CN1195055C - 从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明所要解决的技术问题是提供了从健康产妇的胎盘中提取干细胞建立造血干细胞库的方法。本发明变废为宝，采用机械、酶消化及单克隆抗体-磁珠法从胎盘中提取、浓缩和纯化活性好、浓度高、数量多的血液干细胞。经细胞培养，细胞标记检测和动物实验表明，胎盘中提取的干细胞能加强造血干细胞移植的短期和长期长活。从而可用于冻存建立胎盘和脐带血造血干细胞库，在胎盘供者本人(自体)或其他人(异体)患各种造血干细胞移植适应症时应用，也可结合着各种细胞生长因子在临床上开展细胞修复。本发明为临床提供了造血干细胞和干细胞的新来源，促进了细胞移植和组织修复的发展。
Description
技术领域
本发明涉及属于国际专利分类C12N、A61K领域的建立造血干细胞库的方法，尤其是从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法。
背景技术
人体的受精卵细胞能在子宫内发育成胚胎细胞，这种细胞具有分化成各种组织细胞的能力，像神经细胞、肌肉细胞、肝脏细胞、血液细胞等，所以这种细胞也称为多能干细胞。而定向某一组织分化的细胞亦称为定向干细胞，像造血干细胞、神经干细胞等。这些细胞能继续分化为特定的细胞或组织、血液造血干细胞可以继续分化为红细胞、白细胞和血小板。
肿瘤细胞是种具有无限增殖能力的细胞，临床上常用的治疗方法是大剂量的药物和辐射，而像白血病这样的血液病肿瘤，只有采用药物、辐射和造血干细胞移植才能挽救病人的生命。外来的造血干细胞能在化疗和放疗后的病人骨髓内重建造血。这种造血有几个特点。(1)和外来造血干细胞的数量密切相关，数量越多，越易植活。(2)和供体和受体的白细胞抗原(HLA)有关，HLA位点相符程度越高，越易植活，而且排斥反应(GVHD)也越轻。(3)造血干细胞根据其成熟性的差异可分为二种：一种为可分化成为短期造血干细胞，也称为12天脾集落形成细胞(CFU-S)，另一种为长期造血干细胞，病人造血干细胞移植能否长期存活，和这类细胞密切相关。(4)和基质细胞相关，基质细胞形成越早，越多，就越能促进造血干细胞粘附于基质细胞，加强细胞之间的相互接触及相关因子的分泌，造血干细胞在基质细胞表面呈现“鹅卵石”样的形态、扩增和分化。
目前较为成熟的造血干细胞移植，根据细胞的来源，可分为三类：骨髓造血干细胞移植(BMT)，动员周围血干细胞移植(MPST)和脐带血干细胞移植(UCBT)(Broxymeyer.PNAS 89；86:3828；32)。前二者干细胞来源丰富，一般有核细胞数可达5-10×108/Kg，CD34+细胞(一种造血干/祖细胞的表面标记)可达1-5×106/Kg，可是由于供者和受体之间需HLA严格相符，才能保证移植的成功，否则供者造血干细胞不易在病人体内植活，即使成活也会发生较严重的移植物排宿主病(GVHD)。在一个家庭的子女中，仅有1/4HLA相符的机率，而在非血缘关系的无关供者中，这种机率只有百分之一，这样就极大的限制了BMT或MPST在临床上广泛的应用。近十余年来脐带血造血干细胞移植在临床上成功的应用(Gluckman e et al.New Engl J Med1989，321：1174-1178)促进了脐带血造血干细胞库(UCBB)的成立和UCBT的发展。脐带血来自于胎盘，通常在妇女分娩后废弃，现在发现脐带血中含丰富的造血干细胞，其CD34+细胞的浓度和骨髓类似，约占总细胞数的0.1-0.5％，而CD34-更早期的造血干细胞还较骨髓浓度为高。临床上发现UCBT较BMT更大的优越性为供体和受体间即使HLA有1-2个位点的差异，也不会发生严重的GVHD反应，同时像各种病毒的污染率在脐带血中也较低。因而人们想到把脐血收集、体外浓缩和液氮深低温保存，建立脐带血库(UCBB)。在病人需要时，可随时融化保存的脐血细胞，提供临床造血干细胞移植。至今，全世界已开展近千例UCBT，确切表明UCBT在儿童或体重较轻的病人是成功的，植活成功率可达80-90％，但对体重大的成年人，效果不太理想。表现在植活时间长，有的可达40天才开始有细胞生长，即使植活，供者的淋巴系统免疫功能也较低下。原因是每个脐血的含量有限，平均约为100毫升左右，CD34+细胞约在0.5-5.0×106。显然，用于体重大的病人是不够的，还有人认为脐血造血干细胞的归巢(Homing)和分化为基质细胞的能力较低，这也是植入时间较长的原因之一。同时，由于脐血淋巴系统未经受出生后胸腺的影响，这也造成在成年人中，即使植活，也还有一段免疫功能减弱的时间。鉴于以上原因，科学家们开展相同或类似HLA位点的2个或多个脐血联合应用的混合移植，这可以增加一倍以上脐血造血干细胞数的含量，可临床实践表明，并不能缩短病人无白细胞的时间，而且即使植活，也往往是一个脐血细胞存活。另一个脐血细胞受到排斥。另一个解决途径就是在体外造血干细胞扩增培养。实验证明采用各种细胞刺激因子和适当的培养条件可扩增脐血细胞达数万倍，但问题是这种扩增需要花费时间，费用也高，更重要的是由于扩增的同时，造血干细胞也发生分化，临床应用的结果表明脐血细胞扩增前后对移植无多大差异。
胎盘是胎儿和母亲血液交换的场所，含有非常丰富的方法血液微循环。人在母亲子宫内发育的阶段，胎盘是首先形成的器官之一。这表明在胚胎干细胞的发育、分化过程中，在胎盘中滞留有大量的早期干细胞，而且很有可能这些干细胞在胎盘内还继续保存着分化造血干细胞的能力。尽管在胎儿周围血(脐带血)内含有丰富的造血干细胞，可是这种干细胞和胎盘内滞留的造血干细胞可能在细胞膜表明受体上存在有差异，即胎盘内的造血干细胞具有和组织更强的亲和力(归巢功能)，这样能提取胎盘组织内的干细胞和脐带血细胞一起用于移植，无疑的含有1)胎盘干细胞能像骨髓血细胞一样提供造造血干细胞生长的微环境，加速造血干细胞的生长、发育(Hows JM.Lancet1992；340：73-6)。2)胎盘血干细胞是较为早期的干细胞，能在体内分化成各种细胞(像脂肪细胞、纤维细胞、软骨细胞等)，而正是这类细胞组成了骨髓的微环境，促进血液细胞的生成和分化。3)胎盘血内的造血干细胞有更强的归巢(Homing)功能，这表明若提取这样的细胞输注给病人，这些细胞能更快、更有效的在病人骨髓中生长、发育。4)胎盘血内含有丰富的各种阶段早期造血干细胞，若能和脐带血细胞一起应用于病人，无疑大大增加了造血干细胞的含量，使这种脐—胎盘血干细胞可应用于成年病人。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法。从胎盘组织中提取造血干细胞而建立造血干细胞库是本发明的要旨，实现这一目的的技术方案是采用机械的方式分离、冰冻长期胎盘组织细胞，以及浓缩、纯化造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法，所述方法分为收集步骤、检测步骤、提取步骤、浓缩纯化步骤的过程，其中，所述浓缩纯化步骤的技术方案是：
将提取的胎盘组织细胞和羟乙基淀粉按1∶6比例混合；
在离心机中以500g离心10分钟，去掉红细胞；
和淋巴细胞分离液按1∶4的比例混合；
在离心机中以1000g离心30分钟，去掉残存红细胞以及成熟的粒细胞；
收集和洗涤各个不同发育阶段的造血干细胞群；
建立干细胞库。
根据上述的方法且通过以下的几个方面去改善和提高了UCBT的效果：(1)胎盘组织干细胞；(2)胎盘血和脐带血造血干细胞。显然，上述的方法完全是不同于以前的骨髓造血干细胞移植(BMT)，周围血造血干细胞移植以及脐血造血干细胞移植的方法。其差别在于首先收集的是脐带血液细胞，然后去除各种可能的污染和感染，最后分离在胎盘中的组织细胞(其中含有支持造血细胞发育的各种基质细胞以及能分化成造血细胞的干细胞)。当病人临床上需移植时，将以上二种和病人HLA相符的干/祖细胞从静脉输注病人。该发明的另一个方面就是何时注射这二类细胞给大剂量化疗和放疗后的病人，胎盘血干细胞可以同时和脐带血干细胞通过静脉输入。也可在其前或其后输入。
该发明极大的加强了造血干细胞移植治疗肿瘤疾病的效果。大剂量的化疗和放疗在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了骨髓的微环境，而移植入的造血只有在重建微环境后才能开始分化和生长。正因为这个原因，该发明的最重要方面就是分离、纯化、深低温保存、组织和造血干细胞。在HLA筛选相符时，输送给病人用于重建骨髓微循环，加速造血干细胞的恢复以及保证移植物的存活。
本发明的贡献即是采用各种方式和简易的设备，从胎盘中提取出更多的造血干细胞和类似的中胚层干细胞(mesenchymal stem cellsCMSCs)，在适当的培养条件和细胞选择下，这些细胞可分化成各种不同种类的细胞，像肝脏、皮肤、软骨、骨髓的基质细胞以及各种不同阶段的造血细胞。骨髓基质细胞可以直接支持和指导血液细胞，像造血干细胞等的增植和分化(Herman P.LeuKemia 1998，12：735-45)。因为病人在BMT以前，需进行大剂量的化疗(药物)和放疗(同位素)去消灭病人体内的肿瘤细胞以及破坏了骨髓内部的微环境。这样怎样加快和植活外来细胞在病人体内存活就是个非常关键的问题。本发明的一个重要贡献就是通过从胎盘提取、纯化这些MSC细胞及不同阶段发育的造血干细胞，利用这些细胞的功能加强病人骨髓破坏后的微环境，增多移植时的造血干细胞的含量，使这种UCBT不但可以适用于一切人群，而且可以大大缩短病人移植后的零细胞期，从而提高了病人的存活率。
本发明制备的胎盘组织干细胞一般以静脉输入为主，但也可以局部直接进入到骨髓组织内，也可通过任何其它的途径，像动脉注入等方法输注给病人。
本发明主要应用的药学成份或含量有生理盐水、低分子右旋糖酐、脐带血浆、DMEM(Dulbecco’s Modified Essential Medium)培养液、注射用水等。所有以上成份均是无菌、无热原制备以及适用临床移植的病人。
关于从胎盘中提取组织干细胞的方法可以采取多种途径，特别是像(1)采用机械粉碎胎盘的方法；(2)应用胶原酶或蛋白酶消化组织的方法；(3)以上二种方法的混合；(4)采用其它粉碎胎盘的方法。
本发明关于应用胎盘组织干细胞的途径，可以是静脉注射、动脉输注，也可以是局部注射，当然也不除外采用其它方式的应用。
本发明关于胎盘组织干细胞的应用时间，可以是(1)和脐带血干细胞一起注入；(2)在脐血干细胞注入前一天应用；(3)多次在不同时间内分别输入胎盘组织干细胞。
使用在造血干细胞移植中胎盘组织干细胞的含量是十分重要的。一般讲，每个胎盘组织可分离出1-4×109单个核细胞，这样，即使对100公斤体重的病人，也至少可以有1×107/Kg的单个核细胞。这个数字是完全适合于骨髓移植的病人。在BMT的病人，大致只有1×104/Kg和基质细胞有关的细胞，通常不超过7×105/Kg，因而胎盘组织干细胞和脐血干细胞的共同应用必然会增强造血干细胞移植的效果。
本发明不论在造血干细胞移植中的质和量上都是一个巨大的改进，在脐血移植中它不但加速了脐血移植再生时间，也使造血干细胞的数量大大增多，不但可使脐血广泛的用于各种患病人群，而且可大大缩短脐血移植中病人细胞数为零的时间，减少污染的发生率，可挽救更多病人的生命。
胎盘和脐带逸出后，可在收集脐血的同时，收集胎盘，从胎盘中分离更多的各时期的造血干/祖细胞，加以深低温保存，当病人应用时，可同时和脐血一起输注给病人。
本发明主要的应用范围是：各种恶性血液病，像白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤；遗传性疾病，像先天性溶血性贫血；血液再生不良性疾病，像再生障碍性贫血；药物或化学性元素，像苯、汞等；放射性疾病，像放射线意外等。治疗方法是采用化疗及放疗等各种手段摧毁病人自身患病的骨髓细胞以及免疫系统，然后输入健康的造血干细胞，由于同时摧毁了病人自身的骨髓内环境，所以以后输入的造血干细胞只有在重建骨髓内环境以后才能开始造血细胞的重建。这样就延缓了血细胞重建的时间，而如果事先就输入HLA相符的相当于骨髓内环境的细胞，这就无疑加速了造血干细胞重建的时间，加快病人的恢复。
本发明也适用于患有先天或后天免疫缺陷性疾病(AIDS)，这些病人是患有淋巴免疫系统的疾病，输入正常免疫系统细胞，得到免疫系统功能重建，无疑也可治愈这些病人。
本发明也适用于基因转染的治疗。众所周知，外体基因转染，受基因转染的细胞愈多愈好，而胎盘干细胞具有很强的增生和分化能力，是基因转染的理想细胞。
本发明也适用于多能干细胞向各种组织细胞分化的治疗，现已证实胚胎干细胞、骨髓细胞、脂肪细胞都含有多能干细胞，这些细胞在一定的环境下可分化成各种组织细胞，像脂肪、骨髓、神经、肝脏等。本发明发现在胎盘中也含有这样的多能干细胞。
在本发明的所有操作步骤中，都是药典允许的常规操作方法，这包括采用无菌操作、无菌生理盐水洗涤、灭菌，无菌细胞浓缩和纯化等标准内容，所应用的药品，像二甲亚砜，无菌生理盐水，低分子右旋糖酐，无菌蒸馏水等均是符合我国卫生机构的要求，操作完毕后做常规病毒，细胞检查及细菌、霉菌培养，只有合乎要求的胎盘血细胞才能应用于临床。
采用本方法提取的胎盘血细胞在2-4×109单个核细胞数，其中约有0.3-0.7％为CD34阳性细胞，体外集落细胞培养(CFU-GM)，可见集落巨大的细胞群，一般在5-10×106之间。这种集落群和骨髓、动员外周血以及脐带血干细胞有着明显的差异，表现在集落大，细胞呈重叠样生长，集落群出现的时间也不同，显示出胎盘血干细胞存在有不同阶段。而在长期细胞培养中，胎盘血细胞的扩增能力约比脐血细胞多1-3倍。一般脐血细胞的采集量约为0.8-1.5×109，而CD34阳性细胞约在0.1-0.5％之间，这样若把胎盘血细胞和脐血细胞同时用于病人，则总细胞数可增加3-5倍，完全可适用于一切病人的需要。
通过下面的详述，将对本发明的操作方法，特点和优越性作进一步的阐明。当然，应值得指出的是尽管本文描述了以下几种案例，人们也可根据本发明的基础，提出各种变化和个性的形式也是可能的。
附图说明
图1：为胎盘组织细胞和脐带血液细胞共同培养，可见胎盘血造血干细胞在胎盘组织贴壁细胞上呈“鹅卵石”样生长。
图2：胎盘组织细胞经过长达一月的体外培养，形成贴壁的纤维样细胞，该细胞开始为不规则，细胞巨大，单核或双核，当铺满整个培养皿时，细胞逐渐变成梭形。在体外培养多次传代及深低温保存、融化，细胞活性仍然很好。
图3：胎盘组织细胞的集落培养(CFU-GM)。胎盘组织细胞形成集落的时间较脐带血细胞为晚，但一旦开始形成，细胞生长很快，细胞间相互重叠分层，而且可有3次以上的再集落。
图4：对胎盘组织细胞进行双显色—荧光激活细胞(FACS)分析，发现CD34+细胞在胎盘组织中较脐血细胞为高，平均值约高50％。
图中：图1是指：为从胎盘分离的组织细胞和脐带血液细胞共同培养，可见胎盘血造血干细胞在胎盘组织贴壁细胞上呈“鹅卵石”样生长。
图2是指：胎盘组织形成贴壁状的纤维样细胞，其细胞在开始为不规则、细胞巨大，当贴壁后，细胞逐渐呈梭深低温保存、融化后，细胞活性仍然很好。
图3是指：胎盘组织细胞的集落培养(CFU-GM)：培养时间为第9天，形成集落的时间较脐血细胞为晚(7天)，但一旦开始形成，细胞生长很快，呈现相互重叠，可有3次以上的再集落形成。
图4是指：对同一份脐带血分离后的组织细胞进行流式细胞仪激光分析，CD34阳性细胞(在图上呈红点符号)在胎盘组织中较脐血高一倍左右。
具体实施方式
本发明涉及的技术方案是一种从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法，所述方法是采用机械的方式分离、冰冻长期胎盘组织细胞，以及浓缩、纯化造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法，所述方法分为收集步骤、检测步骤、提取步骤、浓缩纯化步骤的实现过程，其中，所述的浓缩纯化步骤是：
将提取的胎盘组织细胞和羟乙基淀粉按1∶6比例混合；
在离心机中以500g离心10分钟，去掉红细胞；
和淋巴细胞分离液按1∶4的比例混合；
在离心机中以1000g离心30分钟，去掉残存红细胞以及成熟的粒细胞；
收集和洗涤各个不同发育阶段的造血干细胞群；
建立干细胞库。
进一步地说，所述的收集步骤是指：收集脐带血及胎盘并附着条形码标签且存放于4℃冰箱，不超过24小时。
而所述的检测步骤是指：对所冷冻的脐带血及胎盘提取样本并进行如下检测：
肝炎病毒及相应抗体、
性病检测、
爱滋病(AIDs)毒抗体检测、
遗传性溶血性疾病、
有核白细胞及单个核细胞计数、
造血干/祖细胞定量检测(CD34)、
组织配型(HLA)、
造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)的检测。
进一步地说，所述的提取步骤的详细过程是指：一对胎盘组织在无菌的环境和条件下：
用无菌生理盐水清洗胎盘，清洗掉所有的血凝块及积血，采用消毒剂杀灭任何可能的细菌污染；
再次应用磷酸缓冲液(PH7.4)，低分子右旋糖酐及细胞培养液(DMEM)按顺序清洗；
将经选择后的脐带血浆、DMEM培养液和胎盘细胞共同混和过夜；剪除脐带和表层的胎盘膜，应用撕裂，研磨和DMEM冲洗的方法将胎盘细胞收集到50毫升的离心管内，在离心机内以1000rpm，5分钟，4℃离心，弃去上清液；
采用16G、18G和20G的针头过滤，将胎盘细胞制成单个细胞；将制备后的胎盘细胞做以下检测：
细胞和霉菌培养，
有核白细胞及单个核细胞计数，
造血干/祖细胞定量检测(CD34)，
造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)，
造血干/祖细胞的活性(台盼兰染色)，
将检测后的胎盘组织的胎盘细胞制取的单个核细胞以1×108/ml和DMSO混合，且以10％的DMSO和低分子右旋糖酐浓度在液氮低度降温到零下80℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温保存。
为实现本发明目的，本文中所述的浓缩纯化造血干细胞的步骤是必不可少的，而其中的浓缩造血干细胞的步骤还可以是：
准确测量从胎盘中分离的组织细胞体积；
对组织细胞用不含血清的DMEM液洗二次；
将洗涤后的组织细胞按1∶6的比例加入羟乙基淀粉(HES)，在万能摇床上混合5分钟；
取摇混后的组织以200g的速度在温度12℃、时间5分钟的条件下，入离心机内离心，之后，用血浆挤压器压迫富含组织细胞的液体到另一离心管弃去富含红细胞的沉淀物，得到上清液；
将得到的上清液再次以温度12℃，时间15分钟的条件以800g的速度离心，之后弃去上清液；
收集沉于管底的细胞，加入DMEM液把沉淀细胞制成混悬液，以1∶4的比例加到淋巴细胞分离液的上层，然后以800g，温度12℃，时间30分钟离心；
吸取在淋巴细胞分离液和上层液体间的细胞，加入DMEM培养液，洗涤2次，最后做细胞计数和活性检测；
在上述基础上建立干细胞库。
同样的，其中的纯化造血干细胞的步骤还可以是：
应用流式细胞仪分选造血干细胞，并且：
分选具有荧光标记的抗CD34单克隆抗体；
将经过浓缩后的组织细胞和带有荧光抗CD34抗原的单克隆抗体相混合，在室温或4℃中孵育30分钟，然后用不含血清的DMEM培养液洗涤3次；
将洗涤后的组织细胞与具有荧光标记的抗CD34单克隆抗体相结合且放入流式细胞仪经激光照射；
根据荧光发生的强弱，收集90％以上纯度的造血干细胞；
在上述基础上建立干细胞库。
在所述的浓缩、纯化造血干细胞的步骤中还可以采用抗体—磁珠方式纯化造血干细胞的方法或用生物素纯化造血干细胞的方法，它们分别是：
抗体—磁珠法纯化造血干细胞的方法其实施步骤为：分选能与抗CD34单克隆抗体相结合的载体，抗体磁珠；分选浓缩的胎盘组织干细胞群；将胎盘组织干细胞群与抗体磁珠相接触，使细胞群内的造血干/祖细胞与抗体相结合，并粘附于磁珠上；用吸铁装置吸附磁珠并洗涤去未与磁珠相结合的细胞；提取造血干/祖细胞，其纯度至少80％以上。而生物素纯化造血干细胞的方法其步骤为：分选能与生物素相结合的单克隆抗体，含抗生素抗体的生物柱；分选浓缩的胎盘组织干细胞群；将胎盘组织干细胞群与含抗生素抗体的生物柱相结合；洗涤未结合抗体的细胞；改变洗涤液的PH值，提取造血干/祖细胞，其纯度至少80％以上。
如此，再以下实施例析之：
案例一
采用机械的方法分离胎盘组织干细胞
胎盘和脐带血均来自于当地妇产医院或科室。首先，征得孕妇或其直接亲属同意捐献胎盘后，查阅孕妇的所有检验报告，证实无任何的病毒、梅毒等和血液有关的病毒感染，然后详细询问孕妇的生育、疾病、遗传、感染等病史，在一切均为正常后，开始按常规方法收集脐带血(专利技术：“使用软质兜垂直采集脐血的装置”，专利号：ZL99244936.7)。收集完后的脐带血及胎盘均附有条形码标签，存放于4℃冰箱。存放时间一般不超过24小时。
按照条形码的编号，把有关资料输入电脑中储存。在无菌环境中，按条形码的编号从相对脐血中，提取样本，供以下检测：
——肝炎病毒及相应抗体：像乙型肝炎，丙型肝炎等
——性病检测；像梅毒等
——爱滋病(AIDs)毒抗体检测
——遗传性溶血性疾病
——有核白细胞及单个核细胞计数
——造血干/祖细胞定量检测(CD34)
——组织配型(HLA)
——造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)
脐带血细胞按国外常规的技术方法(Robinstein P.Blood1993，80：1679-90)进行单个核细胞浓缩处理，并加入冰冻保存液(DMSO)，在液氮深低温中长期保存。
相应的胎盘组织按下列程序无菌环境和条件下进行处理：用无菌生理盐水清洗胎盘，清洗掉所有的血凝块及积血，采用消毒剂杀灭任何可能的细菌污染，然后再次应用磷酸缓冲液(PH7.4)，低分子右旋糖酐及细胞培养液(Dulbecco’s Modified Eagles Mediam)亦简称DMEM按顺序清洗，最后采用经选择后的脐带血浆(AB血型)，DMEM培养液和胎盘共同混和过夜。剪除脐带和表层的胎盘膜，应用撕裂，研磨和DMEM培养液冲洗的方法，将胎盘细胞收集到50毫升的离心管内，在离心机内以1000rpm，5分钟，4℃离心，弃去上清液再次用培养液清洗3次。最后采用16G、18G和20G的针头过滤，将胎盘细胞制成单个细胞，制备后的胎盘细胞做以下检测：
——细胞和霉菌培养
——有核白细胞及单个核细胞计数
——造血干/祖细胞定量检测(CD34)
——造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)
——造血干/祖细胞的活性(台盼兰染色)
从胎盘制取的单个核细胞以1×108/ml和DMSO混合。以10％的DMSO和低分子右旋糖酐浓度，在液氮低度降温到零下80℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温保存。
案例二
采用酶消化的方法提取胎盘血干细胞
胎盘从医院妇产科采用无菌的方法收集，并和相应的脐带血一起送入脐血干细胞中心，在收集胎盘以前，应征得孕妇本人及相应直系亲属的同意，并调查孕妇及家庭中有关的遗传和传染病史，以及医院所有相关的病毒检查为阴性后才能收集。
收集后的脐带血及相应的胎盘需在一定的温度下(4-20℃)，在24小时以内送到我中心。在中心需再次做相应的病毒检测，只有病毒阴性的脐血及胎盘才能进入我电脑登记程序，在记录相应的条形码编号以后，输往我中心的无菌车间。
在无菌车间内取脐带血中的样本做HLA检测，并把记录输入到计算机系统，脐血按常规进行分离、加冰冻保护剂、程控降温，在液氮深低温中保存。
相应的胎盘，先用无菌生理盐水洗涤，去除一切含有母血的细胞，然后在特殊的容器中加以无菌消毒，去除一切可能细胞污染的来源，此后采用细胞培养液，像DMEM(GIBCO，Grand Island.NY.USA)加以洗涤，再次去除可能的母血污染。然后剪碎胎盘，去掉胞膜和脐带，应用胶原酶(0.2g/ml)消化15分钟、20分钟及30分钟。我们发现以消化15分钟所取得的细胞为好。其中细胞的活性好、回收率高，最后收集消化后的胎盘细胞，在特殊的离心管内离心，转速为1000rpm，10分钟，用低分子右旋糖酐洗涤三次，把所收集的细胞制成单个细胞混悬液、白细胞及单个核细胞计数，测定细胞活性，计算CD34、CD4、CD8细胞含量及体外培养的白细胞集落(CFU-GM)，在加冰冻保护剂(10％DMSO)以前，取一份标本做细胞培养。
案例三
采用物理和生物学的方法浓缩和纯化造血干细胞
应用上述二种方法人胎盘中分离的造血干细胞，实际上也是一群细胞，它含有红细胞、血小板，具有分化成不同组织细胞的成人干细胞，不同时期的造血干细胞以及成熟的粒细胞和淋巴系统细胞。本发明采用以下方法浓缩和纯化造血干细胞。
1.采用沉淀、离心的方法浓缩造血干细胞
准确测量按上述二种方法从胎盘中分离的组织细胞体积，应用不含血清的DMEM液洗二次，按1∶6的比例加入羟乙基淀粉(HES)，在万能摇床上混合5分钟，然后在离心机内以200g，温度12℃，时间5分钟，用血浆挤压器压迫富含组织细胞的液体到另一离心管，弃去富含红细胞的沉淀物，上清液再次离心800g，温度12℃，时间15分钟，弃去上清液。收集沉于管底的细胞，加入DMEM液把沉淀细胞制成混悬液，以1∶4的比例加到淋巴细胞分离液的上层，然后以800g，温度12℃，时间30分钟离心。吸取在淋巴细胞分离液和上层液体间的细胞，加入DMEM培养液，洗涤2次，最后做细胞计数和活性检测。
2.采用生物学的方法纯化造血干细胞。
2.1：应用流式细胞仪分选造血干细胞
在造血干细胞及早期分化后的祖细胞膜表面都含有一种蛋白质称为CD34抗原。抗CD34单克隆抗体可以识别这类人造血细胞(Krause，Blood 1996 87：1-13)。因此可进行荧光激活细胞分类和分选细胞。首先，把上述经过浓缩后的组织细胞和带有荧光抗CD34抗原的单克隆抗体相混合，在室温或4℃中孵育30分钟，然后用不含血清的DMEM培养液洗涤3次。这样胎盘组织中的造血干/祖细胞就能和有荧光标记的抗CD34单克隆抗体相结合。当把这组细胞放入流式细胞仪后，每个细胞都通过激光照射，根据荧光发生的强弱，仪器可自动收集这些带有荧光的细胞，这种方法可以提供90％以上纯度的造血干细胞。
2.2：采用抗体—磁珠法纯化造血干细胞
本发明的另一个方案是采用抗CD34单克隆抗体和一种载体相结合，这种支持载体往往是磁珠。然后使上述浓缩的胎盘组织干细胞群和这抗体相接触，这样细胞群内的造血干/祖细胞会和抗体相结合，并粘附于支持载体。此时，若是磁珠，可用吸铁装置吸附磁珠。同时也保留了造血干/祖细胞，洗涤去未和磁珠相结合的细胞。若采用和生物素相结合的单克隆抗体，则可应用含抗生素抗体的生物柱，当未结合抗体的细胞通过该生物珠时，均被洗涤出去。最后，改变洗涤液的PH值，洗涤下CD34+细胞。采用以上二种方法，获得的造血干/祖细胞的纯度可达80％以上。
3.浓缩纯化后的造血干细胞生物特性。
本发明分别比较来自于胎盘的组织细胞、骨髓细胞以及脐带血细胞的生物特性。正如表1为细胞集落培养来自于胎盘的组织细胞集落形成较晚，但集落生长快，集落细胞大，能形成多次集落。当把这三类细胞长期培养时，来自胎盘的组织细胞能很快的形成贴壁细胞，而且这些贴壁细胞很易多次传代。这三类细胞在和含有造血干细胞刺激因子，像SCF(10μg/ml)，IL-3(100μg/ml)以及FLT-3(50ng/ml)，长期培养时，胎盘组织细胞维持时间长，造血干/祖细胞增生量多。本发明分别采用胎盘组织细胞、脐带血细胞，等量混合的胎盘组织细胞和脐带血细胞注射于同位素并致死量的免疫功能缺陷的小鼠，发现这三类细胞都能在小鼠骨髓内生长，胎盘组织细胞注入小鼠后无任何不良反应。
本发明发现骨髓细胞、脐血细胞以及胎盘组织细胞在和含造血刺激因子的共同培养中(CFU-GM)，所形成的造血细胞集落有明显的差异，如表1所示：_
表1：骨髓细胞、脐血细胞和胎盘组织细胞CFU-GM的比较
| 集落开始形成时间 | 集落大小 | 集落细胞形态 | 多次集落培养 | 贴壁细胞 | 贴壁细胞传代 | |
| 骨髓细胞 | 5天 | 集落内含细胞约50-200个 | 细胞小，圆，生长较分散 | 仅能生成一次集落 | 少量纤维样细胞 | 困难 |
| 胎盘组织细胞 | 9天 | 集落内含细胞大于1,000个，并形成重叠细胞 | 细胞大，圆，周边不规则，生长集中，相互重叠 | 可生成四次集落 | 大量或片、纤维样细胞，长满培养皿 | 10-20代 |
| 脐血细胞 | 7天 | 集落内含细胞约200-1,000 | 细胞大，圆，生长较为集中 | 可生成二次集落 | 散形较多纤维细胞 | 2-4代 |
案例四
建立异体胎盘——脐带血库
自Robinstein(Rubinstein P，et al；Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，10 119-10122，1995)建立脐带血库以来，在世界范围内已开展2,000多例脐血造血干细胞移植，挽救了许多患者的生命，可是由于(1)脐带血内的有核细胞及干/祖细胞的有限，并不太适宜于体重较大病人移植；(2)可能由于脐带血内细胞含基质细胞或能转化成基质细胞较骨髓内为少，从而移植后的脐血在患者内生长缓慢。胎盘组织细胞正是可以弥补脐带血的特点，从而可建立一个大型的胎盘——脐带血库，供任何年龄和体重的病人开展造血干细胞移植，其步骤有下述组成(周胜利，中国实验血液学2001，2：153-160)。
1.建立电脑联网和条形码系统：便于资料储存，保证所有数据的准确，而且也可以迅速根据病人的HLA配型结果查询到和病人HLA相符的胎盘——脐带血干细胞，用以临床移植。
2.和医院共同合作收集胎盘和脐带血：在征求得孕妇同意的情况下，收集各项检测及孕妇家庭中无相关遗传病史的脐带血和胎盘。
3.检测：所有从医院收集的脐带血均需再做一次和病毒细胞、霉菌和遗传病有关的各项检测，只有各项检测指标阴性的脐血才能提供给临床移植。
4.组织配型(HLA)：HLA配型的准确性是关系到移植是否成功的主要因素之一，常用于脐血移植的HLA抗原有I类：A，B和II类DR。这二类HLA配型需采用分子生物学(DNA)检测，而对II类DR更需应用高分辨检测。
5.胎盘及脐血干/祖细胞保存、提取、纯化：浓缩的脐带血干/祖细胞及胎盘组织干/祖细胞和冰冻保存剂(DMSO)混合，在液氮内深低温降温到-80℃，然后转移到液氮内(-196℃)长期保存。
6.冻融和造血干细胞移植：当临床确认需应用造血干细胞库内的某例脐血和胎盘组织干细胞/祖细胞时，在病人床前从液氮内取出脐血及胎盘组织干/祖细胞，于37℃电动水浴箱内融化，在血细胞几乎即将冻融完毕时，加入低分子右旋糖酐等量混合，按顺序给病人输注。
案例五
建立自体胎盘——脐带血库
自体胎盘——脐带血库是孕妇在新生儿出生后，贮存胎盘组织细胞及脐带血干/祖细胞，其目的是(1)因为胎盘和脐带血内含有丰富的造血干/祖细胞，出生以后贮存就避免了孩子长大以后，若患有肿瘤，尤其是血液疾病时，缺乏供体时的危险，这特别适合于家庭中有肿瘤或血液病的新生儿；(2)目前，大量的科学实验证明，在组织中含有早期能分化成各种组织细胞，像肝脏、皮肤、神经等的干细胞。生命越早期，这种干细胞的含量就越高。若能保存胎盘中的组织细胞，无疑是给新生儿建立了一个生命银行。在新生儿的成长发育过程中，由于各种原因，像外伤、脏器衰竭等，而需要脏器细胞移植，均可通过胎盘组织细胞在体外培养，分化成所需要的细胞，供临床应用。由于这些细胞是来自于新生儿的自体细胞，不存在排斥和不能生长等问题，在某种意义上讲，可以为新生儿提供第二次生命的机会。具体程序除以下几点外，其余的和异体胎盘——脐带血库一样。
1.在收集胎盘和脐血时，孕妇或其直系亲属要和我方签订协议书，同意由我方有价保存新生儿的胎盘和脐血干细胞，而我方也需保证未得孕妇家属同意，不得把该份脐血细胞用于任何人。
2.脐血干/祖细胞及胎盘组织细胞要分多袋储存，以便于在不同时间分次给新生儿应用。
3.当需要除造血干细胞移植以外的用途时，例如需要用于肝脏损伤、皮肤移植等，按临床要求冻融胎盘组织细胞，在细胞培养液(如1640、DMEM)内培养，待胎盘组织细胞长满培养瓶后，换用相应的含刺激因子的培养液，如肝脏细胞刺激因子、神经细胞刺激因子，促使胎盘组织细胞向相应的细胞分化，待细胞分化完全后，给病人应用。
4.当新生儿在生长、发育过程中，任何原因引起需造血干细胞移植来挽救其生命时，可随时应用其储存的脐血及组织干细胞来替代其患病的细胞。
基因治疗为当前治疗各种疾病的有效手段。胎盘组织细胞及脐血干/祖细胞是基因转染的很好载体。带有正常或治病基因的质粒可以有效的嵌合入胎盘组织细胞的DNA链中，并随着细胞的分裂而不断的复制，转录成能表达蛋白质的RNA，从而起到治疗疾病的效果。
Claims (3)
1.一种从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法，所述方法分为收集步骤、检测步骤、提取步骤、浓缩纯化步骤的过程，其分别为：
(1)收集步骤：收集脐带血及胎盘并附着条形码标签且存放于4℃冰箱，不超过24小时；
(2)检测步骤：对所冷冻的脐带血及胎盘提取样本并进行如下检测，
肝炎病毒及相应抗体、
性病检测、
爱滋病(AIDs)毒抗体检测、
遗传性溶血性疾病、
有核白细胞及单个核细胞计数、
造血干/祖细胞定量检测(CD34)、
组织配型(HLA)、
造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)的检测；
(3)提取步骤：对胎盘组织在无菌的环境和条件下，用无菌生理盐水清洗胎盘，清洗掉所有的血凝块及积血，采用消毒剂杀灭任何可能的细菌污染；
再次应用磷酸缓冲液(PH7.4)，低分子右旋糖酐及细胞培养液(DMEM)按顺序清洗；
将经选择后的脐带血浆、DMEM培养液和胎盘细胞共同混和过夜；剪除脐带和表层的胎盘膜，应用撕裂，研磨和DMEM冲洗的方法将胎盘细胞收集到50毫升的离心管内，在离心机内以1000rpm，5分钟，4℃离心，弃去上清液；
采用16G、18G和20G的针头过滤，将胎盘细胞制成单个细胞；
将制备后的胎盘细胞做以下检测：
细胞和霉菌培养，
有核白细胞及单个核细胞计数，
造血干/祖细胞定量检测(CD34)，
造血干/祖细胞定性检测(CFU-GM)，
造血干/祖细胞的活性(台盼兰染色)；
将检测后的胎盘组织的胎盘细胞制取的单个核细胞以1×108/ml和DMSO混合，且以10％的DMSO和低分子右旋糖酐浓度，在液氮低度降温到零下80℃，然后转移到液氮(-186℃)液相中深低温保存；
(4)浓缩纯化步骤：将提取的胎盘组织细胞和羟乙基淀粉按1∶6比例混合；
在离心机中以500g离心10分钟，去掉红细胞；
和淋巴细胞分离液按1∶4的比例混合；
在离心机中以1000g离心30分钟，去掉残存红细胞以及成熟的粒细胞；
收集和洗涤各个不同发育阶段的造血干细胞群；
建立干细胞库。
2.根据权利要求1所述的从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法，其特征是，所述的浓缩纯化造血干细胞的步骤还可以是：
准确测量从胎盘中分离的组织细胞体积；
对组织细胞用不含血清的DMEM液洗二次；
将洗涤后的组织细胞按1∶6的比例加入羟乙基淀粉(HES)，在万能摇床上混合5分钟；
取摇混后的组织以200g的速度在温度12℃、时间5分钟的条件下，入离心机内离心，之后，用血浆挤压器压迫富含组织细胞的液体到另一离心管弃去富含红细胞的沉淀物，得到上清液；
将得到的上清液再次以温度12℃，时间15分钟的条件以800g的速度离心，之后弃去上清液；
收集沉于管底的细胞，加入DMEM液把沉淀细胞制成混悬液，以1∶4的比例加到淋巴细胞分离液的上层，然后以800g，温度12℃，时间30分钟离心；
吸取在淋巴细胞分离液和上层液体间的细胞，加入DMEM培养液，洗涤2次，最后做细胞计数和活性检测；
在上述基础上建立干细胞库。
3.根据权利要求1所述的从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的方法，其特征是，所述的浓缩纯化造血干细胞的步骤还可以是：
应用流式细胞仪分选造血干细胞，并且：
分选具有荧光标记的抗CD34单克隆抗体；
将经过浓缩后的组织细胞和带有荧光抗CD34抗原的单克隆抗体相混合，在室温或4℃中孵育30分钟，然后用不含血清的DMEM培养液洗涤3次；
将洗涤后的组织细胞与具有荧光标记的抗CD34单克隆抗体相结合且放入流式细胞仪经激光照射；
根据荧光发生的强弱，收集90％以上纯度的造血干细胞；
在上述基础上建立干细胞库。
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Effective date of registration: 20170418 Address after: 200335 room 5F-704, Hami Road, Shanghai, Changning District, 1955 Patentee after: Shanghai thick East Biotechnology Co., Ltd. Address before: 224200 Jiangsu City, Dongtai Province Coastal Economic Zone, Metro North Road, No. 6 Patentee before: Sail Parke (Jiangsu) stem cell biology engineering Co. Ltd. |
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