CN119095983A - 用于边合成边测序的过渡金属催化剂组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用于边合成边测序的组合物和方法。核苷酸的封端基团可以通过过渡金属催化剂去除，该过渡金属催化剂由非还原配体和还原剂活化。

Description

用于边合成边测序的过渡金属催化剂组合物和方法

背景

技术领域

本公开整体涉及多核苷酸测序方法、组合物和用于测序的试剂盒。本公开还涉及去除封端基团的方法。

背景技术

一直以来，分子研究的进展在某种程度上是由用于表征分子或其生物反应的技术的改进所引起的。特别地，核酸DNA和RNA研究得益于对用于序列分析的技术的开发以及对杂交事件的研究。

已改进核酸研究的技术的一个示例是开发固定化核酸的装配阵列。这些阵列通常由固定到固体载体材料上的多核苷酸的高密度矩阵组成。参见例如，Fodor等人，TrendsBiotech.12:19-26,1994，其描述了使用化学敏化玻璃表面组装核酸的方法，该化学敏化玻璃表面受掩模保护，但在限定的区域暴露以允许连接经适当修饰的核苷酸亚磷酰胺。装配阵列也可以通过将已知的多核苷酸“点样”到固体载体上的预定位置的技术来制造(例如，Stimpson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.92:6379-6383,1995)。

确定与阵列结合的核酸的核苷酸序列的一种方法被称为“边合成边测序”或“SBS”。在理想情况下，用于测定DNA的核苷酸序列的这种技术需要有控制地(即，每次一个)掺入与正在测序的核酸相反的正确互补核苷酸。这使得能够通过在多个循环中添加核苷酸来准确测序，由于每次只测序一个核苷酸残基，从而防止不受控制地掺入核苷酸序列。使用与掺入的核苷酸连接的适当标记来读取掺入的核苷酸，之后除去该标记部分，并进行随后的下一轮测序。

为了确保仅掺入单个核苷酸，在每个标记的核苷酸中包括结构修饰(“保护基团”或“封端基团”)，该结构修饰被添加到生长链以确保仅掺入一个核苷酸。在添加具有保护基团的核苷酸后，在不干扰正在测序的DNA的完整性的反应条件下除去该保护基团。然后可继续测序循环，掺入下一个受保护的标记核苷酸。为了用于DNA测序，核苷酸(通常是核苷酸三磷酸)一般需要3'-羟基封端基团，以便一旦在该核苷酸上添加碱基，就防止用于将其掺入多核苷酸链中的聚合酶继续复制。

测序循环的每个步骤都采用不同的组合物。例如，在掺入步骤期间采用包含聚合酶和一种或多种不同类型的核苷酸的掺入组合物。扫描组合物尤其可以包括抗氧化剂，该抗氧化剂在检测步骤期间保护多核苷酸免受光诱导的损伤，例如，当核苷酸包含用于检测的荧光团标记时。在解封端步骤期间采用解封端组合物，该解封端组合物包含用于从所掺入的核苷酸中裂解封端部分(例如，3'羟基封端基团)的试剂。裂解试剂，诸如在存在水溶性膦配体的情况下从钯络合物制备的钯(Pd)催化剂，已经在解封端组合物中有所报道，例如，美国公开第2020/0216891号和第2021/0403500号，这些文献中的每一篇均全文以引用方式并入。Pd有能力主要以其无活性的Pd(II)形式粘附在DNA上，这可能干扰DNA与聚合酶之间的结合，从而导致定相增加。在解封步骤之后，可以使用包含Pd清除剂化合物的裂解后洗涤组合物。例如，PCT公开第WO 2020/126593号公开了Pd清除剂(诸如3,3’-二硫代二丙酸(DDPA)和硫辛酸(LA))可以包含在扫描组合物和/或裂解后洗涤组合物中。在裂解后洗涤溶液中使用这些清除剂的目的是清除Pd(0)、将Pd(0)转化为无活性的Pd(II)形式，从而改善预定相值和测序指标、减少信号劣化，并且延长测序读段长度。然而，存在对开发用于测序的每个步骤以优化性能的组合物的持续需求。

发明内容

本公开的一个方面涉及一种用于确定多种靶多核苷酸的序列的方法，该方法包括：

(a)使固体载体在杂交条件下与测序引物接触，其中所述固体载体包含多种固定在其上的靶多核苷酸；并且所述测序引物与所述靶多核苷酸的至少一部分互补；

(b)在适合于DNA聚合酶介导的引物延伸的条件下，使该固体载体与第一水溶液接触，该第一水溶液包含DNA聚合酶和四种不同类型的核苷酸中的一种或多种类型的核苷酸，其中这些核苷酸中的每种核苷酸包含3'封端基团，该3'封端基团包含未取代的或取代的烯丙基基团；

(c)将一种类型的核苷酸掺入到所述测序引物中以产生延伸的拷贝多核苷酸；

(d)对所述延伸的拷贝多核苷酸执行一次或多次荧光测量；

(e)在包含过渡金属催化剂和一种或多种还原剂的第二水溶液中去除所掺入的核苷酸的该3'封端基团，该过渡金属催化剂由具有水溶性非还原膦或N,N-双齿非膦配体的钯或镍络合物产生，并且其中该一种或多种还原剂包括含硼还原剂；以及

(f)在去除所掺入的核苷酸的该3'封端基团之后，用第三水溶液对该固体载体进行洗涤。

本公开的另一方面涉及一种与测序设备一起使用的试剂盒，该试剂盒包括：含水裂解混合物，该含水裂解混合物包含过渡金属催化剂和一种或多种还原剂，其中该过渡金属催化剂由具有水溶性非还原膦或N,N-双齿非膦配体的钯或镍络合物产生，并且其中该一种或多种还原剂包括含硼还原剂。

本公开的另外的方面涉及一种与测序设备一起使用的盒，该盒包括多个室，其中该多个室中的一个室与本文所述的包括含水裂解混合物的试剂盒一起使用。

附图说明

图1是与还原膦配体(THPP)、不含还原剂的非还原膦配体(TCEP)和含还原剂(NH₃BH₃)的非还原膦配体(TCEP)混合的Pd(II)络合物的3'封端基团的裂解率百分比随时间变化的线形图。

图2是当Pd(II)络合物与非还原膦配体TCEP在存在还原剂的情况下在pH 7下混合时，与标准通用裂解混合物(UCM)在两种不同pH(pH为7和9.5)下相比，3'封端基团的裂解率百分比随时间变化的线形图。

图3是当与100％或50％钯催化剂浓度的标准UCM比较时，当Pd(II)络合物与50％浓度的TCEP混合时，3'封端基团的裂解率百分比随时间变化的线形图。

图4是在Illumina的iSeq^TM平台上作为测序循环的函数的定相百分比和预定相百分比的线形图，该线形图比较标准UCM与根据本公开的实施方案的Pd裂解混合物的性能。

图5A展示了与由N,N-双齿非膦配体产生的钯催化剂相比，使用标准通用裂解混合物的Pd(0)形成。

图5B展示了与由N,N-双齿非膦配体产生的钯催化剂相比，使用标准通用裂解混合物对含有AOM基团的底物的裂解率百分比。

具体实施方式

本公开的一些方面涉及核酸测序的方法，其中过渡金属催化剂活化包括单独的配位和还原步骤。具体地，本文所述的测序方法涉及使用过渡金属催化剂，例如钯(Pd)催化剂或镍(Ni)催化剂与非还原配体，例如水溶性膦和还原剂在下一个掺入循环之前裂解掺入的核苷酸的3'羟基封端基团。在一些实施方案中，水溶性膦包括三[取代的烷基]膦。在一些实施方案中，钯(Pd)络合物是Pd(0)络合物。在一些实施方案中，镍(Ni)络合物是Ni(0)络合物。在一些实施方案中，还原剂包含硼。本公开的一些方面通常涉及去除封端基团的方法。

定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包含(including)”以及如“包含(include)”、“包含(includes)”、和“包含(included)”等其他形式的使用不具限制性。术语“具有(having)”以及如“具有(have)”、“具有(has)”、和“具有(had)”等其他形式的使用不具限制性。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含”和“包括”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。

在提供值的范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限以及上限与下限之间的每个中间值均涵盖在这些实施方案内。

如本文所用，常见的有机缩写定义如下：

℃以摄氏度计的温度

dATP 三磷酸脱氧腺苷

dCTP 三磷酸脱氧胞苷

dGTP 三磷酸脱氧鸟苷

dTTP 三磷酸脱氧胸苷

ddNTP 三磷酸双脱氧核苷酸

ffN 完全官能化核苷酸

ffA 完全官能化“A”核苷酸

ffC 完全官能化“C”核苷酸

ffT 完全官能化“T”核苷酸

ffG 完全官能化“G”核苷酸

IMX掺入混合物(“Incorporation mix”或“Incorporation mixture”)

Ni 镍

Pd 钯

RT 室温

SBS 边合成边测序

TCEP三(2-羧乙基)膦

THPP三(羟丙基)膦

如本文所用，术语“阵列”是指连接到一个或多个底物的一组不同探针分子，使得这些不同探针分子可根据相对位置彼此区分。阵列可包括各自位于底物上的不同可寻址位置处的不同探针分子。替代性地或另外地，阵列可包括各自带有不同探针分子的单独底物，其中可根据底物在底物所连接到的表面上的位置或根据底物在液体中的位置来识别不同的探针分子。其中单独底物位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中包含珠粒的那些，如例如美国专利第6,355,431B1号、US2002/0102578和PCT公开第WO 00/63437号中所述的。例如，在美国专利第6,524,793号中描述了在本发明中可用于例如使用微流体装置，诸如荧光活化细胞分选器(FACS)区分液体阵列中的珠粒的示例性形式。可用于本发明的阵列的另外的示例包括但不限于美国专利第5,429,807号；第5,436,327号；第5,561,071号；第5,583,211号；第5,658,734号；第5,837,858号；第5,874,219号；第5,919,523号；第6,136,269号；第6,287,768号；第6,287,776号；第6,288,220号；第6,297,006号；第6,291,193号；第6,346,413号；第6,416,949号；第6,482,591号；第6,514,751号和第6,610,482号；和WO93/17126；WO 95/11995；WO 95/35505；EP 742287；和EP 799 897中描述的那些。

如本文所用，术语“共价连接的”或“共价键合的”是指形成特征在于原子之间共用电子对的化学键合。例如，共价连接的聚合物涂层是指与底物的官能化表面形成化学键的聚合物涂层，这与经由其他方式(例如，粘附或静电相互作用)粘附到该表面形成比较。应当理解，共价连接到表面的聚合物也可以经由除共价连接之外的方式键合。

如本文所用，“活化(activate或activating)”过渡金属催化剂(例如钯催化剂或镍催化剂)包括但不限于(1)将非活性形式的过渡金属(例如Pd(II)或Ni(II))暴露于还原配体以将过渡金属转化为活性形式(例如Pd(0)或Ni(0))，或(2)将非活性形式的过渡金属(例如Pd(II)或Ni(II))暴露于非还原配体和还原剂以将过渡金属转化为活性形式(例如Pd(0)或Ni(0))。

如本文所用，使钯催化剂“失活(inactivate或inactivating)”包括但不限于以下若干使用钯清除剂的机制：(1)钯清除剂可以作为消耗粘附在核酸上的任何其余的活性Pd(0)的竞争性底物；(2)钯清除剂可以作为将活性Pd(0)转化为非活性Pd(II)形式的氧化剂；以及(3)钯清除剂可以作为除去粘附在核酸上的Pd(例如，Pd(0)或Pd(II))的竞争性配体。

如本文所用，任何“R”基团均表示可以连接到指定原子的取代基。R基团可为取代的或未取代的。

应当理解，根据上下文，某些基团命名惯例可以包括单基或二基。例如，当取代基需要两个与分子其余部分的连接点时，应当理解，该取代基为二基。例如，被识别为需要两个连接点的烷基的取代基包括二基，诸如-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH(CH₃)CH₂-等。其他基团命名惯例清楚地指示该基团为二基，诸如“亚烷基”或“亚烯基”。

如本文所用，术语“卤素”或“卤基”意味着元素周期表第7列的放射性稳定原子中的任一种，例如，氟、氯、溴或碘，其中氟和氯是优选的。

如本文所用，其中“a”和“b”是整数的“C_a-C_b”、“C_a-C_b”或“C_a-b”是指烷基、烯基或炔基基团中的碳原子数，或环烷基或芳基基团的环原子数。即，烷基、烯基、炔基、环烷基的环和芳基的环可以含有“a”至“b”个(包括端值在内)的碳原子。例如，“C₁至C₄烷基”基团是指具有1个至4个碳的所有烷基基团，即CH₃-、CH₃CH₂-、CH₃CH₂CH₂-、(CH₃)₂CH-、CH₃CH₂CH₂CH₂-、CH₃CH₂CH(CH₃)-和(CH₃)₃C-；C₃至C₄环烷基基团是指具有3至4个碳原子的所有环烷基基团，即环丙基和环丁基。类似地，“4至6元杂环基”基团是指具有4至6个总环原子的所有杂环基基团，例如氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、噁唑啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉等。如果对于烷基、烯基、炔基、环烷基或芳基基团没有指定“a”和“b”，则将假设这些定义中描述的最广泛范围。如本文所用，术语“C₁-C₆”包括C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆，以及由这两个数字中的任一者定义的范围。例如，C₁-C₆烷基包括C₁烷基、C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基和C₆烷基、C₂-C₆烷基、C₁-C₃烷基等。类似地，C₂-C₆烯基包括C₂烯基、C₃烯基、C₄烯基、C₅烯基和C₆烯基、C₂-C₅烯基、C₃-C₄烯基等；并且C₂-C₆炔基包括C₂炔基、C₃炔基、C₄炔基、C₅炔基和C₆炔基、C₂-C₅炔基、C₃-C₄炔基等。C₃-C₈环烷基各自包括含有3、4、5、6、7和8个碳原子或由任何两个数字限定的范围的烃环，诸如C₃-C₇环烷基或C₅-C₆环烷基。

如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子(每当在本文中出现时，诸如“1至20”的数值范围是指给定范围内的每个整数；例如，“1至20个碳原子”意味着烷基基团可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，最多至并包括20个碳原子组成，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烷基”)。烷基基团还可以是具有1至9个碳原子的中等大小烷基。烷基基团还可以是具有1至6个碳原子的低级烷基。烷基基团可以被命名为“C₁-C₄烷基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C_1-C₆烷基”表示烷基链中存在一至六个碳原子，即，烷基链选自由甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基组成的组。典型的烷基基团包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。

如本文所用，“烷氧基”是指式-OR(其中R为如上文所定义的烷基)，诸如“C_1-C₉烷氧基”，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。

如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可具有2至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烯基”。烯基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小烯基。烯基基团还可以是具有2至6个碳原子的低级烯基。烯基基团可以被命名为“C_2-C₆烯基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C_2-C₆烯基”表示烯基链中存在两至六个碳原子，即，烯基链选自由乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2-二烯基和丁-1,2-二烯-4-基组成的组。典型的烯基基团包括但绝不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基等。

术语“芳族”是指具有共轭π电子体系的环或环系，并且包括碳环芳族基团(例如，苯基)和杂环芳族基团(例如，吡啶)这两者。该术语包括单环基团或稠环多环(即，共用相邻原子对的环)基团，前提条件是整个环系是芳族的。

如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可以具有6至18个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“芳基”。在一些实施方案中，芳基基团具有6至10个碳原子。芳基基团可以被命名为“C₆-C₁₀芳基”、“C₆或C₁₀芳基”或类似的名称。芳基基团的示例包括但不限于苯基、萘基、薁基和蒽基。

“芳烷基”或“芳基烷基”为作为取代基经由亚烷基基团连接的芳基基团，诸如“C_7-14芳烷基”等，包括但不限于苄基、2-苯基乙基、3-苯基丙基和萘基烷基。在一些情况下，亚烷基基团为低级亚烷基基团(即，C_1-C₆亚烷基基团)。

如本文所用，“芳氧基”是指RO-，其中R是如上文所定义的芳基，诸如但不限于苯基。

如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可以具有5至18个环成员(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂芳基”。在一些实施方案中，杂芳基基团具有5至10个环成员或者5至7个环成员。杂芳基基团可以被命名为“5至7元杂芳基”、“5至10元杂芳基”或类似的名称。杂芳基环的示例包括但不限于呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基和苯并噻吩基。

“杂芳烷基”或“杂芳基烷基”为作为取代基经由亚烷基基团连接的杂芳基基团。示例包括但不限于2-噻吩基甲基、3-噻吩基甲基、呋喃基甲基、噻吩基乙基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异噁唑基烷基和咪唑基烷基。在一些情况下，亚烷基基团为低级亚烷基基团(即，C_1-C₆亚烷基基团)。

如本文所用，“碳环基”意味着在环系骨架中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系。当碳环基为环系时，两个或更多个环可以以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。碳环基可以具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可以具有3至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“碳环基”。碳环基基团也可以是具有3至10个碳原子的中等大小碳环基。碳环基基团也可以是具有3至6个碳原子的碳环基。碳环基基团可以被命名为“C_3-C₆碳环基”或类似的名称。碳环基环的示例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛烷基、金刚烷基和螺[4.4]壬烷基。

如本文所用，“环烷基”意味着完全饱和的碳环基环或环系。示例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。

如本文所用，“杂环基”是指在环骨架中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环基可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个环不是芳族的。杂原子可以存在于环系中的非芳族环或芳族环中。杂环基基团可以具有3至20个环元(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂环基”。杂环基基团也可以是具有3至10个环元的中等大小杂环基。杂环基基团也可以是具有3至6个环元的杂环基。杂环基基团可以被命名为“3至6元杂环基”或类似的名称。在优选的六元单环杂环基中，杂原子选自O、N或S中的一个至最多三个，并且在优选的五元单环杂环基中，杂原子选自一个或两个选自O、N或S的杂原子。杂环基环的示例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、哌啶基、哌嗪基、二氧代哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基、4-哌啶酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二噁英基、1,3-二噁烷基、1,4-二噁英基、1,4-二噁烷基、1,3-氧硫杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烯基、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-噁嗪基、三噁烷基、六氢-1,3,5-三嗪基、1,3-间二氧杂环戊烯基、1,3-二氧戊环基、1,3-二噻吩基、1,3-二噻烷基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑烷酮基、噻唑啉基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂环戊烷基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基和四氢喹啉。

如本文所用，“(芳基)烷基”是指作为取代基经由如上文所述的亚烷基基团连接的如上文所定义的芳基基团。芳烷基的亚烷基和芳基基团可为取代的或未取代的。示例包括但不限于苄基、2-苯基烷基、3-苯基烷基和萘基烷基。在一些实施方案中，亚烷基是含有1、2、3、4、5或6个亚甲基单元的未取代的直链。

如本文所用，“(杂芳基)烷基”是指作为取代基经由如上文所定义的亚烷基基团连接的如上文所定义的杂芳基基团。杂芳烷基的亚烷基和杂芳基基团可为取代的或未取代的。示例包括但不限于2-噻吩基烷基、3-噻吩基烷基、呋喃基烷基、噻吩基烷基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异噁唑基烷基和咪唑基烷基，以及它们的苯并稠合类似物。在一些实施方案中，亚烷基是含有1、2、3、4、5或6个亚甲基单元的未取代的直链。

如本文所用，“(杂环基)烷基”是指作为取代基经由如上文所定义的亚烷基基团连接的如上文所定义的杂环或杂环基基团。(杂环基)烷基的亚烷基基团和杂环基基团可以是取代的或未取代的。示例包括但不限于(四氢-2H-吡喃-4-基)甲基、(哌啶-4-基)乙基、(哌啶-4-基)丙基、(四氢-2H-噻喃-4-基)甲基和(1,3-噻嗪烷-4-基)甲基。在一些实施方案中，亚烷基是含有1、2、3、4、5或6个亚甲基单元的未取代的直链。

如本文所用，“(碳环基)烷基”是指作为取代基经由亚烷基基团连接的碳环基基团(如本文所定义的)。示例包括但不限于环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基乙基和环己基丙基。在一些实施方案中，亚烷基是含有1、2、3、4、5或6个亚甲基单元的未取代的直链。

如本文所用，“烷氧基烷基”或“(烷氧基)烷基”是指通过亚烷基基团连接的烷氧基基团，诸如C₂-C₈烷氧基烷基或(C₁-C₆烷氧基)C₁-C₆烷基，例如-(CH₂)_1-3-OCH₃。

如本文所用，“-O-烷氧基烷基”或“-O-(烷氧基)烷基”是指经由-O-(亚烷基)基团连接的烷氧基基团，诸如-O-(C₁-C₆烷氧基)C₁-C₆烷基，例如-O-(CH₂)_1-3-OCH₃。

如本文所用，“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子被卤素取代的烷基基团(例如，单卤代烷基、二卤代烷基和三卤代烷基)。此类基团包括但不限于氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基和1-氯-2-氟甲基、2-氟异丁基。卤代烷基可为取代的或未取代的。

如本文所用，“卤代烷氧基”是指其中一个或多个氢原子被卤素取代的烷氧基基团(例如，单卤代烷氧基、二卤代烷氧基和三卤代烷氧基)。此类基团包括但不限于氯甲氧基、氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基和1-氯-2-氟甲氧基、2-氟异丁氧基。卤代烷氧基可为取代的或未取代的。

“氨基”基团是指-NH₂基团。如本文所用，术语“单取代的氨基基团”是指其中一个氢原子被取代基取代的氨基(-NH₂)基团。如本文所用，术语“二取代的氨基基团”是指其中两个氢原子中的每个均被取代基取代的氨基(-NH₂)基团。如本文所用，术语“任选地取代的氨基”是指-NR_AR_B基团，其中R_A和R_B独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、芳烷基或杂环基(烷基)，如本文所定义的。

“O-羧基”基团是指其中R选自氢、C_1-C₆烷基、C_2-C₆烯基、C_2-C₆炔基、C_3-C₇碳环基、C_6-C₁₀芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-OC(＝O)R”基团，如本文所定义的。

“C-羧基”基团是指其中R选自由氢、C_1-C₆烷基、C_2-C₆烯基、C_2-C₆炔基、C_3-C₇碳环基、C_6-C₁₀芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基组成的组的“-C(＝O)OR”基团，如本文所定义的。非限制性示例包括羧基(即，-C(＝O)OH)。

“磺酰基”基团是指其中R选自氢、C_1-C₆烷基、C_2-C₆烯基、C_2-C₆炔基、C_3-C₇碳环基、C_6-C₁₀芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-SO₂R”基团，如本文所定义的。

“亚磺酸基”基团是指“-S(＝O)OH”基团。

“磺基”基团是指“-S(＝O)₂OH”或“-SO₃H”基团。

“磺酸根”基团是指“-SO₃ ^-”基团。

“硫酸根”基团是指“-SO₄ ^-”基团。

“S-亚磺酰氨基”基团是指其中R_A和R_B各自独立地选自氢、C_1-C₆烷基、C_2-C₆烯基、C_2-C₆炔基、C_3-C₇碳环基、C_6-C₁₀芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-SO₂NR_AR_B”基团，如本文所定义的。

“N-亚磺酰氨基”基团是指其中R_A和R_B各自独立地选自氢、C_1-C₆烷基、C_2-C₆烯基、C_2-C₆炔基、C_3-C₇碳环基、C_6-C₁₀芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-N(R_A)SO₂R_B”基团，如本文所定义的。

“C-酰氨基”基团是指其中R_A和R_B各自独立地选自氢、C_1-C₆烷基、C_2-C₆烯基、C_2-C₆炔基、C_3-C₇碳环基、C_6-C₁₀芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-C(＝O)NR_AR_B”基团，如本文所定义的。

“N-酰氨基”基团是指其中R_A和R_B各自独立地选自氢、C_1-C₆烷基、C_2-C₆烯基、C_2-C₆炔基、C_3-C₇碳环基、C_6-C₁₀芳基、5至10元杂芳基和3至10元杂环基的“-N(R_A)C(＝O)R_B”基团，如本文所定义的。

“O-氨甲酰基”基团是指“-OC(＝O)N(R_AR_B)”基团，其中R_A和R_B可以与S-亚磺酰氨基的定义相同。O-氨甲酰基可为取代的或未取代的。

“N-氨甲酰基”基团是指“ROC(＝O)N(R_A)^-”基团，其中R和R_A可以与N-亚磺酰氨基的定义相同。N-氨甲酰基可为取代的或未取代的。

“O-硫代氨甲酰基”基团是指“-OC(＝S)-N(R_AR_B)”基团，其中R_A和R_B可以与S-亚磺酰氨基的定义相同。O-硫代氨甲酰基可为取代的或未取代的。

“N-硫代氨甲酰基”基团是指“ROC(＝S)N(R_A)-”基团，其中R和R_A可以与N-亚磺酰氨基的定义相同。N-硫代氨甲酰基可为取代的或未取代的。

术语“烷基氨基”或“(烷基)氨基”是指其中一个或两个氢被烷基基团取代的氨基基团。

“(烷氧基)烷基”基团是指经由亚烷基基团连接的烷氧基基团，诸如“(C_1-C₆烷氧基)C_1-C₆烷基”等。

如本文所用的术语“羟基”是指-OH基团。

如本文所用的术语“氰基”是指“-CN”基团。

如本文所用的术语“叠氮基”是指-N₃基团。

当基团被描述为“任选地取代的”时，其可以是未取代的或取代的。同样，当基团被描述为“取代的”时，取代基可以选自所指示的取代基中的一者或多者。如本文所用，取代的基团衍生自未取代的母体基团，其中已存在一个或多个氢原子与另一个原子或基团的交换。除非另外指明，否则当基团被认为是“取代的”时，这意味着该基团被一个或多个取代基取代，该取代基独立地选自：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烯基、C₁-C₆炔基、C₁-C₆杂烷基、C₃-C₇碳环基(任选地被卤代基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、C₃-C₇碳环基-C₁-C₆-烷基(任选地被卤代基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、3-10元杂环基(任选地被卤代基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、3-10元杂环基-C₁-C₆-烷基(任选地被卤代基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、芳基(任选地被卤代基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、(芳基)C₁-C₆烷基(任选地被卤代基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、5-10元杂芳基(任选地被卤代基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、(5-10元杂芳基)C₁-C₆烷基(任选地被卤代基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、卤代基、-CN、羟基、C₁-C₆烷氧基、(C₁-C₆烷氧基)C₁-C₆烷基、-O(C₁-C₆烷氧基)C₁-C₆烷基；(C₁-C₆卤代烷氧基)C₁-C₆烷基；-O(C₁-C₆卤代烷氧基)C₁-C₆烷基；芳氧基、巯基(氢硫基)、卤代(C₁-C₆)烷基(例如，-CF₃)、卤代(C₁-C₆)烷氧基(例如，-OCF₃)、C₁-C₆烷硫基、芳硫基、氨基、氨基(C₁-C₆)烷基、硝基、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基、氰酸根、异氰酸根、硫氰酸根、异硫氰酸根、亚磺酰基、磺酰基、-SO₃H、磺酸根、硫酸根、亚磺基、-OSO₂C_1-4烷基、单磷酸根、二磷酸根、三磷酸根和氧代基(＝O)。在基团被描述为“任选地取代的”的任何地方，该基团可以被上述取代基取代。

如本领域的普通技术人员所理解的，本文所述的化合物可以以离子化形式存在，例如，-CO₂ ^-、-SO₃ ^-或-O-SO₃ ^-。如果化合物包含带正电荷或带负电荷的取代基基团，例如，-SO₃ ^-，则其还可以包含带负电荷或带正电荷的抗衡离子，使得该化合物整体为中性的。在其他方面，该化合物可以以盐形式存在，其中抗衡离子由共轭酸或碱提供。

如本文所用，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。它们是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖为核糖，并且在DNA中为脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮杂环碱基可为嘌呤或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的修饰衍生物或类似物，诸如7-脱氮腺嘌呤或7-脱氮鸟嘌呤。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。

如本文所用，“核苷”在结构上类似于核苷酸，但缺少磷酸部分。核苷类似物的一个示例是其中标记与碱基连接并且没有磷酸基团连接到糖分子的核苷类似物。术语“核苷”在本文中以本领域技术人员所理解的常规含义使用。示例包括但不限于包含核糖部分的核糖核苷和包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。经修饰的戊糖部分是其中氧原子已被碳取代和/或碳已被硫或氧原子取代的戊糖部分。“核苷”是可以具有取代的碱基和/或糖部分的单体。另外，核苷可以掺入较大的DNA和/或RNA聚合物和低聚物中。

术语“嘌呤碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选地取代的嘌呤碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、脱氮嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶碱基的示例包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)。

如本文所用，当寡核苷酸或多核苷酸被描述为“包含”或“掺入”本文所述的核苷或核苷酸时，这意味着本文所述的核苷或核苷酸与寡核苷酸或多核苷酸形成共价键。类似地，当核苷或核苷酸被描述为寡核苷酸或多核苷酸的一部分，诸如“掺入到”寡核苷酸或多核苷酸中时，这意味着本文所述的核苷或核苷酸与寡核苷酸或多核苷酸形成共价键。在一些此类实施方案中，共价键在寡核苷酸或多核苷酸的3'羟基与在本文中描述为寡核苷酸或多核苷酸的3'碳原子与核苷酸的5'碳原子之间的磷酸二酯键的核苷酸的5'磷酸基团之间形成。

如本文所用，术语“可裂解的连接基”并不意在暗示需要除去整个连接基。裂解位点可以位于连接基上确保该连接基的一部分在裂解后保持连接到可检测标记和/或核苷或核苷酸部分的某个位置处。

如本文所用，“衍生物”或“类似物”意指具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。此类衍生物和类似物在例如Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley&Son,1980)和Uhlman等人，Chemical Reviews 90:543-584,1990中进行了讨论。核苷酸类似物还可以包括经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯键和氨基磷酸酯键。如本文所用，“衍生物”、“类似物”和“修饰的”可以互换使用，并且由本文定义的术语“核苷酸”和“核苷”涵盖。

如本文所用，术语“磷酸酯”以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其质子化形式(例如，)。如本文所用，术语“单磷酸”、“二磷酸”和“三磷酸”以本领域技术人员所理解的其普通含义使用，并且包括质子化形式。

如本文所用，术语“保护基团(protecting group/protecting groups)”是指添加到分子中以便防止分子中的现有基团经历不希望的化学反应的任何原子或原子团。有时，“保护基团”和“封端基团”可以互换使用。

如本文所用，术语“定相”是指SBS中的现象，该现象是由3'终止子和荧光团的不完全去除以及未能通过在给定测序循环下通过聚合酶完成簇内DNA链的一部分掺入所引起的。预定相是由掺入不具有有效3'终止子的核苷酸引起的，其中掺入事件由于终止失败而提前1个周期。定相和预定相导致特定循环的测量信号强度由来自当前循环的信号以及来自前一个和后一个循环的噪声组成。随着循环的数量增加，受到定相和预定相影响的每个簇的序列分数增加，妨碍对正确碱基的识别。预定相可以由在通过边合成边测序(SBS)期间存在痕量的未保护或未封端的3'-OH核苷酸引起。不受保护的3'-OH核苷酸可以在制造过程期间或可能在储存和试剂处理过程期间产生。因此，降低预定相发生率的核苷酸类似物的发现是令人惊讶的，并且在SBS应用中提供了比现有核苷酸类似物的更大的优势。例如，所提供的核苷酸类似物可以带来更快的SBS循环时间、更低的定相值和预定相值以及更长的测序读长。

利用过渡金属催化剂、非还原配体和还原剂的测序方法

本公开的一些实施方案涉及一种用于确定多种靶多核苷酸(例如，单链多核苷酸)的序列的方法，该方法包括：

(a)使固体载体在杂交条件下与测序引物接触，其中所述固体载体包含多种固定在其上的靶多核苷酸；并且所述测序引物与所述靶多核苷酸的至少一部分互补；

(b)在适合于DNA聚合酶介导的引物延伸的条件下，使该固体载体与第一水溶液接触，该第一水溶液包含DNA聚合酶和四种不同类型的核苷酸中的一种或多种类型的核苷酸，其中这些核苷酸中的每种核苷酸包含3'封端基团，该3'封端基团包含未取代的或取代的烯丙基基团；

(c)将一种类型的核苷酸掺入到所述测序引物中以产生延伸的拷贝多核苷酸；

(d)对所述延伸的拷贝多核苷酸执行一次或多次荧光测量；

(e)在包含过渡金属催化剂和一种或多种还原剂的第二水溶液中去除所掺入的核苷酸的该3'封端基团，该过渡金属催化剂由具有水溶性非还原膦或N,N-双齿非膦配体的钯或镍络合物产生；以及

(f)在去除所掺入的核苷酸的该3'封端基团之后，用第三水溶液对该固体载体进行洗涤。

在本文所述的方法的一些实施方案中，该方法还包括重复步骤(b)至(f)，直到确定靶多核苷酸的至少一部分的序列。在另外的实施方案中，将步骤(b)至(f)重复至少50次、至少100次、至少150次、至少200次、至少250次、至少300次、至少350次、至少400次、至少450次或至少500次。

在本文所述的方法的一些实施方案中，过渡金属催化剂是Pd(0)催化剂，并且Pd(0)催化剂由具有水溶性非还原膦的钯络合物产生。在另外的实施方案中，Pd(0)催化剂由钯络合物(例如，Pd(II)络合物)和水溶性非还原膦原位产生。在一些实施方案中，水溶性非还原膦包括三(取代的C₁-C₆烷基)膦或未取代的或取代的芳族膦或它们的组合。在一些实施方案中，过渡金属催化剂是由钯络合物和水溶性非还原三(取代的C₁-C₆烷基)膦原位产生的Pd(0)催化剂。在其他实施方案中，过渡金属催化剂是由钯络合物和水溶性非还原三(取代的C₆-C₁₀芳基)膦原位产生的Pd(0)催化剂。在一些实施方案中，钯络合物包括[Pd(烯丙基)Cl]₂、Na₂PdCl₄、K₂PdCl₄、Li₂PdCl₄、[Pd(烯丙基)(THPP)]Cl、[Pd(烯丙基)(THPP)₂]Cl、Pd(CH₃CN)₂Cl₂、Pd(OAc)₂、Pd(PPh₃)₄、Pd(dba)₂、Pd(Acac)₂、PdCl₂(COD)、Pd(TFA)₂、Na₂PdBr₄、K₂PdBr₄、PdCl₂、PdBr₂或Pd(NO₃)₂或它们的组合。在另外的实施方案中，钯络合物包括[Pd(烯丙基)Cl]₂或Na₂PdCl₄。在一些实施方案中，三(取代的C₁-C₆烷基)膦是三(羧基取代的C₁-C₆烷基)膦，其中一个、两个或三个C₁-C₆烷基可以被羧基基团取代。在一个示例中，三(取代的C₁-C₆烷基)膦是(TCEP)。在一些其他实施方案中，三(取代的C₁-C₆烷基)膦配体的一个、两个或三个C₁-C₆烷基可以被一个或多个改善膦的水溶解性的官能团取代，这些官能团诸如氨基、取代的氨基、铵、-SO₃H或磺酸根(-SO₃ ^-)或它们的组合。在一些实施方案中，三(取代的C₁-C₆烷基)膦是：(DIPA)或(diBuPpropSO₃)。在一些实施方案中，非还原芳族膦包含或为三(取代的C₆-C₁₀芳基)膦，例如三(取代的苯基)膦，其中一个、两个或三个苯基可以被一个或多个改善膦的水溶解性的官能团取代，这些官能团诸如氨基、取代的氨基、铵、-SO₃H或磺酸根或它们的组合。在一些实施方案中，三(取代的苯基)膦是三(磺酸根取代的苯基)膦。此类磺酸根取代的三苯基膦可以呈盐的形式，诸如钠盐或钾盐。另外，三(磺酸根取代的苯基)膦的一个、两个或三个苯基基团可以进一步被羧基基团取代。在该方法的一些实施方案中，钯络合物与水溶性膦的摩尔比为约1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10。

在该方法的一些实施方案中，过渡金属催化剂是Pd(0)催化剂，并且Pd(0)催化剂由具有N,N-双齿非膦配体的钯络合物产生。在另外的实施方案中，N,N-双齿配体选自由以下组成的组： (GSH)、

它们的盐；其中R₁独立地是-SO₃H、-COOH、-PO₃H₂或-NMe₃ ⁺；R₂是-(CH₂)_1-3COOH；并且R₃是-SO₃H或-COOH。在一些实施方案中，钯络合物与N,N-双齿非膦配体的摩尔比为约1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10。

在该方法的一些实施方案中，还原剂是含硼还原剂。在一些实施方案中，含硼还原剂是NH₃BH₃或B₂(OH)₄。在一些实施方案中，含硼还原剂也是膦还原剂。含硼膦还原剂的非限制性示例包括硼氢化钠、硼烷四氢呋喃、硼氢化锂、三乙酰氧基硼氢化钠、硼烷二甲胺、硼烷二甲基硫醚、儿茶酚硼烷、四丁基硼氢化铵、硼烷-氨络合物、硼氢化钙、硼氢化镁、硼氢化钾、二氯苯基硼烷、硼氢化钙双(四氢呋喃)、三乙基硼氢化钾、硼烷二苯基膦络合物、二环己基碘硼烷、硼氢化四乙基铵、二氯(二异丙基氨基)硼烷、溴二甲基硼烷、二乙基甲氧基硼烷、二氯甲基二异丙氧基硼烷、溴二甲基硼烷或单溴硼烷甲硫醚。在该方法的一些实施方案中，第二水溶液的pH为约7.0至约10或约7.5至约9.5。在该方法的一些实施方案中，3'封端基团具有连接到核苷酸的3'氧的结构其中R^a、R^b、R^c、R^d和R^e中的每一者独立地是H、卤素、未取代的或取代的C₁-C₆烷基或C₁-C₆卤代烷基。在另外的实施方案中，核苷酸的3'封端基团具有连接到核苷酸的3'氧的结构在该方法的一些实施方案中，第一水溶液或第三水溶液包含至少一种Pd(0)清除剂。在又另外的实施方案中，Pd(0)清除剂包括一个或多个选自由以下组成的组的烯丙基部分：-O-烯丙基、-S-烯丙基、-NR-烯丙基和-N⁺RR'-烯丙基和它们的组合，其中R是H、未取代的或取代的C₁-C₆烷基、未取代的或取代的C₂-C₆烯基、未取代的或取代的C₂-C₆炔基、未取代的或取代的C₆-C₁₀芳基、未取代的或取代的5至10元杂芳基、未取代的或取代的C₃-C₁₀碳环基或未取代的或取代的5至10元杂环基；并且R'是H、未取代的C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在又另外的实施方案中，包含一个或多个-O-烯丙基部分的Pd(0)清除剂是(N-Boc酪氨酸(烯丙基)-OH)或(烯丙基-β-D-吡喃葡萄糖苷)或它们的盐。在又另外的实施方案中，包含一个或多个一个或多个-NR-烯丙基或-N⁺RR'-烯丙基部分的Pd(0)清除剂是其中Z^-是Cl^-或F^-。在另外的实施方案中，包含一个或多个烯丙基部分的Pd(0)清除剂在第一水溶液中。在该方法的一些实施方案中，第三水溶液还包含至少一种Pd(II)清除剂。在另外的实施方案中，Pd(II)清除剂包括L-半胱氨酸或硫代硫酸钠。在该方法的一些实施方案中，当步骤(e)在室温下进行时，将所掺入的核苷酸的3'封端基团在少于5分钟内去除。在该方法的一些实施方案中，将所掺入的核苷酸的3'封端基团在约1分钟内去除。在该方法的一些实施方案中，固体载体包含固定的靶多核苷酸的阵列。

非还原配体

在一些实施方案中，被包括以产生过渡金属催化剂的配体是非还原配体。在一些实施方案中，非还原配体可以包括水溶性非还原膦。在一些其他实施方案中，非还原配体可以包括N,N-双齿非膦配体。过渡金属络合物(预催化剂)可以与非还原配体混合以产生配位络合物。单独地，需要至少一种还原剂将过渡金属膦配体配位络合物还原成活性催化剂形式。例如，Pd(II)预催化剂[Pd(烯丙基)Cl]₂或Na₂PdCl₄可以与非还原膦TCEP形成中间体Pd(II)配位络合物。为了使Pd(II)中间体络合物转化成活性催化形式，还引入还原剂(诸如本文所述的含硼还原剂)，将Pd(II)还原成活性Pd(0)形式。在某些反应条件下，TCEP本身可能无法作为还原剂，因为其不具有还原Pd(II)络合物的正确潜力。此类反应通路可能是期望的，因为其将过渡金属的还原与过渡金属的配位分开。相反，某些膦配体可以用于与过渡金属配位和将过渡金属还原成活性催化形式的双重目的。例如，当Na₂PdCl₄与三(羟丙基)膦(THPP或THP)混合时，THPP也用作还原剂以将Pd(II)还原成Pd(0)。

非还原水溶性膦配体包括例如三(取代的C₁-C₆烷基)膦，其中三(取代的C₁-C₆烷基)膦配体的一个、两个或一个、两个或三个C₁-C₆烷基可以被一个或多个改善膦的水溶解性的官能团取代，这些官能团诸如氨基、取代的氨基、铵、-SO₃H或磺酸根或它们的组合；而这些官能团不能用作过渡金属的电子供体，例如将Pd(II)还原成Pd(0)。此类三(取代的C₁-C₆烷基)膦可以包含至少一个取代的C₁-C₆烷基，但所有三个C₁-C₆烷基不必被取代。合适的三(取代的C₁-C₆烷基)膦可以包括三(羧乙基)膦(TCEP)、2-(二异丙基磷烷基)乙-1-胺(DIPA)和3-(二叔丁基膦基)丙烷-1-磺酸酯(diBuPpropSO₃)。其他合适的非还原膦可以是(取代的C₁-C₆烷基)(二环烷基)膦，诸如2-(二环己基膦基)-N,N,N-三甲基乙烷-1-铵(DCPT)。另外的合适的非还原膦可以是芳族膦，诸如三(取代的C₆-C₁₀芳基)膦或三(取代的苯基)膦，其中一个、两个或三个苯基基团可以被一个或多个改善膦的水溶解性的官能团取代，这些官能团诸如氨基、取代的氨基、铵、-SO₃H或磺酸酯或它们的组合。在一些实施方案中，三(取代的苯基)膦是三(磺酸根取代的苯基)膦。此类磺酸根取代的三苯基膦可以呈盐的形式，诸如钠盐或钾盐。另外，三(磺酸根取代的苯基)膦的一个、两个或三个苯基基团可以进一步被羧基基团取代。示例性三(取代的苯基)膦包括但不限于：

或它们的盐，诸如钠盐或钾盐，例如三(2,4-二甲基-5-磺基苯基)膦三钠盐(TXPTS)。另外的合适的非还原膦可以是(取代的二苯基)(取代的C₁-C₆烷基)膦，诸如其他水溶性膦可以是合适的非还原剂。例如，1,2-双(二甲基膦基)乙烷((diMeP)₂Et)可以是合适的非还原配体。一些非膦分子可以是合适的非还原配体，诸如N,N-双齿配体。在一些实施方案中，谷胱甘肽(GSH)可以是合适的非还原配体。

其他合适的N,N-双齿配体可以包括例如

它们的盐；其中R₁独立地是-SO₃H、-COOH、-PO₃H₂或-NMe₃ ⁺；R₂是-(CH₂)_1-3COOH；并且R₃是-SO₃H或-COOH。在一些其他实施方案中，本文所述的N,N-双齿配体可以含有另外的水溶性基团，包括但不限于磷酸根；(其中中的每个C₁-C₆烷基任选地被一个或多个选自磷酸根、的取代基取代)；

还原剂

还原剂可以用于将过渡金属从其预催化形式还原为活性形式，以用于根据本公开的3'去封端反应和/或接头的裂解。在一些实施方案中，还原剂含有硼。例如，还原剂可以是硼烷、二取代硼酸(borinic acid)、硼酸、硼酸酯或硼氢化物。在一些实施方案中，还原剂是硼烷或硼酸。合适的硼烷包括二硼烷、三硼烷、四硼烷、五硼烷、六硼烷、七硼烷、八硼烷、九硼烷、十硼烷、硼烷四氢呋喃、硼烷二甲基硫醚、儿茶酚硼烷、二氯苯基硼烷、硼烷二苯基膦络合物、二环己基碘硼烷、溴二甲基硼烷、二乙基甲氧基硼烷、二甲基二异丙氧基硼烷、溴二甲基硼烷和单溴硼烷甲基硫醚。合适的硼烷包括氨基硼烷。合适的胺-硼烷包括吡啶-硼烷、N-基杂芳族-硼烷络合物、氨三氢化硼(NH₃BH₃)、硼烷-氨络合物、硼烷二甲胺、硼烷叔丁胺、硼烷三甲胺、硼烷异丙胺、二氯(二异丙基氨基)硼烷和环硼氮烷。合适的硼酸包括硼酸、4-羟基苯基硼酸、四氢氧化硼(B₂(OH)₄)、苯基硼酸、2-噻吩基硼酸、甲基硼酸、顺式丙烯基硼酸和反式丙烯基硼酸。合适的硼酸酯包括烯丙基硼酸频哪醇酯、苯基硼酸三亚甲基二醇酯和二异丙氧基甲基硼烷。合适的硼氢化物包括硼氢化钠(Na₂BH₄)、硼氢化锂、硼氢化钙、硼氢化钙双(四氢呋喃)、硼氢化镁、硼氢化钾、三乙基硼氢化钾、三乙酰氧基硼氢化钠、硼氢化四乙基铵和四丁基硼氢化铵。在一些实施方案中，还原剂(诸如含硼还原剂)在第一水溶液(也被称为裂解混合物)中的浓度为约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM、20mM、22.5mM、25mM、37.5mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM，或由前述值中的任意两个限定的范围。在一个实施方案中，还原剂在第一水溶液中的浓度为约20mM。

过渡金属催化剂

过渡金属催化剂可以与非还原配体和还原剂一起用于反应中以去除3'封端基团。用作催化剂的合适的过渡金属包括钯(Pd)和镍(Ni)。类似于钯，镍预催化剂可以以Ni(II)的形式存在，并且活性催化形式是Ni(0)。

钯催化剂

在一些实施方案中，用于除去或裂解本文所述的3'封端基团的Pd催化剂是水溶性的。在一些此类实施方案中，Pd催化剂为活性Pd(0)形式。在一些情况下，Pd(0)催化剂可以通过试剂诸如烯烃、醇、胺、膦或金属氢化物从Pd络合物或Pd预催化剂(例如，Pd(II)络合物)的还原原位生成。合适的Pd源包括Pd(CH₃CN)₂Cl₂、[Pd(烯丙基)Cl]₂、[Pd(烯丙基)(THPP)]Cl、[Pd(烯丙基)(THPP)₂]Cl、Na₂PdCl₄、K₂PdCl₄、Li₂PdCl₄、Pd(OAc)₂、Pd(PPh₃)₄、Pd(dba)₂、Pd(Acac)₂、PdCl₂(COD)、Pd(TFA)₂、Na₂PdBr₄、K₂PdBr₄、PdCl₂、PdBr₂和Pd(NO₃)₂。在一个此类实施方案中，Pd(0)络合物从钯酸盐(II)的有机或无机盐，例如Na₂PdCl₄或K₂PdCl₄原位生成。在另一个实施方案中，钯源为烯丙基氯化钯(II)二聚体[(烯丙基)PdCl]₂或[PdCl(C₃H₅)]₂。在一些实施方案中，根据本公开，通过将Pd(II)络合物与水溶性非还原配体和还原剂混合，在水溶液中产生Pd(0)催化剂。合适的非还原配体包括三(取代的C₁-C₆烷基)膦，诸如三(羧乙基)膦(TCEP)、2-(二异丙基磷烷基)乙-1-胺(DIPA)、3-(二叔丁基膦基)丙烷-1-磺酸酯(diBuPpropSO₃)；三(取代的苯基)膦，诸如三(2,4-二甲基-5-磺基苯基)膦三钠盐(TXPTS)；(取代的C₁-C₆烷基)(二环烷基)膦，诸如2-(二环己基膦基)-N,N,N-三甲基乙烷-1-铵(DCPT)或它们的组合。其他水溶性膦，诸如1,2-双(二甲基膦基)乙烷((diMeP)₂Et)也可以适合用作非还原配体。根据本公开，合适的还原剂可以含有硼烷。

在一些实施方案中，钯催化剂通过将[(烯丙基)PdCl]₂与TCEP原位混合来制备。[(烯丙基)PdCl]₂与TCEP的摩尔比可以为约1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10。在一个实施方案中，[(烯丙基)PdCl]₂与TCEP的摩尔比为1:5。在一些其他实施方案中，钯催化剂通过将水溶性Pd试剂诸如Na₂PdCl₄或K₂PdCl₄与TCEP原位混合来制备。Na₂PdCl₄或K₂PdCl₄与TCEP的摩尔比可以为约1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10。在一个实施方案中，Na₂PdCl₄或K₂PdCl₄与TCEP的摩尔比为约1:3。在另一个实施方案中，Na₂PdCl₄或_K2PdCl₄与TCEP的摩尔比为约1:3.5。

用于本文所述的方法的裂解步骤的Pd络合物和水溶性膦可以呈组合物或混合物，也称为裂解混合物。在一些另外的实施方案中，裂解混合物可以含有附加缓冲液试剂，诸如伯胺、仲胺、叔胺、天然氨基酸、非天然氨基酸、碳酸盐、磷酸盐或硼酸盐或它们的组合。在一些另外的实施方案中，缓冲液试剂包括乙醇胺(EA)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、碳酸钠、磷酸钠、硼酸钠、二甲基乙醇胺(DMEA)、二乙基乙醇胺(DEEA)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMEDA)、N,N,N',N'-四乙基乙二胺(TEEDA)或哌啶基乙醇胺(PipEA或1-(2-羟乙基)哌啶，具有结构)或它们的组合。在一个实施方案中，一种或多种缓冲液试剂包括DEEA。在另一个实施方案中，一种或多种缓冲液试剂包括PipEA。在另一个实施方案中，一种或多种缓冲液试剂含有一种或多种无机盐，诸如碳酸盐、磷酸盐或硼酸盐，或者它们的组合。在一个实施方案中，无机盐为钠盐。在一些实施方案中，Pd催化剂与还原剂的摩尔比为约1:100、1:50、1:20、1:10或1:5。在一些实施方案中，Pd催化剂与包含一个或多个烯丙基部分的Pd清除剂的摩尔比为约1:100、1:50、1:20、1:10或1:5。在一些另外的实施方案中，包含一个或多个烯丙基部分的Pd清除剂是Pd催化剂的活性形式Pd(0)的Pd清除剂。

在一些实施方案中，3'封端基团的裂解条件与裂解核苷酸的可裂解接头的条件相同。例如，核苷酸可以包含与3'封端基团相同的接头部分。在其他实施方案中，3'封端基团的裂解条件与裂解核苷酸的可裂解接头的条件不同。

镍催化剂

在一些实施方案中，用于去除或裂解本文所述的3'封端基团的Ni催化剂是水溶性的。在一些此类实施方案中，Ni络合物是Ni(0)络合物。在一些情况下，Ni(0)络合物可以通过试剂诸如烯烃、醇、胺、膦或金属氢化物从Ni络合物或Ni预催化剂(例如，Ni(II)络合物)的还原原位产生。在一些实施方案中，Ni(II)化合物是NiCl₂。在一些实施方案中，根据本公开，通过将Ni(II)络合物与水溶性非还原配体和还原剂混合，在水溶液中产生Ni(0)催化剂。例如，通过将NiCl₂与1至10摩尔当量的水溶性非还原配体混合来制备Ni络合物。合适的非还原配体包括三(取代的C₁-C₆烷基)膦，诸如TCEP、DIPA、diBuPpropSO₃、TXPTS、DCPT或它们的组合。其他水溶性膦，诸如1,2-双(二甲基膦基)乙烷((diMeP)₂Et)也可以适合用作非还原配体。根据本公开，合适的还原剂可以含有硼烷。在一些实施方案中，根据本公开，通过将Ni(II)络合物与水溶性还原配体(例如，THPP)混合，在水溶液中产生Ni(0)催化剂。

钯清除剂

本公开的某些方面涉及在边合成边测序的若干步骤中采用替代性钯清除剂，其中至少一种钯清除剂包含一个或多个烯丙基部分(例如，-O-烯丙基、-S-烯丙基、-NR-烯丙基、或-N⁺RR'-烯丙基或它们的组合)，作为消耗粘附在核酸上的任何其余的Pd(0)的竞争性底物(即，Pd(0)清除剂)。这些钯清除剂描述于WO/2022/243480中，该文献以引用方式整体并入。本文所述的测序方法实质上改善了测序指标(例如，减少定相值和预定相值)并且还可以通过某些消除裂解后处理步骤来减少每个循环的测序时间。

在本文所述的方法中的任一种的一些实施方案中，包含一个或多个烯丙基部分的钯清除剂在第一水溶液中。在一些情况下，第一水溶液也称为掺入混合物(IMX)。在一些此类实施方案中，这种钯清除剂与第一水溶液中的其他测序试剂相容，除了一种或多种不同类型的核苷酸之外，所述第一水溶液还可以包含聚合酶(诸如DNA聚合酶)。在一些此类实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶，诸如9°N聚合酶的突变体(例如，WO 2005/024010中公开的那些，该专利以引用的方式并入)，例如，Pol 812、Pol 1901、Pol 1558或Pol 963。Pol 812、Pol 1901、Pol 1558或Pol 963DNA聚合酶的氨基酸序列描述于例如美国专利公开第2020/0131484A1号和第2020/0181587A1号中，这些公开均以引用方式并入本文。在一些实施方案中，第一水溶液还包含一种或多种缓冲剂。缓冲剂可以包括伯胺、仲胺、叔胺、天然氨基酸或非天然氨基酸，或者它们的组合。在另外的实施方案中，缓冲剂包括乙醇胺或甘氨酸，或者它们的组合。在一个实施方案中，缓冲剂包括甘氨酸，或为甘氨酸。在另外的实施方案中，包含一个或多个烯丙基部分的钯清除剂在下一个掺入循环之前不需要单独的洗涤步骤。在另外的实施方案中，第一水溶液中的钯清除剂是本文所述的Pd(0)清除剂。在一些实施方案中，Pd(0)清除剂与DNA聚合酶和/或四种类型的核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP)中的一种或多种预混合。在其他实施方案中，Pd(0)清除剂与DNA聚合酶和/或四种类型的核苷酸中的一种或多种核苷酸分开储存，并在测序运行开始前不久与这些组分混合。

在本文所述的方法中的任一种的一些实施方案中，包含一个或多个烯丙基部分的Pd(0)清除剂在第一水溶液中的浓度为约0.1mM至约100mM、0.2mM至约75mM、约0.5mM至约50mM、约1mM至约20mM或约2mM至约10mM。在另外的实施方案中，钯清除剂(例如，Pd(0)清除剂)的浓度为约0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、5.5mM、6mM、6.5mM、7mM、7.5mM、8mM、8.5mM、9mM、9.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM或20mM，或由前述值中的任意两个限定的范围。在另外的实施方案中，这种钯清除剂的浓度是在第一水溶液中的浓度。在另外的实施方案中，第一水溶液的pH为约9。

在本文所述的方法中的任一种的一些其他实施方案中，当进行一次或多次荧光测量时，包含一个或多个烯丙基部分的钯清除剂在溶液中。在这种实施方案中，这种钯清除剂与扫描溶液(也称为扫描混合物)的测序试剂相容。在另外的实施方案中，一种或多种钯清除剂在下一个掺入循环之前不需要单独的洗涤步骤。在另外的实施方案中，扫描溶液中的钯清除剂是本文所述的Pd(0)清除剂。

在本文所述的方法的其他实施方案中，包含一个或多个烯丙基部分的钯清除剂在裂解后洗涤溶液(即，第二水溶液)中。在另外的实施方案中，裂解后洗涤溶液中的钯清除剂是本文所述的Pd(0)清除剂。在一些此类实施方案中，裂解后洗涤溶液不包含硫辛酸或3,3'-二硫代二丙酸(DDPA)。

在本文所述的方法的另外其他实施方案中，包含一个或多个烯丙基部分的钯清除剂可以存在于第一水溶液(例如，掺入混合物)和第二水溶液(例如，裂解后洗涤溶液)中，或者存在于第一水溶液和扫描混合物中。在一些此类实施方案中，裂解后洗涤溶液不包含硫辛酸或DDPA。

包含一个或多个-O-烯丙基或烯丙基部分的Pd(0)清除剂的非限制性示例包括以下：

(化合物A)、(化合物B，N-Boc酪氨酸(烯丙基)-OH)、(化合物C，烯丙基-β-D-吡喃葡萄糖苷)、(化合物D)、(化合物E)、(化合物F)、(化合物G)、(化合物H)、(化合物I)、(化合物J)、

(化合物K)、(化合物L)、(化合物M)和(化合物N)。

包含一个或多个-S-烯丙基部分的Pd(0)清除剂的非限制性示例包括以下：

包含一个或多个-NR-烯丙基或-N⁺RR'-烯丙基部分的Pd(0)清除剂的非限制性示例包括以下： 其中Z^-是阴离子(例如，卤化物阴离子，诸如F^-或Cl^-)。在一个实施方案中，钯清除剂是(化合物O，二烯丙基二甲基氯化铵，也称为DADMAC)。

在本文所述的方法的一些实施方案中，该方法可以进一步使用附加钯清除剂，诸如Pd(II)清除剂。在一些此类实施方案中，使用附加Pd清除剂可以改善测序指标的定相值。例如，附加Pd清除剂可以包括异氰基乙酸(ICNA)盐、异氰基乙酸乙酯、异氰基乙酸甲酯、半胱氨酸(例如，L-半胱氨酸)或其盐(例如，N-乙酰基-L-半胱氨酸)、乙基黄原酸钾、异丙基黄原酸钾、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸(EDTA)、亚氨基二乙酸、次氮基二乙酸、三巯基-S-三嗪、二甲基二硫代氨基甲酸酯、二硫苏糖醇、巯基乙醇、烯丙醇、炔丙醇、硫醇、硫代硫酸盐盐(例如，硫代硫酸钠或硫代硫酸钾)、叔胺和/或叔膦或它们的组合。在一个实施方案中，该方法还包括使用L-半胱氨酸或其盐。在另一个实施方案中，该方法还包括使用硫代硫酸盐诸如硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)。在一些实施方案中，附加Pd清除剂是Pd(II)的清除剂。在一些此类实施方案中，Pd(II)清除剂(例如，L-半胱氨酸或硫代硫酸钠)在第一水溶液中。在其他实施方案中，Pd(II)清除剂(例如，L-半胱氨酸或硫代硫酸钠)在裂解后洗涤溶液(即，第二水溶液)中。在其他实施方案中，Pd(II)清除剂(例如，L-半胱氨酸或硫代硫酸钠)可以存在于第一水溶液和第二水溶液二者中。在其他实施方案中，Pd(II)清除剂(例如，L-半胱氨酸或硫代硫酸钠)可以存在于扫描混合物(即，执行所掺入的核苷酸的一次或多次荧光测量的溶液)中。在其他实施方案中，Pd(II)清除剂可以存在于掺入混合物(例如，第一水溶液)、扫描混合物或裂解后洗涤溶液(例如，第二水溶液)中的一者或多者中。在另外的实施方案中，Pd(II)清除剂(诸如L-半胱氨酸或硫代硫酸钠)在第一水溶液或第二水溶液中的浓度为约0.1mM至约100mM、0.2mM至约75mM、约0.5mM至约50mM、约1mM至约20mM或约2mM至约10mM。在另外的实施方案中，Pd(II)清除剂(诸如L-半胱氨酸或硫代硫酸钠)的浓度为约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、6.5mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM或20mM，或由前述值中的任意两个限定的范围。在另外的实施方案中，Pd(II)清除剂在第二水溶液中，并且第二水溶液中的Pd(II)清除剂的浓度为约10mM。

在本文所述的方法的一些实施方案中，所有Pd清除剂均在第一水溶液中。在本文所述的方法的一些其他实施方案中，所有Pd清除剂均在第二水溶液中。在一些其他实施方案中，包含一个或多个烯丙基部分的一种或多种Pd清除剂(例如，Pd(0)清除剂)在掺入混合物(即，第一水溶液)中，并且Pd(II)清除剂在裂解后洗涤溶液(即，第二水溶液)中。在另一个实施方案中，裂解后洗涤溶液不含硫辛酸或DDPA。在其他实施方案中，该方法不包括裂解后洗涤步骤。

在本文所述的方法的一些实施方案中，靶多核苷酸被固定至底物的表面。在一些另外的实施方案中，表面包含多种固定的靶多核苷酸，例如不同的固定的靶多核苷酸的阵列。在一些此类实施方案中，底物包括玻璃、改性的或功能化的玻璃、塑料、多糖、尼龙、硝酸纤维素、树脂、二氧化硅、硅、改性的硅、碳、金属、无机玻璃或光纤束或它们的组合。在一些另外的实施方案中，底物是流动池、纳米颗粒或珠粒(诸如球形二氧化硅珠粒、无机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、镉基点和无镉点，或美国公开第2021/0187470A1号中公开的珠粒，该公开以引用的方式并入)。在一个实施方案中，底物是包括由间隙区域分隔开的图案化纳米孔的流动池，并且其中固定的靶多核苷酸驻留在图案化纳米孔内。

在本文所述的方法中的任一种的一些实施方案中，该方法在自动测序仪器上进行，并且其中自动测序仪器包括在不同波长(例如，约450nm至约460nm、和约520nm至约540nm，尤其是约460nm和约532nm)处操作的两个光源。在其他实施方案中，自动测序仪器包括在一个波长处操作的单个光源。

具有3'封端基团的核苷酸

本公开的一些实施方案涉及包含核碱基、核糖或脱氧核糖部分以及包含未取代的或取代的烯丙基部分的3'羟基封端基团(诸如具有连接到核苷酸的3'氧的结构的3'封端基团)的核苷酸分子，其中R^a、R^b、R^c、R^d和R^e中的每一者独立地是H、卤素、未取代的或取代的C₁-C₆烷基或C₁-C₆卤代烷基。在一个实施方案中，R^a、R^b、R^c、R^d和R^e各自为H，在一些其他实施方案中，R^a和R^b各自为H，并且R^c、R^d和R^e中的至少一者独立地为卤素(例如，氟、氯)或未取代的C₁-C₆烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、异丁基或叔丁基)。例如，R^c为未取代的C₁-C₆烷基，并且R^d和R^e各自为H。在另一个示例中，R^c为H，并且R^d和R^e中的一者或两者为卤素或未取代的C₁-C₆烷基。3'封端基团的非限制性实施方案包括 在一个实施方案中，3'封端基团为它与3'氧一起形成(“AOM”)基团，该AOM基团连接到核糖或脱氧核糖部分的3'碳原子上。3'封端基团的另外的实施方案描述于美国公开第2020/0216891A1号中，该文献全文以引用方式并入。在本文所述的核苷酸的任何实施方案中，核苷酸可以包含3'封端的2-脱氧核糖部分。此外，核苷酸可以是核苷三磷酸。在另一个实施方案中，3'封端基团是连接到脱氧核糖部分的3'碳原子的烯丙基醚基团(-O-CH₂CH＝CH₂)。

标记的核苷酸

在一些实施方案中，3'封端核苷酸还包含可检测标记，这种核苷酸被称为标记的核苷酸或完全官能化的核苷酸(ffN)。标记(例如，荧光染料)通过多种方式经由可裂解接头缀合，这些方式包括疏水吸引、离子吸引和共价连接。在一些方面，染料通过经由可裂解接头实现的共价连接来缀合至核苷酸。本领域的普通技术人员理解，该标记可以通过使该标记的官能团(例如，羧基)与接头的官能团(例如，氨基)反应来共价结合到接头。在一些此类实施方案中，可裂解接头可以包含与3'封端基团相同的部分。因此，可裂解接头和3'封端基团可以在相同的反应条件下裂解或除去。在一些此类实施方案中，可裂解接头可以包含烯丙基部分，具体而言包含以下结构的部分：

其中R^1a、R^1b、R^2a、R^3a和R^3b各自独立地为H、卤素、未取代的或取代的C₁-C₆烷基或C₁-C₆卤代烷基。

在一些实施方案中，染料可以经由核苷酸碱基共价连接到寡核苷酸或核苷酸。例如，标记的核苷酸或寡核苷酸可以具有通过可裂解接头部分连接到嘧啶碱基的C5位或7-脱氮嘌呤碱基的C7位的标记。

核苷酸可以在糖或核碱基上的位点处标记。如本领域所知的，“核苷酸”由含氮碱基、糖和一个或多个磷酸基团组成。在RNA中，该糖是核糖，而在DNA中是脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮碱基是嘌呤(例如，脱氮嘌呤、7-脱氮嘌呤)或嘧啶的衍生物。嘌呤为腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，并且嘧啶为胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)，或在RNA的情况下为尿嘧啶(U)。脱氧核糖的C-1原子与嘧啶的N-1或嘌呤的N-9键合。核苷酸也是核苷的磷酸酯，其中酯化发生在连接到糖的C-3或C-5的羟基基团上。核苷酸通常是单磷酸、二磷酸或三磷酸。

虽然碱基通常被称为嘌呤或嘧啶，但是技术人员将理解，可获得不改变核苷酸或核苷经历Watson-Crick碱基配对的能力的衍生物和类似物。“衍生物”或“类似物”意味着这样的化合物或分子：其核心结构与母体化合物的核心结构相同或非常类似，但其具有允许衍生的核苷酸或核苷与另一分子连接的化学或物理修饰，诸如不同的或附加的侧基。例如，碱基可以为脱氮嘌呤。在特定实施方案中，衍生物应当能够经历Watson-Crick配对。“衍生物”和“类似物”还包括例如具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。此类衍生物和类似物在例如Scheit,Nucleotide analogs(John Wiley&Son,1980)和Uhlman等人，Chemical Reviews 90:543-584,1990中进行了讨论。核苷酸类似物还可以包括经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯键、亚磷酰胺键等。

在特定实施方案中，标记的核苷酸可以是可酶促掺入的和可酶促延伸的。因此，连接基部分可以具有足够的长度以将核苷酸连接到化合物，使得该化合物不显著干扰核酸复制酶对核苷酸的总体结合与识别。因此，连接基还可以包含间隔区单元。间隔区距离为例如核苷酸碱基距裂解位点或标记的距离。

本公开还涵盖掺入本文所述的核苷酸的多核苷酸。此类多核苷酸可以为分别由以磷酸二酯键接合的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的DNA或RNA。多核苷酸可以包含与如本文示出的至少一种经修饰的核苷酸(例如，用染料化合物标记)组合的天然存在的核苷酸、除本文所述的标记的核苷酸之外的非天然存在的(或经修饰的)核苷酸或它们的任何组合。根据本公开的多核苷酸还可以包括非天然的骨架键和/或非核苷酸化学修饰。还设想了由包含至少一种标记的核苷酸的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物组成的嵌合结构。

在一些实施方案中，本文所述的标记的核苷酸包含或具有式(I)的结构：

其中B为核碱基；

R⁴为H或OH；

R⁵是含有烯丙基的3'封端基团，诸如如本文所述的亚磷酰胺；

R⁶为H、单磷酸根、二磷酸根、三磷酸根、硫代磷酸根、磷酸酯类似物、反应性含磷基团，或羟基保护基团；

L是含有烯丙基部分的接头，诸如并且

L¹和L²各自独立地为任选地存在的接头部分。

在本文所述的核苷酸的一些实施方案中，R^1a、R^1b、R^2a、R^3a和R^3b各自为H。在其他实施方案中，R^1a、R^1b、R^2a、'^3a和R^3b中的至少一者为卤素(例如，氟、氯)或未取代的C₁-C₆烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、异丁基或叔丁基)。在一些此类情况下，R^1a和R^1b各自为H，并且R^2a、R^3a和R^3b中的至少一者为未取代的C₁-C₆烷基或卤素(例如，R^2a为未取代的C₁-C₆烷基，并且R^3a和R^3b各自为H；或者R^2a为H，并且R^3a和R^3b中的一者或两者为卤素或未取代的C₁-C₆烷基)。在一个实施方案中，可裂解接头或L包含(“AOL”接头部分)。

在本文所述的核苷酸的一些实施方案中，核碱基(式(I)中的“B”)为嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)、脱氮嘌呤或嘧啶(例如，胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)。在另外一些实施方案中，脱氮嘌呤为7-脱氮嘌呤(例如，7-脱氮腺嘌呤或7-脱氮鸟嘌呤)。B的非限制性示例包括 它们的任选地取代的衍生物和类似物。在一些另外的实施方案中，标记的核碱基包括结构

在本文所述的核苷酸的一些其他实施方案中，式(I)中的R⁵为亚磷酰胺。在此类实施方案中，R⁶为可酸裂解的羟基保护基团，其允许随后在自动化合成条件下进行单体偶联。

在本文所述的核苷酸的一些实施方案中，L¹存在，并且L¹包括选自由以下项组成的组的部分：炔丙胺、炔丙酰胺、烯丙胺、烯丙酰胺，以及这些物质的任选地取代的变体。在一些另外的实施方案中，L¹包括在另外一些实施方案中，星号*指示L¹与核碱基(例如，嘧啶碱基的C5位，或者7-脱氮嘌呤碱基的C7位)的连接点。

本文所述核苷或核苷酸的另外一些实施方案包括具有式(Ia)、(Ia')、(Ib)、(Ic)、(Ic')或(Id)的那些：

在本文所述的核苷酸的一些另外的实施方案中，L²存在，并且L²包括其中n为整数1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，并且苯基部分任选地被取代。在一些此类实施方案中，n为5，并且L²的苯基部分为未取代的。在一些另外的实施方案中，R⁴是H。在一些另外的实施方案中，-OR⁶是三磷酸。

在本文所述的核苷酸的任何实施方案中，可裂解接头或L¹/L²还可以包含二硫化物部分或叠氮基部分(诸如)或它们的组合。可以掺入L¹或L²中的接头部分的附加的非限制性示例包括：

另外的接头部分公开于WO 2004/018493和美国公开第2016/0040225号和第2021/0403500号中，这些文献以引用方式并入本文。

如本文所述的非限制性示例性标记的核苷酸包括：

其中L表示可裂解接头(任选地包括本文所述的L²)，R表示如上所述的核糖或脱氧核糖部分，或者5’位被一个、两个或三个磷酸取代的核糖或脱氧核糖部分。

在一些实施方案中，非限制性示例性荧光染料缀合物在下文示出：

其中PG代表本文所述的3'封端基团；n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；并且m为0、1、2、3、4或5。在一个实施方案中，-O-PG是AOM。在一个实施方案中，n为5。是指作为连接基部分的氨基与染料的羧基基团之间的反应的结果的染料与可裂解连接基的连接点。

各种荧光染料可以在本公开中用作可检测标记，尤其是可被蓝光(例如，约450nm至约460nm)或绿光(例如，约520nm至约540nm)激发的那些染料。这些染料也可以分别称为“蓝色染料”和“绿色染料”。各种类型的蓝色染料的示例，包括但不限于香豆素染料、色喹啉染料和含双硼杂环化合物，公开于美国公开第2018/0094140号、第2018/0201981号、第2020/0277529号、第2020/0277670号、第2021/0188832号、第2022/0195517号、第2022/0380389号和第2023/0313292号中，这些文献中的每个文献以引用方式整体并入本文。绿色染料的示例包括国际公开第WO2013/041117号、第WO2014/135221号、第WO 2016/189287号、第WO2017/051201号和第WO2018/060482A1号中公开的花青或多甲川染料，这些文献中的每个均以引用的方式整体并入。

在本文所述的核苷酸的任何实施方案中，核苷酸包含2'脱氧核糖部分(即，R⁴为式(I)和(Ia)至(Id)为H)。在某个另外方面，2'脱氧核糖在糖环的5'位含有一个、两个或三个磷酸基团。在某个另外方面，本文所述的核苷酸为核苷酸三磷酸(即，-OR⁶为式(I)和(Ia)至(Id)形成三磷酸)。

本公开的附加实施方案涉及包含本文所述核苷或核苷酸的寡核苷酸或多核苷酸。在一些此类实施方案中，该寡核苷酸或多核苷酸与模板或靶多核苷酸杂交。在一些此类实施方案中，模板多核苷酸被固定在固体载体上。

本公开的附加实施方案涉及固体载体，其包括多个固定的模板或靶多核苷酸的阵列，并且此类固定的模板或靶多核苷酸的至少一部分与包含本文所述核苷或核苷酸的寡核苷酸或多核苷酸杂交。

本申请还将参考DNA进一步描述，然而该描述也将适用于RNA、PNA和其他核酸，除非另外指明不适用。

可裂解接头的裂解条件

在本文所述核苷酸或核苷的任何实施方案中，3'封端基团和可裂解接头(以及连接的标记)可以能够在相同或基本上相同的化学反应条件下除去，例如，3'封端基团和可检测标记可以在单个化学反应中除去。在其他实施方案中，3'封端基团和可检测标记在两个分开的步骤中除去。

本文所述的可裂解接头可以在各种化学条件下除去或裂解。非限制性裂解条件包括在存在水溶性膦配体，例如三(羟丙基)膦(THPP或THP)、三(羟甲基)膦和/或三(2-羧乙基)膦(TCEP)的情况下，在存在或不存在还原剂的情况下的钯催化剂，诸如Pd(II)络合物(例如，Pd(OAc)₂、氯化烯丙基Pd(II)二聚体[(烯丙基)PdCl]₂或Na₂PdCl₄)。非限制性裂解条件包括在存在膦配体，例如三(羟丙基)膦、三(羟甲基)膦和/或三(2-羧乙基)膦的情况下的镍催化剂，诸如Ni(II)化合物(NiCl₂)。在一些实施方案中，3'封端基团可以在与用于可裂解接头的裂解条件相同或基本上相同的裂解条件下裂解。

与线性化相容

为了使核酸测序反应的通量最大化，有利的是能够并行对多个模板分子测序。可通过使用核酸阵列技术来实现多个模板的并行处理。这些阵列通常由固定到固体载体材料上的多核苷酸的高密度矩阵组成。

WO 98/44151和WO 00/18957均描述了核酸扩增方法，其允许将扩增产物固定在固体载体上以便形成阵列，这些阵列由簇或“集落”组成，其中簇或“集落”由多条相同的固定化多核苷酸链和多条相同的固定化互补链形成。这种类型的阵列在本文中被称为“成簇阵列”。在根据这些方法制备的聚类阵列上的DNA集落中存在的核酸分子可提供用于测序反应的模板，例如如WO 98/44152中所述。固相扩增反应的产物(诸如WO 98/44151和WO 00/18957中描述的那些)是所谓的“桥接”结构，这些结构通过对成对的固定化多核苷酸链和固定化互补链(两条链均在5'端连接到固体载体上)进行退火而形成。为了提供更适合的模板用于核酸测序，优选的是除去“桥接”结构的其中一条固定化链的基本上全部或至少一部分，以便产生至少部分是单链的模板。因此，该模板的单链部分将可用于与测序引物杂交。除去“桥接”双链核酸结构中的一条固定化链的全部或一部分的过程被称为“线性化”。线性化的方式有多种，包括但不限于酶促裂解、光化学裂解或化学裂解。线性化方法的非限制性示例公开于PCT公开第WO 2007/010251号、美国专利公开第2009/0088327号、美国专利公开第2009/0118128号和美国专利公开第2019/0352327号中，这些专利全文以引用方式并入。

在一些实施方案中，除去3'封端基团和/或可裂解接头的条件也与线性化方法相容，例如包括使用Pd络合物和膦的化学线性化方法。在一些实施方案中，Pd络合物是Pd(II)络合物(例如，Pd(OAc)₂、[(烯丙基)PdCl]₂、K₂PdCl₄或Na₂PdCl₄)，其在存在本文所述的水溶性膦的情况下，在存在或不存在还原剂的情况下原位产生Pd(0)。

边合成边测序的实施方案和替代方案

另选地，还可以使用未标记的核苷酸和含有本文所述的荧光染料的亲和试剂来进行本文所述的测序方法。例如，在步骤(a)的掺入混合物中，四种不同类型的核苷酸(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP)中的一种类型、两种类型、三种类型或每种类型可以未被标记。四种类型的核苷酸(例如，dNTP)中的每一种类型都具有3'封端基团，以确保仅单一碱基可以通过聚合酶添加到引物多核苷酸的3'端。在步骤(b)中掺入未标记的核苷酸后，洗掉剩余未掺入的核苷酸。然后引入亲和试剂，其特异性地识别并结合掺入的dNTP以提供包含掺入的dNTP的标记的延伸产物。在WO 2018/129214和WO 2020/097607中已经公开了未标记的核苷酸和亲和试剂在合成测序中的用途。另外，掺入后标记测序方法已描述于美国公开2023/0383342A1和美国序列第63/579897号中，这些文献中的每个文献以引用方式并入本文。使用未标记核苷酸的本公开的修饰的测序方法可以包括以下步骤：

(a')使固体载体在杂交条件下与测序引物接触，其中固体载体包含多种固定在其上的靶多核苷酸；并且所述测序引物与所述靶多核苷酸的至少一部分互补；

(b')在适合于DNA聚合酶介导的引物延伸的条件下，使固体载体与第一水溶液接触，该第一水溶液包含DNA聚合酶和四种不同类型的核苷酸中的一种或多种类型的核苷酸，其中这些核苷酸中的每种核苷酸包含3'封端基团，该3'封端基团包含如本文所述的未取代的或取代的烯丙基部分；

(c')使延伸的拷贝多核苷酸与一组亲和试剂在其中一种亲和试剂特异性地结合所掺入的未标记核苷酸的条件下接触，以提供标记的延伸拷贝多核苷酸；

(d')对固体载体进行成像并且对延伸的拷贝多核苷酸执行一次或多次荧光测量；以及

(e')在包含过渡金属催化剂和一种或多种还原剂的第二水溶液中去除所掺入的核苷酸的3'封端基团，过渡金属催化剂由具有水溶性非还原三(取代的C₁-C₆烷基)膦的钯或镍络合物产生，并且其中一种或多种还原剂包括含硼还原剂。

在本文所述的经修饰的测序方法的一些实施方案中，该方法还包括从所掺入的核苷酸去除亲和试剂。在仍另外的实施方案中，在相同反应中去除3'封端基团和亲和试剂。在一些实施方案中，该方法还包括步骤(f')用第三含水洗涤溶液洗涤固体载体。在另外的实施方案中，将步骤(b')至(f')重复至少50个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个或500个循环以确定靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，亲和试剂组可以包含特异性结合第一类型的核苷酸的第一亲和试剂、特异性结合第二类型的核苷酸的第二亲和试剂和特异性结合第三类型的核苷酸的第三亲和试剂。在一些另外的实施方案中，第一亲和试剂、第二亲和试剂和第三亲和试剂中的每一种亲和试剂包含光谱可区分的可检测标记。在一些实施方案中，亲和试剂可以包括蛋白质标签、抗体(包括但不限于抗体的结合片段、单链抗体、双特异性抗体等)、适体、打结素、affimer或以合适的特异性和亲和力结合掺入的核苷酸的任何其他已知的试剂。在一个实施方案中，至少一种亲和试剂是抗体或蛋白质标签。在另一个实施方案中，第一类型的亲和试剂、第二类型的亲和试剂和第三类型的亲和试剂中的至少一种是包含一个或多个可检测标记(例如，相同可检测标记的多个拷贝)的抗体或蛋白质标签，其中可检测标记是或包括本文所述的双硼染料部分。

一些实施方案包括焦磷酸测序技术。焦磷酸测序检测当将特定的核苷酸掺入到新生链中时无机焦磷酸盐(PPi)的释放(Ronaghi,M.,Karamohamed,S.,Pettersson,B.,Uhlen,M.和Nyren,P.(1996)“Real-time DNA sequencing using detection ofpyrophosphate release.”Analytical Biochemistry242(1),84-9；Ronaghi,M.(2001)“Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing”Genome Res.11(1),3-11；Ronaghi,M.、Uhlen,M.和Nyren,P.(1998)“A sequencing method based on real-timepyrophosphate.”Science281(5375),363；美国专利号6,210,891、6,258,568和6,274,320，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可通过被腺苷三磷酸(ATP)硫酸化酶立即转化为ATP成来进行检测，并且通过荧光素酶产生的光子来检测所产生的ATP水平。待测序的核酸可连接到阵列中的特征部，并且可对阵列进行成像以捕获由于在阵列的特征部处掺入核苷酸而产生的化学发光信号。可在用特定核苷酸类型(例如，A、T、C或G)处理阵列后获得图像。在添加每种核苷酸类型后获得的图像将在阵列中哪些特征部被检测到方面不同。图像中的这些差异反映阵列上的特征部的不同序列内容。然而，每个特征部的相对位置将在图像中保持不变。可使用本文所述的方法存储、处理和分析图像。例如，在用每种不同核苷酸类型处理阵列后获得的图像可以与本文针对从用于基于可逆终止子的测序方法的不同检测通道获得的图像所例示的相同方式进行处理。

在另一种示例性类型的SBS中，通过逐步添加可逆终止子核苷酸来完成循环测序，这些可逆终止子核苷酸包含例如可裂解或可光漂白的染料标记，如例如WO 04/018497和美国专利第7,057,026号所述，这两份专利的公开内容以引用方式并入本文。该方法由Solexa(现为Illumina,Inc.)商业化，在WO 91/06678和WO 07/123,744中也有所描述，这两份专利各自以引用方式并入本文。荧光标记终止子(其中不但终止可以逆转，而且荧光标记可以裂解)的可用性有利于高效的循环可逆终止(CRT)测序。聚合酶也可共工程化以有效地掺入这些经修饰的核苷酸并从这些经修饰的核苷酸延伸。

优选地，在基于可逆终止子的测序实施方案中，标记在SBS反应条件下基本上不抑制延伸。然而，检测标记可以是可移除的，例如通过裂解或降解移除。可在将标记掺入到阵列化核酸特征部中后捕获图像。在具体实施方案中，每个循环涉及将四种不同的核苷酸类型同时递送到阵列，并且每种核苷酸类型具有在光谱上不同的标记。然后可获得四个图像，每个图像使用对四个不同标记中的一个标记具有选择性的检测通道。替代性地，可以顺序地添加不同的核苷酸类型，并且可以在每个添加步骤之间获得阵列的图像。在此类实施方案中，每个图像将示出已掺入特定类型的核苷酸的核酸特征部。由于每个特征部的不同序列内容，不同特征部将存在于或不存在于不同图像中。然而，特征部的相对位置将在图像中保持不变。通过此类可逆终止子-SBS方法获得的图像可如本文所述进行存储、处理和分析。在图像捕获步骤后，可以除去标记，并且可以除去可逆终止子部分，以便进行核苷酸添加和检测的后续循环。已在特定循环中以及在后续循环之前检测到标记之后移除这些标记可提供减少循环之间的背景信号和串扰的优点。可用的标记和去除方法的示例在下文进行阐述。

一些实施方案可使用少于四种不同标记来使用对四种不同核苷酸的检测。例如，可以利用结合的美国专利第2013/0079232号的材料中所述的方法和系统来执行SBS。作为第一示例，一对核苷酸类型可在相同波长下检测，但基于对中的一个成员相对于另一个成员的强度差异，或基于对中的一个成员的导致与检测到的该对的另一个成员的信号相比明显的信号出现或消失的改变(例如，通过化学修饰、光化学修饰或物理修饰)来区分。作为第二示例，四种不同核苷酸类型中的三种能够在特定条件下被检测到，而第四种核苷酸类型缺少在那些条件下可被检测到或在那些条件下被最低限度地检测到的标记(例如，由于背景荧光而导致的最低限度检测等)。可基于其相应信号的存在来确定前三种核苷酸类型掺入到核酸中，并且可基于任何信号的不存在或对任何信号的最低限度检测来确定第四核苷酸类型掺入到核酸中。作为第三示例，一种核苷酸类型可包括在两个不同通道中检测到的标记，而其他核苷酸类型在不超过一个通道中被检测到。上述三种例示性构型不被认为是互相排斥的，并且可以各种组合进行使用。组合所有三个示例的示例性实施方案是基于荧光的SBS方法，该方法使用在第一通道中检测到的第一核苷酸类型(例如，具有当由第一激发波长激发时在第一通道中检测到的标记的dATP)，在第二通道中检测到的第二核苷酸类型(例如，具有当由第二激发波长激发时在第二通道中检测到的标记的dCTP)，在第一通道和第二通道两者中检测到的第三核苷酸类型(例如，具有当被第一激发波长和/或第二激发波长激发时在两个通道中检测到的至少一个标记的dTTP)，以及缺少在任一通道中检测到或最低限度地检测到的标记的第四核苷酸类型(例如，不具有标记的dGTP)。

此外，如并入的美国公开第2013/0079232号的材料中所述，可使用单个通道获得测序数据。在此类所谓的单染料测序方法中，标记第一核苷酸类型，但在生成第一图像之后移除标记，并且仅在生成第一图像之后标记第二核苷酸类型。第三核苷酸类型在第一图像和第二图像中都保留其标记，并且第四核苷酸类型在两个图像中均保持未标记。

一些实施方案可利用边连接边测序技术。此类技术利用DNA连接酶掺入寡核苷酸并识别此类寡核苷酸的掺入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸杂交的序列中的特定核苷酸的同一性相关的不同标记。与其他SBS方法一样，可在用已标记的测序试剂处理核酸特征部的阵列后获得图像。每个图像将示出已掺入特定类型的标记的核酸特征部。由于每个特征部的不同序列内容，不同特征部将存在于或不存在于不同图像中，但特征部的相对位置将在图像中保持不变。通过基于连接的测序方法获得的图像可如本文所述进行存储、处理和分析。可以与本文所述的方法和系统一起使用的示例性SBS系统和方法在美国专利号6,969,488、6,172,218和6,306,597中有所描述，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文。

一些实施方案可利用纳米孔测序(Deamer,D.W.和Akeson,M.“Nanopores andnucleic acids:prospects for ultrarapid sequencing.”Trends Biotechnol.18,147-151(2000)；Deamer,D.和D.Branton,“Characterization of nucleic acids by nanoporeanalysis,”Acc.Chem.Res.35:817-825(2002)；Li,J.,M.Gershow,D.Stein,E.Brandin和J.A.Golovchenko,“DNA molecules and configurations in a solid-state nanoporemicroscope,”Nat.Mater.2:611-615(2003年)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。在此类实施方案中，靶核酸穿过纳米孔。纳米孔可为合成孔或生物膜蛋白，诸如α-溶血素。当靶核酸穿过纳米孔时，可通过测量孔的电导率的波动来识别每个碱基对。(美国专利第7,001,792号；Soni,G.V.和Meller,“A.Progress toward ultrafast DNA sequencingusing solid-state nanopores,”Clin.Chem.53,1996-2001(2007)；Healy,K.“Nanopore-based single-molecule DNA analysis,”Nanomed.2,459-481(2007)；Cockroft,S.L.,Chu,J.,Amorin,M.和Ghadiri,M.R.“A single-molecule nanopore device detects DNApolymerase activity with single-nucleotide resolution,”J.Am.Chem.Soc.130,818-820(2008年)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。从纳米孔测序获得的数据可如本文所述进行存储、处理和分析。具体地，根据本文所述的光学图像和其他图像的示例性处理，可将数据如同图像那样进行处理。

测序方法的一些其他实施方案涉及在纳米球测序技术中使用本文所述的3'封端核苷酸，诸如美国专利第9,222,132号中所述的那些，该专利的公开内容以引用方式并入本文。通过滚环扩增(RCA)过程，可以产生大量离散的DNA纳米球。然后将纳米球混合物分布到含有允许单个纳米球与每个位置相关联的特征的图案化载玻片表面上。在DNA纳米球产生过程中，将DNA片段化，然后使其与四个衔接子序列中的第一个连接。对模板进行扩增、环化，之后用II型内切核酸酶裂解。添加第二组衔接子，然后进行扩增、环化和裂解。对剩余的两个衔接子重复该过程。最终产物是具有四个衔接子的环状模板，每个衔接子由模板序列分开。文库分子经历滚环扩增步骤，产生大量称为DNA纳米球的多联体，这些多联体随后沉积在流通池上。Goodwin等人，“Coming of age:ten years of next-generationsequencing technologies,”Nat Rev Genet.2016；17(6):333-51。

一些实施方案可利用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。可以通过携带荧光团的聚合酶与γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用来检测核苷酸掺入(如例如美国专利第7,329,492号和第7,211,414号中所述，这两份专利均以引用方式并入本文)，或者可以用零模波导来检测核苷酸掺入(如例如美国专利第7,315,019号中所述，该专利以引用方式并入本文)，并且可以使用荧光核苷酸类似物和工程化聚合酶来检测核苷酸掺入(如例如美国专利第7,405,281号和美国公开第2008/0108082号中所述，这两份专利均以引用方式并入本文)。可以将照明限于表面拴系的聚合酶周围的z升规模体积，使得可以在低背景下观察荧光标记核苷酸的掺入情况(Levene,M.J.等人“Zero-modewaveguides for single-molecule analysis at high concentrations,”Science 299,682-686(2003)；Lundquist,P.M.等人“Parallel confocal detection of singlemolecules in real time,”Opt.Lett.33,1026-1028(2008年)；Korlach,J.等人“Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNApolymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)，这些文献的公开内容全文以引用方式并入本文)。通过此类方法获得的图像可如本文所述进行存储、处理和分析。

一些SBS实施方案包括检测在核苷酸掺入延伸产物时释放的质子。例如，基于对释放质子的检测的测序可以使用可从Ion Torrent(Guilford，CT，Life Technologies子公司)商购获得的电检测器和相关技术，或者在美国公开第2009/0026082号、第2009/0127589号、第2010/0137143号和第2010/0282617号(所有这些公开均以引用方式并入本文)中所述的测序方法和系统。本文阐述的使用动力学排阻来扩增靶核酸的方法可容易地应用于用于检测质子的底物。更具体地，本文阐述的方法可以用于产生用于检测质子的扩增子克隆群体。

上述SBS方法可有利地以多种格式进行，使得同时操纵多个不同的靶核酸。在具体实施方案中，可在共同的反应容器中或在特定底物的表面上处理不同的靶核酸。这允许以多种方式方便地递送测序试剂、移除未反应的试剂和检测掺入事件。在使用表面结合的靶核酸的实施方案中，靶核酸可为阵列格式。在阵列格式中，靶核酸通常可以在空间上可区分的方式结合到表面。靶核酸可通过直接共价附着、附着到小珠或其他粒子或结合到附着到表面的聚合酶或其他分子来结合。阵列可包括在每个位点(也被称为特征部)处的靶核酸的单个拷贝，或者具有相同序列的多个拷贝可存在于每个位点或特征部处。多个拷贝可通过扩增方法(诸如，如下文进一步详细描述的桥式扩增或乳液PCR)产生。

本文所述的方法可使用具有处于多种密度中任一种密度的特征部的阵列，该多种密度包括例如至少约10个特征部/cm²、100个特征部/cm²、500个特征部/cm²、1,000个特征部/cm²、5,000个特征部/cm²、10,000个特征部/cm²、50,000个特征部/cm²、100,000个特征部/cm²、1,000,000个特征部/cm²、5,000,000个特征部/cm²或更高。

本文阐述的方法的优点是它们并行提供了对多个靶核酸的快速且有效检测。因此，本公开提供了能够使用本领域已知的技术(诸如上文所例示的那些)来制备和检测核酸的整合系统。因此，本公开的整合系统可包括能够将扩增试剂和/或测序试剂递送到一个或多个固定DNA片段的流体组件，该系统包括诸如泵、阀、贮存器、流体管线等的组件。流通池在整合系统中可被配置用于和/或用于检测靶核酸。示例性流通池在例如美国公开第2010/0111768号和美国专利申请第13/273,666号中有所描述，这两份专利中的每一者以引用方式并入本文。如针对流通池所例示的，整合系统的一个或多个流体组件可用于扩增方法和检测方法。以核酸测序实施方案为例，整合系统的一个或多个流体组件可用于本文阐述的扩增方法以及用于在测序方法(诸如上文例示的那些)中递送测序试剂。另选地，整合系统可包括单独的流体系统以执行扩增方法并执行检测方法。能够产生扩增核酸而且还能够确定核酸序列的整合测序系统的示例包括但不限于MiSeq^TM平台(Illumina,Inc.,San Diego,CA)，以及在美国专利申请号13/273,666中描述的设备，该专利以引用方式并入本文。

其中多核苷酸已直接连接到基于二氧化硅的载体的阵列是例如在WO 00/06770(以引用方式并入本文)中所公开的那些，其中通过玻璃上的环氧侧基与多核苷酸上的内部氨基基团之间的反应将多核苷酸固定在玻璃载体上。此外，可以通过硫基亲核物质与固体载体的反应将多核苷酸连接到固体载体，例如，如WO 2005/047301(以引用方式并入本文)中所述。固体承载的模板多核苷酸的又一个示例为，其中模板多核苷酸连接到承载在基于二氧化硅的固体载体或其他固体载体上的水凝胶，例如，如WO 00/31148、WO 01/01143、WO02/12566、WO 03/014392、美国专利第6,465,178号和第WO 00/53812号中所述，这些专利各自以引用方式并入本文。

模板多核苷酸可以固定于其上的特定表面是聚丙烯酰胺水凝胶。聚丙烯酰胺水凝胶描述于上文引用的参考文献和WO 2005/065814中，该专利以引用方式并入本文。可以使用的特定水凝胶包括WO 2005/065814和美国公开第2014/0079923号中所述的那些。在一个实施方案中，水凝胶为PAZAM(聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺))。

DNA模板分子可以连接到珠粒或微粒，例如，如美国专利第6,172,218号(以引用方式并入本文)中所述。与珠粒或微粒的连接可以用于测序应用。可以制备珠粒文库，其中每个珠粒包含不同的DNA序列。示例性文库及其产生方法描述于以下文献中：Nature,437,376-380(2005)；Science,309,5741,1728-1732(2005)，这些文献各自以引用方式并入本文。使用本文示出的核苷酸对此类珠粒的阵列进行测序在本公开的范围内。

待测序的模板可以形成固体载体上的“阵列”的一部分，在这种情况下，阵列可以采取任何方便的形式。因此，本公开的方法适用于所有类型的高密度阵列，包括单分子阵列、成簇阵列和珠粒阵列。本公开的标记核苷酸可以用于对基本上任何类型的阵列上的模板(包括但不限于通过将核酸分子固定在固体载体上而形成的那些)进行测序。

然而，本公开的标记核苷酸在对成簇阵列进行测序的背景中是特别有利的。在成簇阵列中，阵列上的不同区域(通常称为位点或特征)包含多个多核苷酸模板分子。一般来讲，所述多个多核苷酸分子不能通过光学手段单独地分辨，而是作为整体被检测到。取决于阵列的形成方式，阵列上的每个位点可以包含一个单独多核苷酸分子的多个拷贝(例如，该位点对于特定的单链核酸种类或双链核酸种类是同质的)或甚至少量不同多核苷酸分子的多个拷贝(例如，两个不同核酸种类的多个拷贝)。核酸分子的成簇阵列可以使用本领域中公知的技术产生。以举例的方式，WO 98/44151和WO 00/18957(其中的每一篇均并入本文)描述了扩增核酸的方法，其中模板和扩增产物均保持固定在固体载体上，以便形成由固定的核酸分子的簇或“集落”组成的阵列。根据这些方法制备的成簇阵列上存在的核酸分子是使用用本公开的染料化合物标记的核苷酸进行测序的合适模板。

本公开的标记核苷酸还可用于对单分子阵列上的模板进行测序。如本文所用的术语“单分子阵列”(“SMA”)是指分布(或排列)在固体载体上的多核苷酸分子群，其中任何单独的多核苷酸与该群的所有其他多核苷酸分子的间距使得有可能单独地分辨单独的多核苷酸分子。因此，在一些实施方案中，固定到固体载体的表面上的靶核酸分子能够通过光学手段分辨。这意味着一个或多个不同的信号(每个信号代表一种多核苷酸)将出现在所用的特定成像装置的可分辨区域内。

可以实现单分子检测，其中阵列上的相邻多核苷酸分子之间的间距为至少100nm，更具体地讲至少250nm，还更具体地讲至少300nm，甚至更具体地讲至少350nm。因此，每个分子能够作为单分子荧光点来单独地分辨和检测，并且来自所述单分子荧光点的荧光也表现出单步光漂白。

术语“单独分辨的”和“单独分辨”在本文中用于规定，当可视化时，有可能将阵列上的一个分子与其相邻分子区分开。阵列上各个分子之间的间隔将部分地通过用于分辨各个分子的特定技术来确定。通过参考公布的申请WO 00/06770和WO 01/57248将理解单分子阵列的一般特征，这些公布各自以引用方式并入本文。虽然本公开的核苷酸的一种用途是用于边合成边测序反应，但这些核苷酸的效用却不限于此类方法。事实上，这些核苷酸可以有利地用于需要检测连接于掺入到多核苷酸中的核苷酸的荧光标记的任何测序方法。

特别地，本公开的标记核苷酸可以用于自动化荧光测序方案中，尤其是基于Sanger和同事的链终止测序方法的荧光染料-终止子循环测序。此类方法通常使用酶和循环测序将荧光标记的双脱氧核苷酸掺入引物延伸测序反应中。所谓的Sanger测序方法和相关方案(Sanger型)利用带有标记的双脱氧核苷酸的随机化链终止。

因此，本公开还涵盖下述标记核苷酸：这些标记核苷酸是在3’位和2’位处都缺少羟基基团的双脱氧核苷酸，此类双脱氧核苷酸适合在Sanger型测序方法等中使用。

应当理解，掺入了3’封端基团的本公开的标记核苷酸也可以用于Sanger方法和相关方案中，因为通过使用具有3'-OH封端基团的核苷酸可以实现与通过使用双脱氧核苷酸所实现的效果相同的效果：两者均防止掺入后续核苷酸。在根据本公开的并且具有3'封端基团的核苷酸将用于Sanger型测序方法的情况下，应当理解，连接到核苷酸的染料化合物或可检测标记不需要经由可裂解的连接基连接，因为在掺入本公开的标记的核苷酸的每种情况下；随后不需要掺入核苷酸，因此不需要从核苷酸上除去标记。

试剂盒

本公开还提供了与测序设备一起使用的试剂盒，该试剂盒包括：含水裂解混合物，该含水裂解混合物包含过渡金属催化剂和一种或多种还原剂，其中过渡金属催化剂由具有水溶性非还原膦或N,N-双齿非膦配体的钯或镍络合物产生。在一些实施方案中，一种或多种还原剂包括本文所述的含硼还原剂。在一些实施方案中，过渡金属催化剂可以是Pd(0)催化剂，并且Pd(0)催化剂由具有水溶性非还原膦的钯络合物产生。在另外的实施方案中，Pd(0)催化剂可以由本文结合测序方法所述的钯络合物和水溶性非还原三(取代的C₁-C₆烷基)膦原位产生。在又另外的实施方案中，钯络合物可以包括[Pd(烯丙基)Cl]₂、Na₂PdCl₄、K₂PdCl₄、Li₂PdCl₄、[Pd(烯丙基)(THPP)]Cl、[Pd(烯丙基)(THPP)₂]Cl、Pd(CH₃CN)₂Cl₂、Pd(OAc)₂、Pd(PPh₃)₄、Pd(dba)₂、Pd(Acac)₂、PdCl₂(COD)、Pd(TFA)₂、Na₂PdBr₄、K₂PdBr₄、PdCl₂、PdBr₂或Pd(NO₃)₂或它们的组合。在又另外的实施方案中，钯络合物可以包含[Pd(Allyl)Cl]₂或Na₂PdCl₄。在一些实施方案中，水溶性非还原膦包括或是三(取代的C₁-C₆烷基)膦或三(取代的C₆-C₁₀芳基)膦或它们的组合。在一些实施方案中，三(取代的C₁-C₆烷基)膦是三(羧基取代的C₁-C₆烷基)膦。在另外的实施方案中，三(取代的C₁-C₆烷基)膦是TCEP。在一些其他实施方案中，三(取代的C₁-C₆烷基)膦是DIPA或diBuPpropSO₃。在一些实施方案中，钯络合物与水溶性非还原膦的摩尔比为约1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10。在一些其他实施方案中，过渡金属催化剂是Pd(0)催化剂，并且Pd(0)催化剂由具有N,N-双齿非膦配体的钯络合物产生。在一些实施方案中，钯络合物与N,N-双齿非膦配体的摩尔比为约1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10。在一些实施方案中，含硼还原剂是NH₃BH₃或B₂(OH)₄。在一些实施方案中，含水裂解混合物的pH为约7.0至约10或约7.5至约9.5。也可以使用其他合适的非还原水溶性膦和还原剂，诸如上文关于测序方法所述的那些。

一些实施方案还包括掺入混合物，其中掺入混合物包含四种不同类型的核苷酸中的一种或多种类型的核苷酸(例如，来自A、T、C和G或U的四种不同类型的核苷酸；dATP、dTTP、dCTP和dGTP或dUTP)，其中这些核苷酸中的每种核苷酸具有本文所述的3'封端基团。在另外的实施方案中，掺入混合物可以包含至少一种如本文所述的Pd(0)清除剂。在另外的实施方案中，核苷酸的3'封端基团具有连接到核苷酸的3'氧的结构其中R^a、R^b、R^c、R^d和R^e中的每一者独立地是H、卤素、未取代的或取代的C₁-C₆烷基或C₁-C₆卤代烷基。在又另外的实施方案中，核苷酸的3'封端基团具有连接到核苷酸的3'氧的结构在一些另外的实施方案中，Pd(0)清除剂包括一个或多个选自由以下组成的组的烯丙基部分：-O-烯丙基、-S-烯丙基、-NR-烯丙基和-N⁺RR'-烯丙基和它们的组合，其中R是H、未取代的或取代的C₁-C₆烷基、未取代的或取代的C₂-C₆烯基、未取代的或取代的C₂-C₆炔基、未取代的或取代的C₆-C₁₀芳基、未取代的或取代的5至10元杂芳基、未取代的或取代的C₃-C₁₀碳环基或未取代的或取代的5至10元杂环基；并且R'是H、未取代的C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。在另外的实施方案中，包含一个或多个-O-烯丙基部分的Pd(0)清除剂是它们的盐。在另外的实施方案中，包含一个或多个一个或多个-NR-烯丙基或-N⁺RR'-烯丙基部分的Pd(0)清除剂是其中Z^-是Cl^-或F^-。在另外的实施方案中，掺入混合物呈冻干形式。

试剂盒的一些实施方案还包括含水洗涤溶液或者能够重构成含水洗涤溶液的组合物。在一些实施方案中，含水洗涤溶液包含至少一种如本文所述的Pd(II)清除剂。

本公开还提供了一种与测序设备一起使用的盒，该盒包括多个室，其中该多个室中的一个或多个室与包括本文所述的含水裂解混合物的试剂盒一起使用。例如，盒可以包括两个或更多个单独的室，一个室含有本文所述的含水裂解混合物，并且另一个室含有本文所述的掺入混合物。

实施例

在以下实施例中更详细地公开了附加的实施方案，这些实施例并非旨在以任何方式限制权利要求书的范围。

实施例1.用还原剂去除3'封端基团的TCEP的效率

在溶液测定中，在存在和不存在还原剂NH₃BH₃的情况下测试作为非还原配体的TCEP对THPP的效率。用于裂解的底物是具有3'AOM封端基团的完全官能化的A核苷酸，并且在所有条件下裂解混合物的pH为大约9.5。Pd(0)催化剂由Pd(II)络合物Na₂PdCl₄产生。

如图1所示，具有TCEP和NH₃BH₃的裂解混合物表现出比THPP更高的裂解速率，在1分钟时达到接近100％裂解率。不具有还原剂的TCEP的裂解速率为大约0，证实TCEP本身不能将Pd(II)转化为活性Pd(0)形式。

实施例2.Pd裂解混合物在中性pH下的效率

在溶液测定中，相对于在两个不同pH：约7和约9.5下含有THPP的标准Pd裂解混合物(UCM)，测试了在约7的pH下含有TCEP和NH₃BH₃的裂解混合物的效率。UCM是在几个Illumina的SBS平台中使用的Pd裂解混合物，并且通常具有9.5的pH。用于裂解的底物是具有3'AOM封端基团的完全官能化的A核苷酸。由Na₂PdCl₄产生Pd(0)催化剂。

如图2所示，在pH 9.5下的UCM在5分钟内实现约100％裂解率。在pH 7下的TCEP能够在10分钟时实现约90％裂解率，并且在30分钟时实现约100％裂解率。在pH 7下的UCM不那么快，在50分钟时仅实现约75％裂解率。结果表明，TCEP可以适合于包含在期望中性pH的试剂中。

实施例3.具有50％ Pd浓度的TCEP的效率

在具有50％和100％ Pd的溶液测定中在存在还原剂B₂(OH)₄的情况下针对UCM测试了与标准UCM相比，在具有50％的Pd浓度的裂解混合物中，在存在还原剂B₂(OH)₄的情况下的TCEP的效率。UCM通常与100％ Pd一起使用。用于裂解的底物是具有3'AOM封端基团的完全官能化的A核苷酸，并且所有条件的pH为大约9.5。

如图3所示，具有50％ Pd的TCEP在5分钟实现高于90％裂解率，并且在10分钟时实现接近100％裂解率。具有100％ Pd的UCM能够在5分钟时实现约100％裂解率。具有50％ Pd的UCM在10分钟时达到约60％裂解率，并且在60分钟之后达到约90％裂解率。结果表明，TCEP可以适合于包含在期望最小化Pd的试剂中。

实施例4.Pd/TCEP/NH₃BH₃在边合成边测序中的评价

在Pd裂解混合物中存在含硼还原剂NH₃BH₃的情况下，在Illumina的iSeq^TM上针对含有Pd/THPP的标准UCM(不具有还原剂)测试TCEP的效率。用于裂解的底物是具有3'AOM封端基团的完全官能化的A核苷酸，并且所有条件的pH为大约9.5。如图4所示，用Pd/TCEP/NH₃BH₃裂解混合物进行的测序运行的定相％和预定相％与标准Pd裂解混合物相当。

实施例5.双齿N,N非膦配体的效率

在该实施例中，测试具有结构的N,N-双齿非膦配体以评估其由Pd预催化剂Na₂PdCl₄形成Pd(0)的能力(配体与Pd的比率为1:2)和其在存在外部还原剂NH₃BH₃的情况下裂解AOM底物的能力。如图5A所示，N,N-双齿配体能够形成Pd(0)。含有Pd/THPP的标准UCM(不具有还原剂)用作对照，产生80,551RFU，而由N,N-双齿非膦配体产生的Pd(0)活性催化剂产生42,059RFU。

另外地，测试由N,N-双齿非膦配体产生的Pd催化剂的裂解效率。用于裂解的底物是具有3'AOM封端基团的完全官能化的A核苷酸。图5B展示了在1分钟和60分钟时分别暴露于UCM或含有N,N-双齿非膦配体的裂解混合物之后，3'AOM封端的底物的裂解率百分比。如图所示，N,N-双齿非膦配体在1分钟之后裂解约14％的AOM底物，并且在60分钟时裂解约33％的AOM底物，而UCM在1分钟时裂解约49.3％的AOM底物，并且在60分钟时裂解约98.2％的AOM底物。该实验证明了N,N-双齿非膦配体在化学裂解反应中形成活性Pd(0)催化剂的可用性。

Claims (51)

1.一种用于确定多种靶多核苷酸的序列的方法，所述方法包括：

(a)使固体载体在杂交条件下与测序引物接触，其中所述固体载体包含多种固定在其上的靶多核苷酸；并且所述测序引物与所述靶多核苷酸的至少一部分互补；

(b)在适合于DNA聚合酶介导的引物延伸的条件下，使所述固体载体与第一水溶液接触，所述第一水溶液包含DNA聚合酶和四种不同类型的核苷酸中的一种或多种类型的核苷酸，其中所述核苷酸中的每种核苷酸包含3'封端基团，所述3'封端基团包含未取代的或取代的烯丙基基团；

(c)将一种类型的核苷酸掺入到所述测序引物中以产生延伸的拷贝多核苷酸；

(d)对所述延伸的拷贝多核苷酸执行一次或多次荧光测量；

(e)在包含过渡金属催化剂和一种或多种还原剂的第二水溶液中去除所掺入的核苷酸的所述3'封端基团，所述过渡金属催化剂由具有水溶性非还原膦或N,N-双齿非膦配体的钯或镍络合物产生，并且其中所述一种或多种还原剂包括含硼还原剂；以及

(f)在去除所掺入的核苷酸的所述3'封端基团之后，用第三水溶液对所述固体载体进行洗涤。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括重复步骤(b)至(f)，直到确定所述靶多核苷酸的至少一部分的序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其中将步骤(b)至(f)重复至少50次、至少100次、至少150次、至少200次、至少250次或至少300次。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述过渡金属催化剂是Pd(0)催化剂，并且所述Pd(0)催化剂由具有所述水溶性非还原膦的所述钯络合物产生。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述水溶性非还原膦包括三(取代的C₁-C₆烷基)膦或三(取代的C₆-C₁₀芳基)膦或它们的组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述过渡金属催化剂是由所述钯络合物和所述水溶性非还原三(取代的C₁-C₆烷基)膦原位产生的Pd(0)催化剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述钯络合物包括[Pd(烯丙基)Cl]₂、Na₂PdCl₄、K₂PdCl₄、Li₂PdCl₄、[Pd(烯丙基)(THPP)]Cl、

[Pd(烯丙基)(THPP)₂]Cl、Pd(CH₃CN)₂Cl₂、Pd(OAc)₂、Pd(PPh₃)₄、Pd(dba)₂、Pd(Acac)₂、PdCl₂(COD)、Pd(TFA)₂、Na₂PdBr₄、K₂PdBr₄、PdCl₂、PdBr₂或Pd(NO₃)₂或它们的组合。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述钯络合物包括[Pd(烯丙基)Cl]₂或Na₂PdCl₄。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述三(取代的C₁-C₆烷基)膦是三(羧基取代的C₁-C₆烷基)膦。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述三(取代的C₁-C₆烷基)膦是

11.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述三(取代的C₁-C₆烷基)膦是：

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述钯络合物与所述水溶性非还原膦的摩尔比为约1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、

1:9.5或1:10。

13.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述过渡金属催化剂是Pd(0)催化剂，并且所述Pd(0)催化剂由具有所述N,N-双齿非膦配体的所述钯络合物产生。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述N,N-双齿配体选自由以下组成的组：

和它们的盐；其中R₁独立地是-SO₃H、-COOH、-PO₃H₂或-NMe₃ ⁺；R₂是-(CH₂)_1-3COOH；并且R₃是-SO₃H或-COOH。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述含硼还原剂是NH₃BH₃或B₂(OH)₄。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述第二水溶液的pH为约7.0至约10或约7.5至约9.5。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述3'封端基团具有连接到所述核苷酸的3'氧的结构其中R^a、R^b、R^c、R^d和R^e中的每一者独立地是H、卤素、未取代的或取代的C₁-C₆烷基或C₁-C₆卤代烷基。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述核苷酸的所述3'封端基团具有连接到所述核苷酸的所述3'氧的结构

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述第一水溶液或所述第三水溶液包含至少一种Pd(0)清除剂。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述Pd(0)清除剂包括一个或多个选自由以下组成的组的烯丙基部分：-O-烯丙基、-S-烯丙基、-NR-烯丙基和-N⁺RR'-烯丙基和它们的组合，其中R是H、未取代的或取代的C₁-C₆烷基、未取代的或取代的C₂-C₆烯基、未取代的或取代的C₂-C₆炔基、未取代的或取代的C₆-C₁₀芳基、未取代的或取代的5至10元杂芳基、未取代的或取代的C₃-C₁₀碳环基或未取代的或取代的5至10元杂环基；并且R'是H、未取代的C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。

21.根据权利要求20所述的方法，其中包含一个或多个-O-烯丙基部分的所述Pd(0)清除剂是(N-Boc酪氨酸(烯丙基)-OH)或(烯丙基-β-D-吡喃葡萄糖苷)或它们的盐。

22.根据权利要求20所述的方法，其中包含一个或多个一个或多个-NR-烯丙基或-N⁺RR'-烯丙基部分的所述Pd(0)清除剂是Z^-，其中Z^-是Cl^-或F^-。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中包含一个或多个烯丙基部分的所述Pd(0)清除剂在所述第一水溶液中。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述第三水溶液还包含至少一种Pd(II)清除剂。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述Pd(II)清除剂包括L-半胱氨酸或硫代硫酸钠。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中当步骤(e)在室温下进行时，将所掺入的核苷酸的所述3'封端基团在少于5分钟内去除。

27.根据权利要求26所述的方法，其中将所掺入的核苷酸的所述3'封端基团在约1分钟内去除。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述固体载体包括固定的靶多核苷酸的阵列。

29.一种与测序设备一起使用的试剂盒，所述试剂盒包括：

含水裂解混合物，所述含水裂解混合物包含过渡金属催化剂和一种或多种还原剂，其中所述过渡金属催化剂由具有水溶性非还原膦或N,N-双齿非膦配体的钯或镍络合物产生，并且其中所述一种或多种还原剂包括含硼还原剂。

30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述过渡金属催化剂是Pd(0)催化剂，并且所述Pd(0)催化剂由具有所述水溶性非还原膦的所述钯络合物产生。

31.根据权利要求29或30所述的试剂盒，其中所述水溶性非还原膦包括三(取代的C₁-C₆烷基)膦或三(取代的C₆-C₁₀芳基)膦或它们的组合。

32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述过渡金属催化剂是由所述钯络合物和所述水溶性非还原三(取代的C₁-C₆烷基)膦原位产生的Pd(0)催化剂。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述钯络合物包括[Pd(烯丙基)Cl]₂、Na₂PdCl₄、K₂PdCl₄、Li₂PdCl₄、[Pd(烯丙基)(THPP)]Cl、

[Pd(烯丙基)(THPP)₂]Cl、Pd(CH₃CN)₂Cl₂、Pd(OAc)₂、Pd(PPh₃)₄、Pd(dba)₂、Pd(Acac)₂、PdCl₂(COD)、Pd(TFA)₂、Na₂PdBr₄、K₂PdBr₄、PdCl₂、PdBr₂或Pd(NO₃)₂或它们的组合。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述钯络合物包括[Pd(烯丙基)Cl]₂或Na₂PdCl₄。

35.根据权利要求31至34中任一项所述的试剂盒，其中所述三(取代的C₁-C₆烷基)膦是三(羧基取代的C₁-C₆烷基)膦。

36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述三(取代的C₁-C₆烷基)膦是

37.根据权利要求31至34中任一项所述的试剂盒，其中所述三(取代的C₁-C₆烷基)膦是：

38.根据权利要求29至37中任一项所述的试剂盒，其中所述钯络合物与所述水溶性非还原膦的摩尔比为约1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、

1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、

1:9、1:9.5或1:10。

39.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述过渡金属催化剂是Pd(0)催化剂，并且所述Pd(0)催化剂由具有所述N,N-双齿非膦配体的所述钯络合物产生。

40.根据权利要求29至39中任一项所述的试剂盒，其中所述含硼还原剂是NH₃BH₃或B₂(OH)₄。

41.根据权利要求29至40中任一项所述的试剂盒，其中所述含水裂解混合物的pH为约7.0至约10或约7.5至约9.5。

42.根据权利要求29至41中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括掺入混合物，其中所述掺入混合物包含：四种不同类型的核苷酸中的一种或多种类型的核苷酸，其中所述核苷酸中的每种核苷酸具有包含未取代的或取代的烯丙基基团的3'封端基团；以及至少一种Pd(0)清除剂。

43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述核苷酸的所述3'封端基团具有连接到所述核苷酸的3'氧的结构其中R^a、R^b、R^c、R^d和R^e中的每一者独立地是H、卤素、未取代的或取代的C₁-C₆烷基或C₁-C₆卤代烷基。

44.根据权利要求43所述的试剂盒，其中所述核苷酸的所述3'封端基团具有连接到所述核苷酸的所述3'氧的结构

45.根据权利要求42至44中任一项所述的试剂盒，其中所述Pd(0)清除剂包含一个或多个选自由以下组成的组的烯丙基部分：-O-烯丙基、-S-烯丙基、-NR-烯丙基和

-N+RR'-烯丙基和它们的组合，其中R是H、未取代的或取代的C₁-C₆烷基、未取代的或取代的C₂-C₆烯基、未取代的或取代的C₂-C₆炔基、未取代的或取代的C₆-C₁₀芳基、未取代的或取代的5至10元杂芳基、未取代的或取代的C₃-C₁₀碳环基或未取代的或取代的5至10元杂环基；并且R'是H、未取代的C₁-C₆烷基或取代的C₁-C₆烷基。

46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中包含一个或多个-O-烯丙基部分的所述Pd(0)清除剂是或它们的盐。

47.根据权利要求45所述的试剂盒，其中包含一个或多个一个或多个-NR-烯丙基或-N⁺RR'-烯丙基部分的所述Pd(0)清除剂是 ^-Z，其中Z^-是Cl^-或F^-。

48.根据权利要求42至47中任一项所述的试剂盒，其中所述掺入混合物呈冻干形式。

49.根据权利要求29至48中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括含水洗涤溶液或者能够重构成含水洗涤溶液的组合物。

50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述含水洗涤溶液包含至少一种Pd(II)清除剂。

51.一种与测序设备一起使用的盒，所述盒包括多个室，其中所述多个室中的一个室与根据权利要求29至41中任一项所述的包括所述含水裂解混合物的所述试剂盒一起使用。