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JP2020504074A - クマリン化合物および蛍光標識としてのそれらの使用 - Google Patents

クマリン化合物および蛍光標識としてのそれらの使用 Download PDF

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JP2020504074A JP2018566875A JP2018566875A JP2020504074A JP 2020504074 A JP2020504074 A JP 2020504074A JP 2018566875 A JP2018566875 A JP 2018566875A JP 2018566875 A JP2018566875 A JP 2018566875A JP 2020504074 A JP2020504074 A JP 2020504074A
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Abstract

本出願は、新規クマリン化合物および蛍光標識としてのそれらの使用に関する。化合物は、核酸配列決定用途におけるヌクレオチドの蛍光標識として使用され得る。

Description

本出願は、クマリン化合物に関する。化合物は、特に、核酸配列決定用途におけるヌクレオチド標識のための蛍光標識として使用され得る。
蛍光標識を利用する核酸の非放射性検出は、分子生物学における重要な技術である。組み換えDNA技術において用いられる多くの手順は、以前は、例えば32Pで放射性標識されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に依存していた。放射性化合物は、目的の核酸および他の分子の高感度検出を可能にする。しかしながら、放射性同位元素の使用には、それらの費用、限られた貯蔵寿命およびより重要なことに安全上の配慮などの重大な制限がある。放射性標識の必要性を排除することは、環境への影響、および例えば試薬廃棄に関連する費用を削減しながら、安全性を高める。非放射性蛍光検出に適した方法には、非限定的な例として、自動DNA配列決定、ハイブリダイゼーション方法、ポリメラーゼ連鎖反応生成物のリアルタイム検出および免疫測定法が挙げられる。
多くの用途に対して、空間的に重なり合う複数の検体の独立した検出を達成するために、スペクトル的に区別可能な複数の蛍光標識を使用することが望ましい。そのような多重方法では、反応容器の数を減らして実験プロトコルを単純化することと、特定用途向け試薬キットの製造を容易にすることが可能である。例えば、多色自動DNA配列決定システムでは、多重蛍光検出は、単一の電気泳動レーン内でいくつかの異なるヌクレオチド塩基の分析を可能にする。これにより、単色を使用する検出システムよりも処理量が増加し、レーン間の電気泳動移動度の変動に関連する不確実性も軽減できる。
しかしながら、多重蛍光検出は問題を含む可能性があり、蛍光標識の選択を制限する多くの重要な要因がある。第1に、吸収および発光スペクトルが適切にスペクトル分解される色素化合物を見つけることは困難である。さらに、いくつかの蛍光色素が一緒に使用される場合、異なるスペクトル領域に対する色素の吸収帯が広く分離され得るため、同時励起は困難となり得る。多くの励起方法は高出力レーザーを使用し、したがって色素は、そのようなレーザー励起に耐えるのに十分な光安定性を有していなければならない。分子生物学的方法において特に重要な最終検討は、蛍光色素が試薬化学と相性が良くなければならないということである。したがって、例えば、DNA合成または配列決定反応において使用される蛍光色素は、それらの反応で使用される溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素およびリガーゼ酵素と相性が良くなければならない。一例では、PCT公開番号WO 2007/135368は、蛍光標識として使用されるローダミン化合物のクラスを記載している。
クマリン色素ファミリーは、それらの顕著なスペクトル特性のために、化学者の注目を集めている。それにもかかわらず、市販されている大きなストークスシフト（LSS）を有する光安定性蛍光色素は、わずか数種である。これらの色素のほとんどは、足場としてクマリンフラグメントも含む。例えば、Dyomicsからの色素のほとんどは、約480〜520nmで吸収し、560〜630の領域で発光するクマリン誘導体である。このクラスのクマリン色素の他の例には、米国特許出願公開第2014/0220588に開示されているようなリン酸化クマリン系色素、ならびにAbberiorから市販されている色素Star440SXPおよびStar 470SXPが挙げられる。別の特に実用的なクマリン色素は、434nmおよび539nmにそれぞれ最大吸収および最大発光を有するAlexaFluor（商標）430である。他のLSS蛍光色素には、Pacific Orange（商標）（吸収390nm、発光540nm；ストークスシフト150nm、Invitrogen）およびBD Horizon（商標）V500（吸収415nm、発光500nm；ストークスシフト85nm、BD Biosciences）Chromeo（商標）494（吸収494nm、発光628nm、ストークスシフト134nm、Active Motive）が挙げられる。
本明細書に記載されているのは、新規クマリン誘導体、および生体分子標識としての、特に核酸配列決定に使用されるヌクレオチドの標識としてのそれらの使用である。そのような色素が生体分子コンジュゲートの調製に使用される場合、これらの新規蛍光化合物の使用により得られる配列決定読み取りの長さ、強度および質における改善を見ることができる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、式（I）のクマリン化合物、それらの塩またはメソメリー形態に関する：

［式中、R1は

であり、ここで、R1は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C-カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたシクロアルキル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択される1つ以上の置換基で任意に置換され；
各R2、R3、R4、R5、およびR9は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
各R6、R10a、R10bおよびR10cは、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
各R7およびR8は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
あるいは、R6およびR7は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換された5〜10員ヘテロアリールまたは任意に置換された5〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択される環または環系を形成し；
Xは、O、S、NR11、およびSeからなる群より選択され；
R11は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；ならびに
実線と破線とで表される結合
は、単結合および二重結合からなる群より選択されるが、ただし、
が二重結合の場合、R3は存在しない］。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、少なくとも約60nmのストークスシフトを有する式（II）の蛍光化合物、それらの塩、またはメソメリー形態に関する：

［式中、RHetは、1つ以上のR10で任意に置換された5〜10員ヘテロアリールであり；
各R1、R2、R3、R4、およびR5は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
R6は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
各R7およびR8は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
あるいは、R6およびR7は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換された5〜10員ヘテロアリールまたは任意に置換された5〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択される環または環系を形成し；
各R10は、独立して、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
実線と破線とで表される結合
は、単結合および二重結合からなる群より選択されるが、ただし、
が二重結合の場合、R3は存在しない］。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、式（I）または式（II）の化合物で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、1つ以上のヌクレオチドを含むキットであって、ここで少なくとも1つのヌクレオチドが本明細書に記載の標識ヌクレオチドであるキットに関する。
本明細書に記載のいくつかのさらなる実施形態は、本明細書に記載の標識ヌクレオチドを配列決定アッセイに組み込む工程、および標識ヌクレオチドを検出する工程を含む配列決定方法に関する。
本明細書に記載のような新規クマリン色素I-16で標識されたA‐ヌクレオチドの、配列決定分析に対する有用性を示す。 長いストークスシフトを有する市販の蛍光色素DY510XLで標識されたA‐ヌクレオチドの、配列決定分析に対する有用性を示す。 長いストークスシフトを有する市販の蛍光色素Chromeo494で標識されたAヌクレオチドの、配列決定分析に対する有用性を示す。
本明細書に記載の実施形態は、蛍光標識として使用するための、式（I）の構造の新規クマリン色素およびそれらの誘導体に関する。さらなる実施形態は、少なくとも約60nmのストークスシフトを有する式（II）の構造の蛍光化合物に関する。
これらの新規蛍光色素は、特に核酸配列決定用途におけるヌクレオチド標識のための蛍光標識として使用され得る。これらの蛍光色素を調製する方法およびこれらの色素を利用する下流配列決定用途も例示される。
驚くべきことに、新規色素およびそれらのバイオコンジュゲートの蛍光強度は、青色または緑色のいずれかの光源で照射したときにほぼ等しいことが発見された。例えば、色素が460nm（青色）および540nm（緑色）のレーザーまたはLEDで励起されるとき、蛍光強度はいくつかの例ではほぼ同じである。後述するように、この性質は溶液中およびフローセル上で成り立ち、高品質の単純化された配列決定分析を可能にする。
（式（I）の化合物）
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、式（I）の新規クマリン誘導体、またはそれらの塩、メソメリー形態に関する：

［式中、R1は

であり、ここで、R1は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C-カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたシクロアルキル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択される1つ以上の置換基で任意に置換され；
各R2、R3、R4、R5、およびR9は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
各R6、R10a、R10bおよびR10cは、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
各R7およびR8は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
あるいは、R6およびR7は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換された5〜10員ヘテロアリールまたは任意に置換された5〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択される環または環系を形成し；
Xは、O、S、NR11、およびSeからなる群より選択され；
R11は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；ならびに
実線と破線とで表される結合
は、単結合および二重結合からなる群より選択されるが、ただし、
が二重結合の場合、R3は存在しない］。
式（I）の化合物のいくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルキルまたは置換アルキルは、C1-12アルキル、またはより好ましくはC1-6アルキルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルコキシは、C1-12アルコキシ、またはより好ましくはC1-6アルコキシである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルケニルおよびアルキニル基は、C2-6アルケニルおよびC2-6アルキニルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル基は、C1-12ハロアルキル、C1-12ハロアルコキシ、C1-12アミノアルキル、C1-12ヒドロキシアルキルおよびC1-12ヘテロアルキルである；より好ましくは、C1-6ハロアルキル、C1-6ハロアルコキシ、C1-6アミノアルキル、C1-6ヒドロキシアルキルおよびC1-6ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルコキシアルキル基は、C1-6アルコキシ（C1-6アルキル）である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意に置換されたアリールは、任意に置換されたC6-10アリール、例えばフェニルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意に置換されたヘテロアリールは、任意に置換された5〜10員ヘテロアリールである；より好ましくは、任意に置換された5〜6員ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意に置換されたカルボシクリルは、任意に置換された3〜7員カルボシクリル、特に3〜7員シクロアルキルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意に置換されたヘテロシクリルは、任意に置換された3〜7員ヘテロシクリル、より好ましくは5〜6員ヘテロシクリルである。
式（I）の化合物のいくつかの実施形態では、R2からR9のいずれかは、カルボキシル（-CO2H）またはカルボキシレート(CO2￣)、スルホ（SO3H）またはスルホネート（SO3 -）基から選択される1つ以上の置換基で置換されたアルキルから選択され得る。いくつかのそのような実施形態では、式（I）の化合物は、有機または無機カチオンを有するそれらの塩形態の式（I'）でも表される：

［式中、Kは有機または無機カチオンであり、nは1〜20から選択される整数である］。
式（I）または（I'）の化合物のいくつかの実施形態では、R1は

である。いくつかのそのような実施形態では、XはOである。いくつかの他の実施形態では、XはOである。いくつかのそのような実施形態では、式（I）の化合物は、式（Ia）でも表される：

いくつかの実施形態では、R1は、アルキル、ハロ、およびC‐カルボキシからなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されている。一実施形態では、R1はクロロ（すなわち、‐Cl）で置換されている。別の実施形態では、R1はカルボキシル（すなわち、-C(O)OH）で置換されている。
式（I）または（I'）の化合物のいくつかの実施形態では、R1は

である。いくつかの他の実施形態では、R1は

である。R10a、R10bまたはR10cが、窒素原子上に正電荷を持つピリジル基に結合している場合、R10a、R10bまたはR10cは負電荷を持つことができ、その結果R1は全体として電荷中性であることが理解される。あるいは、R10a、R10bまたはR10cが、窒素原子上に正電荷を持つピリジル基に結合している場合、本明細書に記載の化合物は対イオンを含有することができ、その結果化合物は全体として電荷中性である。いくつかのそのような実施形態では、R10a、R10bまたはR10cは、置換アルキル、例えば、置換C1、C2、C3、C4、C5、またはC6アルキルである。いくつかのそのような実施形態では、アルキルは、カルボキシル（-CO2H）、カルボキシレート（CO2 -）、スルホ（SO3H）、またはスルホネート（SO3 -）で置換されている。いくつかのそのような実施形態では、式（I）の化合物は、式（Ib）および（Ic）またはそれらの塩である式（Ib'）および（Ic'）でも表される：

［式中、YはIbと電荷中性化合物を形成することができるアニオンである。いくつかの実施形態では、Yは有機酸または無機酸から誘導されるアニオンである。いくつかの実施形態では、Yはハロゲンアニオンである。
式（I）、（I'）、（Ia）、（Ib）、（Ib'）、（Ic）、または（Ic'）の化合物のいくつかの実施形態では、実線と破線とで表される結合
は二重結合であり、化合物は、式（I‐1）、（I'‐1）、（Ia‐1）、（Ib‐1）、（Ib'‐1）、（Ic‐1）、または（Ic'‐1）でも表される：
式（I）、（I‐1）、（I'‐1）、（Ia‐1）、（Ib‐1）、（Ib'‐1）、（Ic‐1）、または（Ic'‐1）の化合物のいくつかの実施形態では、R2はアルキルである。一実施形態では、R2はメチルである。いくつかの他の実施形態では、R2はHである。
式（I）、（I‐1）、（I'‐1）、（Ia‐1）、（Ib‐1）、（Ib'‐1）、（Ic‐1）、または（Ic'‐1）の化合物のいくつかの実施形態では、R4およびR5の少なくとも一方はアルキルである。いくつかのそのような実施形態では、各R4およびR5はアルキルである。一実施形態では、R4およびR5の両方がメチルである。いくつかの代替実施形態では、R4およびR5の少なくとも一方はHである。そのような一実施形態では、R4およびR5の両方がHである。
式（I）、（I'）、（Ia）、（Ib）または（Ib'）の化合物のいくつかの実施形態では、実線と破線とで表される結合
は単結合であり、化合物は式（I‐2）、（I'‐2）、（Ia‐2）、（Ib‐2）、（Ib'‐2）、（Ic‐2）、または（Ic'‐2）でも表される：
式（I）、（I‐2）、（I'‐2）、（Ia‐2）、（Ib‐2）、（Ib'‐2）、（Ic‐2）、または（Ic'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R2およびR3の少なくとも一方はアルキルである。いくつかのさらなる実施形態では、R2およびR3の両方がアルキルである。一実施形態では、R2およびR3の両方がメチルである。いくつかの他の実施形態では、R2およびR3の少なくとも一方はHである。一実施形態では、R2およびR3の両方がHである。
式（I）、（I‐2）、（I'‐2）、（Ia‐2）、（Ib‐2）、（Ib'‐2）、（Ic‐2）、または（Ic'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R4およびR5の少なくとも一方はHである。そのような一実施形態では、R4およびR5の両方がHである。いくつかの代替実施形態では、R4およびR5の少なくとも一方はアルキルである。いくつかのそのような実施形態では、各R4およびR5はアルキルである。一実施形態では、R4およびR5の両方がメチルである。
式（I）、（I'）、（I‐1）、（I'‐1）、（Ia‐1）、（Ib‐1）、（Ib'‐1）、（Ic‐1）、（Ic'‐1）、（I‐2）、（I'‐2）、（Ia‐2）、（Ib‐2）、（Ib'‐2）、（Ic‐2）、または（Ic'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R6は置換アルキル、例えば、置換C1、C2、C3、C4、C5、またはC6アルキルである。一実施形態では、R6はカルボキシルで置換されたアルキルである。いくつかの実施形態では、R6は‐C(O)OR12で置換されたアルキルであり、ここでR12は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、および任意に置換された3〜7員シクロアルキルからなる群より選択される。そのような一実施形態では、R12はアルキル、例えばメチル、エチル、またはｔ‐ブチルである。いくつかのさらなる実施形態では、R6は‐C(O)NR13R14で置換されたアルキルであり、ここで各R13およびR14は、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換された3〜7員シクロアルキルから選択される。いくつかのさらなる実施形態では、R13およびR14は、独立して、カルボキシル、カルボキシレート、‐C(O)OR11、スルホおよびスルホネートからなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されたアルキルから選択される。
式（I）、（I'）、（I‐1）、（I'‐1）、（Ia‐1）、（Ib‐1）、（Ib'‐1）、（Ic‐1）、（Ic'‐1）、（I‐2）、（I'‐2）、（Ia‐2）、（Ib‐2）、（Ib'‐2）、（Ic‐2）、または（Ic'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R7はHである。
式（I）、（I'）、（I‐1）、（I'‐1）、（Ia‐1）、（Ib‐1）、（Ib'‐1）、（I‐2）、（I'‐2）、（Ia‐2）、（Ib‐2）、または（Ib'‐2）の化合物のいくつかの代替実施形態では、R6およびR7は、それらが結合している原子と一緒になってつながり、任意に置換された3〜10員ヘテロシクリル、例えば、任意に置換された6員ヘテロシクリルを形成する。いくつかのそのような実施形態では、任意に置換されたヘテロシクリルは1個のヘテロ原子を含む。いくつかのそのような実施形態では、任意に置換されたヘテロシクリルは、1つ以上のアルキル、例えばメチルで置換されている。
式（I）、（I'）、（I‐1）、（I'‐1）、（Ia‐1）、（Ib‐1）、（Ib'‐1）、（Ic‐1）、（Ic'‐1）、（I‐2）、（I'‐2）、（Ia‐2）、（Ib‐2）、（Ib'‐2）、（Ic‐2）、または（Ic'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R8はHである。
式（I）、（I'）、（I‐1）、（I'‐1）、（Ia‐1）、（Ib‐1）、（Ib'‐1）、（Ic‐1）、（Ic'‐1）、（I‐2）、（I'‐2）、（Ia‐2）、（Ib‐2）、（Ib'‐2）、（Ic‐2）、または（Ic'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R9はHである。
いくつかの特定の実施形態では、式（I）の例示的化合物には、以下の表１に示されるように、化合物I‐1〜I‐20および化合物I‐22〜I‐32が挙げられる。
式（I）の化合物のいくつかの実施形態では、化合物はR6を介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、ここで、R6は、置換アルキル、例えば置換C1、C2、C3、C4、C5、またはC6アルキルである。一実施形態では、R6はカルボキシルで置換されたアルキルである。
いくつかの代替実施形態では、化合物はR8を介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、ここで、R8は、置換アルキル、例えば置換C1、C2、C3、C4、C5、またはC6アルキルである。一実施形態では、R8はカルボキシルで置換されたアルキルである。
いくつかの代替実施形態では、化合物は、R10a、R10b、もしくはR10cを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、ここで、R10a、R10b、またはR10cの各々は、置換アルキル、例えば、置換C1、C2、C3、C4、C5、またはC6アルキルである。一実施形態では、R10a、R10b、またはR10cの各々は、カルボキシルで置換されたアルキルである。
いくつかの実施形態では、式（I）の化合物の構造は、1つ以上のメソメリー形態で表される：
（式（II）の化合物）
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、少なくとも約60nmのストークスシフトを有する式（II）の蛍光化合物、またはそれらの塩、メソメリー形態に関する：

［式中、RHetは、1つ以上のR10で任意に置換された5〜10員ヘテロアリールであり；
各R1、R2、R3、R4、およびR5は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
R6は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
各R7およびR8は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
あるいは、R6およびR7は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換された5〜10員ヘテロアリールまたは任意に置換された5〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択される環または環系を形成し；
各R10は、独立して、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
実線と破線とで表される結合
は、単結合および二重結合からなる群より選択されるが、ただし、
が二重結合の場合、R3は存在しない］。
いくつかの実施形態では、式（II）の蛍光化合物は、約60nm〜約100nm、または約60nm〜約90nmの範囲のストークスシフトを有する。
式（II）の化合物のいくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルキルまたは置換アルキルは、C1-12アルキル、またはより好ましくはC1-6アルキルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルコキシは、C1-12アルコキシ、またはより好ましくはC1-6アルコキシである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルケニルおよびアルキニル基は、C2-6アルケニルおよびC2-6アルキニルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるハロアルキル、ハロアルコキシ、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル基は、C1-12ハロアルキル、C1-12ハロアルコキシ、C1-12アミノアルキル、C1-12ヒドロキシアルキルおよびC1-12ヘテロアルキルである；より好ましくは、C1-6ハロアルキル、C1-6ハロアルコキシ、C1-6アミノアルキル、C1-6ヒドロキシアルキルおよびC1-6ヘテロアルキルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルコキシアルキル基は、C1-6アルコキシ（C1-6アルキル）である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意に置換されたアリールは、任意に置換されたC6-10アリール、例えばフェニルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意に置換されたヘテロアリールは、任意に置換された5〜10員ヘテロアリールである；より好ましくは、任意に置換された5〜6員ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意に置換されたカルボシクリルは、任意に置換された3〜7員カルボシクリル、特に3〜7員シクロアルキルである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意に置換されたヘテロシクリルは、任意に置換された3〜7員ヘテロシクリル、より好ましくは5〜6員ヘテロシクリルである。
式（II）の化合物のいくつかの実施形態では、R1からR8のいずれかは、カルボキシル（-CO2H）またはカルボキシレート(CO2￣)、スルホ（SO3H）またはスルホネート（SO3 -）基から選択される1つ以上の置換基で置換されたアルキルから選択され得る。いくつかのそのような実施形態では、置換アルキルは、置換C1、C2、C3、C4、C5、またはC6アルキルである。いくつかのそのような実施形態では、式（II）の化合物は、有機または無機カチオンを有するそれらの塩形態の式（II'）でも表される：

［式中、Kは有機または無機カチオンであり、nは1〜20から選択される整数である］。
式（II）または（II'）の化合物のいくつかの実施形態では、RHetは、1つ以上のR10で任意に置換された9員ヘテロアリールである。いくつかのそのような実施形態では、RHetは、任意に置換されたベンゾチアゾリルまたはベンゾオキサゾリル、例えば、2-ベンゾチアゾリルまたは2-ベンゾオキサゾリルから選択される。いくつかの他の実施形態では、RHetは、1つ以上のR10で任意に置換された6員へテロアリールである。そのような一実施形態では、RHetは、置換ピリジル、例えば以下の構造を有する4-ピリジルである：

R10が、窒素原子上に正電荷を持つピリジル基に結合している場合、R10は負電荷を持つことができ、その結果RHetは全体として中性電荷であることが理解される。あるいは、R10が、窒素原子上に正電荷を持つピリジル基に結合している場合、本明細書に記載の化合物は対イオンを含有することができ、その結果化合物は全体として電荷中性である。いくつかのそのような実施形態では、R10は、置換アルキル、例えば、置換C1、C2、C3、C4、C5、またはC6アルキルである。いくつかのそのような実施形態では、R10は、カルボキシル（-CO2H）、カルボキシレート（CO2-）、スルホ（SO3H）、またはスルホネート（SO3 -）で置換されている。
式（II）または（II'）の化合物のいくつかの実施形態では、式（II）において実線と破線とで表される結合
は二重結合であり、化合物は式（II‐1）または（II'‐1）でも表される：
式（II）、（II'）、（II‐1）または（II'‐1）の化合物のいくつかの実施形態では、R2はアルキルである。一実施形態では、R2はメチルである。いくつかの他の実施形態では、R2はHである。
式（II）、（II'）、（II‐1）または（II'‐1）の化合物のいくつかの実施形態では、R4およびR5の少なくとも一方はアルキルである。いくつかのそのような実施形態では、各R4およびR5はアルキルである。一実施形態では、R4およびR5の両方がメチルである。いくつかの代替実施形態では、R4およびR5の少なくとも一方はHである。そのような一実施形態では、R4およびR5の両方がHである。
式（II）または（II'）の化合物のいくつかの実施形態では、実線と破線とで表される結合
は単結合であり、化合物は式（II‐2）または（II'‐2）でも表される：
式（II）、（II'）、（II‐2）または（II'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R2およびR3の少なくとも一方はアルキルである。いくつかのさらなる実施形態では、R2およびR3の両方がアルキルである。一実施形態では、R2およびR3の両方がメチルである。いくつかの他の実施形態では、R2およびR3の少なくとも一方はHである。一実施形態では、R2およびR3の両方がHである。
式（II）、（II'）、（II‐2）または（II'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R4およびR5の少なくとも一方はHである。そのような一実施形態では、R4およびR5の両方がHである。いくつかの代替実施形態では、R4およびR5の少なくとも一方はアルキルである。いくつかのそのような実施形態では、各R4およびR5はアルキルである。一実施形態では、R4およびR5の両方がメチルである。
式（II）、（II'）、（II‐1）、（II'‐1）、（II‐2）または（II'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R6は置換アルキル、例えば、置換C1、C2、C3、C4、C5、またはC6アルキルである。一実施形態では、R6はカルボキシルで置換されたアルキルである。いくつかの実施形態では、R6は‐C(O)OR12で置換されたアルキルであり、ここでR12は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、および任意に置換された3〜7員シクロアルキルからなる群より選択される。そのような一実施形態では、R12はアルキル、例えばメチル、エチル、またはｔ‐ブチルである。いくつかのさらなる実施形態では、R6は‐C(O)NR13R14で置換されたアルキルであり、ここで各R13およびR14は、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換された3〜7員シクロアルキルから選択される。いくつかのさらなる実施形態では、R13およびR14は、独立して、カルボキシル、カルボキシレート、‐C(O)OR11、スルホおよびスルホネートからなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されたアルキルから選択される。
式（II）、（II'）、（II‐1）、（II'‐1）、（II‐2）または（II'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R7はHである。
式（II）、（II'）、（II‐1）、（II'‐1）、（II‐2）または（II'‐2）の化合物のいくつかの代替実施形態では、R6およびR7は、それらが結合している原子と一緒になってつながり、任意に置換された3〜10員ヘテロシクリル、例えば、任意に置換された6員ヘテロシクリルを形成する。いくつかのそのような実施形態では、任意に置換されたヘテロシクリルは、1個のヘテロ原子を含む。いくつかのそのような実施形態では、任意に置換されたヘテロシクリルは、1つ以上のアルキル、例えばメチルで置換されている。
式（II）、（II'）、（II‐1）、（II'‐1）、（II‐2）または（II'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R1はHである。
式（II）、（II'）、（II‐1）、（II'‐1）、（II‐2）または（II'‐2）の化合物のいくつかの実施形態では、R8はHである。
当業者には理解されるように、式（I）または（II）の化合物が正もしくは負の電荷を持つ置換基を含有する場合、それは、化合物が全体として中性になるように、負または正の電荷を持つ対イオンも含有し得る。
（定義）
本明細書で使用されている節の見出しは、単に編成目的のためであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。用語「含んでいる」、ならびに「含む」、「含む」、および「含まれる」などの他の形態の使用は、限定的ではない。用語「有している」、ならびに「有する」、「有する」、および「有した」などの他の形態の使用は、限定的ではない。本明細書で使用される場合、移行句であろうと請求項の本文であろうと、用語「含む」および「含んでいる」は、非限定的意味を有すると解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、「少なくとも有する」または「少なくとも含む」という句と同義的に解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈で使用される場合、用語「含んでいる」は、プロセスが少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、組成物、または装置の文脈で使用される場合、用語「含んでいる」は、化合物、組成物、または装置が少なくとも列挙された特徴または構成要素を含むが、追加の特徴または構成要素も含み得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、一般的な有機略語は以下のように定義される：

Ac アセチル
AC2O 無水酢酸
aq. 水性
BOCまたはBoc tert-ブトキシカルボニル
BOP (ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロリン酸
cat. 触媒的
℃ 摂氏温度
dATP デオキシアデノシン三リン酸
dCTP デオキシシチジン三リン酸
dGTP デオキシグアノシン三リン酸
dTTP デオキシチミジン三リン酸
ddNTP（単数または複数） ジデオキシヌクレオチド（単数または複数）
DCM 塩化メチレン
DMA ジメチルアセトアミド
DMF ジメチルホルムアミド
Et エチル
EtOAc 酢酸エチル
ffC 完全官能化ヌクレオチドコンジュゲート
g グラム（単数または複数）
hまたはhr 時間（単数または複数）
IPA イソプロピルアルコール
LCMS 液体クロマトグラフィー-質量分析
MeCN アセトニトリル
mL ミリリットル（単数または複数）
PG 保護基
Ph フェニル
ppt 沈殿物
PyBOP (ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸
RT、rt 室温
SBS 合成による配列決定
TEA トリエチルアミン
TEAB テトラエチルアンモニウムブロマイド
TFA トリフルオロ酢酸
TRIS トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
Tert、t 第3級
THF テトラヒドロフラン
TLC 薄層クロマトグラフィー
TSTU O-(N-スクシンイミジル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
μL マイクロリットル（単数または複数）
本明細書で使用される場合、用語「共有結合」または「共有結合」は、原子間の電子対の共有を特徴とする化学結合の形成を指す。例えば、共有結合ポリマーコーティングは、他の手段、例えば、接着または静電相互作用による表面への接着とは対照的に、基質の官能化表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。当然のことながら、表面に共有結合しているポリマーは、共有結合以外の手段によって結合することもできる。
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、本明細書で使用される場合、元素周期律表の第7列の放射線安定性原子のいずれか1つ、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味し、フッ素および塩素が好ましい。
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合または三重結合を含まない）直鎖または分岐の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、1〜20個の炭素原子を有していてもよい（本明細書に現れるときはいつでも、「1〜20」などの数値範囲は所定の範囲の各整数を指す；例えば、「1〜20個の炭素原子」は、アルキル基が1個の炭素原子、2個の炭素原子、3個の炭素原子など、最大20個の炭素原子で構成され得ることを意味するが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキル」の出現も包含する）。アルキル基は、1〜9個の炭素原子を有する中サイズのアルキルでもあり得る。アルキル基は、1〜6個の炭素原子を有する低級アルキルでもあり得る。アルキル基は、「C1-4アルキル」または同様の名称として示され得る。ほんの一例として、「C1-6アルキル」は、アルキル鎖中に1〜6個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、n-ブチル、イソ-ブチル、sec‐ブチル、およびｔ‐ブチルからなる群より選択される。典型的なアルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、ブチル、イソブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれるが、決してこれらに限定されるものではない。
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、式-ORを意味し、式中、Rは、メトキシ、エトキシ、n‐プロポキシ、1-メチルエトキシ（イソプロポキシ）、n‐ブトキシ、イソ-ブトキシ、sec‐ブトキシ、およびtert‐ブトキシなどを含むが、これらに限定されない「C1-9アルコキシ」などの、上記定義のアルキルである。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、1つ以上の二重結合を含有する直鎖または分岐の炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、2〜20個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルケニル」の出現も包含する。アルケニル基は、2〜9個の炭素原子を有する中サイズのアルケニルでもあり得る。アルケニル基は、2〜6個の炭素原子を有する低級アルケニルでもあり得る。アルケニル基は、「C2-6アルケニル」または同様の名称として示され得る。ほんの一例として、「C2-6アルケニル」は、アルケニル鎖中に2〜6個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルケニル鎖は、エテニル、プロペン‐1‐イル、プロペン‐2‐イル、プロペン‐3‐イル、ブテン‐1‐イル、ブテン‐2‐イル、ブテン‐3‐イル、ブテン‐4‐イル、1‐メチル-プロペン‐1‐イル、2‐メチル-プロペン‐1‐イル、1‐エチル-エテン‐1‐イル、2‐メチル-プロペン‐3‐イル、ブタ‐1,3‐ジエニル、ブタ‐1,2,-ジエニル、およびブタ‐1,2‐ジエン‐4‐イルからなる群より選択される。典型的なアルケニル基には、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、およびヘキセニルなどが挙げられるが、決してこれらに限定されるものではない。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、1つ以上の三重結合を含有する直鎖または分岐の炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、2〜20個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキニル」の出現も包含する。アルキニル基は、2〜9個の炭素原子を有する中サイズのアルキニルでもあり得る。アルキニル基は、2〜6個の炭素原子を有する低級アルキニルでもあり得る。アルキニル基は、「C2-6アルキニル」または同様の名称として示され得る。ほんの一例として、「C2-6アルキニル」は、アルキニル鎖中に2〜6個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキニル鎖は、エチニル、プロピン‐1‐イル、プロピン‐2‐イル、ブチン‐1‐イル、ブチン‐3‐イル、ブチン‐4‐イル、および2‐ブチニルからなる群より選択される。典型的なアルキニル基には、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、およびヘキシニルなどが挙げられるが、決してこれらに限定されるものではない。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」は、1つ以上のヘテロ原子、すなわち、窒素、酸素および硫黄を含むが、これらに限定されない炭素以外の元素をその鎖骨格中に含む直鎖または分岐の炭化水素鎖を指す。ヘテロアルキル基は、1〜20個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアルキル」の出現も包含する。ヘテロアルキル基は、1〜9個の炭素原子を有する中サイズのヘテロアルキルでもあり得る。ヘテロアルキル基は、1〜6個の炭素原子を有する低級ヘテロアルキルでもあり得る。ヘテロアルキル基は、「C1-6ヘテロアルキル」または同様の名称として示され得る。ヘテロアルキル基は、1つ以上のヘテロ原子を含み得る。ほんの一例として、「C1-6ヘテロアルキル」は、ヘテロアルキル鎖中に1〜6個の炭素原子があり、さらに鎖骨格中に1つ以上のヘテロ原子があることを示す。
用語「芳香族」は、共役π電子系を有する環または環系を指し、炭素環式芳香族基（例えば、フェニル）および複素環式芳香族基（例えば、ピリジン）の両方を含む。この用語は、単環式または縮合環多環式（すなわち、隣接する原子の対を共有する環）基を、環系全体が芳香族であるという条件で含む。
本明細書で使用される場合、「アリール」は、環骨格中に炭素のみを含有する芳香環または環系（すなわち、2つの隣接する炭素原子を共有する2つ以上の縮合環）を指す。アリールが環系であるとき、その系中の全ての環は芳香族である。アリール基は、6〜18個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アリール」の出現も包含する。いくつかの実施形態では、アリール基は6〜10個の炭素原子を有する。アリール基は、「C6-10アリール」、「C6もしくはC10アリール」、または同様の名称として示され得る。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
「アラルキル」または「アリールアルキル」は、置換基としてアルキレン基を介して結合しているアリール基であり、例えば、「C7-14アラルキル」など、ベンジル、2-フェニルエチル、3-フェニルプロピル、およびナフチルアルキルを含むが、これらに限定されない。場合によっては、アルキレン基は低級アルキレン基（すなわち、C1-6アルキレン基）である。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、1つ以上のヘテロ原子、すなわち、窒素、酸素および硫黄を含むが、これらに限定されない炭素以外の元素をその環骨格中に含む芳香族環または環系（すなわち、2つの隣接する原子を共有する2つ以上の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系であるとき、その系中の全ての環は芳香族である。ヘテロアリール基は、5〜18個の環員（すなわち、環骨格を構成する、炭素原子およびヘテロ原子を含む原子の数）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアリール」の出現も包含する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、5〜10個の環員または5〜7個の環員を有する。ヘテロアリール基は、「5〜7員ヘテロアリール」、「5〜10員ヘテロアリール」、または同様の名称として示され得る。ヘテロアリール環の例には、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキンリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソインドリル、およびベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」は、置換基としてアルキレン基を介して結合しているヘテロアリール基である。例としては、2‐チエニルメチル、3‐チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキル、イソオキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、アルキレン基は低級アルキレン基（すなわち、C1-6アルキレン基）である。
本明細書で使用される場合、「カルボシクリル」は、環系骨格中に炭素原子のみを含有する非芳香族環式環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、2つ以上の環は、縮合、架橋またはスピロ結合様式で一緒に結合していてもよい。カルボシクリルは、環系中の少なくとも1つの環が芳香族ではないという条件で、任意の程度の飽和を有していてもよい。したがって、カルボシクリルには、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルが含まれる。カルボシクリル基は、3〜20個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「カルボシクリル」の出現も包含する。カルボシクリル基は、3〜10個の炭素原子を有する中サイズのカルボシクリルでもあり得る。カルボシクリル基は、3〜6個の炭素原子を有するカルボシクリルでもあり得る。カルボシクリル基は、「C3-6カルボシクリル」または同様の名称として示され得る。カルボシクリル環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、2,3‐ジヒドロ-インデン、ビシクロ[2.2.2]オクタニル、アダマンチル、およびスピロ[4.4]ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」は、完全に飽和しているカルボシクリル環または環系を意味する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」は、環骨格中に少なくとも1個のヘテロ原子を含有する非芳香族環式環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、融合、架橋またはスピロ結合様式で一緒に結合していてもよい。ヘテロシクリルは、環系中の少なくとも1つの環が芳香族ではないという条件で、任意の程度の飽和を有していてもよい。ヘテロ原子（単数または複数）は、環系中の非芳香族環または芳香族環のいずれに存在してもよい。ヘテロシクリル基は、3〜20個の環員（すなわち、環骨格を構成する、炭素原子およびヘテロ原子を含む原子の数）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロシクリル」の出現も包含する。ヘテロシクリル基は、3〜10個の環員を有する中サイズのヘテロシクリルでもあり得る。ヘテロシクリル基は、3〜6個の環員を有するヘテロシクリルでもあり得る。ヘテロシクリル基は、「3〜6員ヘテロシクリル」または同様の名称として示され得る。好ましい6員単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子（単数または複数）は1〜3個までのO、NまたはSから選択され、好ましい5員単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子（単数または複数）はO、N、またはSから選択される1または2個のヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例には、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセパニル、チエパニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピロリジオニル、4-ピペリドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、1,3-ジオキシニル、1,3-ジオキサニル、1,4-ジオキシニル、1,4-ジオキサニル、1,3-オキサチアニル、1,4-オキサチイニル、1,4-オキサチアニル、2H-1,2-オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ-1,3,5-トリアジニル、1,3-ジオキソリル、1,3-ジオキソラニル、1,3-ジチオリル、1,3-ジチオラニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、1,3-オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ-1,4-チアジニル、チアモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリジニル、およびテトラヒドロキノリンが挙げられるが、これらに限定されない。
「O‐カルボキシ」基は、「-OC(=O)R」基を指し、ここでRは、水素、本明細書で定義されるC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および3〜10員ヘテロシクリルから選択される。
「C-カルボキシ」基は、「-C(=O)OR」基を指し、ここでRは、水素、本明細書で定義されるC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および3〜10員ヘテロシクリルから選択される。非限定的な例には、カルボキシル（すなわち、-C(=O)OH）が挙げられる。
「シアノ」基は、「-CN」基を指す。
「スルホニル」基は、「-SO2R」基を指し、ここでRは、水素、本明細書で定義されるC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および3〜10員ヘテロシクリルから選択される。
「スルホ」または「スルホニルヒドロキシド」基は、「-S(=O)2-OH」基を指す。
「スルフィノ」基は、「-S(=O)OH」基を指す。
「スルホネート」基は、-SO3 - を指す。
「S‐スルホンアミド」基は、「-SO2NRARB」基を指し、ここで、RAおよびRBは、それぞれ独立して、水素、本明細書で定義されるC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および3〜10員ヘテロシクリルから選択される。
「N‐スルホンアミド」基は、「-N(RA)SO2RB」基を指し、ここで、RAおよびRBは、それぞれ独立して、水素、本明細書で定義されるC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および3〜10員ヘテロシクリルから選択される。
「C-アミド」基は、「-C(=O)NRARB」基を指し、ここで、RAおよびRBは、それぞれ独立して、水素、本明細書で定義されるC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および3〜10員ヘテロシクリルから選択される。
「N‐アミド」基は、「-N(RA)C(=O)RB」基を指し、ここで、RAおよびRBは、それぞれ独立して、水素、本明細書で定義されるC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および3〜10員ヘテロシクリルから選択される。
「アミノ」基は、「-NRARB」基を指し、ここで、RAおよびRBは、それぞれ独立して、水素、本明細書で定義されるC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-7カルボシクリル、C6-10アリール、5〜10員ヘテロアリール、および3〜10員ヘテロシクリルから選択される。非限定的な例には、遊離アミノ（すなわち、‐NH2）が挙げられる。
「アミノアルキル」基は、アルキレン基を介して結合しているアミノ基を指す。
「アルコキシアルキル」基は、アルキレン基を介して結合したアルコキシ基、例えば「C2-8アルコキシアルキル」などを指す。
本明細書で使用される場合、置換された基は、非置換の親基から誘導され、1つ以上の水素原子が別の原子または基と交換されている。特に明記しない限り、基が「置換されている」と見なされる場合、それは、その基が以下から独立して選択される1つ以上の置換基で置換されていることを意味する：C1-C6アルキル、C1-C6アルケニル、C1-C6アルキニル、C1-C6ヘテロアルキル、C3-C7カルボシクリル（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで任意に置換された）、C3-C7-カルボシクリル-C1-C6-アルキル（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで任意に置換された）、3〜10員ヘテロシクリル（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで任意に置換された）、3〜10員ヘテロシクリル‐C1-C6-アルキル（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで任意に置換された）、アリール（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで任意に置換された）、アリール(C1-C6)アルキル（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで任意に置換された）、5〜10員ヘテロアリール（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで任意に置換された）、5〜10員ヘテロアリール(C1-C6)アルキル（ハロ、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C1-C6ハロアルキル、およびC1-C6ハロアルコキシで任意に置換された）、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、C1-C6アルコキシ、C1-C6アルコキシ(C1-C6)アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ(C1-C6)アルキル（例えば、‐CF3）、ハロ(C1-C6)アルコキシ（例えば、‐OCF3）、C1-C6アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ(C1-C6)アルキル、ニトロ、O-カルバミル、N‐カルバミル、O‐チオカルバミル、N‐チオカルバミル、C‐アミド、N‐アミド、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、およびオキソ（=O）。基が「任意に置換された」と記載されている場合は常に、その基は上記置換基で置換されていてもよい。
当業者には理解されるように、化合物が正または負の電荷を持つ置換基、例えばSO3 -などを含有する場合、それは、化合物が全体として中性になるように、負または正の電荷を持つ対イオンも含有し得る。
特定のラジカル命名規則は、文脈に応じて、モノラジカルまたはジラジカルのいずれかを含み得ることを理解されたい。例えば、置換基が、分子の残りに対して2つの結合点を必要とする場合、その置換基はジラジカルであることが理解される。例えば、2つの結合点を必要とするアルキルとして認識される置換基には、‐CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-などのジラジカルが挙げられる。他のラジカル命名規則は、そのラジカルが「アルキレン」または「アルケニレン」などのジラジカルであることを明確に示している。
2つの「隣接する」R基が、「それらが結合している原子と一緒になって」環を形成すると言われる場合、それは、原子、介在する結合、および2つのR基の集合単位が、列挙された環であることを意味する。例えば、以下のような下部構造：

が存在し、R1およびR2が水素およびアルキルからなる群より選択されるか、またはR1およびR2がそれらが結合している原子と一緒になってアリールもしくはカルボシクリルを形成すると定義される場合、それは、R1およびR2が水素またはアルキルから選択され得ること、またはその代わりに、下部構造が以下の構造を有することを意味する：

［式中、Aは、描かれた二重結合を含有するアリール環またはカルボシクリルである］。
（標識ヌクレオチド）
本明細書に記載の色素化合物は、基質部位への結合に適している。基質部位は、本明細書に記載の蛍光色素が結合することができる事実上あらゆる分子または物質でもあり得、非限定的な例としては、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、リガンド、粒子、固体表面、有機および無機ポリマー、ならびにそれらの組み合わせまたは集合体、例えば染色体、核、生細胞などを挙げることができる。色素は、疎水性引力、イオン引力および共有結合を含むさまざまな手段により、任意のリンカーによってコンジュゲートすることができる。特に、色素は、共有結合によって基質にコンジュゲートしている。より具体的には、共有結合は、リンカー基によるものである。いくつかの事例では、そのような標識ヌクレオチドは、「修飾ヌクレオチド」とも呼ばれる。
本明細書に記載の長いストークスシフトを有する新規蛍光色素の特に有用な用途は、生体分子、例えばヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを標識することである。本出願のいくつかの実施形態は、本明細書に記載のような新規蛍光化合物で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。
蛍光特性（ストークスシフト、蛍光強度、最大蛍光位置および蛍光バンドの形状など）が改善された蛍光色素分子は、核酸配列決定の速度および精度を改善することができる。ストークスシフトは、生物学的応用での蛍光の検出における重要な側面である。例えば、吸収および蛍光最大が互いに非常に近い（すなわち、小さいストークスシフトの）蛍光体を使用する場合、励起および発光波長が大きく重なるため、発光の検出を励起光と区別することが困難となり得る。対照的に、大きなストークスシフトの蛍光体は、励起波長と発光波長との間のより大きな分離のために、区別が容易である。ある蛍光体の発光波長が同じ試料中の別の蛍光体と重なり、したがって励起させ得るため、ストークスシフトは多重蛍光用途では特に重要である。加えて、測定が水系の生物学的緩衝液中でおよび／またはより高い温度で行われる場合、ほとんどの色素の蛍光はそのような条件では著しく低いため、蛍光シグナル強度が特に重要である。さらに、色素が結合している塩基の性質は、最大蛍光、蛍光強度および他の分光色素特性にも影響を与える。蛍光色素と核酸塩基との間の配列特異的相互作用は、蛍光色素の特定の設計によって調整することができる。蛍光色素の構造の最適化は、それらの蛍光特性を改善し、ヌクレオチド組み込みの効率も改善し、配列決定エラーのレベルを減少させ、試薬の核酸配列決定での使用を減少させ、したがって核酸配列決定の費用を減少させることができる。
生体分子への結合は、式（I）または式（II）の化合物のR6、R8、R10a、R10b、R10cもしくはR10部位を介してもよい。いくつかの実施形態では、R6、R8、R10a、R10b、R10cまたはR10は、置換アルキル、例えばカルボキシル（すなわち、‐CO2H）で置換されたアルキルであるか、またはカルボキシル基の活性型、例えばアミドまたはエステルであり、生体分子のアミノ基への結合に使用され得る。一実施形態では、R6、R8、R10a、R10b、R10cまたはR10は、さらなるアミド／ペプチド結合形成に最も適した活性化エステルまたはアミド残基を含み得る。本明細書で使用される用語「活性化エステル」は、温和な条件下で、例えばアミノ基を含有する化合物と反応することができるカルボキシル基誘導体を指す。活性化エステルの非限定的な例には、p-ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニルおよびスクシンイミドエステルが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、色素化合物は、ヌクレオチド塩基を介してオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドに共有結合してもよい。例えば、標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、リンカー部位を介してピリミジン塩基のC5位または7-デアザプリン塩基のC7位に結合した標識を有してもよい。標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボースまたはデオキシリボース糖に共有結合している3'-OHブロッキング（blocking）基（保護基）も有していてもよい。
（リンカー）
本明細書に開示のような色素化合物は、置換位置の1つに、化合物の別の分子への共有結合のための反応性リンカー基を含み得る。反応性リンカー基は、共有結合を形成することができる部位である。特定の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。用語「切断可能なリンカー」の使用は、リンカー全体が除去される必要があることを暗示することを意味しない。切断後にリンカーの一部が色素および／または基質部位に結合したままであることを確実にするリンカー上の位置に、切断部位を配置することができる。切断可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に開裂可能なリンカー、求核的に開裂可能なリンカー、光開裂可能なリンカーであって、還元的条件下で開裂可能（例えばジスルフィドまたはアジド含有リンカー）、酸化的条件、安全捕獲リンカーの使用により開裂可能および除去機構により開裂可能であり得る。色素化合物を基質部位に結合させるための切断可能なリンカーの使用は、必要ならば、標識が検出後に除去され、下流工程でのいかなる干渉シグナルも回避することを確実にする。
リンカー基の非限定的な例には、ヌクレオチドの塩基を、例えば本明細書に記載の新規蛍光化合物などの標識に結合させる、PCT公開番号WO2004/018493（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されているものが含まれる。これらのリンカーは、水溶性ホスフィンまたは遷移金属と少なくとも部分的に水溶性の配位子とから形成された水溶性遷移金属触媒を使用して切断することができる。水溶液中では、後者は、少なくとも部分的に水溶性の遷移金属錯体を形成する。使用され得るさらなる適切なリンカーには、PCT公開番号WO2004/018493およびWO2007/020457（両方とも参照により本明細書に組み入れられる）に開示されているものが挙げられる。蛍光色素（蛍光体）とグアニン塩基との間のリンカーの長さを変更すること、特にポリエチレングリコールスペーサー基を導入することにより増加させることによって、当該技術分野で知られている他の結合を介してグアニン塩基に結合した同じ蛍光体と比較して、蛍光強度を増大させることが可能であることが発見された。リンカーの設計、および特にそれらの長さの増加は、DNAなどのポリヌクレオチドに組み込まれた際に、グアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合した蛍光体の明るさの改善も可能にする。したがって、グアニン含有ヌクレオチドに結合した蛍光色素標識の検出を必要とする任意の分析方法で色素が使用される場合、リンカーが式-((CH2)2O)n-のスペーサー基を含むと有利であり、ここで、nは2〜50の整数であって、WO 2007/020457に記載されている通りである。
ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基上の部位で標識されていてもよい。当業者には理解されるように、「ヌクレオチド」は、窒素含有塩基、糖、および1つ以上のリン酸基からなる。RNAでは糖はリボースであり、DNAではデオキシリボース、すなわちリボースに存在するヒドロキシル基を欠く糖である。窒素含有塩基はプリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンはアデニン（A）およびグアニン（G）であり、ピリミジンはシトシン（C）およびチミン（T）であるか、またはRNAの文脈ではウラシル（U）である。デオキシリボースのC-1原子は、ピリミジンのN-1またはプリンのN-9に結合している。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルでもあり、エステル化は糖のC-3またはC-5に結合したヒドロキシル基で起こる。ヌクレオチドは通常、一、二または三リン酸である。
「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドと構造的に類似しているが、リン酸部位を欠いている。ヌクレオシド類似体の例は、標識が塩基に結合しており、糖分子に結合しているリン酸基がないものであろう。
塩基は通常プリンまたはピリミジンと呼ばれるが、当業者は、ワトソン-クリック塩基対合を受けるためのヌクレオチドまたはヌクレオシドの能力を変えない誘導体および類似体が利用可能であることを理解するであろう。「誘導体」または「類似体」は、そのコア構造が親化合物と同じであるか、または非常に類似しているが、例えば異なるもしくは追加の側基などの化学的または物理的修飾を有し、これにより誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドを他の分子に連結することを可能にする化合物または分子を意味する。例えば、塩基はデアザプリンであり得る。誘導体はワトソン-クリック対合を受けることができなければならない。「誘導体」および「類似体」は、修飾塩基部位および／または修飾糖部位を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体も意味する。そのような誘導体および類似体は、例えば、Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980)およびUhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990に記載されている。ヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキル-ホスホネート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート結合などを含む修飾ホスホジエステル結合も含み得る。
色素は、ワトソン-クリック塩基対形成をなお実施することができるという条件で、リンカーを介して、ヌクレオチド塩基上の任意の位置に結合していてもよい。特定の核酸塩基標識部位には、ピリミジン塩基のC5位または7-デアザプリン塩基のC7位が含まれる。上記のように、リンカー基を用いて色素をヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合させることができる。
特定の実施形態では、標識ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素的に組み込み可能および酵素的に拡張可能であり得る。したがって、化合物が核酸複製酵素によるヌクレオチドの全体的な結合および認識を著しく妨害しないように、リンカー部位は、ヌクレオチドを化合物に連結するのに十分な長さであり得る。したがって、リンカーは、スペーサー単位も含み得る。スペーサーは、例えば、切断部位または標識からヌクレオチド塩基を遠ざける。
本明細書に記載の新規蛍光色素で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、以下の式を有する：

［式中、Ｄｙｅ（色素）は色素化合物であり、Bは、例えばウラシル、チミン、シトシン、アデニン、グアニンなどの核酸塩基であり、Lは存在してもしていなくてもよい任意のリンカー基である。R'は、H、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した‐O‐、またはブロッキング基（保護基）により保護された‐O‐であり得る。R”は、H、OH、ホスホロアミダイトまたは3'‐OHブロッキング基であり得、R'''は、ＨまたはOHであり得る；ここで、R''がホスホロアミダイトである場合、R'は自動合成条件下でのその後のモノマーカップリングを可能にする酸開裂性ヒドロキシル保護基である］。
場合によっては、ブロッキング基は、色素化合物とは別個に独立している、すなわちそれに結合していない。あるいは、色素は、3'-OHブロッキング基の全部または一部を含み得る。したがって、R”は、色素化合物を含んでも含まなくてもよい3'‐OHブロッキング基であり得る。さらなる代替実施形態では、ペントース糖の3'炭素上にブロッキング基は存在せず、塩基に結合した色素（または色素およびリンカー構築物）は、例えば、3'位以外の場所からのさらなるヌクレオチドの取り込みのブロックとして作用するのに十分なサイズまたは構造であり得る。したがって、ブロックは、立体障害によるものでもよく、またはサイズ、電荷および構造の組み合わせによるものでもよい。
ブロッキング基の使用は、修飾ヌクレオチドが取り込まれたときに伸長を停止させることなどによって、重合を制御することを可能にする。ブロッキング効果が、例えば非限定的な例として化学的条件を変更することまたは化学的ブロックを除去することによって可逆的である場合、伸長は特定の場所で停止し、その後継続することができる。3'-OHブロッキング基の非限定的な例には、参照により本明細書に組み込まれるWO 2004/018497およびWO 2014/139596に開示されているものが含まれる。例えば、ブロッキング基は、アジドメチル（-CH2N3）または置換アジドメチル（例えば、-CH(CHF2)N3もしくはCH(CH2F)N3）、またはアリルであり得る。
特定の実施形態では、リンカーおよびブロッキング基は両方とも存在し、実質的に同様の条件下で両方とも切断可能な別個の部位である。したがって、脱保護および脱ブロッキングプロセスは、色素化合物とブロッキング基との両方を除去するのに単一の処理のみが必要とされるため、より効率的であり得る。
本開示は、本明細書に記載の色素化合物を組み込んでいるポリヌクレオチドを包含することも目的とする。そのようなポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合でつながれたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからそれぞれ構成されるDNAまたはRNAであり得る。本出願による色素化合物で標識された少なくとも1つのヌクレオチドが存在するという条件で、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の標識ヌクレオチド以外の天然ヌクレオチド、非天然（もしくは修飾）ヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る。ポリヌクレオチドは、非天然骨格結合および／または非ヌクレオチド化学修飾も含み得る。少なくとも1つの標識ヌクレオチドを含むリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの混合物からなるキメラ構造も意図される。
本明細書に記載されている非限定的で例示的な標識ヌクレオチドには、以下が挙げられる：

［式中：Lはリンカーを表し、Rは上記のような糖残基を表す］。
いくつかの実施形態では、非限定的で例示的な蛍光色素コンジュゲートは、以下に示される：
（キット）
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載される新規蛍光色素で標識されたヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドを含むキットである。そのようなキットは、通常、色素（Ｄｙｅ）で標識された少なくとも1つのヌクレオチドまたはヌクレオシドを、少なくとも1つのさらなる成分とともに含む。さらなる成分（単数または複数）は、さらなる修飾もしくは未修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドであり得る。例えば、色素で標識されたヌクレオチドは、非標識もしくは天然のヌクレオチドと、および／または蛍光標識されたヌクレオチドと、またはそれらの任意の組み合わせとの組み合わせで供給されてもよい。ヌクレオチドの組み合わせは、別個の成分として、またはヌクレオチド混合物として提供され得る。いくつかの実施形態では、キットは1つ以上のヌクレオチドを含み、少なくとも1つのヌクレオチドは、本明細書に記載の新規蛍光化合物で標識されたヌクレオチドである。キットは、2つ以上の標識ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、2つ以上の蛍光標識で標識されていてもよい。レーザーであり得る単一の励起源を使用して、2つ以上の標識が励起され得る。
キットは、4つのヌクレオチドを含み得、ここで、4つのヌクレオチドのうちの第1のヌクレオチドは、本明細書に開示のような化合物で標識され、第2、第3、および第4のヌクレオチドは、それぞれ異なる化合物で標識されていてもよく、各化合物は異なる最大蛍光を有し、化合物の各々は他の3つの化合物と区別可能である。キットは、2つ以上の化合物が同様の最大吸光度を有するが異なるストークスシフトを有するようなものであり得る。
本明細書に記載の蛍光色素化合物、標識ヌクレオチドまたはキットは、配列決定、発現分析、ハイブリダイゼーション分析、遺伝子分析、RNA分析またはタンパク質結合アッセイに使用され得る。その使用は、自動配列決定機器上であり得る。配列決定機器は、異なる波長で作動する2つのレーザーを含み得る。
キットが、色素化合物で標識された複数の、特に2つ、より特に4つのヌクレオチドを含む場合、異なるヌクレオチドは異なる色素化合物で標識されていてもよく、または1つは暗色で、色素化合物なしであってもよい。異なるヌクレオチドが異なる色素化合物で標識されている場合、前記色素化合物がスペクトル的に区別可能な蛍光色素であることがキットの特徴である。本明細書で使用される場合、用語「スペクトル的に区別可能な蛍光色素」は、2つ以上のそのような色素が1つの試料中に存在する場合、蛍光検出装置（例えば、市販のキャピラリーベースのDNA配列決定プラットフォーム）によって区別可能な波長で蛍光エネルギーを発する蛍光色素を指す。蛍光色素化合物で標識された2つのヌクレオチドがキット形態で供給される場合、スペクトル的に区別可能な蛍光色素は、例えばいくつかの実施形態では同じレーザーによってなど、同じ波長で励起され得る。蛍光色素化合物で標識された4つのヌクレオチドがキット形態で供給される場合、いくつかの実施形態では、2つのスペクトル的に区別可能な蛍光染料を両方とも1つの波長で励起することができ、他の2つのスペクトル的に区別可能な染料を両方とも別の波長で励起することができる。特定の励起波長は約460nmである。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つのヌクレオチドを、異なる波長を有する2つのレーザーで励起可能な色素で標識することができる。
一実施形態では、キットは、本明細書に記載の化合物で標識されたヌクレオチドおよび第2の色素で標識された第2のヌクレオチドを含み、ここで、色素の最大吸光度の差は、少なくとも10nm、特に20nm〜50nmである。より具体的には、2つの色素化合物は、15〜40nm、または20〜40nmのストークスシフトを有する。本明細書で使用される場合、用語「ストークスシフト」は、ピーク吸収波長とピーク発光波長との間の距離である。
さらなる実施形態では、前記キットは、蛍光色素で標識された他の2つのヌクレオチドをさらに含み、前記色素は、約440nm〜約560nmのレーザーによって励起される。
代替実施形態では、キットは、同じ塩基が2つの異なる化合物で標識されているヌクレオチドを含み得る。第1のヌクレオチドは、本明細書に記載の化合物で標識されていてもよい。第2のヌクレオチドは、スペクトル的に異なる化合物、例えば600nmを超えて吸収する「赤色」色素で標識されていてもよい。第3のヌクレオチドは、本明細書に記載の蛍光色素化合物とスペクトル的に異なる化合物との混合物として標識されてもよく、第4のヌクレオチドは「暗色」で、標識を含まなくてもよい。したがって、簡単に言えば、ヌクレオチド1〜4は、「緑色」、「赤色」、「赤色／緑色」、および暗色で標識され得る。器具の使用をさらに単純化するために、単一のレーザーで励起される2つの色素で4つのヌクレオチドを標識することができ、したがってヌクレオチド1〜4の標識は、「緑色1」、「緑色2」、「緑色1／緑色2」、および暗色であってもよい。
他の実施形態では、キットは、ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの取り込みを触媒することができるポリメラーゼ酵素を含み得る。そのようなキットに含まれる他の構成要素には、緩衝液などを挙げることができる。本明細書に記載の新規蛍光色素で標識されたヌクレオチド、および異なるヌクレオチドの混合物を含む他の任意のヌクレオチド成分は、使用前に希釈される濃縮形態でキット中に提供され得る。そのような実施形態では、適切な希釈緩衝液も含めることができる。
（配列決定方法）
本明細書に記載の新規蛍光色素を含むヌクレオチド（またはヌクレオシド）は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに結合した蛍光標識の検出を必要とする任意の分析方法において、それ自体でまたはより大きい分子構造もしくはコンジュゲートに組み込まれているかもしくは会合しているかにかかわらず使用され得る。本出願のいくつかの実施形態は、以下を含む配列決定方法に関する：（ａ）本明細書に記載の少なくとも1つの標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込む工程：および（ｂ）前記修飾ヌクレオチド（単数または複数）に結合した新規蛍光色素からの蛍光シグナルを検出することにより、ポリヌクレオチドに取り込まれた標識ヌクレオチド（単数または複数）を検出する工程。
いくつかの実施形態では、合成工程において、ポリメラーゼ酵素の作用により、少なくとも1つの標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込む。しかしながら、標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込む他の方法、例えば化学的オリゴヌクレオチド合成または標識オリゴヌクレオチドの非標識オリゴヌクレオチドへのライゲーションなどは排除されない。したがって、ヌクレオチドをポリヌクレオチドに「組み込む」という用語は、化学的方法ならびに酵素的方法によるポリヌクレオチド合成を包含する。
本方法の全ての実施形態において、検出工程は、標識ヌクレオチドが組み込まれているポリヌクレオチド鎖を鋳型鎖にアニーリングさせる間に、または2本鎖を分離させる変性工程の後に実施されてもよい。さらなる工程、例えば化学的もしくは酵素的反応工程または精製工程は、合成工程と検出工程との間に含まれてもよい。特に、標識ヌクレオチド（単数または複数）を組み込んでいる標的鎖は、単離または精製され、次いでさらに処理されるか、またはその後の分析に使用され得る。例として、合成工程において本明細書に記載のような修飾ヌクレオチド（単数または複数）で標識された標的ポリヌクレオチドは、その後、標識プローブまたはプライマーとして使用され得る。他の実施形態では、合成工程（a）の生成物をさらなる反応工程にかけてもよく、所望の場合、これらの後続工程の生成物は精製または単離されてもよい。
合成工程に適切な条件は、標準的な分子生物学的技術に精通している人にはよく知られているであろう。一実施形態では、合成工程は、本開示による修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を使用する標準的プライマー伸長反応に類似し得、適切なポリメラーゼ酵素の存在下で鋳型鎖に相補的な伸長された標的鎖を形成する。他の実施形態では、合成工程はそれ自体が、標的および鋳型ポリヌクレオチド鎖のコピーから誘導されたアニーリングされた相補鎖からなる標識二本鎖増幅産物を生成する増幅反応の一部を形成してもよい。他の例示的な「合成」工程には、ニックトランスレーション、鎖置換重合、ランダムプライムドDNA標識などが挙げられる。合成工程で使用されるポリメラーゼ酵素は、本開示による修飾ヌクレオチドの取り込みを触媒することができなければならない。そうでなければ、ポリメラーゼの正確な性質は、特に制限されないが、合成反応の条件に依存し得る。例として、合成反応がサーモサイクリングを用いて行われる場合、熱安定性ポリメラーゼが必要とされるが、これは標準的なプライマー伸長反応に必須ではない場合がある。本開示による修飾ヌクレオチドを組み込むことができる適切な熱安定性ポリメラーゼには、WO2005/024010またはWO2006/120433に記載されているものが挙げられる。37℃などの低温で行われる合成反応では、ポリメラーゼ酵素は必ずしも熱安定性ポリメラーゼである必要はなく、そのためポリメラーゼの選択は、反応温度、pH、鎖置換活性などの多数の要因に依存することになる。
特定の非限定的な実施形態では、本出願によるより長いストークスシフトを有する新規蛍光色素で標識された修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、核酸配列決定法、再配列決定法、全ゲノム配列決定法、一塩基多型スコアリング法、ポリヌクレオチドに組み込まれたときの修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオシドの検出を含む他の任意の用途、または本出願による蛍光色素を含む修飾ヌクレオチドで標識されたポリヌクレオチドの使用を必要とする他の任意の用途に使用され得る。
特定の実施形態では、本出願は、ポリヌクレオチドの「合成による配列決定」反応における、本明細書に記載の色素化合物を含む修飾ヌクレオチドの使用を提供する。合成による配列決定は、通常、配列決定される鋳型核酸に相補的な伸長されたポリヌクレオチド鎖を形成するために、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用して、1つ以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、成長するポリヌクレオチド鎖に5'から3'方向へ順次付加することを含む。1つ以上の付加されたヌクレオチド（単数または複数）に存在する塩基の同一性は、検出または「画像化」工程において決定される。付加された塩基の同一性は、各ヌクレオチド組み込み工程の後に決定され得る。次いで、鋳型の配列は、従来のワトソン-クリック塩基対合規則を使用して推測され得る。本開示による色素で標識された修飾ヌクレオチドの、一塩基の同一性の決定における使用は、例えば、一塩基多型のスコア付けにおいて有用であり得、そのような一塩基伸長反応はこの応用の範囲内である。
一実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドの配列は、取り込まれたヌクレオチド（単数または複数）に結合した蛍光標識（単数または複数）の検出を通して、配列決定される鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖への1つ以上のヌクレオチドの組み込みを検出することによって決定される。鋳型ポリヌクレオチドの配列決定は、適当なプライマー（またはヘアピンの一部としてプライマーを含むことになるヘアピン構築物として調製される）でプライミングされ、新生鎖は、ポリメラーゼ触媒反応における、プライマーの3'末端へのヌクレオチドの付加により段階的に伸長される。
特定の実施形態では、異なるヌクレオチド三リン酸（A、T、GおよびC）の各々は、独自の発蛍体で標識され得、3'位に制御されない重合を防ぐためのブロッキング基も含む。あるいは、4つのヌクレオチドのうちの１つは、標識されていなくてもよい（暗色）。ポリメラーゼ酵素は、ヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖に組み込み、ブロッキング基はヌクレオチドのさらなる組み込みを防ぐ。取り込まれていないヌクレオチドは除去され、取り込まれた各ヌクレオチドからの蛍光シグナルは、レーザー励起および適切な発光フィルターを用いる電荷結合素子などの適切な手段によって光学的に「読み取られる」。次いで、特に同じ化学的または酵素的方法によって、3'ブロッキング基および蛍光色素化合物を除去（脱保護）して、さらなるヌクレオチド組み込みのために新生鎖を露出させる。典型的には、取り込まれたヌクレオチドの同一性は、各取り込み工程の後に決定されることになるが、これは厳密に必須というわけではない。同様に、米国特許第5,302,509号は、固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドを配列決定する方法を開示している。この方法は、DNAポリメラーゼの存在下での、蛍光標識された3'-ブロックヌクレオチドA、G、CおよびTの、固定化ポリヌクレオチドに相補的な成長鎖への組み込みに依存している。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を組み込むが、3'-ブロッキング基によるさらなる付加は妨げられている。次いで、取り込まれたヌクレオチドの標識を決定し、化学的開裂によってブロッキング基を除去してさらなる重合を起こさせることができる。合成による配列決定反応において配列決定される核酸鋳型は、配列決定することが望まれる任意のポリヌクレオチドであり得る。配列決定反応のための核酸鋳型は、典型的には、配列決定反応においてさらなるヌクレオチドの付加のためのプライマーまたは開始点として働く遊離3'ヒドロキシル基を有する2本鎖領域を含むことになる。配列決定される鋳型の領域は、相補鎖上のこの遊離3'ヒドロキシル基をオーバーハングさせることになる。配列決定される鋳型のオーバーハング領域は1本鎖であり得るが、配列決定される鋳型鎖に相補的な鎖上に、配列決定反応の開始のための遊離3'OH基を提供する「ニックが存在する」場合、2本鎖であり得る。そのような実施形態では、配列決定は鎖置換により進行し得る。特定の実施形態では、遊離3'ヒドロキシル基を有するプライマーを、配列決定される鋳型の1本鎖領域にハイブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として添加することができる。あるいは、配列決定されるプライマーおよび鋳型鎖はそれぞれ、例えばヘアピンループ構造などの分子内2本鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部を形成してもよい。ヘアピンポリヌクレオチドおよびそれらを固体支持体に結合させることができる方法は、PCT公開番号WO 2001/057248およびWO 2005/047301に開示されている。ヌクレオチドは遊離3'-ヒドロキシル基に連続的に付加され、5'から3'方向へのポリヌクレオチド鎖の合成をもたらす。付加された塩基の性質を決定することができ、特に各ヌクレオチド付加の後にではあるが必ずしもそうである必要はなく、したがって核酸鋳型についての配列情報を提供する。この文脈において、ヌクレオチドの核酸鎖（またはポリヌクレオチド）への「組み込み」という用語は、ヌクレオチドの5'リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介した、核酸鎖の遊離3'ヒドロキシル基へのヌクレオチドの結合を指す。
配列決定される核酸鋳型は、DNAもしくはRNAであり得、またはデオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドからなるハイブリッド分子でさえあり得る。核酸鋳型は、配列決定反応における鋳型のコピーを妨げない限り、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチドおよび天然または非天然の骨格結合を含み得る。
特定の実施形態では、配列決定される核酸鋳型は、当該技術分野において知られている任意の適切な連結方法によって、例えば共有結合によって、固体支持体に結合されていてもよい。特定の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、固体支持体（例えば、シリカ系支持体）に直接結合されてもよい。しかしながら、他の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドの直接共有結合を可能にするか、またはそれ自体が固体支持体に非共有結合的に結合し得るヒドロゲルもしくは高分子電解質多層を通して鋳型ポリヌクレオチドを固定化するように、固体支持体の表面を何らかの方法で修飾してもよい。
ポリヌクレオチドがシリカ系支持体に直接結合しているアレイは、例えばPCT公開番号WO 2000/006770に開示されているものであり、ここでポリヌクレオチドは、ガラス上のペンダントエポキシド基と、ポリヌクレオチド上の内部アミノ基との反応によってガラス支持体上に固定化される。さらに、PCT公開番号WO2005/047301には、例えば、SMAの調製における使用のための、硫黄ベースの求核剤と固体支持体との反応によって固体支持体に結合したポリヌクレオチドのアレイが開示されている。固体支持鋳型ポリヌクレオチドのさらなる例は、鋳型ポリヌクレオチドがシリカベースまたは他の固体支持体上に支持されたヒドロゲルに結合している場合である。PCT公開番号WO 00/31148、WO 01/01143、WO02/12566、WO 03/014392、WO 00/53812、および米国特許第6,465,178号に記載されるように、シリカ系支持体は、典型的には、ヒドロゲルおよびヒドロゲルアレイを支持するために使用される。
鋳型ポリヌクレオチドが固定化され得る特定の表面は、ポリアクリルアミドヒドロゲルである。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、先行技術において説明されており、そのいくつかは上記で考察されている。本出願において使用され得る具体的なヒドロゲルには、国際公開第WO 2005/065814および米国特許出願公開第2014/0079923号に記載されているものが挙げられる。一実施形態では、ヒドロゲルはPAZAM（ポリ(N-(5-アジドアセトアミジルペンチル)アクリルアミド-コ-アクリルアミド)）である。
DNA鋳型分子を、配列決定の目的で、ビーズまたは微粒子に結合させることができる：例えば、米国特許第6,172,218号に記載のように。各ビーズが異なるDNA配列を含むビーズライブラリーの調製のさらなる例は、Margulies et al., Nature 437, 376-380 (2005)；Shendure et al., Science. 309(5741):1728-1732 (2005)で見ることができる。記載のようなヌクレオチドを用いたそのようなビーズのアレイの配列決定は、本出願の範囲内である。
配列決定される鋳型（単数または複数）は、固体支持体上で「アレイ」の一部を形成してもよく、その場合、アレイは任意の都合のよい形態をとり得る。したがって、本開示の方法は、単分子アレイ、クラスターアレイおよびビーズアレイを含むあらゆる種類の「高密度」アレイに適用可能である。本出願の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、固体支持体上での核酸分子の固定化によって形成された実質的にあらゆる種類のアレイ、より具体的にはあらゆる種類の高密度アレイ上での鋳型の配列決定に使用され得る。しかしながら、本明細書に記載の新規蛍光色素で標識された修飾ヌクレオチドは、クラスター化アレイの配列決定の状況で特に有利である。
マルチポリヌクレオチドまたはクラスター化アレイにおいて、アレイ上の異なる領域は、複数のポリヌクレオチド鋳型分子を含む。用語「クラスター化アレイ」は、アレイ上の異なる領域または部位が、光学的手段によって個々に分割できない複数のポリヌクレオチド分子を含むアレイを指す。アレイがどのように形成されるかに応じて、アレイ上の各部位は、1つの個々のポリヌクレオチド分子の複数のコピー、または少数の異なるポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、2つの相補的核酸鎖の複数のコピー）さえも含み得る。マルチポリヌクレオチドまたは核酸分子のクラスター化アレイは、当該技術分野において一般的に知られている技術を使用して作製することができる。例として、WO 98/44151およびWO 00/18957は両方とも、固定化核酸分子のクラスターまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために、鋳型および増幅産物の両方が固体支持体上に固定化されたままである核酸の増幅方法を記載する。これらの方法に従って調製されたクラスター化アレイ上に存在する核酸分子は、本明細書に記載の新規蛍光色素で標識された修飾ヌクレオチドを使用して配列決定するのに適切な鋳型である。
本出願の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、単一分子アレイ上の鋳型の配列決定においても有用である。本明細書で使用される用語「単一分子アレイ」または「SMA」は、固体支持体上に分布（または配列）したポリヌクレオチド分子の集団を指し、ここで、個々のポリヌクレオチドの集団の他の全てからの間隔は、ポリヌクレオチドの個々の分割を達成することが可能であるようになっている。したがって、固体支持体の表面上に固定化された標的核酸分子は、光学的手段によって分割されることができるはずである。これは、使用される特定の撮像装置の分割可能な領域内に、それぞれが1つのポリヌクレオチドを表す1つ以上の異なる信号が存在するはずであることを意味する。
これは、アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が、少なくとも100nm、より特には少なくとも250nm、さらにより特には少なくとも300nm、さらにより特には少なくとも350nmである場合に達成され得る。したがって、各分子は、個々に分割可能であり、単一分子の蛍光点として検出可能であり、前記単一分子の蛍光点からの蛍光も一段階の光退色を示す。
用語「個々に分割された」および「個々の分割」は、本明細書では、視覚化されたときに、アレイ上の1つの分子をその隣接分子と区別することが可能であることを明記するために使用される。アレイ上の個々の分子間の分離は、部分的には、個々の分子を分割するために使用される特定の技術によって決定されることになる。単一分子アレイの一般的な特徴は、PCT公開番号WO 2000/006770およびWO 2001/057248を参照することによって理解されよう。本開示の修飾ヌクレオチドの一用途は、合成による配列決定反応におけるものであるが、そのような標識ヌクレオチドの有用性は、そのような方法に限定されない。実際、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出を必要とする任意の配列決定方法において有利に使用され得る。
特に、本出願の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、自動蛍光配列決定プロトコル、特にサンガーおよび同僚のチェーンターミネーション配列決定法に基づく蛍光色素ターミネーターサイクル配列決定において使用され得る。そのような方法は通常、酵素およびサイクル配列決定を使用して、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドをプライマー伸長配列決定反応に組み入れる。いわゆるサンガー配列決定法、および関連プロトコル（サンガー型）は、標識ジデオキシヌクレオチドを用いるランダム化チェーンターミネーションに依存する。
したがって、本開示は、3'位および2'位の両方にヒドロキシル基を欠くジデオキシヌクレオチドである、本明細書に記載の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドも包含し、そのような修飾ジデオキシヌクレオチドは、サンガー型配列決定法などでの使用に適している。
さらなる実施形態を以下の実施例においてさらに詳細に開示するが、これらは決して特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
（実施例１）
4-[3-(ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-7,8-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(6H)-イル]ブタン酸tert-ブチル（化合物I‐1）

4-(6-ホルミル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-3,4-ジヒドロキノリン-1(2H)-イル)ブタン酸tert-ブチル（0.19g）をエタノール（2mL）に溶解させた。2-(ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)酢酸エチル（0.124g）を加え、混合液を室温で15分間撹拌した。ピペリジン（5μL）を加えると、反応混合液の色は赤黄色に変わった。反応混合液を室温で一晩撹拌し続けた。翌日、クルード反応混合液を水性ワークアップし、乾燥させ、クロマトグラフィー（シリカゲルと、溶離剤としての石油エーテル／酢酸エチルとで）により精製し、化合物I‐1を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値518.22。実測値：(-) 517 (M-1)。
（実施例２）
4-[3-(ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-7,8-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(6H)-イル]ブタン酸（化合物I‐2）

化合物I‐1（51.8mg）をDCM（5mL）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（0.5mL）をシリンジで加え、反応混合液を室温で一晩撹拌し続けた。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を留去し、残渣を水（5mL）でトリチュレートし、固体を濾取し、乾燥させて化合物I‐2を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値462.16。実測値：(-) 461 (M-1)。
（実施例３）
4-[3-(ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(6H)-イル]ブタン酸tert-ブチル（化合物I‐3）

4-(6-ホルミル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-キノリン-1(2H)-イル)ブタン酸tert-ブチル（0.19g）をエタノール（2mL）に溶解させた。2-(ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)酢酸エチル（0.124g）を加え、混合液を室温で15分間撹拌した。ピペリジン（5μL）を加えると、反応混合液の色は赤黄色に変わった。反応混合液を室温で一晩撹拌し続け、クルード反応混合液を水性ワークアップし、乾燥させ、クロマトグラフィー（シリカゲルと、溶離剤としての石油エーテル／酢酸エチルとで）により精製し、化合物I‐3を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値516.22。実測値：(-) 515 (M-1); (+) 517 (M+1)。
（実施例４）
4-[3-(ベンゾ[d]チアゾール-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(6H)-イル]ブタン酸（化合物I‐4）

化合物I‐3（51.7mg）をDCM（６mL）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（1mL）をシリンジで加え、反応混合液を室温で一晩撹拌し続けた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、残渣を水（5mL）でトリチュレートした。形成された固体を濾取し、乾燥させ、化合物I‐4を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値460.15。実測値：(+) 461 (M+1)。
（実施例５）
4-[3-(ベンゾオキサゾリル-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-7,8-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(6H)-イル]ブタン酸t-ブチル（化合物I‐5）

4-(6-ホルミル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-3,4-ジヒドロキノリン-1(2H)-イル)ブタン酸tert-ブチル（0.18g）をエタノール（3mL）に溶解させた。2-(ベンゾオキサゾリル)酢酸エチル（0.124g）を加え、混合液を室温で15分間撹拌した。ピペリジン（5μL）を加えた。反応混合液の色は赤黄色に変わった。反応混合液を室温で一晩撹拌し続けた。クルード反応混合液を水性ワークアップ、乾燥およびクロマトグラフィー（シリカゲルと、溶離剤としての石油エーテル／酢酸エチルとで）による精製にかけ、化合物I‐5を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値502.25。実測値：(-) 501 (M-1)。
（実施例６）
4-[3-ベンゾオキサゾール-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-7,8-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(6H)-イル]ブタン酸（化合物I‐6）

化合物I‐5（50mg）をDCM（5mL）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（0.5mL）をシリンジで加え、反応混合液を室温で一晩撹拌し続けた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、残渣を水（5mL）でトリチュレートした。形成された固体を濾取し、乾燥させ、化合物I‐6を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値446.16。実測値：(-) 445 (M-1)。
（実施例７）
4-[3-(ベンゾオキサゾール-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-7,8-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(6H)-イル]ブタン酸エチル（化合物I-7）

4-[6-ホルミル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-3,4-キノリン-1(2H)-イル]ブタン酸エチル（0.17g）を無水エタノール（2.5mL）に溶解させた。2-(ベンゾオキサゾール-2-イル)酢酸エチル（0.102g）を加え、混合液を室温で15分間撹拌した。ピペリジン（5μL）を加えた。反応混合液を室温で一晩撹拌し続けた。クルード反応混合液を水性ワークアップ、乾燥およびクロマトグラフィー（シリカゲルと、溶離剤としての石油エーテル／酢酸エチルとで）による精製にかけ、化合物I-7を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値472.20。実測値：(+) 473 (M+1)。
（実施例８）
4-[3-(ベンゾオキサゾール-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(6H)-イル]ブタン酸（化合物I-8）

化合物I-7（51.8mg）を酢酸（2.5mL）に溶解させ、塩酸（5mL）を加え、反応混合液を60℃で一晩撹拌し続けた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、残渣を水（5mL）でトリチュレートした。化合物I-8を濾取し、真空乾燥させた。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値444.17。実測値：(+) 445 (M+1)。
（実施例９）
3-[4-(3-(ベンゾオキサゾール-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(8H)-イル)-N-(4-(tert-ブトキシ)-4-オキソブチル)ブタンアミド]プロパン-1-スルホン酸（化合物I-9）

化合物I-8（50mg、112μmol）をジメチルホルムアミド（1mL）に溶解させ、次いで溶媒を真空留去した。この操作をさらに2回繰り返した後、乾燥した化合物I-8を室温でDMF（1mL）に再溶解させた。(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（PyBOP、1.5当量、64mg、169μmol）をフラスコに加えた後、N,N‐ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA、3当量、336μmol、43mg、58μL）をマイクロピペットで加えた。反応フラスコを窒素ガス下で密閉した。反応が完了した後、DMF中の活性化色素溶液を3-[(4-(tert-ブトキシ)-4-オキソブチル)アミノ]プロパン-1-スルホン酸（1.5当量、224μmol、63mg）と混合させた。さらにDIPEA（3当量、336μmol、43mg、58μL）を加えた。フラスコを窒素ガス下で再び密封し、室温で一晩放置した。反応の進行をTLC、HPLCおよび（LCMS）によってモニターした。反応が完了したら、水（2mL）を加え、反応混合液を15分間撹拌し、次いで溶媒を反応混合液から室温で真空留去した。化合物I-9を、それ以上精製せずに次の工程に使用した。
（実施例１０）
4-[4-(3-(ベンゾオキサゾール-2-イル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(8H)-イル)-N-(3-スルホプロピル)ブタンアミド]ブタン酸（化合物I-10）

乾燥クルード化合物I‐9を、ジクロロメタン（2mL）に再溶解させた。トリフルオロ酢酸（0.5mL）を加え、反応液を室温で一晩撹拌し続けた。反応を水でクエンチさせ真空濃縮させた後、分取HPLCにより精製した。生成物の純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値651.23。実測値：(-) 650 (M-1)。
（実施例１１）
4-[3-(ベンゾオキサゾール-2-イル)-8,8-ジメチル-2-オキソ-6-(スルホメチル)-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-9(8H)-イル)ブタン酸（化合物I-11）

硫酸（2.5mL）を約5℃に冷却し、次いで化合物I-8（45mg）を加え、反応混合液を20〜25℃で1時間撹拌した。次に反応混合液を室温で一晩保った。反応混合液を、外部冷却の存在下で、無水エーテルでゆっくり希釈した。沈殿物を濾取し、水（5mL）とアセトニトリル（5mL）との混合液に溶解させた。溶液を濾過し、分取HPLCにより精製した。生成物の純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値524.13。実測値：(-) 623 (M-1)。
（実施例１２）
1-[(5-カルボキシペンチル)-4-(11-オキソ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H,5H,11H-ピラノ[2,3-f]ピリド[3,2,1-ij]キノリン-10-イル]ピリジニウム臭化物（化合物I-12）

8-ヒドロキシ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H,5H-ピリド[3,2,1-ij]キノリン-9-カルバルデヒド（0.217g）をエタノール（6mL）に溶解させた。この溶液に、1-[(5-カルボキシペンチル)-(4-エトキソキシカルボニル)メチルピリジニウム臭化物（0.36g）を加え、混合液を室温で15分間撹拌した。ピペリジン（20mg）および酢酸（20mg）から調製した酢酸ピペリジン／エタノール（5mL）溶液を加え、この反応混合液を60℃で5時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水（15mL）とアセトニトリル（15mL）との混合液に溶解させた。得られた溶液を濾過し、分取HPLCにより精製した。この化合物を、より安定な臭化水素酸塩形態に変換し、化合物I‐12を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値432.20。実測値：(+) 433 (M+1)。
（実施例１３）
1-(5-カルボキシペンチル)-4-(1,1,7,7-テトラメチル-11-オキソ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1H,5H,11H-ピラノ[2,3-f]ピリド[3,2,1-ij]キノリン-10-イル)ピリジン-1-イウム臭化物（化合物I-13）

8-ヒドロキシ-2,3,6,7-テトラヒドロ-1,1,7,7-テトラメチル-1H,5H-ピリド[3,2,1-ij]キノリン-9-カルバルデヒド（0.27g）をエタノール（7mL）に溶解させた。1-[(5-カルボキシペンチル)-(4-エトキソキシカルボニル)メチルピリジニウム臭化物（0.36g）を加え、混合液を室温で30分間撹拌した。ピペリジン（20mg）および酢酸（20mg）から調製された酢酸ピペリジンのエタノール（5mL）溶液を加えた。この反応混合液を60℃で5時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。溶媒を留去し、赤色残渣を水（15mL）とアセトニトリル（15mL）との混合液に溶解させた。得られた溶液を濾過し、分取HPLCにより精製した。この化合物を、酢酸中のHBr溶液（10%、0.3mL）との反応により、より安定な臭化水素酸塩形態に変換し、化合物I‐13を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値488.27。実測値：(+) 489 (M+1)。
（実施例１４）
1-(5-カルボキシペンチル)-4-(9-エチル-2-オキソ-6,7,8,9-テトラヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-3-イル)ピリジン-1-イウム臭化物（化合物I-14）
1-エチル-7-ヒドロキシ-1,2,3,4-テトラヒドロキノリン-6-カルバルデヒド（0.2g）をエタノール（10mL）に溶解させた。1-[(5-カルボキシペンチル)-(4-エトキソキシカルボニル)メチルピリジニウム臭化物（0.36g）を加え、混合液を室温で30分間撹拌した。ピペリジン（20mg）および酢酸（20mg）から調製した酢酸ピペリジン／エタノール（5mL）の溶液を加えた。この反応混合液を80℃で2時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水（10mL）とアセトニトリル（10mL）との混合液に溶解させた。得られた溶液を濾過し、分取HPLCにより精製した。この化合物を、酢酸中のHBr溶液（10%、0.3mL）との反応により、より安定な臭化水素酸塩形態に変換し、化合物I‐14を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値420.20。実測値：(+) 421 (M+1)。
（実施例１５）
4-[4-(9-(4-(tert-ブトキシ)-4-オキソブチル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-6,7,8,9-テトラヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-3-イル)ピリジン-1-イウム-1-イル]ブタン-1-スルホン酸（化合物I-15）

4-(6-ホルミル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-3,4-ジヒドロキノリン-1(2H)-イル)ブタン酸tert-ブチル（0.72g）をエタノール（25mL）に溶解させた。4-[4-(2-エトキシ-2-オキソエチル)ピリジン-1-イウム-1-イル]ブタン-1-スルホン酸（0.60g）を加え、混合液を室温で30分間撹拌した。ピペリジン（50mg）および酢酸（50mg）から調製した酢酸ピペリジン／エタノール（15mL）の溶液を加えた。この反応混合液を80℃で3時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水（20mL）とアセトニトリル（20mL）との混合液に溶解させた。得られた溶液を濾過し、分取HPLCで精製し、化合物I-15を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値598.20。実測値：(+) 599 (M+1)。
（実施例１６）
4-[4-(9-(3-カルボキシプロピル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-6,7,8,9-テトラヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-3-イル)ピリジン-1-イウム-1-イル]ブタン-1-スルホン酸（化合物I-16）

化合物I‐15をDCM（5mL）に溶解させ、TFAを加えた。反応混合液を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空留去した。残渣に水（1.5mL）およびアセトニトリル（10mL）を加え、溶媒を再び留去してTFAを除去した。残った橙色結晶生成物を水（１2mL）とアセトニトリル（１2mL）との混合液に溶解させた。得られた溶液を濾過し、分取HPLCにより精製した。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値542.21。実測値：(+) 543 (M+1)。
（実施例１７）
4-[4-(9-(4-(tert-ブトキシ)-4-オキソブチル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-8,9-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-3-イル)ピリジン-1-イウム-1-イル]ブタン-1-スルホン酸（化合物I-17）

4-(6-ホルミル-7-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル-キノリン-1(2H)-イル)ブタン酸tert-ブチル（0.36g）をエタノール（5mL）に懸濁した。4-[4-(2-エトキシ-2-オキソエチル)ピリジン-1-イウム-1-イル]ブタン-1-スルホン酸（0.30g）を加え、混合液を室温で30分間撹拌した。ピペリジン（50mg）および酢酸（50mg）から調製された酢酸ピペリジンのエタノール（15mL）溶液を加えた。この反応混合液を50℃で5時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水（10mL）とアセトニトリル（10mL）との混合液に溶解させた。得られた溶液を濾過し、分取HPLCにより精製し、化合物I-17を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値596.26。実測値：(+) 597 (M+1)。
（実施例１８）
4-[4-(9-(3-カルボキシプロピル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-8,9-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-3-イル)ピリジン-1-イウム-1-イル]ブタン-1-スルホン酸（化合物I-18）

化合物I-17をDCM（5mL）に溶解させ、TFAを加えた。反応混合液を室温で一晩撹拌し、次いで溶媒を真空留去した。残渣に水（2mL）およびアセトニトリル（10mL）を加え、溶媒を再度留去して残渣のTFAを除去した。残った橙色結晶生成物をエーテルでトリチュレートし、濾過し、分取HPLCにより精製して化合物I-18を得た。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値540.19。実測値：(-) 539 (M-1); (+) 541 (M+1)。
（実施例１９）
4-(4-(9-(4-((4-(tert-ブトキシ)-4-オキソブチル)(3-スルホプロピル)アミノ)-4-オキソブチル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-8,9-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-3-イル)ピリジン-1-イウム-1-イル)ブタン-1-スルホン酸（化合物I-19）

化合物I-8（50mg）をDMF（1mL）に溶解した後、溶媒を真空留去した。この操作を2回繰り返した。乾燥した化合物I-8を室温でDMF（1.5mL）に再溶解させた。(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（PyBOP、1.5当量、64mg、169μmol）をフラスコに加え、次いで過剰のDIPEA（60μL）を加えた。反応フラスコを窒素ガス下で密閉した。反応が完了した後、DMF中の活性化色素溶液を、3-[(4-(tert-ブトキシ)-4-オキソブチル)アミノ]プロパン-1-スルホン酸（63mg）と混合した。さらにDIPEA（58μL）を加えた。フラスコを窒素ガス下で再び密封し、室温で一晩放置した。反応の進行をTLC、HPLCおよび（LCMS）によってモニターした。反応が完了したら、水（2mL）を加えた。反応混合液を15分間撹拌し、次いで溶媒を反応混合液から室温で真空留去し、化合物I-19を得た。この化合物を、さらに精製することなく次の工程に使用した。
（実施例２０）
4-(4-(9-(4-((3-カルボキシプロピル)(3-スルホプロピル)アミノ)-4-オキソブチル)-6,8,8-トリメチル-2-オキソ-8,9-ジヒドロ-2H-ピラノ[3,2-g]キノリン-3-イル)ピリジン-1-イウム-1-イル)ブタン-1-スルホン酸（化合物I-20）

乾燥した化合物I-19をジクロロメタン（5mL）に溶解させた。トリフルオロ酢酸（0.5mL）を加え、反応液を室温で一晩撹拌し続けた。反応を水（0.5mL）でクエンチさせ、真空濃縮し、次いで分取HPLCにより精製した。生成物の純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値747.25。実測値：(-) 746 (M-1)。
（実施例２１）
1-(5-カルボキシペンチル)-4-(7-(ジエチルアミノ)-2-オキソ-2H-クロメン-3-イル)ピリジン-1-イウム臭化物（化合物I-21）

4-ジエチルアミノサリシル酸アルデヒド（0.19g）をエタノール（5mL）に溶解させた。1-[(5-カルボキシペンチル)-(4-エトキソキシカルボニル)メチルピリジニウム臭化物（0.36g）を加え、混合液を室温で30分間撹拌した。ピペリジン（10mg）および酢酸（10mg）から調製した酢酸ピペリジン／エタノール（5mL）の溶液を加えた。この反応混合液を70℃で5時間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。生成物を濾取し、酢酸中のHBr溶液（20%、1mL）に懸濁した。この懸濁液を室温で2時間撹拌し、最終生成物を濾取し、化合物I‐2１のより安定なHBr塩を得た。この色素を、さらに精製することなく次の工程に使用した。純度、構造および組成を、HPLC、NMRおよびLCMSにより確認した。MS (DUIS)：MW計算値408.20。実測値：(+) 409 (M+1)、817 (2M+1)。
表２は、実施例に開示されている新規クマリン蛍光色素の収率、特性評価データ、およびスペクトル特性を要約している。

（実施例２２）
（完全官能性ヌクレオチドコンジュゲートの合成のための一般的手順）
本明細書に開示されるクマリン蛍光色素を、カルボキシル基の活性化後に、適切なアミノ置換ヌクレオチドA-LN3-NH2またはC-LN3-NH2とカップリングさせる：
色素（10μmol）をジメチルホルムアミド（1mL）に溶解させ、次いで溶媒を真空留去する。この手順をあと2回繰り返す。乾燥した色素を、5mLの丸底フラスコ中のN,N‐ジメチルアセトアミド（DMA、0.2mL）に室温で溶解させる。
N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロホウ酸（TSTU、1.5当量、15μmol、4.5mg）をフラスコに加え、次いでN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA、3当量、30μmol、3.8mg、5.2μL）をマイクロピペットでこの溶液に加える。反応フラスコを窒素ガス下で密閉する。15分後、反応の進行をTLC（溶離剤H20／アセトニトリル1:9）およびHPLCによってモニターする。その間に、適切なN-LN3-NH2誘導体（20mM、1.5当量、15μmol、0.75mL）の溶液を真空濃縮し、次いで水（20μL）に再溶解させる。活性化色素のDMA溶液を、N-LN3-NH2の溶液を含むフラスコに移す。さらにDIPEA（3当量、30μmol、3.8mg、5.2μL）を、トリエチルアミン（1μL）とともに加える。カップリングの進行を、TLC、HPLCおよびLCMSによって1時間毎にモニターする。
反応が完了したら、重炭酸トリエチルアミン緩衝液（TEAB、約0.05M、3mL）をピペットで加える。完全官能化ヌクレオチドの最初の精製は、クエンチした反応混合液をDEAE-Sephadex（登録商標）カラム（空の25g Biotageカートリッジ、溶媒系TEAB/MeCNに注いだSephadex）に通すことによって行う。これにより、残っている色素の大部分が取り除かれる。
Sephadexカラムからの画分を真空濃縮する。クルード物質を最小量の水およびアセトニトリルに再溶解した後、20μmナイロンフィルターを通して濾過する。濾過した溶液を分取HPLCにより精製する。調製した化合物の組成を、LCMSにより確認した。
表３は、本明細書に開示される新規クマリン色素で標識されたさまざまなヌクレオチドの構造およびスペクトル特性を要約している。ffA-LN3-色素は、LN3リンカーを有し、本明細書に開示されるクマリン色素で標識された完全官能化Aヌクレオチドを指す。ffC-LN3-色素（Ｄｙｅ）は、LN3リンカーを有し、本明細書に開示されるクマリン色素で標識された完全官能化Cヌクレオチドを指す。各構造中のR基は、コンジュゲーション後のクマリン色素部位を指す。
長いストークスシフトを有する新規クマリン色素I-16で標識されたAヌクレオチドの効率は、市販の色素DY510XLおよびChromeo（登録商標）494（CH494）で標識された適切なAヌクレオチドと比較することによって実証された。この配列決定例では、2チャンネル検出法を使用した。本明細書に記載の2チャネル法に関して、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2013/0079232号に記載の方法およびシステムを利用して、核酸を配列決定することができる。2チャネル検出では、第1のチャネルで検出される第1のヌクレオチド型、第2のチャネルで検出される第2のヌクレオチド型、第1および第2のチャネルの両方で検出される第3のヌクレオチド型、ならびにどちらのチャネルにおいても検出されないか、または最小限にしか検出されない標識を欠く第4のヌクレオチド型を提供することによって、核酸を配列決定することができる。散布図を、I-16、Dy510XLおよびChromeo（商標）494で標識された完全官能化Aヌクレオチドの相対強度を比較する実験のRTA2.0.93分析によって作成した。配列決定プライマーを再ハイブリダイズさせ、短い（26サイクル）SBS実行を行うことにより、比較を同じ実行で行った（同じフローセルおよび配列決定試薬）。図１〜図３に示されている散布図は、26サイクル実行のそれぞれのサイクル5にあった。
図１は、取り込み緩衝液中において、A-I-16（2μM）、C-NR440（2μM）、暗色G（2μM）およびT-NR550S0（1μM）を含有する完全官能化ヌクレオチド（ffN）混合物の、Pol812での散布図を示す（青色露光（チャネル1）500ms、緑色露光（チャネル2）1000ms；走査ミックスで走査）。
図２は、取り込み緩衝液中において、A-DY510XL（2μM）C-NR440（2μM）、暗色G（2μM）およびT-NR550S0（1μM）を含有するffN混合物の、Pol812での散布図を示す（青色露光（チャネル1）500ms、緑色露光（チャネル2）1000ms、SREで走査）。
図３は、取り込み緩衝液中において、A-CH494（2μM）、C-NR440（2μM）、暗色Ｇ（2μM）およびT-NR550S0（1μM）を含有するffN混合物の、Pol812での散布図を示す（青色露光（チャネル1）500ms、緑色露光（チャネル2）1000ms；走査ミックスで走査）。
図１〜３の各図において、「G」ヌクレオチドは標識されておらず、左下の雲として示される（「暗色G」）。新規クマリン色素I-16、DY510XL、およびCH494標識された「A」ヌクレオチドからのシグナルは、図１、２、および３それぞれにおいて右上の雲として示される。NR550S0色素標識された「T」ヌクレオチドからのシグナルは、左上の雲によって示され、NR440色素標識された「C」ヌクレオチドシグナルは、右下の雲によって示される。X軸は1つのチャネルの信号強度を示し、Y軸は他のチャネルの信号強度を示す。それは、色素I-16で標識された完全官能性A‐ヌクレオチドコンジュゲートが、市販のロングストークスシフト色素DY510XLおよびCH494と比較して、十分な信号強度と、実質的により良好な雲分離とを提供することを示す。NR440の構造は、米国仮特許出願第62/402,635号に開示されている。

Claims (66)

  1. 式（I）の化合物、またはその塩、メソメリー形態：

    ［式中、R1は

    であり、ここで、R1は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C-カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたシクロアルキル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択される1つ以上の置換基で任意に置換され；
    各R2、R3、R4、R5、およびR9は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
    各R6、R10a、R10bおよびR10cは、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
    各R7およびR8は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
    あるいは、R6およびR7は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換された5〜10員ヘテロアリールまたは任意に置換された5〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択される環または環系を形成し；
    Xは、O、S、NR11、およびSeからなる群より選択され；
    R11は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、カルボキシアルキル、スルホナトアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホ、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；ならびに
    実線と破線とで表される結合
    は、単結合および二重結合からなる群より選択されるが、ただし、
    が二重結合の場合、R3は存在しない］。
  2. R1が
    である、請求項１に記載の化合物。
  3. XがOである、請求項２に記載の化合物。
  4. XがSである、請求項２に記載の化合物。
  5. R1が
    である、請求項１に記載の化合物。
  6. R1が
    である、請求項１に記載の化合物。
  7. 各R10aおよびR10bが置換アルキルである、請求項５または６に記載の化合物。
  8. 各R10aおよびR10bが、カルボキシル、カルボキシレート、スルホまたはスルホネートで置換されたアルキルである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. R1が、アルキル、ハロ、およびC‐カルボキシからなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
  10. 前記実線と破線とで表される結合
    が二重結合である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. R2がアルキルである、請求項１０に記載の化合物。
  12. R2がメチルである、請求項１１に記載の化合物。
  13. 各R4およびR5がHである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
  14. R4およびR5の少なくとも一方がアルキルである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
  15. 各R4およびR5がアルキルである、請求項１４に記載の化合物。
  16. 各R4およびR5がメチルである、請求項１５に記載の化合物。
  17. 前記実線と破線とで表される結合
    が単結合である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
  18. R2およびR3の少なくとも一方がアルキルである、請求項１７に記載の化合物。
  19. R2およびR3の各々がアルキルである、請求項１８に記載の化合物。
  20. R2およびR3の少なくとも一方がHである、請求項１７に記載の化合物。
  21. R2およびR3の各々がHである、請求項２０に記載の化合物。
  22. R4およびR5の少なくとも一方がHである、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
  23. R4およびR5の少なくとも一方がアルキルである、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
  24. R6が置換アルキルである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物。
  25. R6がカルボキシルで置換されたアルキルである、請求項２４に記載の化合物。
  26. R6が‐C(O)OR12で置換されたアルキルであり、ここで、R12が、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、および任意に置換された3〜7員シクロアルキルからなる群より選択される、請求項２４に記載の化合物。
  27. R6が‐C(O)NR13R14で置換されたアルキルであり、ここで、各R13およびR14が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換された3〜7員シクロアルキルから選択される、請求項２４に記載の化合物。
  28. 各R13およびR14が、独立して、カルボキシル、カルボキシレート、‐C(O)OR12、スルホおよびスルホネートからなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されたアルキルから選択される、請求項２７に記載の化合物。
  29. R7がHである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物。
  30. R6およびR7が、それらが結合している原子と一緒になってつながり、任意に置換された6員ヘテロシクリルを形成する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物。
  31. 前記任意に置換された6員ヘテロシクリルが1個のヘテロ原子を含有する、請求項３０に記載の化合物。
  32. 前記6員ヘテロシクリルが1つ以上のアルキルで置換されている、請求項３０または３１に記載の化合物。
  33. R8がHである、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の化合物。
  34. R9がHである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の化合物。
  35. 以下からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物：
    またはそれらの塩、メソメリー形態。
  36. 前記化合物が、R6を介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、ここで、R6が置換アルキルである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の化合物。
  37. 前記化合物が、R10a、R10b、もしくはR10cを介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、ここで、R10a、R10b、およびR10cの各々が置換アルキルである、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の化合物。
  38. 少なくとも約60nmのストークスシフトを有する式（II）の蛍光化合物、またはその塩、メソメリー形態：
    ［式中、RHetは、1つ以上のR10で任意に置換された5〜10員ヘテロアリールであり；
    各R1、R2、R3、R4、およびR5は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
    R6は、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
    各R7およびR8は、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルコキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアルキル、C‐カルボキシ、O‐カルボキシ、C‐アミド、N‐アミド、ニトロ、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、S‐スルホンアミド、N‐スルホンアミド、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
    あるいは、R6およびR7は、それらが結合している原子と一緒になって、任意に置換された5〜10員ヘテロアリールまたは任意に置換された5〜10員ヘテロシクリルからなる群より選択される環または環系を形成し；
    各R10は、独立して、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノアルキル、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アルコキシアルキル、スルホニルヒドロキシド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、任意に置換されたカルボシクリル、および任意に置換されたヘテロシクリルからなる群より選択され；
    実線と破線とで表される結合
    は、単結合および二重結合からなる群より選択されるが、ただし、
    が二重結合の場合、R3は存在しない］。
  39. RHetが、1つ以上のR10で任意に置換された6員ヘテロアリールである、請求項３８に記載の蛍光化合物。
  40. RHetが、

    である、請求項３９に記載の蛍光化合物。
  41. RHetが、1つ以上のR10で任意に置換された9員ヘテロアリールである、請求項３８に記載の蛍光化合物。
  42. RHetが、1つ以上のR10でそれぞれ任意に置換されたベンゾチアゾリルまたはベンゾオキサゾリルから選択される、請求項４１に記載の蛍光化合物。
  43. 前記実線と破線とで表される結合
    が二重結合である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の化合物。
  44. R2がアルキルである、請求項４３に記載の化合物。
  45. R4およびR5の少なくとも一方がアルキルである、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の化合物。
  46. 前記実線と破線とで表される結合
    が単結合である、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の化合物。
  47. R2およびR3の少なくとも一方がアルキルである、請求項４６に記載の化合物。
  48. R2およびR3の少なくとも一方がHである、請求項４６に記載の化合物。
  49. R4およびR5の少なくとも一方がアルキルである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の化合物。
  50. R4およびR5の少なくとも一方がHである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の化合物。
  51. R6が置換アルキルである、請求項３８〜５０のいずれか一項に記載の化合物。
  52. R6が、カルボキシル、‐C(O)OR12、および‐C(O)NR13R14から選択される1つ以上の置換基で置換されたアルキルであり、ここで、R12が、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、および任意に置換された3〜7員シクロアルキルからなる群より選択され、各R13およびR14が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールおよび任意に置換された3〜7員シクロアルキルから選択される、請求項５１に記載の化合物。
  53. 各R13およびR14が、独立して、カルボキシル、カルボキシレート、‐C(O)OR12、スルホおよびスルホネートからなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されたアルキルから選択される、請求項５２に記載の化合物。
  54. R6およびR7が、それらが結合している原子と一緒になってつながり、任意に置換された6員ヘテロシクリルを形成する、請求項３８〜５０のいずれか一項に記載の化合物。
  55. 請求項１〜５４のいずれか一項に記載の化合物で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
  56. 前記化合物が、R6を介して前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、ここでR6が置換アルキルである、請求項５５に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
  57. 前記化合物が、R10を介して前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合しており、ここでR10が置換アルキルである、請求項５５に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
  58. 前記化合物が、リンカー部位を介して、前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのピリミジン塩基のC5位もしくは7‐デアザプリン塩基のC7位に結合している、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
  59. 前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのリボースもしくはデオキシリボース糖に共有結合している3'-OHブロッキング基をさらに含む、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
  60. 1つ以上のヌクレオチドを含むキットであって、ここで少なくとも1つのヌクレオチドが請求項５５〜５９に記載の標識ヌクレオチドである、キット。
  61. 2つ以上の標識ヌクレオチドを含む、請求項６０に記載のキット。
  62. 前記標識ヌクレオチドのうちの2つが、単一レーザーを使用して励起される、請求項６１に記載のキット。
  63. 第3および第4ヌクレオチドをさらに含むキットであって、ここで、第2、第3および第4ヌクレオチドの各々が異なる化合物で標識されており、各化合物が異なる最大吸光度を有し、前記化合物の各々が他の前記化合物と区別可能である、請求項６１または６２に記載のキット。
  64. 請求項５５〜５９のいずれか一項に記載のヌクレオチドを配列決定アッセイに組み込む工程を含む、配列決定方法。
  65. 前記ヌクレオチドを検出する工程をさらに含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記配列決定アッセイが自動配列決定機器上で行われ、ここで前記自動配列決定機器が異なる波長で作動する2つの光源を含む、請求項６４または６５に記載の方法。
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