JP2022153244A - 熱安定性が向上した変異型グルコースデヒドロゲナーゼ及びその利用 - Google Patents
熱安定性が向上した変異型グルコースデヒドロゲナーゼ及びその利用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】熱安定性の向上したグルコース脱水素酵素を提供すること【解決手段】本発明は、触媒サブユニット、電子伝達サブユニット、及びヒッチハイカーサブユニットを含む変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素であって、前記触媒サブユニットのアミノ酸配列と前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列の各々がその中に導入されたシステイン残基を含み、前記触媒サブユニット及び前記電子伝達サブユニットが前記システイン残基間のジスルフィド結合を介して相互に結合することで熱安定性が改善された前記ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素を提供する。【選択図】図１
Description
本発明はバイオテクノロジー、及び変異型グルコース脱水素酵素を利用するグルコースの電気化学測定に関する。
タンパク質の熱安定性を改善するために多数の方法が開発されてきた。改善のための公知の人工的アプローチの例にはグリコシル化、化学的架橋、及び重合体への結合が挙げられる。これらの方法は任意の標的タンパク質に対して広範に適用可能であり、それはこれらの方法がこれらの標的タンパク質を包括的に保護することでそれらのタンパク質を安定化させるからである。しかしながら、酵素の場合ではこれらの方法は酵素活性に対して結果の再現性の低下という無視できない影響を有し、精製及び修飾のための追加工程が必要になる等、実用上の問題を引き起こす。
米国特許第９０７４２３９号明細書（特許文献１）及び米国特許第８９４５３５９号明細書（特許文献２）は部位特異的変異導入によりＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素（ＦＡＤ－ＧＤＨ）の熱安定性を改善するための技法について開示している。ただし、これらの文書はサブユニット間の結合の安定化を触媒サブユニット内での変異導入との関連で示唆していない。米国特許第８９４５３５９号明細書（特許文献２）はその変異体の５０℃における特異的活性が３０℃における特異的活性と比べてわずかに５０％であること、及びその変異体が６０℃という高温条件では不活性化されることを記載している。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ誌、１７７４～８頁（２０１５年）（非特許文献１）には触媒サブユニットの２つの特定の部位に導入されたシステイン残基を含む変異型酵素が活性及び特異性を維持しながらも、改善された耐熱性を示したことが報告されている。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ誌、１７７４～８頁（２０１５年）（非特許文献１）には触媒サブユニットの２つの特定の部位に導入されたシステイン残基を含む変異型酵素が活性及び特異性を維持しながらも、改善された耐熱性を示したことが報告されている。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ誌、１７７４～８頁（２０１５年）
グルコース脱水素酵素はグルコースセンサーに使用されることが多い酵素である。
糖尿病患者による血糖自己測定において日常的に使用されるグルコースセンサーにはどんな状況又は環境でも正確な測定値を示すことが求められている。したがって、性能の重要な因子である前記酵素は熱不活化を回避するような高い安定性を有することが必要とされる。
したがって、本発明は、熱安定性の向上したグルコース脱水素酵素を提供することを課題とする。
糖尿病患者による血糖自己測定において日常的に使用されるグルコースセンサーにはどんな状況又は環境でも正確な測定値を示すことが求められている。したがって、性能の重要な因子である前記酵素は熱不活化を回避するような高い安定性を有することが必要とされる。
したがって、本発明は、熱安定性の向上したグルコース脱水素酵素を提供することを課題とする。
電子伝達サブユニットを含むヘテロ三量体であるＦＡＤ－ＧＤＨの結晶構造についての情報に基づき、本発明者らはサブユニット間接触面上の特定の部位にシステイン残基を導入してその接触面上にジスルフィド結合を形成することによりそのヘテロ三量体の高次構
造の安定化及び耐熱性の顕著な改善に成功した。さらに、この変異型酵素の電子伝達活性は、この酵素の分子内電子伝達経路内にあると考えられている位置にシステイン残基が導入されていることにより顕著に増大している可能性があるため、本発明者らはこれらのシステイン残基が前記サブユニット間の架橋だけでなく、電子伝達の促進にも重要な役割を果たしていることを見出した。
造の安定化及び耐熱性の顕著な改善に成功した。さらに、この変異型酵素の電子伝達活性は、この酵素の分子内電子伝達経路内にあると考えられている位置にシステイン残基が導入されていることにより顕著に増大している可能性があるため、本発明者らはこれらのシステイン残基が前記サブユニット間の架橋だけでなく、電子伝達の促進にも重要な役割を果たしていることを見出した。
本発明の１つの形態では酵素活性を低下させることなく熱安定性が安定した変異型グルコース脱水素酵素が提供される。
本発明の１つの態様によると、
触媒サブユニット、
電子伝達サブユニット、及び
ヒッチハイカーサブユニット
を含む変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素であって、前記触媒サブユニットのアミノ酸配列と前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列の各々がその中に導入されたシステイン残基を含み、前記触媒サブユニット及び前記電子伝達サブユニットが前記システイン残基間のジスルフィド結合を介して相互に結合している前記変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素が提供される。
触媒サブユニット、
電子伝達サブユニット、及び
ヒッチハイカーサブユニット
を含む変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素であって、前記触媒サブユニットのアミノ酸配列と前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列の各々がその中に導入されたシステイン残基を含み、前記触媒サブユニット及び前記電子伝達サブユニットが前記システイン残基間のジスルフィド結合を介して相互に結合している前記変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素が提供される。
本発明の別の態様によると、前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列がその中に導入された別のシステイン残基を含み、且つ、前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列がその中に導入されたシステイン残基を含み、前記システイン残基間のジスルフィド結合を介して前記ヒッチハイカーサブユニット及び前記電子伝達サブユニットが相互に結合している前記変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素が提供される。
本発明の別の態様によると、前記触媒サブユニットのアミノ酸配列及び前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列がそれらの中に導入されたシステイン残基を含み、前記触媒サブユニット及び前記電子伝達サブユニットが前記システイン残基間のジスルフィド結合を介して相互に結合しており、同時に前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列がその中に導入された別のシステイン残基を含み、前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列がその中に導入されたシステイン残基を含み、前記システイン残基間のジスルフィド結合を介して前記ヒッチハイカーサブユニット及び前記電子伝達サブユニットが相互に結合している前記変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素が提供される。
本発明の別の態様によると、前記変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素を含む酵素電極が提供される。
本発明の別の態様によると、前記酵素電極を含むバイオセンサーが提供される。
本発明によれば、熱安定性の向上したＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素が提供される。
本発明の１つの実施形態による前記グルコース脱水素酵素は、
触媒サブユニット（αサブユニット）、
電子伝達サブユニット（βサブユニット）、及び
ヒッチハイカーサブユニット（γサブユニット）
を含むＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素であって、少なくとも前記触媒サブユニット及び前記電子伝達サブユニットの各々がその中に導入されたシステイン残基を含み、これらのシステイン残基がそれらの間にジスルフィド結合を形成している前記ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素である。
これより後に本明細書において前記グルコース脱水素酵素を変異型グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）又は変異型ＦＡＤ－ＧＤＨと呼ぶ。
本明細書では、酵素はシステイン残基の導入により変異体となり、触媒活性はフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）に依存する。 なお、本明細書において、システイン残基の導入とは、配列中の既存の残基をシステイン残基に置換して導入すること（例えば、以下に示す残基に導入すること）、または配列中にシステイン残基を導入すること（例えば、以下に示す残基の直前または直後に導入すること）をいう。 したがって、本発明の変
異型GDHは、以下に示す残基の位置にシステイン残基を含んでいてもよいし、以下に示す
残基の直前または直後の隣接する残基にシステイン残基を含んでいてもよい。
触媒サブユニット（αサブユニット）、
電子伝達サブユニット（βサブユニット）、及び
ヒッチハイカーサブユニット（γサブユニット）
を含むＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素であって、少なくとも前記触媒サブユニット及び前記電子伝達サブユニットの各々がその中に導入されたシステイン残基を含み、これらのシステイン残基がそれらの間にジスルフィド結合を形成している前記ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素である。
これより後に本明細書において前記グルコース脱水素酵素を変異型グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）又は変異型ＦＡＤ－ＧＤＨと呼ぶ。
本明細書では、酵素はシステイン残基の導入により変異体となり、触媒活性はフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）に依存する。 なお、本明細書において、システイン残基の導入とは、配列中の既存の残基をシステイン残基に置換して導入すること（例えば、以下に示す残基に導入すること）、または配列中にシステイン残基を導入すること（例えば、以下に示す残基の直前または直後に導入すること）をいう。 したがって、本発明の変
異型GDHは、以下に示す残基の位置にシステイン残基を含んでいてもよいし、以下に示す
残基の直前または直後の隣接する残基にシステイン残基を含んでいてもよい。
したがって、前記変異型グルコース脱水素酵素は３サブユニットから構成される三量体である。これらのサブユニットはリンカー及び／又はそのようなものを介して相互に結合していてよい。
前記３サブユニットから構成される三量体であるＦＡＤ－ＧＤＨの公知の例にはバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）、バークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）、ラルストニア・ピケッティイ（Ralstonia pickettii）、ラルストニア・ソ
ラナセアラム（Ralstonia solanacearum）、バークホルデリア・ファイトフィルマンス（Burkholderia phytofirmans）、ラルストニア エスピー（Ralstonia sp.）、モラクセラ
科細菌（Moraxellaceae bacterium）、シュードモナス・クナックムッシイ（Pseudomonas
knackmussii）、エルシニア・ヌルミイ（Yersinia nurmii）、エダホビルガ・クレメア
（Edaphovirga cremea）、シルビモナス・テラエ（Silvimonas terrae）ザイモバクター・パルマエ（Zymobacter palmae）、コベティア エスピー（Cobetia sp.）、ハロモナス エスピー（Halomonas sp.）またはエウィンゲラ・アメリカナ（Ewingella americana）のＦＡＤ－ＧＤＨが挙げられる。本発明の１つの実施形態による前記変異型ＦＡＤ－ＧＤＨは前記ＦＡＤ－ＧＤＨに変異を導入することにより得られる。
前記３サブユニットから構成される三量体であるＦＡＤ－ＧＤＨの公知の例にはバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）、バークホルデリア・タイランデンシス（Burkholderia thailandensis）、ラルストニア・ピケッティイ（Ralstonia pickettii）、ラルストニア・ソ
ラナセアラム（Ralstonia solanacearum）、バークホルデリア・ファイトフィルマンス（Burkholderia phytofirmans）、ラルストニア エスピー（Ralstonia sp.）、モラクセラ
科細菌（Moraxellaceae bacterium）、シュードモナス・クナックムッシイ（Pseudomonas
knackmussii）、エルシニア・ヌルミイ（Yersinia nurmii）、エダホビルガ・クレメア
（Edaphovirga cremea）、シルビモナス・テラエ（Silvimonas terrae）ザイモバクター・パルマエ（Zymobacter palmae）、コベティア エスピー（Cobetia sp.）、ハロモナス エスピー（Halomonas sp.）またはエウィンゲラ・アメリカナ（Ewingella americana）のＦＡＤ－ＧＤＨが挙げられる。本発明の１つの実施形態による前記変異型ＦＡＤ－ＧＤＨは前記ＦＡＤ－ＧＤＨに変異を導入することにより得られる。
本発明の１つの実施形態によると前記変異型ＦＡＤ－ＧＤＨでは前記触媒サブユニットのアミノ酸配列と前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列の各々がその中に導入されたシステイン残基を含み、前記触媒サブユニット及び前記電子伝達サブユニットが前記システイン残基間のジスルフィド結合を介して相互に結合している。システイン残基の導入にはアミノ酸置換による導入及び挿入による導入が挙げられる。
バークホルデリア・セパシアのＦＡＤ－ＧＤＨを例として用いて各サブユニットを以下に説明する。ただし、前記変異型ＧＤＨは以下の実施形態に限定されない。
前記バークホルデリア・セパシアは限定されない。例えば、バークホルデリア・セパシアＫＳ１株が使用されてよい。バークホルデリア・セパシアＫＳ１株はＦＥＲＭ ＢＰ－７３０６の受入番号で２０００年９月２５日に産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現在の独立行政法人製品評価技術基盤機構生物資源センター特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ ＩＰＯＤ））に寄託されている。
前記バークホルデリア・セパシアは限定されない。例えば、バークホルデリア・セパシアＫＳ１株が使用されてよい。バークホルデリア・セパシアＫＳ１株はＦＥＲＭ ＢＰ－７３０６の受入番号で２０００年９月２５日に産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現在の独立行政法人製品評価技術基盤機構生物資源センター特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ ＩＰＯＤ））に寄託されている。
＜触媒サブユニット＞
αサブユニットとも呼ばれる前記触媒サブユニットはＦＡＤ（フラビンアデニンジヌク
レオチド）に依存してグルコース脱水素の触媒活性を有するポリペプチドである。前記触媒サブユニットは、Ｆｅ－Ｓクラスターを含有していることが好ましい。
配列番号３はバークホルデリア・セパシアＫＳ１株のＦＡＤ－ＧＤＨ触媒サブユニットのアミノ酸配列である。この配列を参照しながら以下の説明を行う。
αサブユニットとも呼ばれる前記触媒サブユニットはＦＡＤ（フラビンアデニンジヌク
レオチド）に依存してグルコース脱水素の触媒活性を有するポリペプチドである。前記触媒サブユニットは、Ｆｅ－Ｓクラスターを含有していることが好ましい。
配列番号３はバークホルデリア・セパシアＫＳ１株のＦＡＤ－ＧＤＨ触媒サブユニットのアミノ酸配列である。この配列を参照しながら以下の説明を行う。
前記触媒サブユニットのアミノ酸配列中のシステイン導入部位は、前記ＦＡＤ－ＧＤＨの空間的構造中で前記電子伝達サブユニットとの接触面を形成する領域中にあることが好ましい。例えば、配列番号３のアミノ酸位置２００～２４０の領域中の位置にシステインが導入される。したがって、配列番号３のアミノ酸位置２００～２４０の領域中のアミノ酸残基がシステインで置換される。前記触媒サブユニット中のこの領域はＧＤＨの空間的構造中の前記電子伝達サブユニットとの接触面上に位置する領域である。
この領域中の前記アミノ酸の具体的な例には配列番号３のアミノ酸配列中の位置２０５のプロリン残基、位置２０８のグリシン残基、位置２１５のアスパラギン残基、位置２２４のイソロイシン残基、及び位置２３５のグルタミン酸残基が挙げられる。システイン残基の導入にはシステインによる置換及びシステインの挿入が含まれる。例えば、上記のアミノ酸残基のうちのどの残基もシステイン残基で置換されてよい。あるいは、システイン残基が挿入される場合、そのシステイン残基はこれらの残基の直前又は直後の位置に挿入されてよい。
この領域中の前記アミノ酸の具体的な例には配列番号３のアミノ酸配列中の位置２０５のプロリン残基、位置２０８のグリシン残基、位置２１５のアスパラギン残基、位置２２４のイソロイシン残基、及び位置２３５のグルタミン酸残基が挙げられる。システイン残基の導入にはシステインによる置換及びシステインの挿入が含まれる。例えば、上記のアミノ酸残基のうちのどの残基もシステイン残基で置換されてよい。あるいは、システイン残基が挿入される場合、そのシステイン残基はこれらの残基の直前又は直後の位置に挿入されてよい。
上記のアミノ酸置換位置は配列番号３中の位置である。しかしながら、前記変異が導入される前記触媒サブユニットのアミノ酸配列は配列番号３の長さとは異なる長さを有してよい。例えば、前記変異が導入される前記触媒サブユニットのアミノ酸配列が配列番号３と比較してＮ末端側で３アミノ酸だけ短い場合、配列番号３の位置２０５のプロリン残基は前記アミノ酸配列の位置２０２のプロリンに対応する。このような事例も「位置２０５のプロリン残基」に対応するプロリン残基の置換とされ、本発明の形態に含まれる。同じことが他の残基にも当てはまる。
上記アミノ酸残基のうち、位置２０５のプロリン残基がシステイン残基に置換されることが好ましい。このプロリン残基は、アミノ酸モチーフ「ARNSRPYD」（配列番号２３）中に存在する。一態様においては、システイン残基がこのモチーフ内のプロリン残基を置換するように導入される。そして、変異型グルコース脱水素酵素の触媒サブユニットは、配列番号３、７、１３、１７または２１のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％同一性を有するアミノ酸配列において、「ARNSRCYD」（配列番号２４）を有する。
ＦＡＤ－ＧＤＨは他の微生物でも知られている。それらの触媒サブユニットのアミノ酸配列、例えば配列番号３に対して少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列においてシステインを上記の領域内に、又は上記の特定のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の位置に導入してよい。
より具体的には、前記変異が導入される前記触媒サブユニットのアミノ酸配列を配列番号３のアミノ酸配列と整列させ、配列番号３のアミノ酸位置２００～２４０の領域中のアミノ酸残基、例えば位置２０５のプロリン残基、位置２０８のグリシン残基、位置２１５のアスパラギン残基、位置２２４のイソロイシン残基、又は位置２３５のグルタミン酸残基の位置に対応する位置のアミノ酸をシステインで置換してよい。
より具体的には、前記変異が導入される前記触媒サブユニットのアミノ酸配列を配列番号３のアミノ酸配列と整列させ、配列番号３のアミノ酸位置２００～２４０の領域中のアミノ酸残基、例えば位置２０５のプロリン残基、位置２０８のグリシン残基、位置２１５のアスパラギン残基、位置２２４のイソロイシン残基、又は位置２３５のグルタミン酸残基の位置に対応する位置のアミノ酸をシステインで置換してよい。
配列番号３または下記で示す触媒サブユニットの他の配列とある程度の配列同一性を有するポリペプチドであれば、触媒サブユニットの機能を維持する限りにおいて、変異型グルコース脱水素酵素の触媒サブユニットを調製するために使用しうる。触媒サブユニットの機能とは、例えば、電子伝達サブユニット及びヒッチハイカーサブユニットと複合体を形成し、グルコース脱水素酵素の活性を発揮する機能を意味する。
配列の同一性とは、2つのアミノ酸配列の同一性の割合のことで、目視や計算によって
求めることができる。ここでいうアミノ酸配列の同一性とは、2つのアミノ酸を、必要に
応じてギャップを挿入しながら、一致するアミノ酸の数が最大となるようにアライメントし、アライメントされた部分の全アミノ酸数に対する一致するアミノ酸の数の割合を算出することで定義できる（以下、同様）。
配列の同一性とは、2つのアミノ酸配列の同一性の割合のことで、目視や計算によって
求めることができる。ここでいうアミノ酸配列の同一性とは、2つのアミノ酸を、必要に
応じてギャップを挿入しながら、一致するアミノ酸の数が最大となるようにアライメントし、アライメントされた部分の全アミノ酸数に対する一致するアミノ酸の数の割合を算出することで定義できる（以下、同様）。
配列番号３に対して６０％以上の同一性を有するＧＤＨ αサブユニットのアミノ酸配列の例にはバークホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＷＰ＿００６４８２９７２）、バークホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株（ＷＰ＿００９９００２９８）、ラルストニア・ピケッティイ１２Ｄ株（ＷＰ＿０１２７６１５０８）、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株（ＷＰ＿００３２６５１４３）、バークホルデリア・ファイトフィルマンスＰｓＪＮ株（ＷＰ＿０１２４２８６１０）、ラルストニア エスピー（ＷＰ＿０４８９３１８２８）、モラクセラ科細菌（ＷＰ＿１１４８
９９５３７）、シュードモナス・クナックムッシイ（ＷＰ＿０４３２４８５２１）、エルシニア・ヌルミイ（ＷＰ＿０４９５９６８５０）、エダホビルガ・クレメア（ＷＰ＿１１４１９３３３９）、シルビモナス・テラエ (WP_184102398)、ザイモバクター・パルマエ
（ＷＰ＿０２７７０５３５６）、コベティア エスピー（ＷＰ＿１５８７７３８５１）、
ハロモナス エスピー（ＷＰ＿１０７３３４７１６）、及びエウィンゲラ・アメリカナ（
ＷＰ＿０３４７８８２８１）の各々のαサブユニットの配列が挙げられる。
９９５３７）、シュードモナス・クナックムッシイ（ＷＰ＿０４３２４８５２１）、エルシニア・ヌルミイ（ＷＰ＿０４９５９６８５０）、エダホビルガ・クレメア（ＷＰ＿１１４１９３３３９）、シルビモナス・テラエ (WP_184102398)、ザイモバクター・パルマエ
（ＷＰ＿０２７７０５３５６）、コベティア エスピー（ＷＰ＿１５８７７３８５１）、
ハロモナス エスピー（ＷＰ＿１０７３３４７１６）、及びエウィンゲラ・アメリカナ（
ＷＰ＿０３４７８８２８１）の各々のαサブユニットの配列が挙げられる。
上記のように、これらの触媒サブユニットにおいてシステイン残基が導入される前記領域及び残基は、各触媒サブユニットの配列をバークホルデリア・セパシアの触媒サブユニットの配列（配列番号３）と整列させることによって決定可能である。例えば、エウィンゲラ・アメリカナＧＤＨの触媒サブユニット（配列番号７）の場合では図１０に示されているように配列番号３中の領域２００～２４０は配列番号７中の領域１９７～２３７に位置し、位置２０５のプロリン残基、位置２０８のグリシン残基、位置２１５のアスパラギン残基、位置２２４のイソロイシン残基、及び位置２３５のグルタミン酸残基はそれぞれ配列番号７中の位置２０２のプロリン残基、位置２０５のグリシン残基、位置２１２のアスパラギン残基、位置２２１のイソロイシン残基、及び位置２３２のグルタミン酸残基に対応する。
前記触媒サブユニットの別の実施形態には配列番号７に対して少なくとも６０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む触媒サブユニットであって、配列番号７中の位置２０２のプロリン残基、位置２０５のグリシン残基、位置２１２のアスパラギン残基、位置２２１のイソロイシン残基、又は位置２３２のグルタミン酸残基に対応する位置にシステインが導入されている前記触媒サブユニットが挙げられる。
例えば、シルビモナス・テラエGDHの触媒サブユニット（配列番号１３）においては、
図１８に示されるように、配列番号３の位置２０５のプロリン残基は配列番号１３の位置２０４のプロリン残基に該当する。
触媒サブユニットの別の態様は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１３の位置２０４のプロリン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
図１８に示されるように、配列番号３の位置２０５のプロリン残基は配列番号１３の位置２０４のプロリン残基に該当する。
触媒サブユニットの別の態様は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１３の位置２０４のプロリン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
例えば、ザイモバクター・パルマエGDHの触媒サブユニット（配列番号１７）において
は、図１８に示されるように、配列番号３の位置２０５のプロリン残基は配列番号１７の位置２００のプロリン残基に該当する。
触媒サブユニットの別の態様は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１７の位置２００のプロリン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
は、図１８に示されるように、配列番号３の位置２０５のプロリン残基は配列番号１７の位置２００のプロリン残基に該当する。
触媒サブユニットの別の態様は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１７の位置２００のプロリン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
例えば、コベティア エスピーGDHの触媒サブユニット（配列番号２１）においては、図１８に示されるように、配列番号３の位置２０５のプロリン残基は配列番号２１の位置２０４のプロリン残基に該当する。
触媒サブユニットの別の態様は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２１の位置２０４のプロリン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
触媒サブユニットの別の態様は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２１の位置２０４のプロリン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
前記触媒サブユニット（αサブユニット）のアミノ酸配列はシステインを導入する前記変異だけでなくその他の変異も含んでよい。バークホルデリア・セパシアに由来するＦＡＤ依存性ＧＤＨの触媒サブユニット中に変異を含む変異体の公知の例には位置４７２及び位置４７５のアミノ酸残基が置換されている変異体（国際公開第２００５／１０３２４８号）、位置３２６、位置３６５、及び位置４７２のアミノ酸残基が置換されている変異体（ＱＹＹ変異体、特開２０１２－０９０５６３号公報）、位置３６５と位置３２６、位置４７２、位置４７５、位置５２９などの位置が置換されている変異体（国際公開第２００６／１３７２８３号）が挙げられる。本発明の１つの実施形態による前記変異型ＧＤＨの触媒サブユニットはこれらの変異を有してよい。
＜電子伝達サブユニット＞
前記電子伝達サブユニットはβサブユニットとも呼ばれ、少なくとも１つのヘム結合ドメインを含む。このサブユニットはグルコースを基質として用いる反応により生成した電子を電極へ伝達する機能（電子授受機能）を有する。
前記電子伝達サブユニットはその中に導入されたシステイン残基を含み、このシステイン残基は前記触媒サブユニットに導入された前記システイン残基とジスルフィド結合を形成する。
前記電子伝達サブユニットはβサブユニットとも呼ばれ、少なくとも１つのヘム結合ドメインを含む。このサブユニットはグルコースを基質として用いる反応により生成した電子を電極へ伝達する機能（電子授受機能）を有する。
前記電子伝達サブユニットはその中に導入されたシステイン残基を含み、このシステイン残基は前記触媒サブユニットに導入された前記システイン残基とジスルフィド結合を形成する。
前記電子伝達サブユニットはグルコース脱水素により生成した電子を電極へ伝達する機能を有する限り限定されない。公知の電子伝達サブユニットを含む様々な生物に由来する電子伝達サブユニットが使用されてよい。前記電子伝達サブユニットは、前記触媒サブユニットが由来する微生物と同じ微生物に由来してよい。前記電子伝達サブユニットの例にはバークホルデリア・セパシアのＧＤＨの電子伝達サブユニットが挙げられる。バークホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨ電子伝達サブユニットの例には配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。配列番号４はバークホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨ βサブユニットのアミノ酸配列である。この配列を参照しながら以下の説明を行う。
前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列中のシステイン導入部位は、前記触媒サブユニットとの接触面を形成する領域中にあることが好ましい。例えば、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸位置３３０～４００の領域中の位置にシステインが導入される。したがって、配列番号４のアミノ酸位置３３０～４００の領域中のアミノ酸残基がシステインで置換される。前記電子伝達サブユニット中のこの領域はＧＤＨの空間的構造中の前記触媒サブユニットとの接触面上に位置する領域である。
この領域中の前記アミノ酸のより具体的な例には配列番号４のアミノ酸配列中の位置３３６のスレオニン残基、位置３８５のグリシン残基、位置３８３のアスパラギン酸残基、及び位置３９１のチロシン残基が挙げられる。これらのうちのどの残基もシステイン残基で置換されてよい。システイン残基が挿入される場合、そのシステイン残基はこれらの残基の直前又は直後の位置に挿入されてよい。
この領域中の前記アミノ酸のより具体的な例には配列番号４のアミノ酸配列中の位置３３６のスレオニン残基、位置３８５のグリシン残基、位置３８３のアスパラギン酸残基、及び位置３９１のチロシン残基が挙げられる。これらのうちのどの残基もシステイン残基で置換されてよい。システイン残基が挿入される場合、そのシステイン残基はこれらの残基の直前又は直後の位置に挿入されてよい。
上記アミノ酸残基のうち、位置３８３のアスパラギン酸残基がシステイン残基に置換されることが好ましい。このアスパラギン酸残基は、アミノ酸モチーフ「MP(A/G)F」（配列
番号２５）の３アミノ酸前に存在する。一態様においては、システイン残基がこのモチーフの３アミノ酸前のアミノ酸残基を置換するように導入される。そして、変異型グルコース脱水素酵素の電子伝達サブユニットは、配列番号４、８、１４、１８または２２のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％同一性を有するアミノ酸配列において、「CXXMP(A/G)F」（配列番号２６）を有する。
番号２５）の３アミノ酸前に存在する。一態様においては、システイン残基がこのモチーフの３アミノ酸前のアミノ酸残基を置換するように導入される。そして、変異型グルコース脱水素酵素の電子伝達サブユニットは、配列番号４、８、１４、１８または２２のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％同一性を有するアミノ酸配列において、「CXXMP(A/G)F」（配列番号２６）を有する。
前記触媒サブユニット中の前記領域（配列番号３のアミノ酸位置２００～２４０の領域）内の前記システイン導入部位と前記電子伝達サブユニット中の前記領域（配列番号４のアミノ酸位置３３０～４００の領域）内の前記システイン導入部位の好ましい組合せの例には前記触媒サブユニットの位置２０５のプロリンと前記電子伝達サブユニットの位置３８３のアスパラギン酸の組合せ、及び前記触媒サブユニットの位置２１５のアスパラギンと電子伝達サブユニットの位置３３６のスレオニンの組合せが挙げられる。残基のこれらの組合せは、ＦＡＤ－ＧＤＨの空間的構造において互いに約５Åの距離があり、且つ、より効率的にジスルフィド結合を形成できる残基の組合せである。
前記変異型グルコース脱水素酵素は、導入された別のシステイン残基が前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列に含まれており、そのシステイン残基が前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列中に導入されたシステイン残基とジスルフィド結合を形成して前記ヒッチハイカーサブユニットと前記電子伝達サブユニットが相互に結合している変異型グルコース脱水素酵素であってもよい。
前記の別のシステイン残基は、前記ヒッチハイカーサブユニットとの接触面上にある前記電子伝達サブユニットの領域内に導入されることが好ましい。このような領域の例には配列番号４のアミノ酸配列中のアミノ酸位置３４１～３５０の領域が挙げられる。したがって、配列番号４のアミノ酸位置３４１～３５０の領域中のアミノ酸残基がシステインで置換されてよい。前記電子伝達サブユニット中のこの領域はＧＤＨの空間的構造中の前記ヒッチハイカーサブユニットとの接触面上に位置する領域である。
この領域中の前記アミノ酸のより具体的な例には配列番号４の前記領域のアミノ酸配列中の位置３４５のスレオニン残基、位置３４６のプロリン残基、及び位置３４９のチロシン残基が挙げられる。システイン残基の導入にはシステインによる置換及びシステインの挿入が含まれる。例えば、上記のアミノ酸残基のうちのいずれもシステイン残基によって置換されてよい。あるいは、システイン残基が挿入される場合、そのシステイン残基はこれらの残基の直前又は直後の位置に挿入されてよい。
この領域中の前記アミノ酸のより具体的な例には配列番号４の前記領域のアミノ酸配列中の位置３４５のスレオニン残基、位置３４６のプロリン残基、及び位置３４９のチロシン残基が挙げられる。システイン残基の導入にはシステインによる置換及びシステインの挿入が含まれる。例えば、上記のアミノ酸残基のうちのいずれもシステイン残基によって置換されてよい。あるいは、システイン残基が挿入される場合、そのシステイン残基はこれらの残基の直前又は直後の位置に挿入されてよい。
上記アミノ酸残基のうち、位置３４９のチロシン残基がシステイン残基に置換されることが好ましい。このチロシン残基は、アミノ酸モチーフ「YPS(L/M)」（配列番号２７）の１アミノ酸前に存在する。一態様においては、システイン残基がこのモチーフの１アミノ酸前のアミノ酸残基を置換するように導入される。そして、変異型グルコース脱水素酵素の電子伝達サブユニットは、配列番号４、８、１４、１８または２２のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％同一性を有するアミノ酸配列において、「CYPS(L/M)」（配列番号２８）を有する。
上記のアミノ酸置換変異位置は配列番号４中の位置である。しかしながら、前記変異が導入される前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列は配列番号４の長さと異なる長さを有してよい。例えば、前記変異が導入される前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列が配列番号４と比較してＮ末端側で５アミノ酸だけ短い場合、配列番号４の位置３３６のスレオニン残基は前記アミノ酸配列の位置３３１のスレオニンに対応する。このような事例も「位置３３６のスレオニン残基」に対応するスレオニン残基の置換とされ、本発明の形態に含まれる。同じことが他の残基にも当てはまる。
前記電子伝達サブユニットはシステインを導入する前記変異に加えて別の変異を含んでもよい。
前記電子伝達サブユニットは３つのヘム結合ドメインを含む。前記電子伝達サブユニットは第１ヘム結合ドメインと第２ヘム結合ドメイン、すなわちＮ末端側から数えて１番目と２番目のドメインがそれぞれ欠失している変異型（短縮型）電子伝達サブユニットであってよい。このような変異型電子伝達サブユニットは米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書中に開示されている。
したがって、３つのヘム結合ドメイン（ＣＸＸＣＨモチーフ(配列番号３１)）を有する前記電子伝達サブユニットではＮ末端側から数えて第１と第２のヘム結合ドメイン又はこれらのドメインを含む領域が欠失していてよい。以下の説明はバークホルデリア・セパシアの電子伝達サブユニットを代表的な例として使用する。配列番号４には第１ヘム結合ドメイン（アミノ酸位置４３～４７）、第２ヘム結合ドメイン（アミノ酸位置１９１～１９５）、及び第３ヘム結合ドメイン（アミノ酸位置３３４～３３８）が存在する。これらの内、第１ヘム結合ドメインと第２ヘム結合ドメインが欠失していてもよく、又は第１と第２のヘム結合ドメインを含む領域（アミノ酸位置４３～１９５）が欠失していてもよい。
第１と第２のヘム結合ドメインを含む領域が欠失している変異体電子伝達サブユニットの例には配列番号４のアミノ酸位置３１４～４２５又は位置３３０～４２５から構成される変異型電子伝達サブユニットが挙げられる。
第１と第２のヘム結合ドメインを含む領域が欠失している変異体電子伝達サブユニットの例には配列番号４のアミノ酸位置３１４～４２５又は位置３３０～４２５から構成される変異型電子伝達サブユニットが挙げられる。
ＧＤＨは他の微生物でも知られている。それらの電子伝達サブユニットのアミノ酸配列、例えば配列番号４に対して、又は配列番号４のアミノ酸位置３１４～４２５若しくはアミノ酸位置３３０～４２５から構成される前記短縮型配列に対して少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列においてシステインを位置３３６のスレオニン残基、位置３８５のグリシン残基、位置３８３のアスパラギン酸残基、又は位置３９１のチロシン残基、及び／又は位置３４５のスレオニン残基、位置３４６のプロリン残基、又は位置３４９のチロシン残基のようなアミノ酸残基に対応する位置に導入してよい。
具体的には、前記変異が導入される前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列を配列番号４のアミノ酸配列と整列させ、配列番号４の位置３３６のスレオニン残基、位置３８５のグリシン残基、位置３８３のアスパラギン酸残基、又は位置３９１のチロシン残基；又は位置３４５のスレオニン残基、位置３４６のプロリン残基、又は位置３４９のチロシン残基の位置に対応する位置のアミノ酸をシステインで置換してよい。
具体的には、前記変異が導入される前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列を配列番号４のアミノ酸配列と整列させ、配列番号４の位置３３６のスレオニン残基、位置３８５のグリシン残基、位置３８３のアスパラギン酸残基、又は位置３９１のチロシン残基；又は位置３４５のスレオニン残基、位置３４６のプロリン残基、又は位置３４９のチロシン残基の位置に対応する位置のアミノ酸をシステインで置換してよい。
配列番号４または下記で示す電子伝達サブユニットの他の配列とある程度の配列同一性を有するポリペプチドであれば、電子伝達サブユニットの機能を維持する限りにおいて、変異型グルコース脱水素酵素の電子伝達サブユニットを調製するために使用しうる。電子伝達サブユニットの機能とは、例えば、触媒サブユニット及びヒッチハイカーサブユニットと複合体を形成し、電子の授受を行う機能を意味する。電子伝達サブユニットは好ましくは３つのヘム結合領域を有し、短縮型の場合は、第３ヘム結合領域を有する。
配列番号４に対して少なくとも６０％の同一性を有する前記ＧＤＨ電子伝達サブユニットのアミノ酸配列の例にはバークホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株（ＷＰ＿００６４８２９５８）、バークホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株（ＷＰ＿００９９００２９７）、ラルストニア・ピケッティイ１２Ｄ株（ＷＰ＿０１２７６１５０９）、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株（ＷＰ＿０４９２８１２１４）、バークホルデリア・ファイトフィルマンスＰｓＪＮ株（ＷＰ＿０１２４２８６０９）、ラルストニア
エスピー（ＷＰ＿０４８９３１８２９）、モラクセラ科細菌（ＷＰ＿１１４８９９５３
６）、シュードモナス・クナックムッシイ（ＷＰ＿０４３２４８５２０）、エルシニア・ヌルミイ（ＷＰ＿０４９５９６８５１）、エダホビルガ・クレメア（ＷＰ＿１１４１９３
３３８）、シルビモナス・テラエ (ＷＰ＿１８４１０２３９７)、ザイモバクター・パル
マエ（ＷＰ_２１１２４５１８８）、コベティア エスピー（Ｃｏｂｅｔｉａ ｓｐ）（Ｗ
Ｐ＿１５８７７３８５０）、ハロモナス エスピー（ＷＰ＿１０７３３６５２９）及びエ
ウィンゲラ・アメリカナ（ＷＰ＿０３４７８８３１７）の各々の電子伝達サブユニットの配列が挙げられる。
配列番号４に対して少なくとも６０％の同一性を有する前記ＧＤＨ電子伝達サブユニットのアミノ酸配列の例にはバークホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株（ＷＰ＿００６４８２９５８）、バークホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株（ＷＰ＿００９９００２９７）、ラルストニア・ピケッティイ１２Ｄ株（ＷＰ＿０１２７６１５０９）、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株（ＷＰ＿０４９２８１２１４）、バークホルデリア・ファイトフィルマンスＰｓＪＮ株（ＷＰ＿０１２４２８６０９）、ラルストニア
エスピー（ＷＰ＿０４８９３１８２９）、モラクセラ科細菌（ＷＰ＿１１４８９９５３
６）、シュードモナス・クナックムッシイ（ＷＰ＿０４３２４８５２０）、エルシニア・ヌルミイ（ＷＰ＿０４９５９６８５１）、エダホビルガ・クレメア（ＷＰ＿１１４１９３
３３８）、シルビモナス・テラエ (ＷＰ＿１８４１０２３９７)、ザイモバクター・パル
マエ（ＷＰ_２１１２４５１８８）、コベティア エスピー（Ｃｏｂｅｔｉａ ｓｐ）（Ｗ
Ｐ＿１５８７７３８５０）、ハロモナス エスピー（ＷＰ＿１０７３３６５２９）及びエ
ウィンゲラ・アメリカナ（ＷＰ＿０３４７８８３１７）の各々の電子伝達サブユニットの配列が挙げられる。
上記のように、これらの電子伝達サブユニットにおいてシステイン残基が導入される前記領域及び残基は、各電子伝達サブユニットの配列をバークホルデリア・セパシアの電子伝達サブユニットの配列（配列番号４）と整列させることによって決定可能である。例えば、エウィンゲラ・アメリカナの電子伝達サブユニット（配列番号８）の場合では図１１に示されているように配列番号４中の領域３３０～４００は配列番号８中の領域３２２～３９２に位置し、位置３３６のスレオニン残基、位置３８３のアスパラギン酸残基、位置３８５のグリシン残基、及び位置３９１のチロシン残基はそれぞれ配列番号８中の位置３２８のセリン残基、位置３７５のグルタミン酸残基、位置３７７のフェニルアラニン残基、及び位置３８３のアスパラギン酸残基に対応する。
さらに、エウィンゲラ・アメリカナの電子伝達サブユニット（配列番号８）の場合では図１１に示されているように配列番号４中の領域３４１～３５０は配列番号８中の領域３３３～３４２に位置し、位置３４５のスレオニン残基、位置３４６のプロリン残基、及び位置３４９のチロシン残基はそれぞれ配列番号８中の位置３３７のセリン残基、位置３３８のグルタミン残基、及び位置３４１のチロシン残基に対応する。
配列番号８には第１ヘム結合ドメイン（アミノ酸位置４１～４５）、第２ヘム結合ドメイン（アミノ酸位置１８７～１９１）、及び第３ヘム結合ドメイン（アミノ酸位置３２６～３３０）が存在する。これらの内、第１ヘム結合ドメイン及び第２ヘム結合ドメインが欠失していてもよく、又は第１と第２のヘム結合ドメインを含む領域（アミノ酸位置４１～１９１）が欠失していてもよい。第１と第２のヘム結合ドメインを含む領域が欠失している変異型電子伝達サブユニットの例には配列番号８のアミノ酸位置３０６～４２０又はアミノ酸位置３２２～４２０から構成される変異型電子伝達サブユニットが挙げられる。
前記電子伝達サブユニットの別の実施形態には配列番号８に対して、又は配列番号８のアミノ酸３０６～４２０に対して少なくとも６０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む電子伝達サブユニットであって、配列番号８中の位置３２８のセリン残基、位置３７５のグルタミン酸残基、位置３７７のフェニルアラニン残基又は位置３８３のアスパラギン酸に対応する位置に第１のシステインが導入され、配列番号８中の位置３３７のセリン残基、位置３３８のグルタミン残基、又は位置３４１のチロシン残基に対応する位置に第２のシステインが導入されている前記電子伝達サブユニットが挙げられる。
さらに、例えば、シルビモナス・テラエGDHの電子伝達サブユニット（配列番号１４）
においては、図１９に示されるように、配列番号４の位置３８３のアスパラギン酸残基は配列番号１４の位置３８２のヒスチジン残基に該当する。配列番号４の位置３４９のチロシン残基は配列番号１４の位置３４７のアラニン残基に該当する。
配列番号１４において、第１ヘム結合領域（アミノ酸番号４３～４７）、第２ヘム結合領域（アミノ酸番号１９１～１９５）、第３ヘム結合領域（アミノ酸番号３３２～３３６）が存在する。これらのうち、第１ヘム結合領域及び第２ヘム結合領域は欠失してもよく、第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域（アミノ酸番号４３～１９５）が欠失してもよい。第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域が欠失した変異型電子伝達サブユニットの例は、配列番号１４のアミノ酸番号３３２～４８１からなるアミノ酸配列を有する。
電子伝達サブユニットの別の態様は、配列番号１４または配列番号１４のアミノ酸番号３３２～４８１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１４の位置３８２のヒスチジン残基に相当する位置に第１のシステイン残基が導入され、及び／又は配列番号１４の位置３４７のアラニン残基に相当する位置に第２のシステイン残基が導入されている。
においては、図１９に示されるように、配列番号４の位置３８３のアスパラギン酸残基は配列番号１４の位置３８２のヒスチジン残基に該当する。配列番号４の位置３４９のチロシン残基は配列番号１４の位置３４７のアラニン残基に該当する。
配列番号１４において、第１ヘム結合領域（アミノ酸番号４３～４７）、第２ヘム結合領域（アミノ酸番号１９１～１９５）、第３ヘム結合領域（アミノ酸番号３３２～３３６）が存在する。これらのうち、第１ヘム結合領域及び第２ヘム結合領域は欠失してもよく、第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域（アミノ酸番号４３～１９５）が欠失してもよい。第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域が欠失した変異型電子伝達サブユニットの例は、配列番号１４のアミノ酸番号３３２～４８１からなるアミノ酸配列を有する。
電子伝達サブユニットの別の態様は、配列番号１４または配列番号１４のアミノ酸番号３３２～４８１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１４の位置３８２のヒスチジン残基に相当する位置に第１のシステイン残基が導入され、及び／又は配列番号１４の位置３４７のアラニン残基に相当する位置に第２のシステイン残基が導入されている。
さらに、例えば、ザイモバクター・パルマエGDHの電子伝達サブユニット（配列番号１
８）においては、図１９に示されるように、配列番号４の位置３８３のアスパラギン酸残基は配列番号１８の位置３８９のアスパラギン酸残基に該当する。配列番号４の位置３４９のチロシン残基は配列番号１８の位置３５５のチロシン残基に該当する。
配列番号１８において、第１ヘム結合領域（アミノ酸番号４９～５３）、第２ヘム結合領域（アミノ酸番号１９６～２００）、第３ヘム結合領域（アミノ酸番号３４０～３４４）が存在する。これらのうち、第１ヘム結合領域及び第２ヘム結合領域は欠失してもよく、第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域（アミノ酸番号４９～２００）が欠失してもよい。第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域が欠失した変異型電子伝達サブユニットの例は、配列番号１８のアミノ酸番号３４０～４３３からなるアミノ酸配列を有する。
電子伝達サブユニットの別の態様は、配列番号１８または配列番号１８のアミノ酸番号３４０～４３３のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１８の位置３８９のアスパラギン酸残基に相当する位置に第１のシステイン残基が導入され、及び／又は配列番号１８の位置３５５のチロシン残基に相当する位置に第２のシステイン残基が導入されている。
８）においては、図１９に示されるように、配列番号４の位置３８３のアスパラギン酸残基は配列番号１８の位置３８９のアスパラギン酸残基に該当する。配列番号４の位置３４９のチロシン残基は配列番号１８の位置３５５のチロシン残基に該当する。
配列番号１８において、第１ヘム結合領域（アミノ酸番号４９～５３）、第２ヘム結合領域（アミノ酸番号１９６～２００）、第３ヘム結合領域（アミノ酸番号３４０～３４４）が存在する。これらのうち、第１ヘム結合領域及び第２ヘム結合領域は欠失してもよく、第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域（アミノ酸番号４９～２００）が欠失してもよい。第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域が欠失した変異型電子伝達サブユニットの例は、配列番号１８のアミノ酸番号３４０～４３３からなるアミノ酸配列を有する。
電子伝達サブユニットの別の態様は、配列番号１８または配列番号１８のアミノ酸番号３４０～４３３のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１８の位置３８９のアスパラギン酸残基に相当する位置に第１のシステイン残基が導入され、及び／又は配列番号１８の位置３５５のチロシン残基に相当する位置に第２のシステイン残基が導入されている。
さらに、例えば、コベティア エスピーGDHの電子伝達サブユニット（配列番号２２）においては、図１９に示されるように、配列番号４の位置３８３のアスパラギン酸残基は配列番号２２の位置４６７のセリン残基に該当する。配列番号４の位置３４９のチロシン残基は配列番号２２の位置４３３のチロシン残基に該当する。
配列番号２２において、第１ヘム結合領域（アミノ酸番号８４～８８）、第２ヘム結合領域（アミノ酸番号２３１～２３５）、第３ヘム結合領域（アミノ酸番号４１８～４２２）が存在する。これらのうち、第１ヘム結合領域及び第２ヘム結合領域は欠失してもよく、第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域（アミノ酸番号８４～２３５）が欠失してもよい。第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域が欠失した変異型電子伝達サブユニットの例は、配列番号２２のアミノ酸番号４１８～５２２からなるアミノ酸配列を有する。
電子伝達サブユニットの別の態様は、配列番号２２または配列番号２２のアミノ酸番号４１８～５２２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２２の位置４６７のセリン残基に相当する位置に第１のシステイン残基が導入され、及び／又は配列番号２２の位置４３３のチロシン残基に相当する位置に第２のシステイン残基が導入されている。
配列番号２２において、第１ヘム結合領域（アミノ酸番号８４～８８）、第２ヘム結合領域（アミノ酸番号２３１～２３５）、第３ヘム結合領域（アミノ酸番号４１８～４２２）が存在する。これらのうち、第１ヘム結合領域及び第２ヘム結合領域は欠失してもよく、第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域（アミノ酸番号８４～２３５）が欠失してもよい。第１ヘム結合領域と第２ヘム結合領域を含む領域が欠失した変異型電子伝達サブユニットの例は、配列番号２２のアミノ酸番号４１８～５２２からなるアミノ酸配列を有する。
電子伝達サブユニットの別の態様は、配列番号２２または配列番号２２のアミノ酸番号４１８～５２２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２２の位置４６７のセリン残基に相当する位置に第１のシステイン残基が導入され、及び／又は配列番号２２の位置４３３のチロシン残基に相当する位置に第２のシステイン残基が導入されている。
＜ヒッチハイカーサブユニット＞
前記グルコース脱水素酵素はヒッチハイカーサブユニットも内包する。前記ヒッチハイカーサブユニットはγサブユニットとも呼ばれ、αサブユニット及びβサブユニットと共に複合体を形成し、且つ、ペリプラズム中に分泌される機能を有する。前記ヒッチハイカーサブユニットはこの機能を有する限り限定されない。公知のγサブユニットを含む様々な生物に由来するγサブユニットが使用されてよい。前記ヒッチハイカーサブユニットは、前記触媒サブユニット又は電子伝達サブユニットが由来する微生物と同じ微生物に由来してよい。前記ヒッチハイカーサブユニットの例にはバークホルデリア・セパシアのＧＤＨのヒッチハイカーサブユニットが挙げられる。
配列番号２はバークホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨヒッチハイカーサブユニッ
トのアミノ酸配列である。この配列を参照しながら以下の説明を行う。
前記グルコース脱水素酵素はヒッチハイカーサブユニットも内包する。前記ヒッチハイカーサブユニットはγサブユニットとも呼ばれ、αサブユニット及びβサブユニットと共に複合体を形成し、且つ、ペリプラズム中に分泌される機能を有する。前記ヒッチハイカーサブユニットはこの機能を有する限り限定されない。公知のγサブユニットを含む様々な生物に由来するγサブユニットが使用されてよい。前記ヒッチハイカーサブユニットは、前記触媒サブユニット又は電子伝達サブユニットが由来する微生物と同じ微生物に由来してよい。前記ヒッチハイカーサブユニットの例にはバークホルデリア・セパシアのＧＤＨのヒッチハイカーサブユニットが挙げられる。
配列番号２はバークホルデリア・セパシアＫＳ１株のＧＤＨヒッチハイカーサブユニッ
トのアミノ酸配列である。この配列を参照しながら以下の説明を行う。
上記のように、前記ヒッチハイカーサブユニットは、前記電子伝達サブユニットとジスルフィド結合を形成するためにその中に導入されたシステイン残基を含む場合がある。
前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列中のシステイン導入部位は、前記電子伝達サブユニットとの接触面を形成する領域中にあることが好ましい。例えば、配列番号２のアミノ酸配列中のアミノ酸位置１４０～１６０の領域中の位置にシステインが導入される。したがって、配列番号２のアミノ酸位置１４０～１６０の領域中のアミノ酸残基がシステインで置換される。前記ヒッチハイカーサブユニット中のこの領域はＧＤＨの空間的構造中の前記電子伝達サブユニットとの接触面上に位置する領域である。
この領域中の前記アミノ酸の具体的な例には配列番号２のアミノ酸配列中の位置１４５のスレオニン残基、位置１５４のアスパラギン残基、及び位置１５５のリジン残基が挙げられる。システイン残基の導入にはシステインによる置換及びシステインの挿入が含まれる。例えば、上記のアミノ酸残基のうちのいずれもシステイン残基によって置換されてよい。あるいは、システイン残基が挿入される場合、そのシステイン残基はこれらの残基の直前又は直後の位置に挿入されてよい。
前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列中のシステイン導入部位は、前記電子伝達サブユニットとの接触面を形成する領域中にあることが好ましい。例えば、配列番号２のアミノ酸配列中のアミノ酸位置１４０～１６０の領域中の位置にシステインが導入される。したがって、配列番号２のアミノ酸位置１４０～１６０の領域中のアミノ酸残基がシステインで置換される。前記ヒッチハイカーサブユニット中のこの領域はＧＤＨの空間的構造中の前記電子伝達サブユニットとの接触面上に位置する領域である。
この領域中の前記アミノ酸の具体的な例には配列番号２のアミノ酸配列中の位置１４５のスレオニン残基、位置１５４のアスパラギン残基、及び位置１５５のリジン残基が挙げられる。システイン残基の導入にはシステインによる置換及びシステインの挿入が含まれる。例えば、上記のアミノ酸残基のうちのいずれもシステイン残基によって置換されてよい。あるいは、システイン残基が挿入される場合、そのシステイン残基はこれらの残基の直前又は直後の位置に挿入されてよい。
上記アミノ酸残基のうち、位置１５５のリジン残基がシステイン残基に置換されることが好ましい。このリジン残基は、アミノ酸モチーフ「PXXWXXXP」（配列番号２９）の１アミノ酸前に存在する。一態様においては、システイン残基がこのモチーフの１アミノ酸前のアミノ酸残基を置換するように導入される。そして、変異型グルコース脱水素酵素のヒッチハイカーサブユニットは、配列番号２、６、１２、１６または２０のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０または９５％同一性を有するアミノ酸配列において、「CPXXWXXXP」（配列番号３０）を有する。
上記のアミノ酸置換変異位置は配列番号２中の位置である。しかしながら、前記変異が導入される前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列は配列番号２の長さと異なる長さを有してよい。例えば、前記変異が導入される前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列が配列番号２と比較してＮ末端側で２アミノ酸だけ長い場合、配列番号２の位置１４５のスレオニン残基は前記アミノ酸配列の位置１４７のスレオニンに対応する。このような事例も「位置１４５のスレオニン残基」に対応するスレオニン残基の置換とされ、本発明の形態に含まれる。同じことが他の残基にも当てはまる。
前記電子伝達サブユニット（配列番号４のアミノ酸位置３４１～３５０の領域）中の前記ヒッチハイカーサブユニットとのジスルフィド形成のためのシステイン導入部位と前記ヒッチハイカーサブユニット（配列番号２のアミノ酸位置１４０～１６０の領域）中のシステイン導入部位の好ましい組合せの例には前記電子伝達サブユニットの位置３４５のスレオニンと前記ヒッチハイカーサブユニットの位置１５４のアスパラギンの組合せ、及び前記電子伝達サブユニットの位置３４９のチロシンと前記ヒッチハイカーサブユニットの位置１５５のリジンの組合せが挙げられる。残基のこれらの組合せは、ＦＡＤ－ＧＤＨの空間的構造において互いに約５Åの距離があり、且つ、より効率的にジスルフィド結合を形成できる残基の組合せである。
前記ヒッチハイカーサブユニットはシステインを導入する前記変異に加えて別の変異を含んでもよい。
ＧＤＨは他の微生物でも知られている。それらのヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列、例えば配列番号２に対して少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列においてシステインを上記の領域内に、又は上記の特定のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の位置に導入してよい
。
具体的には、前記変異が導入される前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列を配列番号２のアミノ酸配列と整列させ、配列番号２の位置１４５のスレオニン残基、位置１５４のアスパラギン残基、又は位置１５５のリジン残基の位置に対応する位置のアミノ酸をシステインで置換してよい。
。
具体的には、前記変異が導入される前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列を配列番号２のアミノ酸配列と整列させ、配列番号２の位置１４５のスレオニン残基、位置１５４のアスパラギン残基、又は位置１５５のリジン残基の位置に対応する位置のアミノ酸をシステインで置換してよい。
配列番号２または下記で示すヒッチハイカーサブユニットの他の配列とある程度の配列同一性を有するポリペプチドであれば、ヒッチハイカーサブユニットの機能を維持する限りにおいて、変異型グルコース脱水素酵素のヒッチハイカーサブユニットを調製するために使用しうる。ヒッチハイカーサブユニットの機能とは、例えば、触媒サブユニット及び電子伝達サブユニットと複合体を形成し、ペリプラズム中に分泌される機能を意味する。
配列番号２に対して少なくとも６０％の同一性を有する前記ＧＤＨヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列の例にはバークホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株（ＷＰ＿００６４８２９７４）、バークホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株（ＷＰ＿００９９００２９９）、ラルストニア・ピケッティイ１２Ｄ株（ＷＰ＿０１２７６１５０７）、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株（ＷＰ＿００３２６５１４２）、バークホルデリア・ファイトフィルマンスＰｓＪＮ株（ＷＰ＿０１２４２８６１１）、ラルストニア エスピー（ＷＰ＿０４８９３１９９０）、モラクセラ科細菌（ＷＰ＿１１４８９
９５３８）、シュードモナス・クナックムッシイ（ＷＰ＿０４３２４８５２３）、エルシニア・ヌルミイ（ＷＰ＿０４９５９６８４９）、エダホビルガ・クレメア（ＷＰ＿１１４１９３３４０）、シルビモナス・テラエ (ＷＰ＿１８４１０２３９９),ザイモバクター・パルマエ（ＢＢＧ２９８３７）、コベティア エスピー（ＷＰ＿１５８７７３８５２）、
ハロモナス エスピー（ＷＰ＿１０７３３４７１５）及びエウィンゲラ・アメリカナ（Ｗ
Ｐ＿０３４７８８２７９）の各々のγサブユニットの配列が挙げられる。
配列番号２に対して少なくとも６０％の同一性を有する前記ＧＤＨヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列の例にはバークホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株（ＷＰ＿００６４８２９７４）、バークホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株（ＷＰ＿００９９００２９９）、ラルストニア・ピケッティイ１２Ｄ株（ＷＰ＿０１２７６１５０７）、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株（ＷＰ＿００３２６５１４２）、バークホルデリア・ファイトフィルマンスＰｓＪＮ株（ＷＰ＿０１２４２８６１１）、ラルストニア エスピー（ＷＰ＿０４８９３１９９０）、モラクセラ科細菌（ＷＰ＿１１４８９
９５３８）、シュードモナス・クナックムッシイ（ＷＰ＿０４３２４８５２３）、エルシニア・ヌルミイ（ＷＰ＿０４９５９６８４９）、エダホビルガ・クレメア（ＷＰ＿１１４１９３３４０）、シルビモナス・テラエ (ＷＰ＿１８４１０２３９９),ザイモバクター・パルマエ（ＢＢＧ２９８３７）、コベティア エスピー（ＷＰ＿１５８７７３８５２）、
ハロモナス エスピー（ＷＰ＿１０７３３４７１５）及びエウィンゲラ・アメリカナ（Ｗ
Ｐ＿０３４７８８２７９）の各々のγサブユニットの配列が挙げられる。
上記のように、これらのヒッチハイカーサブユニットにおいてシステイン残基が導入される前記領域及び残基は、各ヒッチハイカーサブユニットの配列をバークホルデリア・セパシアのヒッチハイカーサブユニットの配列（配列番号２）と整列させることによって決定可能である。例えば、エウィンゲラ・アメリカナのヒッチハイカーサブユニット（配列番号６）の場合では図９に示されているように配列番号２中の領域１４０～１６０は配列番号６中の領域１４２～１６２に位置し、位置１４５のスレオニン残基、位置１５４のアスパラギン残基、及び位置１５５のリジン残基はそれぞれ配列番号６中の位置１４７のバリン残基、位置１５６のアスパラギン残基、及び位置１５７のアルギニン残基に対応する。
前記ヒッチハイカーサブユニットの別の実施形態には配列番号６に対して少なくとも６０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むヒッチハイカーサブユニットであって、システインが配列番号６中の位置１４７のバリン残基、位置１５６のアスパラギン残基、又は位置１５７のアルギニン残基に対応する位置に導入されている前記ヒッチハイカーサブユニットが挙げられる。
例えば、シルビモナス・テラエGDHのヒッチハイカーサブユニット（配列番号１２）に
おいては、図２０に示されるように、配列番号２の位置１５５のリジン残基は配列番号１２の位置１６８のアラニン残基に該当する。
ヒッチハイカーサブユニットの別の態様は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１２の位置１６８のアラニン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
おいては、図２０に示されるように、配列番号２の位置１５５のリジン残基は配列番号１２の位置１６８のアラニン残基に該当する。
ヒッチハイカーサブユニットの別の態様は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１２の位置１６８のアラニン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
例えば、ザイモバクター・パルマエGDHのヒッチハイカーサブユニット（配列番号１６
）においては、図２０に示されるように、配列番号２の位置１５５のリジン残基は配列番
号１６の位置１８２のアルギニン残基に該当する。
ヒッチハイカーサブユニットの別の態様は、配列番号１６または配列番号１６のアミノ酸１９～１９５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１６の位置１８２のアルギニン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
）においては、図２０に示されるように、配列番号２の位置１５５のリジン残基は配列番
号１６の位置１８２のアルギニン残基に該当する。
ヒッチハイカーサブユニットの別の態様は、配列番号１６または配列番号１６のアミノ酸１９～１９５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号１６の位置１８２のアルギニン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
例えば、コベティア エスピーGDHのヒッチハイカーサブユニット（配列番号２０）においては、図２０に示されるように、配列番号２の位置１５５のリジン残基は配列番号２０の位置１９８のグルタミン残基に該当する。
ヒッチハイカーサブユニットの別の態様は、配列番号２０または配列番号２０のアミノ酸１４～２０７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２０の位置１９８のグルタミン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
ヒッチハイカーサブユニットの別の態様は、配列番号２０または配列番号２０のアミノ酸１４～２０７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、配列番号２０の位置１９８のグルタミン残基に相当する位置にシステイン残基が導入されている。
変異型FAD依存グルコース脱水素酵素の一態様として、触媒サブユニットは配列番号３
のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３の位置２０５のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号４または配列番号４のアミノ酸番号３３０～４２５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号４の位置３８３のアスパラギン酸に相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号４の位置３４５のスレオニンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２の位置１５４のアスパラギンに相当する位置にシステインが導入されている。
のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３の位置２０５のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号４または配列番号４のアミノ酸番号３３０～４２５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号４の位置３８３のアスパラギン酸に相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号４の位置３４５のスレオニンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２の位置１５４のアスパラギンに相当する位置にシステインが導入されている。
変異型FAD依存グルコース脱水素酵素の一態様として、触媒サブユニットは配列番号３
のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３の位置２０５のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号４または配列番号４のアミノ酸番号３３０～４２５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号４の位置３８３のアスパラギン酸に相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号４の位置３４９のチロシンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２の位置１５５のリジンに相当する位置にシステインが導入されている。
のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３の位置２０５のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号４または配列番号４のアミノ酸番号３３０～４２５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号４の位置３８３のアスパラギン酸に相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号４の位置３４９のチロシンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２の位置１５５のリジンに相当する位置にシステインが導入されている。
変異型FAD依存グルコース脱水素酵素の一態様として、触媒サブユニットは配列番号７
のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号７の位置２０２のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号８または配列番号８のアミノ酸番号３２６～４２０のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号８の位置３７５のグルタミン酸に相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号８の位置３４１のチロシンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号６の位置１５７のアルギニンに相当する位置にシステインが導入されている。
のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号７の位置２０２のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号８または配列番号８のアミノ酸番号３２６～４２０のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号８の位置３７５のグルタミン酸に相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号８の位置３４１のチロシンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号６の位置１５７のアルギニンに相当する位置にシステインが導入されている。
変異型FAD依存グルコース脱水素酵素の一態様として、触媒サブユニットは配列番号１
３のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１３の位置２０４のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号１４または配列番号１４のアミノ酸番号３３２～４８１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１４の位置３８２のヒスチジンに相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号１４の位置３４７のアラニンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１２の位置１６８のアラニンに相当する位置にシステインが導入されている。
３のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１３の位置２０４のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号１４または配列番号１４のアミノ酸番号３３２～４８１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１４の位置３８２のヒスチジンに相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号１４の位置３４７のアラニンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１２の位置１６８のアラニンに相当する位置にシステインが導入されている。
変異型FAD依存グルコース脱水素酵素の一態様として、触媒サブユニットは配列番号１
７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１７の位置２００のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号１８または配列番号１８のアミノ酸番号３４０～４６５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１８の位置３８９のアスパラギン酸に相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号１８の位置３５５のチロシンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号１６または配列番号１６のアミノ酸１９～１９５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１６の位置１８２のアルギニンに相当する位置にシステインが導入されている。
７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１７の位置２００のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号１８または配列番号１８のアミノ酸番号３４０～４６５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１８の位置３８９のアスパラギン酸に相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号１８の位置３５５のチロシンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号１６または配列番号１６のアミノ酸１９～１９５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１６の位置１８２のアルギニンに相当する位置にシステインが導入されている。
変異型FAD依存グルコース脱水素酵素の一態様として、触媒サブユニットは配列番号２
１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２１の位置２０４のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号２２または配列番号２２のアミノ酸番号４１８～５２２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２２の位置４６７のセリンに相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号２２の位置４３３のチロシンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号２０または配列番号２０のアミノ酸１４～２０７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２０の位置１９８のグルタミンに相当する位置にシステインが導入されている。
１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２１の位置２０４のプロリンに相当する位置にシステインが導入されており、電子伝達サブユニットは配列番号２２または配列番号２２のアミノ酸番号４１８～５２２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２２の位置４６７のセリンに相当する位置に第１のシステインが導入されており、配列番号２２の位置４３３のチロシンに相当する位置に第２のシステインが導入されており、ヒッチハイカーサブユニットは配列番号２０または配列番号２０のアミノ酸１４～２０７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２０の位置１９８のグルタミンに相当する位置にシステインが導入されている。
本発明の１つの実施形態による前記変異型ＧＤＨは遺伝子工学により得られる。より具体的には、前記変異型ＧＤＨは、ＧＤＨをコードする遺伝子に部位特異的変異導入等により目的の変異を導入し、そしてそれにより生じた変異型ＧＤＨ遺伝子を任意の宿主細胞又は無細胞翻訳系内で発現させることにより得られる。
したがって、ＦＡＤ依存性ＧＤＨを発現する核酸分子に本明細書に記載の変異を導入し、前記変異型ＦＡＤ依存性ＧＤＨを発現させることを含む、変異型ＦＡＤ依存性ＧＤＨの製造方法も本発明の範囲に含まれる。前記ＧＤＨは単離または精製されることが好ましい。
したがって、ＦＡＤ依存性ＧＤＨを発現する核酸分子に本明細書に記載の変異を導入し、前記変異型ＦＡＤ依存性ＧＤＨを発現させることを含む、変異型ＦＡＤ依存性ＧＤＨの製造方法も本発明の範囲に含まれる。前記ＧＤＨは単離または精製されることが好ましい。
前記ＧＤＨ触媒（α）サブユニットをコードする遺伝子は前記ＧＤＨ αサブユニットのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を有する限り限定されない。この遺伝子の具体的な例には配列番号１のヌクレオチド位置７６４～２３８０から構成されるＤＮＡが挙げられる。前記αサブユニット遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド
位置７６４～２３８０から構成されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってよく、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（たとえば、配列番号１のヌクレオチド位置７６４～２３８０から構成されるＤＮＡと少なくとも８０％、９０％または９５％の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ）であってよい。
位置７６４～２３８０から構成されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってよく、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（たとえば、配列番号１のヌクレオチド位置７６４～２３８０から構成されるＤＮＡと少なくとも８０％、９０％または９５％の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ）であってよい。
前記ＧＤＨ電子伝達（β）サブユニットをコードする遺伝子の具体的な例には配列番号１のヌクレオチド位置２３８６～３６６０から構成されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡが挙げられる。前記βサブユニット遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド位置２３８６～３６６０から構成されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってよく、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡ（たとえば、配列番号１のヌクレオチド位置２３８６～３６６０から構成されるＤＮＡと少なくとも８０％、９０％または９５％の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ）であってよい。
前記ＧＤＨヒッチハイカーサブユニット（γ）サブユニットをコードする遺伝子の具体的な例には配列番号１のヌクレオチド位置２５８～７６１から構成されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡが挙げられる。前記γサブユニット遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド位置２５８～７６１から構成されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってよく、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、γサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡ（たとえば、配列番号１のヌクレオチド位置２５８～７６１から構成されるＤＮＡと少なくとも８０％、９０％または９５％の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ）であってよい。
上記のストリンジェントな条件の例には好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを許し、且つ、８０％未満、９０％未満、又は９５％未満の同一性を有するＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを許さない条件が挙げられる。このストリンジェントな条件の具体的な例には６０℃、６５℃、又は６８℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを使用して洗浄が行われる条件が挙げられる。
前記αサブユニット遺伝子、βサブユニット遺伝子、及びγサブユニット遺伝子は例えばバークホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより得られる。このためのＰＣＲプライマーは、上記のヌクレオチド配列に基づいて化学合成により調製可能である。あるいは、前記遺伝子は、上記の配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプローブとして使用するハイブリダイゼーションによってバークホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡから得られる。ＫＳ１株以外の株、例えばバークホルデリア・セノセパシアＪ２３１５株、バークホルデリア・タイランデンシスＴＸＤＯＨ株、ラルストニア・ピケッティイ１２Ｄ株、ラルストニア・ソラナセアラムＩＰＯ１６０９株、及びバークホルデリア・ファイトフィルマンスＰｓＪＮ株が使用されてもよい。
所望の変異を有する前記ＧＤＨ αサブユニット、βサブユニット、及びγサブユニットの各々は、そのＧＤＨサブユニットをコードするＤＮＡへ所望のアミノ酸変異（システイン残基による置換等）に対応するヌクレオチド変異を部位特異的変異導入により導入し、そしてそれにより生じた変異体ＤＮＡが適切な発現系の使用により発現することによって得られる。さらに、変異型ＧＤＨは、前記変異型ＧＤＨ αサブユニットをコードするＤＮＡから発現させ、そして前記変異型βサブユニットをコードするＤＮＡ及び前記変異型γサブユニットをコードするＤＮＡからも発現させることによって得られる。各サブユニットをコードするＤＮＡへの変異の導入は、前記γサブユニット、αサブユニット、及
びβサブユニットをこの順序でコードするポリシストロン性ＤＮＡ断片を使用して実施されてよい。
びβサブユニットをこの順序でコードするポリシストロン性ＤＮＡ断片を使用して実施されてよい。
前記γサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットをこの順序でコードする前記ポリシストロン性ＤＮＡ断片は、例えばバークホルデリア・セパシアＫＳ１株の染色体ＤＮＡを鋳型として、並びに配列番号９及び１０のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するＰＣＲにより得られる。
前記ＧＤＨサブユニットの遺伝子を得るため、前記変異を導入するため、前記遺伝子を発現させるため等に使用されるベクターにはエシェリキア属に属する細菌において機能し得るベクター、例えばｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＡＣＹＣ１８４、及びｐＢＢＲ１２２が挙げられる。遺伝子発現に使用されるプロモーターの例にはｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＰＬ、ｔｅｔ、及びＰｈｏＡが挙げられる。プロモーターを含有する発現ベクター中の適切な部位へ前記γサブユニット遺伝子、αサブユニット遺伝子、及びβサブユニット遺伝子を導入することによってそれらの遺伝子のベクターへの挿入とプロモーターの結合を同一の処理内で実行できる。そのような発現ベクターの例にはｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びｐＫＫ２２３－３が挙げられる。
前記γサブユニット遺伝子、αサブユニット遺伝子、及びβサブユニット遺伝子は、発現を可能にする形で宿主微生物の染色体ＤＮＡに組み込まれてよい。組換えベクターを使用する微生物の形質転換法の例にはカルシウム処理によるコンピテント細胞法、プロトプラスト法、及び電気穿孔法が挙げられる。
前記宿主微生物の例には枯草菌などのバチルス属に属する細菌、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母、及びアスペルギルス・ニガーなどの糸状菌が挙げられるがこれらに限定されない。外来性タンパク質の生産に適切などの宿主微生物も使用可能である。
前記変異型ＧＤＨ遺伝子を使用して形質転換された微生物などの形質転換体は、その形質転換体の種類の応じた適切な培養方法によって培養可能である。その培養のための条件の例には３０～３７℃における１２～２４間にわたる培養が挙げられる。
前記変異型ＧＤＨは精製後に使用されてもよい。前記変異型ＧＤＨは精製のためのタグ配列などの追加の配列を含んでよい。
前記変異型ＧＤＨ遺伝子を使用して形質転換された微生物などの形質転換体は、その形質転換体の種類の応じた適切な培養方法によって培養可能である。その培養のための条件の例には３０～３７℃における１２～２４間にわたる培養が挙げられる。
前記変異型ＧＤＨは精製後に使用されてもよい。前記変異型ＧＤＨは精製のためのタグ配列などの追加の配列を含んでよい。
本発明の１つの実施形態による前記変異型ＧＤＨ又は前記変異型ＧＤＨを発現する前記微生物はグルコースセンサーの酵素電極の構成要素として使用される場合がある。このグルコースセンサーの具体的な例には金電極、プラチナ電極、又は炭素電極などの電極の表面上に前記変異型ＧＤＨを固定化することにより形成される酵素電極を作用電極として使用するグルコースセンサーが挙げられる。このセンサーは目的の被験物質の濃度を電気化学的に測定するための測定系を意味し、そのセンサーは３本の電極を通常含み、これらの電極は作用電極（酵素電極）、対電極（プラチナ等）、及び基準電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ等）である。前記センサーは作用電極と対電極、例えば従来の簡易血糖レベルシステムに使用される電極から構成される２電極系であってもよい。前記センサーは、緩衝液及び被験試料を入れるための恒温セル、作用電極に電圧を印加するための電源、電流計、記録装置等をさらに含むことが好ましい。前記センサーはバッチタイプセンサー又はフロータイプセンサーのどちらであってもよい。具体的には、このフロータイプセンサーは血糖レベルの連続測定が可能なセンサーであってよい。より具体的には、前記センサーは本発明の前記酵素が固定化される２電極系又は３電極系を有するセンサーであってよく、連続的に供給される血液試料又は透析試料の中、又は血液若しくは間質液の中にこの電極系を入れて測定が実施される。このような酵素センサーの構造は当技術分野においてよく知られており、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ － Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ、Ａｎｔｈｏｎｙ Ｐ． Ｆ． Ｔｕｒｎｅｒ、Ｉｓａｏ Ｋａｒｕｂｅ、及びＧｅｒｏｇｅ Ｓ． Ｗｉｌｓｏｎ著、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ社、１９８７年等に記載されている。
本発明の１つの形態による前記センサーは電子伝達媒体を含有しない直接電子伝達型センサーであってよい。
ｏｎｓ、Ａｎｔｈｏｎｙ Ｐ． Ｆ． Ｔｕｒｎｅｒ、Ｉｓａｏ Ｋａｒｕｂｅ、及びＧｅｒｏｇｅ Ｓ． Ｗｉｌｓｏｎ著、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ社、１９８７年等に記載されている。
本発明の１つの形態による前記センサーは電子伝達媒体を含有しない直接電子伝達型センサーであってよい。
前記電極上に前記酵素（変異型ＧＤＨ）を固定化する方法は限定されない。この方法の例には架橋剤等を使用して酵素分子を前記電極上に化学的に固定化する方法、結合剤等を使用して酵素分子を前記電極上に間接的に固定化する方法、及び前記電極への酵素分子の物理的吸着による方法が挙げられる。
架橋剤等を使用して前記酵素を前記電極上に化学的に固定化する前記方法は前記酵素を前記電極上に直接的に固定化する方法であってよい。あるいは、米国特許第１０５６３２４２（Ｂ２）号明細書中に開示される方法などの方法が使用可能である。より具体的には、この方法は、前記電極上に単分子層（ＳＡＭ）形成分子を固定化し、そしてこのＳＡＭ形成分子を介して前記酵素を含む分子認識要素を固定化する方法である。
前記単分子層形成分子は、前記電極に結合し、且つ、前記酵素分子をその電極へ結合させることが可能な化合物である。前記電極表面上で前記化合物の複数の分子が同方向で結合することによって単分子層膜が形成され得る。この単分子層形成分子を使用することによって前記電極と前記酵素分子との間の距離を制御することができる。
前記単分子層形成分子は、前記電極に対する親和性を有する第１官能基、スペーサー領域、及び前記酵素分子に含まれる官能基と反応する第２官能基を含むことが好ましい。前記単分子層形成分子は、前記電極に対する親和性を有する前記第１官能基が前記スペーサー領域の第１末端に結合しており、且つ、前記酵素分子に含まれる官能基と反応する前記第２官能基が前記スペーサー領域の第２末端に結合している構造を有していることがより好ましい。ここで、前記電極に対する親和性を有する前記第１官能基の例には前記電極が金属である場合のチオール基及びジチオール基、並びに前記電極が炭素である場合のピレン及びポルフィリンが挙げられる。他方、前記酵素分子に含まれる官能基と反応する前記第２官能基の例には前記酵素分子に含まれるアミノ基（末端アミノ基及び側鎖アミノ基を含む）と反応する場合のスクシンイミド基、及び前記酵素分子に含まれるカルボキシル基（末端カルボキシル基及び側鎖カルボキシル基を含む）と反応する場合のオキサゾリン基が挙げられる。チオール基又はジチオール基及びスクシンイミド基を含む単分子層形成分子の例には実施例において後に説明されるＤＳＨが挙げられる。
前記単分子層形成分子は、前記電極に結合し、且つ、前記酵素分子をその電極へ結合させることが可能な化合物である。前記電極表面上で前記化合物の複数の分子が同方向で結合することによって単分子層膜が形成され得る。この単分子層形成分子を使用することによって前記電極と前記酵素分子との間の距離を制御することができる。
前記単分子層形成分子は、前記電極に対する親和性を有する第１官能基、スペーサー領域、及び前記酵素分子に含まれる官能基と反応する第２官能基を含むことが好ましい。前記単分子層形成分子は、前記電極に対する親和性を有する前記第１官能基が前記スペーサー領域の第１末端に結合しており、且つ、前記酵素分子に含まれる官能基と反応する前記第２官能基が前記スペーサー領域の第２末端に結合している構造を有していることがより好ましい。ここで、前記電極に対する親和性を有する前記第１官能基の例には前記電極が金属である場合のチオール基及びジチオール基、並びに前記電極が炭素である場合のピレン及びポルフィリンが挙げられる。他方、前記酵素分子に含まれる官能基と反応する前記第２官能基の例には前記酵素分子に含まれるアミノ基（末端アミノ基及び側鎖アミノ基を含む）と反応する場合のスクシンイミド基、及び前記酵素分子に含まれるカルボキシル基（末端カルボキシル基及び側鎖カルボキシル基を含む）と反応する場合のオキサゾリン基が挙げられる。チオール基又はジチオール基及びスクシンイミド基を含む単分子層形成分子の例には実施例において後に説明されるＤＳＨが挙げられる。
本発明の前記グルコースセンサーを使用するグルコース濃度の測定は以下のように実施可能である。前記センサーの恒温セルに緩衝液を入れ、このセルの温度を一定に保つ。作用電極として前記変異型ＧＤＨが固定化されている酵素電極を使用する。対電極として例えばプラチナ電極を使用する。基準電極として例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を使用する。この作用電極に定電圧を印加する。電流が一定になった後にグルコースを含む試料をこの恒温セルに入れ、電流の増加を測定する。標準濃度を有するグルコース溶液を使用して用意された検量線に従ってこの試料中のグルコース濃度を計算できる。
本発明の１つの実施形態による前記変異型ＧＤＨはグルコースアッセイキットの構成要素としても利用可能である。このグルコースアッセイキットは前記変異型ＧＤＨに加えて発色試薬又は発光試薬、希釈緩衝液、標準物質、製造業者の説明書等を含んでよい。
例えば、バークホルデリア・セパシアの野生型ＧＤＨを使用するグルコースセンサー及びグルコースアッセイキットが米国特許出願公開第２００４／００２３３３０（Ａ１）号明細書中に記載されている。前記変異型ＧＤＨは同様の方法で適用可能である。
非限定的な実施例を示すことによって本発明を以下でさらに具体的に説明する。
実施例１
変異型ＧＤＨの発現
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨ（ＣｙＧＤＨ）としてバークホルデリア・セパシア由来のＣｙＧＤＨを使用した。このバークホルデリア・セパシア由来のＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号１のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。この配列に基づき、コードされるαサブユニットがＱＹＹ変異を有するように改変されたポリヌクレオチドを含むｐＴｒｃ９９Ａγα（ＱＹＹ）β、及びαサブユニットがＱＹＹ変異を有し、且つ、コードされるβサブユニットがアミノ酸位置３３０～４２５から構成される短縮型βサブユニットであるように改変されたポリヌクレオチドを含むｐＴｒｃ９９Ａγα（ＱＹＹ）β３３０－Ｈｉｓを使用した（米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書）。
変異型ＧＤＨの発現
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨ（ＣｙＧＤＨ）としてバークホルデリア・セパシア由来のＣｙＧＤＨを使用した。このバークホルデリア・セパシア由来のＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号１のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。この配列に基づき、コードされるαサブユニットがＱＹＹ変異を有するように改変されたポリヌクレオチドを含むｐＴｒｃ９９Ａγα（ＱＹＹ）β、及びαサブユニットがＱＹＹ変異を有し、且つ、コードされるβサブユニットがアミノ酸位置３３０～４２５から構成される短縮型βサブユニットであるように改変されたポリヌクレオチドを含むｐＴｒｃ９９Ａγα（ＱＹＹ）β３３０－Ｈｉｓを使用した（米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書）。
これらのベクターを使用して前記サブユニットに以下のアミノ酸置換が導入されるように部位特異的変異導入を実行した。変異体１は、γサブユニットの位置１５４がシステインで置換されており、βサブユニットの位置３４５がシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合が形成されている変異体である。変異体２は、γサブユニットの位置１５５がシステインで置換されており、βサブユニットの位置３４９がシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合が形成されている変異体である。変異体３は、αサブユニットの位置２０５がシステインで置換されており、βサブユニットの位置３８３がシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合が形成されている変異体である。変異体４は、αサブユニットの位置２０５がシステインで置換されており、βサブユニットの位置３８３がシステインで置換されており、これらのシステイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されており、βサブユニットの位置３４５がシステインで置換されており、γサブユニットの位置１５４がシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合（β－γジスルフィド結合）が形成されている変異体である。変異体５は、αサブユニットの位置２０５がシステインで置換されており、βサブユニットの位置３８３がシステインで置換されており、これらのシステイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されており、βサブユニットの位置３４９がシステインで置換されており、γサブユニットの位置１５５がシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合（β－γジスルフィド結合）が形成されている変異体である。
得られた各ベクターを使用して大腸菌を形質転換し、それにより生じた形質転換体を培養して各変異型ＧＤＨを発現させた。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
酵素活性の測定
各変異型ＧＤＨを各温度で１５分間にわたって加熱処理し、その後で米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＰＭＳ／ＤＣＩＰを使用する系を用いて酵素活性を測定した。
各変異型ＧＤＨを各温度で１５分間にわたって加熱処理し、その後で米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＰＭＳ／ＤＣＩＰを使用する系を用いて酵素活性を測定した。
結果が図１に示されている。システイン残基が導入されていないＱＹＹは５５℃から活性の激減を示し、一方で変異体１、変異体２、及び変異体３の場合では５５℃及び６５℃においても活性が維持された。
図２に示されているように、前記短縮型βサブユニットが使用され、且つ、そのサブユニットにシステインが導入されている場合では活性の減少がほとんど認められなかった。
その後、α－βジスルフィド結合とβ－γジスルフィド結合を形成するためにαサブユニットだけでなくγサブユニットにもシステインが導入されている変異体４及び変異体５について熱安定性を評価した。
結果として、図３に示されているように変異体４は７５℃において元の活性と比べて約３分の１まで活性の減少を示した。対照的に変異体５は正常型βサブユニット又は短縮型サブユニットのどちらについても７５℃において元の活性の約７０％を示し、高温でもその酵素の性能が低下する可能性が低いことを示した。
結果として、図３に示されているように変異体４は７５℃において元の活性と比べて約３分の１まで活性の減少を示した。対照的に変異体５は正常型βサブユニット又は短縮型サブユニットのどちらについても７５℃において元の活性の約７０％を示し、高温でもその酵素の性能が低下する可能性が低いことを示した。
その後、様々な長さの時間にわたって７５℃で加熱処理を実施した後に活性を調査した。結果として、変異体４及び変異体５はこの加熱処理の６０分後でも活性の維持を示した。特に、変異体５はこの加熱処理の６０分後でも元の活性の６０％以上が維持可能な高い熱安定性を有する酵素であることが分かった。
酵素電極の調製及びグルコースの測定
その後、変異体５を使用して酵素電極を調製し、この酵素電極をグルコース濃度の測定に使用した。
まず、単分子層形成分子を介して金表面に前記変異型を固定化することにより酵素電極を調製した。前記単分子層形成分子として以下に示されるＤＳＨを使用した。
その後、変異体５を使用して酵素電極を調製し、この酵素電極をグルコース濃度の測定に使用した。
まず、単分子層形成分子を介して金表面に前記変異型を固定化することにより酵素電極を調製した。前記単分子層形成分子として以下に示されるＤＳＨを使用した。
具体的には、金線（直径、０．５ｍｍ；長さ、６～７ｃｍ）を室温で２時間にわたってピラニア溶液（２００μｌ）中に浸漬し、その後にアセトンで洗浄した。その後、この線
をアセトン中のＤＳＨ溶液（濃度２０μＭ）中に浸漬し、２５℃で２４時間にわたってインキュベートしてＤＳＨのチオール基を金表面に結合させた。その後、この線をアセトンで洗浄し、その後で前記変異型ＧＤＨ（濃度、０．０３ｍｇ／ｍｌ）を含むリン酸緩衝液（３００μｌ）中に浸漬し、４℃で一晩にわたってインキュベートしてＤＳＨの官能基を介して前記変異型ＧＤＨを結合させることにより前記変異型ＧＤＨが表面上に固定化されている酵素電極を得た。
をアセトン中のＤＳＨ溶液（濃度２０μＭ）中に浸漬し、２５℃で２４時間にわたってインキュベートしてＤＳＨのチオール基を金表面に結合させた。その後、この線をアセトンで洗浄し、その後で前記変異型ＧＤＨ（濃度、０．０３ｍｇ／ｍｌ）を含むリン酸緩衝液（３００μｌ）中に浸漬し、４℃で一晩にわたってインキュベートしてＤＳＨの官能基を介して前記変異型ＧＤＨを結合させることにより前記変異型ＧＤＨが表面上に固定化されている酵素電極を得た。
上記の通り調製された前記酵素電極を使用して０ｍＭ（バックグラウンド）、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、又は５０ｍＭのグルコース水溶液に対する応答電流値をクロノアンペロメトリーによって測定した。対電極（プラチナ（Ｐｔ）線）及び基準電極（銀／塩化銀）を使用し、（銀／塩化銀と比べて）＋０．４Ｖの電位を前記作用電極に対して印加することにより３７℃でグルコース測定を実施した。
結果として、図５に示されているように応答電流のグルコース濃度依存性が分かった。
したがって、ジスルフィド結合によってサブユニットを相互に結合するためにシステインが導入されているＧＤＨを使用するセンサーを用いてグルコース濃度を測定できることが示された。さらに、驚くべきことにこれらのシステインの導入によって電極特性が改善されることが分かった。
したがって、ジスルフィド結合によってサブユニットを相互に結合するためにシステインが導入されているＧＤＨを使用するセンサーを用いてグルコース濃度を測定できることが示された。さらに、驚くべきことにこれらのシステインの導入によって電極特性が改善されることが分かった。
応答電流の連続測定
上記の通り調製された変異体５を担持する前記酵素電極を対電極（プラチナ（Ｐｔ）線）及び基準電極（銀／塩化銀）と共に室温で２０ｍＭのグルコース溶液中に浸漬した。（銀／塩化銀と比べて）＋０．２Ｖの電位を前記作用電極に印加することによって電流応答を連続的に４週間にわたって測定し、結果をシステイン残基が導入されていないＱＹＹ ＧＤＨを担持する前記酵素電極に対して比較した。図６に示されているように変異体５を担持する前記酵素電極の電流応答が４週間にわたって高いレベルで維持され、一方でＱＹＹ ＧＤＨを担持する前記酵素電極の電流応答は約４０％まで減少した。
上記の通り調製された変異体５を担持する前記酵素電極を対電極（プラチナ（Ｐｔ）線）及び基準電極（銀／塩化銀）と共に室温で２０ｍＭのグルコース溶液中に浸漬した。（銀／塩化銀と比べて）＋０．２Ｖの電位を前記作用電極に印加することによって電流応答を連続的に４週間にわたって測定し、結果をシステイン残基が導入されていないＱＹＹ ＧＤＨを担持する前記酵素電極に対して比較した。図６に示されているように変異体５を担持する前記酵素電極の電流応答が４週間にわたって高いレベルで維持され、一方でＱＹＹ ＧＤＨを担持する前記酵素電極の電流応答は約４０％まで減少した。
次に、変異体５を担持する前記酵素電極を対電極（プラチナ（Ｐｔ）線）及び基準電極（銀／塩化銀）と共に室温でグルコース溶液（０ｍＭ、１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、及び２０ｍＭ）中に浸漬した。（銀／塩化銀と比べて）＋０．２Ｖの電位を連続的に前記作用電極に対して印加し、応答電流を開示的に測定及びプロットし、結果をシステイン残基が導入されていないＱＹＹ ＧＤＨを担持する前記酵素電極に対して比較した。図７に示されているように変異体５を担持する前記酵素電極の電流応答のグルコース濃度依存性が約５週間にわたって維持され、一方でＱＹＹ ＧＤＨを担持する前記酵素電極の電流応答のグルコース濃度依存性が２６日目及び３４日目にほぼ失われた。
これらのデータはシステイン残基が導入された前記酵素が非常に安定しており、グルコースの長期測定に好適に使用可能であることを明確に示している。
これらのデータはシステイン残基が導入された前記酵素が非常に安定しており、グルコースの長期測定に好適に使用可能であることを明確に示している。
実施例２
エウィンゲラ・アメリカナ由来の変異型ＧＤＨの調製及び耐熱性の評価
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨとしてエウィンゲラ・アメリカナ由来のＣｙＧＤＨを使用した。このエウィンゲラ・アメリカナ由来のＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号５のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。このＣｙＧＤＨ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａに挿入した。
エウィンゲラ・アメリカナ由来の変異型ＧＤＨの調製及び耐熱性の評価
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨとしてエウィンゲラ・アメリカナ由来のＣｙＧＤＨを使用した。このエウィンゲラ・アメリカナ由来のＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号５のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。このＣｙＧＤＨ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａに挿入した。
このベクターを使用して前記サブユニットに以下のアミノ酸置換が導入されるように部位特異的変異導入を実行した。変異体Ｅは、αサブユニットの位置２０２がシステインで置換されており、βサブユニットの位置３７５がシステインで置換されており、これらの
システイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されており、βサブユニットの位置３４１がシステインで置換されており、γサブユニットの位置１５７がシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合（β－γジスルフィド結合）が形成されている変異体である。
システイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されており、βサブユニットの位置３４１がシステインで置換されており、γサブユニットの位置１５７がシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合（β－γジスルフィド結合）が形成されている変異体である。
得られた各ベクターを使用して大腸菌を形質転換し、それにより生じた形質転換体を培養して前記変異型ＧＤＨを発現させた。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
酵素活性の測定
前記変異型ＧＤＨを６５℃で加熱処理し、米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＰＭＳ／ＤＣＩＰを使用する系を用いて酵素活性を測定し、そして酵素活性の時間依存的変化をプロットした。
前記変異型ＧＤＨを６５℃で加熱処理し、米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＰＭＳ／ＤＣＩＰを使用する系を用いて酵素活性を測定し、そして酵素活性の時間依存的変化をプロットした。
結果が図８に示されている。システイン残基が導入されていない野生型ＧＤＨは６５℃で活性の激減を示し、一方でα－βジスルフィド結合及びβ－γジスルフィド結合を有する前記変異型ＧＤＨの活性は６５℃において３０分間にわたって維持された。
実施例３
シルビモナス・テラエ由来の変異型ＧＤＨの調製及び耐熱性の評価
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨとしてシルビモナス・テラエ由来のＣｙＧＤＨを使用した。このＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号１１のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。このＣｙＧＤＨ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａに挿入した。
シルビモナス・テラエ由来の変異型ＧＤＨの調製及び耐熱性の評価
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨとしてシルビモナス・テラエ由来のＣｙＧＤＨを使用した。このＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号１１のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。このＣｙＧＤＨ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａに挿入した。
このベクターを使用して前記サブユニットに以下のアミノ酸置換が導入されるように部位特異的変異導入を実行した。２つの変異型ＣｙＧＤＨを作成した。一つは、αサブユニットの位置２０４のプロリンがシステインで置換されており、βサブユニットの位置３８２のヒスチジンがシステインで置換されており、これらのシステイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されており、βサブユニットの位置３４７のアラニンがシステインで置換されており、γサブユニットの位置１６８のアラニンがシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合（β－γジスルフィド結合）が形成されている変異体(αP204CβH382C-γA168CβA347C)である。もう一つは
、αサブユニットの位置２０４のプロリンがシステインで置換されており、βサブユニットの位置３８２のヒスチジンがシステインで置換されており、これらのシステイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されている変異体(αP204CβH382C)である。
、αサブユニットの位置２０４のプロリンがシステインで置換されており、βサブユニットの位置３８２のヒスチジンがシステインで置換されており、これらのシステイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されている変異体(αP204CβH382C)である。
得られた各ベクターを使用して大腸菌を形質転換し、それにより生じた形質転換体を培養して前記変異型ＧＤＨを発現させた。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
酵素活性の測定
前記変異型ＧＤＨを６０℃で加熱処理し、米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＲｕ／ＭＴＴを使用する系を用いて酵素活性を測定し、そして酵素活性の時間依存的変化をプロットした。
前記変異型ＧＤＨを６０℃で加熱処理し、米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＲｕ／ＭＴＴを使用する系を用いて酵素活性を測定し、そして酵素活性の時間依存的変化をプロットした。
結果が図１２に示されている。システイン残基が導入されていない野生型ＧＤＨは温度の増加とともに活性が激減したが、α－βジスルフィド結合を有する変異型ＧＤＨは熱安定性の向上を示し、α－βジスルフィド結合及びβ－γジスルフィド結合を有する変異型ＧＤＨの活性は６０℃まで維持された。また、図１３に示されるように、システイン残基が導入されていない野生型ＧＤＨは６０℃で活性の激減を示し、一方でα－βジスルフィド結合を有する変異型ＧＤＨは熱安定性の向上を示し、α－βジスルフィド結合及びβ－γジスルフィド結合を有する前記変異型ＧＤＨの活性は６０℃において３０分間にわたって維持された。
実施例４
ザイモバクター・パルマエ由来の変異型ＧＤＨの調製及び耐熱性の評価
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨとしてザイモバクター・パルマエ由来のＣｙＧＤＨを使用した。このＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号１５のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。配列番号１５のヌクレオチド配列において、位置５５のｇをａに置換して、配列番号１６のアミノ酸配列の位置１９のバリンがメチオニンに置換されてγサブユニットがこの位置から翻訳される改変型ＣｙＧＤＨ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａに挿入した。
ザイモバクター・パルマエ由来の変異型ＧＤＨの調製及び耐熱性の評価
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨとしてザイモバクター・パルマエ由来のＣｙＧＤＨを使用した。このＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号１５のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。配列番号１５のヌクレオチド配列において、位置５５のｇをａに置換して、配列番号１６のアミノ酸配列の位置１９のバリンがメチオニンに置換されてγサブユニットがこの位置から翻訳される改変型ＣｙＧＤＨ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａに挿入した。
このベクターを使用して前記サブユニットに以下のアミノ酸置換が導入されるように部位特異的変異導入を実行した。２つの変異型ＣｙＧＤＨを作成した。一つは、αサブユニットの位置２００のプロリンがシステインで置換されており、βサブユニットの位置３８９のアスパラギン酸がシステインで置換されており、これらのシステイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されており、βサブユニットの位置３５５のチロシンがシステインで置換されており、γサブユニットの位置１６４のアルギニン（配列番号１６の位置１８２のアルギニンに相当）がシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合（β－γジスルフィド結合）が形成されている変異体(αP200CβD389C-γR182CβY355C)である。もう一つは、αサブユニットの位置２００
のプロリンがシステインで置換されており、βサブユニットの位置３８９のアスパラギン酸がシステインで置換されており、これらのシステイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されている変異体(αP200CβD389C)である。
のプロリンがシステインで置換されており、βサブユニットの位置３８９のアスパラギン酸がシステインで置換されており、これらのシステイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されている変異体(αP200CβD389C)である。
得られた各ベクターを使用して大腸菌を形質転換し、それにより生じた形質転換体を培養して前記変異型ＧＤＨを発現させた。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
酵素活性の測定
前記変異型ＧＤＨを６０℃で加熱処理し、米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＲｕ／ＭＴＴを使用する系を用いて酵素活性を測定し、そして酵素活性の時間依存的変化をプロットした。
前記変異型ＧＤＨを６０℃で加熱処理し、米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＲｕ／ＭＴＴを使用する系を用いて酵素活性を測定し、そして酵素活性の時間依存的変化をプロットした。
結果が図１４に示されている。システイン残基が導入されていない野生型ＧＤＨは温度の増加とともに活性が激減したが、α－βジスルフィド結合を有する変異型ＧＤＨおよびα－βジスルフィド結合及びβ－γジスルフィド結合を有する変異型ＧＤＨの活性は６５℃まで維持された。また、図１５に示されるように、システイン残基が導入されていない野生型ＧＤＨは６０℃で活性がゼロになるまで激減し、一方でα－βジスルフィド結合を有する変異型ＧＤＨおよびα－βジスルフィド結合及びβ－γジスルフィド結合を有する変異型ＧＤＨの活性は６０℃において３０分間にわたって維持された。
実施例５
コベティア エスピー由来の変異型ＧＤＨの調製及び耐熱性の評価
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨとしてコベティア エスピー由来のＣｙＧ
ＤＨを使用した。このＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号１９のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。配列番号１９のヌクレオチド配列において、位置４０～４２のａｔｇを開始コドンとし、γサブユニットが、配列番号２０のアミノ酸配列の位置１４のメチオニンから翻訳されるＣｙＧＤＨ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａに挿入した。
コベティア エスピー由来の変異型ＧＤＨの調製及び耐熱性の評価
シトクロムＣ含有サブユニットを含むＧＤＨとしてコベティア エスピー由来のＣｙＧ
ＤＨを使用した。このＣｙＧＤＨはγサブユニット、αサブユニット、及びβサブユニットから構成されるオリゴマー酵素である。これらの３サブユニットは配列番号１９のヌクレオチド配列を有する遺伝子にコードされている。配列番号１９のヌクレオチド配列において、位置４０～４２のａｔｇを開始コドンとし、γサブユニットが、配列番号２０のアミノ酸配列の位置１４のメチオニンから翻訳されるＣｙＧＤＨ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａに挿入した。
このベクターを使用して前記サブユニットに以下のアミノ酸置換が導入されるように部位特異的変異導入を実行した。１つの変異型ＣｙＧＤＨを作成した。その変異型ＣｙＧＤＨでは、αサブユニットの位置２０４のプロリンがシステインで置換されており、βサブユニットの位置４６７のセリンがシステインで置換されており、これらのシステイン間でジスルフィド結合（α－βジスルフィド結合）が形成されており、βサブユニットの位置４３３のチロシンがシステインで置換されており、γサブユニットの位置１８５のグルタミン（配列番号２０の位置１９８のグルタミンに相当）がシステインで置換されており、そしてこれらのシステイン間でジスルフィド結合（β－γジスルフィド結合）が形成されている変異体(αP204CβS467C-γQ198CβY433C)である。
得られた各ベクターを使用して大腸菌を形質転換し、それにより生じた形質転換体を培養して前記変異型ＧＤＨを発現させた。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法によって培養及びグルコース脱水素酵素の精製を実施した。
酵素活性の測定
前記変異型ＧＤＨを６０℃で加熱処理し、米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＲｕ／ＭＴＴを使用する系を用いて酵素活性を測定し、そして酵素活性の時間依存的変化をプロットした。
前記変異型ＧＤＨを６０℃で加熱処理し、米国特許出願公開第２０１９－００１０２１５号明細書に記載される方法に従ってＲｕ／ＭＴＴを使用する系を用いて酵素活性を測定し、そして酵素活性の時間依存的変化をプロットした。
結果が図１６に示されている。システイン残基が導入されていない野生型ＧＤＨは温度の増加とともに活性が低下したが、α－βジスルフィド結合及びβ－γジスルフィド結合を有する変異型ＧＤＨの活性は６０℃まで維持された。また、図１７に示されるように、システイン残基が導入されていない野生型ＧＤＨは６０℃で活性がゼロになるまで激減し、一方でα－βジスルフィド結合及びβ－γジスルフィド結合を有する変異型ＧＤＨの活性は６０℃において３０分間にわたって維持された。
これらのデータは起源が様々なオリゴマーＧＤＨ酵素の安定性を向上させるためにジスルフィド結合の形成も効果的であることを明確に示している。
本明細書において引用されている特許及び特許出願並びに非特許文書を含む全ての刊行物の内容は、全ての内容が明確に説明された場合と同程度に参照により本明細書に援用される。
Claims (19)
- 触媒サブユニット、
電子伝達サブユニット、及び
ヒッチハイカーサブユニット
を含む変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素であって、前記触媒サブユニットのアミノ酸配列と前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列の各々がその中に導入されたシステイン残基を含み、前記触媒サブユニット及び前記電子伝達サブユニットが前記システイン残基間のジスルフィド結合を介して相互に結合している、変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。 - 前記触媒サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸位置２００～２４０の領域に対応する領域内に導入されたシステイン残基を含む、請求項１に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記触媒サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号３の位置２０５のプロリン残基、位置２０８のグリシン残基、位置２１５のアスパラギン残基、位置２２４のイソロイシン残基、又は位置２３５のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基の位置に導入されたシステイン残基を含む、請求項２に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号４のアミノ酸位置３３０～４００の領域に対応する領域内に導入されたシステイン残基を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号４の位置３３６のスレオニン残基、位置３８５のグリシン残基、位置３８３のアスパラギン酸残基、又は位置３９１のチロシン残基に対応するアミノ酸残基の位置に導入されたシステイン残基を含む、請求項４に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列がその中に導入された別のシステイン残基を含み、且つ、前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列がその中に導入されたシステイン残基を含み、前記システイン残基間のジスルフィド結合を介して前記ヒッチハイカーサブユニット及び前記電子伝達サブユニットが相互に結合している、請求項１～５のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号４のアミノ酸位置３４１～３５０の領域に対応する領域内に導入された別のシステイン残基を含む、請求項６に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号４の位置３４５のスレオニン残基、位置３４６のプロリン残基、又は位置３４９のチロシン残基に対応するアミノ酸残基の位置に置換されることで導入された別のシステイン残基を含む、請求項７に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸位置１４０～１６０の領域に対応する領域内に導入されたシステイン残基を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列が、配列番号２の位置１４５のスレオニン残基、位置１５４のアスパラギン残基、又は位置１５５のリジン残基に対応するアミ
ノ酸残基の位置に置換されることで導入されたシステイン残基を含む、請求項９に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。 - 前記触媒サブユニットのアミノ酸配列が配列番号３に対して少なくとも６０％の同一性を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記電子伝達サブユニットのアミノ酸配列が
配列番号４のアミノ酸配列、又は
配列番号４のアミノ酸位置３１４～４２５のアミノ酸配列
に対して少なくとも６０％の同一性を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。 - 前記ヒッチハイカーサブユニットのアミノ酸配列が配列番号２に対して少なくとも６０％の同一性を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。
- 前記触媒サブユニットが配列番号７に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、システインが配列番号７中の位置２０２のプロリン残基、位置２０５のグリシン残基、位置２１２のアスパラギン残基、位置２２１のイソロイシン残基、又は位置２３２のグルタミン酸残基に対応する位置に導入されており、
前記電子伝達サブユニットが配列番号８又は配列番号８のアミノ酸３０６～４２０に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、第１のシステインが配列番号８中の位置３２８のセリン残基、位置３７５のグルタミン残基、位置３７７のフェニルアラニン残基または位置３８３のアスパラギン酸残基に対応する位置に導入されており、第２のシステインが配列番号８中の位置３３７のセリン残基、位置３３８のグルタミン残基、または位置３４１のチロシン残基に対応する位置に導入されており、且つ、
前記ヒッチハイカーサブユニットが配列番号６に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、システインが配列番号６中の位置１４７のバリン残基、位置１５６のアスパラギン残基、又は位置１５７のアルギニン残基に対応する位置に導入されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。 - 前記触媒サブユニットが配列番号１３に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、システインが配列番号１３中の位置２０４のプロリン残基に対応する位置に導入されており、
前記電子伝達サブユニットが配列番号１４又は配列番号１４のアミノ酸３３２～４８１に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、第１のシステインが配列番号１４中の位置３８２のヒスチジン残基に対応する位置に導入されており、第２のシステインが配列番号１４中の位置３４７のアラニン残基に対応する位置に導入されており、且つ、
前記ヒッチハイカーサブユニットが配列番号１２に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、システインが配列番号１２中の位置１６８のアラニン残基に対応する位置に導入されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。 - 前記触媒サブユニットが配列番号１７に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、システインが配列番号１７中の位置２００のプロリン残基に対応する位置に導入されており、
前記電子伝達サブユニットが配列番号１８又は配列番号１８のアミノ酸３４０～４６５
に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、第１のシステインが配列番号１８中の位置３８９のアスパラギン酸残基に対応する位置に導入されており、第２のシステインが配列番号１８中の位置３５５のチロシン残基に対応する位置に導入されており、且つ、
前記ヒッチハイカーサブユニットが配列番号１６または配列番号１６のアミノ酸１９～１９５に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、システインが配列番号１６中の位置１８２のアルギニン残基に対応する位置に導入されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。 - 前記触媒サブユニットが配列番号２１に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、システインが配列番号２１中の位置２０４のプロリン残基に対応する位置に導入されており、
前記電子伝達サブユニットが配列番号２２又は配列番号２２のアミノ酸４１８～５２２に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、第１のシステインが配列番号２２中の位置４６７のセリン残基に対応する位置に導入されており、第２のシステインが配列番号２２中の位置４３３のチロシン残基に対応する位置に導入されており、且つ、
前記ヒッチハイカーサブユニットが配列番号２０または配列番号２０のアミノ酸１４～２０７に対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、システインが配列番号２０中の位置１９８のグルタミン残基に対応する位置に導入されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素。 - 請求項１～１７のいずれか一項に記載のＦＡＤ依存性グルコース脱水素酵素を含む酵素電極。
- 請求項１８に記載の酵素電極を含むバイオセンサー。
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