-1の
うちの1つもしくは複数、又は全てを、例えば、該細胞（単数又は複数）が成長する培養
培地中に分泌する。別の実施態様では、該PDACは、酸素正常条件（例えば、約20％又は約
21％のO₂）と比較して、低酸素条件（例えば、約5％未満のO₂）下で増大したレベルのCD2
02b、IL-8、及び／又はVEGFを発現する。

別の実施態様では、PDAC又は本明細書に記載のPDACを含む細胞の集団はいずれも、該胎
盤由来接着細胞と接触した内皮細胞の集団内での新芽又は管状構造の形成を引き起こすこ
とができる。具体的な実施態様では、胎盤由来血管形成細胞を、ヒト内皮細胞と共培養し
て、新芽又は管状構造を形成させるか、或いは例えば、細胞外マトリックスタンパク質、
例えば、コラーゲンI型及びIV型、並びに／又は血管形成因子、例えば、血管内皮成長因
子（VEGF）、上皮成長因子（EGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、もしくは塩基性線維
芽細胞成長因子（bFGF）の存在下、例えば、胎盤コラーゲン又はMATRIGEL（商標）などの
基材の中又はその上で、少なくとも4日間培養したとき、内皮細胞新芽を支持する。

本明細書に開示されている胎盤細胞のいずれかの特定の実施態様では、細胞は、ヒトの
ものである。

特定の実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性
細胞はいずれも、レシピエントにとって自己のものである。特定の他の実施態様では、本
明細書に記載の胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞はいずれも、レシピエ
ントにとって同種異系のものである。

特定の実施態様では、胎盤細胞は、該投与することの前に凍結保存される。別の実施態
様では、該単離された胎盤細胞は、胎盤細胞バンク（例えば、PDACバンク）から得られる
。

単離された胎盤細胞の上記の実施態様のいずれにおいても、単離された胎盤細胞は、通
常、成長培地、すなわち、増殖を促進するように調合された培地中で培養する間、例えば
、成長培地中での増殖の間、分化しない。別の実施態様では、該単離された胎盤細胞は、
増殖するためにフィーダー層を必要としない。別の実施態様では、該単離された胎盤細胞
は、単にフィーダー細胞層の非存在下での培養の結果として、培養で分化しない。

特定の実施態様では、該単離された胎盤細胞は、血液が抜かれ、かつ残留血液を取り除
くように灌流されているか；血液は抜かれているが、残留血液を取り除くように灌流され
ていないか；又は血液が抜かれておらず、残留血液を取り除くように灌流されてもいない
分娩後の胎盤の灌流によって得られる。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細
胞は、胎盤組織の物理的及び／又は酵素的破壊によって得られる。

本明細書で提供される方法において有用な、胎盤細胞の細胞表面マーカー、分子マーカ
ー、及び遺伝子マーカーは、下の第5.2節で詳細に記載されている。

上記の方法の別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、ボーラス注射で投
与される。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、静脈内注入で投与され
る。具体的な実施態様では、該静脈内注入は、約1～約8時間かかる静脈内注入である。別
の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、頭蓋内投与される。別の具体的な実
施態様では、該単離された胎盤細胞は、腹腔内投与される。別の具体的な実施態様では、
該単離された胎盤細胞は、動脈内投与される。治療方法の別の具体的な実施態様では、該
単離された胎盤細胞は、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内、又は眼内に投与される。

上記の方法の別の実施態様では、該単離された胎盤細胞は、該単離された胎盤細胞を含
む物質の組成物の該個体への外科的埋め込みによって投与される。具体的な実施態様では
、該物質の組成物は、マトリックス又はスキャフォールドである。別の具体的な実施態様
では、該マトリックス又はスキャフォールドは、ハイドロゲルである。別の具体的な実施
態様では、該マトリックス又はスキャフォールドは、脱細胞化組織である。別の具体的な
実施態様では、該マトリックス又はスキャフォールドは、合成された生体分解性組成物で
ある。別の具体的な実施態様では、該マトリックス又はスキャフォールドは、発泡体であ
る。

上記の方法の別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、該個体に1回投与
される。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、2回以上の個別投与で該
個体に投与される。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム
当たり約1×10⁴～1×10⁵個の単離された胎盤細胞、例えば、胎盤細胞を投与することを含
む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり約1×10⁵
～1×10⁶個の単離された胎盤細胞を投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該
投与することは、該個体のキログラム当たり約1×10⁶～1×10⁷個の単離された胎盤細胞を
投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラ
ム当たり約1×10⁷～1×10⁸個の単離された胎盤細胞を投与することを含む。他の具体的な
実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり約1×10⁶～約2×10⁶個の単
離された胎盤細胞；該個体のキログラム当たり約2×10⁶～約3×10⁶個の単離された胎盤細
胞；該個体のキログラム当たり約3×10⁶～約4×10⁶個の単離された胎盤細胞；該個体のキ
ログラム当たり約4×10⁶～約5×10⁶個の単離された胎盤細胞；該個体のキログラム当たり
約5×10⁶～約6×10⁶個の単離された胎盤細胞；該個体のキログラム当たり約6×10⁶～約7
×10⁶個の単離された胎盤細胞；該個体のキログラム当たり約7×10⁶～約8×10⁶個の単離
された胎盤細胞；該個体のキログラム当たり約8×10⁶～約9×10⁶個の単離された胎盤細胞
；又は該個体のキログラム当たり約9×10⁶～約1×10⁷個の単離された胎盤細胞を投与する
ことを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり
約1×10⁷～約2×10⁷個の単離された胎盤細胞を該個体を投与することを含む。別の具体的
な実施態様では、該投与することは、該個体のキログラム当たり約1.3×10⁷～約1.5×10⁷
個の単離された胎盤細胞を該個体を投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該
投与することは、該個体のキログラム当たり最大約3×10⁷個の単離された胎盤細胞を該個
体を投与することを含む。具体的な実施態様では、該投与することは、約5×10⁶～約2×1
0⁷個の単離された胎盤細胞を該個体を投与することを含む。別の具体的な実施態様では、
該投与することは、約20ミリリットルの溶液中の約150×10⁶個の単離された胎盤細胞を該
個体を投与することを含む。

具体的な実施態様では、該投与することは、約5×10⁶～約2×10⁷個の単離された胎盤細
胞を該個体に投与することを含み、ここで、該細胞は、10％デキストラン、例えば、デキ
ストラン-40、5％ヒト血清アルブミン、及び任意で免疫抑制剤を含む溶液中に含まれる。

別の具体的な実施態様では、該投与することは、約5×10⁷～3×10⁹個の単離された胎盤
細胞を静脈内投与することを含む。具体的な実施態様では、該投与することは、約9×10⁸
個の単離された胎盤細胞又は約1.8×10⁹個の単離された胎盤細胞を静脈内投与することを
含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、約5×10⁷～1×10⁸個の単離された
胎盤細胞を病変内投与することを含む。別の具体的な実施態様では、該投与することは、
約9×10⁷個の単離された胎盤細胞を病変内投与することを含む。

本明細書で提供される方法で用いられる胎盤細胞は、特定の実施態様では、血管形成を
促進する1種以上のタンパク質を産生するように遺伝子操作することができる。特定の実
施態様では、血管形成を促進する該タンパク質は、肝細胞成長因子（HGF）、血管内皮成
長因子（VEGF）（例えば、VEGFD）、線維芽細胞成長因子（FGF）（例えば、FGF2）、アン
ジオジェニン（ANG）、上皮成長因子（EGF）、上皮好中球活性化タンパク質78（ENA-78）
、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、成長調節オンコジーンタンパク
質（growth-regulated ongogene protein）（GRO）、インターロイキン-6（IL-6）、IL-8
、レプチン、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、MCP-3、血小板由来成長因子サブユニッ
トB（platelet-derived growth factor submunit B）（PDGFB）、ランテス、形質転換成
長因子ベータ1（TGF-β1）、トロンボポエチン（Tpo）、メタロプロテイナーゼの組織イ
ンヒビター1（TIMP1）、TIMP2、及び／又はウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受
容体（uPAR）のうちの1つ又は複数である。

（3.1 定義）
本明細書で使用されるように、記述された数値に言及するときの「約」という用語は、
該記述された数値の±10％以内の値を示す。

本明細書で使用されるように、本明細書に記載の胎盤由来接着細胞に関する「血管形成
性」という用語は、該細胞が、血管もしくは血管様新芽を形成することができること、又
は該細胞が、別の細胞、例えば、内皮細胞の集団内での血管形成（例えば、血管もしくは
血管様構造の形成）を促進することができることを意味する。

本明細書で使用されるように、「血管形成」という用語は、限定するものではないが、
内皮細胞活性化、遊走、増殖、マトリックスリモデリング、及び細胞安定化を含む血管形
成の過程を指す。

本明細書で使用されるように、「由来した」という用語は、単離されているか、又は別
の形で純化されていることを意味する。例えば、胎盤由来接着細胞は、胎盤から単離され
ている。「由来した」という用語は、組織、例えば、胎盤から直接単離された細胞、及び
初代単離株から培養又は拡大された細胞から培養される細胞を包含する。

本明細書で使用されるように、「免疫局在化」は、例えば、フローサイトメトリー、蛍
光活性化細胞選別、磁気細胞選別、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学
などにおいて、免疫タンパク質、例えば、抗体又はその断片を用いる、化合物、例えば、
細胞マーカーの検出を意味する。

本明細書で使用されるように、「SH2」という用語は、細胞マーカーCD105上のエピトー
プに結合する抗体を指す。したがって、SH2⁺と表される細胞は、CD105⁺である。

本明細書で使用されるように、「SH3」及び「SH4」という用語は、細胞マーカーCD73上
に存在するエピトープに結合する抗体を指す。したがって、SH3⁺及び／又はSH4⁺と表され
る細胞は、CD73⁺である。

胎盤は、その中で発生する胎児の遺伝子型を有するが、妊娠中、母親の組織とも密接に
物理的に接触している。そのため、本明細書で使用されるように、「胎児の遺伝子型」と
いう用語は、胎児を身ごもった母親の遺伝子型に対立するものとして、胎児の遺伝子型、
例えば、本明細書に記載されている、特定の単離された胎盤細胞が得られる胎盤と関連し
ている胎児の遺伝子型を意味する。本明細書で使用されるように、「母親の遺伝子型」と
いう用語は、胎児、例えば、本明細書に記載されている、特定の単離された胎盤細胞が得
られる胎盤と関連している胎児を身ごもった母親の遺伝子型を意味する。

本明細書で使用されるように、「単離された細胞」、例えば、「単離された胎盤細胞」
、「単離された胎盤幹細胞」などの用語は、該幹細胞が由来する組織、例えば、胎盤の他
の異なる細胞から実質的に分離されている細胞を意味する。細胞は、該幹細胞が天然に関
連している細胞、例えば、非幹細胞、又は異なるマーカープロファイルを示す幹細胞の少
なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は少なくとも99％が、例えば、該幹細
胞の回収及び／又は培養時に、該幹細胞から取り除かれる場合、「単離された」ものとな
る。

本明細書で使用されるように、細胞に言及するときの「多能性」は、該細胞が、いくつ
かの、しかし、必ずしも全てではないタイプの体の細胞、又はいくつかの、しかし、全て
ではないタイプの体の細胞の特徴を有する細胞、又は3胚葉のうちの1つもしくは複数の細
胞に分化する能力を有することを意味する。特定の実施態様では、神経形成細胞、軟骨形
成細胞、及び／又は骨形成細胞の特徴を有する細胞に分化する能力を有する、例えば、下
の第5.2節に記載されているような、単離された胎盤細胞（PDAC）は、多能性細胞である
。

本明細書で使用されるように、「単離された細胞の集団」という用語は、該細胞の集団
が由来する組織、例えば、胎盤の他の細胞から実質的に分離されている細胞の集団を意味
する。

本明細書で使用されるように、「胎盤細胞」という用語は、例えば、下の第5.2節に記
載されているように、哺乳動物胎盤から単離されるか、又は初代培養後の継代数を問わず
、初代単離株もしくは培養細胞のいずれかとして、本明細書で「PDAC」とも呼ばれる、哺
乳動物の胎盤から単離された細胞から培養される、幹細胞又は前駆細胞を指す。特定の実
施態様では、本明細書で使用される「胎盤細胞」という用語は、しかしながら、栄養芽層
も、細胞栄養芽層も、合胞体栄養細胞層も、血管芽細胞（angioblast）も、血管芽細胞（
hemangioblast）も、胚性生殖細胞も、胚性幹細胞も、胚盤胞の内部細胞塊から得られる
細胞も、後期胚、例えば、胚性生殖細胞の生殖隆起から得られる細胞も指さず、また、本
明細書で提供される方法で使用される胎盤細胞は、しかしながら、栄養芽層でも、細胞栄
養芽層でも、合胞体栄養細胞層でも、血管芽細胞（angioblast）でも、血管芽細胞（hema
ngioblast）でも、胚性生殖細胞でも、胚性幹細胞でも、胚盤胞の内部細胞塊から得られ
る細胞でも、後期胚、例えば、胚性生殖細胞の生殖隆起から得られる細胞でもない。本明
細書に記載の胎盤細胞、例えば、PDACは、その開示がその全体として引用により本明細書
中に組み込まれている、2009年11月19日に出願された「羊膜由来血管形成細胞（Amnion D
erived Angiogenic Cells）」という表題の係属米国特許出願第12／622,352号に記載され
ている羊膜由来接着細胞ではない。細胞は、該細胞が、幹細胞の性質、例えば、1種類以
上の幹細胞と関連するマーカー又は遺伝子発現プロファイル；培養下で少なくとも10～40
回複製する能力、及び3胚葉のうちの1つ又は複数の分化した細胞の特徴を示す細胞に分化
する能力を示す場合、「幹細胞」とみなされる。本明細書で特に注記しない限り、「胎盤
」という用語は、臍帯を含む。本明細書に開示されている単離された胎盤細胞は、特定の
実施態様では、分化条件下にインビトロで分化するか、インビボで分化するか、又は両方
である。

本明細書で使用されるように、胎盤細胞は、そのマーカーがバックグラウンドを超えて
検出可能であるとき、特定のマーカーについて陽性である。特定のマーカーの検出は、例
えば、抗体の使用によるか、又は該マーカーをコードする遺伝子もしくはmRNAの配列に基
づくオリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマーによるかのいずれかで達成すること
ができる。例えば、胎盤細胞は、例えば、CD73が（例えば、アイソタイプ対照と比較して
）バックグラウンドよりも検出可能に大きい量で、胎盤細胞に検出されるので、CD73陽性
である。また、細胞は、そのマーカーを用いて、該細胞を少なくとも1つの他の細胞型と
区別することができるか、又は該細胞によって提示もしくは発現されるときに、そのマー
カーを用いて、該細胞を選択もしくは単離することができる場合、マーカー陽性である。
例えば、抗体を介する検出との関連において、特定の細胞表面マーカーが存在することを
示す「陽性」は、該マーカーが、そのマーカーに特異的な抗体、例えば、蛍光標識抗体を
用いて検出されることを意味し；「陽性」は、例えば、サイトメーターにおいて、バック
グラウンドを検出可能に上回るシグナルを発生させる量のマーカーを示す細胞も指す。例
えば、細胞は、該細胞が、CD200に特異的な抗体で検出可能に標識され、かつ該抗体から
のシグナルが、対照（例えば、バックグラウンド又はアイソタイプ対照）のシグナルより
も検出可能に高い場合、「CD200⁺」である。逆に、同じ文脈における「陰性」は、細胞表
面マーカーが、対照（例えば、バックグラウンド又はアイソタイプ対照）と比較して、そ
のマーカーに特異的な抗体を用いて検出可能でないことを意味する。例えば、細胞は、該
細胞が、対照（例えば、バックグラウンド又はアイソタイプ対照）よりも大きい程度に、
CD34に特異的な抗体で再現性良く検出可能に標識されない場合、「CD34^-」である。抗体
を用いて検出されないか、又は検出可能でないマーカーは、適切な対照を用いて、同様の
様式で陽性又は陰性と決定される。例えば、細胞又は細胞集団は、該細胞又は細胞の集団
由来のRNA中に検出されるOCT-4 RNAの量が、例えば、RNAを検出する方法、例えば、RT-PC
R、スロットブロットなどによって決定されるバックグラウンドよりも検出可能に多い場
合、OCT-4⁺であると決定することができる。本明細書で特に注記しない限り、分化抗原群
（「CD」）マーカーは、抗体を用いて検出される。特定の実施態様では、OCT-4が、RT-PC
Rを用いて検出可能である場合、OCT-4が存在すると決定され、細胞は「OCT-4⁺」である。

本明細書で使用されるように、フローサイトメトリーによって検出可能なマーカーの発
現に言及するときの「low」という記号表示は、該マーカーが、試験した細胞の10％未満
によって発現されていること、又は例えば、フローサイトメトリーでの、該マーカーに起
因する蛍光が、バックグラウンドを超えて1対数未満であることを意味する。

本明細書で使用されるように、「治療する」は、疾患、障害、もしくは病気、又はそれ
らの任意のパラメータもしくは症状の矯正、改善、その重症度の軽減、或いはその時間経
過の減少を包含する。

(4.図面の簡単な説明）
胎盤由来接着細胞による、選択された血管形成タンパク質の分泌を示す。

ヒト内皮細胞（HUVEC）管形成に対する胎盤由来接着細胞馴化培地の血管形成効果を示す。

ヒト内皮細胞遊走に対する胎盤由来接着細胞馴化培地の血管形成効果を示す。

ヒト内皮細胞増殖に対する胎盤由来接着細胞馴化培地の血管形成効果を示す。

HUVEC及び胎盤由来接着細胞の管形成を示す。

低酸素条件下及び酸素正常条件下の胎盤由来接着細胞によるVEGF及びIL-8の分泌を示す。

ニワトリ漿尿膜血管形成モデルでの血管形成に対するPDACの正の効果を示す。bFGF：塩基性線維芽細胞成長因子（陽性対照）。MDAMB231：血管形成性乳癌細胞株（陽性対照）。Y軸：血管形成の程度。

ニワトリ漿尿膜血管形成モデルでの血管形成に対するPDAC馴化培地（上清）の正の効果を示す。bFGF：塩基性線維芽細胞成長因子（陽性対照）。MDAMB231：血管形成性乳癌細胞株（陽性対照）。Y軸：血管形成の程度。

星状細胞の培養物、又は星状細胞とPDACの共培養物中に存在する、過酸化水素により生成された活性酸素種。RFU ROS活性：活性酸素種についての相対蛍光単位。

（5.詳細な説明）
（5.1 血管形成、及び血流不足と関連するか又はそれに起因する疾患又は状態の治療）
循環器系の疾患又は障害を治療する方法であって、下の第5.2節に記載するような、組
織培養プラスチック接着性胎盤細胞、例えば、PDACの有効量を投与することを含む、方法
が本明細書で提供される。特定の実施態様では、PDACは血管形成性である。PDACは、イン
ビトロとインビボの両方で、内皮細胞及び内皮細胞集団、並びに上皮細胞及び上皮細胞集
団の成長を支持することができる。

(5.1.1 循環器系疾患）
本明細書で提供される、PDAC、そのような細胞の集団、及びPDACを含む細胞の集団を用
いて、血管形成の増加によって利益を得る種々の病態又は病状を示す個体を治療すること
ができる。そのような病態又は病状の例としては、心筋梗塞、先天性心不全、末梢動脈疾
患、左心低形成症候群、糖尿病性潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈性潰瘍、動脈性潰瘍、火傷、偽
関節骨折（non-union fracture）、骨関節炎、及び顎顔面骨修復が挙げられる。PDAC、及
びそのような細胞の集団は、特定の実施態様では、外傷性組織欠損を示す個体で血管形成
を促進するために、もしくは瘢痕形成を予防するために、又は関節全置換もしくは義歯を
有する個体で用いることができる。

より具体的な実施態様では、本明細書で提供される、PDAC、及びそのような細胞の集団
を用いて、循環器系の不全を有する個体、例えば、末梢血管疾患又は冠動脈疾患を有する
個体を治療することができる。

一態様では、心疾患又は心損傷を有する患者を治療する方法であって、治療的細胞組成
物を心臓又は循環器系の疾患又は損傷を有する患者に投与すること、及び該患者を心機能
の改善について評価することを含み、ここで、該細胞組成物は、本明細書に記載のPDACを
含む、方法が本明細書で提供される。一実施態様では、心疾患は、心筋症である。具体的
な実施態様では、心筋症は、特発性のもの、又は原因不明の心筋症のいずれかである。他
の具体的な実施態様では、心筋症は、虚血性又は非虚血性のいずれかの性質である。別の
実施態様では、心臓又は循環器系の疾患は、血管形成術、動脈瘤、狭心症（angina）（狭
心症(angina pectoris））、大動脈狭窄、大動脈炎、不整脈、動脈硬化症、動脈炎、非対
称性心室中隔肥大（ASH）、アテローム動脈硬化症、心房細動及び粗動、細菌性心内膜炎
、バーロー症候群（僧帽弁逸脱症）、徐脈、バージャー病（閉塞性血栓血管炎）、心肥大
、心筋症、心臓炎、頸動脈疾患、大動脈縮窄症、先天性心疾患（先天性心欠損）、先天性
心不全（心不全）、冠動脈疾患、アイゼンメンガー症候群、塞栓症、心内膜炎、先端紅痛
症、細動、線維筋性形成異常、心ブロック、心雑音、高血圧症、低血圧症、特発性乳児動
脈石灰化、川崎病（皮膚粘膜リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節疾患、乳児多発性動脈炎
）、メタボリックシンドローム、微小血管狭心症、心筋梗塞（心臓発作）、心筋炎、発作
性心房頻拍（PAT）、結節性動脈周囲炎（多発性動脈炎、結節性多発性動脈炎）、心膜炎
、末梢血管疾患、重症肢虚血、糖尿病性血管症、静脈炎、肺動脈弁狭窄（肺動脈狭窄）、
レイノー病、腎動脈狭窄、腎血管性高血圧症、リウマチ性心疾患、中隔欠損、無症候性虚
血、X症候群、頻脈、高安動脈炎、ファローの四徴症、大血管転位症、三尖弁閉鎖症、総
動脈幹症、心臓弁膜症、静脈瘤性潰瘍、静脈瘤、血管炎、心室中隔欠損、ウルフ-パーキ
ンソン-ホワイト症候群、又は心内膜床欠損のうちの1つ又は複数を含む。

他の実施態様では、心臓又は循環器系の疾患は、急性リウマチ熱、急性リウマチ性心膜
炎、急性リウマチ性心内膜炎、急性リウマチ性心筋炎、慢性リウマチ性心疾患、僧帽弁の
疾患、僧帽弁狭窄、リウマチ性僧帽弁閉鎖不全症、大動脈弁の疾患、他の心内膜構造の疾
患、虚血性心疾患（急性及び亜急性）、狭心症（angina pectoris）、肺循環の疾患（急
性肺性心疾患、肺塞栓症、慢性肺性心疾患）、脊柱後側弯性心疾患、心筋炎、心内膜炎、
心内膜心筋線維症、心内膜弾性線維症、房室ブロック、心律動障害、心筋変性、脳血管疾
患を含む循環器系の疾患、前大脳動脈の閉塞及び狭窄、大脳動脈の閉塞、動脈、細動脈、
及び毛細血管の疾患（アテローム動脈硬化症、動脈瘤）、又は静脈及びリンパ管の疾患の
うちの1つ又複数を含む。

別の実施態様では、治療は、別の細胞型を含むか又はそれを含まない、PDACを含む治療
的細胞組成物による心筋症を有する個体の治療を含む。特定の実施態様では、該個体は、
療法による、例えば、心臓に存在する幹細胞又は前駆細胞を含む他の細胞の成長を支持す
る該細胞の能力による、組織の内部成長又は組織の血管新生による、及び有益な細胞因子
、ケモカイン、サイトカインなどの存在による利益を受けるが、該細胞は、該個体に融合
することも、該個体で倍加することもない。別の実施態様では、患者は、該細胞による治
療的治療によって利益を得るが、該細胞は、該患者内で長期間にわたって生存するもので
はない。一実施態様では、該細胞は、数、生存率、又は生化学的活性が徐々に減少し、他
の実施態様では、細胞の減少に先立って、一定期間の活性、例えば、成長、分裂、又は生
化学的活性がある場合がある。他の実施態様では、老化しているか、生存不能であるか、
又は死んでさえいる細胞が、有益な治療効果を有することができる。

本明細書で提供されるPDAC又は治療的組成物を投与される、循環器系の疾患又は障害を
有する個体の改善は、循環器系の疾患又は障害の1以上の症状の検出可能な改善によって
評価又は実証することができる。

別の実施態様では、PDAC又はPDACを含む治療的組成物を投与される、循環器系の疾患又
は障害を有する個体の改善は、PDACの投与前の個体と比較したときの、心機能の1以上の
兆候の検出可能な改善、例えば、胸部心拍出量（CO）、心係数（CI）、肺動脈楔入圧（PA
WP）、及び心係数（CI）、％短縮率（％FS）、駆出率（EF）、左室駆出率（LVEF）；左室
拡張末期径（LVEDD）、左室収縮末期径（LVESD）、収縮力（例えば、dP／dt）、左室圧-
容量曲線（pressure-volume loops）、心仕事量の測定値、心房機能又は心室機能の増大
；ポンプ効率の増大、ポンプ効率の損失率の低下、血行動態機能の損失の減少；並びに心
筋症と関連する合併症の減少のうちの1つ又は複数の検出可能な改善の実証によって評価
又は実証することができる。

本明細書で提供されるPDAC、又はPDACを含む治療的組成物を受容する個体の改善は、主
観的な指標、例えば、該個体による投与後の彼又は彼女の健康状態についての自己評価に
よって評価することもできる。

該細胞の投与の成功は、特定の実施態様では、投与されたPDACの該個体における生存に
基づくものではない。その代わり、成功は、上に示したような、心臓又は循環器系の健康
の改善に関する1以上の指標に基づくものである。したがって、該細胞は、融合して患者
の心臓とともに拍動する必要も、血管に融合する必要もない。

特定の実施態様では、本明細書で提供される治療方法は、間葉系系統に沿って、例えば
、心筋形成性、血管形成性、もしくは脈管形成性の表現型の方向に、又は筋細胞、心筋細
胞（cardiomyocyte）、内皮細胞、心筋細胞（myocardial cell）、心外膜細胞、血管内皮
細胞、平滑筋細胞（例えば、血管平滑筋細胞）などの細胞に分化するようにPDACを誘導す
ることを含む。

それを必要とする個体へのPDAC、又はそのような細胞を含む治療的組成物の投与は、例
えば、移植、（例えば、細胞それ自体もしくはマトリックス-細胞の組合せの部分として
の細胞の）埋め込み、注射（例えば、疾患もしくは病気の部位に直接、例えば、心筋梗塞
に罹った個体の心臓の虚血部位に直接）、注入、カテーテルからの送達、又は細胞療法を
提供するための当技術分野で公知の任意の他の手段によって達成することができる。

一実施態様では、治療的細胞組成物は、それを必要とする個体に、例えば、該個体内の
1以上の部位への注射によって提供される。具体的な実施態様では、治療的細胞組成物は
、例えば、心臓の虚血領域への心腔内注射によって提供される。他の具体的な実施態様で
は、該細胞は、心臓の表面に、隣接部位に、又はより離れた部位にも注射される。好まし
い実施態様では、該細胞は、罹患部位又は損傷部位にホーミングすることができる。

冠動脈系又は血管系の疾患又は病気を有する個体に、PDACを、該細胞が治療上有益であ
るどの時点でも投与することができる。特定の実施態様では、例えば、本発明のPDAC又は
治療的組成物は、心筋梗塞の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16
、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24時間、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、も
しくは30日以内に投与される。心筋梗塞に時間的に近い、例えば、1～3又は1～7日以内の
投与は、時間的に遠い、例えば、心筋梗塞から3又は7日後の投与よりも好ましい。他の実
施態様では、本発明の細胞又は治療的組成物は、疾患又は病気の初期診断の1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは2
4時間、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20
、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30日以内に投与される。

心筋梗塞の治療で用いるためのキットも本明細書で提供される。該キットは、例えば、
医薬として許容し得る担体と混合することによって医薬として許容し得る形態で調製する
ことができる、PDACを含む治療的細胞組成物と、アプリケータとを、使用説明書とともに
提供する。理想的には、該キットは、心筋梗塞又は同様の心イベントを起こしていると診
断された患者に適用されるために、現場、例えば、診療室で、又は救急医療提供者によっ
て用いられることができる。

本明細書で提供される治療方法の具体的な実施態様では、PDACは、幹細胞（すなわち、
PDACではない幹細胞）、筋芽細胞、筋細胞、心筋芽細胞、心筋細胞、又は筋芽細胞、筋細
胞、心筋芽細胞、及び／もしくは心筋細胞の前駆体とともに投与される。

具体的な実施態様では、本明細書で提供される治療方法は、PDAC、例えば、該細胞を含
む治療的組成物を、心臓又は循環器系の疾患を有する患者に投与すること；及び該患者を
心機能の改善について評価することを含み、ここで、該治療的細胞組成物は、マトリック
ス-細胞複合体として投与される。特定の実施態様では、マトリックスは、好ましくは生
体吸収性で、少なくとも該細胞を含む、スキャフォールドである。

この目的のために、心臓形成、血管形成（angiogenic）、血管形成（hemangiogenic）
、又は脈管形成経路に沿った幹細胞又は前駆細胞分化を刺激する1以上の因子と接触させ
た、例えば、該因子の存在下でインキュベート又は培養した、PDACの集団が本明細書でさ
らに提供される。そのような因子としては、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、細胞
産物、脱メチル化剤などの因子、及び例えば、心臓形成、血管形成（angiogenic）、血管
形成（hemangiogenic）、又は脈管形成経路又は系統に沿った幹細胞の分化を刺激するこ
とが現在知られているか又は後に明らかにされる他の因子が挙げられるが、これらに限定
されない。

特定の実施態様では、PDACは、脱メチル化剤、BMP（骨形成タンパク質）、FGF（線維芽
細胞成長因子）、Wnt因子タンパク質、ヘッジホッグタンパク質、及び／又は抗Wnt因子の
うちの少なくとも1つを含む因子の存在下での該細胞の培養により、インビトロで、心臓
形成、血管形成（angiogenic）、血管形成（hemangiogenic）、又は脈管形成経路又は系
統に沿って分化させることができる。

脱メチル化剤の包含は、間葉系系統に沿った、心筋形成経路の方向へのPDACの分化を促
進する傾向にある。分化は、例えば、免疫染色もしくはRT-PCRによって決定されるような
、例えば、心臓ミオシン、骨格筋ミオシン、もしくはGATA4のうちの少なくとも1つの発現
によって；又は自発的な、もしくはさもなければ誘導される、拍動リズムの獲得によって
；又は不整脈を誘発することなく、少なくとも部分的に個体の心筋に融合する能力によっ
て、決定することができる。そのような分化を開始させるために用いることができる脱メ
チル化剤としては、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、ジメチルスルホキシ
ド、塩化ケレリトリン、レチノイン酸もしくはその塩、2-アミノ-4-(エチルチオ）酪酸、
プロカインアミド、及び／又はプロカインが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書における特定の実施態様では、上で特定されている1以上の因子と接触したPDA
Cは、心筋形成性、血管形成性（angiogenic）、血管形成性（hemangiogenic）、又は脈管
形成性の細胞、又は前駆体になることができる。好ましくは、該細胞の少なくとも一部は
、限定するものではないが、心臓の筋肉、血管、及び心臓の他の構造物、心血管又は末梢
血管などを含む、レシピエントの心血管系に少なくとも一部融合する。特定の実施態様で
は、分化したPDACは、心筋形成細胞又はその前駆体の2以上の特徴を示す細胞に分化し、
レシピエントの心臓又は血管系に一部又は完全に融合することができる。具体的な実施態
様では、該細胞は、個体に投与されたとき、不整脈、心欠損、血管欠損、又は個体の循環
器系もしくは健康の他の異常の増加をもたらさない。特定の実施態様では、PDACは、患者
の心筋、血管、血液などに天然に存在する幹細胞の分化を促進するか、それ自体、例えば
、心筋細胞に分化するか、又は少なくとも心筋形成、血管形成（angiogenic）、血管形成
（hemangiogenic）、もしくは脈管形成系統に沿って分化するように作用する。

PDAC、及びそのような細胞の集団は、個体、例えば、心臓もしくは循環器系の、又は心
臓もしくは循環器系に影響を及ぼす、疾患、障害、もしくは病気を有する個体に対して、
治療的又は予防的に提供することができる。そのような疾患、障害、又は病気としては、
アテローム動脈硬化症、心筋症、又は心損傷、例えば、心筋梗塞もしくは創傷（急性もし
くは慢性）などによる虚血性傷害による先天性心不全を挙げることができる。

特定の実施態様では、個体に、例えば、PDACを含む細胞の集団内のPDACの治療有効量を
投与する。具体的な実施態様では、該集団は、約50％のPDACを含む。別の具体的な実施態
様では、該集団は、PDACの実質的に均質な集団である。他の実施態様では、該集団は、少
なくとも約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％
、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％のPDACを含む。

PDACは、該細胞と、別の治療的作用因子、例えば、インスリン様成長因子（IGF）、血
小板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血管内
皮成長因子（VEGF）、肝細胞成長因子（HGF）、インターロイキン 18（IL-8）、抗血栓剤
（例えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、ウロキナーゼ、又はPPack（デキストロフェニル
アラニンプロリンアルギニンクロロメチルケトン）、抗トロンビン化合物、血小板受容体
アンタゴニスト、抗トロンビン抗体、抗血小板受容体抗体、アスピリン、ジピリダモール
、プロタミン、ヒルジン、プロスタグランジン阻害剤、及び／又は血小板阻害剤）、抗ア
ポトーシス剤（例えば、エリスロポエチン（Epo）、Epo誘導体もしくは類似体、又はそれ
らの塩、トロンボポエチン（Tpo）、IGF-I、IGF-II、肝細胞成長因子（HGF）、又はカス
パーゼ阻害剤）、抗炎症剤（例えば、（例えば、p38 MAPキナーゼ阻害剤、スタチン、IL-
6阻害剤、IL-1阻害剤、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード、シロリムス、及び／
又は非ステロイド抗炎症化合物（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、テポキ
サリン、トルメチン、もしくはスプロフェン））、免疫抑制剤又は免疫調節剤（例えば、
カルシニューリン阻害剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス、mTOR阻害剤、例えば
、シロリムス又はエベロリムス；抗増殖薬、例えば、アザチオプリン及び／又はミコフェ
ノール酸モフェチル；コルチコステロイド、例えば、プレドニゾロン又はヒドロコルチゾ
ン；抗体、例えば、モノクローナル抗IL-2Rα受容体抗体、バシリキシマブ、ダクリズマ
、ポリクローナル抗T細胞抗体、例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ATG）、抗リンパ球グロ
ブリン（ALG）、及び／又はモノクローナル抗T細胞抗体OKT3、又はその各々の開示がその
全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,468,276号及び米国
特許出願公開第2007／0275362号に記載されている接着性胎盤幹細胞、並びに／或いは抗
酸化剤（例えば、プロブコール；ビタミンA、C、及び／もしくはE、補酵素Q-10、グルタ
チオン、Lシステイン、N-アセチルシステイン、又は前述のもののいずれかの抗酸化誘導
体、類似体、もしくは塩）とを含む治療的組成物の形態で個体に投与することができる。
特定の実施態様では、PDACを含む治療的組成物は、1以上のさらなる細胞型、例えば、成
体細胞（例えば、線維芽細胞もしくは内胚葉細胞）、幹細胞、及び／又は前駆細胞をさら
に含む。そのような治療剤及び／又は1以上のさらなるタイプの細胞は、それを必要とす
る個体に、個別にもしくは組み合わせて、又は2以上のそのような化合物もしくは薬剤を
投与することができる。

特定の実施態様では、治療すべき個体は、哺乳動物である。具体的な実施態様では、治
療すべき個体は、ヒトである。具体的な実施態様では、該個体は、畜産動物又は家畜であ
る。他の具体的な実施態様では、治療すべき個体は、ウマ、ウシもしくは去勢ウシ、ブタ
、イヌ、又はネコである。

（5.1.2 虚血性疾患の治療）
特定の実施態様では、例えば、末梢血管系における血流の途絶を有する個体を治療する
方法であって、該個体にPDACの治療有効量を投与することを含む、方法が本明細書で提供
される。特定の具体的な実施態様では、虚血は、末梢動脈疾患（PAD）であり、例えば、
重症肢虚血（CLI）である。特定の他の実施態様では、虚血は、末梢血管疾患（PVD）、末
梢動脈疾患、虚血性血管疾患、虚血性心疾患、又は虚血性腎疾患である。

具体的な実施態様では、該血流の途絶は、重症肢虚血である。別のより具体的な実施態
様では、該CLIは、血流を著しく減少させる、下肢の動脈における重症閉塞である。別の
より具体的な実施態様では、該CLIは、虚血性安静時痛、個体が動いていない時の脚及び
足の激しい疼痛、足もしくは脚の治癒しない痛み、足の疼痛もしくはしびれ、脚もしくは
足の光沢があり、滑らかで、乾燥した皮膚、足指の肥厚、脚もしくは足の脈拍の欠如もし
くは減弱、開いた傷口、治癒しない皮膚感染もしくは潰瘍、及び／又は脚もしくは足の乾
燥した壊疽（乾燥した黒い皮膚）を特徴とする。別の具体的な実施態様では、CLIを有す
る個体は、少なくとも1本の指及び／又は肢全体の喪失を経験している。本方法の別の具
体的な実施態様では、該治療有効量は、該個体の末梢血管系における血流の途絶に起因す
る肢機能の喪失及び／又は酸素欠乏（低酸素症／無酸素症）の1以上の症状の消失、その
検出可能な改善、その重症度の軽減、又はその進行の緩徐化をもたらすPDACの数である。
別の具体的な実施態様では、単離されたPDACの該治療有効量を、例えば、該血流の途絶後
の肢又はその周辺の血流の二次的又は後続的途絶によって引き起こされる組織損傷を低減
又は消失させるために、該個体に予防的に投与する。

他の実施態様では、PDACは、脳卒中、例えば、虚血性脳卒中の治療、例えば、CNSの虚
血領域内での血管形成の促進による脳卒中の治療において用いることができる。一態様で
は、個体の脳又はその周辺の血流の途絶を有する、例えば、個体の脳もしくは中枢神経系
（CNS）又はそれらの周辺の血流の途絶に起因する症状又は神経学的欠損を有する個体を
治療する方法であって、該個体に、単離された組織培養プラスチック接着性ヒト胎盤細胞
の治療有効量を投与することを含み、ここで、該単離された胎盤細胞は、多能性細胞又は
幹細胞の特徴を有する、方法が本明細書で提供される。特定の実施態様では、血流の途絶
は、個体の脳又はCNSに酸素欠乏傷害又は低酸素傷害をもたらす。本明細書で企図されて
いるように、個体の脳又はその周辺の血流の途絶に起因する個体の症状又は神経学的欠損
の治療は、個体の脳又はその周辺のそのような血流の途絶を伴い得る再灌流傷害に起因す
る症状又は神経学的欠損の治療を含む。

血管形成性であることに加え、本明細書で提供される胎盤細胞（例えば、下記のPDAC）
は、神経保護的である。特定の実施態様では、該胎盤細胞は、低酸素環境で、例えば、低
酸素条件（例えば、約5％未満のO₂）下で神経保護的である。特定の実施態様では、該胎
盤幹細胞は、ニューロンもしくは他の神経細胞、又は星状細胞と接触させたとき、例えば
、PDACとニューロンの共培養下のインビトロでの神経突起長の増加に見られるように、ニ
ューロン、神経細胞、又は星状細胞の健康を増進させる。特定の他の実施態様では、PDAC
は、低酸素環境で1以上の活性酸素種の濃度を低下させる。さらに、特定の実施態様では
、該胎盤細胞（例えば、PDAC）は、神経栄養性サイトカインBDNF、VEGF、HGF、G-CSF、神
経成長因子（NGF）、及び／又はニューロトロフィン-3（NTF3）のうちの1つ又は複数を分
泌する。したがって、PDACは、CNSとPNSの両方の虚血性傷害、例えば、脳卒中に起因する
CNSの神経系の虚血性傷害、又は重症肢虚血もしくは末梢血管疾患に起因するPNSの神経系
の虚血性傷害の治療に有用である。他の実施態様では、PDACを用いて、例えば、多発性硬
化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び／又は末梢神経障
害、例えば、糖尿病性神経障害を治療することができる。

(5.2 単離された胎盤細胞及び単離された胎盤細胞集団）
循環器疾患又は障害を有する個体の治療において有用な、単離された胎盤細胞、例えば
、PDACは、胎盤又はその部分から得ることができ、組織培養基材に接着し、かつ多能性細
胞又は幹細胞の特徴を有するが、栄養芽層ではない細胞である。特定の実施態様では、本
明細書に開示されている方法において有用な単離された胎盤細胞は、非胎盤細胞型に分化
する能力を有する。

本明細書に開示されている方法において有用な単離された胎盤細胞は、胎児起源のもの
又は母親起源のもののいずれかであることができる（すなわち、それぞれ、胎児又は母親
のいずれかの遺伝子型を有することができる）。好ましくは、単離された胎盤細胞及び単
離された胎盤細胞の集団は、胎児起源のものである。本明細書で使用されるように、「胎
児起源」又は「非母親起源」という語句は、単離された胎盤細胞又は単離された胎盤細胞
の集団が、胎児と関連する、すなわち、胎児の遺伝子型を有する臍帯又は胎盤構造物から
得られることを示す。本明細書で使用されるように、「母親起源」という語句は、細胞又
は細胞の集団が、母親と関連する、すなわち、母親の遺伝子型を有する胎盤構造物から得
られることを示す。単離された胎盤細胞、例えば、PDAC、又は単離された胎盤細胞を含む
細胞の集団は、もっぱら胎児起源のものもしくは母親起源のものである単離された胎盤細
胞を含むことができるか、又は胎児起源と母親起源の両方の単離された胎盤細胞の混合集
団を含むことができる。単離された胎盤細胞、及び単離された胎盤細胞を含む細胞の集団
は、以下で論じられている形態的特性、マーカー特性、及び培養特性によって同定及び選
択することができる。特定の実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞、例えば、胎盤幹
細胞又は胎盤多能性細胞はいずれも、レシピエント、例えば、循環器系の疾患又は障害を
有する個体にとって自己のものである。特定の他の実施態様では、本明細書に記載の胎盤
細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞はいずれも、レシピエント、例えば、循環
器系の疾患又は障害を有する個体にとって同種異系のものである。

（5.2.1 物理的及び形態的特性）
本明細書に記載の単離された胎盤細胞（PDAC）は、初代培養又は細胞培養で培養したと
き、組織培養基材、例えば、組織培養容器表面（例えば、組織培養プラスチック）、又は
ラミニン、コラーゲン（例えば、天然物もしくは変性物）、ゼラチン、フィブロネクチン
、オルニチン、ビトロネクチン、及び細胞外膜タンパク質（例えば、MATRIGEL（登録商標
）（BD Discovery Labware, Bedford, Mass.））などの細胞外マトリックスもしくはリガ
ンドをコーティングした組織培養表面に接着する。培養下の単離された胎盤細胞は、通常
、線維芽細胞のような星状の外観をしており、いくつかの細胞質突起が中央の細胞体から
伸びている。しかしながら、単離された胎盤細胞は、線維芽細胞よりも多くのそのような
突起を示すので、これらの細胞は、同じ条件下で培養された線維芽細胞と形態的に区別す
ることができる。形態的には、単離された胎盤細胞は、造血幹細胞からも区別することが
でき、造血幹細胞は、通常、培養下では、より丸みを帯びた、又は敷石状の形態をとる。

特定の実施態様では、本明細書に開示されている方法において有用な単離された胎盤細
胞は、成長培地中で培養したときに、胚様体様体を発生させる。胚様体様体は、増殖して
いる単離された胎盤細胞の接着層の最上部で成長することができる不連続な細胞塊である
。該細胞塊が、胚性幹細胞の培養物から成長する細胞塊である胚様体に似ているので、「
胚様体様」という用語が用いられる。胚様体様体が、単離された胎盤細胞の増殖する培養
物中に発生することができる成長培地としては、例えば、DMEM-LG（例えば、Gibco製）；
2％胎仔ウシ血清（例えば、Hyclone Labs.製）；1×インスリン-トランスフェリン-セレ
ン（ITS）；1×リノール酸-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）；10^-9Mデキサメタゾン（例え
ば、Sigma製）；10^-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（例えば、Sigma製）；上皮成長因
子10ng／mL（例えば、R&D Systems製）；及び血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／mL（
例えば、R&D Systems製）を含む培地が挙げられる。

（5.2.2 細胞表面マーカー、分子マーカー、及び遺伝子マーカー）
本明細書に開示されている方法、例えば、循環器系の疾患又障害の治療方法において有
用な、単離された胎盤細胞、例えば、単離された多能性胎盤細胞又は単離された胎盤幹細
胞、及びそのような単離された胎盤細胞の集団は、多能性細胞又は幹細胞の特徴を有し、
かつ幹細胞を含む細胞、又は幹細胞を含む細胞の集団を同定及び／又は単離するために用
いることができる複数のマーカーを発現する組織培養プラスチック接着性ヒト胎盤細胞で
ある。特定の実施態様では、PDACは、例えば、インビトロ又はインビボで血管形成性であ
る。本明細書に記載の単離された胎盤細胞、及び胎盤細胞集団（すなわち、2以上の単離
された胎盤細胞）には、胎盤、又はその任意の部分（例えば、絨毛膜、胎盤葉など）から
直接得られる胎盤細胞及び胎盤細胞含有細胞集団が含まれる。単離された胎盤細胞集団に
は、培養下の単離された胎盤細胞の集団（すなわち、2以上の単離された胎盤細胞）、及
び容器、例えば、バッグの中の集団も含まれる。本明細書に記載の単離された胎盤細胞は
、骨髄由来間葉系細胞でも、脂肪由来間葉系幹細胞でも、臍帯血、胎盤血、又は末梢血か
ら得られる間葉系細胞でもない。本明細書に記載の方法及び組成物において有用な、胎盤
細胞、例えば、胎盤多能性細胞及び胎盤細胞は本明細書に記載されており、かつ例えば、
その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,31
1,904号；第7,311,905号；及び第7,468,276号；並びに米国特許出願公開第2007／0275362
号に記載されている。

特定の実施態様では、単離された胎盤細胞は、単離された胎盤幹細胞である。特定の他
の実施態様では、単離された胎盤細胞は、単離された胎盤多能性細胞である。一実施態様
では、単離された胎盤細胞、例えば、PDACは、フローサイトメトリーで検出した場合、CD
34^-、CD10⁺、及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34^-、CD10⁺、
CD105⁺胎盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、及び／又は軟骨形成表現型
の細胞に分化する潜在能力を有する。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34^-、CD1
0⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、CD200⁺である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD
34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、CD45^-又はCD90⁺である。別の具体的な実施態様で
は、単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出し
た場合、CD45^-及びCD90⁺である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34^-、CD10⁺、
CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出した場合、CD90⁺又はCD4
5^-である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細
胞はさらに、フローサイトメトリーで検出した場合、CD90⁺及びCD45^-である、すなわち、
該細胞は、CD34^-、CD10⁺、CD45^-、CD90⁺、CD105⁺、及びCD200⁺である。別の具体的な実施
態様では、該CD34^-、CD10⁺、CD45^-、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺細胞はさらに、CD80^-及びCD8
6^-である。

特定の実施態様では、該胎盤細胞は、フローサイトメトリーで検出した場合、CD34^-、C
D10⁺、CD105⁺、及びCD200⁺、かつCD38^-、CD45^-、CD80^-、CD86^-、CD133^-、HLA-DR、DP、DQ
^-、SSEA3^-、SSEA4^-、CD29⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺、HLA-A、B、C⁺、PDL1⁺、ABC-
p⁺、及び／又はOCT-4⁺のうちの1つ又は複数である。他の実施態様では、上記のCD34^-、CD
10⁺、CD105⁺細胞はいずれもさらに、CD29⁺、CD38^-、CD44⁺、CD54⁺、SH3⁺、又はSH4⁺のう
ちの1つ又は複数である。別の具体的な実施態様では、該細胞はさらに、CD44⁺である。上
記の単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞のいずれかの別の具体的な実施態様では、
該細胞はさらに、CD117^-、CD133^-、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、
もしくはプログラム死-1リガンド（PDL1）⁺のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意
の組合せである。

別の実施態様では、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺細胞はさらに、CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-
、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD62E^-、CD62L^-、CD62P^-、SH3⁺（CD73⁺）、SH4⁺（CD73⁺）、CD8
0^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺（CD105⁺）、CD106／VCAM⁺、CD117^-、CD144／VE-カドヘリン^low
、CD184／CXCR4^-、CD200⁺、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-（VEGFR2^-）
、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、HLA-G^-、もしくはプログラム死-1リガンド（PDL1）⁺
のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組合せである。別の実施態様では、CD34^-
、CD10⁺、CD105⁺細胞はさらに、CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54／ICA
M⁺、CD62E^-、CD62L^-、CD62P^-、SH3⁺（CD73⁺）、SH4⁺（CD73⁺）、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、S
H2⁺（CD105⁺）、CD106／VCAM⁺、CD117^-、CD144／VE-カドヘリン^low、CD184／CXCR4^-、CD2
00⁺、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-
DP、DQ、DR^-、HLA-G^-、及びプログラム死-1リガンド（PDL1）⁺である。

別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の胎盤幹胞はいずれもさらに、フローサイ
トメトリーで検出した場合、ABC-p⁺、又はRT-PCRで決定した場合、OCT-4⁺（POU5F1⁺）で
あり、ここで、ABC-pは、胎盤特異的ABC輸送体タンパク質（乳癌耐性タンパク質（BCRP）
及びミトキサントロン耐性タンパク質（MXR）としても知られる）であり、かつOCT-4は、
オクタマー-4タンパク質（POU5F1）である。別の具体的な実施態様では、本明細書に記載
の胎盤細胞はいずれもさらに、フローサイトメトリーで決定した場合、SSEA3^-又はSSEA4^-
であり、ここで、SSEA3はステージ特異的胚抗原3であり、かつSSEA4はステージ特異的胚
抗原4である。別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞はいずれもさらに
、SSEA3^-及びSSEA4^-である。

別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞はいずれもさらに、MHC-I⁺（例
えば、HLA-A、B、C⁺）、MHC-II^-（例えば、HLA-DP、DQ、DR^-）、又はHLA-G^-のうちの1つ
又は複数である。別の具体的な実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞はいずれもさら
に、MHC-I⁺（例えば、HLA-A、B、C⁺）、MHC-II^-（例えば、HLA-DP、DQ、DR^-）、及びHLA-
G^-のうちの1つ又は複数である。

本明細書に開示されている方法及び組成物において有用である、単離された胎盤細胞の
集団、又は単離された胎盤細胞を含む、例えば、単離された胎盤細胞が濃縮されている、
細胞の集団、例えば、胎盤細胞の集団も本明細書で提供される。好ましい細胞の集団は、
単離された胎盤細胞を含み、ここで、該細胞の集団は、例えば、少なくとも10％、15％、
20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85
％、90％、95％、又は98％の単離されたCD10⁺、CD105⁺、及びCD34^-胎盤細胞を含む；すな
わち、該集団内の細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、又は98％は、単離され
たCD10⁺、CD105⁺、及びCD34^-胎盤細胞である。具体的な実施態様では、単離されたCD34^-
、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、CD200⁺である。別の具体的な実施態様では、単離さ
れたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出した
場合、CD90⁺又はCD45^-である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34^-、CD10⁺、CD
105⁺、CD200⁺胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出した場合、CD90⁺及びCD45^-
である。別の具体的な実施態様では、上記の単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞は
いずれもさらに、CD29⁺、CD38^-、CD44⁺、CD54⁺、SH3⁺、又はSH4⁺のうちの1つ又は複数で
ある。別の具体的な実施態様では、単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞、又は単離
されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞はさらに、CD44⁺である。上記の単離され
たCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれかの具体的な実施態様では、
単離された胎盤細胞はさらに、CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD6
2E^-、CD62L^-、CD62P^-、SH3⁺（CD73⁺）、SH4⁺（CD73⁺）、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺（CD
105⁺）、CD106／VCAM⁺、CD117^-、CD144／VE-カドヘリン^low、CD184／CXCR4^-、CD200⁺、CD
133^-、OCT-4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ
、DR^-、HLA-G^-、もしくはプログラム死-1リガンド（PDL1）⁺のうちの1つもしくは複数、
又はそれらの任意の組合せである。別の具体的な実施態様では、CD34^-、CD10⁺、CD105⁺細
胞はさらに、CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54／ICAM⁺、CD62E^-、CD62L
^-、CD62P^-、SH3⁺（CD73⁺）、SH4⁺（CD73⁺）、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺（CD105⁺）、CD
106／VCAM⁺、CD117^-、CD144／VE-カドヘリン^low、CD184／CXCR4^-、CD200⁺、CD133^-、OCT-
4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、HLA-
G^-、及びプログラム死-1リガンド（PDL1）⁺である。

特定の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤
細胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺
、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺、及びABC-p⁺のうちの1つもしくは複数、又は全てであり、こ
こで、該単離された胎盤細胞は、胎盤組織の物理的及び／又は酵素的破壊によって得られ
る。具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺及びABC-p⁺である。別の具
体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺及びCD34^-であり、ここで、該単
離された胎盤細胞は、以下の特徴のうちの少なくとも1つを有する：CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺
、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、及びSSEA4^-。別の具体的な実施態様では
、該単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90
⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、及びSSEA4^-である。別の実施態様では、該単離された胎盤細胞
は、OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、及びSSEA4^-である。別の具体的な実施態様では、該単離さ
れた胎盤細胞は、OCT-4⁺及びCD34^-であり、かつSH2⁺又はSH3⁺のいずれかである。別の具
体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、SH2⁺、及びSH3⁺である
。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、及びS
SEA4^-であり、かつSH2⁺又はSH3⁺のいずれかである。別の具体的な実施態様では、該単離
された胎盤細胞は、OCT-4⁺及びCD34^-であり、かつSH2⁺又はSH3⁺のいずれかであり、かつC
D10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SSEA3^-、又はSSEA4^-のうちの少なくとも1つ
である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD10⁺、
CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SSEA3^-、及びSSEA4^-であり、かつSH2⁺又はSH3⁺の
いずれかである。

別の実施態様では、本明細書に開示されている方法及び組成物において有用な単離され
た胎盤細胞は、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、及びOCT-4⁺である。別の具体的な実施態様では、該単
離された胎盤細胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺、CD34^-、CD45^-、SSEA3^-、又
はSSEA4^-である。別の実施態様では、該単離された胎盤細胞は、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA
3^-、及びSSEA4^-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、SH2⁺、SH
3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、及びSSEA4^-、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺、OCT-4⁺、CD34^-、
又はCD45^-である。

別の実施態様では、本明細書に開示されている方法及び組成物において有用な単離され
た胎盤細胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、及びS
H4⁺であり；ここで、該単離された胎盤細胞はさらに、OCT-4⁺、SSEA3^-、又はSSEA4^-のう
ちの1つ又は複数である。

特定の実施態様では、本明細書に開示されている方法及び組成物において有用な単離さ
れた胎盤細胞は、CD200⁺又はHLA-G^-である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤細
胞は、CD200⁺及びHLA-G^-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞はさ
らに、CD73⁺及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞はさ
らに、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤
細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該幹細胞
は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様では、該単
離されたCD200⁺又はHLA-G^-胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で、該単離
された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団内での胚様体様体の形成を促進する。別の具体的な
実施態様では、該単離された胎盤細胞は、幹細胞でも多能性細胞でもない胎盤細胞から単
離されている。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、これらのマーカー
を示さない胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、CD20
0⁺、HLA-G^-幹細胞を含む、例えば、CD200⁺、HLA-G^-幹細胞が濃縮されている、細胞の集団
である。具体的な実施態様では、該集団は、胎盤細胞の集団である。様々な実施態様では
、該細胞集団内の細胞の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少な
くとも約40％、少なくとも約50％、又は少なくとも約60％は、単離されたCD200⁺、HLA-G^-
胎盤細胞である。好ましくは、該細胞集団内の細胞の少なくとも約70％は、単離されたCD
200⁺、HLA-G^-胎盤細胞である。より好ましくは、該細胞の少なくとも約90％、95％、又は
99％は、単離されたCD200⁺、HLA-G^-胎盤細胞である。該細胞集団の具体的な実施態様では
、該単離されたCD200⁺、HLA-G^-胎盤細胞は、CD73⁺及びCD105⁺でもある。別の具体的な実
施態様では、該単離されたCD200⁺、HLA-G^-胎盤細胞は、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-でもあ
る。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200⁺、HLA-G^-胎盤細胞は、CD34^-、CD38^-
、CD45^-、CD73⁺、及びCD105⁺でもある。別の実施態様では、該細胞集団は、胚様体様体の
形成を可能にする条件下で培養したとき、1以上の胚様体様体を生じさせる。別の具体的
な実施態様では、該細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体
的な実施態様では、該単離されたCD200⁺、HLA-G^-胎盤細胞は、これらのマーカーを示さな
い胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、CD73⁺、CD105⁺、及びCD200⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎
盤細胞は、HLA-G^-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、CD34^-
、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、CD34
^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、CD3
4^-、CD38^-、CD45^-、及びHLA-G^-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺
、CD105⁺、及びCD200⁺胎盤細胞は、該単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様
体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該集団内での1以上の胚様体様体の形
成を促進する。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、単離された胎盤細
胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤
細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離
されたCD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞を含む、例えば、単離されたCD73⁺、CD105⁺、CD20
0⁺胎盤細胞が濃縮されている、細胞の集団である。様々な実施態様では、該細胞集団内の
細胞の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少
なくとも約50％、又は少なくとも約60％は、単離されたCD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞
である。別の実施態様では、該細胞の集団内の該細胞の少なくとも約70％は、単離された
CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の細胞の少
なくとも約90％、95％、又は99％は、単離されたCD73⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞である
。該集団の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、HLA-G^-である。別の具体的
な実施態様では、該単離された胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別
の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-で
ある。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、CD45
^-、及びHLA-G^-である。別の具体的な実施態様では、該細胞の集団は、胚様体様体の形成
を可能にする条件下で培養したとき、1以上の胚様体様体を生じさせる。別の具体的な実
施態様では、該胎盤細胞の集団は、幹細胞でない胎盤細胞から単離されている。別の具体
的な実施態様では、該胎盤細胞の集団は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離され
ている。

特定の他の実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44
⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺、HLA-G^-、又はAB
C-p⁺のうちの1つ又は複数である。具体的な実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD10⁺
、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、SSEA3^-、SSE
A4^-、及びOCT-4⁺である。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD10⁺、CD
29⁺、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD54⁺、SH2⁺、SH3⁺、及びSH4⁺である。別の具体的な実施態
様では、単離された胎盤細胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD54⁺、SH2⁺、SH
3⁺、SH4⁺、及びOCT-4⁺である。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD10
⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、HLA-G^-、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺であ
る。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺及びABC-p⁺である。別の
具体的な実施態様では、単離された胎盤細胞は、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、及びOCT-4⁺である。
別の実施態様では、単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、及びSSEA4^-である
。具体的な実施態様では、該単離されたOCT-4⁺、CD34^-、SSEA3^-、及びSSEA4^-胎盤細胞は
さらに、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、及びSH4⁺で
ある。別の実施態様では、単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺及びCD34^-であり、かつSH3⁺又
はSH4⁺のいずれかである。別の実施態様では、単離された胎盤細胞は、CD34^-、かつCD10⁺
、CD29⁺、CD44⁺、CD54⁺、CD90⁺、又はOCT-4⁺のいずれかである。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、CD200⁺及びOCT-4⁺である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、CD73
⁺及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、HLA-G^-であ
る。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞は、CD34^-、CD38^-
、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞
は、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200⁺
、OCT-4⁺胎盤細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺、及びHLA-G^-である。別の具
体的な実施態様では、該単離されたCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞は、該単離された細胞を含む
胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該集団による
1以上の胚様体様体の産生を促進する。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD200⁺
、OCT-4⁺胎盤細胞は、幹細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態
様では、該単離されたCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から
単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、CD20
0⁺、OCT-4⁺胎盤細胞を含む、例えば、CD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞が濃縮されている、細胞の
集団である。様々な実施態様では、該細胞集団内の細胞の少なくとも約10％、少なくとも
約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、又は少なくとも約60
％は、単離されたCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞である。別の実施態様では、該細胞の少なくと
も約70％は、該単離されたCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞である。別の実施態様では、該細胞集
団内の細胞の少なくとも約80％、90％、95％、又は99％は、該単離されたCD200⁺、OCT-4⁺
胎盤細胞である。該単離された集団の具体的な実施態様では、該単離されたCD200⁺、OCT-
4⁺胎盤細胞はさらに、CD73⁺及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離され
たCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞はさらに、HLA-G^-である。別の具体的な実施態様では、該単離
されたCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的
な実施態様では、該単離されたCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、CD45^-
、CD73⁺、CD105⁺、及びHLA-G^-である。別の具体的な実施態様では、該細胞集団は、胚様
体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、1以上の胚様体様体を産生する。別の
具体的な実施態様では、該細胞集団は、単離されたCD200⁺、OCT-4⁺胎盤細胞ではない胎盤
細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該細胞集団は、これらのマーカー
を示さない胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、CD73⁺、CD105⁺、及びHLA-G^-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD7
3⁺、CD105⁺、及びHLA-G^-胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体
的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38
^-、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-
胎盤細胞はさらに、OCT-4⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD1
05⁺、HLA-G^-胎盤細胞はさらに、CD200⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離され
たCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺、及びCD200⁺
である。別の具体的な実施態様では、単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞は、該
細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該
集団内での胚様体様体の形成を促進する。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73
⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞は、該単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞ではない胎
盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺、H
LA-G^-胎盤細胞は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離
されたCD73⁺、CD105⁺、及びHLA-G^-胎盤細胞を含む、例えば、単離されたCD73⁺、CD105⁺、
及びHLA-G^-胎盤細胞が濃縮されている、細胞の集団である。様々な実施態様では、該細胞
の集団内の細胞の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも
約40％、少なくとも約50％、又は少なくとも約60％は、単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G
^-胎盤細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約70％は、単
離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の
細胞の少なくとも約90％、95％、又は99％は、単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細
胞である。上記の集団の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎
盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離
されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の
具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞はさらに、OCT-4⁺
である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞はさ
らに、CD200⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-
胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺、及びCD200⁺である。別の具体的な実
施態様では、該細胞集団は、CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離
されている。別の具体的な実施態様では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎
盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、CD73⁺及びCD105⁺であり、かつ該CD73⁺、CD105⁺細胞を含む単離された胎盤細胞の集
団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該集団内での1以上の胚様
体様体の形成を促進する。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤
細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離さ
れたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的な実
施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、OCT-4⁺である。別の具体的
な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-
、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞は
、該細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離され
たCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、CD73
⁺、CD105⁺であり、かつ該細胞を含む単離された胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を
可能にする条件下で培養したとき、該集団内での1以上の胚様体様体の形成を促進する単
離された胎盤細胞を含む、例えば、該単離された胎盤細胞が濃縮されている、細胞の集団
である。様々な実施態様では、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約10％、少なくとも約
20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、又は少なくとも約60％
は、該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の
細胞の少なくとも約70％は、該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞である。別の実施態様
では、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約90％、95％、又は99％は、該単離されたCD73
⁺、CD105⁺胎盤細胞である。上記の集団の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD
105⁺胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様では、
該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具
体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、OCT-4⁺である。別
の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、CD200⁺である
。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD
38^-、CD45^-、OCT-4⁺、及びCD200⁺である。別の具体的な実施態様では、該細胞集団は、該
単離されたCD73⁺、CD105⁺胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な
実施態様では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている
。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、OCT-4⁺であり、かつ胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該細胞
を含む単離された胎盤細胞の集団内での1以上の胚様体様体の形成を促進する。具体的な
実施態様では、該単離されたOCT-4⁺胎盤細胞はさらに、CD73⁺及びCD105⁺である。別の具
体的な実施態様では、該単離されたOCT-4⁺胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-
である。別の具体的な実施態様では、該単離されたOCT-4⁺胎盤細胞はさらに、CD200⁺であ
る。別の具体的な実施態様では、該単離されたOCT-4⁺胎盤細胞はさらに、CD73⁺、CD105⁺
、CD200⁺、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたO
CT-4⁺胎盤細胞は、OCT-4⁺胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な
実施態様では、該単離されたOCT-4⁺胎盤細胞は、これらの特徴を示さない胎盤細胞から単
離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、OCT-
4⁺であり、かつ該細胞を含む単離された胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にす
る条件下で培養したとき、該集団内での1以上の胚様体様体の形成を促進する単離された
胎盤細胞を含む、例えば、該単離された胎盤細胞が濃縮されている、細胞の集団である。
様々な実施態様では、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少
なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、又は少なくとも約60％は、該単
離されたOCT-4⁺胎盤細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の細胞の少なくとも
約70％は、該単離されたOCT-4⁺胎盤細胞である。別の実施態様では、該細胞の集団内の細
胞の少なくとも約80％、90％、95％、又は99％は、該単離されたOCT-4⁺胎盤細胞である。
上記の集団の具体的な実施態様では、該単離されたOCT-4⁺胎盤細胞はさらに、CD34^-、CD3
8^-、又はCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたOCT-4⁺胎盤細胞はさら
に、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該単離されたOCT-4⁺
胎盤細胞はさらに、CD73⁺及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離されたO
CT-4⁺胎盤細胞はさらに、CD200⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離されたOCT-4
⁺胎盤細胞はさらに、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。別の具
体的な実施態様では、該細胞集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の
具体的な実施態様では、該細胞集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離さ
れている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、単離されたHLA-A、B、C⁺、CD45^-、CD133^-、及びCD34^-胎盤細胞である。別の実施態
様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤細
胞を含む細胞の集団であり、ここで、該単離された細胞集団内の細胞の少なくとも約70％
、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％は、
単離されたHLA-A、B、C⁺、CD45^-、CD133^-、及びCD34^-胎盤細胞である。具体的な実施態様
では、該単離された胎盤細胞又は単離された胎盤細胞の集団は、HLA-A、B、C⁺、CD45^-、C
D133^-、及びCD34^-胎盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様
では、該単離された胎盤細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、
該単離された胎盤細胞集団は、母親成分を実質的に含まず；例えば、該単離された胎盤細
胞集団内の該細胞の少なくとも約40％、45％、5-0％、55％、60％、65％、70％、75％、9
0％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、単離されたCD10⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD45^-、CD117^-、及びCD133^-胎盤細胞である。別
の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離され
た胎盤細胞を含む細胞の集団であり、ここで、該細胞の集団内の細胞の少なくとも約70％
、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％は、
単離されたCD10⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD45^-、CD117^-、及びCD133^-胎盤細胞である。具体的な
実施態様では、該単離された胎盤細胞又は単離された胎盤細胞の集団は、該単離された胎
盤細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様では、該単離された
CD10⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD45^-、CD117^-、及びCD133^-胎盤細胞は、非母親起源のものである
、すなわち、胎児の遺伝子型を有する。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細
胞集団内の該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90
％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。別の具体的な実施
態様では、該単離された胎盤細胞又は単離された胎盤細胞の集団は、これらの特徴を示さ
ない胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、単離されたCD10^-、CD33^-、CD44⁺、CD45^-、及びCD117^-胎盤細胞である。別の実施態
様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離された胎盤細
胞を含む、例えば、単離された胎盤細胞が濃縮されている、細胞の集団であり、ここで、
該細胞の集団内の細胞の少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少な
くとも約95％、又は少なくとも約99％は、単離されたCD10^-、CD33^-、CD44⁺、CD45^-、及び
CD117^-胎盤細胞である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞又は単離された胎
盤細胞の集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具体的な実施態様で
は、該単離された胎盤細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な実施態様では、該
細胞集団内の該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、
90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである。別の具体的な実
施態様では、該単離された胎盤細胞又は単離された胎盤細胞の集団は、これらのマーカー
を示さない胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、単離されたCD10^-、CD13^-、CD33^-、CD45^-、及びCD117^-胎盤細胞である。別の実施態
様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離されたCD10^-
、CD13^-、CD33^-、CD45^-、及びCD117^-胎盤細胞を含む、例えば、該胎盤細胞が濃縮されて
いる、細胞の集団であり、ここで、該集団内の細胞の少なくとも約70％、少なくとも約80
％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％は、CD10^-、CD13^-、CD
33^-、CD45^-、及びCD117^-胎盤細胞である。具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞
又は単離された胎盤細胞の集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離されている。別の具
体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、非母親起源のものである。別の具体的な
実施態様では、該細胞集団内の該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65
％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源のものである
。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞又は単離された胎盤細胞の集団は、
これらの特徴を示さない胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、HLA A、B、C⁺、CD45^-、CD34^-、及びCD133^-であり、かつさらに、CD10⁺、CD13⁺、CD
38⁺、CD44⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺、及び／もしくはHLA-G^-であり、かつ／又はCD117陰
性である。別の実施態様では、本明細書に記載の方法において有用な細胞集団は、単離さ
れた胎盤細胞を含む細胞の集団であり、ここで、該集団内の細胞の少なくとも約20％、25
％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％
、95％、98％、又は約99％は、HLA A、B、C^-、CD45^-、CD34^-、CD133^-であり、かつさらに
CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200が陽性であり、かつ／又はCD117及び／も
しくはHLA-Gが陰性である単離された胎盤細胞である。具体的な実施態様では、該単離さ
れた胎盤細胞又は単離された胎盤細胞の集団は、該細胞ではない胎盤細胞から単離されて
いる。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、非母親起源のものである。
別の具体的な実施態様では、該細胞集団内の該細胞の少なくとも約40％、45％、50％、55
％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、非母親起源
のものである。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞又は単離された胎盤細
胞の集団は、これらのマーカーを示さない胎盤細胞から単離されている。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、抗体結合によって決定した場合、CD200⁺及びCD10⁺であり、かつ抗体結合とRT-PCR
の両方で決定した場合、CD117^-である単離された胎盤細胞である。別の実施態様では、本
明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細胞は、CD10⁺、CD29^-、CD
54⁺、CD200⁺、HLA-G^-、MHCクラスI⁺、及びβ-2-ミクログロブリン⁺である、単離された胎
盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞である。別の実施態様では、本明細書に
記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細胞は、少なくとも1つの細胞マー
カーの発現が、間葉系幹細胞（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞）の場合よりも少なくとも
2倍高い胎盤細胞である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、非母親
起源のものである。別の具体的な実施態様では、該細胞集団内の該細胞の少なくとも約40
％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％、又は
99％は、非母親起源のものである。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54／ICAM⁺、CD62E^-、CD62L^-、CD62P^-、CD80^-、CD
86^-、CD103^-、CD104^-、CD105⁺、CD106／VCAM⁺、CD144／VE-カドヘリン^low、CD184／CXCR4
^-、β2-ミクログロブリン^low、MHC-I^low、MHC-II^-、HLA-G^low、及び／又はPDL1^lowのうち
の1つ又は複数である、単離された胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞で
ある。具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、少なくともCD29⁺及びCD54⁺であ
る。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、少なくともCD44⁺及びCD106⁺
である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、少なくともCD29⁺である
。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞集団は、単離
された胎盤細胞を含み、かつ該細胞集団内の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、
90％、95％、98％、又は99％は、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54／ICAM⁺、CD62-E^-、
CD62-L^-、CD62-P^-、CD80^-、CD86^-、CD103^-、CD104^-、CD105⁺、CD106／VCAM⁺、CD144／VE-
カドヘリン^dim、CD184／CXCR4^-、β2-ミクログロブリン^dim、HLA-I^dim、HLA-II^-、HLA-G^d
im、及び／又はPDL1^dimのうちの1つ又は複数である単離された胎盤細胞である。別の具体
的な実施態様では、該細胞集団内の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95
％、98％、又は99％は、CD10⁺、CD29⁺、CD44⁺、CD45^-、CD54／ICAM⁺、CD62-E^-、CD62-L^-
、CD62-P^-、CD80^-、CD86^-、CD103^-、CD104^-、CD105⁺、CD106／VCAM⁺、CD144／VE-カドヘ
リン^dim、CD184／CXCR4^-、β2-ミクログロブリン^dim、MHC-I^dim、MHC-II^-、HLA-G^dim、及
びPDL1^dimである。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細
胞は、CD10⁺、CD29⁺、CD34^-、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD90⁺、SH2⁺、SH3⁺、SH4⁺、
SSEA3^-、SSEA4^-、OCT-4⁺、及びABC-p⁺のうちの1つもしくは複数、又は全てである単離さ
れた胎盤細胞であり、ここで、ABC-pは、胎盤特異的ABC輸送体タンパク質（乳癌耐性タン
パク質（BCRP）及びミトキサントロン耐性タンパク質（MXR）としても知られる）であり
、ここで、該単離された胎盤細胞は、臍帯血が抜かれ、かつ残留血液を取り除くように灌
流された、哺乳動物、例えば、ヒトの胎盤の灌流によって得られる。

上記の特徴のいずれかの別の具体的な実施態様では、細胞マーカー（例えば、分化抗原
群又は免疫学的マーカー）の発現は、フローサイトメトリーで決定され；別の具体的な実
施態様では、該マーカーの発現は、RT-PCRで決定される。

遺伝子プロファイリングによって、単離された胎盤細胞、及び単離された胎盤細胞の集
団は、他の細胞、例えば、間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞と区別可能であ
ることが確認されている。本明細書に記載の単離された胎盤細胞は、例えば、その発現が
、骨髄由来間葉系幹細胞と比較して、単離された胎盤細胞、又は特定の単離された臍帯幹
細胞で有意により高い、1種以上の遺伝子の発現に基づいて、間葉系幹細胞と区別するこ
とができる。特に、本明細書で提供される治療方法において有用な単離された胎盤細胞は
、その発現が、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞でよりも、単離された胎盤細胞で有意によ
り高い（すなわち、少なくとも2倍高い）1種以上の遺伝子の発現に基づいて、間葉系幹細
胞と区別することができ、ここで、該1種以上の遺伝子は、これらの細胞を同等の条件下
で成長させたとき、ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、
COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、G
PRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MAT
N2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC
5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A、又は前述のもののいずれかの組合せである。
例えば、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特
許出願公開第2007／0275362号を参照されたい。特定の具体的な実施態様では、該1種以上
の遺伝子の該発現は、例えば、RT-PCR、又は例えば、U133-Aマイクロアレイ（Affymetrix
）を用いるマイクロアレイ解析によって決定される。別の具体的な実施態様では、該単離
された胎盤細胞は、DMEM-LG（例えば、Gibco製）；2％胎仔ウシ血清（例えば、Hyclone L
abs.製）；1×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）；1×リノール酸-ウシ血清ア
ルブミン（LA-BSA）；10^-9Mデキサメタゾン（例えば、Sigma製）；10^-4Mアスコルビン酸2
-ホスフェート（例えば、Sigma製）；上皮成長因子10ng／mL（例えば、R&D Systems製）
；及び血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／mL（例えば、R&D Systems製）を含む培地中
で、何回かの集団倍加、例えば、約3～約35回の範囲の集団倍加の間、培養したときに、
該1種以上の遺伝子を発現する。別の具体的な実施態様では、単離された胎盤細胞に特異
的な又は単離された臍帯細胞に特異的な遺伝子は、CD200である。

これらの遺伝子に対する特異的な配列は、2008年3月現在、GenBankにおいて、アクセッ
ション番号NM_001615（ACTG2）、BC065545（ADARB1）、（NM_181847（AMIG02）、AY35859
0（ARTS-1）、BC074884（B4GALT6）、BC008396（BCHE）、BC020196（C11orf9）、BC03110
3（CD200）、NM_001845（COL4A1）、NM_001846（COL4A2）、BC052289（CPA4）、BC094758
（DMD）、AF293359（DSC3）、NM_001943（DSG2）、AF338241（ELOVL2）、AY336105（F2RL
1）、NM_018215（FLJ10781）、AY416799（GATA6）、BC075798（GPR126）、NM_016235（GP
RC5B）、AF340038（ICAM1）、BC000844（IER3）、BC066339（IGFBP7）、BC013142（IL1A
）、BT019749（IL6）、BC007461（IL18）、（BC072017）KRT18、BC075839（KRT8）、BC06
0825（LIPG）、BC065240（LRAP）、BC010444（MATN2）、BC011908（MEST）、BC068455（N
FE2L3）、NM_014840（NUAK1）、AB006755（PCDH7）、NM_014476（PDLIM3）、BC126199（P
KP-2）、BC090862（RTN1）、BC002538（SERPINB9）、BC023312（ST3GAL6）、BC001201（S
T6GALNAC5）、BC126160又はBC065328（SLC12A8）、BC025697（TCF21）、BC096235（TGFB2
）、BC005046（VTN）、及びBC005001（ZC3H12A）で見出すことができる。

特定の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、これらの細胞を同等の条件下
で成長させたとき、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりも検出可能に高いレベルで、ACTG
2、ADARB1、AMIG02、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、
DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、I
ER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK
1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGF
B2、VTN、及びZC3H12Aの各々を発現する。

具体的な実施態様では、胎盤細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞（BM-MSC）よりも
検出可能に高いレベルで、CD200及びARTS1（1型腫瘍壊死因子のアミノペプチダーゼ調節
因子）；ARTS-1及びLRAP（白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ）；IL6（インター
ロイキン-6）及びTGFB2（形質転換成長因子、β2）；IL6及びKRT18（ケラチン18）；IER3
（即初期応答3）、MEST（中胚葉特異的転写産物ホモログ）、及びTGFB2；CD200及びIER3
；CD200及びIL6；CD200及びKRT18；CD200及びLRAP；CD200及びMEST；CD200及びNFE2L3（
核因子（赤血球由来2）-様3）；又はCD200及びTGFB2を発現し、ここで、該骨髄由来間葉
系幹細胞は、該単離された胎盤細胞が経た継代数と同等の培養継代数を経たものである。
他の具体的な実施態様では、胎盤細胞は、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞BM-MSCよりも検
出可能に高いレベルで、ARTS-1、CD200、IL6、及びLRAP；ARTS-1、IL6、TGFB2、IER3、KR
T18、及びMEST；CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2；ARTS-1、C
D200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3、及びTGFB2；又はIER3、MEST、及びTGFB2
を発現し、ここで、該骨髄由来間葉系幹細胞は、該単離された胎盤細胞が経た継代数と同
等の培養継代数を経たものである。

上に言及した遺伝子の発現を標準的な技術で評価することができる。例えば、遺伝子（
複数可）の配列に基づくプローブを個々に選択し、従来技術で構築することができる。該
遺伝子の発現は、例えば、該遺伝子の1つ又は複数に対するプローブを含むマイクロアレ
イ、例えば、Affymetrix GENECHIP（登録商標）ヒトゲノムU133A 2.0アレイ、又はAffyme
trix GENECHIP（登録商標）ヒトゲノムU133 Plus 2.0（Santa Clara, California）で評
価することができる。これらの遺伝子の発現は、特定のGenBankアクセッション番号の配
列が変更された場合でも評価することができるが、それは、変更された配列に特異的なプ
ローブを、周知の標準的な技術を用いてすぐに作製することができるからである。

これらの遺伝子の発現のレベルを用いて、単離された胎盤細胞の集団の同一性を確認す
るか、細胞の集団が少なくとも複数の単離された胎盤細胞を有することを確認するか、又
は同様のことをすることができる。その同一性が確認される単離された胎盤細胞の集団は
、クローン性のもの、例えば、単一の単離された胎盤細胞から拡大された単離された胎盤
細胞の集団、又は混合された幹細胞集団、例えば、複数の単離された胎盤細胞から拡大さ
れた単離された胎盤細胞をのみ含む細胞の集団、もしくは本明細書に記載の単離された胎
盤細胞と少なくとも1種類の他の細胞とを含む細胞の集団であることができる。

これらの遺伝子の発現のレベルを用いて、単離された胎盤細胞の集団を選択することが
できる。例えば、上記の遺伝子のうちの1つ又は複数の発現が、間葉系幹細胞の同等の集
団でよりも細胞の集団由来の試料で有意に高い場合、細胞、例えば、クローン性に拡大さ
れた細胞の集団を選択することができる。そのような選択は、複数の単離された胎盤細胞
集団由来の集団、その正体が不明の複数の細胞集団由来の集団などについてのものである
ことができる。

単離された胎盤細胞は、例えば、間葉系幹細胞対照における該1種以上の遺伝子の発現
のレベル、例えば、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞における該1種以上の遺伝子の発現の
レベルと比較したときの、1種以上のそのような遺伝子の発現のレベルに基づいて選択す
ることができる。一実施態様では、同数の間葉系幹細胞を含む試料における該1種以上の
遺伝子の発現のレベルは対照として用いられる。別の実施態様では、特定の条件下で試験
される単離された胎盤細胞についての対照は、該条件下の間葉系幹細胞における該1種以
上の遺伝子の発現のレベルを表す数値である。

特定の実施態様では、本明細書で提供される方法において有用な胎盤細胞（例えば、PD
AC）は、1～100ng／mLのVEGFへの4～21日間の曝露後、免疫局在化によって検出した場合
、CD34を発現しない。具体的な実施態様では、該胎盤接着細胞は、組織培養プラスチック
に接着する。別の具体的な実施態様では、該細胞の集団は、血管形成因子、例えば、血管
内皮成長因子（VEGF）、上皮成長因子（EGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、又は塩基
性線維芽細胞成長因子（bFGF）の存在下、例えば、MATRIGEL（商標）などの基材の上で培
養したとき、内皮細胞を誘導して、新芽又は管状構造を形成させる。

別の態様では、本明細書で提供されるPDAC、細胞の集団、例えば、PDACの集団、又は該
単離された細胞集団内の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、もし
くは98％がPDACである細胞の集団は、VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、
G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレクチン-1の
うちの1つもしくは複数、又は全てを、例えば、該細胞（単数又は複数）が成長する培養
培地中に分泌する。別の実施態様では、該PDACは、酸素正常条件（例えば、約20％又は約
21％のO2）と比較して、低酸素条件（例えば、約5％未満のO2）下で増大したレベルのCD2
02b、IL-8、及び／又はVEGFを発現する。

別の実施態様では、PDAC又は本明細書に記載のPDACを含む細胞の集団はいずれも、該胎
盤由来接着細胞と接触した内皮細胞の集団内での新芽又は管状構造の形成を引き起こすこ
とができる。具体的な実施態様では、該PDACをヒト内皮細胞と共培養し、それにより、新
芽もしくは管状構造を形成させるか、或いは例えば、細胞外マトリックスタンパク質、例
えば、コラーゲンI型及びIV型、並びに／又は血管形成因子、例えば、血管内皮成長因子
（VEGF）、上皮成長因子（EGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、もしくは塩基性線維芽
細胞成長因子（bFGF）の存在下、例えば、胎盤コラーゲン又はMATRIGEL（商標）などの基
材の中又はその上で、少なくとも4日間培養したとき、内皮細胞新芽の形成を支持する。
別の実施態様では、本明細書に記載の胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団はいずれも、血
管形成因子、例えば、血管内皮成長因子（VEGF）、肝細胞成長因子（HGF）、血小板由来
成長因子（PDGF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、又はインターロイキン-8（IL-8
）を分泌し、かつそれにより、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、コラーゲンI型
及びIV型の存在下、例えば、胎盤コラーゲン又はMATRIGEL（商標）などの基材の中又はそ
の上で培養したとき、ヒト内皮細胞を誘導して、新芽又は管状構造を形成させることがで
きる。

別の実施態様では、胎盤由来接着細胞（PDAC）を含む上記の細胞の集団はいずれも、血
管形成因子を分泌する。具体的な実施態様では、該細胞の集団は、血管内皮成長因子（VE
GF）、肝細胞成長因子（HGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、塩基性線維芽細胞成長因
子（bFGF）、及び／又はインターロイキン-8（IL-8）を分泌する。他の具体的な実施態様
では、PDACを含む細胞の集団は、1以上の血管形成因子を分泌し、かつそれにより、イン
ビトロの創傷治癒アッセイで遊走するようにヒト内皮細胞を誘導する。他の具体的な実施
態様では、胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団は、ヒト内皮細胞、内皮前駆体、筋細胞、
又は筋芽細胞の成熟、分化、又は増殖を誘導する。

本明細書に記載の単離された胎盤細胞は、初代培養下、又は例えば、DMEM-LG（Gibco）
、2％胎仔ウシ血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1×インスリン-トランスフェリン
-セレン（ITS）、1×レノレニック酸（lenolenic-acid）-ウシ血清アルブミン（LA-BSA）
、10^-9Mデキサメタゾン（Sigma）、10^-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート（Sigma）、上皮
成長因子（EGF）10ng／ml（R&D Systems）、血小板由来成長因子（PDGF-BB）10ng／ml（R
&D Systems）、及び100Uペニシリン／1000Uストレプトマイシンを含む培地中での増殖の
間に、上記の特徴（例えば、細胞表面マーカー及び／又は遺伝子発現プロファイルの組合
せ）を示す。

本明細書に開示されている胎盤細胞のいずれかの特定の実施態様では、細胞はヒトのも
のである。本明細書に開示されている胎盤細胞のいずれかの特定の実施態様では、細胞マ
ーカー特性又は遺伝子発現特性は、ヒトマーカー又はヒト遺伝子である。

該単離された胎盤細胞又は該単離された胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施
態様では、該細胞又は集団は拡大したものであり、例えば、少なくとも、約、もしくはわ
ずか1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは2
0回、又はそれより多くの回数継代したものであるか、或いは少なくとも、約、又はわず
か1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22
、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42
、43、44、45、46、47、48、49、又は50回の集団倍加の間、増殖させたものである。該単
離された胎盤細胞又は該単離された胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施態様で
は、該細胞又は集団は、初代単離株である。本明細書に開示されている、単離された胎盤
細胞、又は単離された胎盤細胞を含む細胞の集団の別の具体的な実施態様では、該単離さ
れた胎盤細胞は、胎児起源のものである（すなわち、胎児の遺伝子型を有する）。

特定の実施態様では、該単離された胎盤細胞は、成長培地、すなわち、増殖を促進する
ように調合された培地中で培養する間、例えば、成長培地中での増殖の間、分化しない。
別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、増殖するためにフィーダー層を必
要としない。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、フィーダー細胞層の
欠如という理由だけで、フィーダー層の非存在下の培養では分化しない。

別の実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞は、単離され
た胎盤細胞であり、ここで、複数の該単離された胎盤細胞は、アルデヒドデヒドロゲナー
ゼ活性アッセイで評価したとき、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）陽性である。その
ようなアッセイは当技術分野で公知である（例えば、Bostian及びBettsの文献（Biochem.
J., 173, 787,（1978））を参照されたい）。具体的な実施態様では、該ALDHアッセイは
、ALDEFLUOR（登録商標）（Aldagen社, Ashland, Oregon）をアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ活性のマーカーとして用いる。具体的な実施態様では、該複数は、該細胞の集団内の細
胞の約3％～約25％である。別の実施態様では、単離された臍帯細胞、例えば、単離され
た多能性臍帯細胞の集団が本明細書で提供され、ここで、複数の該単離された臍帯細胞は
、ALDEFLUOR（登録商標）をアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の指標として用いるアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ活性アッセイで評価したとき、アルデヒドデヒドロゲナーゼ陽性で
ある。具体的な実施態様では、該複数は、該細胞の集団内の細胞の約3％～約25％である
。別の実施態様では、該単離された胎盤細胞又は単離された臍帯細胞の集団は、ほぼ同等
数の細胞を有し、かつ同じ条件下で培養された骨髄由来間葉系幹細胞の集団よりも少なく
とも3倍、又は少なくとも5倍高いALDH活性を示す。

本明細書に記載の単離された胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれかの特定の実施態様で
は、該細胞の集団内の胎盤細胞は、母親の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例え
ば、該集団内の胎盤細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％
、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％は、胎児の遺伝子型を有する。本明細書に記
載の単離された胎盤細胞を含む細胞の集団のいずれかの特定の他の実施態様では、該胎盤
細胞を含む細胞の集団は、母親の遺伝子型を有する細胞を実質的に含まず；例えば、該集
団内の細胞の少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％
、90％、95％、98％、又は99％は、胎児の遺伝子型を有する。

上記の単離された胎盤細胞又は単離された胎盤細胞の細胞集団のいずれかの具体的な実
施態様では、該細胞、又は該集団内の細胞の少なくとも約95％もしくは約99％の核型は、
正常である。上記の胎盤細胞又は細胞集団のいずれかの別の具体的な実施態様では、該細
胞、又は該細胞の集団内の細胞は、非母親起源のものである。

上記のマーカーの組合せのいずれかを有する単離された胎盤細胞、又は単離された胎盤
細胞の集団を任意の比で組み合わせることができる。上記の単離された胎盤細胞集団のう
ちのいずれか2つ又はそれより多くの集団を組み合わせて、単離された胎盤細胞集団を形
成させることができる。例えば、単離された胎盤細胞の集団は、上記のマーカー組合せの
うちの1つによって定義される第1の単離された胎盤細胞の集団と、上記のマーカー組合せ
のうちの別のものによって定義される第二の単離された胎盤細胞の集団とを含むことがで
き、ここで、該第1の集団と第二の集団は、約1：99、2：98、3：97、4：96、5：95、10：
90、20：80、30：70、40：60、50：50、60：40、70：30、80：20、90：10、95：5、96：4
、97：3、98：2、又は約99：1の比で組み合わされる。同じやり方で、上記の単離された
胎盤細胞、又は単離された胎盤細胞集団のいずれか3つ、4つ、5つ、又はそれより多くを
組み合わせることができる。

本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細胞は、例えば、酵素
的破壊（第5.3.3節参照）もしくは灌流（第5.3.4節参照）を用いるか、又はこれらを用い
ない、胎盤組織の破壊によって得ることができる。例えば、単離された胎盤細胞の集団は
、臍帯血が抜かれ、かつ残留血液を取り除くように灌流された哺乳動物の胎盤を灌流する
こと；該胎盤を灌流溶液で灌流すること；及び該灌流溶液を回収すること（ここで、灌流
後の該灌流溶液は、単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を含む）；並びに該細胞の
集団から複数の該単離された胎盤細胞を単離することを含む方法によって生じさせること
ができる。具体的な実施態様では、該灌流溶液を臍帯静脈と臍帯動脈の両方に通し、それ
が胎盤から浸出した後に回収する。別の具体的な実施態様では、該灌流溶液を臍帯静脈に
通して、臍帯動脈から回収するか、又は臍帯動脈に通して、臍帯静脈から回収する。

様々な実施態様では、胎盤の灌流によって得られる細胞の集団内に含まれる単離された
胎盤細胞は、該胎盤細胞の集団の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％
、又は少なくとも99.5％である。別の具体的な実施態様では、灌流によって回収される単
離された胎盤細胞は、胎児の細胞と母親の細胞を含む。別の具体的な実施態様では、灌流
によって回収される単離された胎盤細胞は、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、
95％、99％、又は少なくとも99.5％胎児細胞である。

別の具体的な実施態様では、灌流によって回収される、本明細書に記載の単離された胎
盤細胞の集団を含む組成物が本明細書で提供され、ここで、該組成物は、該単離された胎
盤細胞を回収するために用いられた灌流溶液の少なくとも一部を含む。

本明細書に記載の単離された胎盤細胞の単離された集団は、該細胞を含む胎盤細胞の集
団を得るために組織破壊酵素で胎盤組織を消化し、かつ複数の胎盤細胞を該胎盤細胞の残
りの部分から単離、又は実質的に単離することによって生じさせることができる。胎盤の
全体、又は任意の部分を消化して、本明細書に記載の単離された胎盤細胞を得ることがで
きる。具体的な実施態様では、例えば、該胎盤組織は、全胎盤、羊膜、絨毛膜、羊膜と絨
毛膜の組合せ、又は前述のもののいずれかの組合せであることができる。他の具体的な実
施態様では、組織破壊酵素は、トリプシン又はコラゲナーゼである。様々な実施態様では
、胎盤の消化によって得られる細胞の集団内に含まれる単離された胎盤細胞は、該胎盤細
胞の集団の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、又は少なくとも99.5
％である。

上記の単離された胎盤細胞集団、又は単離された胎盤細胞の集団は、通常、約、少なく
とも、又は以下の個数を超えない1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1
×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×1O¹¹個、又はそれより多くの単
離された胎盤細胞を含むことができる。本明細書に記載の治療方法において有用な単離さ
れた胎盤細胞の集団は、例えば、トリパンブルー排出などによって決定した場合、少なく
とも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、又は99％の
生存している単離された胎盤細胞を含む。

（5.2.3 培養下の成長）
任意の哺乳動物細胞に関して、本明細書中の第5.4.2節に記載の単離された胎盤細胞の
成長は、成長用に選択される特定の培地に一部左右される。最適な条件下では、該単離さ
れた胎盤細胞は、通常、約1日で数が2倍になる。培養中、本明細書に記載の単離された胎
盤細胞は、培養液中の基材、例えば、組織培養容器（例えば、組織培養ディッシュプラス
チック、フィブロネクチンコーティングしたプラスチックなど）の表面に接着し、単層を
形成する。

本明細書に記載の単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団は、適切な条件下で培養し
たとき、胚様体様体を形成することができる、すなわち、3次元の細胞塊が、接着細胞層
の上で成長する。胚様体様体内の細胞は、ごく初期の幹細胞と関連するマーカー、例えば
、OCT-4、Nanog、SSEA3、及びSSEA4を発現することができる。胚様体様体内の細胞は、通
常、本明細書に記載の単離された胎盤細胞が接着するように、培養基材に接着するのでは
なく、培養中、接着細胞に付着した状態であり続ける傾向にある。胚様体様体は、接着性
の単離された胎盤細胞の非存在下では形成されないので、胚様体様体細胞は、生存を接着
性の単離された胎盤細胞に依存している。接着性の単離された胎盤細胞は、したがって、
該接着性の単離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団内での1以上の胚様体様体の成長を
促進する。理論に束縛されることを望むものではないが、胚様体様体の細胞は、胚性幹細
胞が細胞のフィーダー層上で成長するのと同じ程度に、接着性の単離された胎盤細胞上で
成長すると考えられる。

（5.3 単離された胎盤細胞を得る方法）
（5.3.1 幹細胞回収組成物）
胎盤細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の単離された胎盤細胞を回収及び単離する方
法が本明細書でさらに提供される。通常、そのような細胞は、生理的に許容し得る溶液、
例えば、細胞回収組成物を用いて、哺乳動物の胎盤から得られる。例示的な細胞回収組成
物は、その開示がその全体として引用により本明細書中に組み込まれている、「胎盤幹細
胞の回収及び器官の保存のための改善された培地（Improved Medium for Collecting Pla
cental Stem Cells and Preserving Organs）」という表題の関連米国特許出願公開第200
7／0190042号に詳細に記載されている。

細胞回収組成物は、細胞、例えば、本明細書に記載の単離された胎盤細胞の回収及び／
又は培養に好適な任意の生理的に許容し得る溶液、例えば、生理食塩水溶液（例えば、リ
ン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、0.9％NaClなど
）、培養培地（例えば、DMEM、H.DMEMなど）などを含むことができる。

細胞回収組成物は、回収の時点から培養の時点まで、単離された胎盤細胞を保存する、
すなわち、単離された胎盤細胞の死を防止するか、又は該単離された胎盤細胞の死を遅延
させるか、死滅する細胞の集団内の単離された胎盤細胞の数を低下させるなどの傾向があ
る1種以上の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤
（例えば、カスパーゼ阻害剤もしくはJNK阻害剤）；血管拡張剤（例えば、硫酸マグネシ
ウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、副腎皮質刺激ホルモン、副
腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシ
ン三リン酸、アデノシン、インドメタシンもしくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラ
ーゼ阻害剤など）；壊死阻害剤（例えば、2-（1H-インドール-3-イル）-3-ペンチルアミ
ノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、もしくはクロナゼパム）；TNF-α阻害
剤；及び／又は酸素担持ペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロオクチルブロミド
、ペルフルオロデシルブロミドなど）であることができる。

細胞回収組成物は、1種以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプ
ロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを含むことができる。その
ような酵素としては、コラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロス
トリジウム・ヒストリチカム（Clostridium histolyticum）由来のコラゲナーゼなど）；
ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE、ヒアルロニダーゼ
などが挙げられるが、これらに限定されない。

細胞回収組成物は、殺菌又は静菌有効量の抗生物質を含むことができる。特定の非限定
的な実施態様では、抗生物質は、マクロライド（例えば、例えば、トブラマイシン）、セ
ファロスポリン（例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、
セファクロール、セフィキシム、もしくはセファドロキシル）、クラリスロマイシン、エ
リスロマイシン、ペニシリン（例えば、ペニシリンV）、又はキノロン（例えば、オフロ
キサシン、シプロフロキサシン、もしくはノルフロキサシン）、テトラサイクリン、スト
レプトマイシンなどである。特定の実施態様では、抗生物質は、グラム陽性細菌及び／又
はグラム陰性細菌、例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Stap
hylococcus aureus）などに対して活性がある。一実施態様では、抗生物質は、例えば、
培養培地中、約0.005％～約0.01％（w／v）のゲンタマイシンである。

細胞回収組成物は、以下の化合物のうちの1つ又は複数を含むこともできる：アデノシ
ン（約1mM～約50mM）；D-グルコース（約20mM～約100mM）；マグネシウムイオン（約1mM
～約50mM）；一実施態様では、内皮の完全性及び細胞の生存能力を維持するのに十分な量
で存在する、分子量20,000ダルトン超の巨大分子（例えば、合成もしくは天然のコロイド
、約25g／l～約100g／l、もしくは約40g／l～約60g／lで存在する、デキストランもしく
はポリエチレングリコールなどの多糖）；酸化防止剤（例えば、約25μM～約100μMで存
在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビ
タミンC、もしくはビタミンE）；還元剤（例えば、約0.1mM～約5mMで存在するN-アセチル
システイン）；細胞内へのカルシウムの侵入を防止する薬剤（例えば、約2μM～約25μM
で存在するベラパミル）；ニトログリセリン（例えば、約0.05g／L～約0.2g／L）；一実
施態様では、残留血液の凝固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤（例えば、
約1000ユニット／l～約100,000ユニット／lの濃度で存在するヘパリンもしくはヒルジン
）；又はアミロライド含有化合物（例えば、約1.0μM～約5μMで存在するアミロライド、
エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド
、もしくはイソブチルアミロライド）。

（5.3.2 胎盤の回収及び取扱い）
通常、ヒトの胎盤を、出産後のその娩出後すぐに回収する。好ましい実施態様では、イ
ンフォームドコンセント後、及び患者の全病歴を取得して、該胎盤と関連付けた後、胎盤
を患者から回収する。好ましくは、この病歴は分娩後も続く。そのような病歴を用いて、
胎盤又はそれから採取される単離された胎盤細胞の後続的使用を調整することができる。
例えば、単離されたヒト胎盤細胞は、その病歴を考慮して、該胎盤と関連する幼児のため
の、又は親、兄弟姉妹、もしくはその幼児の他の血縁者のための個人医療に用いることが
できる。

単離された胎盤細胞の回収前に、臍帯血及び胎盤血を除去することが好ましい。特定の
実施態様では、分娩後、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血の回収プロセ
スに供することができる。通常、針又はカニューレを用い、重力の助けを借りて、胎盤を
放血させる（例えば、Andersonの米国特許第5,372,581号；Hesselらの米国特許第5,415,6
65号を参照されたい）。針又はカニューレを、通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やか
にマッサージして、胎盤からの臍帯血の排出を助けることができる。そのような臍帯血の
回収は、商業的に、例えば、LifeBank USA, Cedar Knolls, NJにより行なわれてもよい。
好ましくは、臍帯血を回収する間の組織破壊を最小限に抑えるために、胎盤を、それ以上
操作することなく、重力排出させる。

通常、臍帯血の回収、及び例えば、灌流又は組織解離による幹細胞の回収のために、胎
盤を、分娩室又は出産室から別の場所、例えば、実験室まで輸送する。例えば、胎盤を、
近位臍帯をクランプしたまま、滅菌されたジップロック式プラスチックバッグの中に入れ
、その後、このプラスチックバッグを断熱容器内に入れることによって、胎盤を（胎盤の
温度を20～28℃に維持する）滅菌された断熱輸送装置に入れて輸送することが好ましい。
別の実施態様では、その開示が引用により本明細書中に組み込まれている、係属中の米国
特許第7,147,626号に実質的に記載されているように、胎盤を臍帯血回収キットに入れて
輸送する。好ましくは、胎盤を、分娩から4～24時間後に、実験室に移送する。特定の実
施態様では、臍帯血の回収前に、胎盤への挿入部から4～5cm（センチメートル）以内のと
ころで、近位臍帯をクランプする。他の実施態様では、臍帯血の回収後、しかし、それ以
上の胎盤の処理前に、近位臍帯をクランプする。

胎盤は、細胞回収前に、滅菌条件下、かつ室温又は5～25℃の温度のいずれかで保存す
ることができる。胎盤を灌流して残留臍帯血を除去する前に、胎盤は、4～24時間、最大4
8時間、又は48時間よりも長い時間、保存してもよい。一実施態様では、胎盤は、娩出後
、約0時間から約2時間で採取される。胎盤は、5～25℃の温度で、抗凝血剤溶液に入れて
保存することが好ましい。好適な抗凝血剤溶液は当技術分野で周知である。例えば、ヘパ
リン又はワルファリンナトリウム溶液を用いることができる。好ましい実施態様では、抗
凝血剤溶液は、ヘパリン溶液（例えば、1:1000溶液中で1％w／w）を含む。放血された胎
盤は、胎盤細胞を回収する前に、36時間を超えない時間、保存することが好ましい。

哺乳動物の胎盤又はその一部は、一般に上記のように回収及び調製されれば、単離され
た胎盤細胞を得るために、任意の当技術分野で公知の方法で処理することができ、例えば
、灌流するか、又は破壊する、例えば、1種以上の組織破壊酵素で消化することができる
。

（5.3.3 胎盤組織の物理的破壊及び酵素的消化）
一実施態様では、幹細胞を、哺乳動物の胎盤の一部又は全ての物理的破壊によって、こ
の臓器から回収する。例えば、胎盤、又はその一部を、例えば、圧搾するか、剪断するか
、細かく切り刻むか、さいの目状に切るか、みじん切りにするか、液体に浸して柔らかく
するか、又は同様に処理することができる。その後、この組織を培養して、単離された胎
盤細胞の集団を得ることができる。通常、胎盤組織を、例えば、培養培地、生理食塩水溶
液、又は幹細胞回収組成物を用いて破壊する（第5.5.1節及び下記を参照されたい）。

物理的破壊及び／又は酵素的消化並びに幹細胞回収の前に、胎盤を構成要素に解剖する
ことができる。単離された胎盤細胞は、全胎盤を含む、羊膜、絨毛膜、臍帯、胎盤葉、又
はそれらの任意の組合せの全て又は一部から得ることができる。好ましくは、単離された
胎盤細胞は、羊膜及び絨毛膜を含む胎盤組織から得られる。通常、単離された胎盤細胞は
、胎盤組織の小さなブロック、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40
、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、又は約1000立
方ミリメートルの体積の胎盤組織のブロックの破壊によって得ることができる。破壊方法
が、例えば、トリパンブルー排出によって決定した場合、該臓器内の細胞の複数、より好
ましくは大部分、及びより好ましくは、少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、98％
、又は99％を生きた状態にとどめるという条件で、任意の物理的破壊方法を用いることが
できる。

単離された接着性胎盤細胞を、通常、娩出後の最初の約3日以内の任意の時点で、しか
し、好ましくは、娩出後、約8時間～約18時間で、胎盤、又はその一部から回収すること
ができる。

具体的な実施態様では、破壊された組織を、単離された胎盤細胞の増殖に好適な組織培
養培地中で培養する（例えば、胎盤細胞、例えば、PDACの培養を記載している、下の第5.
6節を参照されたい）。

別の具体的な実施態様では、単離された胎盤細胞を、胎盤組織の物理的破壊によって回
収し、ここで、該物理的破壊は、1種以上の組織消化酵素の使用によって達成することが
できる酵素的破壊を含む。胎盤、又はその一部を、1種以上の酵素で物理的に破壊及び消
化し、その後、得られた材料を細胞回収組成物に浸漬させるか、又は細胞回収組成物中に
混合することもできる。

好ましい細胞回収組成物は、1種以上の組織破壊酵素を含む。胎盤組織を破壊するため
に用いることができる酵素としては、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロ
テアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、又はエ
ラスターゼが挙げられる。セリンプロテアーゼは、血清中のα2ミクログロブリンによっ
て阻害されることがあり、そのため、消化に用いられる培地は、通常、無血清のものであ
る。EDTA及びDNアーゼは、細胞回収効率を増加させるために、酵素的消化手順において一
般的に用いられる。粘性のある消化液内に細胞が捕捉されることを避けるために、消化物
を希釈することが好ましい。

組織消化酵素の任意の組合せを用いることができる。トリプシンを用いる消化のための
典型的な濃度は、0.1％～約2％トリプシン、例えば、約0.25％トリプシンを含む。胎盤細
胞、例えば、胎盤幹細胞及び胎盤多能性細胞を遊離させるために、プロテアーゼを組み合
わせて、すなわち、2種以上のプロテアーゼを同じ消化反応で用いることができるか、又
はプロテアーゼを順次用いることができる。例えば、一実施態様では、胎盤、又はその一
部を、まず、約1～約2mg／mlの適量のコラゲナーゼIで、例えば、30分間消化し、その後
、約0.25％の濃度のトリプシンで、例えば、37℃で10分間消化する。セリンプロテアーゼ
を、他の酵素の使用後に連続して用いることが好ましい。

別の実施態様では、キレート剤、例えば、エチレングリコールビス（2-アミノエチルエ
ーテル）-N,N,N'N'-四酢酸（EGTA）又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、幹細胞を含
む幹細胞回収組成物に、又は幹細胞回収組成物で幹細胞を単離する前に、その中で組織を
破壊及び／もしくは消化する溶液に添加することにより、組織をさらに破壊することがで
きる。

消化後、消化物を、例えば、培養培地で3回洗浄し、洗浄した細胞を培養フラスコ中に
播種する。その後、細胞を示差的接着により単離し、例えば、生存能力、細胞表面マーカ
ー、分化などについて特徴付ける。

胎盤全体、又は胎盤の一部が、胎児細胞と母親細胞の両方を含む場合（例えば、胎盤の
一部が、絨毛膜又は胎盤葉を含む場合）、単離された胎盤細胞は、胎児起源と母親起源の
両方に由来する胎盤細胞の混合物を含むことができることが理解されるであろう。胎盤の
一部が、母親細胞（例えば、羊膜）を全く、又はごくわずかな数しか含まない場合、それ
から単離される胎盤細胞は、ほとんど胎児性の胎盤細胞（すなわち、胎児の遺伝子型を有
する胎盤細胞）しか含まないことになる。

胎盤細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の胎盤細胞を、示差的トリプシン処理（下の
第5.3.5節参照）、その後の、1以上の新しい培養容器における、新鮮な増殖培地中での培
養、任意でその後の、第二の示差的トリプシン処理工程によって、破壊された胎盤組織か
ら単離することができる。

（5.3.4 胎盤灌流）
胎盤細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の胎盤細胞を、哺乳動物の胎盤の灌流によっ
て得ることもできる。哺乳動物の胎盤を灌流して胎盤細胞を得る方法は、例えば、その各
々の開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、Haririの米国特
許第7,045,148号及び第7,255,729号、並びに米国特許出願公開第2007／0275362号及び第2
007／0190042号に開示されている。

胎盤細胞を、例えば、細胞回収組成物を灌流溶液として用いる、例えば、胎盤血管系を
通した灌流によって、回収することができる。一実施態様では、哺乳動物の胎盤を、灌流
溶液を臍帯動脈と臍帯静脈のどちらか又は両方に通すことによって灌流する。胎盤を通る
灌流溶液の流れを、例えば、胎盤の中への重力流を用いて達成することができる。好まし
くは、灌流溶液を、ポンプ、例えば、蠕動ポンプを用いて、胎盤に強制的に通す。臍帯静
脈に、例えば、滅菌チューブなどの滅菌された接続装置に接続されている、カニューレ、
例えば、TEFLON（登録商標）又はプラスチックカニューレを挿入することができる。この
滅菌された接続装置は、灌流マニフォールドに接続されている。

灌流に備えて、臍帯動脈及び臍帯静脈が胎盤の最も高い位置に配置されるような形で、
胎盤を配向させる（例えば、ぶら下げる）ことが好ましい。灌流液を胎盤血管系及び周囲
組織に通すことによって、胎盤を灌流することができる。灌流液を臍帯静脈に通し、臍帯
動脈から回収するか、又は灌流液を臍帯動脈に通し、臍帯静脈から回収することによって
、胎盤を灌流することもできる。

一実施態様では、例えば、臍帯動脈及び臍帯静脈を、例えば、柔軟なコネクタを介して
灌流溶液のリザーバに接続されたピペットに同時に接続する。灌流溶液を、臍帯静脈及び
臍帯動脈に通す。灌流溶液は、血管壁から滲出し、かつ／又は血管壁を通って、胎盤の周
囲組織中に入り、妊娠中、母親の子宮に付着していた胎盤表面から好適な開放容器中に回
収される。灌流溶液を臍帯の開放部に通して導入し、母親の子宮壁と接続している胎盤壁
の開口部から流出又は浸出させることもできる。「受け皿（pan）」法と呼ぶことができ
るこの方法で回収される胎盤細胞は、通常、胎児細胞と母親細胞の混合物である。

別の実施態様では、灌流溶液を臍帯静脈に通し、臍帯動脈から回収するか、又は臍帯動
脈に通し、臍帯静脈から回収する。「閉回路」法と呼ぶことができるこの方法で回収され
る胎盤細胞は、通常、ほとんど胎児のものしかない。

灌流液が胎盤の母親側から滲出した後に灌流液が回収される、受け皿法を用いる灌流は
、胎児細胞と母親細胞の混合物をもたらすことが理解されるだろう。結果として、この方
法で回収された細胞は、胎児起源と母親起源の両方の、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又
は胎盤多能性細胞の混合集団を含むことができる。対照的に、灌流液が1つ又は2つの胎盤
血管に通され、もっぱら残りの血管（複数可）を通して回収される、もっぱら胎盤血管系
を通した閉回路法での灌流は、ほぼ胎児起源のものしかない胎盤細胞の集団の回収をもた
らす。

閉回路灌流法を、一実施態様では、次のように実施することができる。出産後胎盤を、
出産後、約48時間以内に得る。臍帯をクランプし、クランプの上方で切断する。臍帯は、
廃棄することができるか、又は例えば、臍帯幹細胞を回収するために、及び／もしくは生
体材料の産生用に臍帯膜を処理するために、処理することができる。羊膜を灌流中保持す
ることができるか、又は例えば、指を用いる鈍的剥離を用いて絨毛膜から分離することが
できる。羊膜を灌流前に絨毛膜から分離する場合、それを、例えば、廃棄するか、又は例
えば、酵素的消化によって幹細胞を得るために、もしくは例えば、羊膜生体材料、例えば
、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願
公開第2004／0048796号に記載されている生体材料を産生するために、処理することがで
きる。例えば、滅菌ガーゼを用いて、全ての目に見える血の塊及び残留血液を胎盤から除
去した後、例えば、臍帯膜を一部切断して、臍帯の断面を露出させることにより、臍帯血
管を露出させる。血管を確認し、それを、例えば、閉じたアリゲータークランプを各々の
血管の切断端に通して前進させることによって広げる。その後、装置、例えば、灌流装置
又は蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブを胎盤動脈の各々に挿入する。ポンプ
は、この目的に好適な任意のポンプ、例えば、蠕動ポンプであることができる。その後、
滅菌された回収リザーバ、例えば、250mL回収バッグなどの血液バッグに接続されたプラ
スチックチューブを胎盤静脈に挿入する。或いは、ポンプに接続されたチューブを胎盤静
脈に挿入し、回収リザーバ（複数可）に接続されたチューブを胎盤動脈の一方又は両方に
挿入する。その後、胎盤を、ある容量の灌流溶液、例えば、約750mlの灌流溶液で灌流す
る。その後、灌流液中の細胞を、例えば、遠心分離によって回収する。特定の実施態様で
は、灌流して、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞及び／又は胎盤多能性細胞を回収する前に
残留血液を除去するために、胎盤を、灌流溶液、例えば、100～300mLの灌流溶液で灌流す
る。別の実施態様では、灌流して胎盤細胞を回収する前に残留血液を除去するために、胎
盤を灌流溶液で灌流することはない。

一実施態様では、灌流中、近位臍帯をクランプし、より好ましくは、胎盤への臍帯挿入
部から4～5cm（センチメートル）以内のところで、近位臍帯をクランプする。

放血プロセスの間の哺乳動物の胎盤からの灌流液の最初の回収物は、通常、臍帯血及び
／又は胎盤血の残留赤血球のために色が付いている。該灌流液は、灌流が進み、残留臍帯
血細胞が胎盤から洗い流されるにつれて、より無色になっていく。通常、最初に胎盤を放
血するためには、30～100ml（ミリリットル）の灌流液で十分であるが、観察された結果
次第で、より多くの又はより少ない灌流液を用いることができる。

胎盤細胞を単離するために用いられる灌流液の容量は、回収しようとする細胞の数、胎
盤の大きさ、単一の胎盤から行なわれる回収の回数などによって異なり得る。様々な実施
態様では、灌流液の容量は、50mL～5000mL、50mL～4000mL、50mL～3000mL、100mL～2000m
L、250mL～2000mL、500mL～2000mL、又は750mL～2000mLであることができる。通常、放血
後、胎盤を700～800mLの灌流液で灌流する。

胎盤を、数時間から数日間かけて、複数回灌流することができる。胎盤を複数回灌流し
ようとする場合、それを、容器（container）又は他の好適な容器（vessel）中、無菌条
件下で維持又は培養し、細胞回収組成物、又は抗凝血剤（例えば、ヘパリン、ワルファリ
ンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン）を含むかもしくは含まない、及び／
又は抗微生物剤（例えば、β-メルカプトエタノール（0.1mM）；ストレプトマイシン（例
えば、40～100μg／ml）、ペニシリン（例えば、40U／ml）、アンフォテリシンB（例えば
、0.5μg／ml）などの抗生物質を含むかもしくは含まない、標準的な灌流溶液（例えば、
リン酸緩衝生理食塩水（「PBS」）などの生理食塩水溶液）で灌流することができる。一
実施態様では、胎盤を、灌流及び灌流液の回収前に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1
1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24時間、又は2もしくは
3日間もしくはそれより長い間、維持又は培養するように、単離された胎盤を、灌流液を
回収しないで、しばらくの間、維持又は培養する。灌流された胎盤を、さらにもう1回以
上、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、2
0、21、22、23、24時間、又はそれより長い時間、維持し、例えば、700～800mLの灌流液
で再び灌流することができる。胎盤を、1、2、3、4、5回、又はそれより多く、例えば、1
、2、3、4、5、又は6時間に1回、灌流することができる。好ましい実施態様では、回収さ
れた有核細胞の数が100細胞／mlを下回るまで、胎盤の灌流、及び灌流溶液、例えば、細
胞回収組成物の回収を繰り返す。異なる時点の灌流液をさらに個別に処理して、時間依存
的な細胞、例えば、幹細胞の集団を回収することができる。異なる時点からの灌流液をプ
ールすることもできる。好ましい実施態様では、娩出後、約8時間～約18時間の間に、1回
又は複数回で、胎盤細胞を回収する。

灌流は、好ましくは、該溶液で灌流していないし、胎盤細胞を得るために他の方法で（
例えば、組織破壊、例えば、酵素的消化によって）処理してもいない、哺乳動物の胎盤か
ら得ることができる数よりも有意に多い胎盤細胞の回収をもたらす。この文脈において、
「有意により多い」とは、少なくとも10％より多いことを意味する。灌流によって、例え
ば、胎盤、又はその一部が培養された培養培地から単離することができる胎盤細胞の数よ
りも有意に多い胎盤細胞が得られる。

胎盤細胞を、1種以上のプロテアーゼ又は他の組織破壊酵素を含む溶液での灌流によっ
て、胎盤から単離することができる。具体的な実施態様では、胎盤又はその部分（例えば
、羊膜、羊膜と絨毛膜、胎盤小葉もしくは胎盤葉、臍帯、又は前述のもののいずれかの組
合せ）を25～37℃に置き、1種以上の組織破壊酵素とともに、200mLの培養培地中、30分間
インキュベートする。灌流液由来の細胞を回収し、4℃に置き、5mM EDTA、2mMジチオスレ
イトール、及び2mMβ-メルカプトエタノールを含む冷たい阻害剤混合物で洗浄する。数分
後、胎盤細胞を冷たい（例えば、4℃の）幹細胞回収組成物で洗浄する。

（5.3.5 胎盤細胞の単離、選別、及び特徴付け）
灌流で得られたものであれ、物理的破壊、例えば、酵素的消化によって得られたもので
あれ、単離された胎盤細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の細胞を、最初に、Ficoll勾
配遠心分離によって、他の細胞から純化（すなわち、単離）することができる。そのよう
な遠心分離は、遠心分離速度などについての任意の標準的なプロトコルに従うことができ
る。一実施態様では、例えば、胎盤から回収された細胞を、室温で15分間、5000×gでの
遠心分離によって灌流液から回収し、これにより、細胞は、例えば、夾雑している破片及
び血小板から分離される。別の実施態様では、胎盤灌流液を、約200mlに濃縮し、Ficoll
上で穏やかに層を形成させ、22℃で20分間、約1100×gで遠心分離し、該細胞の低密度界
面層をさらなる処理のために回収する。

細胞ペレットを、新鮮な幹細胞回収組成物、又は細胞維持、例えば、幹細胞維持に好適
な培地、例えば、2U／mlヘパリン及び2mM EDTA（GibcoBRL,NY）を含むIMDM無血清培地に
再懸濁することができる。全単核細胞画分を、例えば、製造者の推奨手順に従って、Lymp
hoprep（Nycomed Pharma, Oslo, Norway）を用いて単離することができる。

灌流又は消化によって得られた胎盤細胞を、例えば、0.2％EDTA（Sigma, St. Louis MO
）を含む0.05％トリプシン溶液を用いる示差的トリプシン処理によって、例えば、さらに
、又は最初に単離することができる。組織培養プラスチック接着性である単離された胎盤
細胞は、通常、約5分以内にプラスチック表面から剥がれるが、他の接着性の集団は、通
常、20～30分間を超えるインキュベーションを必要とするので、示差的トリプシン処理が
可能である。トリプシン処理、及び例えば、トリプシン中和溶液（TNS、Cambrex）を用い
るトリプシン中和後、剥がれた胎盤細胞を回収することができる。接着細胞の単離の一実
施態様では、一定分量の、例えば、約5～10×10⁶個の細胞を、いくつかのT-75フラスコ、
好ましくは、フィブロネクチンコーティングしたT75フラスコの各々に入れる。そのよう
な実施態様では、該細胞を、市販の間葉系幹細胞成長培地（MSCGM）（Cambrex）を用いて
培養し、組織培養インキュベーター（37℃、5％CO₂）内に置くことができる。10～15日後
、PBSで洗浄することにより、接着していない細胞をフラスコから除去する。その後、PBS
をMSCGMに交換する。フラスコを、様々な接着細胞型の存在について、特に、線維芽細胞
様細胞の塊の同定及び拡大のために、毎日調べることが好ましい。

哺乳動物の胎盤から回収された細胞の数と種類を、例えば、フローサイトメトリー、細
胞選別、免疫細胞化学（例えば、組織特異的もしくは細胞マーカー特異的抗体による染色
）、蛍光活性化細胞選別（FACS）、磁気活性化細胞選別（MACS）などの標準的な細胞検出
技術を用いて形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することにより、光学顕微鏡もしく
は共焦点顕微鏡法を用いて細胞の形態を調べることにより、並びに／又はPCR及び遺伝子
発現プロファイリングなどの当技術分野で周知の技術を用いて遺伝子発現の変化を測定す
ることにより、モニタリングすることができる。これらの技術を、同様に、1種以上の特
定のマーカーが陽性である細胞を同定するためにも用いることができる。例えば、CD34に
対する抗体を用いて、上記の技術を用いて、細胞が検出可能な量のCD34を含むかどうかを
決定することができ；もしそうであるならば、細胞はCD34⁺である。同様に、細胞がRT-PC
Rで検出されるのに十分なOCT-4 RNA、又は成体細胞よりも有意に多くのOCT-4 RNAを産生
するならば、該細胞は、OCT-4⁺である。細胞表面マーカー（例えば、CD34などのCDマーカ
ー）に対する抗体及びOCT-4などの幹細胞特異的遺伝子の配列は、当技術分野で周知であ
る。

胎盤細胞、特に、Ficoll分離、示差的接着、又は両方の組合せによって単離された細胞
を、蛍光活性化細胞選別機（FACS）を用いて選別することができる。蛍光活性化細胞選別
（FACS）は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離する周知の方法である（
Kamarchの文献（1987, Methods Enzymol, 151：150-165））。個々の粒子中の蛍光部分の
レーザーによる励起によって、わずかな電荷が生じ、混合物からの陽性粒子及び陰性粒子
の電磁分離が可能になる。一実施態様では、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドを
個別の蛍光標識で標識する。細胞をセルソーターに通して処理し、使用された抗体に結合
するその能力に基づく細胞の分離を可能にする。FACSで選別された粒子を96ウェル又は38
4ウェルプレートの個々のウェルに直接に堆積させて、分離及びクローニングをしやすく
することができる。

1つの選別スキームでは、胎盤由来の細胞、例えば、PDACを、マーカーCD34、CD38、CD4
4、CD45、CD73、CD105、OCT-4、及び／又はHLA-Gのうちの1つ又は複数の発現に基づいて
選別する。これは、そのような細胞を培養下のその接着特性に基づいて選択する手順との
関連で達成することができる。例えば、組織培養プラスチック接着の選択を、マーカー発
現に基づく選別の前又は後に達成することができる。一実施態様では、例えば、細胞を、
まず、そのCD34発現に基づいて選別し；CD34^-細胞を保持し、さらにCD200⁺及びHLA-G^-で
あるCD34^-細胞を、他の全てのCD34^-細胞から分離する。別の実施態様では、胎盤由来の細
胞をそのマーカーCD200及び／又はHLA-Gの発現に基づいて選別し；例えば、CD200を提示
し、かつHLA-Gを欠く細胞をさらなる使用のために単離する。例えば、CD200を発現し、か
つ／又は例えば、HLA-Gを欠く細胞を、具体的な実施態様では、そのCD73及び／もしくはC
D105、又は抗体SH2、SH3、もしくはSH4によって認識されるエピトープの発現、或いはCD3
4、CD38、又はCD45の発現の欠如に基づいてさらに選別することができる。例えば、別の
実施態様では、胎盤細胞を、CD200、HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38、及びCD45の発現
、又はその欠如によって選別し、かつCD200⁺、HLA-G^-、CD73⁺、CD105⁺、CD34^-、CD38^-、
及びCD45^-である胎盤細胞を、さらなる使用のために他の胎盤細胞から単離する。

選別された胎盤細胞の上記の実施態様のいずれかの具体的な実施態様では、選別後に残
存する細胞集団内の細胞の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、又は95％は、該単
離された胎盤細胞である。胎盤細胞を、上の第5.2.2節に記載のマーカーのいずれかの1つ
又は複数によって選別することができる。

具体的な実施態様では、例えば、（1）組織培養プラスチックに接着性であり、かつ（2
）CD10⁺、CD34^-、及びCD105⁺である胎盤細胞を他の胎盤細胞から選別する（すなわち、単
離する）。別の具体的な実施態様では、（1）組織培養プラスチックに接着性であり、か
つ（2）CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、及びCD200⁺である胎盤細胞を他の胎盤細胞から選別する
（すなわち、単離する）。別の具体的な実施態様では、（1）組織培養プラスチックに接
着性であり、かつ（2）CD10⁺、CD34^-、CD45^-、CD90⁺、CD105⁺、及びCD200⁺である胎盤細
胞を他の胎盤細胞から選別する（すなわち、単離する）。

胎盤細胞のヌクレオチド配列ベースの検出に関して、本明細書に記載のマーカーの配列
は、GenBank又はEMBLなどの公的に利用可能なデータベースで容易に入手可能である。

胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞の抗体による検出及び選別に関して
、特定のマーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出及び選別（例えば、蛍光活性化細
胞選別）に好適な任意のフルオロフォア又は他の標識と組み合わせて用いることができる
。特異的マーカーに対する抗体／フルオロフォアの組合せとしては、HLA-Gに対するフル
オレセインイソチオシアネート（FITC）コンジュゲートモノクローナル抗体（Serotec, R
aleigh, North Carolinaから入手可能）、CD10に対するフルオレセインイソチオシアネー
ト（FITC）コンジュゲートモノクローナル抗体（BD Immunocytometry Systems, San Jose
, Californiaから入手可能）、CD44に対するフルオレセインイソチオシアネート（FITC）
コンジュゲートモノクローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen, San Jose, Californi
aから入手可能）、及びCD105に対するフルオレセインイソチオシアネート（FITC）コンジ
ュゲートモノクローナル抗体（R&D Systems社, Minneapolis, Minnesotaから入手可能）
；CD44、CD200、CD117、及びCD13に対するフィコエリスリン（PE）コンジュゲートモノク
ローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen）；CD33及びCD10に対するフィコエリスリン-
Cy7（PE Cy7）コンジュゲートモノクローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen）；アロ
フィコシアニン（APC）コンジュゲートストレプトアビジン及びCD38に対するアロフィコ
シアニン（APC）コンジュゲートモノクローナル抗体（BD Biosciences Pharmingen）；並
びにビオチン化CD90（BD Biosciences Pharmingen）が挙げられるが、これらに限定され
ない。使用することができる他の抗体としては、CD133-APC（Miltenyi）、KDR-ビオチン
（CD309、Abcam）、サイトケラチンK-Fitc（Sigma又はDako）、HLA ABC-Fitc（BD）、HLA
DR、DQ、DP-PE（BD）、β2-ミクログロブリン-PE（BD）、CD80-PE（BD）、及びCD86-APC
（BD）が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる他の抗体／標識の
組合せとしては、CD45-PerCP（ペリジンクロロフィルタンパク質）；CD44-PE；CD19-PE；
CD10-F（フルオレセイン）；HLA-G-F及び7-アミノ-アクチノマイシン-D（7-AAD）；HLA-A
BC-F；などが挙げられるが、これらに限定されない。このリストは網羅的なものではなく
、他の供給業者からの他の抗体も市販されている。

本明細書で提供される単離された胎盤細胞を、例えば、フィコエリスリン-Cy5（PE Cy5
）コンジュゲートストレプトアビジンと、CD117又はCD133に対するビオチンコンジュゲー
トモノクローナル抗体とを用いてCD117又はCD133についてアッセイすることができる；し
かしながら、このシステムを用いると、バックグラウンドが比較的高いために、該細胞は
、それぞれ、CD117又はCD133陽性であるように見えることがある。

単離された胎盤細胞を単一のマーカーに対する抗体で標識し、検出及び／選別すること
ができる。胎盤細胞を異なるマーカーに対する複数の抗体で同時に標識することもできる
。

別の実施態様では、磁気ビーズを用いて細胞を分離することができる。磁気ビーズ（直
径0.5～100μm）に結合するその能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化
細胞選別（MACS）技術を用いて、該細胞を選別してもよい。特定の細胞表面分子又はハプ
テンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾を磁気マイクロ
スフェアに対して行なうことができる。その後、該ビーズを細胞と混合し、結合させてお
く。その後、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一
実施態様では、その後、これらの細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する抗体
と結合した磁気ビーズと再び混合することができる。該細胞を再び磁場に通して、両方の
抗体に結合した細胞を単離する。その後、そのような細胞を希釈して、別々のディッシュ
、例えば、クローン単離用のマイクロタイターディッシュに入れることができる。

単離された胎盤細胞を、形態及び成長特性に基づいて特徴付け、かつ／又は選別するこ
ともできる。例えば、単離された胎盤細胞を、例えば、培養下で線維芽細胞様の外観を有
するものとして特徴付け、かつ／又は培養下での線維芽細胞様の外観に基づいて選択する
ことができる。単離された胎盤細胞を、胚様体様体を形成するその能力を有するものとし
て特徴付け、かつ／又は胚様体様体を形成するその能力に基づいて選択することもできる
。一実施態様では、例えば、線維芽細胞様の形状であり、CD73及びCD105を発現し、かつ
培養下で1以上の胚様体様体を生じさせる胎盤細胞を他の胎盤細胞から単離する。別の実
施態様では、培養下で1以上の胚様体様体を生じさせるOCT-4⁺胎盤細胞を他の胎盤細胞か
ら単離する。

別の実施態様では、単離された胎盤細胞は、コロニー形成単位アッセイによって同定し
、特徴付けることができる。MESENCULT（商標）培地（Stem Cell Technologies社, Vanco
uver British Columbia）などの、コロニー形成単位アッセイは、当技術分野で一般に公
知である。

単離された胎盤細胞を、（生存を評価するための）トリパンブルー排出アッセイ、フル
オレセインジアセテート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ；及び（増
殖を評価するための）チミジン取込みアッセイ、MTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イ
ル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞増殖アッセイなどの、当技術分野で
公知の標準的技術を用いて、生存能力、増殖能力、及び寿命について評価することができ
る。寿命は、延長された培養下での集団倍加の最大数を決定することなどの、当技術分野
で周知の方法によって測定してもよい。

単離された胎盤細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の単離された胎盤細胞を、当技術
分野で公知の他の技術、例えば、所望の細胞の選択的成長（陽性選択）、望ましくない細
胞の選択的破壊（陰性選択）；例えば、ダイズ凝集素を用いる、混合集団における示差的
細胞凝集力に基づく分離；凍結-解凍処置；濾過；従来のゾーン遠心分離；遠心洗浄（向
流遠心分離）；単位重力分離；向流分配；電気泳動法；などを用いて他の胎盤細胞から分
離することもできる。

（5.4 単離された胎盤細胞の培養）
（5.4.1 培養培地）
単離された胎盤細胞、又は単離された胎盤細胞の集団、又は胎盤細胞が生じる細胞もし
くは胎盤組織を用いて、細胞培養物をイニシエートするか、又はそれを播種することがで
きる。通常、細胞を、コーティングされていないか、或いはラミニン、コラーゲン（例え
ば、天然物もしくは変性物）、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチ
ン、ポリリジン、CELLSTART（商標）、及び／又は細胞外膜タンパク質（例えば、MATRIGE
L（登録商標）（BD Discovery Labware, Bedford, Mass.））などの細胞外マトリックス
もしくはリガンド、又は他の好適な生体分子もしくは合成模倣剤でコーティングされてい
るかのいずれかの滅菌組織培養容器に移す。

単離された胎盤細胞を、細胞、例えば、幹細胞の培養に許容し得るものとして当技術分
野で認識されている任意の培地中及び任意の条件下で培養することができる。好ましくは
、培養培地は、血清を含む。単離された胎盤細胞を、例えば、ITS（インスリン-トランス
フェリン-セレン）、LA＋BSA（リノール酸-ウシ血清アルブミン）、デキサメタゾン、L-
アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM-L
G（ダルベッコの改変必須培地、低グルコース）／MCDB 201（ニワトリ線維芽細胞基本培
地）；10％胎仔ウシ血清（FBS）を含むDMEM-HG（高グルコース）；15％FBSを含むDMEM-HG
；10％FBS、10％ウマ血清、及びヒドロコルチゾンを含むIMDM（イスコフの改変ダルベッ
コ培地）；1％～20％FBS、EGF、及びヘパリンを含むM199；10％FBS、GLUTAMAX（商標）、
及びゲンタマイシンを含むα-MEM（最小必須培地）；10％FBS、GLUTAMAX（商標）、及び
ゲンタマイシンを含むDMEMなどの中で培養することができる。

胎盤細胞を培養するために用いることができる他の培地としては、DMEM（高グルコース
又は低グルコース）、イーグルの基本培地、ハムのF10培地（F10）、ハムのF-12培地（F1
2）、イスコフの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地（MSCGM）、ライボヴィッツ
のL-15培地、MCDB、DMEM／F12、RPMI 1640、改良DMEM（Gibco）、DMEM／MCDB201（Sigma
）、及びCELL-GRO FREEが挙げられる。

培養培地には、例えば、血清（例えば、ウシ胎仔血清（FBS）、好ましくは、約2～15％
（v／v）；ウマ（equine）（ウマ（horse））血清（ES）；ヒト血清（HS））；β-メルカ
プトエタノール（BME）、好ましくは、約0.001％（v／v）；1種以上の成長因子、例えば
、血小板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子（EGF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFG
F）、インスリン様成長因子-1（IGF-1）、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮成長因子（V
EGF）、及びエリスロポエチン（EPO）；L-バリンを含むアミノ酸；並びに例えば、単独の
又は組み合わせた、ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、アンフォテリシンB、ゲンタ
マイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を防除するための1種以上の抗生物質及
び／又は抗真菌剤を含む1種以上の成分を補充することができる。

単離された胎盤細胞を、標準的な組織培養条件で、例えば、組織培養ディッシュ又はマ
ルチウェルプレート中で培養することができる。単離された胎盤細胞を、ハンギングドロ
ップ法を用いて培養することもできる。この方法では、単離された胎盤細胞を約5mLの培
地に1mL当たり約1×10⁴細胞で懸濁し、この培地の1以上の滴を組織培養容器、例えば、10
0mLペトリ皿の蓋の内側に置く。この滴は、例えば、単一の滴、又は例えば、マルチチャ
ネルピペッターからの複数の滴であることができる。蓋を慎重にひっくり返し、ある容量
の液体、例えば、皿の雰囲気内の水分含量を維持するのに十分な滅菌PBSを含む皿底の上
部に置き、幹細胞を培養する。

一実施態様では、単離された胎盤細胞を、該単離された胎盤細胞における未分化な表現
型を維持するように作用する化合物の存在下で培養する。具体的な実施態様では、該化合
物は、置換3,4-ジヒドロピリジモル[4,5-d]ピリミジンである。別の具体的な実施態様で
は、該化合物は、以下の化学構造を有する化合物である：

該化合物を、例えば、約1μM～約10μMの濃度で、単離された胎盤細胞、又は単離された
胎盤細胞の集団と接触させることができる。

（5.4.2 胎盤細胞の拡大及び増殖）
単離された胎盤細胞、又は単離された胎盤細胞の集団が分離されれば（例えば、胎盤細
胞又は胎盤細胞の集団が、該幹細胞又は幹細胞の集団が通常インビボで関連している胎盤
細胞の少なくとも50％から分離されれば）、該細胞又は細胞の集団をインビトロで増殖さ
せ、拡大することができる。例えば、単離された胎盤細胞の集団を、組織培養容器、例え
ば、ディッシュ、フラスコ、マルチウェルプレートなどの中で、70～90％コンフルエンス
になるまで、すなわち、該細胞及びその子孫が、組織培養容器の培養表面積の70～90％を
占めるまで、該細胞が増殖するのに十分な時間、培養することができる。

単離された胎盤細胞を、細胞成長を可能にする密度で培養容器中に播種することができ
る。例えば、該細胞を、低密度（約1000～約5000細胞／cm²）から高密度（例えば、約50,
000以上の細胞／cm²）で播種してもよい。好ましい実施態様では、該細胞を、大気中、約
0～約5容積％のCO₂の存在下で培養する。いくつかの好ましい実施態様では、該細胞を、
大気中、約2～約25％のO₂、好ましくは、大気中、約5～約20％のO₂で培養する。該細胞を
、約25℃～約40℃、好ましくは37℃で培養することが好ましい。該細胞をインキュベータ
ー内で培養することが好ましい。培養培地は、静止状態とするか、又は例えば、バイオリ
アクターを用いて撹拌することができる。胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性
細胞を（例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセ
チルシステインなどの添加により）低酸化ストレス下で成長させることが好ましい。

100％未満、例えば、70～90％のコンフルエンスが得られれば、細胞を継代してもよい
。例えば、該細胞を、当技術分野で周知の技術を用いて酵素的に処理し、例えば、トリプ
シン処理し、それらを組織培養表面から分離することができる。該細胞をピペッティング
で取り除き、該細胞を計数した後、約10,000～100,000細胞／cm²を、新鮮な培養培地を含
む新しい培養容器に継代する。通常、新しい培地は、単離された胎盤細胞が取り除かれた
培地と同じ種類である。該単離された胎盤細胞を、約、少なくとも、又は以下を超えない
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、もしくは20回、又はそれより多くの
回数継代することができる。

（5.4.3 単離された胎盤細胞の集団）
本明細書に記載の方法及び組成物において有用な、単離された胎盤細胞、例えば、上の
第5.2.2節に記載の単離された胎盤細胞の集団も本明細書で提供される。単離された胎盤
細胞の集団を1以上の胎盤から直接単離することができる；すなわち、該細胞集団は、単
離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団であることができ、ここで、該単離された胎盤細
胞は、灌流液から得られるか、又はその中に含まれるか、或いは破壊された胎盤組織、例
えば、胎盤組織消化物（すなわち、胎盤もしくはその部分の酵素的消化によって得られる
細胞の集合体）から得られるか、又はその中に含まれる。本明細書に記載の単離された胎
盤細胞を培養及び拡大して、単離された胎盤細胞の集団を生じさせることもできる。該単
離された胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を培養及び拡大して、胎盤細胞集団を生じさせる
こともできる。

本明細書で提供される治療方法において有用な胎盤細胞集団は、単離された胎盤細胞、
例えば、本明細書中の第5.4.2節に記載された単離された胎盤細胞を含む。様々な実施態
様では、胎盤細胞集団内の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％
、80％、90％、95％、又は99％は、単離された胎盤細胞である。すなわち、単離された胎
盤細胞の集団は、例えば、該単離された胎盤細胞ではない1％、5％、10％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％と同程度の量の細胞を含むことができる。

本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細胞集団を、例えば、
酵素的消化によって得られたものであれ、灌流によって得られたものであれ、特定のマー
カー及び／又は特定の培養特性もしくは形態特性を発現する単離された胎盤細胞を選択す
ることによって生じさせることができる。一実施態様では、例えば、（a）基材に接着し
、かつ（b）CD200を発現し、HLA-Gの発現を欠く胎盤細胞を選択し；かつ該細胞を他の細
胞から単離して細胞集団を形成させることによって、細胞集団を生じさせる方法が本明細
書で提供される。別の実施態様では、細胞集団を、CD200を発現し、HLA-Gの発現を欠く胎
盤細胞を選択し、かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって
生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を、（a）基材に接着し、かつ（b）CD73、CD10
5、及びCD200を発現する胎盤細胞を選択し；かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団
を形成させることによって生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を、CD73、CD105、
及びCD200を発現する胎盤細胞を同定し、かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を
形成させることによって生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を、（a）基材に接着
し、かつ（b）CD200及びOCT-4を発現する胎盤細胞を選択し；かつ該細胞を他の細胞から
単離して細胞集団を形成させることによって生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を
、CD200及びOCT-4を発現する胎盤細胞を選択し、かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞
集団を形成させることによって生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を、（a）基材
に接着し、（b）CD73及びCD105を発現し、かつ（c）該幹細胞を含む胎盤細胞の集団を、
胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該集団内での1以上の胚様体様体
の形成を促進する胎盤細胞を選択し；かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成
させることによって生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を、CD73及びCD105を発現
し、かつ該幹細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養
したとき、該集団内での1以上の胚様体様体の形成を促進する胎盤細胞を選択し、かつ該
細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生じさせる。別の実施態
様では、細胞集団を、（a）基材に接着し、かつ（b）CD73及びCD105を発現し、HLA-Gの発
現を欠く胎盤細胞を選択し；かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させるこ
とによって生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を、CD73及びCD105を発現し、HLA-G
の発現を欠く胎盤細胞を選択し、かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させ
ることによって生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を生じさせる方法は、（a）基
材に接着し、（b）OCT-4を発現し、かつ（c）該幹細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様体
様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該集団内での1以上の胚様体様体の形成
を促進する胎盤細胞を選択すること；及び該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成
させることを含む。別の実施態様では、細胞集団を、OCT-4を発現し、かつ該幹細胞を含
む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該集団内で
の1以上の胚様体様体の形成を促進する胎盤細胞を選択し、かつ該細胞を他の細胞から単
離して細胞集団を形成させることによって生じさせる。

別の実施態様では、細胞集団を、（a）基材に接着し、かつ（b）CD10及びCD105を発現
し、CD34を発現しない胎盤細胞を選択し；かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を
形成させることによって生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を、CD10及びCD105を
発現し、CD34を発現しない胎盤細胞を選択し、かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集
団を形成させることによって生じさせる。別の実施態様では、細胞集団を、（a）基材に
接着し、かつ（b）CD10、CD105、及びCD200を発現し、CD34を発現しない胎盤細胞を選択
し；かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生じさせる。
別の実施態様では、細胞集団を、CD10、CD105、及びCD200を発現し、CD34を発現しない胎
盤細胞を選択し、かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって
生じさせる。別の具体的な実施態様では、細胞集団を、（a）基材に接着し、かつ（b）CD
10、CD90、CD105、及びCD200を発現し、CD34及びCD45を発現しない胎盤細胞を選択し；か
つ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成させることによって生じさせる。別の具
体的な実施態様では、細胞集団を、CD10、CD90、CD105、及びCD200を発現し、CD34及びCD
45を発現しない胎盤細胞を選択し、かつ該細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成さ
せることによって生じさせる。

上の第5.2.2節に記載のマーカー組合せのいずれかを有する胎盤細胞を含む細胞集団の
選択物を同様のやり方で単離するか、又は得ることができる。

上記の実施態様のいずれにおいても、単離された細胞集団の選択はさらに、ABC-p（胎
盤特異的ABC輸送体タンパク質；例えば、Allikmetsらの文献（Cancer Res. 58（23）：53
37-9（1998））を参照されたい）を発現する胎盤細胞を選択することを含むことができる
。該方法は、例えば、間葉系幹細胞に特異的な少なくとも1つの特徴、例えば、CD44の発
現、CD90の発現、又は前述のものの組合せの発現を示す細胞を選択することを含むことも
できる。

上記の実施態様では、基材は、細胞、例えば、単離された胎盤細胞の培養及び／又は選
択を達成することができる任意の表面であることができる。通常、該基材は、プラスチッ
ク、例えば、組織培養ディッシュ又はマルチウェルプレートプラスチックである。組織培
養プラスチックは、生体分子、例えば、ラミニン又はフィブロネクチンでコーティングす
ることができる。

細胞、例えば、単離された胎盤細胞を、細胞選択の技術分野で公知の任意の手段によっ
て、胎盤細胞集団について選択することができる。例えば、細胞を、例えば、フローサイ
トメトリー又はFACSにおいて1つ又は複数の細胞表面マーカーに対する1つ又は複数の抗体
を用いて選択することができる。抗体を磁気ビーズと組み合わせて用いて、選択を達成す
ることができる。特定の幹細胞関連マーカーに特異的である抗体は当技術分野で公知であ
る。例えば、OCT-4に対する抗体（Abcam, Cambridge, MA）、CD200に対する抗体（Abcam
）、HLA-Gに対する抗体（Abcam）、CD73に対する抗体（BD Biosciences Pharmingen, San
Diego, CA）、CD105に対する抗体（Abcam；BioDesign International, Saco, ME）など
。他のマーカーに対する抗体も市販されており、例えば、CD34、CD38、及びCD45に対する
抗体が、例えば、StemCell Technologies又はBioDesign Internationalから入手可能であ
る。

単離された胎盤細胞集団は、幹細胞ではない胎盤細胞、又は胎盤細胞ではない細胞を含
むことができる。

本明細書に記載の胎盤由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、第二の細胞型、例え
ば、胎盤由来接着細胞ではない胎盤細胞、又は例えば、胎盤細胞ではない細胞を含むこと
ができる。例えば、単離された胎盤由来接着細胞集団は、第二のタイプの細胞の集団を含
むことができ、例えば、第二のタイプの細胞の集団と組み合わせることができ、ここで、
該第二のタイプの細胞は、例えば、胚性幹細胞、血液細胞（例えば、胎盤血、胎盤血細胞
、臍帯血、臍帯血細胞、末梢血、末梢血細胞、胎盤血、臍帯血、又は末梢血由来の有核細
胞など）、血液から単離された幹細胞（例えば、胎盤血、臍帯血、又は末梢血から単離さ
れた幹細胞）、胎盤灌流液から単離された有核細胞、例えば、胎盤灌流液由来の全有核細
胞；臍帯幹細胞、血液由来有核細胞の集団、骨髄由来間葉系間質細胞、骨髄由来間葉系幹
細胞、骨髄由来造血幹細胞、粗骨髄、成体（体性）幹細胞、組織内に含まれる幹細胞の集
団、培養された細胞、例えば、培養された幹細胞、完全に分化した細胞（例えば、軟骨細
胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋肉細胞、心臓細胞など）の集団、周皮細胞など
である。具体的な実施態様では、胎盤由来接着細胞を含む細胞の集団は、胎盤幹細胞又は
臍帯由来の幹細胞を含む。第二のタイプの細胞が血液又は血液細胞である特定の実施態様
では、赤血球は、細胞の集団から取り除かれている。

具体的な実施態様では、第二のタイプの細胞は、造血幹細胞である。そのような造血幹
細胞は、例えば、未処理の胎盤血、臍帯血、又は末梢血；胎盤血、臍帯血、又は末梢血由
来の全有核細胞；胎盤血、臍帯血、又は末梢血由来の単離されたCD34⁺細胞集団；未処理
の骨髄；骨髄由来の全有核細胞；骨髄由来の単離されたCD34⁺細胞集団などに含まれるこ
とができる。

別の実施態様では、単離された胎盤由来接着細胞集団を、血管系由来の複数の成体細胞
又は前駆細胞と組み合わせる。様々な実施態様では、該細胞は、内皮細胞、内皮前駆細胞
、筋細胞、心筋細胞、周皮細胞、血管芽細胞、筋芽細胞、又は心筋芽細胞である。

別の実施態様では、第二の細胞型は、多能性のマーカー、及び胚性幹細胞と関連する機
能を発現させるために培養下で操作された非胚細胞型である。

上記の単離された胎盤由来接着細胞集団の具体的な実施態様では、該胎盤由来接着細胞
と第二のタイプの細胞のうちのどちらか又は両方は、該細胞の意図されるレシピエントに
とって、自己のものであるか、又は同種異系のものである。

別の具体的な実施態様では、組成物は、胎盤由来接着細胞、及び胚性幹細胞を含む。別
の具体的な実施態様では、組成物は、胎盤由来接着細胞、及び間葉系間質細胞又は間葉系
幹細胞、例えば、骨髄由来間葉系間質細胞又は骨髄由来間葉系幹細胞を含む。別の具体的
な実施態様では、組成物は、骨髄由来造血幹細胞を含む。別の具体的な実施態様では、組
成物は、胎盤由来接着細胞、並びに造血前駆細胞、例えば、骨髄、胎児血液、臍帯血、胎
盤血、及び／又は末梢血由来の造血前駆細胞を含む。別の具体的な実施態様では、組成物
は、胎盤由来接着細胞及び体性幹細胞を含む。より具体的な実施態様では、該体性幹細胞
は、神経幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、又は筋肉幹細胞で
ある。

他の具体的な実施態様では、第二のタイプの細胞は、該集団内の細胞の約、少なくとも
、又はわずか10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％を含む。他の
具体的な実施態様では、該組成物中のPDACは、該組成物中の細胞の少なくとも50％、55％
、60％、65％、70％、75％、80％、85％、又は90％を含む。他の具体的な実施態様では、
胎盤由来接着細胞は、該集団内の細胞の約、少なくとも、又はわずか10％、15％、20％、
25％、30％、35％、40％、又は45％を含む。

単離された胎盤由来接着細胞集団内の細胞を、各々の集団内の全有核細胞の数と比べて
、約100,000,000：1、50,000,000：1、20,000,000：1、10,000,000：1、5,000,000：1、2
,000,000：1、1,000,000：1、500,000：1、200,000：1、100,000：1, 50,000：1、20,000
：1、10,000：1、5,000：1、2,000：1、1,000：1、500：1、200：1、100：1、50：1、20
：1、10：1、5：1、2：1、1：1；1：2；1：5；1：10；1：100；1：200；1：500；1：1,00
0；1：2,000；1：5,000；1：10,000；1：20,000；1：50,000；1：100,000；1：500,000；
1：1,000,000；1：2,000,000；1：5,000,000；1：10,000,000；1：20,000,000；1：50,00
0,000；又は約1：100,000,000の比で、別のタイプの複数の細胞、例えば、幹細胞の集団
と組み合わせることができる。単離された胎盤由来接着細胞集団内の細胞を複数の細胞型
の複数の細胞と組み合わせることもできる。

他の実施態様では、本明細書に記載の胎盤細胞、例えば、上記のPDACの集団を、骨形成
性胎盤接着細胞（OPAC）、例えば、2009年8月24日に出願された、「胎盤幹細胞を用いた
骨欠損の治療のための方法及び組成物（Methods and Compositions for Treatment of Bo
ne Defects With Placental Stem Cells）」という表題の米国特許出願第12／546,556号
に記載されているOPACと組み合わせるか、又は羊膜由来血管形成細胞（AMDAC）、例えば
、その開示がその全体として引用により本明細書中に組み込まれている、「羊膜由来血管
形成細胞（Amnion Derived Angiogenic Cells）」という表題の米国特許出願第12／622,3
52号に記載されているAMDACと組み合わせる。

（5.5 胎盤細胞バンクの作製）
分娩後の胎盤由来の単離された細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の単離された胎盤
細胞をいくつかの異なる方法で培養して、単離された胎盤細胞のロットの組を生じさせる
ことができ、例えば、ここで、ロットは、個別投与可能な用量の組である。そのようなロ
ットは、例えば、胎盤灌流液由来の細胞又は酵素的消化した胎盤組織由来の細胞から得る
ことができる。複数の胎盤から得られた胎盤細胞のロットの組を、例えば、長期保存用の
単離された胎盤細胞のバンクに準備しておくことできる。通常、組織培養プラスチック接
着性胎盤細胞を胎盤材料の初期培養物から得て、シード培養物を形成させ、これを制御さ
れた条件下で拡大して、ほぼ同等数の倍加から細胞の集団を形成させる。ロットは、単一
の胎盤の組織に由来することが好ましいが、複数の胎盤の組織に由来することもできる。

一実施態様では、胎盤細胞ロットは、次のように得られる。胎盤組織をまず、例えば、
細かく刻むことによって破壊し、好適な酵素、例えば、トリプシン又はコラゲナーゼで消
化する（上の第5.3.3節を参照されたい）。胎盤組織は、例えば、単一の胎盤由来の羊膜
全体、絨毛膜全体、又は両方を含むことが好ましいが、羊膜又は絨毛膜のいずれかの一部
のみを含むことができる。消化した組織を、例えば、約1～3週間、好ましくは、約2週間
培養する。接着していない細胞を除去した後、形成される高密度コロニーを、例えば、ト
リプシン処理によって回収する。これらの細胞を回収し、好都合な容量の培養培地に再懸
濁し、その後、それを用いて、拡大培養物を播種する。拡大培養物は、個別の細胞培養装
置、例えば、NUNC（商標）製のCell Factoryに配置されたものであることができる。拡大
培養物を、例えば、1×10³、2×10³、3×10³、4 ×10³、5 ×10³、6 ×10³、7 ×10³、8
×10³、9×10³、1×10⁴、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8
×10⁴、9×10⁴、又は10×10⁴細胞／cm²で播種するために、細胞を任意の程度に細分する
ことができる。好ましくは、約1×10³～約1×10⁴細胞／cm²を用いて、各々の拡大培養物
を播種する。拡大培養物の数は、該細胞が得られる特定の胎盤（複数可）によって、数が
より多いことも、より少ないこともあり得る。

培養下の細胞の密度が、一定のレベル、例えば、約1×10⁵細胞／cm²に達するまで、拡
大培養物を成長させる。細胞をこの時点で回収して凍結保存するか、又は上記のような新
しい拡大培養物へと継代することができる。使用前に、細胞を、例えば、2、3、4 、5、6
、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20回継代することができる
。拡大培養（複数可）中、集団倍加の累積数の記録を保持することが好ましい。培養物由
来の細胞は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、
32、34、36、38、もしくは40回の倍加、又は最大60回の倍加の間、拡大することができる
。しかしながら、細胞の集団を個々の用量に分割する前の集団倍加の数は、約15～約30回
であることが好ましい。細胞は、拡大過程を通して連続的に培養することができるか、又
は拡大の間の1以上の時点で凍結させることができる。

個々の用量のために使用すべき細胞は、凍結させる、例えば、後続的使用のために凍結
保存することができる。個々の用量は、例えば、 1ml当たり約1,000,000～約50,000,000
個の細胞を含むことができ、かつ全体で約10⁶～約10¹⁰個の細胞を含むことができる。

一実施態様では、それゆえ、胎盤細胞バンクは、第一の複数の集団倍加の間、ヒトの分
娩後の胎盤から初代培養胎盤細胞を拡大し；該胎盤細胞を凍結保存して、マスター細胞バ
ンクを形成させ；第二の複数の集団倍加の間、該マスター細胞バンクから複数の胎盤細胞
を拡大し；該胎盤細胞を凍結保存して、ワーキング細胞バンクを形成させ；第三の複数の
集団倍加の間、該ワーキング細胞バンクから複数の胎盤細胞を拡大し；かつ該胎盤細胞を
個々の用量で凍結保存すること：を含む方法によって作製することができ、ここで、該個
々の用量は、胎盤細胞バンクを集合的に構成する。任意で、該第三の複数の集団倍加から
の複数の胎盤細胞を第四の複数の集団倍加の間、拡大して、個々の用量で凍結保存するこ
とができ、ここで、該個々の用量は、胎盤細胞バンクを集合的に構成する。

別の具体的な実施態様では、該初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来の胎盤細胞を含む
。別の具体的な実施態様では、該初代培養胎盤細胞は、消化した胎盤組織由来の胎盤細胞
を含む。別の具体的な実施態様では、該初代培養胎盤細胞は、胎盤灌流液由来及び消化し
た胎盤組織由来の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様では、該胎盤細胞初代培養物中
の該胎盤細胞は全て、同じ胎盤由来のものである。別の具体的な実施態様では、本方法は
さらに、該ワーキング細胞バンク由来の該複数の該胎盤細胞からCD200⁺又はHLA-G^-胎盤細
胞を選択して、個々の用量を形成させる工程を含む。別の具体的な実施態様では、該個々
の用量は、約10⁴～約10⁵個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様では、該個々の用量
は、約10⁵～約10⁶個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様では、該個々の用量は、約
10⁶～約10⁷個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様では、該個々の用量は、約10⁷～
約10⁸個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様では、該個々の用量は、約10⁸～約10⁹
個の胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様では、該個々の用量は、約10⁹～約10¹⁰個の
胎盤細胞を含む。

好ましい実施態様では、胎盤が得られるドナー（例えば、母親）を少なくとも1つの病
原体について検査する。母親が、検査した病原体について陽性反応を示す場合、該胎盤由
来の全ロットを廃棄する。そのような検査は、胎盤細胞ロットの産生中、例えば、拡大培
養中のいつでも実施することができる。その存在を検査する病原体としては、限定するも
のではないが、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス
（I型及びII型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどを挙げることができる
。

（5.6 胎盤細胞の保存）
単離された胎盤細胞、例えば、上の第5.3.2節に記載の単離された胎盤細胞を、保存す
る、すなわち、長期保存を可能にする条件下、又は例えば、アポトーシスもしくは壊死に
よる細胞死を阻害する条件下に置くことができる。

胎盤細胞を、例えば、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれ
ている、関連米国特許出願公開第2007／0190042号に記載されているアポトーシス阻害剤
、壊死阻害剤、及び／又は酸素担持ペルフルオロカーボンを含む組成物を用いて保存する
ことができる。一実施態様では、本明細書に記載の方法及び組成物において有用な細胞の
集団を保存する方法は、該細胞の集団を、アポトーシスの阻害剤及び酸素担持ペルフルオ
ロカーボンを含む細胞回収組成物と接触させることを含み、ここで、該アポトーシスの阻
害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触していない細胞の集団と比較したとき、該細胞の
集団のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量で、かつ該細胞の集団のア
ポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な時間、存在する。具体的な実施態様で
は、該アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的な実施態様では、
該アポトーシスの阻害剤はJNK阻害剤である。別の具体的な実施態様では、該JNK阻害剤は
、該細胞の分化又は増殖を調節しない。別の実施態様では、該細胞回収組成物は、分離相
中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素担持ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様
では、該細胞回収組成物は、エマルジョン中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素担持ペ
ルフルオロカーボンを含む。別の実施態様では、該細胞回収組成物はさらに、乳化剤、例
えば、レシチンを含む。別の実施態様では、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカ
ーボンは、該細胞と接触させるときに、約0℃～約25℃である。別の具体的な実施態様で
は、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該細胞と接触させるときに、
約2℃～10℃、又は約2℃～約5℃である。別の具体的な実施態様では、該接触させること
は、該細胞の集団の輸送の間に行なわれる。別の具体的な実施態様では、該接触させるこ
とは、該細胞の集団の凍結及び解凍の間に行なわれる。

胎盤細胞の集団を、例えば、該細胞の集団をアポトーシスの阻害剤及び臓器保存化合物
と接触させる方法によって保存することができ、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該
アポトーシスの阻害剤と接触していない細胞の集団と比較したとき、該細胞の集団のアポ
トーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量で、かつ該細胞の集団のアポトーシス
を低下させるか又は防止するのに十分な時間、存在する。具体的な実施態様では、臓器保
存化合物は、UW溶液（米国特許第4,798,824号に記載されており；ViaSpanとしても知られ
ているもの；Southardらの文献（Transplantation 49（2）：251-257（1990））も参照さ
れたい）、又はSternらの米国特許第5,552,267号に記載されている溶液であり、これらの
文献の開示は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれる。別の実施態様では、該
臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はそ
れらの組合せである。別の実施態様では、細胞回収組成物はさらに、2相状態にあるか又
はエマルジョンとしてかのいずれかの酸素担持ペルフルオロカーボンを含む。

本方法の別の実施態様では、胎盤細胞を、灌流の間に、アポトーシス阻害剤及び酸素担
持ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はそれらの組合せを含む細胞回収組成物と
接触させる。別の実施態様では、該細胞を、組織破壊、例えば、酵素的消化のプロセスの
間に、接触させる。別の実施態様では、胎盤細胞を、灌流による回収の後に、又は組織破
壊、例えば、酵素的消化による回収の後に、該細胞回収化合物と接触させる。

通常、胎盤細胞の回収、濃縮、及び単離時に、低酸素及び機械的ストレスによる細胞ス
トレスを最小限に抑えるか、又はそれらを排除することが好ましい。本方法の別の実施態
様では、それゆえ、細胞、又は細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、該保存時に6
時間未満の間、低酸素状態に曝され、ここで、低酸素状態は、正常な血中酸素濃度を下回
る酸素濃度である。別の具体的な実施態様では、該細胞の集団は、該保存時に2時間未満
の間、該低酸素状態に曝される。別の具体的な実施態様では、該細胞の集団は、回収、濃
縮、又は単離時に、1時間未満、もしくは30分未満の間、該低酸素状態に曝されるか、又
は低酸素状態に曝されない。別の具体的な実施態様では、該細胞の集団は、回収、濃縮、
又は単離時に、剪断ストレスに曝されない。

胎盤細胞を、例えば、小型の容器、例えば、アンプル中の凍結保存培地に入れて凍結保
存することができる。好適な凍結保存培地としては、例えば、成長培地、又は細胞凍結培
地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、C2695、C2639、もしくはC6039（Sigma）をは
じめとする培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。凍結保存培地は、約2％～
約15％（v／v）、例えば、約10％（v／v）の濃度のDMSO（ジメチルスルホキシド）を含む
ことが好ましい。凍結保存培地は、さらなる作用物質、例えば、メチルセルロース及び／
又はグリセロールを含んでいてもよい。胎盤細胞を、凍結保存時に、約1℃／分で冷却す
ることが好ましい。好ましい凍結保存温度は、約-80℃～約-180℃、好ましくは約-125℃
～約-140℃である。凍結保存された細胞を液体窒素に移した後、使用のために解凍するこ
とができる。いくつかの実施態様では、例えば、アンプルが約-90℃に達したら、それを
液体窒素保存領域に移す。速度制御フリーザーを用いて凍結保存を行なうこともできる。
凍結保存された細胞は、約25℃～約40℃、好ましくは約37℃の温度で解凍することが好ま
しい。

（5.7 単離された胎盤細胞を含む組成物）
本明細書中、例えば、第5.4.2節に記載の胎盤細胞を、本明細書に記載の方法及び組成
物で用いるための任意の生理的に許容し得る又は医学的に許容し得る化合物、組成物、又
は装置と組み合わせることができる。本明細書で提供される治療方法において有用な組成
物は、本明細書に記載の胎盤細胞のいずれか1つ又は複数を含むことができる（上の第5.4
.2節を参照されたい）。特定の実施態様では、該組成物は、医薬として許容し得る組成物
、例えば、医薬として許容し得る担体中に胎盤細胞を含む組成物である。下の第5.9.2節
を参照されたい。

特定の実施態様では、単離された胎盤細胞を含む組成物はさらに、マトリックス、例え
ば、脱細胞化マトリックス又は合成マトリックスを含む。別の具体的な実施態様では、該
マトリックスは、3次元スキャフォールドである。別の具体的な実施態様では、該マトリ
ックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン
、又はビトロネクチンを含む。別のより具体的な実施態様では、該マトリックスは、羊膜
又は羊膜由来生体材料である。別の具体的な実施態様では、該マトリックスは、細胞外膜
タンパク質を含む。別の具体的な実施態様では、該マトリックスは、合成化合物を含む。
別の具体的な実施態様では、該マトリックスは、生体活性化合物を含む。別の具体的な実
施態様では、該生体活性化合物は、5,000ダルトン未満の成長因子、サイトカイン、抗体
、又は有機分子である。

別の実施態様では、本明細書で提供される治療方法において有用な組成物は、前述の胎
盤細胞のいずれか、又は前述の胎盤細胞集団のいずれかによって馴化された培地を含む。

（5.7.1 凍結保存された単離された胎盤細胞）
本明細書に記載の方法及び組成物において有用な単離された胎盤細胞集団を、後で使用
するために保存する、例えば、凍結保存することができる。幹細胞などの細胞の凍結保存
方法は当技術分野で周知である。単離された胎盤細胞集団を、個体に容易に投与すること
ができる形態、例えば、医療用途に好適な容器中に含まれる単離された胎盤細胞集団とし
て調製することができる。そのような容器は、例えば、注射器、滅菌プラスチックバッグ
、フラスコ、瓶、又は単離された胎盤細胞集団を容易に分注することができる他の容器で
あることができる。例えば、該容器は、血液バッグ又はレシピエントへの液体の静脈内投
与に好適な他のプラスチック製の、医療用に許容し得るバッグであることができる。該容
器は、特定の実施態様では、組み合わされた細胞集団の凍結保存を可能にする容器である
。

凍結保存された単離された胎盤細胞集団は、単一のドナー、又は複数のドナーに由来す
る単離された胎盤細胞を含むことができる。単離された胎盤細胞集団は、意図されるレシ
ピエントと完全にHLAが一致するものであることができるか、又は一部もしくは完全にHLA
が一致しないものであることができる。

したがって、一実施態様では、単離された胎盤細胞を、本明細書に記載の方法において
、容器中に組織培養プラスチック接着性胎盤細胞集団を含む組成物の形態で用いることが
できる。具体的な実施態様では、単離された胎盤細胞は凍結保存されている。別の具体的
な実施態様では、容器は、バッグ、フラスコ、又は瓶である。別の具体的な実施態様では
、該バッグは、滅菌プラスチックバッグである。別の具体的な実施態様では、該バッグは
、例えば、静脈内注入による該単離された胎盤細胞集団の静脈内投与に好適であるか、該
静脈内投与を可能にするか、又は該静脈内投与を容易にする。該バッグは、投与の前又は
投与の間に、単離された胎盤細胞と1種以上の他の溶液、例えば、薬物との混合を可能に
するために相互接続されている複数の内腔又は区画を含むことができる。別の具体的な実
施態様では、該組成物は、組み合わされた細胞集団の凍結保存を容易にする1種以上の化
合物を含む。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞集団は、生理的に許容し
得る水溶液に含まれている。別の具体的な実施態様では、該生理的に許容し得る水溶液は
、0.9％NaCl溶液である。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞集団は、該
細胞集団のレシピエントとHLAが一致する胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様では、
該組み合わされた細胞集団は、該細胞集団のレシピエントと少なくとも一部HLAが一致し
ない胎盤細胞を含む。別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、複数のドナ
ーに由来する。

特定の実施態様では、容器中の単離された胎盤細胞は、単離されたCD10⁺、CD34^-、CD10
5⁺胎盤細胞であり、ここで、該細胞は、凍結保存されたものであり、かつ容器に収容され
ている。具体的な実施態様では、該CD10⁺、CD34^-、CD105⁺胎盤細胞は、CD200⁺でもある。
別の具体的な実施態様では、該CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞は、CD45^-又はCD9
0⁺でもある。別の具体的な実施態様では、該CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞は、
CD45^-及びCD90⁺でもある。別の具体的な実施態様では、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞
はさらに、CD13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54⁺、CD62E^-、CD62L^-、CD62P
^-、SH3⁺（CD73⁺）、SH4⁺（CD73⁺）、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺（CD105⁺）、CD106／VCA
M⁺、CD117^-、CD144／VE-カドヘリン^dim、CD184／CXCR4^-、CD200⁺、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA
3^-、SSEA4^-、ABC-p⁺、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、HLA-G^-、もし
くはプログラム死-1リガンド（PDL1）⁺のうちの1つもしくは複数、又はそれらの任意の組
合せである。別の具体的な実施態様では、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、CD
13⁺、CD29⁺、CD33⁺、CD38^-、CD44⁺、CD45^-、CD54／ICAM⁺、CD62E^-、CD62L^-、CD62P^-、SH3
⁺（CD73⁺）、SH4⁺（CD73⁺）、CD80^-、CD86^-、CD90⁺、SH2⁺（CD105⁺）、CD106／VCAM⁺、CD
117^-、CD144／VE-カドヘリン^dim、CD184／CXCR4^-、CD200⁺、CD133^-、OCT-4⁺、SSEA3^-、SS
EA4^-、ABC-p⁺、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、HLA-G^-、及びプログ
ラム死-1リガンド（PDL1）⁺である。

特定の他の実施態様では、上で言及した単離された胎盤細胞は、単離されたCD200⁺、HL
A-G^-胎盤細胞であり、ここで、該細胞は、凍結保存されたものであり、かつ容器に収容さ
れている。別の実施態様では、該単離された胎盤細胞は、凍結保存されたものであり、か
つ容器に収容されている、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺細胞である。別の実施態様では、該単
離された胎盤細胞は、凍結保存されたものであり、かつ容器に収容されている、CD200⁺、
OCT-4⁺幹細胞である。別の実施態様では、該単離された胎盤細胞は、凍結保存されたもの
であり、かつ容器に収容されている、CD73⁺、CD105⁺細胞であり、ここで、該単離された
胎盤細胞は、胚様体様体の形成を可能にする条件下で胎盤細胞の集団とともに培養したと
き、1以上の胚様体様体の形成を促進する。別の実施態様では、該単離された胎盤細胞は
、凍結保存されたものであり、かつ容器に収容されている、CD73⁺、CD105⁺、HLA-G^-細胞
である。別の実施態様では、該単離された胎盤細胞は、凍結保存されたものであり、かつ
容器に収容されている、OCT-4⁺胎盤細胞であり、ここで、該細胞は、胚様体様体の形成を
可能にする条件下で胎盤細胞の集団とともに培養したとき、1以上の胚様体様体の形成を
促進する。

別の具体的な実施態様では、上で言及した単離された胎盤細胞は、フローサイトメトリ
ーで検出した場合、CD34^-、CD10⁺、及びCD105⁺である胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞（例
えば、PDAC）である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎
盤細胞は、神経表現型の細胞、骨形成表現型の細胞、又は軟骨形成表現型の細胞に分化す
る潜在能力を有する。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎
盤細胞はさらに、CD200⁺である。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD34^-、CD10⁺
、CD105⁺胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出した場合、CD90⁺又はCD45^-であ
る。別の具体的な実施態様では、該単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞はさらに、
フローサイトメトリーで検出した場合、CD90⁺又はCD45^-である。別の具体的な実施態様で
は、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出し
た場合、CD90⁺又はCD45^-である。別の具体的な実施態様では、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、
CD200⁺細胞はさらに、フローサイトメトリーで検出した場合、CD90⁺及びCD45^-である。別
の具体的な実施態様では、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD90⁺、CD45^-細胞はさらに
、フローサイトメトリーで検出した場合、CD80^-及びCD86^-である。別の具体的な実施態様
では、該CD34^-、CD10⁺、CD105⁺細胞はさらに、CD29⁺、CD38^-、CD44⁺、CD54⁺、CD80^-、CD8
6^-、SH3⁺、又はSH4⁺のうちの1つ又は複数である。別の具体的な実施態様では、該細胞は
さらに、CD44⁺である。上記の単離されたCD34^-、CD10⁺、CD105⁺胎盤細胞のいずれかの具
体的な実施態様では、該細胞はさらに、CD117^-、CD133^-、KDR^-（VEGFR2^-）、HLA-A、B、C
⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、及び／又はPDL1⁺のうちの1つ又は複数である。

前述の凍結保存された単離された胎盤細胞のいずれかの具体的な実施態様では、該容器
はバッグである。様々な具体的な実施態様では、該容器は、約、少なくとも、又は多くと
も1×10⁶個の該単離された胎盤細胞、5×10⁶個の該単離された胎盤細胞、1×10⁷個の該単
離された胎盤細胞、5×10⁷個の該単離された胎盤細胞、1×10⁸個の該単離された胎盤細胞
、5×10⁸個の該単離された胎盤細胞、1×10⁹個の該単離された胎盤細胞、5×10⁹個の該単
離された胎盤細胞、1×10¹⁰個の該単離された胎盤細胞、又は1×10¹⁰個の該単離された胎
盤細胞を含む。前述の凍結保存された集団のいずれかの他の具体的な実施態様では、該単
離された胎盤細胞は、約、少なくとも、又はわずか5回、わずか10回、わずか15回、又は
わずか20回、継代されたものである。前述の凍結保存された単離された胎盤細胞のいずれ
かの別の具体的な実施態様では、該単離された胎盤細胞は、該容器内で拡大されたもので
ある。

特定の実施態様では、胎盤由来接着細胞の単一の単位用量は、様々な実施態様では、約
、少なくとも、又は以下の個数を超えない1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5
×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、又はそれより
多くの胎盤由来接着細胞を含むことができる。特定の実施態様では、本明細書で提供され
る医薬組成物は、50％以上の生細胞を含む胎盤由来接着細胞の集団を含む（すなわち、該
集団内の細胞の少なくとも50％は機能的であるか又は生きている）。好ましくは、該集団
内の細胞の少なくとも60％は生きている。より好ましくは、医薬組成物中の該集団内の細
胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％は生きている。

（5.7.2 遺伝子操作された胎盤細胞）
胎盤細胞、例えば、上の第5.2.2節に記載の胎盤多能性細胞もしくは胎盤細胞のいずれ
か、又はそのような胎盤細胞を含む医薬組成物が本明細書でさらに提供され、ここで、該
胎盤細胞は、血管形成と関連するか、又はそれを促進する組換え又は外因性サイトカイン
を産生するように遺伝子操作されている。特定の実施態様では、血管形成を促進する該タ
ンパク質は、肝細胞成長因子（HGF）、血管内皮成長因子（VEGF）（例えば、VEGFD）、線
維芽細胞成長因子（FGF）（例えば、FGF2）、アンジオジェニン（ANG）、上皮成長因子（
EGF）、上皮好中球活性化タンパク質78（ENA-78）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺
激因子（G-CSF）、成長調節オンコジーンタンパク質（growth-regulated ongogene prote
in）（GRO）、インターロイキン-6（IL-6）、IL-8、レプチン、単球走化性タンパク質-1
（MCP-1）、MCP-3、血小板由来成長因子サブユニットB（platelet-derived growth facto
r submunit B）（PDGFB）、ランテス、形質転換成長因子ベータ1（TGF-β1）、トロンボ
ポエチン（Tpo）、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター1（TIMP1）、TIMP2、及び／
又はウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（uPAR）のうちの1つ又は複数であ
る。

例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベク
ター、ポリエチレングリコール、又は当業者に公知の他の方法によって、細胞を遺伝子操
作する方法を用いることができる。これらは、細胞内に核酸分子を運び、細胞内で核酸分
子を発現させる発現ベクターを用いることを含む。（Geoddelの文献；遺伝子発現技術（G
ene Expression Technology）（Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Dieg
o, Calif.（1990））を参照されたい）。ベクターDNAを、従来の形質転換又はトランスフ
ェクション技術によって、原核生物又は真核生物細胞に導入することができる。宿主細胞
を形質転換又はトランスフェクトするための好適な方法は、Sambrookらの文献、分子クロ
ーニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）（第2版, Col
d Spring Harbor Laboratory press（1989））、及び他の実験用教科書に見出すことがで
きる。

例えば、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、サルウイルス40（SV40）、アデノ
ウイルス、シンドビスウイルス、及びウシパピローマウイルスなどのDNAもしくはRNAウイ
ルスベクターの使用を含むウイルスによる転移；リン酸カルシウムトランスフェクション
及びDEAEデキストラントランスフェクション法を含む、化学的転移；例えば、リポソーム
、赤血球ゴースト、及びプロトプラストなどのDNAをローディングする膜小胞を用いる、
膜融合転移；又はマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、もしくは裸のDN
Aの転移などの物理的転移技術をはじめとする方法によって、細胞にDNA又はRNA、例えば
、目的のタンパク質をコードするDNA又はRNAを導入することにより、胎盤細胞、例えば、
上の第5.2節に記載のPDACを遺伝子修飾することができる。外因性DNAの挿入によるか、又
は細胞ゲノムのセグメントと外因性DNAとの置換によって、胎盤細胞を遺伝子改変するこ
とができる。例えば、相同組換えによるか、又は宿主細胞ゲノムへのウイルスの組込みに
よるか、又はプラスミド発現ベクター及び核局在化配列を用いて、細胞、特に、その核に
DNAを取り込ませることによって、外因性DNA配列（複数可）の挿入を達成することができ
る。DNAは、特定の化学物質／薬物、例えば、テトラサイクリンを用いて、目的のタンパ
ク質の正又は負の発現誘導を可能にする、1以上のプロモーターを含むことができ；該プ
ロモーターは、他の実施態様では、構成的であることができる。

リン酸カルシウムトランスフェクションを用いて、例えば、目的のタンパク質をコード
するポリヌクレオチド配列を含むプラスミドDNAを細胞に導入することができる。特定の
実施態様では、DNAを塩化カルシウム溶液と組み合わせ、その後、リン酸緩衝溶液に添加
する。沈殿が形成されたら、この溶液を培養細胞に直接添加する。DMSO又はグリセロール
による処理を用いて、トランスフェクション効率を向上させることができ、ビス-ヒドロ
キシエチルアミノエタンスルホネート（BES）を用いて、安定なトランスフェクタントの
レベルを向上させることができる。リン酸カルシウムトランスフェクションシステムは、
市販されている（例えば、PROFECTION（登録商標）, Promega社, Madison, Wis.）。DEAE
-デキストラントランスフェクションを用いることもできる。

単離された胎盤細胞を、マイクロインジェクションによって遺伝子操作することもでき
る。特定の実施態様では、ガラスマイクロピペットを光学顕微鏡下で細胞の核に導いて、
DNA又はRNAを注入する。

胎盤細胞を、エレクトロポレーションを用いて遺伝子改変することもできる。特定の実
施態様では、DNA又はRNAを培養細胞の懸濁液に添加し、DNA／RNA-細胞懸濁液を2本の電極
の間に配置し、電気パルスにかけて、膜を横断する孔の出現により明らかになる細胞外膜
における一過性の透過性を生じさせる。

細胞を遺伝子改変するためのDNA又はRNAのリポソーム送達を、任意にジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（DOPE）又はジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）を
含むカチオン性リポソーム、例えば、LIPOFECTIN（登録商標）（Life Technologies社）
を用いて行なうことができる。他の市販の送達系としては、EFFECTENE（商標）（Qiagen
）、DOTAP（Roche Molecular Biochemicals）、FUGENE 6（商標）（Roche Molecular Bio
chemicals）、及びTRANSFECTAM（登録商標）（Promega）が挙げられる。

ウイルスベクターを用いて、例えば、標的遺伝子、ポリヌクレオチド、アンチセンス分
子、又はリボザイム配列の細胞への送達により、胎盤細胞を遺伝子改変することができる
。レトロウイルスベクターは、迅速に分裂する細胞に形質導入するのに効果的であるが、
DNAを非分裂細胞にも同じく効果的に転移するように、いくつかのレトロウイルスベクタ
ーが開発されている。レトロウイルスベクター用のパッケージング細胞株は当業者に公知
である。特定の実施態様では、レトロウイルスDNAベクターは、第1のLTRが、マルチクロ
ーニング部位にクローニングされた標的遺伝子配列に機能的に連結されるSV40プロモータ
ーの5'に位置し、マルチクローニング部位の後に3'の第二のLTRが位置するように、2つの
レトロウイルスLTRを含む。形成されたら、先に記載したようなリン酸カルシウムを介す
るトランスフェクションを用いて、レトロウイルスDNAベクターをパッケージング細胞株
に転移する。ウイルス産生の約48時間後、その時にはもう標的遺伝子配列を含んでいるウ
イルスベクターを回収する。レンチウイルスベクター、組換えヘルペスウイルス、アデノ
ウイルスベクター、又はアルファウイルスベクターを用いて細胞をトランスフェクトする
方法は、当技術分野で公知である。

標的細胞のトランスフェクション又は形質導入の成功を、当業者に公知の技術において
、遺伝子マーカーを用いて示すことができる。例えば、オワンクラゲ（Aequorea victori
a）の緑色蛍光タンパク質は、遺伝子改変された造血細胞の同定及び追跡のための効果的
なマーカーであることが示されている。別の選択マーカーとしては、β-Gal遺伝子、切断
型の神経成長因子受容体、又は薬物選択マーカー（限定するものではないが、NEO、MTX、
もしくはハイグロマイシンを含む）を挙げることができる。

（5.7.3 医薬組成物）
単離された胎盤細胞、例えば、PDACの集団、又は単離された胎盤細胞を含む細胞の集団
を、例えば、本明細書で提供される治療方法においてインビボで用いるための医薬組成物
へと製剤化することができる。そのような医薬組成物は、医薬として許容し得る担体、例
えば、生理食塩水溶液又はインビボ投与のための他の認可された生理的に許容し得る溶液
中に、単離された胎盤細胞の集団、又は単離された胎盤細胞を含む細胞の集団を含む。本
明細書に記載の単離された胎盤細胞を含む医薬組成物は、本明細書の別所に記載されてい
る、単離された胎盤細胞集団、もしくは単離された胎盤細胞のいずれか、又は単離された
胎盤細胞集団、もしくは単離された胎盤細胞の任意の組合せを含むことができる。医薬組
成物は、胎児の、母親の、又は胎児と母親の両方の単離された胎盤細胞を含むことができ
る。本明細書で提供される医薬組成物はさらに、単一の個体もしくは胎盤から、又は複数
の個体もしくは胎盤から得られた単離された胎盤細胞を含むことができる。

本明細書で提供される医薬組成物は、任意の数の単離された胎盤細胞を含むことができ
る。例えば、単離された胎盤細胞の単一の単位用量は、様々な実施態様では、約、少なく
とも、又は以下の個数を超えない1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1
×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹個、又はそれより多くの単
離された胎盤細胞を含むことができる。

本明細書で提供される医薬組成物は、50％以上の生存細胞を含む細胞の集団を含む（す
なわち、該集団内の細胞の少なくとも50％は機能的であるか、又は生存している）。好ま
しくは、該集団内の細胞の少なくとも60％が生存している。より好ましくは、該医薬組成
物中の該集団内の細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％が生存している。

本明細書で提供される医薬組成物は、例えば、生着を促進する1種以上の化合物（例え
ば、抗T細胞受容体抗体、免疫抑制剤など）；アルブミン、デキストラン40、ゼラチン、
ヒドロキシエチルスターチ、プラズマライトなどの安定化剤などを含むことができる。

注射用溶液として製剤化される場合、一実施態様では、医薬組成物は、約1％～1.5％の
HSA及び約2.5％のデキストランを含む。好ましい実施態様では、医薬組成物は、5％HSA及
び10％デキストラン、任意で、例えば、10mg／kgのシクロスポリンAのような、免疫抑制
剤を含む溶液中に、1ミリリットル当たり約5×10⁶細胞～1ミリリットル当たり約2×10⁷細
胞を含む。

他の実施態様では、医薬組成物、例えば、溶液は、複数の細胞、例えば、単離された胎
盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞を含み、ここで、該医薬組成物は、1ミ
リリットル当たり約1.0±0.3×10⁶細胞～1ミリリットル当たり約5.0±1.5×10⁶細胞を含
む。他の実施態様では、医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.5×10⁶細胞～1ミリリッ
トル当たり約3.75×10⁶細胞を含む。他の実施態様では、医薬組成物は、約1×10⁶細胞／m
L～約50×10⁶細胞／mL、約1×10⁶細胞／mL～約40×10⁶細胞／mL、約1×10⁶細胞／mL～約3
0×10⁶細胞／mL、約1×10⁶細胞／mL～約20×10⁶細胞／mL、約1×10⁶細胞／mL～約15×10⁶
細胞／mL、又は約1×10⁶細胞／mL～約10×10⁶細胞／mLを含む。特定の実施態様では、医
薬組成物は、目に見える細胞塊を含まない（すなわち、巨大な細胞塊を含まない）か、又
はそのような目に見える細胞塊を実質的に含まない。本明細書で使用されるように、「巨
大な細胞塊」は、拡大しなくても目に見える、例えば、裸眼で見える、細胞の凝集体を意
味し、かつ通常、約150ミクロンよりも大きい細胞凝集体を指す。いくつかの実施態様で
は、医薬組成物は、約2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5
％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、又は10％のデキストラン、例えば、デ
キストラン-40を含む。具体的な実施態様では、該組成物は、約7.5％～約9％のデキスト
ラン-40を含む。具体的な実施態様では、該組成物は、約5.5％のデキストラン-40を含む
。特定の実施態様では、医薬組成物は、約1％～約15％のヒト血清アルブミン（HSA）を含
む。具体的な実施態様では、医薬組成物は、約1％、2％、3％、4％、5％、65、75、8％、
9％、10％、11％、12％、13％、14％、又は15％のHSAを含む。具体的な実施態様では、該
細胞は、凍結保存され、解凍されたものである。別の具体的な実施態様では、該細胞は、
70μM～100μMのフィルターに通して濾過されたものである。別の具体的な実施態様では
、該組成物は、目に見える細胞塊を含まない。別の具体的な実施態様では、該組成物は、
10⁶細胞当たり約200個未満の細胞塊を含み、ここで、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学
顕微鏡下でしか目に見えない。別の具体的な実施態様では、該組成物は、10⁶細胞当たり
約150個未満の細胞塊を含み、ここで、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡下でし
か目に見えない。別の具体的な実施態様では、該組成物は、10⁶細胞当たり約100個未満の
細胞塊を含み、ここで、該細胞塊は、顕微鏡、例えば、光学顕微鏡下でしか目に見えない
。

具体的な実施態様では、医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.0±0.3×10⁶細胞、約
5.5％デキストラン-40（w／v）、約10％HSA（w／v）、及び約5％DMSO（v／v）を含む。

他の実施態様では、医薬組成物は、10％デキストラン-40を含む溶液中に複数の細胞、
例えば、複数の単離された胎盤細胞を含み、ここで、該医薬組成物は、1ミリリットル当
たり約1.0±0.3×10⁶細胞～1ミリリットル当たり約5.0±1.5×10⁶細胞を含み、かつ該組
成物は、肉眼で見える細胞塊を含まない（すなわち、巨大な細胞塊を含まない）。いくつ
かの実施態様では、医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.5×10⁶細胞～1ミリリットル
当たり約3.75×10⁶細胞を含む。具体的な実施態様では、該細胞は、凍結保存され、解凍
されたものである。別の具体的な実施態様では、該細胞は、70μM～100μMのフィルター
に通して濾過されたものである。別の具体的な実施態様では、該組成物は、10⁶細胞当た
り約200個未満の微小な細胞塊（すなわち、拡大したときにだけ目に見える細胞塊）を含
む。別の具体的な実施態様では、医薬組成物は、10⁶細胞当たり約150個未満の微小な細胞
塊を含む。別の具体的な実施態様では、医薬組成物は、10⁶細胞当たり約100個未満の微小
な細胞塊を含む。別の具体的な実施態様では、医薬組成物は、15％、14％、13％、12％、
11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、もしくは2％未満のDMSO、又は1％、0
.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、もしくは0.1％未満のDMSOを
含む。

細胞を含む組成物が本明細書でさらに提供され、ここで、該組成物は、本明細書に開示
されている方法のうちの1つによって産生される。例えば、一実施態様では、医薬組成物
は細胞を含み、ここで、該医薬組成物は、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性
細胞を含む溶液を濾過して、濾過された細胞含有溶液を形成させること；該濾過された細
胞含有溶液を、例えば、凍結保存前に、第1の溶液で1ミリリットル当たり約1～50×10⁶、
1～40×10⁶、1～30×10⁶、1～20×10⁶、1～15×10⁶、又は1～10×10⁶細胞に希釈すること
；及び得られた濾過された細胞含有溶液を、デキストランを含むが、ヒト血清アルブミン
（HSA）を含まない第二の溶液で希釈して、該組成物を産生することを含む方法によって
産生される。特定の実施態様では、該希釈することは、1ミリリットル当たり約15×10⁶細
胞以下までとする。特定の実施態様では、該希釈することは、1ミリリットル当たり約10
±3×10⁶細胞以下までとする。特定の実施態様では、該希釈することは、1ミリリットル
当たり約7.5×10⁶細胞以下までとする。他の特定の実施態様では、希釈前の、該濾過され
た細胞含有溶液が、1ミリリットル当たり約15×10⁶未満の細胞を含む場合、濾過は任意で
ある。他の特定の実施態様では、希釈前の、該濾過された細胞含有溶液が、1ミリリット
ル当たり約10±3×10⁶未満の細胞を含む場合、濾過は任意である。他の特定の実施態様で
は、希釈前の、該濾過された細胞含有溶液が、1ミリリットル当たり約7.5×10⁶未満の細
胞を含む場合、濾過は任意である。

具体的な実施態様では、細胞は、該第一の希釈溶液による希釈と該第二の希釈溶液によ
る希釈の間に凍結保存される。別の具体的な実施態様では、第一の希釈溶液は、デキスト
ラン及びHSAを含む。第一の希釈溶液又は第二の希釈溶液中のデキストランは、任意の分
子量のデキストラン、例えば、約10kDa～約150kDaの分子量を有するデキストランである
ことができる。いくつかの実施態様では、該第一の希釈溶液又は該第二の溶液中の該デキ
ストランは、約2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0
％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、又は10％デキストランである。別の具体的な
実施態様では、該第一の希釈溶液又は該第二の希釈溶液中のデキストランはデキストラン
-40である。別の具体的な実施態様では、該第一の希釈溶液及び該第二の希釈溶液中のデ
キストランはデキストラン-40である。別の具体的な実施態様では、該第一の希釈溶液中
の該デキストラン-40は5.0％デキストラン-40である。別の具体的な実施態様では、該第
一の希釈溶液中の該デキストラン-40は5.5％デキストラン-40である。別の具体的な実施
態様では、該第二の希釈溶液中の該デキストラン-40は10％デキストラン-40である。別の
具体的な実施態様では、該HSAを含む溶液中の該HSAは1～15％HSAである。別の具体的な実
施態様では、該HSAを含む溶液中の該HSAは、約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％
、9％、10％、11％、12％、13％、14％、又は15％HSAである。別の具体的な実施態様では
、該HSAを含む溶液中の該HSAは10％HSAである。別の具体的な実施態様では、該第一の希
釈溶液はHSAを含む。別の具体的な実施態様では、該第一の希釈溶液中の該HSAは10％HSA
である。別の具体的な実施態様では、該第一の希釈溶液は凍結保存剤を含む。別の具体的
な実施態様では、該凍結保存剤はDMSOである。別の具体的な実施態様では、該第二の希釈
溶液中の該デキストラン-40は約10％デキストラン-40である。別の具体的な実施態様では
、該細胞を含む組成物は、約7.5％～約9％デキストランを含む。別の具体的な実施態様で
は、医薬組成物は、1ミリリットル当たり約1.0±0.3×10⁶細胞～1ミリリットル当たり約5
.0±1.5×10⁶細胞を含む。別の具体的な実施態様では、医薬組成物は、1ミリリットル当
たり約1.5×10⁶細胞～1ミリリットル当たり約3.75×10⁶細胞を含む。

別の実施態様では、医薬組成物を、（a）凍結保存前に、胎盤細胞、例えば、胎盤幹細
胞又は胎盤多能性細胞を含む細胞含有溶液を濾過して、濾過された細胞含有溶液を産生す
ること；（b）該濾過された細胞含有溶液中の細胞を、1ミリリットル当たり約1～50×10⁶
、1～40×10⁶、1～30×10⁶、1～20×10⁶、1～15×10⁶、又は1～10×10⁶細胞で凍結保存す
ること；（c）該細胞を解凍すること；及び（d）該濾過された細胞含有溶液をデキストラ
ン-40溶液で約1：1～約1：11（v／v）に希釈することを含む方法によって作製する。特定
の実施態様では、細胞の数が、工程（a）の前に、1ミリリットル当たり約10±3×10⁶細胞
未満である場合、濾過は任意である。別の具体的な実施態様では、工程（b）の細胞を1ミ
リリットル当たり約10±3×10⁶細胞で凍結保存する。別の具体的な実施態様では、工程（
b）の細胞を約5％～約10％デキストラン-40とHSAとを含む溶液中で凍結保存する。特定の
実施態様では、該工程（b）の希釈は、1ミリリットル当たり約15×10⁶細胞以下までとす
る。

別の実施態様では、医薬組成物を、（a）10％HSAを含む5.5％デキストラン-40溶液に胎
盤細胞、例えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞を懸濁して、細胞含有溶液を形成させる
こと；（b）該細胞含有溶液を70μMフィルターに通して濾過すること；（c）該細胞含有
溶液を、5.5％デキストラン-40、10％HSA、及び5％DMSOを含む溶液で、1ミリリットル当
たり約1～50×10⁶、1～40×10⁶、1～30×10⁶、1～20×10⁶、1～15×10⁶、又は1～10×10⁶
細胞に希釈すること；（d）該細胞を凍結保存すること；（e）該細胞を解凍すること；並
びに（f）該細胞含有溶液を10％デキストラン-40で1：1～1：11（v／v）に希釈すること
を含む方法によって作製する。特定の実施態様では、該工程（c）の希釈は、1ミリリット
ル当たり約15×10⁶細胞以下までとする。特定の実施態様では、該工程（c）の希釈は、約
10±3×10⁶細胞／mL以下までとする。特定の実施態様では、該工程（c）の希釈は、約7.5
×10⁶細胞／mL以下までとする。

別の実施態様では、細胞を含む組成物を、（a）複数の細胞を遠心分離して、該細胞を
回収すること；（b）該細胞を5.5％デキストラン-40に再懸濁すること；（c）該細胞を遠
心分離して、該細胞を回収すること；（d）該細胞を、10％HSAを含む5.5％デキストラン-
40溶液に再懸濁すること；（e）該細胞を70μMフィルターに通して濾過すること；（f）
該細胞を、1ミリリットル当たり約1～50×10⁶、1～40×10⁶、1～30×10⁶、1～20×10⁶、1
～15×10⁶、又は1～10×10⁶細胞になるまで5.5％デキストラン-40、10％HSA、及び5％DMS
Oに希釈すること；（g）該細胞を凍結保存すること；（h）該細胞を解凍すること；並び
に（i）該細胞を10％デキストラン-40で1：1～1：11（v／v）に希釈することを含む方法
によって作製する。特定の実施態様では、該工程（f）の希釈は、1ミリリットル当たり約
15×10⁶細胞までとする。特定の実施態様では、該工程（f）の希釈は、約10±3×10⁶細胞
／mL以下までとする。特定の実施態様では、該工程（f）の希釈は、約7.5×10⁶細胞／mL
以下までとする。他の特定の実施態様では、細胞の数が、1ミリリットル当たり約10±3×
10⁶細胞未満である場合、濾過は任意である。

本明細書に記載の組成物、例えば、単離された胎盤細胞を含む医薬組成物は、本明細書
に記載の単離された胎盤細胞のいずれかを含むことができる。

細胞産物の投与に好適な他の注射用製剤を用いてもよい。

一実施態様では、医薬組成物は、実質的に、又は完全に非母親起源のものである、すな
わち、胎児の遺伝子型を有する単離された胎盤細胞を含み；例えば、少なくとも約90％、
95％、98％、99％、又は約100％は、非母親起源のものである。例えば、一実施態様では
、医薬組成物は、CD200⁺及びHLA-G^-；CD73⁺、CD105⁺、及びCD200⁺；CD200⁺及びOCT-4⁺；C
D73⁺、CD105⁺、及びHLA-G^-；CD73⁺及びCD105⁺であり、かつ該単離された胎盤細胞の集団
を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該胎盤
細胞の集団内での1以上の胚様体様体の形成を促進するか；又はOCT-4⁺であり、かつ該単
離された胎盤細胞の集団を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下
で培養したとき、該胎盤細胞の集団内での1以上の胚様体様体の形成を促進するか；又は
前述のものの組合せである単離された胎盤細胞の集団を含み、ここで、該単離された胎盤
細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％は、非母親起源のものである。別の
実施態様では、医薬組成物は、CD10⁺、CD105⁺、及びCD34^-；CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺、及
びCD34^-；CD10⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、かつCD90⁺もしくはCD45^-のうちの少なくとも1
つ；CD10⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、及びCD45^-； CD10⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200
⁺、CD34^-、及びCD45^-；CD200⁺及びHLA-G^-；CD73⁺、CD105⁺、及びCD200⁺；CD200⁺及びOCT-
4⁺；CD73⁺、CD105⁺、及びHLA-G^-；CD73⁺及びCD105⁺であり、かつ該単離された胎盤細胞を
含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したとき、該胎盤細
胞の集団内での1以上の胚様体様体の形成を促進するか；OCT-4⁺であり、かつ該単離され
た胎盤細胞を含む胎盤細胞の集団を、胚様体様体の形成を可能にする条件下で培養したと
き、該胎盤細胞の集団内での1以上の胚様体様体の形成を促進するか；又はCD117^-、CD133
^-、KDR^-、CD80^-、CD86^-、HLA-A、B、C⁺、HLA-DP、DQ、DR^-、及び／又はPDL1⁺のうちの1つ
もしくは複数であるか；又は前述のものの組合せである単離された胎盤細胞の集団を含み
、ここで、該単離された胎盤細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％は、非
母親起源のものである。具体的な実施態様では、医薬組成物はさらに、胎盤から得られな
い幹細胞を含む。

本明細書で提供される、組成物、例えば、医薬組成物中の単離された胎盤細胞は、単一
のドナーに由来するか、又は複数のドナーに由来する胎盤細胞を含むことができる。単離
された胎盤細胞は、意図されるレシピエントと完全にHLAが一致するものであることがで
きるか、又は一部もしくは完全にHLAが一致しないものであることができる。

（5.7.4 単離された胎盤細胞を含むマトリックス）
胎盤細胞、又は単離された胎盤細胞の集団を含むマトリックス、ハイドロゲル、スキャ
フォールドなどを含む組成物が本明細書でさらに提供される。そのような組成物を、液体
懸濁液中の細胞の代わりに、又はそれに加えて用いることができる。

本明細書に記載の単離された胎盤細胞を、天然マトリックス、例えば、羊膜材料などの
胎盤生体材料に播種することができる。そのような羊膜材料は、例えば、哺乳動物の胎盤
から直接解剖された羊膜；固定又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥している（すなわち
、＜20％H₂Oの）羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥している絨毛膜、実質的に乾燥している羊
膜と絨毛膜などであることができる。単離された胎盤細胞を播種することができる好まし
い胎盤生体材料は、その開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれてい
る、Haririの米国特許出願公開第2004／0048796号に記載されている。

本明細書に記載の単離された胎盤細胞を、例えば、注射に好適なハイドロゲル溶液に懸
濁することができる。そのような組成物のための好適なハイドロゲルは、RAD16などの自
己集合ペプチドを含む。一実施態様では、細胞を含むハイドロゲル溶液を、例えば、鋳型
中で硬化させて、その中に分散した細胞を有する埋め込み用のマトリックスを形成させる
ことができる。そのようなマトリックス中の単離された胎盤細胞を、該細胞が埋め込み前
に有糸分裂で拡大されるように培養することもできる。ハイドロゲルは、例えば、共有結
合、イオン結合、又は水素結合によって架橋されて、3次元開放格子構造を生成する有機
ポリマー（天然物又は合成物）であり、この3次元開放格子構造は、水分子を捕捉してゲ
ルを形成する。ハイドロゲル形成材料としては、イオンによって架橋される、アルギネー
トなどの多糖類及びその塩、ペプチド、ポリホスファジン、並びにポリアクリレート、又
はそれぞれ、温度もしくはpHによって架橋される、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレ
ングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーが挙げられる。いくつかの実施
態様では、ハイドロゲル又はマトリックスは生体分解性である。

いくつかの実施態様では、製剤は、インサイチュで重合可能なゲルを含む（例えば、そ
の開示が、その全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開
第2002／0022676号；Ansethらの文献（J. Control Release, 78（1-3）：199-209（2002
））；Wangらの文献（Biomaterials, 24（22）：3969-80（2003））を参照されたい）。

いくつかの実施態様では、ポリマーは、荷電側基、又はその一価イオン塩を有する水、
緩衝塩溶液、又は水性アルコール溶液などの水溶液に少なくとも一部溶ける。カチオンと
反応させることができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ
（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ
（酢酸ビニル）、及びスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリ
ル酸又はメタクリル酸とビニルエーテルモノマー又はビニルエーテルポリマーの反応によ
って形成される酸性側基を有するコポリマーを用いることもできる。酸性基の例は、カル
ボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくは、フッ素化）アルコール基、フェノー
ル性OH基、及び酸性OH基である。

具体的な実施態様では、マトリックスは、生体吸収性材料、例えば、PGA、PLA、PCLコ
ポリマーもしくはブレンド、又はヒアルロン酸でできたマルチフィラメント糸から構成さ
れることができるフェルトである。クリンピング、裁断、カーディング、及びニードリン
グからなる標準的な繊維加工技術を用いて、該糸をフェルトにする。別の好ましい実施態
様では、本発明の細胞を、複合構造物であり得る発泡体スキャフォールド上に播種する。
さらに、3次元フレームワークを、有用な形状、例えば、修復、置換、又は強化すべき体
内の特定の構造に成形することができる。使用することができるスキャフォールドの他の
例としては、不織マット、多孔性発泡体、又は自己集合ペプチドが挙げられる。不織マッ
トは、グリコール酸と乳酸の吸収性合成コポリマー（例えば、PGA／PLA）（VICRYL, Ethi
con社，Somerville, N.J.）から構成される繊維を用いて形成させることができる。フリ
ーズドライ、又は凍結乾燥などのプロセスによって形成される、例えば、ポリ（ε-カプ
ロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（PCL／PGA）コポリマーから構成される発泡体（例
えば、米国特許第6,355,699号参照）をスキャフォールドとして用いることもできる。

本明細書に記載の単離された胎盤細胞又はその共培養物を3次元フレームワーク又はス
キャフォールドに播種し、インビボで埋め込むことができる。そのようなフレームワーク
を、任意の1種以上の成長因子、細胞、薬物、又は例えば、組織形成を刺激する他の成分
と組み合わせて埋め込むことができる。

使用することができるスキャフォールドの例としては、不織マット、多孔性発泡体、又
は自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、グリコール酸と乳酸の吸収性合成コポ
リマー（例えば、PGA／PLA）（VICRYL, Ethicon社, Somerville, N.J.）から構成される
繊維を用いて形成させることができる。フリーズドライ、又は凍結乾燥などのプロセスに
よって形成される、例えば、ポリ（ε-カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（PCL／
PGA）コポリマーから構成される発泡体（例えば、米国特許第6,355,699号参照）をスキャ
フォールドとして用いることもできる。

別の実施態様では、単離された胎盤細胞を、例えば、PGA、PLA、PCLコポリマーもしく
はブレンド、又はヒアルロン酸などの生体吸収性材料でできたマルチフィラメント糸から
構成されることができるフェルトに播種するか、或いはそれと接触させることができる。

本明細書で提供される単離された胎盤細胞を、別の実施態様では、複合構造物であり得
る発泡体スキャフォールドに播種することができる。そのような発泡体スキャフォールド
を、有用な形状、例えば、修復、置換、又は強化すべき体内の特定の構造物の一部の形状
に成形することができる。いくつかの実施態様では、フレームワークを、例えば、0.1M酢
酸で処理し、その後、細胞接着を強化するために、細胞の接種前に、ポリリジン、PBS、
及び／又はコラーゲン中でインキュベートする。例えば、マトリックスのプラズマ被覆、
又は1種以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質
、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）、コンドロイチン-
4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸（keratin sulfate）な
ど）、細胞マトリックス、並びに／もしくは限定するものではないが、ゼラチン、アルギ
ネート、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどのような他の材料の付加によって、マトリ
ックスの外部表面を修飾し、細胞の接着又は成長、及び組織の分化を改善することができ
る。

いくつかの実施態様では、スキャフォールドは、それを抗血栓性にする材料を含むか、
又は該材料で処理される。これらの処理及び材料は、内皮成長、移動、及び細胞外マトリ
ックス沈着を促進し、かつ持続させることもできる。これらの材料及び処理の例としては
、天然材料、例えば、ラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、合成材料、
例えば、EPTFE、並びにセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、PURSPAN（商
標）（The Polymer Technology Group社, Berkeley, Calif）が挙げられるが、これらに
限定されない。スキャフォールドは、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むこともでき；単離さ
れた胎盤細胞の播種の前に、スキャフォールドを、表面電荷を変化させるように処理する
（例えば、プラズマで被覆する）こともできる。

本明細書で提供される胎盤細胞（例えば、PDAC）を、限定するものではないが、モノリ
ン酸カルシウム、ジリン酸カルシウム、トリリン酸カルシウム、α-トリリン酸カルシウ
ム、β-トリリン酸カルシウム、及びテトラリン酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト
、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カル
シウム、リン酸カルシウムマグネシウム、BIOGLASS（登録商標）などの生体活性ガラス、
並びにそれらの混合物をはじめとする、生理的に許容し得るセラミック材料に播種するか
、又はそれと接触させることもできる。現在市販されている多孔性の生体適合性セラミッ
ク材料としては、SURGIBONE（登録商標）（CanMedica社, Canada）、ENDOBON（登録商標
）（Merck Biomaterial France, France）、CEROS（登録商標）（Mathys, AG, Bettlach,
Switzerland）、並びにHEALOS（商標）（DePuy社, Raynham, MA）、並びにVITOSS（登録
商標）、RHAKOSS（商標）、及びCORTOSS（登録商標）（Orthovita, Malvern, Pa.）など
の石灰化コラーゲンの骨移植用製品が挙げられる。フレームワークは、天然材料及び／又
は合成材料の混合物、ブレンド、又は複合物であることができる。

一実施態様では、単離された胎盤細胞を、約0.5×10⁶～約8×10⁶細胞／mLで、好適なス
キャフォールドに播種するか、又はそれと接触させる。

（5.8 不死化胎盤細胞株）
成長促進タンパク質の産生及び／又は活性が外部因子によって調節可能であるように、
哺乳動物の胎盤細胞、例えば、PDACを、成長促進遺伝子、すなわち、適切な条件下で、ト
ランスフェクトされた細胞の成長を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の
好適なベクターによるトランスフェクションによって、条件付きで不死化することができ
る。好ましい実施態様では、成長促進遺伝子は、限定するものではないが、v-myc、N-myc
、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス、又はヒ
トパピローマウイルスのE7タンパク質などのオンコジーンである。

成長促進タンパク質の外部調節は、外部調節可能なプロモーター、例えば、その活性を
、例えば、トランスフェクトされた細胞の温度又は該細胞と接触する培地の組成を変更す
ることによって制御することができるプロモーターの制御下に成長促進遺伝子を配置する
ことによって達成することができる。一実施態様では、テトラサイクリン（tet）制御遺
伝子発現系を利用することができる（Gossenらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89
：5547-5551, 1992）；Hoshimaruらの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：1518-1523
, 1996）を参照されたい）。tetの非存在下で、このベクター中のtet制御性トランス活性
化因子（tTA）は、tetオペレーター配列に融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小
プロモーターであるph_CMV*-1からの転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌のトランスポ
ゾン-10由来のtet耐性オペロンのリプレッサー（tetR）と単純ヘルペスウイルスのVP16の
酸性ドメインの融合タンパク質である。tetの低い、非毒性濃度（例えば、0.01～1.0μg
／mL）は、tTAによるトランス活性化をほぼ完全に消失させる。

一実施態様では、ベクターは、選択マーカー、例えば、薬物耐性を付与するタンパク質
をコードする遺伝子をさらに含む。細菌のネオマイシン耐性遺伝子（neo^R）は、本方法に
おいて利用し得るそのようなマーカーの1つである。neo^Rを有する細胞は、成長培地への
、例えば、100～200μg／mLのG418の添加などの、当業者に公知の手段によって選択する
ことができる。

トランスフェクションは、限定するものではないが、レトロウイルス感染を含む、当業
者に公知の種々の手段のいずれかによって達成することができる。一般に、細胞培養物を
、ベクターのプロデューサー細胞株から回収される馴化培地とN2補給剤含有DMEM／F12の
混合物とのインキュベーションによってトランスフェクトすることができる。例えば、上
記のように調製された胎盤細胞培養物を、例えば、5日後にインビトロで、1容量の馴化培
地と2容量のN2補給剤含有DMEM／F12中での約20時間のインキュベーションによって感染さ
せることができる。その後、選択マーカーを有するトランスフェクトされた細胞を、上記
のように選択することができる。

トランスフェクション後、培養物を、増殖を可能にする、例えば、24時間の間に細胞の
少なくとも約30％を倍加させる表面に継代する。好ましくは、基材は、ポリオルニチン（
10μg／mL）及び／もしくはラミニン（10μg／mL）でコーティングされた組織培養プラス
チックからなるポリオルニチン／ラミニン基材、ポリリジン／ラミニン基材、又はフィブ
ロネクチンで処理された表面である。その後、培養物に、3～4日ごとに成長培地を供給す
る。この成長培地には、1種以上の増殖増強因子が補充されていてもよいし、補充されて
いなくてもよい。増殖増強因子は、培養物が50％未満のコンフルエントである場合に、成
長培地に添加してもよい。

80～95％コンフルエントになったとき、条件的に不死化された胎盤細胞株を、標準的な
技術を用いて、例えば、トリプシン処理によって継代することができる。約20回目の継代
までは、いくつかの実施態様では、選択（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞の
場合、G418の添加による）を維持することが有益である。細胞は、長期保存のために液体
窒素で凍結することもできる。

クローン細胞株を、上記のように調製された条件的に不死化されたヒト胎盤細胞株から
単離することができる。一般に、そのようなクローン細胞株を、標準的な技術を用いて、
例えば、限定希釈によるか、又はクローニングリングを用いて単離し、拡大することがで
きる。通常、クローン細胞株に、上記のように栄養を与え、それを継代することができる
。

クローンであってもよいが、その必要はない、条件的に不死化されたヒト胎盤細胞株は
、通常、分化を促進する培養条件下で成長促進タンパク質の産生及び／又は活性を抑制す
ることによって、分化するように誘導することができる。例えば、成長促進タンパク質を
コードする遺伝子が外部調節可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば、培
地の温度又は組成を変更して、成長促進遺伝子の転写を抑制することができる。上で論じ
られているテトラサイクリンで制御される遺伝子発現系については、成長促進遺伝子の転
写を抑制するためのテトラサイクリンの添加によって、分化を達成することができる。一
般に、分化を開始するのに、4～5日間の1μg／mLのテトラサイクリンで十分である。さら
なる分化を促進するために、追加の薬剤を成長培地に含めてもよい。

（5.9 キット）
別の態様では、循環器系の疾患又は障害を有する個体の治療に好適なキットであって、
残りのキット内容物とは別の容器中に、組織培養プラスチック接着性多能性胎盤細胞、例
えば、胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞、例えば、上の第5.2節に記載の細胞（PDAC）と、
使用説明書とを含む、キットが本明細書で提供される。好ましくは、該胎盤細胞は、医薬
として許容し得る溶液、例えば、病変内投与に好適な溶液又は静脈内投与に好適な溶液に
入れて提供される。特定の実施態様では、該胎盤幹細胞又は胎盤多能性細胞は、本明細書
に記載のCD10⁺、CD34^-、CD105⁺胎盤細胞のいずれか、例えば、CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD
200⁺胎盤細胞又はCD10⁺、CD34^-、CD45^-、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺胎盤細胞である。

特定の実施態様では、キットは、個体への胎盤細胞の送達を容易にする1種以上の構成
要素を含む。例えば、特定の実施態様では、キットは、個体への胎盤細胞の病変内送達を
容易にする構成要素を含む。そのような実施態様では、キットは、例えば、個体への細胞
の送達に好適な注射器及び針などを含むことができる。そのような実施態様では、胎盤細
胞は、バッグに、又は1以上のバイアルに入れて、キットに含まれていてもよい。特定の
他の実施態様では、キットは、個体への胎盤細胞の静脈内又は動脈内送達を容易にする構
成要素を含む。そのような実施態様では、胎盤細胞は、例えば、ボトル又はバッグ（例え
ば、血液バッグもしくは細胞を含む最大約1.5Lの溶液を含むことができる同様のバッグ）
に含まれていてもよく、かつキットは、個体への細胞の送達に好適なチューブ及び針をさ
らに含む。

さらに、キットは、個体の疼痛又は炎症を軽減する1種以上の化合物（例えば、鎮痛薬
、ステロイド性又は非ステロイド性抗炎症化合物など）を含むことができる。キットは、
抗菌化合物又は抗ウイルス化合物（例えば、1種以上の抗生物質）、個体の不安を軽減す
る化合物（例えば、アラプラゾラム（alaprazolam））、個体の免疫応答を低下させる化
合物（例えば、シクロスポリンA）、抗ヒスタミン薬（ジフェンヒドラミン、ロラタジン
、デスロラタジン、クエチアピン、フェキソフェナジン、セチリジン、プロメタジン、ク
ロレフェニラミン（chlorepheniramine）、レボセチリジン、シメチジン、ファモチジン
、ラニチジン、ニザチジン、ロキサチジン、ラフチジンなど）を含むこともできる。

さらに、キットは、個体の送達への準備を促進するか、又は胎盤細胞の投与の結果とし
ての個体の感染の可能性を低下させる、使い捨て品、例えば、滅菌ワイプ、使い捨て紙製
品、手袋などを含むことができる。

（6.実施例）
（6.1 実施例1：表現型による胎盤由来接着細胞の特徴付け）
この実施例は、胎盤細胞（PDACとも呼ばれる、CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盤幹細
胞）による血管形成因子の分泌を示す。

（6.1.1 胎盤由来接着細胞の血管形成能の評価のためのセクレトームプロファイリング
）
マルチプレックスビーズアッセイ：継代数6の胎盤由来接着細胞を成長培地中に同じ細
胞数でプレーティングし、馴化培地を48時間後に回収した。磁気ビーズに基づくマルチプ
レックスアッセイ（Bio-Plex ProTM, Bio-Rad, CA）アッセイを用いて、細胞馴化培地中
の複数の血管形成サイトカイン／成長因子の同時定量解析を行なった。このアッセイは、
血清、血漿、及び細胞／組織培養上清を含む多様なマトリックス中での血管形成性バイオ
マーカーの測定を可能にするものである。これらの96ウェルプレートフォーマットのビー
ズに基づくアッセイの原理は、捕捉サンドイッチイムノアッセイと類似している。所望の
血管形成標的に対する抗体を、内部染色したビーズに共有結合させる。結合したビーズを
、該血管形成標的を含む試料と反応させる。未結合タンパク質を除去するための一連の洗
浄の後、異なるエピトープに特異的なビオチン化検出抗体を反応に加える。結果は、該血
管形成標的周辺での抗体のサンドイッチの形成である。次に、ストレプトアビジン-PEを
加えて、ビーズ表面のビオチン化検出抗体に結合させる。簡潔に述べると、マルチプレッ
クスアッセイを製造業者の指示に従って行ない、馴化培地中のそれぞれの血管形成成長因
子の量を評価した。

ELISA：細胞馴化培地中の単一の血管形成サイトカイン／成長因子の定量解析を、R&D S
ystems（Minneapolis, MN）製の市販キットを用いて行なった。簡潔に述べると、ELISAア
ッセイを製造業者の指示に従って行ない、馴化培地中のそれぞれの血管形成成長因子の量
を評価した。

PDACによる様々な血管形成タンパク質の分泌のレベルを表1に示す。

別の実験において、PDACは、アンジオポエチン-1、アンジオポエチン-2、PECAM-1（CD3
1；血小板内皮細胞接着分子）、ラミニン、及びフィブロネクチンも分泌することが確認
された。

（6.2 実施例2：機能による胎盤細胞の特徴付け）
この実施例は、血管形成能及び分化能と関連する胎盤細胞（PDACとも呼ばれる、CD10⁺
、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盤幹細胞）の様々な特徴を示す。

（6.2.1 PDACの血管形成能の評価のためのHUVEC管形成）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、継代数3以下で、EGM-2培地（Cambrex, East Ruthe
rford, NJ）中で3日間、継代培養し、約70％～80％のコンフルエンシーで回収した。HUVE
Cを基本培地／抗生物質（DMEM／F12（Gibco））で1回洗浄し、所望の濃度で同じ培地に再
懸濁した。HUVECは、調製から1時間以内に用いた。ヒト胎盤コラーゲン（HPC）を10mM HC
l（pH 2.25）中1.5mg／mLの濃度にして、緩衝剤でpH 7.2に中性化し、使用するまで氷上
に置いた。このHPCを4000細胞／μlの最終細胞濃度でHUVEC懸濁液と組み合わせた。得ら
れたHUVEC／HPC懸濁液をすぐにピペッティングし、1ウェル当たり3μlで96ウェルプレー
トに入れた（蒸発を避けるために、プレート周囲を、滅菌PBSで予め満たさなければなら
ない。1条件当たり、n＝5）。コラーゲン重合を可能にするために、培地を添加せずに、H
UVEC滴を37℃及び5％CO₂で75～90分間インキュベートした。「乾燥」インキュベーション
の終了後、各ウェルを200μlの馴化PDAC培地（n＝2細胞株）又は対照培地（例えば、陰性
対照としてのDMEM／F12、及び陽性対照としてのEGM-2）でゆっくりと満たし、37℃及び5
％CO₂で20時間インキュベートした。馴化培地は、継代数6のPDACを成長培地中で4～6時間
インキュベートすることにより調製し；付着及び広がりの後、培地を24時間 DMEM／F12に
交換した。インキュベーション後、HUVEC滴を乱さないで培地をウェルから除去し、ウェ
ルをPBSで1回洗浄した。次に、HUVEC滴を10秒間固定し、Diff-Quik細胞染色キットを用い
て1分間染色し、その後、滅菌水で3回すすいだ。染色された滴を風乾し、Zeiss SteReo D
iscovery V8顕微鏡を用いて各ウェルの画像を取得した。次に、これらの画像を、コンピ
ュータソフトウエアパッケージImageJ及び／又はMatLabを用いて解析した。画像を、カラ
ーから8ビットグレースケール画像に変換し、閾値を設定して白黒画像に変換した。次に
、粒子解析機能を用いて画像を解析し、それにより、カウント（個々の粒子の数）、総面
積、（個々の粒子の）平均サイズ、及びアッセイにおける内皮管形成の量に等しい面積率
を含む、ピクセル密度データがもたらされた。

管形成の誘導によって示されるように、馴化培地は、内皮細胞に対する血管形成効果を
発揮した（図2を参照されたい）。

（6.2.2 HUVEC遊走アッセイ）
この実験で、胎盤由来接着細胞の血管形成能が示された。HUVECをフィブロネクチン（F
N）コーティングした12ウェルプレートで単層コンフルエンスになるまで成長させ、この
単層を1mLプラスチックピペットチップで「傷付け」て、ウェルを横切る無細胞線を作っ
た。この「傷付けられた」細胞を、3日間の成長の後にPDACから得られた無血清馴化培地
（EBM2；Cambrex）とともにインキュベートすることにより、HUVECの遊走を試験した。細
胞を含まないEBM2培地を対照として用いた。15時間後に、無細胞領域内への細胞遊走を倒
立顕微鏡を用いて記録した（n＝3）。次に、これらの写真を、コンピュータソフトウエア
パッケージImageJ及び／又はMatLabを用いて解析した。画像を、カラーから8ビットグレ
ースケール画像に変換し、閾値を設定して白黒画像に変換した。次に、粒子解析機能を用
いて画像を解析し、それにより、カウント（個々の粒子の数）、総面積、（個々の粒子の
）平均サイズ、及びアッセイにおける内皮遊走の量に等しい面積率を含む、ピクセル密度
データがもたらされた。細胞遊走の程度を、最初に記録した創傷線の大きさに対して採点
し、結果を1×10⁶細胞に対して正規化した。

細胞遊走の誘導によって示されるように、胎盤由来接着細胞によって分泌された栄養因
子は、内皮細胞に対する血管形成効果を発揮した（図3）。

別の実験において、HUVECを24ウェルプレートの底で培養して、EGM2中で一晩定着させ
、その後、EBM中で半日飢餓状態にした。同時に、培地で培養したPDACを解凍し、トラン
スウェル（8μM）中で一晩培養した。EC飢餓の後、馴化した無血清DMEMを、トランスウェ
ルとともに、ECの上方に移して、一晩増殖させた。4つの複製物を各実験に含め、24時間
後の増殖をPromegaのCell Titer Glo Assayで評価した。EBM-2培地を陰性対照として用い
、EGM-2を陽性対照として用いた。エラーバーは、分析用複製物（n＝3）の標準偏差を表
す。

PDACによって分泌された栄養因子は、HUVECの増殖を示すHUVEC細胞数の増加をもたらし
た。図4を参照されたい。

（6.2.3 胎盤由来接着細胞の血管形成能の評価のための管形成）
PDACを、VEGFを含まない成長培地か、又はVEGFを含むEGM2-MVかのどちらかの中で成長
させて、この細胞の一般的な血管形成能、及びこの細胞の分化能に対するVEGFの効果を評
価した。HUVECを、管形成の対照細胞として、EGM2-MV中で成長させた。これらの細胞を、
それらが70～80％コンフルエンスに達するまで、それぞれの培地中で4～7日間培養した。
冷たい（4℃）MATRIGEL（商標）溶液（50μL；BD Biosciences）を12ウェルプレートのウ
ェルに分注し、このプレートを37℃で60分間インキュベートして、この溶液をゲル化させ
た。PDAC及びHUVEC細胞をトリプシン処理し、適当な培地（VEGFを含む及び含まない）に
再懸濁し、100μlの希釈した細胞（1～3×10⁴細胞）を、MATRIGEL（商標）を含むウェル
の各々に加えた。重合したMATRIGEL（商標）上の細胞を、0.5～100ngのVEGFの存在下又は
非存在下で、4～24時間、37℃の5％CO₂インキュベーター内に置いた。インキュベーショ
ン後、これらの細胞を、標準的な光学顕微鏡法を用いて、管形成の兆候について評価した
。

PDACは、VEGFの非存在下でわずかな管形成を示したが、VEGFによる刺激によって誘導さ
れ／分化させられて、管状構造を形成した。図5を参照されたい。

（6.2.4 胎盤由来接着細胞の血管形成能の評価のための低酸素応答性）
内皮細胞及び／又は内皮前駆体の血管形成機能を評価するために、細胞を、低酸素及び
酸素正常条件下で血管形成成長因子を分泌するその能力に関して評価することができる。
低酸素条件下の培養は、通常、内皮細胞又は内皮前駆細胞のいずれかによる血管形成成長
因子の分泌の増加を誘導し、これは、馴化培地中で測定することができる。胎盤由来接着
細胞を、その標準的な成長培地中に同じ細胞数でプレーティングし、約70～80％コンフル
エンスになるまで成長させた。その後、細胞を無血清培地（EBM-2）に移し、酸素正常（2
1％O₂）又は低酸素（1％O₂）条件下で24時間インキュベートした。馴化培地を回収し、R&
D Systems製の市販のELISAキットを用いて、血管形成成長因子の分泌を解析した。ELISA
アッセイを製造業者の指示に従って行ない、馴化培地中のそれぞれの血管形成成長因子（
VEGF及びIL-8）の量を1×10⁶細胞に対して正規化した。

胎盤由来接着細胞は、低酸素条件下での様々な血管形成成長因子の分泌の上昇を示した
。図6を参照されたい。

（6.2.5 PDAC馴化培地に対するHUVEC応答）
PDACを、60％DMEM-LG（Gibco）；40％MCBD-201（Sigma）；2％FBS（Hyclone Labs）、1
×インスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）；10ng／mLのリノール酸-ウシ血清アルブ
ミン（LA-BSA）；1n-デキサメタゾン（Sigma）；100 μMアスコルビン酸2-ホスフェート
（Sigma）；10ng／mL 上皮成長因子（R & D Systems）；及び10ng／mL血小板由来成長因
子（PDGF-BB）（R & D Systems）を含む成長培地中で48時間培養し、その後、無血清培地
中でさらに48時間培養した。PDAC培養物由来の馴化培地を回収し、これを用いて、血清飢
餓HUVECを5、15、及び30分間刺激した。その後、HUVECを溶解させ、血管形成経路シグナ
ル伝達において役割を果たすことが知られているホスホタンパク質について、BD（商標）
CBA（サイトメトリービーズアッセイ）Cell Signaling Flex Kit（BD Biosciences）で染
色した。PDACは、AKT-1（これは、アポトーシス過程を阻害する）、AKT-2（これは、イン
スリンシグナル伝達経路の重要なシグナル伝達タンパク質である）、及びERK 1／2という
HUVECの細胞増殖経路の強力なアクチベーターであることが分かった。これらの結果は、P
DACの血管形成能をさらに示している。

（6.3 実施例3：PDACによる血管形成の誘導）
この実施例は、上の実施例1に記載のPDACが、ニワトリ絨毛尿膜（CAM）を用いるインビ
ボアッセイで血管形成を促進することを示す。

2つの別々のCAMアッセイを実施した。第一のCAMアッセイでは、様々なPDAC調製物由来
の無傷の細胞ペレットを評価した。第二のCAMアッセイでは、様々なPDAC調製物の上清を
評価した。線維芽細胞成長因子（bFGF）を陽性対照として用い、MDA-MB-231ヒト乳癌細胞
を参照として用い、ビヒクル対照及び培地対照を陰性対照として用いた。この試験のエン
ドポイントは、全ての治療群及び対照群の血管密度を決定することであった。

（6.3.1 PDACを用いるCAMアッセイ）
上記のように調製され、凍結保存されたPDACを用いた。PDACを投与のために解凍し、CA
M上に投与される細胞の数を決定した。

試験デザイン：この試験は5つの群を含み、各群に10個の胚が含まれた。この試験のデ
ザインを表2に記載する。

CAMアッセイ手順：新鮮な受精卵を標準的な卵インキュベーターにて37℃で3日間インキ
ュベートした。3日目に、滅菌条件下で卵を割り、胚を20枚の100mmプラスチックプレート
に入れ、一番下の棚に貯水槽を備えた胚インキュベーターにて37℃で培養した。インキュ
ベーター内の湿度が一定保たれるように、小型のポンプを用いて空気を貯水槽に連続的に
バブリングさせた。6日目に、滅菌シリコン製「O」リングを各CAM上に置き、その後、7.6
9×10⁵細胞／40μLの培地／MATRIGEL（商標）混合物（1:1）の密度のPDAC を滅菌フード
内の各「O」リングの中に供給した。表2A及び2Bは、使用した細胞の数及び投与用に各細
胞調製物に添加した培地の量を表す。ビヒクル対照胚には、40μLのビヒクル（PBS／ MAT
RIGEL（商標）、1:1）を投与し、陽性対照には、40μlのDMEM培地／MATRIGEL（商標）混
合物（1:1）中の100ng／mlのbFGFを投与し、培地対照には、40μlのDMEM培地のみを投与
した。各投与が終了した後、胚をインキュベーターに戻した。8日目に、胚をインキュベ
ーターから取り出し、室温に保持しながら、画像取得システムを100倍の倍率で用いて、
各「O」リング下で血管密度を決定した。

血管密度は、CAM上の処理部位に存在する血管の数を示す、0～5の算術的数、又は1～32
の指数関数的数を用いた血管形成採点システムにより測定した。より高い得点数がより高
い血管密度を表す一方、0は血管形成なしを表した。各投与部位での阻害のパーセントは
、各々の個々の実験の対照試料から得られた平均得点で割ったその部位について記録され
た得点を用いて計算した。所与の化合物の各用量についての阻害のパーセントは、その用
量について8～10個の胚から得られた全ての結果をプールすることによって計算した。

（結果）
血管密度得点の結果を図7に示す。これらの結果から、PDAC細胞懸濁液、又は100ng／mL
のbFGF、又はMDAMB231乳癌細胞懸濁液で処理したニワトリ絨毛尿膜の血管密度得点が、ビ
ヒクル対照CAMの血管密度得点と比較して統計的に有意に高かった（P＜0.001、スチュー
デントの「t」検定）ことが明白に示されている。PDACを培養するために用いた培地（陰
性対照）は、血管密度に何ら影響を及ぼさなかった。さらに、PDAC調製物の血管密度の誘
導は若干の変動を示したが、この変動は統計的に有意でなかった。

（6.3.2 PDAC上清を用いるCAMアッセイ）
MDA-MB-231細胞及びPDAC由来の上清試料を上記の第二のCAMアッセイで用いた。bFGF及
びMDA-MB-231上清を陽性対照として用い、培地及びビヒクルを陰性対照として用いた。

試験デザイン：この試験は5つの群を含み、各群に10個の胚が含まれた。この試験のデ
ザインを表4に記載する。

CAMアッセイ手順：アッセイの手順は、上の第6.3.1節に記載したものと同じであった。
唯一の違いは、各幹細胞調製物又はMDA-MB-231細胞由来の上清を試験材料として用いたこ
とであった。投与のために、各上清をMATRIGEL（商標）と混合し（体積で1：1）、40μL
の混合物を各胚に投与した。

結果：血管密度得点（図8参照）は、各幹細胞調製物の上清による血管形成の誘導が異
なっていたことを示している。PDAC由来の上清試料は、それぞれP＜0.01、P＜0.001、及
びP＜0.02（スチューデントの「t」検定）で血管誘導に対する有意な効果を示した。予想
されたように、陽性対照bFGFも、CAMアッセイNo.1において上で認められたような血管形
成の強力な誘導を示した（P＜0.001、スチューデントの「t」検定）。しかしながら、MDA
-MB-231ヒト乳癌細胞由来の上清は、ビヒクル対照と比較して血管形成に対する有意な誘
導を示さなかった。先に示したように、培養培地のみは、何ら影響を及ぼさなかった。

（6.4 実施例4：PDACは神経保護効果を示す）
この実施例は、PDACが酸素グルコース除去（OGD）傷害アッセイを用いた低酸素及び低
グルコース条件で神経保護効果を有し、活性酸素種を減少させることを示す。したがって
、これらの結果は、PDACが脳卒中又は末梢血管疾患などの虚血状態の治療において有用で
あり、虚血状態に起因する再灌流傷害を防ぐことを示す。

ヒトニューロン（ScienCell、カタログ# 1520）を製造業者の推奨に従って培養した。
簡潔に述べると、培養容器を、滅菌蒸留水中、37℃で１時間、ポリL-リジン（2μg／mL）
でコーティングした。この容器を再蒸留H₂Oで3回洗浄した。ニューロン培地（ScienCell
）を容器に加え、インキュベーター内で37℃に平衡化した。ニューロンを解凍し、遠心分
離せずに容器に直接加えた。その後の培養では、培地を、培養の開始の翌日に、その後は
1日おきに交換した。ニューロンは、通常、4日目までに傷害を受ける準備が整っていた。

OGD培地（ダルベッコの改変イーグル培地-グルコース不含）は、1つには液体培地中の
酸素の溶解度を低下させるために、最初に培地を水浴中で加温することによって調製した
。溶存酸素を除去するために、0.5μm拡散石（diffusing stone）を用いて100％窒素を培
地中に30分間バブリングさせた。HEPES緩衝液を1mMの最終濃度になるように加えた。スパ
ージの終了時に培地をニューロンに直接加えた。ディップ式の酸素センサーを用いた酸素
レベルの確認のために、少量の培地試料を分注した。酸素レベルは、通常、0.9％～約5.0
％酸素に低下した。

ガス処理前にチャンバーを少なくとも4時間（好ましくは一晩）37℃のインキュベータ
ー内に置くことにより、低酸素チャンバーを準備した。培養容器中の培地を除去し、脱気
した培地と交換し、この培養容器を低酸素チャンバーの中に入れた。次に、この低酸素チ
ャンバーに、システムを通して20～25Lpmの速度で少なくとも5分間、95％N₂／5％CO₂ガス
を流した。このシステムをインキュベーターにて37℃で4時間インキュベートし、1時間後
にチャンバーをもう一度脱気した。

傷害処置の終了時に、OGD培地を吸引し、温かい培地をニューロンに加えた。24～28時
間後に、PDAC及びニューロンを、ニューロンに加えられるニューロン培地に懸濁した6ウ
ェルプレートのウェル当たり各100,000個の細胞で同じ数でプレーティングし、6日間共培
養した。

各条件について6ウェルプレートのランダムな視野の顕微鏡写真を撮影した。典型的な
ニューロンの形態を有する細胞を同定し、神経突起長を記録した。神経突起の平均長は、
ニューロンの健康と正に相関し、ニューロンとPDACの共培養でより長く、PDACが傷害から
細胞を保護することが示された。

（活性酸素種アッセイ）
PDACは、低酸素時にスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、及びヘムオキシゲナ
ーゼ遺伝子を発現することが明らかになった。活性酸素種を除去し、そのような種から細
胞を保護するPDACの能力を、過酸化水素を活性酸素種発生源として用いるアッセイで決定
した。

アッセイの説明：標的細胞（星状細胞、ScienCell Research Laboratories）を、ポリL
-リジンを予めコーティングした96ウェル黒色ウェルプレートに6000個／cm²で播種した。
星状細胞を、成長培地中、37℃、5％二酸化炭素で一晩付着させる。翌日、培養培地を除
去し、細胞を蛍光発生プローブである細胞透過性色素DCFH-DA（ジクロロフルオレセイン
二酢酸塩）とともにインキュベートした。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水又はハンク
スの緩衝塩類溶液で洗浄することにより、余分な色素を除去した。次に、1000μMの過酸
化水素を30～60分間加えることにより、細胞を活性酸素種で傷害した。次に、過酸化水素
含有培地を除去し、無血清のグルコース不含成長培地と交換した。PDACを6000個／cm²で
加え、細胞をさらに24時間培養した。次に、細胞を標準的な蛍光プレートリーダーで480E
x及び530Emで読み取った。培地の活性酸素種含量は、細胞サイトゾル中のDCFH-DAのレベ
ルと正比例していた。活性酸素種含量は、所定のDCF標準曲線との比較により測定した。
全ての実験をN＝24で行なった。

アッセイのために、20×DCFH-DAストック溶液を、胎仔ウシ血清を含まない細胞培養培
地に1×になるまで希釈し、均一になるまで撹拌することにより、1×DCFH-DAを使用直前
に調製した。過酸化水素（H₂O₂）希釈物は、必要に応じてDMEM又はDPBS中で調製した。標
準曲線は、1mM DCF標準を細胞培養培地に希釈し、100μlのDCF標準を蛍光測定に好適な96
ウェルプレートに移し、100μlの細胞溶解緩衝液を加えることにより、0μM～10μMの濃
度範囲の1：10希釈系列として作成した。蛍光は、480Ex及び530Emで読み取った。

結果：PDACは、星状細胞共培養物中の活性酸素種の濃度を有意に低下させた。図9を参
照されたい。

（6.5 実施例5：胎盤幹細胞を用いる治療方法）
（6.5.1 心筋梗塞の治療）
50代半ばの男性個体が、20分間を超えて左腕に放散する胸痛、息切れ、悪心、動悸、発
汗を提示している。心電図の結果、及びクレアチンキナーゼの血中レベルの上下により、
心臓の前壁の心筋梗塞（貫壁性）の鑑別診断がなされる。ニトログリセリン及びストレプ
トキナーゼによる個体の安定化後、該個体に0.9％生理食塩水中1×10⁸～5×10⁸個のCD10⁺
、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盤幹細胞（PDAC）を局所麻酔下で心臓用注射器を用いて罹患
部位に直接投与する。該個体を救急体制で次の72時間モニタリングする。梗塞部位の血行
再建の程度を評価するために、該個体を心電図及び／又は色素による可視化技術によって
治療後の次の3カ月間にわたってさらにモニタリングする。心電図の結果がPDACの投与前
よりも目に見えて正常に近い場合、又は梗塞部位が、可視化したときに、目に見えて血行
再建されている場合、治療の有効性が立証される。

（6.5.2 心筋症の治療）
個体が、息切れ、脚及びくるぶしの腫脹、並びに不規則心拍を提示している。他の原因
を除外した後、確認的心電図により、心筋症の診断がなされる。音波検査図により、該個
体は鬱血性心筋症を有することが確認される。該個体に、0.9％生理食塩水中1×10⁸～5×
10⁸個のCD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盤幹細胞を局所麻酔下で心臓用注射器を用いて
心臓動脈に直接投与する。該個体を、より正常な血流を示す音波検査図の測定値の変化に
ついて、また、息切れの感覚の改善並びに脚及びくるぶしの腫脹の低減について、次の3
カ月間にわたってモニタリングする。これらの兆候のいずれかがモニタリング期間中に改
善を示す場合、該個体について治療の有効性が立証される。

（6.5.3 末梢血管疾患の治療）
個体が、ぶらぶらさせたときに赤くなる冷えた、ひりひりと痛む足、並びに脚の疼痛、
脱力、及び疲労を提示している。糖尿病を除外した後、末梢動脈疾患の診断がなされる。
該個体に450mLの0.9％生理食塩水中1×10⁹～5×10⁹個のCD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎
盤幹細胞を静脈内投与し、次の3カ月間、週2回モニタリングする。上記の症状のいずれか
がモニタリング期間中に改善する場合、治療の有効性が立証される。

（6.5.4 末梢血管疾患の治療）
個体が、ぶらぶらさせたときに赤くなる冷えた、ひりひりと痛む足、並びに脚の疼痛、
脱力、及び疲労を提示している。糖尿病を除外した後、末梢動脈疾患の診断がなされる。
該個体に5mLの0.9％生理食塩水中1×10⁸～5×10⁸個のCD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盤
幹細胞を筋肉内投与し、かつ／又は同等量を静脈内もしくは動脈内、足の指の間に局所的
に投与し、次の3カ月間、週2回モニタリングする。上記の症状のいずれかがモニタリング
期間中に改善する場合、治療の有効性が立証される。

（6.5.5 末梢血管疾患の併用治療）
個体が、ぶらぶらさせたときに赤くなる冷えた、ひりひりと痛む足、並びに脚の疼痛、
脱力、及び疲労を提示している。糖尿病を除外した後、末梢動脈疾患の診断がなされる。
該個体に450mLの0.9％生理食塩水中1×10^９～5×10⁹個のCD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺
胎盤幹細胞を静脈内投与し、次の3カ月間、週2回モニタリングする。該個体に1日2回服用
するシロスタゾール100mgも処方する。上記の症状のいずれかがモニタリング期間中に改
善する場合、治療の有効性が立証される。

（6.5.6 末梢血管疾患の併用療法）
個体が、ぶらぶらさせたときに赤くなる冷えた、ひりひりと痛む右足、並びに右脚の疼
痛、脱力、及び疲労を提示している。糖尿病を除外した後、末梢動脈疾患の診断がなされ
る。該個体は、血管形成術、及び大腿動脈にステントを埋め込む手術を受ける。その後、
該個体に450mLの0.9％生理食塩水中1×10⁹～5×10⁹個のCD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎
盤幹細胞を静脈内投与し、次の3カ月間、週2回モニタリングする。上記の症状のいずれか
がモニタリング期間中に改善する場合、治療の有効性が立証される。

（6.5.7 PDACを用いる脳卒中の治療）
52歳の男性が、体の左側の片麻痺、及び部分的失語症を提示している。虚血性脳卒中の
診断がなされる。磁気共鳴イメージングを用いて虚血の部位を特定した後、該個体に、罹
患側の頭蓋に穴を開けるための手術の準備をする。穴を開けた後、1～2mLの0/9％生理食
塩溶液中5×10⁷～1×10⁸個のCD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盤幹細胞を虚血領域に投与
する。該個体を、脳卒中のいずれかの症状、特に、片麻痺又は失語症の改善の兆候につい
て、次の7～14日間にわたってモニタリングする。上記の症状のいずれかがモニタリング
期間中に改善する場合、治療の有効性が立証される。

（6.5.8 PDACを用いる脳卒中の治療）
52歳の男性が、体の左側の片麻痺、及び部分的失語症を提示している。虚血性脳卒中の
診断がなされる。磁気共鳴イメージングを用いて虚血の部位を特定した後、該個体に、罹
患側の頭蓋に穴を開けるための手術の準備をする。穴を開けた後、450mLの0/9％生理食塩
溶液中1×10⁹～5×10⁹個のCD10⁺、CD34^-、CD105⁺、CD200⁺胎盤幹細胞を静脈内投与する。
該個体を、脳卒中のいずれかの症状、特に、片麻痺又は失語症の改善の兆候について、次
の7～14日間にわたってモニタリングする。上記の症状のいずれかがモニタリング期間中
に改善する場合、治療の有効性が立証される。

等価物：
本開示は、本明細書に記載の具体的な実施態様によって範囲が限定されるべきではない
。実際、記載されたものに加えて、本明細書で提供される対象の様々な変更が、前述の説
明及び添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許
請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。

様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書で引用されており、その開示は、その全
体が引用により本明細書中に組み込まれている。

Claims (20)

1. 単離された胎盤由来接着細胞であって、ここで、該細胞は、組織培養プラスチックに接
   着し、かつ該細胞は、フローサイトメトリーで決定した場合、CD10⁺、CD34^-、CD105⁺、及
   びCD200⁺であり、かつ該細胞は、（1）内皮細胞の増殖を促進するか；（2）内皮細胞の集
   団内での新芽もしくは管状構造の形成を促進するか；又は（3）内皮細胞の遊走を促進す
   る、前記単離された胎盤由来接着細胞。
2. 前記細胞が、フローサイトメトリーで決定した場合、CD45^-及びCD90⁺である、請求項1
   記載の単離された細胞。
3. 前記細胞が、抗体結合によって決定した場合、VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリ
   スタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレ
   クチン-1のうちの1つ又は複数を発現する、請求項1記載の単離された細胞。
4. 請求項1記載の細胞を含む単離された細胞集団。
5. 前記集団内の細胞の少なくとも50％が請求項1記載の細胞である、請求項4記載の単離さ
   れた細胞集団。
6. 前記集団内の細胞の少なくとも90％が請求項1記載の細胞である、請求項4記載の単離さ
   れた細胞集団。
7. 前記集団内の細胞の少なくとも50％が請求項1記載の細胞である、請求項7記載の単離さ
   れた細胞集団。
8. 前記集団内の細胞の少なくとも90％が請求項1記載の細胞である、請求項1記載の単離さ
   れた細胞集団。
9. 請求項1記載の単離された胎盤由来接着細胞を含む組成物。
10. 第二のタイプの細胞を含む、請求項4記載の単離された集団。
11. 前記第二のタイプの細胞が、胚性幹細胞、血液細胞、末梢血から単離された幹細胞、胎
    盤血から単離された幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄由来間葉系
    幹細胞、骨髄由来間葉系間質細胞、造血幹細胞、体性幹細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋
    肉細胞、内皮細胞、血管芽細胞、内皮前駆細胞、周皮細胞、心筋細胞、筋細胞、心筋芽細
    胞、筋芽細胞、胚性幹細胞、又は胚性幹細胞に似るように操作された細胞である、請求項
    10記載の単離された細胞集団。
12. 前記第二のタイプの細胞が、前記集団内の細胞の少なくとも10％を含む、請求項11記載
    の単離された細胞集団。
13. 前記第二のタイプの細胞が、前記集団内の細胞の少なくとも25％を含む、請求項11記載
    の単離された細胞集団。
14. 前記第二のタイプの細胞が、造血幹細胞又は前駆細胞である、請求項11記載の単離され
    た細胞集団。
15. 前記造血幹細胞又は前駆細胞がCD34⁺細胞である、請求項14記載の単離された集団。
16. 請求項1記載の細胞を含む、持続性又は分解性の脱細胞化又は合成マトリックス又はス
    キャフォールド。
17. 前記マトリックス又はスキャフォールドが、羊膜；脱水細胞外マトリックス；胎盤コラ
    ーゲン、又は胎盤細胞外膜である、請求項16記載のマトリックス又はスキャフォールド。
18. 循環器系の疾患又は障害を有する個体を治療する方法であって、請求項1記載の細胞の
    集団を、該個体に、該疾患又は障害の1以上の症状の検出可能な改善に十分な量及び時間
    で投与することを含む、前記方法。
19. 循環器系の疾患又は障害を有する個体を治療する方法であって、請求項1記載の細胞の
    集団を、該個体に、心機能の1以上の兆候の検出可能な改善に十分な量及び時間で投与す
    ることを含み、ここで、該心機能の兆候は、胎盤由来接着細胞投与前の該個人と比較した
    ときの胸部心拍出量（CO）、心係数（CI）、肺動脈楔入圧（PAWP）、心係数（CI）、％短
    縮率（％FS）、駆出率（EF）、左室駆出率（LVEF）；左室拡張末期径（LVEDD）、左室収
    縮末期径（LVESD）、収縮力（dP／dt）、心房機能もしくは心室機能の低下、ポンプ効率
    の増大、ポンプ効率の損失率の低下、血行動態機能の損失の減少、又は心筋症と関連する
    合併症の減少である、前記方法。
20. 肢又はその周辺の血流の途絶を有する個体を治療する方法であって、請求項1記載の胎
    盤由来接着細胞の治療有効量を投与することを含む、前記方法。

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